Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies

10
Journal of Cellular Biochemistry 85:315±324 2002) Tubulin, Actin, and Tau Protein Interactions and the Study of Their Macromolecular Assemblies Gustavo A. Farias, 1 Juan P. Mun Äoz, 1 Jorge Garrido, 2 and Ricardo B. Maccioni 1 * 1 Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Millennium Institute for Advanced Studies in Cell Biology and Biotechnology CBB), Universidad de Chile, Las Palmeras 3425, N Ä un Äoa, Santiago, Chile 2 Faculty of Biological Sciences, Ponti®cia Universidad Cato Âlica de Chile Abstract The intracellular polymerization of cytoskeletal proteins into their supramolecular assemblies raises many questions regarding the regulatory patterns that control this process. Binding experiments using the ELISA solid phase system, together with protein assembly assays and electron microscopical studies provided clues on the protein ± protein associations in the polymerization of tubulin and actin networks. In vitro reconstitution experiments of these cytoskeletal ®laments using puri®ed tau, tubulin, and actin proteins were carried out. Tau protein association with tubulin immobilized in a solid phase support system was inhibited by actin monomer, and a higher inhibition was attained in the presence of preassembled actin ®laments. Conversely, tubulin and assembled microtubules strongly inhibited tau interaction with actin in the solid phase system. Actin ®laments decreased the extent of in vitro tau-induced tubulin assembly. Studies on the morphological aspects of microtubules and actin ®laments coexisting in vitro, revealed the association between both cytoskeletal ®laments, and in some cases, the presence of ®ne ®lamentous structures bridging these polymers. Immunogold studies showed the association of tau along polymerized microtubules and actin ®laments, even though a preferential localization of labeled tau with microtubules was revealed. The studies provide further evidence for the involvement of tau protein in modulating the interactions of microtubules and actin polymers in the organization of the cytsokeletal network. J. Cell. Biochem. 85: 315±324, 2002. ß 2002 Wiley-Liss, Inc. Key words: microtubules; actin polymers; tau; macromolecular interactions; cytoskeleton One of the major paradigms of modern biology has been the capacity of certain macromolecular systems to assemble into polymers that consti- tute fundamental structural elements involved in the morphogenesis, shape determination, and motility of cells and intracellular traf®c of organelles and vesicles. The structure and inte- grity of the cytoplasm in eukaryotic cells relies on the assembly and organization of the cyto- skeletal network [Maccioni and Arechaga, 1987]. Important advances have been achieved in understanding how cytoskeletal proteins form the assembled ®laments, e.g, actin ®laments, microtubules, and intermediate ®laments. These polymers are interlinked through a com- plex and coordinated set of protein interactions, whose dynamics is determining for the organi- zation of this network [Maccioni and Cambiazo, 1995]. Homologous protein±protein interac- tions include those of actin polymerization into micro®laments, or tubulin assembly into micro- tubules, while heterologous interactions include those of actin binding protein with the actin ®lament network, microtubule-associated pro- teins with microtubules, and with other compo- nents of cytoskeletal network [Mandelkow and Mandelkow, 1995; Welch et al., 1997; Mandato et al., 2001]. In this context, since the Porter model on the organization of the cytoplasmic matrix [Ellisman and Porter, 1980], evidence has accumulated on the roles of MAPs in brid- ging microtubules and actin ®laments in several cell types [Cross et al., 1993; Moraga et al., 1993; Henriquez et al., 1995; Maccioni and Cambiazo, ß 2002 Wiley-Liss, Inc. Grant sponsor: CONICYT, Chile Fondecyt grant); Grant number: 199-0002; Grant sponsor: Millennium Science Initiative Millennium Institute for Advanced Studies CBB grant); Grant number: PI99-031F. *Correspondence to: Dr. Ricardo B. Maccioni, Laboratorio de Biologõ Âa Celular y Molecular, Millennium Institute for Advanced Studies in Cell Biology and Biotechnology CBB), Universidad de Chile, Las Palmeras 3425, N Ä un Ä oa, San- tiago, Chile. E-mail: [email protected] Received 30 August 2001; Accepted 8 January 2002 DOI 10.1002/jcb.10133

Transcript of Tubulin, actin, and tau protein interactions and the study of their macromolecular assemblies

������� �� ������ ��� ������� ���������� ������

������� ! ��� ��" ��� #����� $���� ����� ��" ��%��"� �� ���� &� ����� ���� !�������

'����(� !) *����� � ���� #) &��+�, � ���- '����"� � ��" .� ��"� �) &� �����/����������� � ��� ��� ��� ����� ��� �������� �������� � ������ �� �� �������� �� ���� �� ��� ���������� ������������� ����� ����������� �� ����� ��� ������� !"#$� %& �&��� ��������� ����#'�� ��� � ���������� ��������� ����(��� ����������� ���)���� �� ����

!����� � *�� ��������� ��� +�������,����� � �����-������ +������� ���� ����� � +������� ��� ���������� ���������� . ������� ��������� ��� ��� ������ +������� ���� ������� ���� +������/ ������� �0+�������� ���� ��� 1���� �����+���� ������� �������� 2��� +������ �������� ������ ��� �������� ��������+���� �� ���� +������� �� �� �� ��� +������3+������ ������������ �� ��� +�������,����� � � � ��� ��� ����� ���2��-�/ �� ����� ��������� ���� �0+�������� � ����������-������ (������� ���� + ��(�� �� � � � ���� ��� ����� +������� 2��� ������� � �/ *� +������ ����������� 2���� � ��� ��������,�� �� � ����� +���� � ++��� ������ 2�� ��������� �� ����� �������� ��� � ������ ���������� 2���������� �� ��� +������� � +����������� ����� (�������/ ���������� � � ��� ��� ��������� ������ � ��� ����������������� �� ����������� 2��� ����� �� ��� ����� +���� ������/ ����� (������� ��������� ��� �0���� � �� ����� �� 4��� ���� � ��� ��������/ �� ���� �� ��� ���+��������� ��+���� � ������ � ��� ��� ����� (������� ���0������ �� ������ ����������� ����������� ���2��� ���� �����-������ (�������� ��� �� ���� ������ ��� +������� � (�� (������� � ��� �� ����������� ����� +�������/ ��� ������ �� ���� ���2�� ��� ����������� � �� ����� +�������,�� ������ � ��� ��� �����(�������� ���� ��� �� � +���������� ������,����� � ������� �� 2��� ������ � ��� 2�� ��������/ *�� �� ���� +������ ����� �������� �� ��� ����������� � �� +������ �� ��� ������ ��� ������������ � ������ � ��� ��� ����� +������� ����� ������,����� � ��� �����-������ ���2��-/ 5/ ���/ �������/ 6$7 !�$3!#"� #88#/ � #88# 9����4����� ���/

0� 1��"�� ������ � ���: ����� +�������: �� : ���������� ��� ������������: �����-������

��� �� ������ �� ���� ���� ��� ��������� ���� ��� ������ �� ������������������������� �� ������� ���� �������� ��� ����������� ��� ����� ��������� �������� ������� �� ��� �������������� ���� ������������� �������� �� ����� � ����������� ����� ����������� � ��������� ��� ��������� � ���������� �� ��� �������� �� ��������� ����� �������� ��� ������� � ���������� �� ��� ������������������� � ������ � !������ "#$%&�

'������� ����� ��� ���� ������ ���� ����� ��� ��� ����������� �������� ������� ������� �������� ���� ���� ��������������������� � ������� ��� ������������� �������� �� ���������� ������� �������( � ���� ���� ��� �� ������� ����������������� ������ �� ���������� ��� ��� ����������� �� ���� ������� � ������ � )������"##*&� +��������� �������,������� ������������ ����� � ����� �� ���� ������������� ����������������� �� ������� ������� ���� ������������������������������� ����������� ����� ������ �� ���� ��� ��� ������� ���� ��� ���������� �������� ������������������� ��������� ���� ������������� � ���� ����� ����������� �� ����������� ������� � � ����� � � ������ "##*- .���� �� ��� "##%- � ���� ��� /00"&� '� ���� �����(�� ����� ��� 1������� �� �� ��� ���������� �� ��� ��������������( �2������ � 1������ "#$0&� ��� ������ �������� �� ��� ����� �� !1� �� ��� ����������������� � ����������� �� ���������� ����� �)���� �� ��� "##3- ��� �� ��� "##3-+����4��� �� ��� "##*- ������ � )������

� ���� 2���34��� $� )

5��� �������6 )�7')8�� )���� 9:�� ���� ����;- 5���������6 "##�000/- 5��� �������6 ��������� <������'�������� 9 ��������� '�������� ��� ! ���� <�� ���)== ����;- 5��� ������6 1'##�03":�

>)�������� ���� ��6 ?�� @��� � =� ������� A�������� � =�����BC )����� � �������� ��������� '�������� ���! ���� <�� ��� �� )��� =������ � =������������ 9)==;�D������� � )����� A� 1����� 3E/*� 7F ��F�� <������� )����� 2����6 �������G���������

@������ 30 !����� /00"- !������ $ H���� /00/

?�' "0�"00/I���"0"33

"##*&� � ��� �� ��� ���������� ��������������������� ���� ������� ��� ������� �)����� ������� "##$&� ��� ��������� ������������������� � ���� ������� �� ������� ���������� �������������� � ��� �� ������������������ ��� ������ ���������� ���������������� ��� ������������ �� ��������� ��������� �.�� �� ��� /00"&� ��� ���� ������� �� �(���� ��� �������� �� ������ �� ��� ��������������� A����� ����� ���� �� ����� ���� ������� ���������� �� ������������� ���������� �������� ��� �� ���� ���� ���� ������������ ������ �� ����� �� ���� �������=��� �� !1�� ���������������������������

��������� ����� ��� ���#0 �5������ �� ���"##$&� ���� �� �� ������� �� �� ������ ������������ ���������� �� ������������ � ������������� � ��� �� ��� � �� �� ���������� ����� � �� ��� ����� ������� ��������� ���������� ������ �� ���� ����� ��� ������ ��������� �(��������� ���� � �� ��� ���������� ������ ����� � ��� ���� �� �� ������������������ � �(���� �� ������������ ������� ����� ��� ������ �� ������� �����������)�������� �� ��� "##%&� �� �������� ��� ��� ���� �� ��������� (��� �������� ����� � �� ��� ����������� �� ��� ����������� ������� ������������ �� �� ����� ������������ � ������ �� ����������� ���������� �� ���� ���� ������ ����� (��� ���������� �=�� � � A��� "##3&� ��� �������� �� �� �� ���� ����� �� ��� ��������� ����� ���� ������ ������� ���� ��� ���������������������� �������� �� ��� ����������� �� ���������������� �1����� �� ��� "##%&��� ��������� ���� �������I������������ ����� � ��� ��������� ���������� �� ��������� �� �������������� �� ��������� �������������������� �� ������ ������� ������������� 1���������� ��� ������� ���� ���������� ����� ) �* �� ����� ��������������� �� �� � !1"� � ����� ���� ���������������� ���� ��� ����������� ������������� � ��� ���������� �� ���� ���� �� ���������� ������ ����� �1����� �� ��� "##$&�@�������� �� ��� ��� ������� �� ) �*� �3*�� ������ �� ��������� ������� ����� �� ������ ���� �� ��� �������� ���������� ��������������� �� �� ��������������� �� �� �� �� ��� �� ��� ����� (��� ������ ��������������� �� ������ �� ��� /00"&� � ����������� �� ���� ������ ����� �� �� ������� ������������ ����� ���������� � ������ ��!��������K� ����� �!����� �� ��� "###� /00"&�

'� ���� ��� �� �� ����� ��� ����������������� �� �� ������� �� ������� �� ������������������ ��������������(��� ��������� ������ ����������� ����� �������������� ����������� �� �� ���� ���� ���� � ������� � ���� ����� ���������� ��������� '������ ��������� �� ������� � ���� ���������� ������ �� ��� �������� �� ��� � ���������� �(��������� � ��� �������� ������������� ����� �� ���� ��� ��������� ���� ��������� �� ����������� �������� ��� ���� ������������� ����� ���������� ����� ����� ���� � ��������� ������ ��� ��� ���� ������������,������� ������������

&!�5.$!4% !67 &5�897%

&�������

=��������� ������� ���� ���� <��� )������� )��� � ��� ������� ������� � ��� ����� ��� ����� �� ��� ������� ������� 4��������� ������� ��� �� ���� ��� �����6 9�; =����� !60�" 9/�������������;������������� �� 9 ��; ��������� /�*� 25�!� 0�*� �)�/�0�"� 2?�!� �+J�E- 9��; =����� =6 /0� ������+$�0 ���������0�*� �������������� 0�/� !�1 � 0�/� ))�/- 9���; 1=< ������� �+ %�3-� 9��; 1=<�������/0 ������� �+ %�3� ������������ ����� ��� ����� �� ��� �� ������� ���� ������ � �������� ������������ ��� � ���� � ��� ��������� '�5 ����� ���� ������ ��� ����(� �� ���� ���� !�������� ��� ���� ������ ��������� ����� ��@<"�/ �5���C��� �� ��� "##$& �� ��� ��� ����������� ��� ����

#���: ����� �� #������

���������� ������� �� ������ ���������� ����� ���� ��� ����������� ���� ��������� �� ������� � ��������� �<��������� ��� "#%3& ���� �� �������� � ������� ��)���� � ������ �"##$&� 1������ �� ����� � ����������� ������� � � $0�)� � ���� ������� ����� �� ����� ��� ����� �� ������������������ ��� ����������� ������� ������������ � �� ������ !� � ������� �� ������� ���� ��� ����������� ����������� ��������� ���������������� ������������� �� �������� �� ������ ���� ���� �(����� � �������� �� :��� �� �� �"##/&� !1�/ �������� � �� ���� �� L�� �"#$$&� !������ ������ ���� ������� ������� ������� ��� �� ��� "##3&� 1����� ���� ����������� ���� ����� �� 3� ���� ������ �+ $�0 ���

��; *����� � ��)

/ �� � E�)� !���� ������� ��� ������� ������ �� ������ �� ������������� �"00�000� ��� J0 ��� � E�)� 5����� �� ���������� ��������� "00� M)�� � /� �)�/�� ����� �� ���������� ���� �������������� ��������� � 3%�) ��� 30 ���� ��� ���� ��������� ���� )������� =��� @�/*0 � ������ �� �������6����� �� �

#����� 7�����������

1������ ������������ �� ������ �� �������� �� L�� �"#$$&� ����� ������ ����������� 9=<!; � ������� ��� � � ��� ��������� � ���� ������������� ��"0N1!52���� �� ��� �������� �� <?<�

5� ���� &� ��� �<�

����������� ��� ��� ���� ����� ��� ���� H���O"00 �������� ����������� � ��� ������ ���� ��� �(���� � ������� �� �� ����� �������� �������� ���� � ������� �����������5������ �� ��� "##$&� ��� �������� ��������������� ������������� ������������� ���������� �� ���� ����� �� �������� ������������� �� ����� ������� �(��������� �� ����������� � ������ �� �� ���� �(� � ���� �� �����I���� �������� ��� � ��� "�* ��������� ���� "N 4����� �������� �� ���������� � ������� �� �� ��� �������� ������������ :�� ��������� �(���������� ��������� � ���� :����� ��� ���� ��� � 5�� ����� ������� ������ ���� ���� / ��� �������� �=< 930 � ����� "*0 � 7)�� �+ $�/;� ���������� ��� "*��� �� ������ �=5 9�=<���� 0�"N =<!� "N ������� �+ $�/;� <��������� ������� ���� ���� ����� � 9��������������� �� ������ ��������� �@<"�/; ����� �� �=< ����� 30 ��� � ���� ������������ 5�� � ���� ���� ����� ����� �����"0��� ���������=5� ������� ���� ����� ����� � ��������� '�5 ������� ���� ������� � ��� ����� 30 ��� � ���� �������������� ��� ������� ������ * � "0 �� ���� ��� ���� ����� ������ ���� ���� ���� ���������� ����� * ��� �� �=5 ������ � ����������������� �� �=<� ��� ������� ������� �� ������� ���� ���� ��� ��� ��� � �� 1=<��(���� ��� / ��� �� /N ������ ��� � � ������� ���� "N ������

%���" #��� !�����

2(��������� ��� ������ � ������� ��1� ����� �� �� �"##E& ���� ���� �� ������������ ��� � <�������� �� ������������� ��������

� �� ���� ������ �� ��� �+ J�E ������������ ���� � ������������ ���� ��������� � �� ���� �+ $�0 ������� ��� ������� ��� � �������� 9�������� ����� �� �������������������; �� ���� �� �� ��� ����� �� ��� #J����� ���������� ������ � ������� ��� 3 � ������ ������ �� ��� ������ ������� !���������� �� ��� �������� �������� ���� ��������� �������� �� ��������� ��� ����� ���������� �� ��������� ��� 3 � ���� "00 �� ����� �������� ���� 9������/0;� ��� ���������������� �� ������ � � ��� ���������� ��������� ���� ���� ��� ��� ��� ������ � ������� ���� *0 �� �� �� �������� � ���������������������� �� ������� ���� �� ������� �� ���� �� �� ��(���� �� ���������� ����������� � ��� !���� ��������� ��� 3 � �/E�)� ��� ����� ���� ���� � ������� ���� ��� ���� ����� � ��� / � 9������ ���������� ����� �;� ��� ���� ����� � �� ������� � ������������ ������ ��� ������� *0 �� �� ��� ����� ����� � 9����� '�5����� ���� ������ ��� ����(� ��; 9"6"�000 �������; � ������� ��� " � � 3%�)� !����������� ��� �������,������� ���������� �� ������ ����� "00 �� �� �������� ��� �������� �1? 9" ��I�� ����������� ����� � 0�03N +/�/ �� 0�" ������ �� � �+ *�0; � ���������� ��� ��� ������ ����(� ��� � ���������� �������� ���� *0 �� �� E ���������� � ��� ��� ��� �������� �� ����� � ���������� ��� ��� ����� �� �������� �E#0 ��� '� �� �� �� ���� ��� ��� ���������� �� �������������� �� ��� 2A'<! ������� ��������������� ����� =<! ����� �� ���� ���� ��� �� ��� ����������� ���� ��� �� ��� ��� ���������� '�������� ���� ������ !1�/����� �� �� �� ��� � ������� ��������������� �� ����� ��� ��� ��� �� ������� �� ����������� �� ��� ������ �� ����� !� �������������� ������� ��� ��� ���� ��� ���������������� �� ������ ������������� �� �� ����������� �� ��� ���������� ����� �� ����� � !�������� ������� ��������� ����� �� ���������� � �� ��� ������ �� �� � ���� �������� ������� ����� ��� �������������������� �� ��� �(��������� ��� ������ ������������� �� �� �� �� ������ ��� ������� ��� ���� ���� ��� ���� ������ ��������� ������ 2(��������� ���� ����� ��� ��4� �������� 9�� E; �� ���� �� * �� ���� �(����������� ��� ��� � ���������� �������� �� ��� ���� � � ����� ��� ����� �� ����������� ���� � !7�L! ��������� �������

������� ! ��� ��" ��� $���� ����� ��=

.5%>4�%

��� ��������� �� �� ���� �������� �� ����������� � ������������ �� ���������� ��� ������ �� ����� �� ��� ����� �� ���� �������������������� ������� �� �� ������ �������������� �� ����� ����������� �����������'� ���� ������� ����������� ���� ���� ����������� ���� ��� �� ������ ������������ ��� ���������� ������� �� �� ���� ����������� � ����� � ���� � ���� ����� ����������� ��������� �������� ������� �� ����������� �� ��� ����� � ������ ��������������� �� ����� �� �� ������� �� �(� ���������������� �� ��(����� �� ���� �������� ���� � � � ��� ������ �� ������� �� �������� �� ����� � ������ ��������� ����� ��1����� �� ������� ���� �� ��� ��������������� ���� ���� ������� ��������� �� ������������� ���� ��� ������ 9:��� ";� ��

������������� ��� �� ����� ��� ��� ���������� �� �� ������ ���� �������� ������� ����������� �!E#0 � �������� �� ���� �������������� � �� ����� �� ��� ��������������� �� ��� ������ �� ����� �������� 9������������� ��� ��;� ! ����������� ���� ���� ���� ������ ��,������� ���������� �� ������ �� ��������� ������ �� �� ��� ��� ���� ������ �� ���� �� ��� ������� (��� ��� ��� ������ ��� �� ����� � �� ����������������� 0�" � � ! /3N ���������� �� �� ��� ����� ������� ���� ���� ������ �������������� ����� �� �� ����������� ���������9�� 0�0";� )��������� �� ���������� ������������� ��� �� ���������� ���(��� ��� ��� ��������� 9=�(; ������ ���� ��� �������������� ������ �������� ���� ��������� ������������� ��

�� ���� ���������� ���� ��������� ������ ���� � �� ��� ������� �������� ����������� �� ���������� ���������� �� ������� 9�!E#0 ������ �� 3*N� :��� ";� =<! ��� ����� �� ���� � ��� �� ��� ��������������������� ���� �� ������ ��� ���������� ����� ����������� ������ �� ���� �� ���� ����������9:��� ";� =��� �� ��� ������ �� :����� " �� ����� ������������� ���� 0," � � �������������� ����� ������ ��� �� ������ � �� ��� ���� 0,0�" � �� ����� ����������� �� ������ ��������� ��������9M��; �� E� "0% �" ��� ��� �� ��� ��� ��������� �� ��� ������ �� ���� �� ����� ��������� ���� ��� ��� �������� �������� �����I������� ����������� �!����� �� ��� /000&������ M��� "�J� "0% �" �� ������� ���� � �� ��� �������� �� ��������� ����� !� �������� ������� ��� ����������� ��� �������� ������ ������ ���������� ��������� ���� !1�/ �� ��� �������� ������� 9:��� ";� ���������� ���� ���������� ������� � ������ +����� /000&� '� ������ ��� �� �(����������� ���� ���� �� ���������� �� ������������� ����� � ��� ��� ��� �� �� ������� � ! ����������� ��������� ����������9�� 0�00*; �� ��I���� ��������� �� /JN ��������� ���� ��� ����� �� ������� ���������� ��� ������ 9:��� /;� +������� ���� �� ������������ ���� ���������� ������� ���������� ��� ���������� ������� �� ����,�� ����������� ���� ������ ��� ����� �(���� �� ����������� 9���� EEN ����������;� '� ��������� �� ��������� ������ �� ����������������������� ���� �� ��� ���� ���� �������� ��� ��� ��� �� �� ����� 9:��� 3;� !

*�-) �) 1���� �0+������� ���2��� ��� ���+������� � ����� ���� ����������� 2��� � � ���/ ; ����� ���������� � � ������+��� �8/# ��<��� 2��� ������ �� =>42��� 1���� +�����/ ��������-���� ���������� �������������� � + ��(�� �� ���� �� �� +������ ����2�� �� #� �8�" ������ ��������� ����� ���2��� ����� ��� ��� ���������� �� ��� ���������� +�����/������� � �� �� ��� ����� � ��� ��� ��������� ���������� 2������ ��� ���� �� ����4�� ���������� �������� ����/ �7$�888���� ��������� �� ������� ��� ���������� � ��� ���+��0 ��"=8 ��/ �� ��������� �� 2�� +����� ����� 2��� +�������� ��������� ��0� �� ����� �� ��� ����� +���� ������ ��� �����,�� ����������� ���/ ��� ������������ � + �� �� ��������,�� �� ���+����� ��� ������+�� 2��� ����4�� �������� 2�� �����,�� �� ��������/ �� � �������� �������� ���������� �������������� �� � ��� 2��� ����� �� ��� ������� � �� ��� �����,�� �� �����+���� ����� ���� ����4�� ���������� ��������/ �� � ��������������� �� ��� +������ ���������� ��� ����� � #� �8�" ��������� �� � � ���<�� ������������ 2��� �����,�� ���/ �� �+������� ������� �� �� �� ��� ���������� ����� � ����� ���� 4# ����������� 2��� � � ��� 2�� �����,�� ���/ 1��� +������+������� ��� ���� � � � �� (�� ��������������/ ������+��������� �������� ������ ��� ���2� �� ����� ���� ������������ �� (�� �������������� ���$�/

��� *����� � ��)

����� ����������� ������ �� ���� ������� ����I����������� ���������� �� ��� ������� ���� ����� �� ��(���� �� �� ���� ����������� ���� ������� 9���� "JN �������

����;� 2������� �� ��� �(���� �� ���������� ����� � �� ��� ���� ��� ��� ����� ������������� �� ��� ���� ���� ���� ������������ �(��� ��� ��� �� �� 9=�(;� ���� ������������ �� �� ��������� �(��������� ��������� ������������ � ������������ ����� �� ���������������� :�� ����� ��� ���������������� ���� ������� ���� �(��� �������� ���� ��������� �� ������������� � ��� ������� �������� �� ������ �� ��������������� ?������������ �� ���� ����� �� ��� ������� �� ��� ������� �������� ����� ��6������� ��������������� �� "69J�E� 0�E;����� ��� ���� �� �� ������� � ��� ���������������� ���� ������� ��� ������� ���������� �������� �������� � ����������� � ���������� ���������� �� ����� �� :����� E�2�������������� 4��������� ������ ����� ��� ������� ����� � ���� � �� ��� �� ������� � ���� ������� #J � ##N �����'� �� �� �������� �� ����� ��� �� �����

������� �� ������� ���� ������������ �� ����������� �� ����� ��� ��������� �� ������� � ���� �������� � ��� ������� �� �� �� ���������� ���������� ������� �� �� ��� ��������� ���� ������������ ���� "0N ? <� ����� �������� �� ������ �� ���������� ������������ � ��� ������� �������� ��������

*�-) �) 1���� �� �� � ��� ���+������� ���� � � � ��� �������3�� �����������/ *�� 1���� +����� 2��� ��� ����� 2����88 �� � �� ����� ��� ���� �8/# ��<���/ ���. ��� � ������������������������ � �� +������ ���� �� ���. ��� � �� ����2�� ��� � ��� �� � ������������� � 8/# ��<�� 2��� ����� ��� ������ ����������� ��������� �� ��� ����� +���� ����� ��� ��������4�� �������� ����/ �7$�888�/ �� ������� �0+�������� �� 2��+����� ����� 2��� +�������,�� � � ���� ���� ����� �� ��������� ��� ��� ��� ������������ �����,�� �� ��� ��� ����������/ 1��� +���� ��+������� ��� ���� � � � �� (�� ���������4�����/ ���� ��+��������� �������� ������ ��� ���2� �� ��������� ������� ����� �� (�� �������������� ��� $�/

*�-) �) 1���� �� �� � ��� ���+������� � ����� �� �� ����������� 2��� +�������,�� ������ � ���/ *�� 1���� +�����2��� ��� ����� 2��� �88 �� � +����������� ������ � ��� �(���������������� � 8/# ��<�� � � ����/ ���������� ��������������� �� ���� �� ��0� ��� � ���������� �� ��������������+����� ����� 2��� ����� (������� ��� 2��� ����� �� ��� +��������� 1���� ��� ������������ �����,�� ���� �� ����4�� +���4������ ��������/ 1��� +���� ��+������� ��� ���� � � � �� (����������������/ ���� ��+��������� �������� ������ ��� ���2� ������� ���� ������� ����� �� (�� �������������� ���$�/

*�-) �) 1������+������� �������� � ��� +������ ���+������ ������ ��� ������ � ��� ��� �� ��� �� ��/ * � ��� ��������� � ��� ��������� 2��� �8? @��A ���� ��/ �����4� � ��� ������� ��� ����� ������ � ��������4��������������������� ���� ����� ��� 2����� �� � ��� �� ���� ��/���������� ��� ���������� � � � ��� ��� ����� ���� ��/���������� ��� ���������� � +����������� ����� ��� �����4� � ��� ��� ��� �� +�������,� 2��� �� ���� ��/ ����� �������� +������� ���� ��� ��� ��� �+�������,�� ����� ���� ;�/����� ��� 2����� ���-��� ��� ��������� �� ��� �����/

������� ! ��� ��" ��� $���� ����� ��?

�� ��� ����� ���� ��� ����� �� �������� �3E0 ��� 2��� ������ ����� ���������� ����������� �� ��� �(���� �� ������������� ������������� ������� ������� ���� � �������� ���� ������� 9:��� *!;� /0N ���������� ����� �(���� �� ������������� �� ������� � ������ �� ���� �������� ������� �(���������9�� E; �� ��� �������� �� ���� ������� �� ���������� ������� ������� ���� ������������9:��� *=;� �� ��� ���� �� ��� �������� ��� ����� ������ ��� �� ����� �� ��������� ������������������ ��� ������ ��������� ��� ������ �� ����� �� ��� ������� ������� ��������� ������������ � ������ �� ��� "#$#&��(������������� ����� ��� ��� ����� //,/JN ���������� �� ��� ������� ���� ����� ������ ������� �� ��� �������� � ������� ����������� ������� 9 � ��� �����;���� ������������ ������ �� ��� ���������

���� ��������� �� ������� � ���� �� ����������� � ������ �� ��� � ���� � ����� ����� ������� ��������� �������� �� ��������������� ������� ���� ����� �� ��������� ������������ ��� ��� 9:��� J;� !���� �������� ������� �� ��� �������� �� �� 9:��� J�;����� ������ ������� �� ������ ��� ��� ������� ���� ����� ���� ������� 9:��� J;����������� ����������� �������� 9:��� J�;����� ������� �� ��� �������� �� ���� ��������� �(������ ��������� ���������� ����

������������ � ��� �������� ����������������� 9:��� J�� ��� ������ J��;� '� ���� �(����������� �������� ��� ������� ����� ����������������� ���� ��� � ������ � ����� ������������ ���� ��� ������ �� ������������ �������� ���� ���� ������� �� ��� ������ �� ��9:��� J ;� �� ��������� ���� ����� ������������ ��� �������� � ��� �������� ���������������� �� ��������� � <�� ��� � ��� ����������� ������ ����������� �� ��������� ����� ���� ����������� �������� 9:��� %;� ������ ���� ������� �������� �� ����� ����� ����� �� ������������ �� ������ 9:��� %�;� !� ������ ����������� �� ������������� ���� ������������ 9:��� %�; � �������(������ ������������ � ���� �������9:��� % ;���� ������� � '� ��� ���� �(��������������� ������ �� �� ��� ��� �� ������������ ������� ���� ���� �������� ���� ������ �'� ��� ��� � �� ��I������������ ������������9:��� %�;� ����������� ������ ������� 9#"�*N;�� ��������� � ������ �� ���� ������������� �������� ���� ��������������� ����� ���� ���� ������� 9$�*N; ������ ������ � ����� �������� �� ��� ������� ������� 9:��� %�;�$JN �� ��� ��������� � ������ �� ���������� � �� ��� ������ ��������

7$%>%%$96

.� ����� ��� � ���������� ��� � ������� � ��� �� ����� ����� ��� ����������� ������ �� ������� ���� ���� ������� � ������������� � ��� �� ��������� �������(������ ������� �������� �� ����� ���������� ���� ��� � �� � ������ ��� � �������� ��� �� ����� �������������� �� ����� ������������ �������� � ��� ���� �� �� �� ����� ����������� �������� '� ���� ��� �� �(���������� ����� ���� ���� ��������� ��� ��� �����������,������� ���������� �� �� ���� �������������� �������� ������� � ���� � ����� ���� ����� ��������� <��� ���� ������������ �� �� ������� ���� ��� 4�������������������� �� ����������� �������� �1� ������� ��� "##E&� ��� ��� ��� ������ ��� ���������� ���� � ���� ������� �������� ��,������� ������������ � ��� ������(�� ����� �� �� � ���� ������� �(���� ������������������� ��� ��,������� ���������� �������� ��� ���� ��������� �� ��� ���� ��� �������� ��������� � ���������� �������������������� �������� ��,���� ������������ '�������������� ����� ��� ��� �(��������� �� ����

*�-) �) ������ � �� �������� -������� �� ��� +������� � �����(�������/ !7 * � ��� ��/# ��<��� 2�� ��� ��� �� +�������,� ����� +������� � �8? @��A� ������ �� ��� +������� �� ��� �� ����� ������� �� ��� #� � +����������� ����� (������� �8/= ��<�� ������� ��� ��� �������� -������� ��������� �� !"8 ��/ �7 ��������� �0+�������� � � ��� ���+��� 2��� ��� ��� �� ��������2��� + ��(�� �� �8/> ��<��� �� ��� +������� �� ��� !� �� ���������� �� ��� "� � +����������� ����� (�������� ��� ����������� -������� ��������� �� ��� � ������� ������ �� !"8 ��/10+�������� 2��� ��+����� � � ����� ���"� 2��� �������+��+�������� � + ��(�� � � ���� ����� ��� �� � ��� ������������ ��� 2��� �������� ���� . ����(������ � ��� ��������-�������/

��� *����� � ��)

��� ��� �(���� �� ������� ���������� �� ��,���� ����������� �� �������� ������ ��� ����� ���� ���������� �� ��,������� ����������.��� ������������ ���� ���������� �� ������� ���� �������� ��� ��,���� ������������( �� ���� ��������� �� ���������� ����� ��� �� ��� ����������� ��������� )���� ������ ��� ���� ����� �� ������ �� ��� ����������������� � ����� �� :����� E� �� �� ����������� �������� ���������� �� ���� �� �� ����������� �� ������ ��� ����� ����������� ��������� �� ��� ��� �� ������ ������� �� ����� '� ����� ������ ��� ��� ������� ���� ������ ������ ���� ������ ������ ��� ##N �� ��� �� ������ ���� ��� �(�������� ����� #JN���� �� � ������ ������ �������� :������������ ��� �������� �� �� ���������������9"6J�E �����I ����; �� �� ��� �������� ������������ ��� ��� �� ����� ����������� ��� ��

����� ���������� �������� �)����� �� ���"##*- !����� �� ��� /000&���� �������� ��� ��� ����� ��������������

���� ������ �� ��� ��� ��� �� ������� ����� ������ ��� !1� ��� ��� ���� �� ������� ���� �������� ��� ����� ���������� ���������� �� �� �� ������������ ������� �������� ��� ��� ����� �� �� � ������ �� ��� "#$$&� �������� �� �������� ��������� ��� �� ������������� ����������� ��� ��� ������ ������������ ������� ���� � ��������� �������M� /�*� "0* �" � ������ �� ��� "#$#&� '� ������ �� ��� � �� ���� ������� � ���� ���� ���� �������� ��� ��� �� ������� ���������� � ������������� ���� ����� �)���������"##3- +����4��� �� ��� "##*&� ��� ������������� �������� ����������� �� ���� ������ ����(����� �� �� ��������� ���� ������������� ������ ���� ��� �� ��������� ����

*�-) ;) 1������� ��������+� � � � ��� +������� ���������2��� �� �� ��� +������� � ����� (�������/ �7 ����� (���������������� �� ��� ������� � �� / �7 � ����� � ����� (����������� �������� �� ��� +������� � $ �� �� / 7 ������ � ���+������� �� ����� ��������� ��� + ��(�� � � ��� �� ���+������� � ����� �� +������/ "7 ������ � ��� ��������� 2���

�8? @��A �� ��� +������� � ����� (������� ��� �� ���������� � �� / 7 ������ � ��� ��������� �� ��� +������� � �� ��� #/$ �� +����������� ����� (�������/ � �������7 ;����������(������ � �� ���� � +���� ���2� �� ���/ ����� B$ �� �� ����� �� �/ ���� �. ��� #8 �� �� ��� ����� ��/

������� ! ��� ��" ��� $���� ����� ���

������� ������ ��������� �� ��I���� ���������� ��� � ������ ���� �� ���������� ����������������������� ���� �� ����������� ������ ���������� ������ �� �� ��������� ���� ������� ��������������� �������� '� ������������ ���� ��� ��� ����� � ������ ����������� �� ������ ��� ����� �� �� �� �� ���������������� ������� ���� � ������� ���������� <�� ��� �� ����� ���������� ��� �������� ��� ���������� �� !1�/ ���� ������

������ �������� �1� ����� �� ��� "##E&� � ��� ���� ������������ � ���� ���������<������� "#$J- )�������� �� ��� "##%&�� ���� ������� ��� ������� �=���� � L����� "#$3&� '��������� �� !1/� �� ������� ������������ �� ��� ������� ����� � +����� /000&�.����� ��� �������� �� ���� ������� �� ��

�������� �� ������ ��� ������� �� ���� ��������� �� ��� �� ����� ������� �� �������������

*�-) =) �������,����� � ��� ��������� �� +������ ������� ����� ��������� ������ � ��� +������� ��� ����� (������� �������,�� �� �������� ��������+�/ �7 ������ � ��� ��������� ����� +������� � �� +������ ��� ��� ������ ������,����� � �� +������ 2��� ��� ������ � ��� ��� �� ���/ �7 ������ �� ������������ �������� �� 2���� �� ��������,����� �� ��������/ 7

��� ������ ������,����� � �� 2��� ������ � ��� +�������/ "7��� ������ ������,����� � �� +������ 2��� �� ����� ������������2��-� � ������ � ��� ��� ����� (�������/ ����2�� �� ������,����� 2��� ���� �� ����� ��������� �����(�������/�������-�� �� ������,����� 2��� ������ � ���/ ����� #88 �� ����+ ��� B$ �� �� ��� ������ +����� � ��� (� ��/

��� *����� � ��)

2��� ������ �� ��� ������� ���� ������� ����� �(���� �� ������� ������������� � �������� ��� �������� �� ���������� ���� ���������� ��� ������� ������� �� ����� ������� ������������ ���� ? <�� ���� �����������(���� �� ��� ���� �������� �� ������ ����� ���������� ������������������ 9:���*;������ ������� �� ���� ��� ��������� �� ������ �� ��� ������ ���� ���� �������� �� ������������� ��� ��� ������ ������� �� ���������� ����������� �������� ���� ��������������� ����������� �� ���� �������� ��� �� ���������� ���� ������������� <����� ������������ ��� ������� �� ������� ������� �� ��� �� ��� �� ����� � ��������� ��� �� ���� �������� ��� �������� �(��������� ���� ���4������� �� ��� ������������ ������� �� ������������ ���� ���� � ������� ���������� ��� ���� �� ������� ���� ����� ����������������� ����� ��� ��� ����� ����������������� �� ����� ������� �������� �� ��������� � �� ���� �(��������� ��� �������� ���������� ���������������������� ������������� �� ��� �� ������� �� ��� �������� ����� <�� ��� �� ��������������� 9:��� J; ������� ������ ������� ��� ��� ����� ����������� ������� � ������������� ������������� ��� ���������� ������� ��� �� ��������������� ��� �� ��� ��� ��� ������ ��4������� � ��� �� �� ����� ���� �������I����������� ������������ :����������� ���������� �(��������� ����� ��� �� ������� ���� ���� �� ����� ������� ��������� ������� ���� �� �� �������� ���� ��� ��� ��+����� �� �� �"#$$& �� ����� �� ����������������� �� �� ���� ��� ����������� ������������ ���� �� ��� ���� � �������� ������������� '� �� �������� ��� �� ��������������� �� ��� �� ����� � ������� ������������ ��������� ���������� �+����4��� �� ���"##*&� '� ���� ���� � ��� ��� ��� ����� � ��� ���� �� ��� ������ �� �� �� ������� � ����������� �� ���������� ���� ���������� ����������� ��������� ���� �� �������� ���� ����� ������� �������� �!����� �� ��� /000&���� ��������� ����� �� �� ������� �� �� ������� ��� �������� ������� �� ��������������������� �� ������� � ���� �������� ������ ��� ���� ���� ��� ��� �� ������� ������)���� �� ��� "##3&� ��� ��� ���� �� �������� ���� �=�� � � A��� "##E- 5����� �� ���"##E- ��� =����� �� ��� /000&� '� ������������ ��� ��� ��� ��� ����� ���� ��� �� ������ ��� �� ��� �������� ������ �� �������

������������ ��������� �� ����������� �������� � ��� ����� �� �� �������� �� �� ������� ����� �����������

.5*5.565%

!����� � .���� +� � ����� 2� /000� 7������������ ��� �� ����� ���������� �� �� �� ��� ����������������� �� ���� ������ ����������� ������������ H=��� )��� /%*63033*,303E3�

!����� !� ���� @� )����� !� ������ @=� "###� '����������� �� �������������� ������� ����� � �* ����������������� ��� ��� ������� ���� :2=< A��� E*#6E/",E/J�

!����� !� ���� H1� ������ @=� /00"� ! ) �*��3*����� ������( �� ������� �� ��� ��������� ��� ��� ���������� �� ) �* ������� �� ��������� ��������2(� )��� @�� /JE6/JJ,/%E�

=���� 5<� L���� @=� "#$3� !��������� �� ������������������� ������� / 9 !1 /; ���� ������������ � ������� ��� ������� �� ������� ���� ������ H )��� =���#J6"*/3,"*3"�

=�� � @� A�� 5� "##3� ��� ����� ������� �� �������K������������ ������ � ��������� ���������6 ������������ ��� ��� �������� �� (��� ������������� H7�������� J"6##%,"00*�

=�� � @� A�� 5� "##E� ����������� �������� � ���������� ����������� ��� ��� �� ��� �� ������� �� ���������� )��� ���� )����������� /$6"E3,"*E�

)����� L� 5������ � ������ @=� "##*� ? !1�$*6 ������� ������� ���� �������� ����������� ����� H7�������� JE6"/$$,"/#%�

)���� )� ������ @=� "##$� ��� ��������� �� ��������������� ���� �������� ������� �� ������� ������ 2(�)��� @�� /3#6/0/,/"3�

)���� ?� L�� )� ������ @=� "##3� ! ������� ��������������� ���� ������ ����� � ������������ �� ����� �� ��� ������� ���� ������ H )��� <�� "0*6*",J0�

)�������� ))� A������ 7� :���� A!� A� � H����1!� M���� M<� "##%� ������������������ ������� /����������� ���� ������������ � ������������ ���� ������� ���������� ���������� �� � �������� ��� ���������/$0� ������� ������ ���� ����� H )��� =��� "3J6$E*,$*%�

2������ +� 1����� M@� "#$0� ������������ ����������� ��� (������� ����(6 ����������� �� ����������������������� � ����� ������������ H )��� =��� $%6EJE,E%#�

:��� 5!� L�� )� ������ @=� "##/� <������ ������������� ����������� ������� �� � ��� ������������������ �� )��� =������ ""/6$",$$�

5������ � )����� L� ������ @=� "##$� ��� ����������� �� ���#0 ���� ������������ � ���� ������� ������ ���������� 2(� )��� @�� /3#6/E3,/*3�

5������ )� :��� 5� ������ @=� "##$� � ������� ���� �� � !��������K� ���� ������� ���������� ���� ������������� ���� ������������� )��� �� =��� EE6 """%,""/%�

5����� 7� �������� =� =����� H� � ����� 2 � � ������ 2� "##E� ?����� �� �� ������� � ��������������� ������������� =����������� 336#*"",#*//�

+����4��� H1� )����� L� ������ @=� "##*� <������������� �� �� ������� ���� ������������ � ����������� �� ������ ���� ������ )��� =������ :����"36/3#,/*0�

������� ! ��� ��" ��� $���� ����� ���

+�����7� <������8� ���� <� "#$$� �� ��������� ����������� ��������� � �� � �� ��� ��� �� �������������� H )��� =��� "0%6"EE#,"E*#�

������ @=� !����� H� "#$%� ��� ������������ �� ���� ������������� � ����������� �(��� �.��������?�)�6 '@A��(��� D��������� 1����� 3J% ���

������ @=� @��� )'� L�� H)� "#$$� ?�������������������� �� ��������� ����� �� ���� ��� ����(���������� ��������� ���� �� ������� ���� �������������������� ��������� 2 =� H %6"#*%,"#J3�

������ @=� L�� H)� ?�������� H� !��� H� "#$#� ! ������� ������ ��4����� ����� ������� ��� ��� ���� �� ��� !������� =������ =������ /%*6*J$,*%#�

������ @=� )����� L� "##*� @��� �� ������������������� �������� �� ��� ������� �� ����������� ��������� 1������ @�� %*6$3*,$JE�

������ @=� ���� )� )���� ''� ���� H1� /00"� ���������� ����� ) �*� <�������� ������� ����� �� ������������� � ����������� �� !��������K� ��������� 2�� H=������ /J$6"*"$,"*/%�

� �� )!� .���� MA� P� � !H� M����� �H� =�����. � /00"� ������� ��� �(����� � �� �� ������ ��������� �� ������������ ���� ������� � ������� ��������� ������������ ���� � �� =��� "J"6//#,/3#�

� ����� 2� � ����� 2 � "##*� ����������� � ������������������� ��������� )��� ���� )��� =���%6%/,$"�

��� ? � 7���� 1� 5��� � H� ������ @=� "##3� ! ��������� ��������� ���������� ��4����� �� ������� ���� �� ���� �������� H 7�������� J"6#%#,#$J�

���� @<� +���� <� /000� 1�������������� ���� ���������� �� ������������������� ������� !1/� �� ������� ������������� �� =��� )��� ""63*%3,3*$%�

1����� 5� 1����� 5� M�� 1� ����� 5� ������ @�Q����� <� :������ !� )����� !� "##$� 2�� ���� ��� ���

����������� �� ��� �������������� ) �* ������� 13* ����� ������������� (��� ������� H 7�������"$6#$*$,#$J#�

1� ����� =� )������ @� '��� M� "##E� '���������� ��������������������� ������� !1/ ���� ������������� � ���������� ������� � ���� ����� #J��������������� ���� ���� ����� ���������� =�����������336$%#$,$$0J�

1����� 5� 1����� 5� D��� A� !��� H� )����� !� "##%�!������ �� ��� �(��������� ����������� � �������� ��������� ���� ��� ����� * 9) �*; �� ��������� ���������� ������������ H )��� <�� ""06/*%,/%0�

<������ @:� "#$J� '��������� �� ������������������� ������� / ���� ���� �������� =����������� /*6/003,/00#�

<������� A� 5���� :� )���� )� "#%3� ����������������� �� ��� ������ �� � �������� ��� 1��� 7��!� <�� D < ! %06*/#,*3#�

L�� H)� "#$$� ��������� �� �������� 4�������� ��������� �� ����� ������� ����� ���� !�� =������"%E6"$%,"#J�

L�� =����� � :��� ���� 1� =����� H� +������ H� � ����� 2 � � ����� 2� /000� !������� �� ��������� ���� !�������� ���� ������ ������� ���� ��� ���� ��4����� ����� 9930J;LQ'L8M93"";; ���������� ���������� 1��� 7�� !� <�� D < ! #%6*"/#,*"3E�

.��7� 7���� M� <�������� ?� :�� ���� HH� ��������< � ������7��������� ' � 1���� �� ���( @� '����� ?2�/00"� ������� ������� �� ������ ����� ���������� ������� ���������� �� ��� 1��� 7�� !� <�� D < ! #$6%%J*,%%%0�

.���� ?� ������ !� @�������� H� �������� �H�"##%� !���� ������ �� ����� )��� ���� )��� =��� #6*E,J"�

��� *����� � ��)