A c t a Chi r . A u s t r i a c a • Vol . 3 3 • N o 6 • 2001 3 0 5

Aus der Klinik ftir Thorax-. Herz- und Gef~gchirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover, Deutschland

Transplantation von Adrenozyten als Alternative zur Hormonsubstitution bei Nebenniereninsuffizienz O. E. Teebken, E. MOssinger, Ph. He i tmann , H. Seeliger, J. K l e m p n a u e r und G. F. W. S c h e u m a n n

SchlasselwOrter: Adrenalin - adrenokortikal - Glomerulosa - Fasciculata - Hormone - Transplantation.

Keywords: Adrenal - adrenocortical - glomerulosa - f a s c i c u l a - ta - hormones - transplantation.

Zusammenfassung: Grundlagen: Als eine Alternative zur Steroidsubstitutionstherapie wurde die syngene Transplanta- tion von adrenocorticalen Zellpopulationen unter die Nieren- kapsel an LEWIS-Ratten untersucht. Methodik: Suspensionen von Glomerulosazellen (G-Tx), Fas- ciculatazellen (F-Tx) oder beiden Zellpopulationen (K-Tx) - erhalten dutch Dichtegradientenzentrifugation - wurden un- ter die Nierenkapsel adrenalektomierter Lewis-Ratten trans- plantiert. Plasma zur Messung von Aldosteron und Cortico- steron sowie 24-Stunden-Urin wurde nach 3, 30, 120 und 360 Tagen gewonnen. Ergebnisse: In allen Gruppen fanden sich vitale Zelltrans- plantate. Sogenannte Neocortices. mehrschichtig aufgebaute Transplantate, die der normalen Anatomie der Nebennieren- rinde entsprachen, liegen sich nut in den Gruppen G-Tx und K-Tx nachweisen. Plasma (Urin) Corticosteron sank von prfi- operativ 256 bis 304 ng/ml (226 bis 230 ng/Tag) auf halb so hohe Werte an Tag 3 und stieg anschlie6end ab Tag 30 wieder auf normale Werte (Daten angegeben als Spannweite). Plasma Aldosteronkonzentrationen betrugen 0,150-0,180 ng/ml in unbehandetten Ratten und sanken auf signifikant niedrigere Werte an Tag 30. Danach kam es in den Gruppen G-Tx und K-Tx zu einer Restitution prtioperativer Konzentrationen; in Gruppe F-Tx blieben die Werte signifikant erniedrigt. Schlu6folgerungen: Von der Zona glomerulosa abgeleitete Zellen bleiben vital, produzieren Aldosteron und Corticoste- ton und ffihren zur Bildung eines Neokortex mit Aufbau einer Zona glomerulosa und Zona fasciculata. Im Gegensatz dazu bleiben von der Zona fasciculata abgeleitete Zellen zwar vital, aber regenerieren keine Zona glomerulosa und produzieren kaum Aldosteron. Diese Beobachtungen bekr~iftigen die Zell- migrationstheorie. Die Transplantation yon Nebennierenrin- denzellen k6nnte in Zukunft eine physiologische Alternative zur Steroidsubstitutionstherapie bei der Behandlung yon Un- terfunktionszust~inden der Nebennierenrinde des Menschen darstellen.

(Acta Chir. Austriaca 2001; 33 :305 -311 '

Adrenocyte Transplantation as an Alternative to Hormone Substitution in Adrenal Insufficiency Summary: Background: To develop therapeutic alternatives to steroid hormone substitution after bilateral adrenalectomy, adre- nocortical transplantation was investigated in syngeneic rats.

Korrespondenzanschrift: Dr. O.E. Teebken, Klinik ftir Thorax-, Herz- und Gef~igchirurgie, OE 6210. Medizinische Hochschule Hannover, Carl-Neuberg-Strage 1, D-30625 Hannover, Deutsch- land. Fax.: ++49•51 15 32-54 04 E-mail: teebken @thg.mh-hannover.de

Methods: Celt suspensions of glomerulosa and fasciculata cells were obtained by density gradient separation. Rats were sacri- ficed following transplantation of glomerulosa cells (G-Tx), fas- ciculata cells (F-Tx), or both (K-Tx) under the kidney capsule after 30, 120. and 360 days. At day 3, 30. 120 and 360 after transplantation plasma samples and 24-hour urine were collected for measurement of corticosterone and aldosterone as well as so- dium and potassium levels. Results: In every explanted graft vital cortex cells were demon- strated. However. only group G-Tx and K-Tx animals showed neocortex-like structures. Plasma (urine) corticosterone de- creased from preoperatively 256-304 ng/ml (226-230 ng/d) in untreated animals to levels about half as high 3 days after trans- plantation and increased to normal values 30 days after treatment in all study groups (data given as range). Plasma aldosterone concentrations were 0.150-0.180 ng/ml in untreated rats, and de- creased significantly through day 30 in all groups. Afterwards, group K-Tx and G-Tx showed preoperative concentrations, how- ever levels in F-Tx remained significantly decreased. Conclusions: Our findings suggest that fresh zona glomerulosa cells are sufficient to regenerate the adrenal (neo-)cortex. In con- trast to zona fasciculata cells they facilitate both physiological corticosterone but also aldosterone blood levels alter transplanta- tion. According to the cell migration theory, pluripotent adreno- cytes from near the zona glomerulosa migrate centripetally to- wards the medulla and differentiate to fasciculata cells. From this study indications and implications for successful transplanta- tion of adrenocytes can be derived.

Einleitung Nach totaler bilateraler Adrenalektomie oder Funktionsverlust der Nebennieren ist eine lebenslange adrenocorticale Substi- tutionstherapie erfordertich. Diese ist auch heute noch bei 30 %-50 % der Patienten mit somatischen und psychischen StO- rungen verbunden (1). Bei Patienten mit adrenocorticaler Insuffi- zienz werden trotz mehrfach fraktionierter Gabe sowohl Addi- son-Krisen als auch Cushing-Syndrome beschrieben. Weitere Nachteile wie eine fehlende endogene StreBreserve k6nnten theoretisch durch eine Nebennierenautotransplantation umgan- gen werden. Klinische Versuche eines Organersatzes zur L6sung dieser Probleme haben bisher nur selten langfristig funktionsf~i- hige Transplantate hervorgebracht (14). In der Regel wurden da- bei mehr oder weniger gro6e Nebennierenanteile in eine Muskel- tasche, in die Milz oder unter die Nierenkapsel transplantiert. Unklar ist bis heute die genaue Herkunff der regenerationsffihi- gen Zellen sowie deren Potenz zur differenzierten Hormonbil- dung einschlieBlich der neuronalen oder humoralen Steuerungs- mechanismen (5, 21).

Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden Nebennieren- rindenzellen unter die Nierenkapsel syngenetischer adrenalekto- mierter Ratten transplantiert. Untersucht wurden insbesondere die Herkunft regenerationsffihiger Zellen (Zonentheorie versus Zellwanderungstheorie) und die Bedeutung der Bildung eines Neokortex ftir die physiologische Sekretion yon Corticosteron und Aldosteron mit und ohne vorangegangene Kulturperiode (6, 10, 30).

L~s. c,,pyri~,, cl ......... c ..... c,,d, s ........... 0 0 0 1 - 5 4 4 - X / 2 0 0 1 / 3 3 0 6 - 0 3 0 5 $ 1 5 . 0 0 / 0

306 Acta Chir. Aus t r iaca . Vol. 33 • No 6 - 2001

Material und Methoden Versuchstiere Verwendet wurden m~innliche Ratten des Inzuchtstammes LEWIS (RTI) aus den Zuchten des Zentralen Tierlaboratoriums der Medizinischen Hochschule Hanno~er (Leiter: Prof. Dr. med. vet. H.-J. Hedrich) im Gewicht yon 250 bis 340 g. Auf Einhal- tung der Empfehlungen des National Institute of Health (USA) zum Umgang mit Versuchstieren wurde geachtet (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH publication no. 85-23, revised 1985). Die Spendertiere wurden mit 0,8 ml/kg K6rpergewicht Hypnorm i.m. (10 ml enthalten 100 mg Fluani- son und 3,15 mg Fentanyldihydrogencitrat, Janssen, D - Neuss) narkotisiert. Empf~inger- und Scbeinoperationen wurden in Kom- binationsnarkose mit 80-100mg/kg K0rpergewicht Ketamin (Ketamin 10%, WDT, D -Garbsen l und 10mg/kg Xytazin (Xylapan, Chassot, D - Ravensburg) wirkungsabhS.ngig i.p. ap- pliziert durchgeftihrt.

Isolierung von Nebennierenrindenzellen Nach medianer Laparotomie und ln-situ-Perfusion tiber die Aor- ta mit 3 ml HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, Sigma, St. Louis, USA), die Kollagenase (3 mg/ml) (Worthington Bioche- mical Corporation, Freehold, USA) enthielt, erfolgte die Explan- tation beider Nebennieren. Sie wurden vom Fett und vonder Kapsel befreit, und nach der Entfernung des Nebennierenmarkes mit einem Skalpell zerkleinert. Jeweils 10 zerkleinerte Nebennie- ten wurden 1 min bei 150 g in HBSS zentrifugiert. Das Sediment wurde mit 5 ml Kollagenase (2 mg/ml) und DNAse (0,2 mg/ml) (Boehringer Mannheim) versetzt und im Schtittelbad (Julabo SW I, Heizung Julabo PC. Julabo Labortechnik GmbH) bei 37 °C inkubiert. Nach 20 min wurde die Suspension durch ein 125-gm- Nylonnetz (Tetko Co., Freehold, USA) gefiltert. Danach wurden die Zentrifugenrtihrchen mit 4°C kalter HBSS aufgeftillt und zweimal 20 rain bei 400 g bei einer Temperatur von 4 °C zentri- fugiert. Anschlie6end wurden die sedimentierten Zellen mit Hilfe eines Percoll-Dichtegradienten (Pharmacia LKB, Bio- technology AB, Uppsalla, Schweden) in einer Modifikation der von Roskelley und Auersperg beschriebenen Technik getrennt (Abb. 1) (23). Zur Schtitzung der Dichte der Zellen in der jewei- ligen Bande wurden Dichte-Marker-Kugeln (Pharmacia) verwen- det. Die einzelnen Zellschichten wurden separat abpipettiert und durch mehrmaliges Waschen vonder Percoll-L6sung gereinigt.

Transplantation Nach medianer Laparotomie und bilateraler Adrenalektomie wurde die linke Niere exponiert (Gruppen N, K-Tx, G-Tx, F-Tx). Fiir die Transplantation wurden die Zellen in 100 gl HBSS sus- pendiert, mit Hilfe einer Verweilkanale (Abbocath, Abboth Hos- pitals, North Chicago, USA) zwischen der Capsula fibrosa und dem Nierenparenchym plaziert. Bei scheinoperierten Tieren er- folgte lediglich eine mediane Laparotomie, die Mobilisation der Bauchorgane und die Installation von 0,18 ml HBSS unter die Nierenkapsel (Gruppe N, n = 20). Alle Versuchstiere erhielten einmal direkt postoperativ 0,01 mg Decadron-Phosphat 20 mg (Dexamethason-21-dihydrogenphosphat, Dinatriumsalz, MSD Sharp & Dohme GmbH, Manchen) s.c. und 4 ml physiologische Kochsalzl6sung i. p.

Zur Kontrolle der Transplantatfunktion diente die Bestimmung yon Natrium-, Kalium-, Corticosteron- und Aldosteronkonzen- trationen im Plasma und im 24-Stunden-Urin. Am Tag vor der Transplantation (Tag 0) und den Tagen 3, 30, 120 und 360 post operationem erfolgte die Sammlung des 24-Stunden-Urins und jeweils eine Blutabnahme aus dem rechten retrobulb~iren Venen- plexus. In den Gruppen K-Tx, G-Tx und F-Tx wurden jeweils 20 Tiere transplantiert. Nach 30 Tagen wurde bei 6 Tieren, nach 120 und 360 Tagen bei je 7 Tieren einer Gruppe die linke Niere mit dem unter der Nierenkapsel lokalisierten adrenalen Trans- plantat entfernt und histologisch untersucht. Ftir die Messung der Hormon- und Elektrolytkonzentrationen wurden jeweils alle am Beobachtungstag vefftigbaren Tiere herangezogen, also in jeder Gruppe 20 Tiere an den Tagen 0, 3 und 30, je vierzehn Tiere an

Abb. 1. Zellbanden nach Dichtegradientenzentrifugation. Bande 2 enthiilt Fasciculata (FASC) und Bande 7 Glomerulosazellpopulatio- pren (GLOM).

Tag 120 undje 7 Tiere an Tag 360. Die ftir die Einbettung in Pa- raffin vorgesehenen transplantattragenden Rattennieren wurden nach 24sttindiger Fixierung mit Bouinscher L6sung in Isopro- panol (70 %) gelagert.

Radioimmunoassay Die Messung der Corticosteron-Konzentration erfolgte mit einem Radioimmunoassay, der unter Mitarbeit von Schiirmeyer (ehem. Abteilung far Klinische Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover) entwickelt wurde. Der Aldosteron-Radio- immunoassay wurde yon der Firma H. Biermann GmbH Diagno- stica, Bad Nauheim, bezogen.

Statistik Die Tabellen zeigen die Ergebnisse als Mittelwert _+ Standardab- weichung. Die Mittelwerte einzelner Gruppen wurden mit dem parametrischen Student t-Test far unverbundene Stichproben auf signifikante Unterschiede untereinunder hin aberpraft. Far Ver- gleiche zwischen Werten verschiedener Tage innerhalb einer Gruppe wurde der t-Test far verbundene Stichpropen verwendet. Die Berechnungen sowie die Prtifung auf Vorliegen der Normal- verteilung (Kolmogorov-Smimov-Anpassungstest) wurden mit dem Programm SPSS 10.0 fur Windows durchgefahrt. Die Null- hypothese wurde bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von gleich 5 % (p < 0,05) verworfen und die so geprtiften Daten als signifi- kant bezeichnet. Far Corticosteron- und Aldosteronkonzentra- tionen wurden die Ergebnisse zustitzlich in den Tab. l a - c bis Tab. 4a-c erfa6t.

A c t a Ch i r . A u s t r i a c a • Vo l . 3 3 • N o 6 • 2001 3 0 7

7~tb. la. Cortico.wemnkottzetttratiott ilt ~tq/I tm Blutl)laxma nach Transplantation yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte +_ Stan- dardabweichunq,).

Tag

0

3

30

t20

360

K-Tx

256,1 _+ 73,85

135,2 _+ 42,93

238,5 _+ 68,94

225,3 _+ 76,93

211,2 _+ 65,15

G-Tx

273.7 + 91.02

178.9 _+ 47.79

228,4v _+ 66.03

298,7 ± 77.17

236,3 ± 76.31

F-Tx

305,0 _+ 81.54

20% I _+ 55,88

244,7 _+ 59,88

160,1 _+44,99

263,1 _+ 65,82

Tab. 2a. CorticosteronkoJtzentration in ng/I im 24-Stunden-Urin nach Transl)lcmtatiopl v(m Nebennierenritzdenzellen (Mittelwerte ++. Standardabweichttng ).

Tag K-Tx G-Tx F-Tx

0 227,0 + 66,15 229.7 _+ 72,65 225,5 + 63,89

3 112,0 + 35,80 69,93 _+ 21,09 78,90 -+ 25,40

30 204,1 _+ 51,22 195,6 + 55,68 217,7 _+ 65,00

120 198,2 + 55,46 196,5 -+ 60,01 208,7 + 55,26

360 238,1 _+65,84 189.4_+49,91 220,4_+54,57

~zb. 2b. Corticosteronkonzentration in ng/l im 24-Stunden-Urin nach Transl)lantation yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte + StandaJzlabweichung). Dasselbe Tier; verschiedene Tage.

Tage K-Tx G-Tx [ F-Tx

0; 3 < 0,0001 0,0003 0,0001

0; 30 0,6948 0,0872 0,0134

0; 120 0.2152 0,3665 < 0,0001

0; 360 0,0538 0,1784 0,0899

3; 30 < 0,0001 0,0117 0,0655

3; 120 0.0001 < 0,0001 0,0050

3; 360 0.0001 0,0084 0.0096

30; 120 0,5816 0,0045 < 0,0001

30; 360 0,2173 0,7341 0,6803

120; 360 0.5448 0,0166 < 0,000l

Tab. lb. Corticosteronkonzentration in ng/l Transl)lantation yon Nebennierenrindel :ellen dardabweichung). Dasselbe Tier

Tage K-Tx

0; 3 < 0.0001

0:30 0,4376

0; 120 0,1547

0; 360 0,6066

3:30 < 0,0001

3; 120 < 0,0001

3:360 < 0,0001

30:120 0,7353

30; 360 0,0839

120; 360 0,0506

Statistik: t-Test, 2seitig, p-Werte.

verschiedene

G-Tx

< 0,0001

0.1134

0.1332

0.0539

< 0.0001

< 0.0001

< 0,0001

0.9637

0,7203

0.696i

im BhltRlasma nach (Mittelwerte +_ Stan- Tage.

F-Tx

< 0,0001

0,7096

0,3898

0,7899

< 0,0001

< 0,0001

< 0,0001

0,6475

0,1026

0.5159

Tab. lc. CorticosteronkonTentration in t ed im Blutplasma nach Transplantation yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte -4:- Stan- dardabweichung). Dieselbe Gruppe, verschiedene Tage.

Tiere Tag 0 Tag 3 Tag 30 Tag 120 Tag 360

K-Tx; G-Tx 0 ,9051 0 , 0 0 0 1 0 ,6281 0,9275 0,0144

K-Tx: F-Tx 0,9463 0,0022 0 , 4 7 8 6 0,5636 0,3721

G-Tx; F-Tx 0,8532 0,2435 0,2682 i 0,5190 0,0763

Statistik: t-Test, 2seitig, p-Werte.

Statistik: t-Test, 2seitig. p-Wcrte.

Tab. 2c. Corticosteronkonzentration in ng/l im 24-Stunden-Urin nach Transplantation yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte +_ ;tandardabweicl tng) Dieselbe Gruppe, verschiedene Tage.

Tiere Tag 0 Tag 3 Tag 30 Tag 120 Tag 360

K-Tx; G-Tx 0,5184 0,0052 0,6475 0,0056 0,2818

K-Tx; F-Tx 0,0605 0,0048 0,4532 0,7665 0,2350

G-Tx; F-Tx 0,2712 0,0810 ] 0,4288 < 0,0001 0,2530

8tatistik: t-Test. 2-seitig. p-Werte.

Ergebnisse Dichtegradientenzentrifugation Nach Zentrifugation der Zellsuspensionen tiber den diskontinu- ierlichen Dichtegradienten wurden sieben Zellbanden sichtbar (Abb. 1). Aufgrund der morphologischen Charakteristika wurden die Zellen der Bande 2 im weiteren ats Fasciculatazellen (Dichte 1,034 + 0,003 g/ml) und die der Bande 7 als GIomerulosazellen (Dichte: 1,061 + 0,001 g/ml) bezeichnet (23).

Transplantation adrenocortikaler Zeilen Insgesamt wurden 60 Nebennierenrindenzelltransplantationen in den Gruppen K-Tx, G-Tx und F-Tx sowie 20 Scheinoperationen durchgeftihrt. Wtihrend des Beobachtungszeitraumes starb kein Tier. Die K6rpergewichte der Tiere aus den verschiedenen Ver- suchsgruppen unterschieden sich an den Tagen 0, 30, 120 und 360 nicht signifikant von jenem der gleichaltrigen scheinoperier- ten Normaltiere mit 2 Nebennieren.

Volumina des 24-Stunden-Urins Drei Tage nach Transplantation land sich bei allen Versuchstie- ren ein, verglichen mit Tag 0 (ca. 15 ml/d), um etwa 5 ml erh6h- tes 24-Stunden-Urinvolumen (signifikant erh6ht in der Gruppe F-Tx). An Tag 30, 120 und 360 war das Urinvolumen wieder auf prfioperative Werte zurtickgegangen,

Corticosteron im Blutplasma und im 24-Stunden-Urin Corticosteron im Blutplasma (Urin) fiel yon prfioperativ 256 bis 304 ng/ml (226 bis 230 ng/Tag) in unbehandelten Tieren auf die H~lfte an Tag 3 ab (Tab. l a - c und 2a-c). Nach 30, 120 und 360 Tagen wurden in allen Gruppen wieder normale Werte er- reicht.

AIdosteron im Blutplasma und im 24-Stunden-Urin Nicht adrenalektomierte Ratten wiesen Plasma-Aldosteron- konzentrationen von 0,15 ng/ml bis 0,18 ng/ml auf. Drei Tage nach der Transplantation war Aldosteron nur im Plasma der K-Tx-Ratten nachweisbar (0,011 ng/ml) und auch 30, 120 und 360 Tage danach wurde das Mittel der Ausgangswerte nut von Tieren aus den Gruppen der K-Tx- und G-Tx-Ratten erreicht. Bei F-Tx-Tieren stieg Aldosteron w~,hrend des Beobachtungs- zeitraumes hie tiber 0,035 ng/ml. Im 24-Stunden-Urin (prfiopera- tiv 296-303 ng/Tag) wurde am dritten Tag nach der Transplanta- tion in allen F~illen signifikant weniger Aldosteron als an den anderen Tagen gemessen (Tab. 3 und 4). Nach 30 Tagen wurden bei K-Tx- und G-Tx-Ratten etwa halb so hohe Werte wie zum Zeitpunkt vor der Transplantation beobachtet, ab Tag 120 waren pr~ioperative Werte erreicht. In der Gruppe F-Tx wurden zu kei- net Zeit nach Transplantation wieder normale Aldosteronkonzen- trationen erreicht (Maximum 139 ng/Tag an Tag 120).

308 Ac ta Chir. A u s t r i a c a . Vol. 33 - No 6 • 2001

Tab. 3a. Aldosteron in ng/l im Bhttt~lasma nach Transphmtation yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte +- Standardabwei- chunk,,).

Tag K-Tx G-Tx F-Tx

0 0,180+_0,053 0,160+-0.043 0,150+-0,042

3 0,011 +- 0,296 0 0

30 0,122 +- 0,029 0,104 +_ 0,026 0.028 +- 0,010

120 0,178+0,038 0,159+0.045 0,019 + 0,006

360 0,178 +- 0,049 0,127 + 0.046 0,033 + 0,007

Tab. 3b. Aldosteron in ng/I im Bluq~lasma nach Transplantation yon Nebennierenrindenzellen (MittelwelTe + Standardabweichung). Dasselbe Tie~ verschiedene Tage.

Tage K-Tx G-Tx I F-Tx

0; 3 < 0,0001 < 0.0001 ] < 0,0001

0:30 0,0008 < 0,0{301 < 0,0001

0; 120 0,8864 0,9215 < 0,0001

0:360 0,9248 0.0273 < 0,0001

3; 30 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

3; 120 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

3; 360 < 0,0001 < 0.0001 < 0,0001

30; 120 < 0,0001 < 0,000! 0,0020

30; 360 0,0001 0,0636 0,0005

120; 360 0,9673 0,0364 < 0,0001

Tab. 4a. Aldosteron in ng/I im 24-Stunden-Urin nach Transplanta- tion von Nebennierenrinden-ellen (Mittelwerte + Standardabwei- chung).

Tag K-Tx G-Tx F-Tx

0 302,89 + 75,93 298,84 _+ 70,42 296,25 + 76,99

3 140,68+39,62 118,96_+42,42 101,37+29.81

30 200,15 + 47,69 208,16 _+ 45,60 90,72 + 29,43

120 250,75 + 75,84 265,58 _+ 74,83 139,41 + 45,49

360 262,44 + 78,91 273,34 _+ 76,91 137,94 + 38.39

Tab. 4b. Aldosteron in ng/l im 24-Stunden-Urin nach Transplanta- tion von Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte + Standardabwei- chung). Dasselbe Tier, verschiedene Tage.

Tage K-Tx G-Tx F-Tx

0; 3 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

0:30 0,0002 < 0,000 l < 0,0001

0; 120 0,0408 0,1664 < 0,0001

0; 360 0,1157 0,2932 < 0,0001

3; 30 0,0002 < 0,0001 0,2745

3; 120 < 0,0001 < 0,0001 0,0042

3; 360 < 0,0001 < 0,0001 0,0022

30; 120 0,0185 0,0069 0,0004

30; 360 0,0055 0,0029 < 0,000 l

120:360 0.6442 0.7541 0.9148

Statistik: t-Test. 2seitig, p-Werte.

T~zb. 3c. Aldosteron in ng/l im Bhaplasma nach Transplantation yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte + Standardabweichung). Dieselbe Gruppe, verschiedene Tage.

Tiere Tag 0 Tag 3 Tag 30 Tag 120 Tag 360

K-Tx; G-Tx 0,2253 < 0,0001 0 ,0491 0,1765 0,0019

K-Tx; F-Tx 0,0585 < 0,0001 <0,0001 <0,000l <0,0001

G-Tx; F-Tx 0,4473 < 0,0001 < 0.0001 < 0,0001 < 0,0001

Statistik: t-Test, 2-seitig, p-Werte.

Statistik: t-Test, 2seitig. p-Werte.

Tab. 4c. Aldosteron in ng/l im 24-Stunden-Urin nach Transplanta- tion yon Nebennierenrindenzellen (Mittelwerte + Standardabwei- chung). Dieselbe Gruppe, verschiedene Tage.

Tiere [ Tag 0 Tag 3 Tag 30 Tag 120 Tag 360

K-Tx; G-Tx 0,8655 0 ,1111 0,5999 0,5477 0,6687

K-Tx; F-Tx 0,7904 0,0014 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

G-Tx; F-Tx 0,9143 0,1476 < 0,0001 < 0,0001 <0,0001

Statistik: t-Test, 2-seitig, p-Werte.

Natrium- und Kaliumkonzentrationen im 24-Stunden-Urin Drei Tage postoperativ land man verglichen mit Tag 0 (3 600 bis 4 000 retool/l) in allen Gruppen bis auf G-Tx und scheinoperier- ten Tieren signifikant erh6hte Natriumkonzentrationen (4 300 bis 5 300 retool/l) und die Kaliumausscheidung war signifikant er- niedrigt (pr~ioperativ 1 600 bis 2 400 mmol/l gegentiber 800 bis 1 400 retool/l). Anschlie6end wurden nut in wenigen F~illen signifikante Unterschiede im Vergleich zu pr~ioperativen Kon- zentrationen gemessen.

Morphologie von Nebennierenrindenzelltransplantaten In allen 3 Gruppen zeigten sich nach 30. 120 und 360 Tagen, vitale Transplantate im subkapsul~ren Raum. Als Hinweis auf eine eher geringe Proliferationstendenz konnten Mitosen nut in Einzelf'zillen beobachtet werden. Auch wurden interstitielle Zel- len und Bindegewebe nur selten und Nervenstrukturen in der Lichtmikroskopie gar nicht angetroffen.

Am Tag 30 post transplantationem waren die Transplantate aller Gruppen organisiert und vollst~ndig durchblutet. Zellen konnten nur schwerlich anhand ihrer Morphologie als yon einer bestimmten Zone stammend differenziert werden. Das Nieren- parenchym war gut gegen das Transplantat abgrenzbar, ebenso wie die Nierenkapsel. Deutlich waren in das Transplantat ein- sprossende Kapillaren zu erkennen. Eine Kortexstruktur konnte zu diesem Zeitpunkt noch nicht nachgewiesen werden. Granulo-

zyten, Lymphozyten und Makrophagen sowie Fibroblasten und auch H~mosiderineinlagerungen fanden sich nur sehr vereinzelt innerhalb des Transplantates.

Am Tag 120 post transplantationem lag das Transplantat in allen untersuchten Prfiparaten gut abgrenzbar zwischen der leicht verdickten Nierenkapsel und dem Nierenparenchym. Die trans- plantierten Zellen waren zu diesem Zeitpunkt in vornehmlich tra- bekul~iren, sfiulenf6rmigen Strukturen angeordnet und hatten, unabh~ingig v o n d e r ursprtinglich transptantierten Zeltart, also auch in den Gruppen K-Tx und G-Tx, ein den Zellen der Zona fasciculata ~hnliches Aussehen oder waren keiner Zellart mor- phologisch zuzuordnen (Abb. 2). Makrophagen, Granulozyten und Lymphozyten waren nicht mehr im Bereich der transplan- tierten Zellen nachweisbar. In einzelnen Transplantaten der Gruppen K-Tx und G-Tx lie6en sich neokortexartige Strukturen erkennen.

An Tag 360 zeigten die Gruppen K-Tx und G-Tx einen struk- turierten Aufbau innerhalb des Transplantates mit sfiulenf6rmig angeordneter Blutgeffi6versorgung und Neokortex. Als Neo- kortex wurden Transplantate gewertet, die im Bereich des Transplantates sowohl Zellen mit der Zona glomerulosa als auch der Zona fasciculata entsprechender Morphologie aufwiesen (Abb. 3). Die Zellen der neuen Zona glomerulosa waren in rund- lichen Knfiueln in unregelm~iBigen eif6rmigen Gruppen angeord- net. Sie batten runde stark gef'~rbte Zellkerne, wenig Zytoplasma

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Abb. 2. Fasciculata-Zelltransplantat, Gruppe F-Tx, 120 Tage. Das Transplanmt ist uniform, eine morpholo~ische Zuordnung der Zellen zu einer bestimmten Zone ist nicht mSglich. Hgimatoxvlin-Eosin-Fgir- bung, VergrSflerung 200fach.

und waren in fiber 90 % der Ffille direkt unter der Capsula fibrosa der Niere und selten im Bereich yon Narbengewebe zu finden. Die Zellen der neuen Zona fasciculata waren in parallelen Strfin- gen senkrecht zur Nierenkapsel angeordnet. Sie bildeten die brei- teste Schicht des neu organisierten Transplantatkomplexes und

wurden durch Bindegewebsstrfinge mit Sinusoiden voneinander getrennt. Eine Zona reticularis, charakterisiert durch unregelm/,i- Big und dicht aneinander gelagerte Gruppen von Zellen, die durch zahlreiche weite Sinusoide voneinander getrennt wurden, konnte nicht sicher abgegrenzt werden. Eine Neokortexstruktur konnte bei der Gruppe F-Tx nicht nachgewiesen werden.

Diskussion Die theoretische Indikation zur Nebennierenrindentransplan- tation nach bilateraler Adrenalektomie oder vollstiindigem Funktionsverlust ergibt sich aus der bislang im Gegensatz zur Situation bei anderen Organsystemen wie beispietsweise der Schilddriise nur bedingt physiologisch applizierbaren Hormon- substitution und dem Wunsch nach einem ad~iquat funktions- fiibigen Organersatz, der dem Patienten die notwendigen Hor- monspiegel (Abwendung yon Addison-Krisen oder Cushing Syndrom), aber auch entscheidende Reserven, z.B. in Stre6si- tuationen, bietet. Zur Weiterentwicklung und Verbesserung yon Zellautbereitung und Transplantationstechnik sind vor ihrer kli- nischen Anwendung tierexperimentelle Untersuchungen unerl~t3- lich.

Die Identifizierung und Eliminierung nicht adrenocorticaler Zellen und die Gewinnung reiner Glomerulosa- und Fascicula- tazellpopulationen wurde mit Hilfe der Dichtegradientenzentri- fugation in einer nach Roskellev und Auersperg modifizierten Technik durchgeffihrt (23). Ein entscheidender Vorteil dieser Trennmethode ist die nahezu vollstfindige Entfernung von Verun- reinigungen wie Erythrozyten, Nebennierenmarkzellen, aber auch Bindegewebszellen, die sich sowohl in der Kultur als auch

Abb. 3. Glomerulosa-Zelltransplantat. Neokortex, Gruppe G-Tx, 360 Tage. (A) Unter der Kapsel (linker oberer Bildrand) dhnlich den Glomerulosazellen kniiuelartig angeordnete Zellen, in der unteren Bildhgilfie sind parallel angeordnete Fasciculata-Zellstrginge erkennbar; VergrOJ3erung 140fach. Die Ausschnitte -eigen Zellgruppen, die morphologisch Glomerulosazellen (B) und Fasciculatazellen (C) entsprechen. Hgimatoxylin-Eosin-Farbung, Vergr6flerung 350fach.

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nach Transplantation st&end auswirken t12). Weitere Sicherheit beztiglich der Herkunft der Zellpoputationen ergab der Vergteich mit Daten zur Morphologie, Steroidsekretion aus der Literatur und die ln-situ-Hybridisierung (7, 13, 24.25.32).

Ffir die einfache Durchfiihrbarkeit der Transplantation mit die- ser Technik spricht die niedrige perioperative Letalidit von 0 %. Im Gegensatz dazu wird beispielsweise in einer experimentellen Studie zur Transplantation yon fetalem Nebennierengewebe in das Omentum maius yon Wistar-Ratten mit zweizeitiger bilatera- ler Adrenalektomie aus dem Jahre 1993 eine Letalittit von 70 % angegeben (27). Nach der Operation gab es keine signifikanten Unterschiede in der Gewichtsentwicklung der scheinoperierten Tiere und der Transplantatempffinger. Hingegen betrug in Vor- versuchen die Mortalit~it 20 Tage nach bilateraler Adrenalekto- mie ohne zuslitzliche Therapie I00 %. Daher wurden in der hier dargestellten Studie keine adrenalektomierten Kontrollen aufge- ffihrt, wobei durch sorgftiltige Obduktionen ektopes und verblie- benes Nebennierenrindengewebe ausgeschlossen wurde.

Die Corticosteronsekretion war unabh~ngig yon der transplan- tierten Zellart und ausnahmslos in allen Gruppen (K-Tx, G-Tx, F-Tx) zu finden. Physiologische Corticosteronkonzentrationen im Plasma und im Urin wurden erstmals an Tag 30 gefunden und blieben fiber den gesamten Beobachtungszeitraum yon einem Jahr bestehen. Jene Tiere, die nut Fasciculatazellen (F-Tx) er- hielten, wiesen jedoch auch nach 30, 120 und 360 Tagen noch keine normalen Aldosteronspiegel sowohl im Plasma als auch im Urin auf. Wie aber konnten in dieser Gruppe normale Elektrolyt- konzentrationen ffir Natrium und Kalium im Urin erreicht wet- den? Gibt es andere Hormone mit mineralocorticoider Potenz? Das 19-nor-Desoxycorticosteron, ein Mineralocorticoid mit 1,5 bis 5,1 facher Aktivitfit yon Deoxycorticosteron, k6nnte den Aus- fall des Aldosteron nach Transplantation yon Fasciculatazellen kompensieren (9). Cytochrom P-4501113 B3 katalysiert zusfitzlich zur enzymatischen Funktion des Cytochrom P-450~13 die Um- wandlung yon Corticosteron in 18-Hydroxy-Corticosteron, wel- ches ein potentieller Vorltiufer im Syntheseweg des Aldosteron mit mineralocorticoider Wirkung ist (15, 17). Es ist denkbar, dab der Aldosteronmanget mit seinen Fotgen far den Elektrolyt- und Wasserhaushalt einen Stimulationsreiz for die Synthese des Cy- tochrom P-450~ q3 B3 darstellt. Das Fehlen der Nervenversorgung und der Zellen bzw. der Produkte des chromaffinen Nebennieren- marks in den Transplantaten k6nnte der Grund ffir eine unzurei- chende Stimulierung unter Basalbedingungen sein. Es gibt mor- phologische Hinweise auf eine m6gliche parakrine Rolle von chromaffinen Zellen bei der Steroidsekretion und beim kompen- satorischen Wachstum (4, 8). Einige Autoren gehen davon aus, da6 ffir die Erhaltung eines Corticosteron-Tagesrhythmus oder die Beantwortung von Stressoren eine Innervation der Nebennie- renrinde dringend notwendig sei (21). Bei ltingerer Beobach- tungszeit kann abet auch nach Transplantation eine Tagesrhyth- mik nachgewiesen werden (18). Auch konnte nachgewiesen werden, dab vaskularisierte Nebennierentransplantate sofort zu rhythmischen Steroidsekretionsmustern fahig sind (26). In dieser Arbeit wurden keine Messungen yon Zona-reticularis-Hormonen durchgeffihrt, da diese bei m~innlichen Ratten mehrheitlich in den Testes gebildet werden.

Nach Autotransplantation von Nebennierenfragmenten unter die Nierenkapsel land Borst in 82,5 %, wie auch andere Untersu- cher, eine Regeneration von Nebennierengewebe mit Bildung eines Neokortex (3, 5, l 1, 19, 28, 31). Im Gegensatz zu der hier vorliegenden Arbeit wurden jedoch Nebennierenfragmente und keine adrenalen Zellsuspensionen implantiert. Dennoch impo- niert die grundsg.tzlich 5.hnliche Art der Regeneration: Auch bei Transplantation yon adrenalen Zellsuspensionen kommt es in allen Gruppen zur voriibergehenden Ausbildung eines einheit- lichen Kortex, der nach etwa 3 Monaten in einen gegliederten Kortex fibergeht, vorausgesetzt die transplantierte Suspension enthielt auch Glomerulosazellen. Die erhobenen Befunde erhtir- ten die Zellwanderungstheorie. Danach geht die Entwicklungs- stufe der Glomerulosa- und Fasciculatazellen oder allgemein der Nebennierenrindenzellen parallel mit ihrer anatomischen Loka- lisation in vivo. Die Differenzierungsm/3glichkeiten erscheinen

um so eingeschrankter, je mehr sich die Zelle einer zentralen Position nfihert. Es kann daher vermutet werden, dal3 es sich bei den Glomerulosazellen um Zellen handelt, die gem~13 der Zell- wanderungstheorie als Vorstufen der weiter innen gelegenen Zona fasciculata (Fasciculatazellen) anzusehen sind (10, 20). In-vivo-Markierungs- und Enukleationsstudien unterstiJtzen diese Theorie (33). Andere Autoren hingegen widersprechen ihr und geben der Zonentheorie (zonal theory) den Vorzug (6, 30). Mitani et al. beschrieben 1994 eine zwischen Zona glomerulosa und Zona fasciculata gelegene 5 bis 10Zellen umfassende Schicht, die weder Aldosteron Synthase (Cytochrom P-450 aldo) noch andere Isoenzyme des Cytochrom P-450~6 enthielt (16). Nach radioaktiver Markierung der Zellkerne der Nebennieren- rinde mit 5-Brom-2'-Deoxyuridin beobachtete Mitani eine Wan- derung der Zellen aus der Gegend der enzymfreien Zone in die inneren Schichten der Zona fasciculata Richtung Nebennieren- mark, nicht jedoch in Richtung der Zona glomerulosa. Da sie zu- dem nach kochsalzarmer Digit eine Verbreiterung der Zona glo- merulosa und eine Verschm~ilerung der neuen Schicht feststeltte, schlo6 sie daraus, dab es sich um eine Stammzellschicht han- delte. Eine andere Interpretationsm6glichkeit dieser Ergebnisse ist die, dab die adrenocorticalen Zellen auf ihrer Wanderung von der Zona glomerulosa Richtung Nebennierenmark in der Phase der Umdifferenzierung zur Fasciculatazelle ihre enzymatischen F~thigkeiten verlieren und eine transitorische Zone bilden. Die Zellzunahme in der Zona glomerulosa infolge der Kochsalz- Restriktion w~ire dann Ausdruck eines erh6hten Aldosteronbe- darfs, einer verstS.rkten Expression des Aldosteron produzieren- den Typs des Cytochrom P-450 und einer verlangsamten Weiter- entwicklung der Glomerulosazelle tiber die transitorische Zone zur Fasciculatazelle. Die Ursache der Gr66enzunahme der Zona glomerulosa lfige dann nicht, wie von Mitani vermutet, in den Zellen einer Stammzellschicht, sondern in den Zellen der Zona glomerulosa selbst als Ausdruck der Zellproliferation auf einen Proliferationsstimulus. Welcher Mechanismus liegt dieser Trans- formation zugrunde? Neville et al. und Hornsby et al. haben eine Theorie ver6ffentlicht, die auf der GefSBversorgung der Neben- niere basiert. Die Nebennierenarterien bilden vonde r KapseI ausgehend ein Gef56netz, das zuniichst die Zona glomerulosa versorgt. Von dort fliel3t das Blut in Kapillaren und Sinusoiden zentripetal an den Zellstiulen der Zona fasciculata entlang, er- reicht die Zona reticularis, spiiter das Nebennierenmark und sam- melt sich in der grogen Zentralvene (18). Da die Corticosteroid- konzentration in der Nebennierenvene etwa 100-mal h6her ist als im arteriellen oder im ven6sen Mischblut, ist zu erwarten, da6 auch innerhalb der Nebennierenrinde ein steiler Steroidkonzen- trationsgradient herrscht, das hei6t, eine niedrige Konzentration in der Zona glomerulosa und eine hohe in der Zona reticularis. Darfiber hinaus wfiren parakrine Mechanismen wie beispielswei- se das lokale Renin-Angiotensin-Aldosteron-System oder eine rezeptorgesteuerte Zelldifferenzierung zu diskutieren (2).

Die Studie ergab wichtige Informationen bezfiglich der Zell- auswahl (Zona glomerulosa). Unsere Ergebnisse bekraftigen die Zellwanderungstheorie. Durch die syngene Stammkombination konnten die Bedingungen und Konsequenzen ffir die Transplan- tate festgelegt werden. Wir sind uns der Tatsache bewu6t, dab die tiberwiegende Mehrheit der Patienten, die einer Corticoid- substitution bedarf, mit oralen Standardtherapien ein normales Leben fiihrt. Nichtsdestoweniger k6nnten Fortschritte in der Rei- nigung, Charakterisierung und Immunrnodulation zu einer Aus- weitung der Indikationen, beispielsweise Retransplantation von gesundem in Zellkulturen expandierten Gewebe nach Entfernung maligner Tumoren oder auch Allo- oder Xenotransplantationen, ffihren (22, 29).

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119. Kongress der Deutschen Gesellschaft fiir Chirurgie

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ICC Berlin 7. bis 10. Mai 2002 Digitale Revolution in der Chirurgie Prof. Dr. med. J. R. Siewert, Mtinchen Kongressbtiro Tel.: ++49/89/4140-66 00, Fax: ++49/89/41 40-66 01, E-Mail: info@chirurgie2002.de, Intemet: http://www.chirurgie2002.de

43. Osterreichischer Chirurgenkongress - Jahrestagung der Osterreichischen Gesellschaft fiir Chirurgie

Ort: Termin: Leitthema: Kongresspr~isident: Kongresssekretiir: Information:

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Wien-V6sendorf, Event und Congress Center 30. Mai bis 1. Juni 2002 Interdisziplin~ires Management Prof. Dr. R. Schiessel

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