The apoptogenic response of human myeloid leukaemia cell lines and of normal and malignant...

10
126 q 2001 Blackwell Science Ltd The apoptogenic response of human myeloid leukaemia cell lines and of normal and malignant haematopoietic progenitor cells to the proteasome inhibitor PSI Davide Soligo , 1 Federica Servida, 2 Domenico Delia, 3 Enrico Fontanella, 3 Giuseppe Lamorte, 2 Lorenza Caneva, 2 Rossella Fumiatti, 2 and Giorgio Lambertenghi Deliliers 1 1 Bone Marrow Transplantation Unit, I.R.C.C.S., Ospedale Maggiore and University of Milan, 2 Fondazione Matarelli, Ospedale Fatebenefratelli e Oftalmico, Milan, 3 Istituto Nazionale Tumori, Experimental Oncology Department, Milan, Italy Received 2 August 2000; accepted for publication 27 November 2000 Summary. Degradation of several intracellular proteins involved in cell cycle control and tumour growth is regulated by the ubiquitin-dependent multicatalytic pro- tease complex proteasome). We report that proteasome inhibitor Z-Ile-GluOtBu)-Ala-Leucinal PSI) was cytotoxic on most human myeloid leukaemia cell lines at IC 50 doses ranging from 5 to 25 nmol/l. Additionally, PSI pre- treatment enhanced cytotoxicity by taxol and cisplatinum. PSI was more active on leukaemic than on normal CD34 1 bone marrow progenitors because the 50% growth inhib- ition of colony-forming unit granulocyte macrophage CFU- GM) from cases of chronic myelogenous leukaemia CML) and normal subjects was achieved by 15 nmol/l and 50 nmol/l PSI respectively. PSI killed cells by apoptosis as revealed by ultrastructural changes, nuclear DNA fragment- ation, cleavage of poly ADP-ribose) polymerase PARP) and of b-catenin, and was antagonized by ectopic expression of Bcl-2 but not by inactivating mutations of p53. This event was associated with a slight accumulation of Bcl-2, a decrease of Bax but no changes in Bcl-X L protein expression at any time point. In Ph 1 cell lines BCR-ABL protein was only down-regulated after 48 h of treatment with 10 nmol/l PSI. Altogether, these results indicate that PSI, alone or in association with other cytotoxic agents, has anti-tumour activity against myeloid malignancies and is more effective on leukaemic than on normal haematopoietic progenitor cells. Keywords: proteasome inhibitor, cytotoxic agent, apoptosis, myelogenous leukaemia, CD34 1 haematopoietic progenitors. New therapeutic strategies to prevent leukaemic cells from being killed by cytotoxic drugs involve the activation of apoptosis. For this reason, major interest has been focused on the activation of caspases, a family of cysteine proteases that are synthesized as inactive pro-enzymes and are processed in cells undergoing apoptosis by self-proteolysis and/or cleavage by other proteases Korsmeyer, 1999; Reed, 1999; Wickramasinghe & Hoffbrand, 1999). The multicatalytic proteasome complex MCP) or protea- some, the main non-lysosomal mechanism that rapidly degrades or processes proteins by ATP/ubiquitin-dependent proteolysis, plays a major role in the degradation of cell cycle-regulating proteins such as cyclins, cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27 kip21 Pagano et al, 1995; Adams et al, 1999; Kitagawa et al, 1999) and of the transcription factors p53, c-Fos and c-Jun Drexler, 1997). Although a link between proteasome function and apoptosis has been suggested in the tobacco horn moth Manduca sexta Schwarz et al, 1993; Dawson et al, 1995), the use of proteasome inhibitors PI) has only recently enabled the direct demonstration of the role of the proteasome in mammalian cell death Adams et al, 1999). In addition, to ensure orderly progression of cells through the cell cycle, the proteasome may prevent caspase 3 activation Orlowski, 1999) and, therefore, inhibition of this complex can lead to cell cycle arrest, activation of caspases and ultimately cell death Drexler, 1997). Thus, proteasome inhibitors may be exploited to modulate these processes in proliferating cells with little effect on quiescent or terminally differentiated cells. Human myeloid leukaemia cells are actively proliferating and are variably resistant to the apoptosis induced by ionizing radiation and chemotherapeutic drugs Hannun, 1997). Among the different leukaemias, chronic myelogenous British Journal of Haematology , 2001, 113, 126±135 Correspondence: Davide Soligo, MD, PhD, Bone Marrow Transplan- tation Unit, I.R.C.C.S. Ospedale Maggiore, Via F. Sforza, 35, 20122 Milano, Italy. E-mail: [email protected]

Transcript of The apoptogenic response of human myeloid leukaemia cell lines and of normal and malignant...

��� � ���� ������� �� ���� ���

��� ��������� � �������� �� ����� ����� � ������ � ����

� ��� ��� �� ������ ��� ��� ����� ��������� �� � ������ ���

����� �� ��� ���������� �� � ��� ���

������ ����� ����� ��� �� ������ �������� ������ �� ��� ���������� �������� ���� ����

�� ���� �������� ������ ���������� ��� ��� �� ����� ����� ����� �� ����� ������

������� � ��� ��� � ����������� ������� �������� ��� ������� � �� ������ ����������� �� ������� �������

�� �������� ���� � �� ���� �� ������ � � ! � "�������� !����� #$������� �� �� ����� %���� ��� � ������ � ���

�� ����� & '!�! &((() � �� �� ��� �!��� � ��� &* "������� &(((

�������� !������� �� �� ��"���� ������������ ����� �� �"��"�� � ���� ����� ������� ��� ������ ����� ���������� �� ��� �� #� � �$��������� ���� ������� � ���$����� ������% &����������'( )� ������ ���� ���������� �� � ��� *$���$+��&,���'$-��$���� ��� &���' �� ������% ��� ���� ����� ����� � ������ � ���� � ��� �� �./� ��������� �� ���� / �� �/ ����0�( -�� � ������1 ��� ���$��������� �������� ������% � �� �� ��%�� ��� � ����� ���(��� �� ���� ��� "� �� ������ � ���� �� ������ .! 2�

���� ����� ������ ���� ������� ��� /�3 ����� �� �$ � �� �� ������$���� �� �� � ����������� ���������� &.45$+6' ���� ����� �� ����� � ����������� ������ � &.6�'��� ������ ���7���� �� ��� �"�� �� �/ ����0� ���/� ����0� ��� ������� "���( ��� ���� ����� �� ������� � ����"����� �� ��������������� �������1 ������� !8- ��������$

�� ��1 ����"��� �� ���� &-!�$� ����' ���������� &�-9�' ����� �$����� �1 ��� �� ������� :�� �� ����� � �%����� �� �����$� ��� ��� �� ���� "�� �� ����� ��� �� �/ ( �� � �"����� ����� ���� �� � �� ��� ��������� �� �� ���$�1 ��������� �� ��% ��� �� ������� � ���$;� ����� � �%����� ���� ��� � �� �� ��( �� ��� ���� � ��� �.9$-�� ����� � ������ ���$��������� ����� 2< � �� ��������� �� �� ����0����( -���������1 ����� ������� �� ���� ���� ���1 ����� �� ������ �� �� �� ����� ������% � ������1 ��� ��� $��������� " �� ��� ��� ����� � ��� ����� �� ��� � ���� ������ "��� ������ � ���� �� ������ ��������� �� � ������ ��������(

����� � ���������� �� � ���1 ������% � �����1 ������� �1����������� ������ �1 .! 2� ��������� �� � ������ ����(

8� ��������� � ������� �� �� ���"��� ������ � ����� ������ �� ���� �� ������% � ����� �"��"� ��� ��� "�� �� ��������� �( 4�� �� � ������1 ��7�� ������� ��� ���� ��������� ��� ��� "�� �� �� ��������1 � ��� �� �� ����� �� ������������� ��� ������� :�� �� ���� "� ���$��:���� ��� ������������ � ����� ������� �� ������� � �� ����$��������� ����0�� ����"��� �� ����� ��������� &=��������1 �>>>? 9���1�>>>? ) ������ ���� @ A��������1 �>>>'(��� ���� ������� � ���������� ������% &6.�' �� ������$

����1 ��� �� � ���$��������� ������ �� ���� ��� ����������� �� ��������� ����� �� �� -��0�� #� � �$������������������ �1 ����� � ��7�� ���� � ��� �������� �� �� ���������$������� �� ����� �� ���� �� ���� ��1 ���� �$��������� ���� �� � ���� ��� ��� ��B ��� &������ � ��1 �>>/?-���� � ��1 �>>>? = ����� � ��1 �>>>' ��� �� ���

������� �� �� ������� �/ 1 �$4�� ��� �$C�� &!��%���1 �>>B'(-������� � � � ������ ���������� ����� �� ��� ������� ���� ���� ��������� � ��� ������� ���� ���� ����! � �$ �&�����: � ��1 �>> ? !���� � ��1 �>>/'1 ��� ��� ������������ �� � ���� &��' ��� ���� �������� ������� ���� ���� ���������� �� �� ��� ���� �� ��� ���������� ������� �� ���� ����� &-���� � ��1 �>>>'( �� ��� � ��1 �������� ������� �������� �� �� ����� ������� ��� ���� �����1 ������������� ��� ���"��� ������� ��� "�� �� &,���� 1�>>>' ���1 ���������1 �� � � �� �� �� � ������% ��� ���� ������ ����� ������1 ��� "�� �� �� �������� ��� ��� ������ ��������� &!��%���1 �>>B'( ����1 ���������� �� � ���� ��� ���%��� ��� �� �������� ����� ��������� � ���� ����� �� ����� �� � ���� ������ �� #� ������ �� ���� ����� � ������� ���������(A���� ����� � ������ � ����� ��� ��� "��� ���� ����� ��

��� ��� "�� ���� ��� ����� �� ��� ������� � ������ �� �� : ����� �� �� ��� �������������� � ����� &A�����1 �>>B'(-���� ��� � ������� ������ ��1 ����� � �����������

��� �+ ,�!���� �� -���� �����1 ����1 ���1 ���D� /

.�������������E !�" �� ��� ��1 6!1 ��!1 ���� 6���� ���������$��� �� 5� �1 �(9(.(.(�( ,������� 6��� ���1 F � 4( ����:�1 /1 �����

6 ����1 �����( G$�� �E ���� ��H������ ��( �

������ � &.6�' ����� ����� �� ��� �.9$-�� ��� �� ����1� �� ��������� �� �������� ����� � �� ������������� �� ���� ��� " ��1 ��� ���� ������� ��� ����� ��������������$ ������ ������� � &-��������$6����� � ��1�>><'( )� ������ � ��� ������� ����� ���� ���������� �� � � �� �� ��� ������� � � � �� ��"�� �� ������� � �������� ����������� �� ��� ������ �� ������% � ����� � ������� �� ����� � ���� � ���( �� � ������� �"��"�� ������ "�� �� �� ��������1 � ��������� �� � ��� �%����� �� ������������ � ���$� ��� �� ����� �� ��� � ��� ������� �� ���.9$-��( 4 �����1 � ��� ���� ���� � " �� �� ��� � ���������������� � ����� .! 2� ������ ��� ����� ���� .6� ��� �������� ���� ������ ������(

6-�G9�-�� -8! 6G�A,!�

���� ��� ��� ��� � ��� ����� ����������� � ������ ����� � �� A��� �� ���� ��� ���� �������� .��� � ��.������ �� &�.�.1 +���"�1 �����' ��� ��� ��� ��� ���$������������ A��� ���� � �� �� ���� ���" ��� �� !� �(8����� 1 ��������1 .-1 5�-( .6� ���� � ��� ��� =/������ �.�.1 -9� � & ���� ���" ��� �� !� �( 6 :���� 1����1 C����' ��� 9)���2 & ���� ���" ��� �� !� 6( -(������� 1 �������1 �����'? ��� ������ ��� ���� ������ �=+�� �� ���� ��� G������� .������ �� �� -� ��� .���.������� &��� �����1 5=('( ��� �/ �� ���� ��.$8 ��� ���� $4������ ��� "�� �/ ������ ��.� � ��� ��.�<������������� � ���� � ��� ��"� ���� ���" ����� ����� ���&+� � ��1 �>>B'( -�� ���� � ��� ��� �������� � 9����� ���6���� �� ���� ���� &9�6�' ��� �� ��2� ����� � �� ��3����� ��" �� ����� &4��' &�/3 4�� ��� ��� ������������ ����� � ���' �� B�. ��� /3 .,� � � ����� ��� � � ������������( .���� ��� �������� �� ���� � �� ���� �� ���� ��� � ��/ �����0��(��� ���� ��� �������� *$���$+��&,���'$-��$���� ��� &���'

&������1 � :�������' �� � ����"�� � �������� �� ���� �� ��$�� ���� ����� ��1 � �� �� ��� �� ����.( ��� �������� ������� �� ��� ���� �� ���� �I� ����0� ���I/ ����0� ��� �� �� B� �( ��� ����� ��� ���� ������� �� ��%�� &���� ��%�� ���� ��%�� ���" ��� �1 � ���1 �� ��� �16,1 5�-' �� ���������� ��� ���� �� ���� ���/ ���� ����0� �� �� � ����� ��� &���� ��%1 �� ����$6�����#� ��1 8� J��1 5�-' �� ���������� ��� ���� �� ������� �� �I/�� ��0��( �� ���� ��� ����������1 ��� ��� ���� ����� �� ����� � ������������ �� ��%�� �� � ����� $��� �� �2 � ������ ��� � �� �� ��� ������% � �����(

���!��.����� � ����� ��� �� �%/0� ���� ��� ��������� ���� ���� ��� ������� �� � 4 ����$��#�� ���� ���&���� � � ���" �� �I�BB �0��? 8������ ������ -�1 ,���18����' �� �������� ��� ��$���� �� ����������� ����� &�!$68.'? ��� ������� ��� ���� ����� � �� � A���K�������� ���� ����� �� &A���'( ��� �������� ����� �������"�� �� �� �� �$� � ���$��������� ������ �� B�. �����"�K� ��� � �� !�������K� ��� �� &�6!6' �� ��3 4�� � �/ ��� ������� �����( ��� ���$�������� ����� �� ������ ����������� � �6!6 ��3 4��( �� ������ ��� .! 2�

�����1 ��� �!$68. ��� �������� ��� �/ � � �� 2�. ����� L�G8!�� ���������� ��� ���� � ������ ��� ��� ���.! 2 ��� ���( ��� ����� ��� ���� ����� ��� ��������

��� �/ � � �� 2�. �� �����$������ � ����� &6 ����� � ����1 ���� ��� +�������1 +������' ��� ��� L�G8!��( 4����� �������� � ������ �1 .! 2$����������� � &.! 2$�G'���7������ ��� ���� &A�.-$�1 ������ ! � ����1 6����� �F �1 .-1 5�-' �� ����� �� ��� ����� ��� �/ � � �� 2�.( -���� ��� �� ��� ������� ��1 ��� ����� ��� ������� ����������� ��� " �� � �� �� ����� �� ������ ���� ��� �%���� ��?��� � ��� �� �� ������ ��� �� ����� �� ��� �������� ������� �( -�� �� ����� ����� ��� ��������� ����� ����� ����� � ���( ��� ���� ���������� �� ��� �� �� ��� .! 2�

����� ����� �����$������ � ������� �� �� >�I�3(��������� ���� ��� �������� � ������ &.45$+6' ���

���� �� ��� �� ���� �� / � �� .! 2� ����� � � ������$��������� ������� ��� �� &6����.��� 22 21 ����.������������ ��1 F�����"��1 .�����' ����� � �� �I>3 ������$��������� � ����"�K� 6!61 �3 4��1 �3 ��" �� ���������� � &��-'1 ���2 ���0� �$6��������������1 � ����0��$������ ��1 /� ��0�� �� ���� .��� 4�����1 �� ��0�� ������������� ������$�� ����� �� ������ &+6$.�4'1 �� ��0���� ������� � &��$' 1 5� ��0�� �� ��������� �� � ��� ������� ����� �� ���( �� �� ���� � ���� ��� �������� �� B�. � � /3 .,� ����� ��� � � �� ����������( ������������� �� �2� ��� �2� ����� ���1 ������� "���1 �������� ����� �� ��� �������� ����� �2 � �� �������(

���� � � �$� � � ��� ��� ������ �� ��!� �� ��� ����.�����% � �� ������ � �� ���� � ��� ��� ���� ����� ��������� ��������� �� �� � ������� �� ������ ���� � �����&����� ���� 6����� � +��A1 +������' ����� �� �������"��� �� ��� )��$� �����:�� �� ���� �� � �������� ���������������� � " ���� ����� &��� ���� � ��1 �>>�'( �� ����1�� �� �� )��$� �� ����� �� ���� �� ��� >� ��� ������������� ����� � �� ��� �� �� ���� ������� ��( -���� 2 � ������ �� �� B�. � � ����� ��� � � �� ����������1 ��������� �"������� �� �� � �2�� F�.�,9 ���� ����� �������&G+ @ + )�����1 4 �����' ��� ���� �%������� �� �������������� �� ����� ���� ����� ������ :�� �� ��� ����������������(��� ������ �� ��� ���� ��� �� �� ��� &-' ��� ��%�� ��

� ����� ��� &�' �� �"������� ������ �� �� ��� ������ ��=��� � �� &�><<'( ��� �%������ ���� ���" "�� &��%�1 ��� ����� ��� ������� �� ��� ���" "�� �����"�� �� ���� - �������� ��� ���" "�� �����"�� �� ���� � �����' ��� ��������"�� ���� ���" "�� &����' ��� ��� ���� ��� �� �� - ��� ��� ���� �� ��������� �� ���% &9'E9 � ��%�0����( -� 9 ���% �� � &��� � "� ������' �� ���� �� ����� ��� ������� �������� ��( ������ �� �� ��� ��� �� ��� "���� �� 9 ����������� � &9������� � ��1 �><<'(

���� � �� ������� �� �"������ ��� ���� ��� ���� �� ��� ������ ����� ������1 2 � ��/ ����� ��� �������� ��������� �� ����� �� ��� &�I�D�/�� ����0�'1 ���� � %�� �B�3 �������1 ������� �� �I/ ��0�� 98��� &� ���' � ������� �I�3 ����� �1 �������� �� B�. ��� � � � ��������� � �� �� �� ��0�� ���� � �� �� �� &� ���' ��� � � � �� 2�.( .���� ��� ���� �������� ��� !8- ��������� ����� �� 4-.�.�� ��� ��� ��������� &������ ! � ����1��� C���M1 .�� ���� �'( ��� ��#� ��� � �������� ����������� �� �� ���� ��� ������� &������ ! � ����'(

'��� �� �� � ���� 8������ ���������� !8- ������� � ������� � ����� �� �������� �� ��� ���$��� ����

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

1�� ����� ��+��� ��� �� "����� ��� 2�!3���� -���� ������ ��B

�5��$� �� � � � ��� ������ �� ����� #�� &�58G�'&����� ���� 6����� � +��A1 +������'1 �� ����� ��� ������� � �� &�>>2'( �� ����1 ����� ��� ���"����� �� "�� ���� �� �� ��� ����� ��������� �� ���1 � %�� �� ���� �������B�3 &� ���.' ��� ������� � :�� �� �I�3 �� ��� ;$��� � �I�3 ��� �� . ����� ��� � � � �� ��( -���� ��� ��� �� � ���1 ����� ��� �������� �� /� �� �58G� ����� ��� %���� ��� �� � � �� B�. � � ����� ��� � � �� ����$������ � ��� ���( -���� �� ����� � ���1 ��� ����� ����������� �� ��� ���������(4�� � ���������� ������ � �� ������� � ��� ���� �����

������ &G������� � ��1 �>>/'1 ������� ��� � %�� � �3���������������� &�� � � �� 2�.'1 ����� � �� � �� �$�������� ��� �� &���'1 ������� ��� 2/ � � �� B� ����� ��0�� 98��� &� ���'1 ��� ��� ��� �� � � �� 2�. ��� ��0�� 4��.$������ � � &� ���' ��� ���� ��� ��� ���2/ � � �� 2�. �� �/ ��0�� �� ���� � �� �� ��&� ���' ��� �%�� ��� �� � $�������� � ��� ���������1 ������� ��� �� !�� � � �� &�>>B'(

�������� ��� ��� �� �� ��� 4#�5 ������� ���� A�������� ��� ���� ����� � %�� � �I/3 �������������� � ����"��� ��� �� 2�.1 � ���� � ���1 ����� %�� � �3 ,�,2 � ������ � � �� 2�. ��� ���� � ���� � � �� ���� ����( !������� ���� ������� �� ��������� �� �� � ������ ������� ��� ��&B�D���3' ��� ��������� �% ��( -���� ������ �� �-���� ��1 ������� � ���� ��� ��� ���� ��� �� �� � 9� �����C��� ������ �������1 ���������� ��� �� ������ ���������� ���� � ����� ��� �����"�� �� � �� � �� .6�������� �� �� �������� � �������� �� �� F( -� �"����� ��2�� ����� ��� ������ �� �%�� ���( ���� ��� ���������� ��������� � ����� ��� ��� � ������� ��������� ��� ������ �� ���������� � ������� ��� �"������� ������ �� �� ��� �����$���������� �� ��� � �� ��� � �������� &4��� �� � ��1 �>>2?����� � ��1 �>><'( ����� �E ����������� �� ��������������� ���0�� ��������� � ��������1 ��� ��� ��N��������$������ �����K ��� ��������� � ���0�� ������������? ����� ��E ������� ������� � ��������� ��� &���� �������������'? ����� ���E ����� � ����� ? ����� �FE ������� ���� �� &��� ������� � ��� ������'(

6� ��� ��� �� ������ ���� .��� ������� ��� ����� ������� ������ &�I��/ ���0� �� �$A.�1 �A �I<1 /3 ��� ��������� �������� &�!�' ����� � �� � �������� ���� ����$������� �� � ���� � ����0� �������������������� ����� ��&�6�4'1 �� ��0�� ������� ��1 ��� �50�� ����� � �1�� ��0�� ������� � &��� ���� .��� �����1 �� C����1 .-15�-' ��� � ����0� ��� �� �����"������� &� ���'( ���������� ��� �� ��� ��� � � �1 ��� ����� ��� #���� � ���� �� ��� � ���$�.- ������ &� ����1 9������1 ��15�-'( -� #���� ����� � �� 2� ��0�� �� ����� � ���� /3�$��������������� ��� ������ �� ��3 �� B3 �!�$����������� �� ��� ������������� � &�!�$�-+G'1 � :�$����� ������ ��� �������������� ���� �F!4 ���������&6 �� ����1 �������1 6-1 5�-'( -���� ���� �� �� /3���$��� �� �� � � � ��� ���� �I�3 ���� &� ���'1 ������������ ��� �������� �� ������� ��� � ��� ���&�E<��D�E�/��' �� �� ���� ��� ���� ���1 ����� �%���� "���� �� �� � E 2��� � ��� �� �� ��� ����% ����$����������������� ��� ����1 ����� ��� � ��� ��"����� �� G.������ � ���� &� ����' ��� ������� �������( ��� ��������

���� ��� ���������� ��� ��� �� �� ����� �-9� &� ����1�������� 6��� ��1 �-1 5�-'1 �� �$����� �1 ���$� ��� �.9$-�� &.��� �����'1 ���� � ��� ��� �� �� ��% ��� ���;�&����� ����1 �( ! ���1 .-1 5�-' ��� ���� � ��� $5� #� � ���� ����� &� ���'( �� ������ :� ��� ����� � �������1 �������� ��$������ �� ���� � ��� ��� �� �� �$��� � &� ���'(

9G�5���

#��� �� 1�� �� +!��� ��!3���� ��� ������� � �� ��� ���� ��������� ������� �� ��� �� ���������� � ������ � ���� � ��� ��� ���� � 4 � �&-' �������� �( ��� A��� ���� � �� �� ��� ���� ���� � "� �� ��� �� � /�3 ���� �� &�./�' �� <I� � ����0� �� �2 � ���

��� �� !���$��������� ������% � �������� �� ��� ����� 2< ����������( ��� ���� ��� �%������� �� ���� ���������� � �! ��

��� ��������� ������� �� ����� �%��� �����? ��� ��� :����� ���

���������� ��� /�3 �� ���� �� &�./�'E &-' -9� �1 A���1 =/��1

=+�� ��� 9)��� 2? &�' A���$��� ��� A��� ���$�? &.' ��.$81��.�<� ��� ��.� �(

��< %� ������ � ��

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

�I � � ����0� �� 2< �1 �� �"������� �� ��� )��$������:�� �� ���� ������ ���� � �����( �������� ��� ���� $� " � �� ��� ���� � ��� -9� �1 9)���2 ��� =+�� ����� ��� &��� ����� � ��� 4 � �-'( ��� =/�� ���� � �� �� ������� ��� ����� �� ���1 ��� �� �� �./� � �/�� ����0� ���2 �( A��"��1 ����� B� � ������ ��1 ��� ������ ��������� � ��� ��� ���� � ��� �� �� �./� ���� �� ����2I> � �IB �� �BI/ � I> &����� �'(

#��� �� 1�� �� � �.&. ����� �� ��� �� �7/.�! � �� ��� ������� ������ �� ���� �� ���$� � ���$ ������ ���� ����� ������ �� � A��� ����� ������ ����������� � ���� �� ���$��!8- �� �� ��� ������ �$��� ����� ���� ����( ��� A���$��� ����� ����� �� �./� ���������� �� ��� �������� ���� � ��&/ ����0�'1 ������ ��� A���$���$� ����� ��� ���������������� �� ���������� ��� �� ��� �� � ��� �� � �� ������ ����0� &4 � ��'(��� ������������ � ���� � ��� ��.$81 ��.$� � ��� ��.$

� �1 ��� ������ ��� "�� ���� � ������ ���7���1 ��� �������� ���� � $4������ ��� ���� �� ������:����� ����� ���

�� �/ �� ������ � � ��� �<�1 ������� "���1 ����� � � ������� � " �� �� ���1 �� �� �./� ���� �� ���� < �� �� ����0�&4 � �.'( -���������1 ����� ���� ������� � ���$�$������������ �/ $ ���������� ���� �� ��� �� ��� ���(

�� � �$� � ��� � �� 1�� �� ������ ��� �� + � +�� +��� +�����! � ���� �� ������ �� � ��� �������� ��� ������% � �� �� ������������������� � �����1 � �������� ��� �������� �� A�������� �� ���� ��� ���������� �� ��%�� �� � ����� ���(-�� � "� �� ������ �� � ������� ��� ���������� �� ���� ��� ��� ����� ��� �� +��(8� ����������� �� ���� ��� ��� ��� ��%�� &��

� ����� ���' ��� � ������������ �����( .��"������1 ������� �� � ������% � ������ �� ����� ��� ����� ��� ���$������� �� ��� ��� �2 � �� �� �� ��� � �� �� ��� ����������( �� ����1 �������� �� ����� ������� �� � ������ ����0� ��%�� �� ��� ��0�� � ����� ��� �����1 ����� ���$������� ��� �2 � �� � ����0� ��� ������ �%������ �� ���������� ����� �/3 ��� /�3 �������� ���� �� " �� � ��1

��� �� G����� �� ���� ��� ���������� �� ��� ��� ��%�� �� � ����� ���( &-' �2 � ��������� �� � ����0� ���1 �� ����0� ��%��1 ��� � ����0�

��� ���� �� ����0� ��%��? &�' �2 � ��������� �� � ����0� ���1 ��� ��0�� � ����� ��� ��� � ����0� ��� ���� ��� ��0�� � ����� ���? &.'

2< � ��������� �� � ����0� ���1 �� ����0� ��%��1 ��� � ����0� ��� ���� �� ����0� ��%��? &!' 2< � ��������� �� � ����0� ���1 ��� ��0��

� ����� ��� ��� � ����0� ��� ���� ��� ��0�� � ����� ���( ��� ���� ��� �%������� �� ���� ���������� � �! �� ��� ��������� ������� �� ������%��� �����(

��� �� 6��� ����0� ���������� �� �� ��� � �! ���� ������ ��� /�3 �� ���� �� &�./�' �� � ������� ���� � ���(

��������� � �� &�' A��� =+�� 9)���2 -9� � =/��

�2 <I� � 2 IB � �� � �/�� � �/�� � �/��

2< �I � � �� � BI� >I� � 2 <I< � � �/��

B� 2I> � �IB �BI/ � I> BI< � BI � � �� � �I/

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

1�� ����� ��+��� ��� �� "����� ��� 2�!3���� -���� ������ ��>

�� ��� �� � ������ �� � ������ &4 � �-1�'( - ������� �����$� �� �� " �� � �� &� ��3' �� �����"�� ��� ��� ���$��������� �� ������� �� � 2<$� ������ �� �� ��%��1����� "� �� ����� ������� ��� 2< � �� ��%�� ����� &��� � "�������' &4 � �.'( .������� �������� ��� 2< � �� � ����� $��� ����� ���$��������� �� ��� ����� � /�3 ��������������% � �� �������� �� ����� ��������� �� ���1���������� �� � ������ �� � ������ &4 � �!'(

#��� �� ��� ����� ��+��� �� �� ������ ��� ��2 ������� �� ���)��� .! 2 �������� ���� ����� ����� ���� � "� .6���� ���� ��� ���� � "� ������ ������ ��� �%����� �� ���1 �����$��������� �������� �� �� .45$+6 ������ ����� �������"�� &4 � '( A��"��1 ��������� ��� �� ����� � ������� ������ � �� � � �� ��� ����� �� .6�$��� "������� �� &�./� �/ ����0�' ���� ���� �� ������$��� "������� �� &�./� /� ����0�'( ��� � ��������� � �./� ������.6� ��� ������ ������ ��� ����� ��� ���� �� ����� � �� � $���� &�������K� $���� 1 � �I���'(

���� � �� ������ ��� 8�� � !9 %"' ������� � ��� �� 1��. ��� �� ��!3���� ��� ������� �� � �� �� ��� �� �� � � ���� ����� �������� �� �������� ��� �� �� ���� � �� �� �� ��� � �� ��� 4-.������� � &4 � 2'( - �������� �� +� ��� �� ��������� �� ��+� ����� ����� ��� ���� � 9)���2 ����� � ���� ���� �2 ���� ��� � �������� ������ ���� �" ���� �� 2< � �� ��������� �� �� ����0� ��� &4 � 2'( A��"��1 � -9� � ����� ������� � ����� �������� � � ��� �� ������� � +�06 ����������1 ������ � A��� ���� � �� ��� ������� � � ����� �������"�� ����� ��������� �� �� ����0� ���( A��"��1 ������ ���� � ��� � ���� ��� � ������� � ��� �� �" ���� �������������� �� �� ����0� ���1 ���� ����� �2 ��� 2< �&4 � 2'(�� ������� ���� �� ��� ������� � ������ �� ��� �� ��� A���

��� -9� � ���� � ���1 !8- ���������� �� �� �"��������� �� ��� �58G� ����� #��( -� �2 � ����� ��������� ��

�� ����0� ���1 <I�3 ��� 2I�3 �58G�� ������� � �������� �������� � A��� &4 � /' ��� � -9� � ������������ "���(��� � ���������� ��� � �� �� 4$��� � ��� !8- �� 4��.$

������ � � ��� ���� � �� �� �� &��'1 ������� "���1 ���������� ������ ��� �� �� ��� ���� ����� ����� �� ������� � �����&4 � �'( -������ � ����� ��� ��� �� � �� ���� �� 4��.$������ � � ��� ��� ��������� �� ��� �� ���� � �� ��

��� � .45$+6 ������ �� �� ������ ���

.6� ���� ����� .! 2� ��� � �� ���������� ��������� �� � ������� ����� �� ���(

-�� ���� ��� �%������� �� ���� ����������

� �! �� ��� ��������� �������( ��� ��� $

:����� ��� ���������� ��� /�3 �� ���� ��&�./�'(

��� �� .��� ����� ��� �������� � ������ � ����� ��� ���������( .����

��� ������� �� �� ����0� ��� ��� �2D2< �1 ���� ��� ��� ������ � �� �� �� ��� �������� �� �� ��� ��������� &�� ���

�"���� ��� � �������? ��� :����� �% �1 � ���� ������������ ����� ��?

"��� ��� �% �1 ����� "� ���� ������'( 4�� ���� ����������� "�

� �������1 ��� ���������� �� +�1 � ��� +�06 ����� ����� � �� �����(

� � %� ������ � ��

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

� $�������� � ��� ���������1 �"�� ��� ����� � ���������� ������ � ���� !8- �������( -� ���� � 4 � �1��� ������ � �$�� ��� -9� � ��� A��� ����� &���������� ����� �� 9�' ����� �� ���������� ������ !8- ������� ��������� � �� ��� ������ +�1 � ��� +�06 ������( .��"������1��� ������ � �$� � ������� � ����� &��� �� 9�'1 ���� ������������ � ���$������� ������� &4 � ��1!'1 ����� � ���� ������ ������� ���� �� � ����� ���� ��� � ��� ��� �� �" ����� ��� � ���( ��� ���� ����� ����� � ��� ��� �� �� ��� ������ ����$������� ������� �� � � ��� �� ���� ������ ���������1 �� ��� �� ���� ������� � �������� ���� ��� ������ �� ��� ���������(

�� �� �! !��� �������� ������ ����� � ��� �� ������� � ���� �����1 � �%�� ������ � �� ��� ����$��������� ������ �� ��� �� ��� �����$���������� ���������� �� ��� A��� �����( )������ ����� �������� ��� �2D2< � �� � ����0� ��� �������� >>3����������������� ������1 �� �2 �1 ����� �������� ��/ ����0� ��� ����� �" ���� ������� � ������� � ��3 ����� ����� &>I<3 �� ����� �� �� � ����� �1 ����� ������� �'&4 � B1 ����� ��'( -� 2< �1 ���� ��� ���������� �� ����������� � ����� ��������( �� �������� ������� �� �� ����0����1 2�I>3 ������� � ����� ��� ����� �� �2 �1 ������ ��

��� �� 8������ !8- ���������� �� ����� ��� ���������( A��� �����

��� ������� �� �� ����0� ��� ��� �2 �1 ���� �������� �� �� ���

�58G� ������ �� 4��.$�5�� ��� �������� �� �� ��� ���������(�� �� � ����������� "� ����1 <I�3 �� ��� ����� ����� ������� �

��������(

��� �� .��� �����$����� �� ������� � -9� �

��� A��� ����� ������ &-1 .' �� ������%������ &�1 !' �� �� ����0� ���( -����

2< � ���������1 ��� ����� ��� � %��1 ��� ���

�� 4��.$������ � � ��� ���� � �� �� ��

&��' ��� �������� �� �� ���� ������ &�����0���' ��� ���������1 �� ����� ��� � �� ���.

�� ��� �� +��( ��� ��� � �������� � �����

��� ����� �� �� 4��.$������ � � ��� ��� ����

� :� &� �� ������� ��' �� ��� ��� :����� ���"��� ��� �%�� ������� "���( 9� ��� 9� ���

�������� �$����� ���� ���� ��� ����� ���

������� � ��� ���$������� � ����� ������$� "���( ��� !8- � �������� �� ��� �����

����� � 9� ��� 9� ��� ���� � ��� ����

��� � ��� ������ ������� "���( ��� ��������

+� ��� +�06 ����������� ��� ������������ ��� � ��� � !8- � �������� ����� ��� ��

��� ��� ���� ��� � ����� ��(

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

1�� ����� ��+��� ��� �� "����� ��� 2�!3���� -���� ������ � �

2< � ���� ����� &>�I>3' ��� � ��� ���� ������ �� ���������� � ������� &����� ���' &����� ��'(

6� ��� ��� �������� ������ �� ��� �"��"����� �� �������� � ���$ ���������� �����1 A��� ��� -9� � ���� � ��� ��� ������� ��� �� ��2< � �� � �� �� ����0� ��� ��� �������� �� �� )���������� ������ � �� ��� ��� �� �� ����&-!�$� ����' ����$������ &�-9�' ��� �$����� �1 �� ����� � ������������� �� �� ����"�� ���� �� ������� ��� �� ������� �(���� ���� � ��� ����� ��� "��� �%������� �-9� ��� �$����� ����1 ����� ��������� �� ���1 ��������� � ��������� �� �������������� ��� ����� &4 � <-'1 �� ��� �� ��� �"��"������� ������� ��� ���� ��� ������� �( 4����������1 ������������� ���� ��� �� �������� ����� �� �� �� ����������� �� � ���1 � ��������� � )������ ���� ������ �

�� �� ��� $5� #� � � ��� ���� �� ����� ������� �� �� ����� �� ����0� ���( ��� ������� ��� �� ��������� ���� ����$�� #� � ����� ����� �� ����� ��� ���������1 ������$���� �� �� �� � � �� �� ��� ���������� ��� " �� �� ���&4 � <�'(������� ����� � ����� �� ������� � �"��"� ��� ��� ������

������� �� �� ��� ���$������� � ����� � ��% ��� �� ��� ��� $������� � ����� �� ���$� ��� ���$;�1 � �������� � =+��1-9� � ��� =/�� ��� ��"��� �� �%����� �� �� ����� ���$���� �� ������� ����� ��� ���������( )��� ������ :�� ����$��� � �������1 ��� ��"��� �� ��� ��� ������� � ���$� ����� ��������� ��������� � =/��1 ������ � =+�� ��� -9� ����� �������� � ������ �"�� ����� � ����0� ��� ���������&4 � >'( ��% ��"��� ���� ��� �������� � =/�� ������ �-9� � ��� =+�� ���� � � � ���� �� ����� ����� �2 ���������� �� �� ����0� ���( ��� ��"��� �� ��� ��� $������� � ����� � ���$;� ����� �� ������� ����� �� ����0���� ��������� � -9� � ��� =/�� ����� ��� � A��� �� �� ��� ����� ��� "� ��"��� �� �� � ����� � ��� ����������������(-� �.9$-�� � ������� ��� ��� �������� ��� ������ ��

������� � ������ �� �������������� � ������1 � �"���$���� ��� �%����� �� �� �� � ���� ������� � ��� ��� �����=/�� ��� -9� � �� ������ �� � ��� ������ ���$��������� �� �%����� ��( �� -9� �1 ������ � ����0� ����������� ��� �.9$-�� ����� � ��"���1 �� ����0� ������������� ����( �� =/�� �����1 �.9$-�� ��"��� ���������� �2 � ����� ��������� �� ���� � ��� �� ����0� ���1 ������������ � �� � ������ 2< � ����� ��������� �� �� ����0���� &4 � >'(

!��.5���,8

- ������ �� ���������� �� � ���� ��"� ���� ������% ���� " �� ��� ��� � "�� ��� �� ������ ���� � ��� &-���� � ��1

��� �� 5�������������� �������� �� A��� ������������ ��� �2 � �� / ����0� ���( .���� �

� ������� ������ �� ��� ������� � ������� ���

�" ����( ��� ����� ���� ���� ���� � �������

�������� �� �������� ����� ������&�����' ��� ��������� �� "������� ��

� ������� � :� &����� �'? ��� ���� �� ��� ������

���� � ������1 ������ ��� �� ����� �� ���

� ��� ��� ����� � ����� ��� "������������������ �� �� ����������1 ��� ��� �� �

���� ����� �� ��� ������� � ������� &����� ���'

&���� � ��� �� � /���'(

��� ��� G6 #���� ��� "� ������ � �� A��� ����� � ��� "�� ���

������ �� ��� ������� � ������� ����� ��������� �� ���(

�����

�

&3'

�����

��

&3'

�����

���

&3'

�����

������� �

���� ������

�����

�F

F ����

�����

&3'

��� � ����0� �2 � � � � � �� >>

��� � ����0� 2< � �I2 �I �I< �I� >BI/

��� / ����0� �2 � >I< �IB <I2 ��I> 2/ B>I���� / ����0� 2< � �IB �I/ �BI �2I/ >> B/I/

��� �� ����0� �2 � <I< �I �I< 2�I> � � /BI�

��� �� ����0� 2< � 2I� 2I� < IB >�I> /� <I�

����� �1 ������� ���0�� ����������� � �������� ����������� �

������� �� ����������� � �����( ����� ��1 ������� � ��������� ���� �����( ����� ���1 ����� � �������( ����� �F1 ������� � ��� �� &���

������� � ��� �����������'(

� � %� ������ � ��

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

�>>>? ,���� 1 �>>>? ,���� � ��1 �>><'( ��������������1 �� ���"��� �� �������� �� �� ���� ��1 .! �� � ����1 ������ ���������� ����� �� ��� ������� �� ���������1 ��� ������ ���� �� ��������� �� �� ���� ������������� �� ��� ������� � ���� �����( -���� ��� �������$�� �� � ��� ����� ��1 ����������� ���� ����� � ���������������� � &.��' ��� ����1 ����� �� ����� ��� ����� ������ ������� �$ ������ ������� �1 ��"� ������� ���� ������ �� "��� ���� � "� �� ���������� �� � � �� &!�� � � ��1�>><? .������ � ��1 �>><'( �������� ����1 ��� ������ �� ��� $������ ��� " �� �� ��� �� ����� �� � ����1 � ��������

��� "�� "�1 ��� ���� ������������ � ���� � �� �������� �� ��� �.$ �������� ������ ���� � �� &-���� � ��1 �>>>'(-������� ���� �� ����� �� � ���� ������ �� �� ��� "� �

��� � �������� �����1 � ��� ������� �����1 � ��"� �������� ��� ����$�������� ���������� �� � ��� ��� �%���� ������� � ��$ ��� ����$��������� ������% � ������ �� ����$����� ���������� ��� �� ����� � ������ � ���� � ���1 ����� �� ���� ��� � ��� ����� �� ��� �.9$-�� ��� ������ �������1 ��� �� ������ ��� ������ �� ������% � �����&A�����1 �>>B? -��������$6����� � ��1 �>><? !����:� ��1 �>><'( �� ��� � ��1 � ��"� ���� ���� .45$+6��� "�� ���� .! 2 ��� ���� ���� ����� ����� ���� .6���� ���� ��� �� ����� ����� � ��� ���� ���� � "� �� ��� ��������� ��� "�� ���� ������ ���� �����1 ���� ������� ������ ��� � ���� ������ "� � �� �� ������ � ���� ������������ ����( ��� � � ��� ������ ��� �������� �� ��� ������% ������ ��%�� �� � ����� ��� ��� �������� ����� ������ �� �� ����� ��������� ��� ���� ��� ��� �� ��� � �������� ��� ����� � ���1 ���� �� ��� �� ���� ���$������% � ����� ����� ���� � :� ����� �� ��� ��� �� �� ����� ������% ����������(��� ������% � �� �� ������ �� ������� � ����� �� ����$

������ �� G6 ���������� ��� �� � ! !8- ���������� ��( ��

��� �� G%����� �� �� ��� ���$� ��� �� ��� �� �.9$-�� ����� � �����

��� ���������( .���� ��� ������� �� �� ����� &�������' ��� �� ����� ����� �� ���1 ���"����� �� "�� ��� ����"��� ��� ��������

�� �� )������ ���� ������ � �� ��� ��� �� �� ���$�1 ��%1 ���$;���� �.9$-��( -�� ����� ��� �������� ��� �$��� � �� ������ :� �����

��� ����� � �������( ��� �����1 =+�� �����(

��� �� &-' �-9� ��� �$����� � ����"��� � ���$������� �����( .����

��� ������� �� ��� �� ����� ����� �� ���1 ���"����� �� "�� ���

����"��� �� � ��1 ����� ��� ������ �� )������ �����( .���"�� �-9���� �$����� � ����� &6) </ !� ��� �� !� ������� "���' ���

�� �����( ����� ��� ��$������ ��� �$��� � �� ������ :� ����� ���

����� � �������( &�' -�������� �� �� ������ #� � ����� ����� �� �

���$������� -9� � �����( -9� � ����� ��� ��������� &�������' ��������� ��� �2 � �� �� ����0� ��� ��� ������ �� �� )������ ����

������ � �� �� ��� ���� �� �� #� � �( ������ #� � ����� ����� ��

��� �� �����( ��� ���� �� ��$������ ��� �$��� � �� ������ :� �������� �#��� ����� � �������(

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

1�� ����� ��+��� ��� �� "����� ��� 2�!3���� -���� ������ �

���� �"��"�� ��� ��� "�� �� �� �������� �� �� ����� �� ������������ � ����"��� �� �-9� ��� �$����� �( ����� � �� ������ ���������� �� ������ ��� �� ��� "�� �� �� �������� � �������� �� ����� ���������� �� � ���� &!��%���1 �>>B?,���� 1 �>>>'1 ���� ������� ������ : �� ��� � � �������� #� � �$���������� ������� ��� ������� �(+ "�� ���� ��� ������% � ��� " �� �� ����� � �����$

��������� � ����� � ������� :�� �� ����������� �%����� ���� ���$� �� �� �/ ����� � ���� "�� ��1 �� ����"����� � ��� ��� ��� ���1 � ������ ��� � �� � �� ���� ��� ������� ���( -� ���� ����1 ����� � �%����� �� �� ���$� ������� �������� ��� ��� ������ �� ��� &� ���$����' ����� "� �� �������������� �����1 ������� �� ��� �� ���� ��� ������% � �� ����$� ���������( �� � ���� ���� �� ���� ���$� ���� �������� ������� ��� ��� ���������� �� � ����E -���� ���-���6 ��� " �� � �������� ���� ���� ����� � ���������� �����$� �"��$�%����� �� &A������� � ��1 �>><'1 ������� ������ � ������� �� � ���� ��� ������� �� "�� ��� ��"��� �� ���������� � �������( �� ��������1 ���� "�� �� ����� ��� ���/ 1 � �� ������ ��� ������ �� ������% � ������1 ������ ������ �� ��� ������% � ��1 �� ��� �� ���� ��� ���� ������� ����$�$��������� ��� �/ $ ���������� ������(�� ���� ��������1 ��� �������� �������� �� �� ������� �

�� ����� �"��"�� ��� ��� ������ ������� �� �� ���$� ��� ���������1 � ���� ����� ��� ���$������� �� �� ���$� ���0�����;� ��� ��� ��$������� �� �� ��� ���$������� � ����������% &= ���� � ��1 �>>�? ������ � ��1 �>>�? +������ � ��1�>>B'( �� ������ �� � � � ��� �"���� �������� � ���������� ���1 � �"��� ����� ��� �%����� �� �� ����� ����� ��(A��"��1 ��� �� ���� ��� ������ � �� ��� ������� �� ������� ����� �� &4 � >' � � �� �%������ �� ��"��� ���" "�������� ���� ������� � ������� ���$� ��"��� �������������� ����� �� ��% ���������( A��"��1 ��� �� ������� ���� ��� ���$� ����� � �� ��� ��� ���� ���%������ �� ���������� �� � ��������� �� ��� �� #� � �$��������� ������$���� &! ������ � ��1 �>>>' ���1 ���������1 �� � � �� ���� � ������% ��� ������ � ���$� ��������� ��( A��"��1��� ������� �� ��% ��� �� "�� ���� �� ������1 �� ��� ������ �� � ����� � ��������� ����������$��������� �������$� �� ������� �� � � �� �� �� � ������ ����� �� ����������� �� &.���� � ��1 �>><? � @ � �� !��1 ����'(�� �� �������� ���� ���� ���� ��� ��"��� ��� ����

��� " �� �� �.9$-�� � =/�� ����� ��� � �� � ������ ������������ ��������� �� � ���������� �� � ��� &� �� !�� � ��1�>>>' ��� �� � �"�������� ���� �� ������� �( �� ��������� �� ����� � �� ���1 � �����"�� � � �� � ���� ���������� �� �� �.9$-�� ����� � 2< � ����� �%������ �� ��� � -9� � ��� =/�� ����� ��������1 � ��� ������1 �� � �"����� �������� �� �2 � �� �� ������� � ����� � ��"���( ��������� ���� �������� ���� ������� �� ��� ���� �� ��� �� #� � �$���������� ������ � ��� � ���������� ����� �� ������� " �� �� ��� �.9$-�� ��� ������� ���� ���1 �� ���������� �� �� � ��� �� ����� �1 ��� ���� ��� ������������� � " �� �� ������ � ����� �� ������� �(��� �� #� � �$��������� ��������� � ������ � �����

��������� ���� ����� �������� �� ������� ��� �������� �� ������ �� ��� ���� �$��������� ���� &6��� ��� � ��1 �>>B'(� � ��� �� ��� ������ �� ����� �� � ���� &!��%���1 �>>B'1 ��� ������ ���� ���� ����� ����� ������� ���1 � �� ��� ����

���������� � 9)���2 ���� � ��1 � � �� �� �"��� �� ����� +�E+�6 ��� � �� �����"��( 5� �� � $�������� � ������������1 � ���� ����� ���� ���� ������� � ����� ����� �������� ���� ��� ����� ������� � ���� ��� ����� �� ��� ���������(��� ��7�� �� �� �������������� � �����1 �� ��� ��

�� : �� ��� �� ��1 �� ����� �� ������� � ��� ��������� �� ���� � ������ �� ����������� �%����� �� �� ��� ������� ������ &�(�( ���$�'1 ���� �� ����� ���� �/ 1 ����� ��� "���� "�� �� �� ����� �� ����� �� �������� � �� � ������� �$� �� ������� ��� ������ ���� ��� ������( - ���� ��� �� ���������������� � ������ �� �� � ���� �� ������������� " �� ��� ��������� ���" �� �� �������� "� �������� ���"������ ��� ������ �� ������% � ����� � ������ � �����(�� � " � � ���� ��������� �� ��� � �� �� ���� ��� ��������� :� �� �� �� �� ��%�� ��� � ����� ���1 �� �����$��������� � ������ ���� ������ � ���������� ��� !8-������� "��� &+ �� � ��1 �>>B'( 4������ ���� �� ��� �������� ���� �� ����� ������� � ����� ������ �� �� �� �� ��� ������1 ��� �� ������ �� ��� ����� �� �� ����� ���� ���� $��� ��� �� ������ "��� �� ������ � ����� � �� ���� �������� ��������� �� � �����( ���$�� � ��� ���� �� � ����� ���� "�� "� �� � ���������� �� � ��� &��$ 2�' &-���� � ��1�>>>' ��� ���� �� � �������� ��� � "��� � � ������������� ��� ��% � ��1 �� ��� ���� �� �� �� � ���$��������� �( �� � ������ ����� ���� .������ � ��1�>><1 ���������� �� � ���� ��� ���� �� ����� ������������ � �� �� �� �� ��� � :�� ������ ��� ����� � ��������� �� ���" ��� � �� ���1 ������� �� ���� ���� ����� �� �������� ���� ���� � "� �� ��� �� � ���� ���� ����� ��� � ����&!��%���1 �>>B'( ,�� ���� ������� �� ���� ���� ��� � ����������% � �� ���� ����� �� .6� .! 2� ����� ���� ��#� ������ ������ ���� ����� ������ ��� �����( ���� ������� �� ���� � " �� �� ����� �� � ����1 �������� � ����� ���� �����$����� ������1 ��� ��������� ��� � � ���������% � �� �� ����( 4������ �"��� ��� ��� ��� ������ ������� ���������� ��� �� ����� �� � ���� ��� ��� " � �� ������������ �� � ����1 ����� �� ��� ��� ��� � ������ ������ ��� � �� � ��� ������� �� �� ���� �� �� �� �� �� ��� ������1 ����� �� � ���� ��� �� �� ������% � �����(

-.=8,)�G!+6G8��

�� � �� �� ��������� �� ��� -���� �: ��� ���� ��������� � &-��'1 ��� ������ �� ��� -���� �: ��� ���� ���9 ����� .����� &-�9.'(

9G4G9G8.G�

-����1 C(1 ����������1 F(C(1 ����" ���1 G(-(1 C������1 C(1 !������1 -(1

��:����1 !(!(1 6���1 C(1 � ��1 .(�(1 ������ �( @ G�� ��1 �(�( &�>>>'

���������� �� � ����E � ��"�� ����� �� ������ ��� ������ "�

��� ����� ������( ��� �� ����� +1 ��1 ���/D����(

-��������$6�����1 +(1 = �1 .(8(1 � �1 �(1 A����1 J(1 ��� ��1 .(�(1

+����1 !(9( @ ������1 =( &�>><' ���$��� �%���� �� ������ ��� ���� "���� ������� � �� ��� ������� ������� �� � �������� ��

������� �� ���������� � ��� ��� "�� �� �� ������� ( �����1 ��1

�B��D�B�/(

.������1 C(1 8 ����1 �(1 + �������1 C(1 =� ���1 =(,(1 -�������1 6(1

� 2 %� ������ � ��

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

4�� �� ��1 G(C( =��� ��1 6( @ 6�.����1 !(C( &�>><' ����������

�� � ���� ����� ������� � � ��������� �� �$��� ����� ����� �

��������� � ������ � �����������( �����1 ��1 2���D2��>(

.����1 J(.(1 ���1 J(�(1 ��7 ��1 �(1 �����1 =(1 ,����1 �(1

A� ��:1 8(A(1 6 ��� 1 J( @ 6����1 C( &�>><' 6��� ��� ��%1��������� ��� ����� �� ��� �/ ��������1 ��� �������� �� ���

�� #� � �$���������� ������( ���� :��� + ��� %������� �� ���1 �1

B>D<2(

!����1 �(�(1 -�����1 C(G(1 6����1 8(C(1 9�������1 �(G(1 � �����1 6(-(1

+����� .1 .������% � =����:�� �(6(1 �����1 =( @ 6����1 9(C(

&�>>/' !�"���������� ������� �� ��� �� � ���������� �

����� ��� ������������� ������� �� 6������ ��%�� ��� ������������ ���� �����( ,�!���� �� ������� �� �+��� ��1 ���1

2�</�D2�</<(

!�� �1 !(1 +� 1 =(1 6 :���� 1 �(1 J�����1 �( � �� &�>>B' ! ���� �� ��

������ ���� ����� ������ ��� ������� � ��� ����� � � $4������

����� ������:����� ��� �/ ���� ����� ���( �� �����1 ��1 �� BD

��2B(

! ������1 �(1 ��� �������1 =(1 A��������1 C( @ *� ���1 -(6( &�>>>'

!������������� �� ������� ���$� ��� �� #� � �$��������� �����$

��� ��E � � � ������ ��� ���������� ��� ��� ����������������( ,�!���� �� #$������� �� ���� ���1 ���1 �<�/D�<��(

!��%���1 A(.(-( &�>>B' -�� "�� �� �� ��� ���� ����� ������� �� �� � � �� �� ���������� ����� ��( 1�� ������ �� +� "� �����

' ����� �� � ��� � �� +� ��'1 ��1 <//D<��(

!����:1 �(1 G�� �1 �(1 ������1 ,(1 !�� �1 8(1 ������1 -(+( @ ������1G( &�>><' �.9$-�� ������ ������� � �������� �� ����������

��� "�� ��( �����1 ��1 �2�/D�2��(

!�� �1 F(1 ��� �1 +(A(1 4��1 !(4( @ 9���1 �(�( &�>><' 8��������������� �� �� ���. �� �� ��� ����� �� � ��� �E � ���� �� ���

+�06$����� ����� � ��( ���� !��� ��� ����!��� �������1 ��1 /2�D

//B(

G�������1 �(.(1 ����:1 �(�( @ -�����1 C( &�>>/' - �� ���

�������� � ������ ��� � ��� � ��� �� �� ������� � ����� ���

������ �� �� ��� � ���� ����� ���� � � �� ������� ��� � �� �� 4$��� ���� !8-( �� ��� ��1 ��1 ���D�B�(

4��� �� 1 G(1 +��� 1 �(1 .����� 1 -(1 *��� 1 �(1 4���:�1 �( @ F ����1 6(

&�>>2' 8������ ����� � ��� ������� � ����( -� � +��� �� ,�!����1��1 B/2DB� (

+ ��1 9(=(1 ������1 !(!(1 )��1 �(1 ,K.�����1 !(6(1 !��� ��1 !(�( @+���O��$������1 .( &�>>B' -������ � �� � ������� �� �����$

���� � " �� �� � ����� � ��� ��%�� ������� � �"�� �� ������ ����

� ���( :��� ����� �� �� �����1 ��1 � D��(

+� 1 =(1 ���� 1 6(1 ����1 �( !�� �1 !( -����1 6(1 !���� 1 9(1

����������1 J(1 8�:���1 �(1 J�������1 A(1 J����( C(1

������1 =(1 J��� ��� 1 �(1 5������ �1 C(1 5���1 9(1 ��� ��1 .(1

G���� 1 6(1 =�����1 8(1 @ 6 :���� 1 �( &�>>B' !8- ������$����� ���� ���������� �� �� ��� ���� ����� ��� ������� � ������� �

����� �� ����$� �� �/ ����� ��( ��� �� ����� +1 ��1 �<>/D

�>��(

+������ 1 !(1 ���1 -(6(1 -�������1 -(1 ������ � 1 -(1 . ������1 �(1

+�������� 1 6(+(1 ����� 1 �(1 -�����1 6( @ .�� ��� �$.��� �1 4(

&�>>B' 4������� �� �� � �� �� ���$�������� ���$� ���� ������� � .!/� ������ � � �����E � " ���0 � " "� �������� ���( ��� �+

,�!���� �� -���� �����1 ��1 �2BD�/B(

A�����1 J(-( &�>>B' -������ � ��� ��� � ����� �� ������������������( �����1 ��1 �<2/D�</ (

A�������1 C(�(1 �� ����1 4( C�1 �� ����1 �(1 �������� �1 .(C( @6�!������1 �(C( &�>><' �������� ���� ���� ���� ����� ������ ��

���� �� � � �� �� ���������� ��� " �� � ���������� ��

����� ���� ���$� ��� �/ ( �� �����1 ��1 �<<>D�<>>(

�����1 �(1 J�������1 �(1 ��������1 6(1 ,�����1 A( @ 5���1 J(

&�>><' ��� ������� �� ��������������� ������� ���� ����� ��

������� � ����( ;�� +�� '� +���1 ���1 22 D22B(

��� ����1 6(1 ��� ����1 A(1 �� ��1 6(1 ��������1 =(1 ,����1 J( @5���1 =( &�>>�' - ���� ��� ����� �� ���� " �� � �� ��� � " ���

������% � �� �� � � �� ����$������� �����:�� �� ����1 �������

��� ��� ������� " ����( ������� �� 1+���� ����� �!��� ��1 ��1 �/�<D�/��(

=���1 !(A(1 6�����1 .(9( @ A ��������$*�� 1 �(5( &�><<' �� " ���

������������� �� �� �$����$���� ���������������� ��E �������

�� ��� ����� ��� " �� �� � �$� ��� ������������ ���( ��� ������� +1 ��1 ��BD���(

= ����1 �(1 =��7�� 1 �(1 6 ���� ��1 �(1 =��7���1 6( @ 9���1 C(

&�>>�' �$��� �� �� ������ ��������� �� �� ��% ����� � ���

������� � � ��� ����� � "� ����� � " "�( �� �����1 ��1 �<BD�>�(= �����1 A(1 ��� 1 G(1 ������1 A(1 ,:� 1 �(1 8����1 -( @

,����1 �( &�>>>' ���������� �� � ���� ����� � �������� �$

���������� ������� � � ����� �� ��� �����( �#�� 2� ��1 ���1�<�D�<�(

=��������1 �(C( &�>>>' �.�$� ���� ��� �� ��� ��� ������� �� ��

���������� ���� �����( ��� �� ����� +1 ��1 ��> �D�B���(

� 1 �( @ � �� !��1 L( &����' ��% �������� �� �� ��� �� #� � �0����������$��������� ������E �"��"����� � ����� ���" "��

��� �������� ��( 1�� ������ �� +� "� ����� ' ����� �� �� � ��� �

�� +� ��'1 ��1 </�D <//(

6��� ���1 �(6(1 A���� ��1 6(G(9(1 +������1 )(�(A(1 ������1 C(�(F(1����������1 A(1 9�������1 4(.(�( @ �������1 �( &�>>B' !��� ���

������ � �� ���� ����� ��� �� ���� ���������� �� � � ��(

�� ��� ��1 ��1 �2 D�/�(

,���� 1 9(*( &�>>>' ��� ���� �� ��� �� #� � �$���������� ������ � ������� �( ���� %�� + ��� %������� �� ���1 �1 � D � (

,���� 1 9(*(1 G����1 C(9(1 ������$)����1 -(1 +��"��1 6(9(1

,���� 1 6( @ !���1 .(F( &�>><' ����� ����� �� � � �� ������ � � ��� �� ����� �� ����� ��� ��K� �������� �� �

���������� �� � ���( ��� �� ����� +1 ��1 2 2�D2 2<(

������1 6(1 ���1 �()(1 ���������1 -(6(1 ����������1 �(1 !� �� 1 +(1

.���1 F(1 J�(1 �(9(1 !������1 +4( @ 9����1 6( &�>>/' 9��� �� ����� #� � �$���������� ������ � ������� �� ��������� �� ���� �

��������� ���� �� � ��� ��B( � ��� �1 ���1 �<�D�</(

� �� !��1 L(1 6�+� ��1 �(4(1 ����1 J( @ -�1 �( &�>>>' ����������

�� � � �� ����� �� � �� � ���� ������ �� �� ���$-�� �%����� �� ��������#���� ����� �� �� ������� � � =/�� ����� ����� �

����������� ������ � �����( ,�!���� �� 1+���� ����� ���

#$������� �� +�����! � 1 ���1 B<�DB>�(9���1 C(.( &�>>>' !��������� �� �� ������� � � ������( ,�!���� ��

����� �� �� �����1 ��1 �>2�D�>/ (

9������� 1 �(1 ������1 �(1 ������ 1 +(1 .���� � 1 8(1 ���������1 6( @

*� ��1 4( &�><<' �� " ��� ��� � " "� ������� ��� ������� ����� � ��� ��������� � �"�� �� ���� ���� �������( ��� ��

�+��� +����� ��� 1+���� �����1 ��1 </D >�(

�����:1 �(6(1 �� ��1 �()(1 C����1 6(G(G( @ ,������1 �(-( &�>> '

!� ��� ���������� ���� ����� ����� " � ������� �P 1�� ������ �� +� "� ����� ' ����� �� � ��� � �� +� ��'1 ��1 ><�D><2(

�����1 9(1 ����1 +(1 +�����1 C(1 9���� �1 A( @ ) �1 +( &�>>2'

� ���������� ������ ��� �� �� ���� ������� ��� ���� ��� ������$

� �( ���� �� :��� � 1 ��1 2�D2�(������1 -(1 G� 9����1 �(1 9���1 C(.(1 =��7�� 1 �(1 � ����1 9(1

������ �1 6( @ 8�����1 G()( &�>>�' !���$ ������ ������� � �

�$���� ����� � ��������� � ������ �E ����� ���� � ������ �/ ���� ����� �� ��� ���0��% ����� �� � ���� ��� ������( �� �����1

��1 ��//D����(

) ������ ����1 +( @ A��������1 -(F( &�>>>' � ����� ��� ���

����� � ������� �� ������� �E ����"���� �� ������ �������� �� ���� ��������� ��� ��� ����� ��( �����1 ��1 /<BD ���(

� ���� ������� �� ���� ���1 ��� �+ ,�!���� �� -���� ����� ���E ���D� /

1�� ����� ��+��� ��� �� "����� ��� 2�!3���� -���� ������ � /