TAVŞANLARDA BALON HASARI SONRASI DAMAR DÜZ KAS HÜCRELERİNDE TELOMER DEVAMLILIĞI VE OKSİDAN...

i

T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

TAVŞANLARDA BALON HASARI SONRASI

DAMAR DÜZ KAS HÜCRELERİNDE TELOMER DEVAMLILIĞI VE OKSİDAN STRESİN ROLÜ

Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Doktora Tezi

Uzm. Ecz. Gönen ÖZŞARLAK SÖZER

Danışman:

Prof. Dr. Zeliha KERRY

İZMİR 2008

iii

DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ

Başkan : Prof.Dr. Zeliha KERRY

.......................................................

Üye : Prof.Dr.Aslı ÖZER

.......................................................

Üye : Prof.Dr.Zeki TOPÇU .......................................................

Üye : Doç Dr. Metiner TOSUN ........................................................

Üye : Prof.Dr.Gülgün OKTAY ........................................................

Doktora Tezinin kabul edildiği tarih: .............................................

iv

ÖNSÖZ

Tüm akademik yaşamım boyunca her zaman desteğini gördüğüm anabilim dalı başkanımız değerli hocam Prof. Dr. Aslı Özer’e,

Bilimsel gelişimime her zaman destek olup yön veren, istediğim konuda çalışmam için beni teşvik eden ve gerçekleşmesi için sabırla ve özveri ile bütün imkanları sunan, her zaman manevi

desteğini hissettiğim değerli danışman hocam Prof. Dr. Zeliha Kerry’ye

Beni telomer dünyası ile tanıştıran, ve bilmediğim moleküler biyoloji dünyasında bana ışık tutan ve yön veren, laboratuvarının tüm olanaklarını kullanmamı sağlayan ve her zaman bilgi ve

deneyimlerini paylaşan 2. danışmanım, değerli hocam Prof. Dr. Zeki Topçu’ya,

Balon anjiyoplasti modelini bana öğreten, bilgi ve deneyimlerini paylaşan, modelin oturtulmasında ve sonrasında her zaman sonsuz yardımlarını gördüğüm değerli hocam Prof. Dr.

İsmail Oran’a,

Benimle her zaman bilgi ve deneyimlerini paylaşıp, tezimin her aşamısında katkıları ile beni motive eden değerli hocam Doç. Dr. Metiner Tosun’a,

Balon anjiyoplasti operasyonları sırasında bana yardım eden sevgili arkadaşım Göksel Gökçe’ye ve gerektiğinde yardımıma koşan diğer tüm hocalarım ve arkadaşlarıma,

Manevi destekleri ile her zaman yanımda olan sevgili aileme, ve her zaman sonsuz sabır ve anlayışıyla yanımda olan, bu zor sürecin kolaylaşmasını sağlayan sevgili eşim Naci Sözer’e

Teşekkürlerimi sunarım.

İzmir, 2008 Gönen Özşarlak Sözer

v

İÇİNDEKİLER

1. GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER 1

1.1. GİRİŞ 1

1.2. GENEL BİLGİLER 3

1.2.1. Ateroskleroz 3

1.2.1.1. Tanım 3

1.2.1.2. Ateroskleroz Patojenezi 4

1.2.2. Vasküler Proliferasyon ve Ateroskleroz 7

1.2.3. Deneysel İntimal Kalınlaşma Modelleri 9

1.2.3.1. Deneysel Modellere Genel Bakış 9

1.2.3.2. Perkütanöz Tranlüminal Koroner Anjiyoplasti (PTCA) 13

1.2.4. Telomerler 17

1.2.4.1. Telomer Devamlığının Korunması 19

1.2.4.2. Telomer Devamlılığı ve Apoptosis 21

1.2.5. Telomeraz 22

1.2.5.1. Telomerazın RNA Komponenti 23

1.2.5.2. Telomerazın Katalitik Komponenti 24

1.2.5.3. Telomerazın Regülasyonu 25

1.2.5.4. Telomeraz İnhibitörleri 26

1.2.5.5. Telomeraz ile Etkileşen Bileşikler 26

1.2.6. Alternatif Telomer Uzaması (ALT) 29

1.2.7. Oksidatif Stres ve Reaktif Oksijen Türleri 29

vi

1.2.8. Reaktif Oksijen Türleri ve Hücresel Kaynakları 30

1.2.9. Reaktif Oksijen Türlerinin Düzenlenmesinde Rol Alan Oksidan Ve Antioksidan

Enzim Sistemleri 32

1.2.9.1. Oksidan Enzim Sistemleri 32

1.2.9.1.1. NAD(P)H Oksidaz 32

1.2.9.1.2. Ksantin Oksidaz 33

1.2.9.1.3. Endoteliyel Nitrik Oksit Sentaz 33

1.2.9.2. Antioksidan Enzim Sistemleri 34

1.2.9.2.1. Süperoksit Dismutaz (SOD) 34

1.2.9.2.2. Glutatyon Peroksidaz 34

1.2.9.2.3. Katalaz 35

1.2.9.2.4. Tiyoredoksin Reküktaz 36

1.2.10. Oksidan Stres ve Kardiyovasküler Hastalıklar 36

1.2.10.1. Restenoz ve Serbest Oksijen Radikalleri 39

1.2.11. Oksidan Stres ve Telomerler 40

1.2.12.Glutatyon ve BSO 43

1.2.12.1. Hücresel GSH Düzeylerinin Düzenlenmesi 44

1.2.13. Taurin 46

2. GEREÇ ve YÖNTEM 48

2.1. Tavşanların Gruplandırılması 48

2.2. Balon Hasarı Oluşturulması 50

2.3. Doku Örneklerinin İzolasyonu 53

2.4. Telomerik Tekrar Restriksiyonel Fragmantasyon Deneyleri:Terminal

vii

Restriction Fragments (TRF) 54

2.4.1. Dokuların Homojenizasyonu 55

2.4.2. DNA İzolasyonu 56

2.4.3. DNA Miktarının Belirlenmesi 57

2.4.4. DNA’nın Agaroz Jelde Yürütülmesi ve Görüntülenmesi 58

2.4.4.1. DNA’nın Jel Elektroforezinin Temeli 58

2.4.4.2. Agaroz Jel Elektroforezi 59

2.4.5. DNA’nın Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi 60

2.4.6. Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmiş DNA Fragmanlarının

Agaroz Jelde Yürütülmesi 61

2.4.6.1. Agaroz Jelin (% 0.8) Hazırlanması 61

2.4.6.2. Jelin Yürütülmesi 62

2.4.7. Southern Blot Yöntemi ile DNA’nın Jelden Membrana Transfer Edilmesi 63

2.4.7.1. Jelin Transfere Hazırlanması 64

2.4.7.2. Transfer 65

2.4.7.3. Transfer Öncesi ve Transferde Kullanılan Tamponlar 66

2.4.8. Membran Üzerine DNA’nın Sabitlenmesi 66

2.4.9. Prehibridizasyon 67

2.4.10. Hibridizasyon 67

2.4.11. Hibridize Olmuş Telomerik DNA’nın Belirenmesi 68

2.4.12. Hibridizasyonda Kullanılan Çözeltiler 70

2.4.13. DNA’nın Jelden Geri Alınması 70

2.5. Telomerik Tekrar Amplifikasyon Protokolü (Telomeric Repeat

viii

Amplification Protocol, TRAP) 71

2.5.1. Ekstraktların Hazırlanması 72

2.5.2. Total Protein Miktar Tayini 73

2.5.3. Kontroller 76

2.5.4. TRAP Analizinin PCR Basamağı 78

2.5.5. Oluşan PCR Ürünlerinin Poliakrilamit Jelde Yürütülmesi 80

2.6. Histolojik Analizler 81

2.6.1. Morfometrik İncelemeler 83

2.6.2. İmmünohistokimyasal İncelemeler 84

2.7. Kan Örneklerinde Yapılan Ölçümler 86

2.7.1. Plazma Total Glutatyon (GSH) Miktarının Belirlenmesi 86

2.7.2. Plazma Glutatyon /Okside Glutatyon (GSH/GSSG) Oranının Tayini 87

2.7.3. Plazma Glutatyon Peroksidaz (GPx) Enzim Aktivitesinin Tayini 88

2.8. Aygıtlar 88

2.7. Verilerin Değerlendirilmesi 90

3. BULGULAR 91

3.1. Bölüm I 91


3.1.1.1. İntima alanı 92

3.1.1.2. Medya Alanı 93

3.1.1.3. Lümen Alanı 93


3.1.2.1. Ki-67 Ekspresyonu 94

ix

3.1.2.2. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) Ekspresyonu 95

3.1.2.3. α-Aktin Ekspresyonu 95

3.1.3. Telomer Fragmanlarının Uzunluğu 96

3.1.3.1. DNA İzolasyonu ve Miktarının Saptanması 96

3.1.3.2. DNA’nın Restriksiyon Enzimleri İle Kesilmesi 97

3.1.3.3. DNA’nın Jelden Membrana Transfer Edilmesi 97

3.1.3.3.1. Radyoaktif Olmayan İşaretleme ile Yapılan Deneyler 97

3.1.3.3.2. Radyoaktif İşaretleme ile Yapılan Deneyler 102

3.1.3.4. Telomerik Fragmanların Kantitatif Değerlendirilmesi 104

3.1.4. Telomeraz Biyoaktivitesi 106

3.2. Bölüm II 109



3.2.2.1. Ki-67 Ekspresyonu 112

3.2.2.2. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) Ekspresyonu 113

3.2.2.3. α-Aktin Ekspresyonu 114

3.2.3. Kanda Yapılan Ölçümler 115

3.2.3.1. Plazma Glutatyon (GSH) Miktarı 115

3.2.3.2. Plazma Glutatyon/ Okside Glutatyon (GSH/GSSG) Oranları 116

3.2.3.3. Plazma Glutatyon Peroksidaz (GPx) Enzim Aktivitesi 117

3.2.4. Telomer Fragmanlarının uzunluğu 118

3.2.4.1. DNA İzolasyonu ve Miktarının Saptanması 118

3.2.4.2. DNA’nın Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi 120

x

3.2.4.3. DNA’nın Jelden Membrana Transfer Edilmesi 122

3.2.4.4. Telomerik Fragmanların Kantitatif Değerlendirilmesi 127

4. TARTIŞMA 128

5. SONUÇ VE ÖNERİLER 142

ÖZET 143

ABSTRACT 145

KAYNAKLAR 147

xi

TABLO LİSTESİ

Tablo 1.1. İntimal kalınlaşma ve restenoz modelleri 13

Tablo 2.1. Damar örneklerinden elde edilen DNA konsantarsyonları 57

Tablo 2.2. Değişik boyutlarda DNA fargmanlarının ayırımı için

uygun agaroz konsantrasyonları 59

Tablo 2.3. Kullanılan tamponlar 66

Tablo 2.4. Hibridizasyonda kullanılan çözeltiler 70

Tablo 2.5. Total protein miktar tayininde kullanılan dilüsyonlar 74

Tablo 2.6. Standartların belirli konsantrasyonlarına karşı ölçülen absorbans değerleri 75

Tablo 2.7. %12.5’luk Poliakrilamit Jelin Hazırlanması 80

Tablo 2.8. Birinci Seri Deneylerde Kullanılan Aygıtlar 89

Tablo 3.1. DNA izolasyonu sonrası elde edilen absorbans değerleri 98

Tablo 3.2. Şekil 3.8’deki blot görüntüsüne ait ortalama telomerik

fragman (OTF) değerleri 105

Tablo 3.3. Şekil 4.9’daki blot görüntüsüne ait OTF değerleri 105

Tablo 3.4. Şekil 4.10’da radyoaktif işaretleme sonucu elde edilen blot görüntüsü

verilen örneklerin ortalama rölatif telomerik fragman (OTF) değerleri 106

Tablo 3.5. Plazmadaki Totatl Glutatyon Konsantrasyonu 115

Tablo 3.6. Plazma GSH/GSSG Oranları 116

Tablo 3.7. Plazma GPx Enzim Aktivitesi 117

Tablo 3.8. DNA izolasyonu sonrası elde edilen örneklerin absorbans değerleri 119

Tablo 3.9. Ortalama Telomer Boylarının Yüzdesi 127

xii

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil 1.1. Farklı ateroskleroz evrelerinde damar düz kas

hücrelerinin fonksiyonları 11

Şekil 1.2. Uç replikasyon sorunu 20

Şekil 1.3. Telomeraz enziminin üç boyutlu yapısı 23

Şekil 1.4. Telomerik kompleklsler, telomeraz ve telomer sinyallenmesinde

görev alan proteinlerin kompozisyonun şematik gösterimi 27

Şekil 1.5. Reaktif oksijen türleri ve doku hasarı 31

Şekil 1.6. Reaktif oksijen türlerinin etkileri 38

Şekil 1.7. Glutatyonun (GSH) kimyasal yapısı 43

Şekil 1.8. Glutatyonun Metabolizması 44

Şekil 2.1. Deney şeması 50

Şekil 2.2. Total protein miktarı standart grafiği 76

Şekil 3.1. Balon anjiyoplasti sonrası 0. günde hasar uygulanan ve

uygulanmayan tavşan ilyak arterlerine örnek kesitler 92

Şekil 3.2. Balon anjiyoplasti sırasında hasar uygulanan ve uygulanmayan

tavşan ilyak arterlerinin anjiyoplastiyi izleyen 14. günde alınan

örnek kesitleri 92

Şekil 3.3. Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. günde izole

Edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve Ki-67 ile etkileştirilmiş

ilyak arter kesitinde intimal kalınlaşma alanı 94

xiii


Edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve PCNA ile etkileştirilmiş


Şekil 3.5. Balon anjiyoplasti sırasında hasar verilen ve uygulama Sonrası

14. günde izole edilen damarlarda gelişen intimal

kalınlaşmada α-aktin ekspresyonu 96

Şekil 3.6. DNA izolasyonu sonrası genomik DNA’nın %0.8’lik

agaroz jele uygulanması sonucu elde edilen 1. jele ilişkin

görüntü 98

Şekil 3.7. DNA izolasyonu ve restriksiyonu yapılanörneklerin (1. jel)

Southern blot ve hibridizasyon sonrası elde edilen görüntüsü 99

Şekil 3.8.. Telomerik DNA fragmanlarının büyük ölçüde uzun olup

olmadığının kontrol edilmesi amacıyla %0.8’lik agaroz jelde

yürütülen ve ETBr ile görünür hale getirilmiş genomik DNA’nın

restriksiyon öncesi (A) ve sonrası elde edilen fragmanların (B)

jeldeki görüntüleri 100

Şekil 3.9. İkinci denemeye ilişkin (2. jel) DNA izolasyonu ve restriksiyonu

yapılan örneklerin Southern blot ve hibridizasyon sonrası

elde edilen görüntü 101

Şekil 3.10. DNA izolasyonu ve restriksiyon sonrası Southern blot ve

hibridizasyonu yapılan bir diğer deney serisine ilişkin

jelin (3. jel) görüntüsü 102

Şekil 3.11. 32P işaretleme ile elde edilen radyografi 103

xiv

Şekil 3.12. TRAP analizi sonrası elde edilen poliakrilamid jel fotoğrafı 107

Şekil 3.13. TRAPeze (Chemicon, ABD) kiti ile elde edilen telomeraz

aktivitesine ilişkin jel görüntüsü 108

Şekil 3.14. Hematoksilin-eosin ile boyanmış tavşan iliyak arter kesitleri 110

Şekil 3.15. İntimal Alan eDğerleri 111

Şekil 3.16. Lümen Alan Değrleri 111


Edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve Ki-67 ile etkileştirilmiş



Edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve PCNA ile etkileştirilmiş


Şekil 3.19. α-actin boyması 114

Şekil3.20. Telomer analizi öncesi jel fotoğrafı 120

Şekil 3.21. Restriksiyon Sonrası Jel Fotoğraf 121

Şekil 3.22.Transfer ve hibridizasyon sonrası film görüntüsü 123

Şekil 3.23. Hibridizasyonun yoğun olduğu üst bölgeler çıkarıldıktan sonra elde edilen

membran froğrafı 124

Şekil 3.24. 2. denemeye ait restriksiyon sonrası jel foroğrafı 125

Şekil 3.25. 2. membrana ait film görüntüsü 126

xv

RESİM LİSTESİ

Resim 2.1. Tavşan ilyak arter (A) ve femorel arter (B) anjiyogramı 51

Resim 2.2. Bir branül yardımı ile femoral artere girilmesi 52

Resim 2.3. Balon kateterin damar içerisinde kılavuz tel yardımı ile

İlerletilmesi 53

1. GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER

1.1. Giriş

Ateroskleroz ve neden olduğu kardiyovasküler komplikasyonlar ülkemizde ve

tüm dünyada başta gelen ölüm nedenlerinden birini oluşturmaktadır (47). Hastalığın

insan sağlığını tehdit eden özelliğinin ortaya konması, hasta ve hasta yakınlarına

psikolojik ve sosyal sorunlar yüklemesinin yanı sıra neden olduğu sağlık

problemlerinin maliyetinin çok büyük boyutlara ulaşması, önlenmesi ve denetim

altına alınması yönündeki çabaları artırmıştır. Günümüzde artık ateroskleroz ile ilgili

risk faktörlerinin büyük bir bölümü bilinmekte ve erken aterosklerotik lezyonların

gelişimi ile ilgili mekanizmaların aydınlatılmasına çalışılmaktadır (35, 61).

Damar düz kas hücre proliferasyonu ve migrasyonuna bağlı olarak meydana

gelen intimal hiperplazinin aterosklerozun ve balon anjiplasti sonrası oluşan

restenozun patojenezinden sorumlu olduğu bilinmektedir (52). Vasküler düz hücre

migrasyon ve proliferasyonu düzenleyen moleküler yolakları aydınlatmaya ve

vasküler düz kas hücre hiperplazisini önlemeye yönelik stratejileri geliştirmek üzere

çok sayıda çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte neden olan mekanizmalar büyük

oranda bilinmemekte ve etkin bir tedavi de oluşturulamamış durumdadır (105, 107).

Telomeraz enzimi kromozomların uçlarının devamından sorumlu bir

ribonükleoproteindir. Yetişkin somatik hücrelerde her hücre bölünmesi telomerik

2

DNA’dan 30-150 bç’lik kayba neden olur. RNA’ya bağımlı DNA polimeraz olan

telomeraz varlığında, telomer boyu uzatılır veya devam ettirilir ve böylece yinelenen

eskime (repetitive senesence) engellenir. Kanser hücrelerinin büyük çoğunluğunda

ayrıca hızlı çoğalan hematopoietik hücreler, endometriyal hücreler ve trofoblastlarda

değişen oranlarda telomeraz enzim aktivitesi saptanmıştır (104).

Yakın zamanda yapılan çalışmalarda telomeraz aktivasyonu ve telomer

devamlılığının genetik hipertansiyonda vasküler yeniden modellenmenin

oluşumunun temelinde yatan artan damar düz kas hücre proliferasyonunu

yönlendirdiği ileri sürülmektedir (33). Benzer şekilde, vasküler düz kas hücrelerinde,

hücre proliferasyonu sürecinde telomerazın aktive olduğu, buna karşılık telomeraz

aktivitesinin inhibisyonu ile hücre büyümesinin azaldığı da gösterilmiştir (126). Bu

kapsamda, gerek aterosklerotik lezyonlar gerekse balon anjiyoplasti sonrası oluşan

restenozda telomer devamlılığının ve telomeraz aktivitesinin rolü henüz

bilinmemektedir (108).

Bu bilgilerden hareketle bu araştırma projesinde endotel hasarı sonrası gelişen

düz kas hücre proliferasyonu ve/veya migrasyonunda telomeraz enziminin olası rolü

ile telomer devamlılığı ve restenoz arasındaki olası ilişki araştırılmıştır. Bu amaçla

tavşanlarda ilyak arterine balon anjiyoplasti uygulanmış (178) ve daha sonra izole

edilen hasar gören ve hasar görmeyen damar segmentlerinde karşılaştırmalı olarak

telomeraz enzim aktivitesi ve telomer devamlılığı araştırılmıştır. Bu kapsamda damar

segmentlerinden DNA izole edilmiş, restriksiyon enzimleri ile kesilmiş ve Southern

blot ile telomerik DNA fragmanlarının uzunluğu kantitatif olarak analiz edilmiştir.

Ayrıca telomerik fragmanların boy uzunluğu belirlenen örneklerde telomerik tekrar

amplifikasyon protokolü (TRAP) analizi ile telomeraz biyoaktivitesi araştırılmıştır.

3

Bunun yanı sıra ilyak arter segmentlerinde intimal hiperplazi oluşumunun

saptanmasına yönelik morfometrik ve immünohistokimyasal analizler yapılmıştır.

1.2. Genel Bilgiler

1.2.1. Ateroskleroz

1.2.1.1. Tanım

Ateroskleroz, endotel hasarı, lipit birikimi, monosit infiltrasyonu, düz kas

hücre proliferasyonu ve migrasyonu ve ekstraselüler matriks birikimi ile karekterize

kompleks bir arter hastalığıdır. Günümüzde ülkemizde ve tüm dünyada meydana

gelen ölüm vakalarının % 50’sinden ateroskleroz ve ona bağlı olarak gelişen

kardiyovasküler komplikasyonlar sorumlu tutulmaktadır (137, 155).

Ateroskleroz ilk kez 1950’lerin sonlarında Virchow tarafından hücrelerin

katılımı ile gerçekleşen proliferatif bir hastalık olarak tanımlanmıştır (189). O

zamandan günümüze dek aterosklerotik plak evrimini, plak komplikasyonunun

determinantlarını, akut iskemik hastalıkların sebebini anlamaya yönelik olarak

lezyonların morfolojik tipleri üzerinde çalışmalar yapılmıştır (20, 47, 161). Bu

patolojik çalışmalar aterosklerotik lezyonun hücresel elementleri arasında geniş

spektrumlu moleküler etkileşimler bulunduğunu ortaya koymuştur. Son yıllarda artan

moleküler düzeydeki biyolojik çalışmalar özellikle aterosklerozun genetik

predispozisyonu konusuna yoğunlaşmıştır. Genetik yatkınlık hastalığın gelişiminde

4

önemli bir faktör olmasına karşın çevresel, beslenmeye dayalı ve hemodinamik

faktörler de bu patojenezde önemli rol oynamaktadır. Bu nedenle aterosklerozun

daha iyi anlaşılması hastalığın evrimini yavaşlatmak, etkin terapötik yaklaşımlar ve

koruyucu stratejiler geliştirmek açısından son derece önemlidir (91).

Aterosklerotik lezyonlar daha yaşamın erken dönemlerinde, çocukluk

çağlarında çoğunlukla büyük ya da orta büyüklükteki elastik ve müsküler arterlerin

intimasında düşük dansiteli lipoprotein (LDL) ve monositlerden türeyen

makrofajların birikimi sonucu oluşmaya başlar (155). Yağ izleri olarak adlandırılan

bu en erken lezyon tipi uzun süre belirti vermeksizin ilerleyerek yaşamın ileri

dönemlerinde fibröz plak olarak adlandırılan kompleks ilerlemiş lezyonlar haline

dönüşür (153). Oluşan bu lezyonlar kalp, beyin ve ekstremitelerde iskemiye yol

açabilir ve infarktüs ile sonuçlanabilir (155). Dislipidemi, hipertansiyon, diyet,

diyabet, stres, sigara içme alışkanlığı, cinsiyet, genetik faktörler ve yaş hastalığın

patojenezi ve klinik seyri ile yakından ilişkili risk faktörlerini oluşturmaktadır (90).

1.2.1.2. Ateroskleroz Patojenezi

Ateroskleroz, endotel disfonksiyonu, inflamasyon, vasküler proliferasyon ve

matriks değişimini içeren çok yönlü kompleks bir süreçtir. Hastalığın patojenezinin

açıklanmasına yönelik çok sayıda hipotez ileri sürülmüştür. Bunlardan başlıcaları

hasara cevap, monoklonal hücre büyümesi, organize trombus ve infeksiyon

inflamasyon hipotezidir (20, 91,156, 161). Ancak bunlardan en çok kabul gören Ross

tarafından 1976’da ileri sürülen ve 1986’da yine Ross tarafından modifiye edilen

5

hasara cevap hipotezidir (154, 156). Günümüzde ateroskleroz Ross’un “modifiye

hasara cevap hipotezi” ile açıklanmaktadır. Bu hipoteze göre hasar ya da diğer bir

uyaran arterdeki hücrelerin (endotel hücreleri, monosit ve makrofajlar, trombositler)

otokrin ya da parakrin stimülasyonuna yol açarak büyüme faktörleri salınımını

stimüle etmektedir (154). Bu hipotezde birbirine alternatif iki yolağın düz kas hücre

proliferasyonu sonrası lezyon oluşumuna yol açabileği vurgulanmıştır.

Bunlardan ilkinde kronik hiperkolesterolemi başlatıcı faktör olabilir. Endotel

hücreleri kronik olarak yüksek LDL ve VLDL düzeyleri ile karşı karşıya kalırsa

endotel hücrelerinin plazma membranları ile hızlı kolesterol değişimi meydana

gelebilir. Bu olay kolesterol, fosfolipid ve protein oranlarında karmaşık değişikliklere

ve bu hücrelerin plazma membranlarının viskozitesinde değişmelere, endotel

hücrelerinden çeşitli büyüme faktörlerinin salınımına, monositlerin endotel hücre

yüzeyine yapışmasına yol açar. Monositler endotel yüzeyine yapışıp büyüme

faktörleri salıverirler daha sonra endotelyal hücreler arasından subendotelyal bölgeye

geçerek orada lokalize olurlar. Subendotelyal bölgede makrofajlara dönüşürler.

Endotelyal modifiye LDL subendotelyal makrofajlar için bir stimulus olabilir.

Bu makrofajlar reseptör aracılı endositoz ile modifiye LDL’yi bünyelerine alıp

“köpük hücreleri” ni oluştururlar. Damar duvarında görülen “yağ izleri” bu şekilde

oluşur. Makrofajlar da monositler gibi çeşitli büyüme faktörleri, kemoatraktan ve

mitojenleri salıverme yeteneğindedirler. Bu arada trombositler de değişen endotelyal

hücre yüzeyi ile etkileşir ve kemoatraktan maddeler (trombosit kaynaklı büyüme

faktörü; PDGF) salıverirler. Bu maddeler düz kas hücrelerinin arteriyel intimaya

migrasyonu ve orada prolifere olması için yeterli uyaranı oluşturur. Prolifere olan

intimal düz kas hücreleri lipidlerle yüklenerek “miyojenik köpük hücreleri” ne

6

dönüşürler. Sonuçta sürekli devam eden çeşitli büyüme faktörlerinin salınımı,

monosit yapışması ve düz kas hücre birikimi lezyonun “fibröz plak” haline

dönüşmesine yol açar. Bu plak bir bağ dokusu matriksinin çevrelediği değişik

miktarda ekstraselüler lipid içeren intimal düz kas hücrelerinden oluşur.

Makrofajlardan salınan maddeler endotel hücreleri üzerindeki hasarı daha da

artırabilir ve hatta endotel hücre kayıplarına neden olabilir. Bu nedenle trombosit

adezyon ve agregasyonu görülebilir. Büyüme faktörlerinin diğer bir kaynağını

oluşturan trombositler ve trombusun fibröz maddeleri plak içine katıldığı zaman

“kompleks aterosklerotik lezyonlar” oluşabilir (154, 156).

Hasara-cevap hipotezinin ikinci yolağına göre endotelyum kimyasal,

immünolojik, viral ya da diğer zararlı etmenlerle hasar görmesine karşın bütünlüğünü

korur. Endotel hücrelerinde oluşan zedelenme bu hücrelerin turnover’ını artırarak

endotel kaynaklı büyüme faktörleri üretmelerine neden olur. Buna PDGF’nin düz kas

hücreleri tarafından endojen olarak üretimi eşlik eder. Bu büyüme faktörleri düz kas

hücrelerinin medyadan intimaya migrasyonlarını uyarır. Bu yolakta başlangıçta bir

monosit adezyonu olmadan ve trombositler subendotelyal yapılara yapışmadan

doğrudan fibröz plak gelişebilir (154). Bu yolak diyabet, hipertansiyon, sigara içme

alışkanlığı veya ateroskleroz insidansını artıran diğer olgular için önem taşır (153).

Sonuç olarak, endotel hasarı ve endotelyal işlevdeki bozulma hasara-cevap teorisine

göre aterosklerozun başlangıç ve ilerlemesinde esansiyel rol oynar (48).

7

1.2.2. Vasküler Proliferasyon ve Ateroskleroz

Ateroskleroz endotel disfonksiyonu, enflamasyon, vasküler proliferasyon ve

matriks değişikliklerini içeren çok basamaklı süreçlerden oluşurmaktadır (3).

Vasküler porliferasyon ateroskleroz patobiyolojisinde rol oynar ve enflamasyon,

apoptosis ve matriks değişiklikleri gibi diğer hücresel süreçlerle içiçedir. Özellikle

vasküler proliferasyonun in-stent restenoz, transplante damar hastalığı ve ven bypass

graft yetmezliğinin patofizyolojisine olan katkısı oldukça önemlidir. Bu tür

rahatsızlıkların tedavisinde yeni yaklaşım hücre döngüsünün hedeflenmesi ile

vasküler proliferasyonun önlenmesidir (23, 48).

Yapılan son çalışmalar aterosklerozun tüm evrelerinde enflamasyonun yer

aldığını göstermektedir. Enflamasyonun yanı sıra damar düz kas hücre

proliferasyonu da çok önemli bir süreci oluşturmaktadır. Şekil 1.1.’de (47) farklı

ateroskleroz evrelerinde damar düz kas hücrelerinin fonksiyonları görülmektedir.

Erken aterosklerozda damar düz kas hücreleri monosit kemoattraktan protein 1

(MCP–1) ve vasküler hücre adhezyon molekülü (VCAM) gibi enflamatuar

medyatörleri üreterek ve lipoprotein tutulması için gerekli matriks moleküllerini

sentezlenmesi yoluyla aterom oluşumuna katkıda bulunduğu düşünülmektedir.

Bunların yanında, damar düz kas hücreleri fibröz bir kapak oluşturarak plağın

stabilitesinin korunmasında da önemli rol oynadıkları düşünülmektedir. Fibröz

kapağın zayıf ve ince olduğu bölgelerde damar düz kas hücrelerinin apoptosise

uğraması bunun bir kanıtı olarak gösterilmektedir (164). İleri lezyonlarda

fibroblastlar ve damar düz kas hücreleri ekstraselüler kalsifikasyon ile fibrokalsifik

bir plak oluşturmaktadırlar. Büyüme faktörleri ve damar düz kas hücrelerinin damar

8

hasarına yanıtlarının anlaşılmasına yönelik çalışmalar genel olarak hayvan arteriyel

hasar modellerini içermektedir. Hastalardan direkt veri elde etmek güçtür. Sıçan

modelinde ölmekte olan damar hücrelerinden salınan temel fibroblast büyüme

faktörü damar düz kas hücrelerinin medyal proliferasyonunu başlatırken, trombosit

kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) damar düz kas hücrelerinin intimaya göçüne neden

olmaktadırlar. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü, TGFβ, anjiyotensin II, epidermal

büyüme faktörü ve insülin-benzeri büyüme faktörü-1 intimal proliferasyon ve

matriks birikimini etkilemektedirler. Ayrıca, endotel hücrelerden nitrik oksit (NO)

salınımının azalması, reaktif oksijen türleri tarafından NO’in inakive edilmesi veya

heparan sülfat proteoglikan sentezindeki değişiklik nedeniyle ortaya çıkan büyüme

inhibitör faktörlerinin kaybı da damar düz kas hücrelerini göç etmesine

proliferasyonuna ve enflamatuar yanıtlarının artmasına katkıda bulunabilmektedirler.

Bütün bu olaylarda damar düz kas proliferasyonun öneminin algılanması ve hücre

proliferasyonunun moleküler ve hücresel mekanizmalarının anlaşılmasına yönelik

gelişmeler, antiproliferatif tedavi yaklaşımını araştırma ve geliştirmenin hedefi haline

getirmiştir (89, 91, 107, 138).

Vasküler proliferatif hastalıkların önlenmesinde denenen ilaçlar arasında

heparin, anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri, terbinafin ve trapidil gibi

büyüme faktörü antagonistleri, bir somatostatin analoğu olan anjiyopeptin, etoposit

ve doksorubisin gibi sitostatik ajanlar ve kalsiyum-kalmodulin antagonistleri

sayılabilir. Bu ilaçlarda hayvan deneylerinden elde edilen sonuçlar klinik

denemelerde beklenen başarıyı göstermemiştir. Bunun üzerine sitotoksik veya

sitostatik tedavi yaklaşımına gidilmiştir. Bunların arasında en ümit vaadeden ilaç

makrolit grubu bir antibiyotik olan rapamisindir. Son çalışmalar rapamisinin hücre

9

döngüsünün düzenlenmesi ve neointima gelişimini önlenmesindeki etkilerini ve

damar düz kas hücrelerine olan moleküler etkilerini ortaya çıkarmıştır (24, 59). Ümit

veren bir başka ilaç da paklitaksel (taksol)’dir. Paklitaksel tübülinin proliferasyonuna

neden olur ve böylece mikrotübüller oluşamaz ve hücre bölünmesini engelleyerek

hücrenin ölümüne neden olmaktadır. Paklitaksel-kaplı stentlerle yapılan klinik

denemeler lezyonun azaldığını göstermektedir.

Antiproliferatif tedavi yaklaşımları şimdiye dek restenoz ve graft yetmezliği

gibi hızlı gelişen ve lokalize proliferatif damar hastalıklarına odaklanmıştır. Oysa

ateroskleroz yavaş gelişen difüz bir hastalıktır. Bu nedenle hücre siklusunu inhibe

eden ilaçların lokal olarak kısa süreli verilmesi yaklaşımının bu durumda olasılıkla

etkin olması beklenmemelidir. Uzun süreli antiproliferatif tedavi aterosklerotik

lezyonlardaki fibröz kapağı zayıflatarak yırtılmalara açık hale getirebilir. Bunun

yanında antiproliferatif tedavi in-stent restenozun ve ven bypass graft tıkanmasının

önlenmesinde mantıklı bir tedavi yaklaşımı olabilir (29, 46).

1.2.3. Deneysel İntimal Kalınlaşma Modelleri

1.2.3.1. Deneysel Modellere Genel Bakış

Atreoskleroz gelişiminden önceki erken ve temel aşama olarak kabul edilen

intimal kalınlaşmanın patojenezinde vasküler hasar önemli rol oynar (12, 105). Bu

nedenle endotel bütünlüğünün önemini kavramak, endotelyal hasar sonrası oluşan

hücresel çoğalma cevaplarını, bu cevapların farklı vasküler hastalıkların

patojenezindeki rollerini araştırmak için çeşitli deneysel vasküler hasar modelleri

10

geliştirilmiştir (35, 43, 46, 52,58, 134, 195). Fizyolojik koşullarda küçük hayvan

türlerinin çoğunun arterlerinde diffüz intimal kalınlaşma veya intimal yastıkçıklar

oluşmaz ya da hayvanın yaşlanması ile birlikte çok yavaş olarak gelişir. Buna karşın

değişik nitelikteki hasarlara yanıt olarak tüm arterlerde intimal kalınlaşma oluşumu

görülür. Hayvanlarda restenoz ve neointima oluşumu modelleri iki ana gruba

ayrılarak incelenebilir (Tablo 1.1.).

Birinci gruptaki modellerde normal sağlıklı arterlerde endotel tabakasında

değişik tekniklerle hasar oluşturulması (denüdasyon oluşturulması) esastır.

Endotelyumun zedelenmesi balon embolektomi kateterinin hassas bir şekilde damar

içinden geçirilmesi (balon denüdasyon), balon anjiyoblasti kateterinin şişirilerek

arterin gerilmesi (balon anjiyoplasti), döner tel geçirilmesi, elektriksel stimülasyon,

damar üzerine baskı uygulanması, arterin içinden hava akımı geçirilmesi gibi değişik

yöntemlerle sağlanabilir (35, 43). Bu teknikler lipidden zengin bir diyetle kombine

edilebilir (211). Kendi içinde bu gruptaki teknikleri de intravasküler teknikler ve

perivasküler teknikler olarak ayırmak mümkündür. Sert polietilen yaka uygulaması,

elektriksel stimülasyon gibi intravasküler tekniklerin uygulanması ile hasara yanıt

olarak gelişen yeni intima, “neointima” olarak adlandırılır (7). Bunun nedeni orijinal

intimanın hasara uğratılması ya da tümüyle yok edilmesidir. Ancak yumuşak silikon

yaka modelinde olduğu gibi orijinal intimaya doğrudan hasar vermeyen tekniklerle

oluşan yanıta “intimal kalınlaşma” adı verilir.

11

Şekil 1.1.: Farklı ateroskeroz evrelerinde damar düz kas hücrelerinin fonksiyonları (VSMC: Damar düz kas hücreleri) (47).

12

İkinci gruptaki modellerde damarlara ikinci bir hasar oluşturulur. Bunun için

önce ilk grupta belirtilen tekniklerden herhangi biri uygulanarak primer lezyon

oluşturulur. Daha sonra balon anjiyoplasti uygulanarak ikinci lezyon gerçekleştirilir.

Restenoz terimi önceden daralmanın söz konusu olduğu bu durumdaki damarlar için

kullanılır (87).

Hiperkolesterolemi modeli tek başına ya da bu modellere ek olarak

uygulanabilir. Hiperkolesterolemi aslında en yaygın olarak uygulanan intimal

kalınlaşma modelidir (211). Çoğunlukla tavşanlara uygulanmakla birlikte

hiperkolesterolemik primat ve domuz modelleri insan aterosklerotik lezyonlarını en

iyi temsil eden modeller olarak kabul edilmektedir. Bu model endotel hücre

denüdasyonu ve endotelyumda morfolojik değişiklikler oluşturmaksızın intimal

lezyon oluşumuna neden olmaktadır (58). Yukarıda yapılan sınıflandırma en yaygın

olarak kullanılan intimal kalınlaşma modellerini içermektedir. Bununla birlikte bu

sınıflandırmada değinilmeyen ve endotel denüdasyonu oluşturmayan diğer intimal

kalınlaşma modelleri arasında viral hasar (herpes virüs, sitomegalo virüs ile

infeksiyon), kronik karbon monoksit inhalasyonu, endotelin ve anjiyotensin gibi

vazoaktif maddelerin kronik olarak uygulanması sayılabilir. Ayrıca yabancı protein

enjeksiyonu sonucu oluşan ve endotel denüdasyonu oluşturan immun hasar modeli

de bu deneysel modellere eklenebilir (43).

13

Tablo 1.1.: İntimal kalınlaşma ve restenoz modelleri (43)

I. DAMARA TEK HASAR UYGULANAN MODELLER

(hiperlipidemi diyetli / hiperlipidemi diyetsiz)

İntravasküler metodlar Perivasküler metodlar

EH denüdasyonu +

kısmi mediyal hasar

EH denüdasyonu +

şiddetli mediyal hasar

İntimaya direkt hasar İntimaya indirekt

hasar

balon denüdasyon

döner tel

balon anjiyoplasti

havayla kurutma

baskı uygulama

stent yerleştirme

elektriksel stimülasyon

sert polietilen yaka

yumuşak silikon yaka

II. DAMARA İKİ HASAR UYGULANAN MODELLER

Yukarıdaki metodlardan biri ile oluşturulan primer bir lezyon üzerinde anjiyoplasti oluşturulması

1.2.3.1 Perkütanöz Translüminal Koroner Anjiyoplasti (PTCA)

İlk kez deneysel olarak 1963 yılında Baumgartner (11) tarafından tanıtılmakla

birlikte bir balon katater kullanılarak uygulanan koroner anjiyoplastinin ilk klinik

uygulaması 1978 yılında Grutenzig (74) tarafından gerçekleştirilmiştir. Tanıtımından

sonra da balon anjiyoplastinin emin ve etkin olduğu gösterilmiştir. Koroner arter

bypass graft (CABG) operasyonu ile karşılaştırıldığında, PTCA kabul edilebilir bir

alternatif olarak ele alınmaktadır (52). PTCA uygulanan ve CABG operasyonu

geçiren hastaları karşılaştıran çalışmalarda ölüm ve öldürücü-olmayan miyokard

infarktüsü gibi klinik sonlanmalar açısından benzer veriler elde edilmiştir (13).

Ancak PTCA uygulanan hastalarda belirgin şekilde fazla oranda yöntemin tekrarı

gerekmiş ve hastaların büyük çoğunluğunda angina belirtileri gözlenmiştir. PTCA

14

günümüzde de her yıl 500 000’den fazla hastaya uygulanmakta ve etkin olarak

kullanılmaktadır. Ancak akut kapanma ve ilk andaki başarısızlık oranı çok düşük

olmakla birlikte, uzun süreli komplikasyon açısından restenoz hala bir sorun olmayı

sürdürmektedir (29).

Restenoz balon dilatasyonu yapılan damar bölgesinde damarın daralmasıdır.

Uygulamadan hemen sonra gelişir ve belirtilerin tekrarı ile birlikte artar. Restenozun

tam olarak mekanizması henüz aydınlatılamamıştır ancak hastalar arasında

değişkenlik göstermekle birlikte arter duvarının yeniden modellenmesi (remodeling)

ile intimal hiperplazinin bir karışımı sonucu oluştuğu bilinmektedir. Restenozu

incelemek üzere çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir (8, 58, 107). Bu modeller

aracılığı ile restenozun hücresel gelişim mekanizmaları konusunda yoğun bilgiler

elde edilmiştir (95).

İnsanda ve deneysel hayvan modellerinde yapılan çalışmalar restenozun

karakteristik histolojik özelliğinin neointimada düz kas hücre birikiminin olduğunu

göstermektedir. Balon hasarı başlangıçta medyal düz kas hücre ölümü ile birlikte

gelişir ve bunu aşağıda özetlenen olaylar izler;

i. Trombositler ve lizize uğrayan hücrelerden salıverilen büyüme faktöleri

tarafından medyal düz kas hücrelerinde proliferasyon başlar,

ii. Trombosit-kaynaklı büyüme faktörü (PDGF) başta olmak üzere kemo-

atraktanlara yanıt olarak medyal düz kas hücreleri intimaya göç eder,

iii. İntimal düz kas hücrelerinde proliferasyon gelişir,

iv. Sentetik bir fenotipe dönüşen düz kas hücrelerince kondroitin sülfat ve

hyalüronan gibi ekstraselüler matriks moleküllerinin yapımı artar,

15

v. Matriks metaloproteinazlar tarafından ekstraselüler matriksin aşırı yıkımı

ile vasküler yeniden modellenme gelişir.

Bu olayların bir birleşimi olarak meydana gelen ve sonuçta luminal daralmaya

neden olan olay ve bunun yanı sıra bu süreçte her aşamada rol oynayan faktörlerin

anlaşılabilmesi restenozun terapötik yaklaşımında yeni hedeflerin belirlenebilmesine

olanak sağlayacaktır. Bu açıdan bakıldığında balon hasarı sonrası salıverilen

mitojenler ve kemoatraktanlara verdikleri yanıt olarak medyal düz kas hücrelerinin

farklılık gösterdiği açıktır. Düz kas hücrelerinin proliferasyonu ve fenotipik

modülasyonu restenozun deneysel modellerinde arteriyal yanıtın en önemli

özelliklerini oluşturmaktadırlar (115, 196).

Hayvan modelleri

Restenozun mekanizmasını aydınlatmaya yönelik olarak gerçekleştirilen

deneysel çalışmaların büyük çoğunluğu sıçan ve tavşan karotid arteri kullanılarak

uygulanmıştır. Kullanılan bu arterlerin çapının insan koroner arterinden daha az

olması nedeniyle bir anjiyoplasti kateteri kullanılması mümkün olmamış, bu

çalışmaların büyük çoğunluğunda bir Fogarty embolektomi kateteri kullanılmıştır.

Tam olarak bir de-endotelizasyon (endotelsizleştirme) oluşturabilmek için, kısmen

şişirilmiş bir kateterin arter yatağında tekrarlanarak çekilmesi gerekmiştir. Bu

anlamda arter duvarının maruz kaldığı kuvvet büyüklük ve doğası açısından klinik

uygulamada gerçekleştirilenden farklılık göstermektedir. Bir diğer sorun ise, koroner

anjiyopasti daha önceden var olan bir hastalığa karşı arterleri dilate etmek için

16

uygulanırken, deneysel hayvan modelleri kullanılan çalışmaların bulgularının normal

arterleri yansıtması ile ilişkilidir.

Tavşan Modeli

Balon hasarına ilişkin tavşan modeli ilk kullanılan deneysel yöntemlerden

birisidir (211). Tavşanlar aterojenik diyete çok çabuk ve kolay yanıt verirler, diyete

başlandıktan kısa bir süre sonra hiperlipidemi ve erken lezyonlar gelişir. Bu anlamda

ilk çalışmalar Tashiro ve arkadaşları (184) tarafında yapılmıştır ve bu araştırıcılar

doymuş yağ asidlerinin az miktarları ile beslenen tavşanlarda serum lipid düzeyleri

değişmeksizin intimal kalınlaşma geliştiğini saptamışlardır.

İzleyen yıllarda tavşanlarda balon hasarı sonrası oluşan hücre kinetikleri ile

ilgili ayrıntılı veriler sunulmuştur. Bu verilere göre 14. gün sonunda rendotelizayon

tamamlanır, ayrıca vasküler permeabilite faktörlerinin katkısı ile artabilir. Hücre

proliferasyonu medyal hücreler açısından 7., intimal hücreler açısından 14. günde

maksimuma ulaşır; bir ay içinde de bu değerler normal döner (39, 41).

17

1.2.4. Telomerler

Telomerler ökaryotik kromozomların fiziksel uçlarıdır. İlk olarak 1938’de

Muller tarafından kromozom uçlarının özelleşmiş yapılar olduğu Drosophila’da

yaptığı çalışmalar sonucunda önerilmiş ve telomer terimi kullanılmıştır (16).

Telomerler kromozomun yapısal bütünlüğünün korunmasında önemli rol oynarlar

(17, 145). DNA uçlarının tam olarak replike olmasını ve stabilitesini sağlarlar (67).

Kromozomun replikasyon sürecine aracılık ederler. Hücre yaşlanma sürecini

düzenlerler böylece hücrenin ömrünü belirlerler (110). İnsan kromozomlarının

telomerleri 15 kilobaza kadar uzayabilen guanozinden zengin basit telomerik

hekzanükleotid tekrar dizilerinden oluşur. Telomerik DNA genel yapısı (T veya

A)m(G)n şeklindedir. Omurgalılarda ise (TTAGGG)n tekrar dizilerinden oluşur (110).

Telomerik baz dizileri hücresel DNA’yı kararlı halde tutar ve onları yeni

kombinasyonlardan (end to end fusion) korur (149). Tek bir hücrede türüne bağlı

olarak 40.000–1.000.000 telomerik tekrar bulunabilir (67, 148).

Telomerler normal hücrelerde in vivo koşullarda yaş ile birlikte veya normal

hücre kültürlerinde kromozomal DNA’nın bir fonksiyonu olarak progresif bir

kısalma ile metabolize olurlar. Konvansiyonel DNA polimerazların sadece 3’-5’

doğrultusunda DNA’yı replike edebilmeleri nedeniyle telomerlerin en uçta kalan

kısmını yenilemedeki yetersizlikleri sonucu her bir kromozom replikasyon

döngüsünde 5’ ucundan ~150 baz çifti kaybederler. Yeni sentez edilen DNA

dizisinin sentezi küçük RNA primerlernin kullanılması ile gerçekleşir. Bütün DNA

dizisi sentezlenip 5’ ucunun sonuna gelindiğinde primer en son kısma bağlanır fakat

karşı tarafta sentezlenecek kısım kalmadığı için ayrılır ve degrade olur (122).

18

Böylece DNA replikasyonun sonunda tamamlanamayan replikasyon sonucu tek

taraflı dizi kalır. Bu da sentezlenen DNA’nın 5’ ucunun kalıp DNA’nın 3’ ucundan

daha kısa olacağı anlamına gelir. Bu durum “uç replikasyon sorunu” (end replication

problem) olarak bilinir (40) (Şekil 1.2.). Böylece hücre bölünme sayısı artıkça,

telomer boyu kısalır. Bir popülasyonda hücrelerin bölündüğü ölçüde telomerler

kısalır. DNA replikasyonuna bağlı telomer boyundaki bu kısalma hücre yaşlanma

sinyalinin ortaya çıkmasında mitotik bir saat görevi görür. Telomerler hücre

bölünmesiyle birlikte kritik bir noktaya kadar kısalmaya devam ederler. O kritik

noktada hücre yaşlanma sürecine girer ve daha fazla bölünmeyip hücre bölünme

siklusundan çıkar (159). İn vitro koşullarda kültüre edilen normal memeli

hücrelerinin de sınırlı sayıda prolifere olduğu bilinmektedir.

Buna “Hayflick Limiti” denir (81). Daha sonra yaşlanma (state of senescence)

sürecine girerler. Metabolik olarak aktiftirler fakat replike olamazlar. İrreversibl

olarak hücre siklusunun G1 fazında bloke edilirler ve mitojenik uyarıya yanıt

vermezler, fakat canlıdırlar ve metabolik olarak aktiftirler (78, 98). Hücrelerin bu

yaşlanmış fenotipleri normal hücrelere göre morfoloji, nükleer yapı, gen

ekspresyonu, protein işleyişi ve metabolizması açısından farklılık göstermektedirler.

Bu hücrelerin önemli bir kısmı yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz ile boyanırlar ve

tümör baskılayıcı genler olan p53, p21 ve p16 upregüle olur (10,127). Telomerlerin

yaşlanma süreci ve yaşlanma ile ilişkili hastalıklarda biyobelirteç olabileceği öne

sürülmüştür (27, 57, 128, 194).

19

Organizmalar belirli koşullarda telomer kısalmasına karşı telomer kaybını kompanse

etmek için kompleks mekanizmalar geliştirmişlerdir. Şu ana dek 3 tip telomer

devamlılığı mekanizması saptanmıştır (110, 145):

1. İnsan hücrelerinde telomeraz ile telomerlerin yeniden sentezi öncül baskın

mekanizmadır.

2. Drosophila melanogaster’de telomerik DNA kromozom uçlarına spesifik

retrotranspozonların transpozisyonu ile telomerler uzatılabilmektedir.

3. Mayada ise non-resiprokol telomerik DNA’nın telomerler arasına

rekombinasyonu ile telomerler uzatılabilmektedir.

1.2.4.1. Telomer Devamlığının Korunması

Belli bir sürede ökaryotik bir organizmada telomeri kısaltan ve uzatan

mekanizmalar denge halindedir. Telomerler türe spesifik korunmuş DNA

dizilerinden ve bu dizilere bağlanan telomer bağlayan proteinler (Telomere-binding

proteins, TBP) olarak bilinen proteinlerden oluşmuşlardır (159). Telomerik DNA

TBP’ler ile birlikte özel bir yapı oluşturur ve bu yapı kromozomların tek başına

varlığını korur. Telomerik DNA’nın yapısı bozulduğunda zamanla fonksiyonlarını

kaybederler ve kromozomları tek bir bütün yapıda tutamazlar (203). Telomer

fonksiyon kaybının ilk belirtisi uç uca kromozom füzyonunun bir sonucu olarak

disentrik kromozomların ortaya çıkmasıdır. Bu nedenle telomer fonksiyon kaybının

en önemli belirteci telomer kısalmasının normal sınırların altına düşmesidir. İnsan ve

hayvan deneyleri bu bulguyu desteklemektedir (111).

20

Şekil 1.2: Uç replikasyon sorunu (End replication problem) (40).

Telomer dengesinin düzenlenmesinde başlıca düzenleyiciler TBP’lerdir.

Memeli hücrelerinde bunlardan en önemlileri telomer tekrar faktörü 1 (telomere

repeat factor1-TRF1) ve TRF2’dir (187). Bu proteinlerin aşırı ekspresyonu

telomerlerin kısalmasına neden olur. Bu da telomeri uzatan faktörlerin negatif

düzenleyicileri oldukları anlamına gelmektedir. Telomerlerde TRF1 ve TRF2

moleküllerinin sayıca kritik bir düzeyin altına düşmesi telomerazı uyarır. Buradan da

anlaşılacağı gibi, memeli hücreleri protein sayımını içeren bir mekanizma ile telomer

boyunu düzenlerler. Bu mekanizmada görev alan diğer telomerik proteinler tankiraz,

TIN2, hRAP1, TANK2 ve pot1’dir. Bu moleküllerden bazıları telomer boyunun

düzenlenmesinde TRF1 ve TRF2 ile birlikte çalışırlar (42, 75).

21

Telomerin fonksiyonu telomerin yapısı ile yönlendirilir. Gerek maya gerekse

insan telomerlerinde 3’ uzantılar bulunmaktadır. Bu uzantılar aslında DNA çift

sarmak kırıklarından farksızdır ve DNA hasarını belirleyen hücresel

mekanizmalardan korunmalıdır. Memeli telomerleri elektron mikroskobu

incelendiğinde telomerlerde bazı kıvrımların varlığı gösterilmiştir. 3’ uzantılar geriye

doğru katlanır. DNA çift sarmalı üzerinde dolanarak T-kıvrımını oluşturur (73).

Daha sonra serbest olan 3’ ucu iki sarmalın arasına girer ve D-kıvrımını oluşturur. T-

kıvrımının oluşmasına TRF2 aracılık etmektedir. Diğer TBP’ler de kıvrım

içerisindeki yerlerini alırlar. Kıvrım yapısı serbest kalan 3’-ucunu koruyarak DNA

hasarını ve onarım sinyallerinin aktive olmasını önler. Böylelikle kromozoma

stabilite sağlar (171).

1.2.4.2. Telomer Devamlılığı ve Apoptosis (159, 171)

Telomer devamlılığı ve apoptosun kontrolü arasında bir bağlantı olduğu

düşünülmektedir. Telomeraz eksikliği olan farelerde telomer kısalması ve telomerik

füzyonlar ile birlikte apoptosis seviyesinin da artığı gösterilmiştir. Apoptosis üreme

ve homeopoetik sistem gibi yüksek oranda proliferatif dokularda gözlenmektedir

(159). İnsan hücrelerinin TBF’lerinin genetik olarak manipüle edildiği bir çalışma

telomer devamlılığı ve apoptozun kontrolü arasındaki bağlantıyı ortaya çıkarmıştır.

Bu çalışmada TRF2’yi kodlayan gen mutasyona uğratıldığında apoptos düzeyinin

artığı gösterilmiştir. TRF2’nin telomer boyunu düzenlediği, telomerik füzyonları

önlediği ve T-kıvrımlarının oluşumuna katkı sağladığı bilinmektedir. TRF2

yokluğunda telomerler fonksiyon kaybına uğrarlar. Fonksiyon kaybı olan

22

telomerlerin G-uzantıları olmayabilir ve bu nedenle de T-kıvrımlarını oluşturamazlar.

Bu da disentrik kromozomların ortaya çıkmasına neden olur. Yapıdaki bu

değişiklikler hücre bölünmesinin normal akışını etkileyerek hücre yaşlanması veya

apoptosa yol açar. Bazı durumlarda Werner Sendromu gibi prematüre yaşlanma

sendromuna neden olabilir (159).

1.2.5. Telomeraz

Telomeraz telomerik DNA sentezlemede kendi RNA kalıbını kullanan bir

revers transkriptaz enzimidir. RNA altünitesi ve çeşitli protein komponentlerini

içeren büyük bir ribonükleoprotein kompleksidir (37). İlk olarak 1985’te Greider ve

Blackburn adlı araştırmacılar tarafından Tetrahymena thermophila’da varlığı

gösterilmiştir (65). Çoğu normal somatik hücrede telomeraz aktivitesi bulunmazken

kanser hücrelerinin ve in vitro ölümsüzleştirilmiş hücrelerin %90’ında telomeraz

aktivitesi bulunmaktadır (40, 97, 168). Epidermis bazal tabakası (208), menstrüel

siklusun proliferatif fazında endometriyal doku (104) ve oral mukoza hücreleri (93)

gibi yüksek proliferatif özellik gösteren bazı normal hücrelerde de telomeraz

aktivitesi saptanmıştır (130).

23

Şekil 1.3.: Telomeraz enziminin 3 boyutlu yapısı. Enzim en az bir RNA altbirimi ve protein altbirimi (katalitik altbirim) içerir. RNA altbirimi telomer sentezi için gerekli RNA kalıbını içerir. Telomer üzerinde dkG-quadruplex yapısı bulunmaktadır.

Telomerazın iki ana komponenti bulunur (144):

1. Fonksiyonel RNA komponenti

2. Katalitik komponenti

1.2.5.1. Telomerazın RNA komponenti

İnsanda kısaca hTR veya hTERC olarak gösterilir. RNA komponenti telomerik

DNA’nın sentezinde kalıp görevi görmektedir. İnsan telomeraz RNA’sı (hTR) 451

nükleotid uzunluğundadır. hTR’yi kodlayan gen 3. kromozomda bulunmaktadır. 11

nükleotidlik kalıp bir dizi (5’-CUAACCCUAAC–3’) telomerik tekrarları

(TTAGGG)n kodlar (114). Bazı spesifik nükleotidler RNA’yı enzimin aktif

bölgesinde tutabilmek için DNA primer substratındaki yapısal komponentler ve

protein altbirimleri ile etkileşirler (66).

24

1.2.5.2. Telomerazın Katalitik Komponenti

İnsanda hTERT olarak gösterilir. Revers transkriptaz aktivitesi gösteren

katalitik kısımdır. İnsan telomeraz revers transkriptazı veya hTERT 127 kDa’luk bir

polipeptiddir ve 5. kromozomda bulunan bir gen tarafından kodlanmıştır (66).

hTR ve hTERT telomerazın minimum çekirdek yapısını oluştururlar. hTR

telomeraz aktivitesinden bağımsız olarak hemen her dokuda eksprese edilir. Kanser

hücrelerinde ise genel olarak hTR ekspresyonu normal hücrelere göre artmıştır.

Katalitik komponent olan hTERT’in ekspresyonu ise hücredeki telomeraz

aktivitesine bağımlıdır. hTERT normal hücrelerde baskılanırken tümör dokusunda ve

ölümsüz hücrelerde upregüle olur. Telomeraz-negatif hücrelerde ektopik olarak

hTERT ekspresyonu telomeraz aktivitesini başlatmak, telomerleri uzatmak ve hücre

yaşam süresini artırmak için yeterlidir. Bu da hTERT’in, enzim aktivitesinin başlıca

belirleyicisi olduğunu göstermektedir (40).

Telomerazın protein komponentinde yer alan başka bir protein ise telomeraza

bağımlı protein-telomerase associated protein (TEP1)’dir. TEP’in telomeraz

enziminin yapısını kontrol etmede ve çeşitli regülatör faktörün enzime bağlanmasını

düzenlemede rolünün olduğu düşünülmektedir (37).

25

1.2.5.3. Telomerazın Regülasyonu

Telomeraz enzim aktivitesi birkaç farklı düzeyde kontrol edilir.

1. Transkripsiyonel regülasyon:

hTR ve hTEP1’in normal dokularda eksprese olmaslarına karşın, hTERT çoğu

normal somatik dokuda represe edilmektedir. Tümör dokularında ise aktif hale

geçmektedir. Bu da hTEP1 ve hTR’nin inaktif bir kompleks halinde bulıunduğu ve

enzim aktivasyonu için hTERT’in varlığına ihtiyaç duyulduğunu düşündürmektedir.

hTERT farklı durumlarda çeşitli transkripsyon faktörleri düzenlenir (2). C-Myc’nin

telomerazı aktive ettiği gösterilmiştir. NO’in telomerazı aktive ederek endotel hücre

yaşlanmasını geciktirdiği bildirilmiştir (188). Östrojen de telomerazı aktive eden

diğer bir faktördür. Bunun yanında hTERT’in promoter kısmının metilasyonu veya

ilişkili histonun deasetilasyonu genin transkripsiyonunu represe etmektedir (68, 79).

2. Diğer proteinlerle etkileşim

Telomerazın regülasyonunda posttranslasyonel mekanizmalar da etkilidir.

Telomerazın optimal konformasyonu ve aktivitesi diğer proteinlerle etkileşmesini

gerektirmektedir. hTR ve hTERT’in transkripsiyonal düzeyde düzenlenmesi

belirleyici ana faktördür. Bunun yanında post-transkripsiyonel mekanizmalar da rol

oynar. hTEP1’in NH2 bölgesinden bir peptid olan TEIPP1’in spesifik olarak

telomeraz aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu da hTEP’in düzenleyici

faktörler ile etkileşip enzimin konformasyonunu etkileyerek regülatör bir rol

oynadığı fikrini desteklemektedir (84, 79).

26

3. Fosforilasyonun rolü

hTERT’in fosforilasyon durumu da telomerazın katalitik aktivitesinin

düzenlenmesinde etkilidir. Protein fosfotaz 2A (PP2A) ve c-Abl tirozin kinaz

telomeraz fonksiyonunu negatif yönde regüle ederken PKC ve Akt protein kinaz

telomeraz aktivitesini upregüle eder (96). Bu bulgular fosforilasyon ile telomerazın

aktive olduğunu, defosforilasyon ile de telomerazın inaktive olduğunu

göstermektedir (75).

1.2.5.4. Telomeraz İnhibitörleri

Telomeraz inhibitörleri etki yerlerine göre 2 gruba ayrılabilirler: Telomeraz ile

etkileşen bileşikler ve telomer ile etkileşen bileşikler.

1.2.5.5. Telomeraz ile Etkileşen Bileşikler

1. Antisense Oligonükletidler: Bunlar telomerik tekrarları taklit eden

deoksiriboz oligonükleotidlerdir ve hTR’nin kalıp bölgesine karşı

yönlendirilmişlerdir. Bu grupta en çok çalışılan ilaç fosforotiyoattır. RNA’ya bağlı

iken RNA’nın bağlanmasını önler ve translasyonu durdurur (37, 79).

2. Peptid Nükleik Asitler (PNA’lar): PNA’lar non-iyonik bir omurga içeren

modifiye oligonükleotidlerdir. Nükleotidler ve PNA’lar arasındaki bağın yüksüz

oluşu hedeflenen nükleik asitler ile hibridizasyon hızını ve afinitelerini artırır. Bu da

proteazlar ve nükleazlar ile degrade olmaya karşı daha etkin bir şekilde karşı

27

koymalarını sağlar. PNA’lar antisense etkilerini RNA’nın işleyişini bloke ederek

gösterirler. PNA’lar telomerazın RNA komponentini (hTR) hedeflerler ve spesifik

olarak hTR’nin aktivitesini inhibe ederler (37, 79).

3. 2’-O-methyl-RNA molekülleri: Bu moleküller telomerazın çok güçlü

inhibitörleridir. Kimyasal yapılarının DNA’ya benzemesi nedeniyle telomeraz

kompleksi tarafından substrat olarak tanınmada avantaj sağlarlar (37, 79).

Şekil 1.4: Telomerik kompleksler, telomeraz ve telomer sinyallenmesinde görev alan proteinlerin kompozisyonunun şematik gösterimi (96).

28

4. Antibiyotikler: Son gelişmeler hTR’ye karşı bazı antibiyotiklerin de

inhibitör etkiye sahip olabileceğini göstermektedir. Neomisin gibi aminoglikozitler

ve kinolon antibiyotikleri yüksek konsantrasyonlarda insan tranisyonel karsinoma

hücre kültüründe büyüme inhibisyonuna ve telomeraz aktivitesinde azalmaya neden

olmuşlardır (37).

5. Proteinler: HIV gp120, TGF-β1 ve pRb gibi bazı iyi karakterize edilmiş

proteinlerin telomerazı inhibe ettikleri gösterilmiştir. Prostaglandin A1’in de

telomerazı inhibe ettiği gösterilmiştir. Proteinler hücre içine hedeflenmesi zor

bileşiklerdir. Bu nedenle de yakın zamanda klinik uygulamada yer almaları mümkün

görünmemekle birlikte telomerazın düzenlenmesinde ve ileride modifiye bileşiklerin

geliştirilmesinde rol oynayabilirler (37).

6. Gen Modülatörleri: Retroviral vektörler kullanılarak hTERT’in inaktif

mutantını kodlayan bir genin hücre içine sokulması tümör hücrelerinde var olan

telomeraz aktivitesinin kesintiye uğramasına neden olmuştur. Bu durum hem in vitro

hem de in vivo koşullarda gösterilmiştir (37).

7. “Hammerhead” Ribozimler: Bu bileşikler 40-50 bazlık katalitik RNA

dizileridir; GUC gibi trinükleotid dizilerine karşı aktivite gösteren katalitik bölgesi

bulunur (37, 96)

8. Nükleozid ve Non-nükleozid Revers Trankriptaz İnhibitörleri: Bu bileşikler

telomerazın polimeraz aktif bölgesi ile etkileşirler. HIV’e karşı etkili olduğu bilinen

bileşiklerdir. AZT ve ddG’nin uzun süreli hücre kültürlerinde telomerazı inhibe

ettikleri gösterilmiştir (37).

29

1.2.6. Alternatif Telomer Uzaması (ALT)

Tümör hücrelerinin %90’ında telomer devamlılığı telomeraz aktivitesi ile

sağlanır (121). İnsan kanser olgularının ~%10’unda belirlenebilen bir telomeraz

aktivitesi yoktur (14, 19). Bu durumda telomer devamlılığı alternatif telomer uzaması

(ALT) olarak adlandırılan telomerazdan-bağımsız mekanizmalar ile gerçekleştirilir

(146). Bunlardan en önemlisi rekombinasyondur. Rekombinasyonal Telomer

Uzunlaması (RTE) birçok farklı durumda telomer devamlılığının sağlanmasından

sorumludur. ALT tümörleri ve hücre kültürlerinde boyları yüksek oranda heterojenite

gösteren telomerlere sahiplerdir. Boyları 1kb’dan 20kb’a dek farklılık gösterebilir.

Diğer bir özellikleri de ALT ile ilişkili promiyelositik lösemi (PML) cisimciklerinin

bulunmasıdır (26, 82).

1.2.7. Oksidatif Stres Ve Reaktif Oksijen Türleri

Reaktif oksijen / nitrojen türleri (ROS / RNS) ve serbest radikaller normalde

vücutta sürekli olarak oluşmakta ve anti oksidan savunma sistemi ile ortadan

kaldırılmaktadır. Belli bir miktara kadar ROS /RNS üretimi sağlık için gereklidir.

Örneğin ROS /RNS immün sistemin mikroorganizmaları atmasında yardımcıdır (4).

Sağlıklı bireylerde serbest radikallerin oluşum hızı ile bunların ortadan kaldırılma

hızı bir denge içerisindedir ve bu durum “oksidatif denge” olarak adlandırılır.

Oksidatif denge sağlandığı sürece organizma, serbest radikallerden

etkilenmemektedir. Bu radikallerin oluşum hızında bir artma ya da ortadan

kaldırılma hızında bir düşme bu dengenin bozulmasına neden olur. “Oksidatif stres”

30

olarak adlandırılan bu durum özetle: serbest radikal oluşumu ile antioksidan savunma

mekanizması arasındaki ciddi dengesizliği göstermekte olup, sonuçta doku hasarına

yol açmaktadır (166) (Şekil 1.5). Bazı hastalıklarda artan oksidatif /nitrosatif stres

hastalık patolojisine önemli katkıda bulunabileceği gibi hastalık patolojisinden de

kaynaklanabilir. Oksidatif dengenin ROS /RNS lehine artması sonucu oluşan fazla

miktarda serbest radikal hücre yapısını ve canlılığını ciddi şekilde etkileyen lipidler,

proteinler ve nükleik asit bazları gibi hemen hemen her tür biyolojik moleküller ile

reaksiyona girer. Özellikle tiyoller, proteinler ve lipidler gibi hücre sinyallemesinde

önemli role sahip hücresel hedefler serbest radikallerden etkilenirler (4).

1.2.8. Reaktif Oksijen Türleri Ve Hücresel Kaynakları

Birçok ROS /RNS çiftlenmemiş elektrona sahiptir ve bu nedenle de serbest

radikaldir. Bunlar süperoksit anyonu (.O2-), hidroksil radikali, (.OH), nitrik oksit

(.NO), nitrojen dioksit (.NO2) ve lipid radikalleridir. Diğer ROS /RNS ise hidrojen

peroksit (H2O2), peroksinitrit (ONOO-), peroksinitröz asittir (HOCl). Bunlar serbest

radikal değillerdir fakat oksidatif strese katkıda bulunan oksitleyici etkileri

bulunmaktadır. (209)

31

Şekil 1.5: Reaktif oksijen türleri ve doku hasarı

Hücresel olarak herhangi bir reaktif oksijen türünün üretilmesi radikal zincir

reaksiyonları vasıtasıyla diğerlerinin de üretilmesine yol açabilir. Örneğin, hücre

membranında çoklu doymamış yağ asitleri ile radikallerin reaksiyonu sonucu yağ

asidi peroksil radiakalleri (R-COO·) oluşabilir. Bunlar da komşu yağ asidi yan

zincirlerine saldırıp diğer lipid radikallerinin üretimini başlatabilirler (31). Zincir

reaksiyon sonucu üretilen lipid radikalleri hücre mebranında birikirler ve

plazmolemma sızıntısı ve veya membrana bağlı reseptörlerin disfonksiyonu gibi bir

çok hücresel fonksiyonu etkilerler. Lipid peroksidasyonunun son ürünleri olan

doymamış aldehitler ve diğer metabolitler sitotoksik ve mutajenik özelliklere

sahiptirler (31).

32

1.2.9. Reaktif Oksijen Türlerinin Düzenlenmesinde Rol Alan Oksidan ve

Antioksidan Enzim Sistemleri

1.2.9.1. Oksidan Enzin Sistemleri

Memeli hücrelerinde, ROS üretimine neden olan potansiyel enzim kaynakları,

araşidonik asit yolağı enzimleri lipoksijenaz ve siklooksijenaz, sitokrom P450,

ksantin oksidaz, NADH/NADPH oksidaz, nitrik oksit sentaz, peroksidazlar ve

hemoproteinlerdir (197). Bunlardan üçü kardiyovasküler sistemde yaygın olarak

çalışılmıştır:

1.2.9.1.1. NAD(P)H Oksidaz

NADH/NADPH oksidaz damarlarda süperoksit üretiminden sorumlu başlıca

enzimdir. NADH/NADPH oksidaz vasküler patojenezde rol oynayan sitokinler,

hormonlar ve mekanik güçlerle düzenlenir. Vasküler düz kas hücrelerinin

anjiyotensin II, trombin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü, tümör büyüme faktörü-

α ve laktozilseramit vasküler ROS üretimini ve NADH/NADPH oksidaz üretimini

artırırlar (31). Bu enzimin alt üniteleri kesin olarak tanımlanamamıştır, bu nedenle de

nasıl etkileşim gösterdikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Bununla beraber aktive

olduğunda süperoksit üretimini artırarak NO biyoyararlanımını azaltarak endotel

disfonksiyona neden olduğu ve çeşitli patofizyolojik koşullarda vasküler

hastalıkların oluşumunda önemli bir role sahip olduğunu düşünülmektedir (31).

33

1.2.9.1.2. Ksantin Oksidaz

Ksantin oksidoredüktaz pürin metabolizmasında ksantin ve hipoksantinin

oksidasyonunu katalize eden bir enzimdir. Birbirine dönüşebilen iki formda

bulunabilir: Ksantin dehidrogenaz veya ksantin oksidaz. (31). Ksantin oksidaz

moleküler oksijeni redükleyerek süperoksit ve hidrojen peroksit oluşumuna neden

olur. Patolojik koşullarda ksantin oksidaz aktivitesi artar ve yüksek miktarlarda

reaktif oksijen türlerinin üretimine neden olur. Enzim sadece vasküler düz kas

hücrelerinde eksprese olmaz. Aynı zamanda plazmada dolaşarak endotel hücrelerin

ekstraselüler matriksine bağlanır (196).

1.2.9.1.3. Endoteliyel Nitrik Oksit Sentaz

Fizyolojik koşullarda endoteiyel nitrik oksit sentaz L-arjininin L-sitrüline

oksidasyonunu katalizler. Bu reaksiyon sonucunda yan ürün olarak nitrik oksit (NO)

açığa çıkar (196) Bazı koşullarda NOS nitrik okside ilave olarak süperoksit

oluşumuna neden olabilir (183). eNOS elektron transportu için oksijenaz

bölgesindeki hem grubuna yakın bağlanma bölgesi bulunan tetrahidrobiyopterin

kofaktörüne ihtiyaç duymaktadır. L-arjinin veya tetrahidrobiyopterin yetersizliğinde

veya tetrahidrobiyopterin’in yükseltgendiği durumlarda ortaklanmamış elektronlar

moleküler oksijeni NO yerine süperoksite dönüştürürler. (183, 196). Özellikle

hipertansiyonda NAD(P)H oksidazların aktive olması tetrahidrobiyopterinin

oksidasyonuna neden olur ve yüksek miktarlarda süperoksit açığa çıkar (183)

34

1.2.9.2. Antioksidan Enzim Sistemleri

1.2.9.2.1. Superoksit Dismutaz (SOD)

Süperoksit dismutazlar (SOD) bütün vasküler hücrelerde süperoksite karşı

başlıca savunma sistemini oluştururlar. Bu enzimler katalitik merkezlerinde redox

metaller içerirler ve süperoksit radikallerinin hidrojen peroksite dismutasyonunu

katalizlerler. Reaksiyonu aşağıdaki gibidir:

2H+ + 2O2ֿ H2O2 + O2

Günümüze dek üç farklı SOD izoformu tanımlanmıştır: Sitozolik bakır/çinko-

içeren SOD (Cu/ZnSOD veya SOD-1), mitokondriyal mangan-içeren SOD (MnSOD,

SOD-2) ve ekstraselüler SOD (ecSOD, SOD-3). EcSOD da aslında bakır/çinko-

içeren bir enzim olmasına rağmen genel olarak damar düz kas hücrelerinden

salgılanıp, endoteliyel hücre yüzeyinde bulunan vasküler ekstraselüler matriks

içerisindeki glikozaminoglikanlara bağlanır. EcSOD

Vasküler interstisyumun oksidan durumunun düzenlenmesinde önemli rol

oynamaktadır (196).

1.2.9.2.2. Glutatyon Peroksidaz

Glutatyon peroksidaz (GPx) selenyum içeren antioksidan bir enzimdir.

Hidrojen peroksidin ve lipit peroksitlerin sırasıyla suya ve lipit alkollere

indirgenmesini katalize etmektedir (5). Bu reaksiyon sırasında aynı zamanda

35

indirgenmiş glutatyonu glutatyon disülfite yükseltgemektedir. Ortamda yeterince

glutatyon veya glutatyon peroksidazın bulunmadığı durumlarda hidrojen peroksit ve

lipit peroksitleri detoksifiye edilemez ve Fe+2 gibi geçiş elementleri aracılığı ile

hidroksil radikallerine ve lipit peroksil radikallerine dönüşebilirler (196).

1.2.9.2.3. Katalaz

Katalaz çoğunlukla hücresel peroksizomlarda, az miktarlarda da sitozolde

lokalize olan hücreiçi bir antioksidan enzimdir. Hidrojen peroksidin suya ve

moleküler oksijene dönüşümünü katalize etmektedir. Reaksiyonu aşağıdaki gibidir;

2H2O2 2H2O + O2

Hidrojen peroksidi yok ederek SOD tarafından hidrojen perokside

dönüştürülen süperoksit radikallerini de indirekt olarak detoksifiye etmektedir.

Katalaz enzimi aynı zamanda peroksidaz enzim aktivitesine de sahiptir. Organik

peroksitlerle ve hidrojen donörleri ile reaksiyona girerek onları suya ve organik

alkollere dönüştürür. Yüksek düzeydeki oksidatif streste çok etkindir ve hücreyi

hücre içinde oluşan hidrojen peroksitten korur (196). Katalaz enzimi ortamda

glutatyon içeriğinin veya az GPx aktivitesinin yetersiz olduğu durumlarda özel

öneme sahiptir ve hücrelerin adaptif yanıtında oksidan strese tolerans gelişiminde

büyük rol oynamaktadır (60).

36

1.2.9.2.4. Tiyoredoksin Redüktaz

Tiyoredüksin redüktaz tiyole bağlı hücresel indirgenme süreçlerinde görev

yapan antioksidan bir enzimdir. Bu enzim yükseltgenme reaksiyonlarında redüktör

olarak görev alan yükseltgenmiş tiyoredüksinin tiyoredoksine geri indirgenmesini

katalize etmektedir. Ayrıca lipit hidroperoksitleri indirgeme özelliği de

bulunmaktadır. Glutatyona bağlı disülfit redüksiyonunu katalize eden tiyoredoksin ve

glutaredoksin plazma glutatyon peroksidazın redüktanlarıdır. Bu da ortamda

glutatyon seviyesinin düşük olduğu durumlarda glutatyon peroksidin hidroperoksidi

indirgemesini sağlar. Ayrıca tiyoredeoksinin MnSOD ekspresyonunu artırdığı

gösterilmiştir. Tiyoredoksin sistemi oksidatif stres ile inaktive olan proteinleri etkin

şekilde rejenere edebilmektedir (196)

1.2.10. Oksidan Stres ve Kardiyovasküler Hastalıklar

Artmış serbest oksijen radikallerinin ve lipid peroksidasyonunun, birçok

hastalığın patogenezinde rol aldığı bilinmektedir. Miyokard infarktüsü gibi

kardiyolojik hastalıklar, nörolojik hastalıklar, astım, diabetes mellitus, romatoid artrit

gibi romatolojik hastalıklar, kanser, yaşlanma dahil birçok hastalığın oksidatif stres

ile ilişkisi gösterilmiştir (50, 51,80, 206, 207).

Son yıllarda yapılan birçok çalışma oksidatif stresin hiperlipidemi, diabetes mellitus,

hipertansiyon, iskemik kalp hastalığı ve kronik kalp yetmezliği gibi birçok hastalıkla

bağlantılı bulunan kardiyovasküler disfonksiyonun başlamasında ve gelişiminde

37

önemli rol oynadığını göstermektedir. Oksidatif stres fazla miktardaki reaktif oksijen

türlerinin (ROS) endojen antioksidan sistemlere baskın geldiği durum olarak

tanımlanır. ROS damar yapısındaki herbir hücre türünde farklı fonksiyonel etkilere

sahiptir ve hem fizyolojik hem de patofizyolojik rol oynar (184). Damar yapısındaki

en önemli reaktif oksijen türlerinden biri süperoksittir ( .O2- ). Oksijenin tek

değerlikli oksijene indirgenmesi ile oluşur. Bu reaksiyona NAD(P)H oksidaz,

ksantin oksidaz gibi çeşitli enzim sistemleri aracılık eder. Süperoksit vasküler

fonksiyonda kendi bizzat etkiler gösterebilmekle birlikte diğer reaktif türlerin

oluşumunda da ana etkendir. Süperoksidin NO ile etkileşiminden peroksinitrit oluşur.

Süperoksitin süperoksit dismutaz tarafından dismutasyona uğratılması sonucunda da

daha stabil bir ROS olan hidrojen peroksit oluşur. Hidrojen peroksit daha sonra

katalaz ve glutatyon peroksidaz enzimleri vasıtasıyla suya çevrilir. Hidrojen peroksit

aynı zamanda redükte geçiş metalleri ile reaksiyona girerek yüksek oranda rekatif

olan hidroksil radikaline dönüştürülebilir veya miyeloperoksidaz (MPO) ile

metabolize edilerek hipoklorik asit oluşturabilir. Hemen bütün vasküler hücre tipleri

süperoksit ve hidrojen peroksit üretebilirler. NAD(P)H oksidazlar, ksantin oksidazlar

(XO), nitrik oksit sentazlar (NOS) ve miyeloperoksidazlar (MPO) gibi damar

yapısında bulunan çeşitli enzimatik sistemler süperoksit ve türevlerini üretebilirler.

Bu herbir enzimin biribirine göreli olarak önemi damar yapısının fizyolojik

durumuna bağlıdır (184).

Oksidatif stres NO inaktivasyonu, DNA ve proteinlerin oksidatif

modifikasyonu, lipid oksidasyonu, vasküler hücrelerin mitojenliğinin artması,

vasküler hücrelerin apoptozu gibi birçok hücresel olaya yol açabilir. Ayrıca

kardiyovasküler hastalıkların farklı süreçlerinde görev alan okside LDL , adhezyon

38

molekülleri, kemotaktik faktörler, proenflamatuvar sitokinler hücre siklusu sürecinde

görev alan düzenleyiciler ve matriks metaloproteinazlar gibi redoksa duyarlı genlerin

ekspresyonunda ve aktivasyonunda artışa neden olabilirler (Şekil 1.6). Reaktif

oksijen türlerinin yukarıda bahsedilen olaylara etkisinin ve NO biyokaktivitesinin

azalmasının vasküler hücrelerde ateroskerozun tüm evrelerinde hastalığın gelişmesi

ve ilerlemesinde katkısının olduğu düşünülmektedir (Şekil 1.6).

Şekil 1.6: Reaktif oksijen türlerinin etkileri (www.tkd.org.tr)

Ateroskerotik plaklarda hastalığa sahip arter duvarının tüm katmanlarında

reaktif oksijen türlerinin düzeyinin arttığı çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (45, 152,

183). Gerek ateroskerotik hayvanlarda, gerek insanlarda, vasküler hasar sonrası

39

vasküler NAD(P)H oksidazın bazı altünitelerinin upregüle olduğu ve enzim

aktivitesinin arttığı gösterilmiştir (173, 177, 183). NAD(P)H okidazdaki bozulmanın

yanı sıra, koroner arter hastalığında gerek koroner arterlerde gerekse plazmada

ksantin oksidaz aktivitesinin arttığı ve ecSOD aktivitesinin de azaldığı gösterilmiştir

(106, 177). Bütün bu bulgularla birlikte diğer birçok çalışmanın bulguları bir araya

getirildiğinde, oksidan strese neden olan oksidan ve antioksidan enzimlerin

modülasyonuun aterosklerotik hastalığın patojenezinde önemli rol oynadığı

görülmektedir. Bunların yanında GPx aktivitesindeki azalma ve miyeloperoksit

düzeyindeki yükselmenin de koroner arter hastalığına sahip hastalardaki

kardiyovasküler olaylarda bağımsız risk faktörleri olduğunu göstermektedir (18).

1.2.10.1.Restenoz ve Serbest Oksijen Radikalleri

Restenoz anjiyoplasti sonrası karşılaşılan önemli bir komplikasyondur. Bu

patolojik süreçte vasküler düz kas hücreleri apoptoza, proliferasyona ve migrasyona

uğrarlar. Adventisyal fibroblastlar da miyofibroblastlara dönüşüp neointimaya göç

ederek sürece katkıda bulunurlar (201). Serbest oksijen radikalleri de bu fenotipik

değişikliklere neden olarak restenozun patojenezine katkıda bulunabilirler.

Balon hasarı sonrası özellikle medyal ve neointimal düz kas hücrelerinde ve

adventisyel fibroblastlarda süperoksit üretimi artmaktadır. Neointima gelişiminin

antioksidanlar ile inhibe olması, serbest oksijen radikallerinin önemini

göstermektedir (9). Balon hasarı sonrası reaktif oksijen türlerinin gelişiminden

40

sorumlu oksidazlar tam olarak aydınlatılamamak ile birlikte NAD(P)H oksidazın rolü

ortaya konmuştur (169).

1.2.11. Oksidan Stres ve Telomerler

Hücre doğal hücre bölünmesi sonucu yaşlanma sürecine girebildikleri gibi

(replicative senescence), oksidatif stres, radyasyon, DNA hasarına neden olan çeşitli

kimyasallar gibi stres oluşturan çeşitli fakörlere yanıt olarak da “stres kaynaklı

prematüre yaşlanma” (SIPS) sürecine girebilirler (36, 62, 181).

Süperoksit anyonları, hidrojen peroksit ve hidroksil radikallerinin hücre

içerisinde üretilmesi DNA kırıklarına ve çeşitli DNA bazlarının modifikasyonuna

neden olabilir (45, 83, 147). Bunlardan en önemlisi guanin rezidülerinin yüksek

oranda mutajenik olduğu 7,8 dihidro 8-oxo-guanin (8-oxoG)’dir (62).

Telomerler yüksek guanin içerikleri nedeni ile oksidatif stresin neden olduğu

hasara yüksek oranda duyarlılık gösterirler. Bir hücrenin ömrü süresince bazlara

yönelik oksidatif hasarın biriktiği ve hücre yaşlanmasına önemli etkisinin olduğu

bildirilmiştir (143, 150, 158, 191, 193). Reaktif oksijen türleri, özellikle de hidroksil

radikalleri, tekli sarmal kırıklarına neden olurlar (85). Telomerik DNA; genomik

DNA’dan farklı olarak tek sarmal kırıklarını tamir edememektedir. Bunun sonucu

olarak da özellikle reaktif oksijen türlerinin neden olduğu 8-oxodG kırıkları birikime

uğramaktadır (143, 193). Tamir edilemeyen bazların varlığı replikasyonu

etkilemektedir. Bu durum oksidaitif stresin telomer kısalmasını arttırmasının bir

41

nedeni olarak önerilmiştir (192). Telomerik DNA’nın tamir edilememesine bir

açıklama olarak TRF2’nin telomerlere bağlanmasının DNA tamir enzimlerinin

telomerik sarmal kırıklarına ulaşamaması gösterilmiştir (151).

Autosomal Resesiv Ataxia Telangiectasia (A-T) kronik oksidatif stres ve

telomer kısalması arasındaki ilişkiye kanıt oluşturabilecek bir hastalıktır. A-T

immünyetmezlik ve prematüre yaşlanma ile karakterize bir rahatsızlıktır. Bu

hastalıktan sorumlu olan gen “Ataxia telangiectaisa mutasyona uğramış gen” (ATM)

‘dir. ATM geni normalde DNA kırıklarına yanıt olarak aktive olan ve kromozomal

stabilite ve temomer bütünlüğünün korunması için gerekli bir gen olduğu

düşünülmektedir. A-T hastalarında hücrler kronik bir oksidatif stres durumu

içerisindedirler ve bu nedenle de telomerik DNA kırıklarını onaramazlar ve telomer

kısalmasının artmasına neden olurlar (185).

Passos ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada genç ve yaşlı insan

fibroblastları karşılaştırılmıştır. Karşılaştırmanın sonucunda yaşlanmış hücrelerde

reaktif oksijen türlerinin daha yüksek seviyelerde olduğu, mitokondriyal

disfonksiyon olduğu, daha fazla DNA çift-sarmal kırıklarına ve daha kısa telomerlere

sahip oldukları görülmüştür (142)

Glutatyon redoks siklusunun bozulması ile oluşurulan hafif oksidatif stresin

insan umbilikal ven endoteliyel hücrelerinde telomeraz aktivitesinin

downregülasyonunu hızlandırdığı, telomer aşınmasını artırdığı ve replikatif yaşlanma

sürecini prematüre olarak başlattığı gösterilmiştir (103).

42

Hücre kültüründe yapılan farklı çalımalarda çeşitli antioksidanların ortama

ilave edilmesinin hücre ömrünü artırdığı, telomer kısalmasını ve yaşlanma sürecini

yavaşlattığı gösterilmiştir (56, 94).

Homosisteinin aterojenik etkiler göstermektedir ve bunun da hidrojen peroksit

oluşumunu artırarak yaptığı önerilmiştir. Homosisteine maruz bırakılan insan

umblikal ven endotel hücrelerinde telomer kısalma hızının arttığı ve bu etkinin

katalaz ilavesi ile zayıfladığı gösterilmiştir. Kronik olarak homosistein alan bu

hücrelerde ayrıca intraselüler adhezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve plazminojen

aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1) ekspresyonunun arttığı gözlemlenmiştir. Bu markırlar

yaşlanmış hücrelerde çok fazla eksprese edilmektedir. Bunun da ateroskeleroza

katkısının olabileceği düşünülmektedir (205).

1.2.12 Glutatyon ve BSO

Glutatyon (GSH) glutamat, sistein ve glisinden oluşan bir tripeptiddir.

Glutamat ve sistein arasında bir γ-peptid bağı içerir (Şekil 1.7 ). Bu bağ GSH’ı çoğu

peptidazın hidrolizinden korur. GSH çoğu memeli hücresinde bulunur ve hücre

içerisinde en yaygın olarak bulunan tiyoldür (0.2-10 mM). GSH hücre içerisinde

NADPH’a bağımlı bir enzim olan glutatyon disülfit (GSSG) redüktaz tarafından tiyol

formunda tutulur. GSH birçok öemli hücresel fonksiyonlara sahiptir (Şekil 1.8). GSH

bir koenzim olarak görev alır ve amino asid transportuna katılır. Ayrıca askorbik

asidin redükte formda tutulmasında ve ribonükleik asitlerin oluşumunda görev alır.

Toksik bileşikler ile enzimatik veya non-enzimatik olarak etkileşerek GSH

43

konjugatları oluşturur. Bunun yanında metabolik olaylarda doğal olarak oluşan

reaktif oksijen türlerinin neden olduğu oksidatif hasara karşı korur. GSH reaktif

oksijen türleri ile non-enzimatik olarak reaksiyona girebilir. Hidrojen peroksit ve

diğer peroksitler de gluatyon peroksidaz ile detoksifiye olurlar (5).

Şekil 1.7: Glutatyonun (GSH) kimyasal yapısı (L-γ-glutamil-sisteinil glisin)

Şekil 1.8: Glutatyon metabolizması

44

1.2.12.1. Hücresel GSH Düzeylerinin Düzenlenmesi

Glutatyon biyosentezinden sorumlu olan γ-glutamilsistein sentetaz ve GSH

sentetaz enzimerinin doğuştan eksikliği GSH eksikliğine yol açan nedenlerden

biridir. Hemolitik anemi ve nörolojik semptomlar ile karakterizedir. GSH

eksikliğinin etkilerinin tam olarak anlaşılabilmesi amacıyla deneysel olarak in vivo

GSH eksikliğinin oluşturulduğu çalışmalara gerek duyulmuştur. Metiyonin

sülfoksimin (MSO) yapısal olarak γ-glutamil bir bileşik olan glutamine

benzemektedir ve glutamin sentetazı inhibe ettiği gösterilmiştir (157).

Glutaminsentetaz ve γ-glutamilsistein sentetaz benzer reaksiyonları katalizlerler. Bu

nedenle de MSO aynı zamanda γ-glutamilsistein sentetazı da inhibe etmektedir. (69).

MSO’ya benzer diğer bir molekül ise bütiyonin sülfoksimindir ve γ-glutamilsistein

sentetazı selektif olarak inhibe eder (70). GSH çoğu hücrede dışarı taşınır, bu

nedenle BSO verilerek GSH sentezi inhibe edildiğinde GSH düzeyleri azalır.

Rodentlerin ve/veya hücrelerin BSO’ya maruz bırakılması onları radyasyon,

isklofosfamit, civa iyonları, kadmiyum iyonları ve sisplatine karşı duyarlı hale

getirir. (180). İnsan lenfositleri ve T-hücreleri BSO ile muamele edildiğinde

aktivitelerini kaybederler (32). Yeni doğmuş rodentlere BSO verildiğinde katarakt

gelişmektedir (32). Farelere uzun süreli BSO uygulandığında ciddi GSH eksikiği

geliştiği görülmüştür. Mitokondri GSH sentezlemez ve GSH ihtiyacını hücre içi

GSH’tan karşılamaktadır (72). Elektron transport sistemi oldukça etkin olmasına

rağmen bir kısım ROS sızıntıya uğrayabilir. Mitokondrilerde katalaz enzimi

bulunmaması sebebiyle, ROS toksisitesinden korunmak için GSH peroksidaza ve

GSH’ın non-enzimatik reaksiyonlarına bağımlıdır. Uzun süreli BSO uygulaması ile

GSH düzeyleri ciddi anlamda tüketildiğinde mitokondri şişer, vakuoller oluşur ve

45

endojen oksidatif stres modelini oluşturur (117, 118). Oluşan bu oksidatif hasar GSH

esterleri ve askorbat ile önlenebilir. (118).

Düşük GSH düzeyleri HIV, hepatit C, Tip II diyabet, ülseratif kolit, erişkin

solunum güçlüğü sendromu (ARDS) ve katarakt gibi birçok hastalığın patolojisi ile

ilişkilendirilmiştir (5). GSH reaktif oksijen türlerine karşı korunmada önemli bir

proteindir. Hücredeki GSH düzeylerini arttırılması amacıyla çeşitli bileşikler

önerilmiştir. Bunlardan N-asetil sistein, 2-oksotiyazolidin-4 karboksilat gibi sistein

prekürsörü maddeler GSH sentezinde görevli enzimlere ihtiyaç duymaktadırlar ve

sentezlenen GSH hücre dışında degrade olmakta, bir orana kadar hücre içerisine

alınmaktadır. Bu nedenle GSH analogları olan GSH esterler önerilmiştir (5). Bu

bileşikler hücreiçine kolayca taşınıp hücrede GSH’a çevrilirler ve birçok dokuya iyi

dağılım gösterirler.

1.2.13. Taurin

2-aminoetansulfonik asit olarak da bilinen taurin çoğu memeli dokusunda

milimolar konsantrasyonlarda bulunan serbest bir amino asittir (21). Hayvan

dokusunda en bol bulunan serbest amino asitlerden olmasına karşın bazı alg türleri

dışında bitkilerde bulunmamaktadır (88). İnsanlarda ise karaciğerde metiyonin ve

sisteinden sentezlenebilmesine rağmen daha çok taırin transporter Tau (TauT) yolula

gıdalardan alınması gerekmektedir. (86). Taurin hiçbir memeli proteininin

komponenti olmamakla birlikte insanlarda gelişme sürecinde önemli rol

oynamaktadır (179). Osmoregülasyon, immünomodülasyon, ve safra tuzu oluşumu

46

gibi birçok fizyolojik olayda yer almaktadır. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma

diyetle taurin alımının gerekliliğine işaret etmektedir (21)

Diyabetes mellitus’ta taurinin etkileri yaygın olarak çalışılmıştır. Bir tip II

diyabet modeli olan yüksek fruktoz ile beslenmiş sıçanlarda taurinin insülin

rezistansını, hiperinsülinemiyi, lipid peroksidasyonunu, glukoz serum

konsantrasyonunu azalttığı gösterilmiştir (131, 132, 133). Taurinin aynı zamanda

insanlardan saflaştırılan insülin reseptörüne insülinin bağlanma etkilerini

potansiyalize ettiği gösterilmiştir (120). Bu da daha iyi bir metabolizma kontrolünü

sağlamaktadır. Diyabetik sıçanlar ve obez sıçanlarda taurin uygulaması serum lipid

konsantrasyonundaki azalma ile ilişkilendirilmiştir (210). Taurinin aynı zamanda

Langerhans adacıklarında bulunduğu ve insülin sekresyonunu stimule ettiği fetal β

hücrelerde in vitro olarak gösterilmiştir (38). In vivo yapılan birçok çalışma ise taurin

uygulamasının diabetes mellitusun neden olduğu retina, lens, ve periferal sinirlerdeki

değişiklikleri azalttığını göstermektedir (55)

Taurinin antioksidan etkilerini gösteren birçok çalışma yapılmıştır (21). Taurin

reaktif oksijen türlerine karşı direk süpürücü etki gösterememekte fakat diğer

hücresel antioksidan fonksiyonları artırmaktadır. Nötrofil ve lökositlerde daha stabil

bir formu olan taurin-kloramine (Tau-Cl) dönüşmektedir. Tau-Cl lökositlerde ve

makrofajlarda süperoksit anyonunun ve IL-6 ve Il-8 gibi pro-enflamatuvar

sitokinlerin oluşumunun önlenmesi amacıyla TNF-α oluşumunu ve

lipopolisakkaritlerin neden olduğu NO üretimini baskılamaktadır (165, 202). Fare

demir-yükleme modelinde taurinin oksidatif stresi azalttığı ve kardiyovasküler

fonksiyonları düzelttiği gösterilmiştir (139).

47

Taurinin önemli biyolojik aktivitelerinden biri de safra tuzu oluşumudur. Safra

tuzları barsak sindirimi ve lipidlerin absorpsiyonu için esastır. Taurin ve glisin

kolesterol türevleri ile konjugat oluşturmaktadır. İnsanlarda tauroşölat plazmadan

kolesterolün temizlenmesine neden olan ana safra tuzudur. Sonuç olarak, taurinin

vücutta daha az bulunması, kolesterolün kandan daha az temizlenmesi dolayısıyla

daha çok birikmesi anlamına gelmektedir. Bu da ateroskleroz riskini artırmaktadır

(21).

48

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. Tavşanların Gruplandırılması

Deneylerde her iki cinsten (n=40) ortalama 2,5-3 kg ağırlığındaki Yeni Zelanda

tipi beyaz tavşanlar kullanılmıştır. Deney hayvanları protokol gereği tüm deney

süresince ayrı kafeslerde tutulmuş, standart yem ile beslenmişler ve serbestçe su

içmelerine olanak sağlanmıştır. Çalışmanın amacı ve kapsamı doğrultusunda

deneyler balon hasarı sonrası vasküler düz kas hücrelerinde telomer devamlılığının

saptanmasına (Bölüm I) ve oksidan stresin etkisinin araştırılmasına yönelik (Bölüm

II) olmak üzere iki bölümde gerçekleştirilmiştir.

Bölüm I

Balon hasarı sonrası vasküler düz kas hücrelerinde telomer devamlılığı ve

telomeraz aktivitesinin incelenebilmesi amacıyla farklı lezyon süreleri sonrasında (0.

gün, 2. gün, 7. gün ve 14. gün) hasarlı damar ve karşı damar izole edilmiştir. Bu

bölümdeki deneylerde çalışma protokolü uyarınca telomer uzunluğu ve telomeraz

ekspresyonu için doku homojenatı hazırlanması ile morfometrik ve

immünohistokimyasal analizler için doku kesitlerinin alınabilmesi amacıyla iki farklı

seri deney grubu oluşturulmuştur:

49

Seri I: Birinci seri deneylerden elde edilen dokular telomer uzunluğu ve telomeraz

ekspresyonu için doku homojenatı elde edilmesinde kullanılmıştır. Bu seride

kullanılan tavşanlar ayrıca oluşturulan lezyonun süresine göre 0. gün (n=3), 2. gün

(n=3), 7. gün (n=3) ve 14. gün (n=3) olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır.

Seri II: İkinci seri deneylerden elde edilen dokular morfometrik ve

immünohistokimyasal analizler için kullanılmışlardır. Bu seride yine ilk seride

olduğu gibi tavşanlar ayrıca oluşturulan lezyonun süresine göre 0. gün (n=4), 2. gün

(n=4), 7. gün (n=4) ve 14. gün (n=4) olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır.

Bölüm II

Balon hasarı sonrası vasküler düz kas hücrelerinde telomer uzunluğuna

oksidatif stresin etkisinin araştırılması amacıyla 4 farklı deney grubu

oluşturulmuştur:

1. Bütiyonin sülfoksimin, BSO grubu (n=3): Bu gruptaki tavşanlara oksidan stres

oluşturmak amacıyla daha önceden ön denemeler ile 14 günlük uygulama sonunda

yaklaşık %40-50 oranında GSH inhibisyonu sağladığı belirlenen 75 mg/kg/gün

dozda, s.c. yoldan BSO uygulanmıştır.

2. Taurin grubu (n=3): Bu gruba antioksidan bir madde olduğu bilinen taurin içme

suyunda %10 (ağırlık/hacim) oranında uygulanmıştır.

3. BSO + Taurin grubu (n=3): Bu gruptaki tavşanlara aynı yoldan ve aynı dozda

BSO ve taurin verilmiştir.

4. Kontrol grubu (n=3): Bu gruptaki tavşanlara deney süresince herhangi bir tedavi

uygulanmamıştır.

50

Şekil 2.1’de oluşturulan bütün deney grupları ve oluşturulan deney gruplarına

göre yapılan işlemlerin şematik olarak özeti verilmiştir.

Tavşanların Gruplandırılması (n=40)

Bölüm 1•Gruplar: 0., 2., 7., 14. günSeri I: Telomer boyu icin TRF

Telomeraz aktivitesi için TRAP analiziSeri II: Morfometri ve İmmünohistokimya

Balon Hasarı Oluşturulması

Bölüm 2•Gruplar: BSO, Taurin, BSO+Taurin, Kontrol (14 gün)

-Telomer boyu icin TRF analizi-Morfometri ve İmmunohistokimya- 0., 8. ve 14. günlerde oksidan stres markırlarının

belirlenmesi amacıyla kan örneklerinin alınması

Tavşanların Gruplandırılması (n=40)





Balon Hasarı OluşturulmasıBalon Hasarı Oluşturulması

Bölüm 2•Gruplar: BSO, Taurin, BSO+Taurin, Kontrol (14 gün)

-Telomer boyu icin TRF analizi-Morfometri ve İmmunohistokimya- 0., 8. ve 14. günlerde oksidan stres markırlarının

belirlenmesi amacıyla kan örneklerinin alınması

Şekil 2.1.: Deney şeması

2.2. Balon Hasarı Oluşturulması

Balon hasarının etkin ve doğru bir şekilde uygulanabilmesi için Ege

Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyodiagnostik Anabilim Dalında ön denemeler

yapılmıştır. Bu amaçla deneylerde kullanılacak tavşanlara Prof. Dr. İsmail Oran

tarafından anjiyografi uygulanmıştır. Bir cetvel yardımıyla tavşanların femoral ve

ilyak arterlerinin yerleşimi belirlenmiştir (Resim 2.1.A ve B). Bu şekilde balon

51

anjiyoplasti uygulanması sırasında kılavuz tel ile damar içerinde kaç cm ilerlenmesi

gerektiği belirlenmiştir.

A) B)

Resim 2.1.: Tavşan ilyak arter (A) ve femoral arter (B) anjiyogramı.

Balon anjiyoplasti uygulama sürecinde, deney hayvanları, deney başlangıcında

sodyum pentobarbital (25 mg/kg, iv) ile anestezi edilmişlerdir. Femoral arterleri

cerrahi girişim ile açığa çıkarılmış ve 21G branül yardımı ile damar içerisine

girilmiştir (Resim 2.2.). Branül içerisinden damar içerisine kılavuz tel ile girildikten

sonra tel damar içerisinde ilerletilmiştir. Daha sonra branül çıkarılarak 2 cm

uzunluğunda 3 mm çapında Fogarty balon dilatasyon kateteri kılavuz tel aracılığı ile

damar içerisine girilmiştir (Resim 2.3.). Kateter ilyak arterde ön denemelerde

saptanan miktar kadar ilerletilmiş ve balon hasarı uygulanmıştır. Bunun için balon

sırasıyla 4 kez 6, 8, 4 ve 10 atmosfer basınçla 1 dakika boyunca şişirilmiştir. Daha

sonra balon çıkarılmış ve insizyon cerrahi olarak dikilerek kapatılmıştır. Diğer

52

femoral arterde ise aynı işlemlerle insizyon yapılmış, ancak balon kateterle

girilmeksizin kapatılmıştır (178). Cerrahi girişim sonrası femoral arter ligate edilip

kesilen dokular cerrahi iplikle dikilerek kapatılmıştır. Balon anjiyoplasti uygulanması

sonucu tavşanlara 14 gün süre ile yukarıda belirtildiği biçimde BSO, taurin ve

BSO+taurin uygulaması sürdürülmüştür.

Resim 2.2.: Bir branül yardımı ile femoral artere girilmesi

53

Resim 2.3. :Balon kateterinin damar içerisinde kılavuz tel yardımı ile

ilerletilmesi

2.3. Doku Örneklerinin İzolasyonu

1. Bölüm’deki deneyler kapsamında daha önce de belirtildiği gibi telomer

uzunluğu ve telomeraz aktivitesi analizleri için (Seri I) ve morfometri ve

immünohistokimya analizleri için (Seri II) olmak üzere 2 farklı deney serisi

oluşturulmuştur. Belirlenen süreler sonunda (0. 2. 7. ve 14. günler) tavşanlar aşırı

doz sodyum pentobarbital ile öldürülmüş sağ ve sol ilyak arterleri izole edilmiştir.

Damarların izolasyonu sonrası yapılan işlemler gerçekleştirilecek analize göre 2

seride farklılık göstermektedir:

Seri I: İzole edilen damar segmentleri çevrelerindeki bağ dokusundan

temizlenmişlerdir. Daha sonra damar dokuları telomer ve telomeraz enzimi analizi

54

yapılmak üzere 5-6 mm uzunluğunda iki eşit halkaya ayrılmıştır. Elde edilen damar

örnekleri ayrı ayrı düşük ısı ve yüksek basınca dayanıklı önceden darası alınmış

cryotüplere konarak tartılmış ve derhal sıvı azotta dondurulmuştur. Örnekler 3-4 saat

sonra sıvı azot tankından çıkarılarak derin dondurucuya (-80ºC) alınmış ve analiz

gününe dek derin dondurucuda bekletilmiştir.

Seri II: Bu seride damarlar izolasyon sonrası çevrelerindeki bağ dokulardan

temizlenmiş ve morfometrik ölçümler ve immünohistokimyasal incelemeler

yapılmak üzere %4’lük formalin ile fikse edilmişlerdir.

2. Bölümde ise telomer uzunluğu ile morfometri ve immünohistokimya

analizleri için farklı seriler tasarlanmamış, izole edilen damar segmentlerinin 2/3’ü

telomer analizi için kullanılmak üzere 1. Bölüm’dekine benzer şekilde derin

dondurucuda (-80ºC) bekletilmiştir. 1/3’lük kısmı ise morfometrik ölçümler ve

immünohistokimyasal incelemeler yapılmak üzere %4’lük formalin ile fikse

edilmiştir.

2.4. Telomerik Tekrar Restriksiyonel Fragmantasyon Deneyleri: Terminal

Restriction Fragments (TRF)

Bu deneyler Bölüm 1’de Seri I sonucu elde edilen ve -80ºC’de saklanan damar

segmentlerinin her bir damara ait ringlerden birer tanesi kullanılarak Bölüm 2’de ise

morfometri ve immünohistokimya için kullanılacak damar segmenti ayrıldıktan

sonra geri kalan ve -80ºC’de saklanan 2/3’lük damar segmentinde

55

gerçekleştirilmiştir. TRF deneylerinde amaç telomerik fragmanların uzunluğunun

saptanmasıdır. Deney basamakları kısaca aşağıdaki gibidir (100).

TRF Deney Basamakları:

1. Dokuların homojenizasyonu

2. Homojenize edilen dokulardan DNA izolasyonu

3. DNA miktarının belirlenmesi

4. Kromozomal DNA’nın agaroz jelde yürütülmesi ve görüntülenmesi

5. Kromozomal DNA’nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesi

6. Kesilen fragmanların agaroz jelde yürütülmesi

7. Southern Blot yöntemi ile DNA’nın jelden membrana transfer edilmesi

8. Membrana transfer olan DNA’nın telomerik oligonükleotid ile hibridizasyonu

9. Radyografi filmine aktarılarak görüntülenmesi

2.4.1. Dokuların Homojenizasyonu

Derin dondurucudan çıkarılan dokular çözündürülüp steril bir petri kabı

içerisinde steril bir bistüri yardımıyla küçük parçacıklara ayrılmıştır. Daha sonra

doku parçacıkları içerisinde DNA izolasyonu için gerekli olan liziz tamponunu

içeren tüplere (eppendorf) aktarılmıştır. Parçalanma ve homojenizasyonu sağlamak

amacıyla tüp içerisine steril tungsten boncuklar ilave edilmiş ve homojenizatörde

(Qiagen TissuLyser®- Retech, Haan, Almanya) homojenize edilmiştir.

56

2.4.2. DNA İzolasyonu

DNA izolasyonun gerçekleştirilmesi amacıyla Qiagen DNeasy® Tissue Kit’i

(Haan, Almanya) kullanılmıştır. Bu yöntem ile DNA izolasyonu DNA’nın silica-gel

membrana bağlanarak diğer fragmanlardan ayrılması esasına dayanır. Klasik DNA

izolasyon yönteminde olduğu gibi DNA’nın ekstraksiyonu ve etanolle çöktürülme

işlemini içermez.

Temel çalışma prensibi: Örnekler liziz tamponu içerisinde homojenize

edildikten sonra proteinaz K çözeltisi ilave edilerek hücrelerin liziz olması sağlanır.

Daha sonra lizat DNeasy mini spin kolonlara yüklenir ve santrifüj edilir. Santrifüj

işlemi sırasında DNA selektif olarak silika membrana bağlanır. Diğer kontaminantlar

ve enzim inhibitörleri ise membrandan geçer. Kalan kontaminantlar ve enzim

inhibitörlerinin ise iki basamaklı yıkama işleminden geçirilerek uzaklaşmaları

sağlanır. Daha sonra membrana bağlanmış halde olan DNA, TE (Tris-EDTA)

tamponu (10mM Tris.Cl, pH 7.5 + 1mM EDTA, pH 8.0) içerisinde ayrıştırılır.

2.4.3. DNA Miktarının Belirlenmesi

İzolasyonu sonucu elde edilen elüattaki DNA’nın nanogram/mikrogram

düzeyinde belirlenmesi amacıyla spektrofotometrik yöntem kullanıldı. Bu amaçla

elde edilen DNA örnekleri önceden belirlenen oranlarda sulandırılarak UV geçirgen

kuvartz mikroküvetlerde 260nm dalga boyundaki absorbans değerleri okundu.

57

Absorbans değerlerinin 260 nm dalga boyunda okunmasının sebebi nükleotidlerin

heterosiklik halkalarının 260 nm dalga boyunda maksimum absorbans göstermesidir.

Çift zincirli DNA molekülleri için, 1 optik dansitenin (OD) 50 µg/ml’ye

karşılık geldiği bilinmektedir. Buna göre çift zincirli DNA için miktar

belirlenmesinde aşağıdaki formül kullanılmıştır:

DNA (µg/ml) = A260 x seyreltme oranı x 50

Tablo 2.1.: Damar örneklerinden elde edilen DNA konsantrasyonları

Örnek No Absorbans (A260) Konsantrasyon (µg/ml)

1 0.063 63

2 0.044 44

3 0.080 80

4 0.044 44

5 0.046 46

6 0.045 45

7 0.042 42

8 0.048 48

58

2.4.4. DNA’nın Agaroz Jelde Yürütülmesi ve Görüntülenmesi

2.4.4.1. DNA’nın Jel Elektroforezinin Temeli

Kromozomal DNA’nın jel üzerinde görüntülenmesi ve restriksiyon öncesi

spektrofotometre ile belirlenen miktar tayininin doğrulanması amacıyla DNA

örneklerinin bir kısmına agaroz jel elektroforezi uygulanmıştır.

Bu yöntemle UV ışığı altında fluoresan etki gösteren etidyum bromür (EtdBr)

boyası kullanılarak DNA’nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür. DNA’nın

elektroforetik analizinin temeli, elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır.

Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin

konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir.

Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks) mekaniksel etkiyi

engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için kullanılır. Poliakrilamid

jeller genellikle küçük DNA fragmanları (5-500 baz çifti) ve RNA moleküllerinin

ayrımında kullanılır. Bu tip jeller, ayırım güçleri çok fazla olduğundan, boyut

bakımından birbirine çok yakın DNA fragmanlarını analizleri için daha uygundur.

Nükleik asitler için en çok kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir.

59

2.4.4.2. Agaroz Jel Elektroforezi

Agaroz, bir kırmızı alg türü olan Agar agar’dan izole edilen doğrusal bir

polisakkariddir. Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde

karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu sonucu jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri

dönüşümlüdür. Agaroz konsantrasyonu değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir.

Böylece, küçük DNA fragmanları için yüksek, büyük DNA fragmanları için düşük

agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA’nın jelde en uygun şekilde yürümesi

sağlanabilir. DNA’nın jelde görünür hale gelebilmesi EtdBr’ün interkalasyon özelliği

ile DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm’de ışığı absorbe etmesi sonucu

flüoresan etki göstermesi ile olur. Bu etki DNA konsantrasyonuna bağlı olarak

kuvvetli veya zayıf olabilir.

Tablo 2.2.: Değişik boyutlarda DNA fragmanlarının ayırımı için uygun agaroz

konsantrasyonları

Agaroz konsantrasyonu (% ağırlık/hacim) Doğrusal DNA molekülü (kb)

0.3 5.0 – 60.0

0.6 1.0 – 20.0

0.7 0.8 – 10.0

0.9 0.5 – 7.0

1.2 0.4 – 6.0

1.5 0.2 – 3.0

2.0 0.1 – 2.0

60

2.4.5. DNA’nın Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi

DNA’nın enzimatik kesimi “restriksiyon endonükleazları” kullanılarak yapılır.

Restriksiyon endonükleazları, çift iplikli sarmal DNA’da özel nükleotid dizilerini

tanıyan ve DNA’nın her iki ipliğini kesen enzimlerdir. Bakterilerde bulunan bu

enzimler DNA’da özgün kısa dizileri tanır ve kesme işlemini enzime göre değişmek

üzere, tanıma yerinde veya bu yerin dışında başka özel bir dizide gerçekleştirirler.

Kesim sonucunda küt veya yapışkan uçlu DNA fragmanları oluşur. Günümüzde

1000- 1200 restriksiyon enzimi ticari olarak üretilmektedir. Bir ünite restriksiyon

enzim aktivitesi, uygun koşullar altında 1 µg DNA’yı kesebilen enzim olarak

tanımlanmaktadır. Restriksiyon enzimlerinin büyük çoğunluğu %50 gliserol içeren

tamponlarda ve -20˚C’de saklanır. Enzimlerin aktif olarak çalışacağı koşulları

sağlayan özel tamponlar genellikle 10X konsantrasyondadır ve kullanım sırasında 1x

şeklinde sulandırılır. Restriksiyon enzimlerinin çoğu 37˚C’de aktifken, bazıları

60˚C’de optimum aktivite gösterir. Kural olarak 20 µl reaksiyon karışımı içerisinde

0.2-1 µg DNA bulunmalıdır. DNA konsantrasyonu fazla ise reaksiyon hacmi

artırılmalıdır.

Star Aktivitesi: Restriksiyon enzimlerinin uygun olmayan koşullarda özel kesim

dizilerine benzer dizilerde kesim yapmaları sonucunda istenmeyen fragmanların

oluşması olayıdır.

61

DNA izolasyonu sonucu elde edilen DNA örneklerinden telomerik restriksiyon

fragmanlarının saptanması amacıyla bu ve bundan sonraki basamaklarda

TeloTAGGG “Telomere Length Assay” Kit (Roche, Almanya) kullanılmıştır.

Dokulardan izole edilmiş olan genomik DNA örnekleri öncelikle HinfI ve RsaI

restriksiyon enzimleri ile muamele edildiler. Bu iki enzimin özelliği telomerik

DNA’yı ve subtelomerik DNA’yı spesifik tekrar dizi (TTAGGG) özelliğinden dolayı

kesmeyip, DNA’nın geri kalan kısımlarını (non-telomerik kısımlar) düşük moleküler

ağırlık fragmanlarına kadar kesmeleridir. Telomer boyunun saptanmasına yönelik

deneylerde sıklıkla bu 2 enzim birlikte kullanılır. Bu amaçla 1-2 µg DNA final hacmi

17 µl olacak şekilde nükleaz içermeyen su ile seyreltildi. HinfI ve RsaI enzimlerinin

eşit hacimde karışımları hazırlandı. Her bir tüpe 2 µl kesim tamponu ve 1 µl enzim

karışımı ilave edildi ve karıştırıldı. Reaksiyon karışımı 37˚C’de 2 saat inkübe edildi.

İnkübasyon süresi sonunda reaksiyonu durdurmak amacıyla tüp içerisine 4 µl jel

elektroforezi yükleme tamponu (5X) kondu ve karıştırıcıda karıştırıldı.

2.4.6. Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmiş DNA Fragmanlarının Agaroz Jelde

Yürütülmesi

2.4.6.1. Agaroz Jelin (%0.8) Hazırlanması

0.8 mg agaroz tartıldı. 100 ml 0.5xTBE (Tris-borat EDTA tamponu) içerisinde

mikrodalga fırında çözüldü. Elle tutulacak sıcaklığa (50-55˚C) ulaştığında kenarları

kapatılmış yatay elektroforez kabına sızıntı ve hava kabarcığı olmamasına dikkat

62

edilerek döküldü. Cepleri oluşturacak tarak yerleştirilerek donması beklendi. Tarak

ve kenarlıklar dikkatlice uzaklaştırılarak jel elektroforez tankına yerleştirildi.

2.4.6.2. Jelin Yürütülmesi

Her bir kuyucuğa 1-2 µg DNA içerecek şekilde restriksiyon enzimleri ile

kesilen DNA örnekleri yüklendi. Telomer uzunluğunun sağlıklı bir şekilde

ölçülebilmesi için her bir örneğin eşit miktarda DNA içermesine özen gösterildi.

Yaklaşık 500 ng moleküler ağırlık belirteci, 12 µl nükleaz içermeyen su ve 4 µl 5X

yükleme tamponu karıştırıldı. Telomer uzunluğunun belirlenmesinde referans

oluşturması için örneklerin her iki tarafına ilk ve son kuyucuğa 10’ar µl yüklendi.

Daha sonra jel, 0.5xTBE tamponu içerisinde yükleme tamponu içerisindeki

bromfenol mavisinin neden olduğu mavi boya yükleme yerinden 10 cm uzaklaşana

dek yürütüldü (5V/cm). Daha sonra jel EtdBr (10 µg/ml) ile muamele edilerek

UV’de görüntülendi.

0.5xTBE çözeltisinin hazırlanması

0.5xTBE 5xTBE stok çözeltisinden 1:10 oranında seyreltilerek hazırlandı.

1 litre 5 x TBE için: (0,45 M Tris-borate ve 0,01 M EDTA)

54 g Tris-base

27,5 borik asit

20 ml 0,5 M EDTA

63

2.4.7. Southern Blot Yöntemi ile DNA’nın Jelden Membrana Transfer Edilmesi

Aranılan DNA dizisinin saptanması Southern blot tekniği ile mümkün

olabilmektedir. Bu teknik ilk olarak adını aldığı Southern adlı araştırmacı tarafından

1975 yılında tanımlanmıştır (174). Bu tekniğin temeli, istenilen DNA parçasının ona

tamamlayıcı olan radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir takım belirleyicilerle

işaretlenmiş olan problar (tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesine tamamlayıcı

olan, belirleyici olarak kullanılan tek iplikli nükleik asit parçaları) kullanılarak

hibridizasyonuna ve bunun ardından belirleyicinin özelliğine göre radyoaktif,

immünolojik, kimyasal ya da flüoresan yöntemlerle görünür hale getirilmesine

dayanır.

Probların radyoaktif işaretlemesinde en çok 32P kullanılır ve radyoaktivite

otoradyografi ile belirlenir. Radyoaktif maddelerle çalışmanın getirdiği zorluklar ve

tehlikeler nedeniyle radyoaktif olmayan işaretleme ve belirleme sistemleri

geliştirilmiştir. Deneylerimizde kullandığımız digoksigenin-anti-digoksigenin sistemi

bu tür sistemlerden biridir. Digoksigenin-anti-digoksigenin sistemi, otoradyografi ile

aynı temel prensibe dayanır. Radyoaktif madde gerektirmemesi, kolay uygulanabilir

olması, hızlı sonuç vermesi, özgül ve duyarlı olması gibi avantajlara sahiptir.

Digoksigenin-anti-digoksigenin sisteminde DNA, RNA ve oligonükleotidlerin

işaretlenmesinde Digitalis bitkisinden elde edilen bir kardenolid steroid hapten olan

digoksigenin kullanılır. Prob hazırlamada kullanılan digoksigenin nükleotid trifosfat

analoğu olan digoksigenin – dUTP (DIG-11-dUTP) yapısında, urasile bağlı olarak

yer alır. Belirlenmesi istenen DNA dizisinin tamamlayıcısı olan prob in vitro sentez

64

edilirken ortamda 4 çeşit dNTP’ye ek olarak DIG-11-dUTP de bulunduğundan yeni

sentezlenen prob, kalıp DNA zincirindeki her adenin nükleotidinin karşılığı olarak ya

dTTP ya da DIG-11-dUTP taşır.

2.4.7.1. Jelin Transfere Hazırlanması

UV’de görüntülenip kontrol edilen agaroz jel temiz bir kaba alındı. Transfer

öncesi sırasıyla aşağıdaki işlem basamakları uygulandı ve bütün basamaklar oda

sıcaklığında ve jel hafif çalkalanarak gerçekleştirildi:

1. Jel 10 dakika bromfenol mavisi sarıya dönene kadar 0.2 N HCl çözeltisi

içerisinde depürinasyona tabi tutuldu.

2. İki kez su ile yıkandı.

3. 2x15 dakika denatürasyon çözeltisinde bekletildi.

4. Tekrar iki kez su ile yıkandı.

5. 2x15 dakika nötralizasyon çözeltisi içerisinde bekletildi.

6. Jeli transfer çözeltisine hazırlamak amacıyla adaptasyon çözeltisi içerisinde

(2xSSC-sodyum sitrat/sodyum klorür) 5 dakika bekletildi.

7. Transfer işlemine geçildi.

65

2.4.7.2. Transfer

Jel üzerindeki DNA kapiler aktarım yoluyla naylon membrana transfer edildi.

Jel düzenek üzerindeki iki ucu tampona değen blot kağıdı (Hybond®-Amersham,

Pharmacia Biotech, Buckingamshire, İngiltere) üzerine ters ve arada hava kabarcığı

kalmayacak şekilde yerleştirildi. Jel ile aynı boyutta kesilen naylon membran

(Hybond-N+ positively charged nylon membrane, Amersham Biosciences, İngiltere)

suda ıslatıldıktan sonra transfer çözeltisi olan 10xSSC’den (sodyum sitrat-sodyum

klorür) geçirildi. Jel üzerine arada hava kabarcığı kalmayacak şekilde kapatıldı.

Üzeri yine aynı boyuttaki blot kağıtları ile örtüldü ve çok katlı kağıt havlular

dizildikten sonra en üste ağırlık konarak gece boyunca (yaklaşık 16 saat) transfere

bırakıldı. Süre sonunda ıslanmış kâğıt havlular ve blot kâğıtları kaldırıldı. Membran

bir köşesinden işaretlendikten sonra pens ile ters çevrilip bir filtre kâğıdı üzerine

alındı. Aktarımın başarılı olup olmadığının anlaşılması amacıyla jel UV’de

görüntülendi. Transferin tam olup olmadığını anlamak için işlem sonrası jelde

belirgin bir bantın kalmadığı kontrol edildi.

66

2.4.7.3. Transfer Öncesi ve Transferde Kullanılan Tamponlar

Tablo 2.3.: Kullanılan tamponlar

Tampon İçeriği Formülasyon

Apürinasyon Tamponu 0.2 N HCl %37’lik HCl’den 1:50

Denatürasyon Tamponu 0.5N NaOH/1.5 NaCl 300 ml 5M NaCl

100 ml 5N NaOH

600 ml distile su (1litre için)

Nötralizasyon Tamponu 1M Tris (pH 7.5) /1.5M NaCl 225 ml 5M NaCl

500 ml 1.5M Tris (pH 7.5)

distile su ile 750 ml’ye

tamamlanır.

Adaptasyon Tamponu 2x SSC 20xSSC’den 1:10 hazırlanır.

Transfer Tamponu 10xSSC 20xSSC’den 1:2 hazırlanır.

20xSSC stok çözeltisi NaCl-Sodyum sitrat tamponu

(pH:7.0)

175,3 g NaCl

88,2 g Sodyum sitrat

800 ml’ye dH2O ile tamamlanır.

pH :7,0’ye ayarlanır.

Final hacmi:1lt.

2.4.8. Membran Üzerine DNA’nın Sabitlenmesi

Transfer olan DNA’nın membrana sabitlenmesi amacıyla “UV-crosslinker”

cihazında 120 mJ’e tabi tutuldu.

67

2.4.9. Prehibridizasyon

Hibridizasyon işlemi sırasında probların membrana ve DNA örneği üzerinde

özgün olmayan bölgelere bağlanmasını en aza indirgemek ya da önlemek amacıyla

hibridizasyon öncesi işlemler yapılır (prehibridizasyon). Bu amaçla 200 cm2’lik bir

membran için 18 ml olacak şekilde önceden 42˚C’ye ısıtılmış DIG Easy Hyb (kit

içerisinde hazır) çözeltisi içerisinde 30-60 dakika 42˚C’de düşük devirde hafif

çalkalanarak “Thermoshaker”da inkübe edildi.

2.4.10. Hibridizasyon

Her 5 ml DIG Easy Hyb çözeltisine 1 µl DIG işaretli telomer probu olacak

şekilde hibridizasyon çözeltisi hazırlandı. Prehibridizasyon işleminden sonra

prehibridizasyon çözeltisi ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra membran hazırlanan

hibridizasyon çözeltisi içerisinde DIG işaretli telomerik tekrar dizinlere spesifik prob

ile 3 saat 42˚C’de düşük devirde hafif çalkalanarak “Thermoshaker”da

hibridizasyona bırakıldılar. 200 cm2 membran için yaklaşık 6.5 ml hibridizasyon

çözeltisi gerekmektedir. Probla nitroselüloz membran üzerindeki DNA tek zincir

fragmanlarından tamamlayıcısı olan arasında, hidrojen bağları oluşumu ile çift

zincirli DNA parçası meydana geldi.

Hibridizasyon süresi sonunda hibridizasyon çözeltisi uzaklaştırıldı ve önce 2

defa 5’er dakika hibridizasyon sonrası 1. yıkama çözeltisi içerisinde oda sıcaklığında

yıkandı. Daha sonra hibridizasyon sonrası 2. yıkama çözeltisi içerisinde 2 defa 15’er

68

dakika önceden 50˚C’ye ayarlanmış “Thermoshaker”da düşük devirde hafif

çalkalanarak yıkandı. Bu yıkama işlemlerinin sonunda hibridize olmayan fakat

membranın yüzeyine tutunan problar ortamdan uzaklaştırıldılar.

2.4.11. Hibridize Olmuş Telomerik DNA’nın Belirlenmesi

Membran yeni temiz bir kaba alındı. Oda sıcaklığında 100 ml yıkama

tamponunda 5 dakika yıkandı. Yıkama tamponu uzaklaştırıldı ve membran 30 dakika

oda sıcaklığında hafif çalkalanarak taze hazırlanmış bloklama çözeltisi içerisinde

inkübe edildi. Bloklama çözeltisi uzaklaştırıldı. Daha sonra 75mU/ml olacak şekilde

(1/10,000 oranında) bloklama çözeltisi içerisinde sulandırılmış Anti-DIG-Alkalen

fosfataz (AP) çözeltisi hazırlandı. Membran bu çözelti ile probun yapısındaki

digoksigenin ile anti-DIG arasında kompleks oluşumu için oda sıcaklığında 30

dakika hafif çalkalanarak inkübe edildi. İnkübasyon süresi sonunda Anti-DIG-AP

antikor çözeltisi uzaklaştırılarak membran bağlanmayan fakat membran yüzeyine

tutunmuş olan antikorları uzaklaştırmak için 2 defa 15’er dakika 200 ml yıkama

tamponu (kitte hazır) içerisinde yıkandı. Yıkama tamponu uzaklaştırıldıktan sonra

membran 2-5 dakika oda sıcaklığında 100 ml belirleme tamponu içerisinde inkübe

edildi. Belirleme tamponu (kitte hazır) uzaklaştırıldıktan sonra fazla sıvının

uzaklaştırılması amacıyla membran absorban bir kâğıt üzerine kondu. Daha sonra

membran DNA bağlı yüzü üste gelecek şekilde bir naylon film üzerine yerleştirildi.

Bu işlem sırasında membran yüzeyi kurumamalıdır. Membranın üzerine

alkalenfosfataz enziminin substratı olan CDP-star maddesini içeren çözeltiden 40

damla damlatıldı ve membranın bütün yüzeyine homojen dağılması sağlandı.

69

Membranın üzeri arada hava kalmayacak ve düzgün bir yüzey oluşturacak şekilde

tekrar naylon film ile kapatıldı. Daha sonra bir kaset içerisinde karanlık bir odada

ışık geçirmeyecek şekilde yaklaşık 30 dakika radyografi filmi ile etkileştirildi. Daha

sonra film banyo edilerek telomerik fragmanlara ait bant görüntüleri elde edildi.

Bu yöntem kemilüminesans adını alır ve esası alkalen fosfatazın

kemilüminesan özellik gösteren substratı ile reaksiyona girmesi sonucu substratını

ışık sinyalleri (kemilüminesans) oluşturacak ürünlere dönüştürmesi esasına dayanır.

Oluşan bu ışık sinyallerinin radyografi filmini bozundurması sonucu membrandaki

bant görüntüsü filme yansır. Daha sonra filmdeki telomerik fragmanlere ait bölgeler

moleküler ağırlık standartı ile karşılaştırılarak dansitometrik olarak tayin edildi (77).

Bu amaçla aşağıdaki formül kullanıldı:

Ortalama Telomer uzunluğu=∑(ODi)/ ∑(ODi/Li)

ODi: Kemilüminesan sinyal (optik dansite)

Li: i pozisyonunda telomer fragmanının boyu (TeloTAGG Telomer Lenght Assay

kiti, Roche, Almanya)

70

2.4.12. Hibridizayonda Kullanılan Çözeltiler

Tablo 2.4.: Hibridizasyonda kullanılan çözeltiler

Tampon İçeriği

1. yıkama çözeltisi 2xSSC

%0.1 SDS

2. yıkama çözeltisi 0.2xSSC

%0.1 SDS

Bloklama tamponu Kit içerisinde hazır verilen 10x bloklama

tamponundan maleik asit ile 1:10 oranında

seyreltilerek hazırlanır.

Anti-DIG-AP tamponu Kit içerisinde verilen anti-DIG-AP çözeltisi daha

önceden hazırlanmış olan bloklama tamponu ile

1:10 oranında seyreltilir.

2.4.13. DNA’nın Jelden Geri Alınması

TRF analizlerimiz sırasında alınan ilk membran görüntüsünde görüntüde kısa

telomerik fargmanların beklendiği membran bölgesinde daha az yoğunlukta “smear”

(sürüntü) olmuştur. Bunun nedeninin restriksiyon kesiminin yetersiz kalarak

telomerik tekrarların yüksek moleküler ağırlıklı DNA içerisinde taşınması

olabileceği ihtimalini test etmek için, yüksek moleküler ağırlıklı DNA bandı

kesilerek jelden izole edilmiş ve restriksiyon enzimleri ile yeniden kesilerek

incelenmiştir.

71

DNA’nın jelden geri kazanılmasına yönelik oldukça farklı yöntemler

geliştirilmiştir. Bu yöntemlerle istenilen boyuttaki DNA fragmanlarını saf olarak elde

etmek veya DNA’yı herhangi bir aşamada saflaştırmak olasıdır. Jelden kestiğimiz

yüksek ağırlıklı DNA bandı bu yöntemlerden biri olan ticari olarak üretilen kolonlar

(BioBasic® SK131 Uniq-10 Spin Column) kullanılarak jelden izole edilmiştir. Bu

amaçla önce yüksek moleküler ağırlıklı DNA fragmanının olduğu jel bölgesi bistüri

ile kesilip çıkartılmıştır. 1.5 ml’lik bir tüp içerisinde kitle birlikte verilen tampon

çözeltisi içerisinde 50-60˚C’de 10 dakika inkübe edilmiştir. Agaroz tamamen

çözündükten sonra elde edilen çözelti kolonlara aktarılmış ve 8000 g’de 1 dakika

santrifüj edilmiştir. Böylece DNA’nın kolona bağlanması sağlanmıştır. Daha sonra

ayrıştırma tamponu kullanılarak DNA kolondan geri alınmıştır.

2.5. Telomerik Tekrar Amplifikasyon Protokolü (Telomeric Repeat

Amplification Protocol, TRAP)

Bu yöntem 1994’te Kim ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır (97). Hücre

ve dokulardan elde edilen homojenat bir PCR tüpünde, özel hazırlanmış primerler ile

muamele edilir. Eğer homojenat telomeraz içeriyorsa ortama konan primerleri

uzatacaktır. Daha sonra bu uzama ürünleri (extension product) “reverse” primer

kullanılarak PCR sisteminde amplifiye edilir. Poliakrilamid jelde yürütülür.

Telomeraz enzimi varlığında elektroforez sonucu tipik olarak 6 bç (baz çifti) içeren

tekrar bantları oluşur. Her zaman, çalışılan örneklerin ısı ile veya RNaz ile denatüre

edilmiş olanları da paralel olarak çalışılır. Eğer görünen bantlar telomerazın

telomerik DNA sentezlemek için kendi RNA kalıbını kullanması sonucu (telomeraz

72

aktivitesi) ortaya çıkıyorsa, RNA’ları denatüre edilmiş örneklerin bu tekrar bantları

oluşturmaması beklenir.

TRAP yöntemi ile telomeraz aktivitesinin ölçülmesine yönelik bu deneylerde

telomeraz enziminin içerdiği RNA komponentinin DNA primerlerin uzatılmasında

kalıp RNA olarak kullanılması ve RNA’nın çok çabuk denatüre olabilmesi nedeniyle

sterilizasyona son derece dikkat edilmelidir.

2.5.1. Ekstraktların Hazırlanması

Telomeraz aktivitesine yönelik bu seri deneyler için ayrılan, sıvı azotta

dondurulup daha sonra -80˚C’de bekletilmiş olan dokular çıkarılarak buz üzerinde

çözünmeleri sağlanmıştır. Daha sonra dokular steril bir petri kabı içerisinde steril bir

bistüri yardımıyla küçük parçacıklara ayrılmış daha sonra bu parçacıklar içerisinde

40-100 mg dokuya 200 µl 1xCHAPS liziz tamponu olacak şekilde bu tamponu içeren

tüplere (eppendorf) aktarılmıştır. Daha sonra parçalanma ve homojenizasyonu

sağlamak amacıyla içerisine steril tungsten boncuklar ilave edilmiş ve homojenize

edilmiştir. Bu aşamada ısı oluşunu önlemek son derece önemlidir. Bu amaçla

homojenizatörün hazneleri önceden -20˚C’de tutulmuş, homojenizasyon işleminin

hemen öncesinde çıkarılmıştır. Homojenizasyon işlemi ısı oluşumunu önlemek

amacıyla belirli aralıklarla gerçekleştirilmiştir.

73

Homojenizasyon işlemi sonunda suspansiyon haline gelmiş olan dokular buz

üzerinde 30 dakika inkübe edildiler. Daha sonra 12000 g’de 4˚C’de 20 dakika

santrifüj edildiler. Santrifüj işlemi sonucunda oluşan süpernatantın 160 µl’si yeni

steril bir tüpe alındı ve Biçinkoninik asid (BCA) yöntemi ile protein miktar tayini

yapılmak üzere ayrıldı. Kalan ekstrakt ise tekrar -80˚C’ye kaldırıldı.

2.5.2. Total Protein Miktar Tayini

Elde edilen ekstrakttaki toplam protein miktarını belirleyebilmek için total

protein miktar tayini yapılmıştır. Bu amaçla Biçinkoninik Asit (BCA) yöntemi

uygulanmıştır (200). Biçinkoninik asit (BCA) analizinin prensibi Lowry protein

tayinine benzemektedir (113). Her iki yöntemin temeli alkali ortamda Cu+2-protein

kompleksinin oluşumuna ve Cu+2’nin Cu+1’e indirgenmesine dayanmaktadır. Örnekte

var olan protein miktarı indirgenmiş Cu+1 miktarı ile doğru orantılıdır. Protein

yapısında yer alan sistein, sistin, triptofan, tirozin ve peptid bağlarının Cu+2’yi Cu+1’e

indirgediği gösterilmiştir. BCA, alkali ortamda Cu+1 ile mor-mavi kompleks

oluşturur, böylelikle alkali Cu+2’nin proteinler tarafından indirgenmesinin

izlenmesini mümkün kılmaktadır (172).

BCA protein analizi, Lowry (113) protein yönteminden daha duyarlıdır. Ayrıca,

Bradford (22) protein yöntemine göre daha stabil değerler elde edilir. BCA protein

yöntemi diğer protein yöntemlerine göre pek çok avantaja sahiptir;

74

• Kullanımı kolaydır,

• Renkli kompleks stabildir,

• Deterjanlardan daha az etkilenir,

• Geniş aralıkta protein konsantrasyonlarına uygulanabilir.

Çalışma reaktifinin hazırlanışı:

Reaktif A (Biçinkoninik asit çözeltisi) ve Reaktif B (%4’lük Cu(II)sülfat pentahidrat

çözeltisi) 50:1 oranında karıştırılır.

Standartların hazırlanışı:

Protein standartı olarak Bovine Serum Albumin (BSA) ve lizis tamponu kullanılarak

aşağıdaki şekilde dilüsyonlar hazırlanmıştır:

Tablo 2.5.:Total protein miktar tayininde kullanılan dilüsyonlar

Küvet No BSA final miktarı

(µg)

BSA Std. Hacmi

(0.1 mg/ml stoktan)

BSA Std Hacmi (1.0

mg/ml stoktan)

Lizis Tamponu

Hacmi

1 0 0 0 50 µl

2 1 10µl 0 40 µl

3 2 20 µl 0 30 µl

4 5 50 µl 0 0

5 5 0 5 µl 45 µl

6 10 0 10 µl 40 µl

7 15 0 15 µl 35 µl

8 20 0 20 µl 30 µl

75

Örneklerin hazırlanışı:

10 µl örneğe 40 µl lizis tamponu eklenerek dilüsyonlar hazırlanmıştır. Daha

sonra hazırlanan 50 µl final hacmine sahip kör, standart ve örnek dilüzyonlarının

üzerine 1’er ml çalışma reaktifi eklenir. 37˚C’de 30 dakika bekletildikten sonra

spektrofotometrede 562 nm’de örnek ve standartların absorbans değerleri köre karşı

okundu.

Tablo 2.6.’da standartların belirli konsantrasyonlarına karşı ölçülen absorbans

değerleri görülmektedir. Daha sonra bu değerlere göre standart grafiği çizilmiştir

(Şekil 2.2.). Absorbansı ölçülen örneklerin protein miktarları, örnek için ölçülen

absorbans değerine karşılık gelen konsantrasyon değeri standart grafik denkleminden

hesaplanarak belirlenmiştir.

Tablo 2.6.:Standartların belirli konsantrasyonlarına karşı ölçülen absorbans değerleri

Standart Konsantrasyon (µg/ml) Absorbans (nm)

1 0 0

2 1 0.032

3 2 0.079

4 ve 5 5 0.126

6 10 0.177

7 15 0.200

8 20 0.262

76

protein miktar tayini y = 0,0119x + 0,0353R2 = 0,9312

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0 5 10 15 20 25 konsantrasyon

abso

rban

s (5

62 n

m'd

e)

Şekil 2.2.: Total protein miktarı standart grafiği örneği

2.5.3. Kontroller

2.5.3.1. Negatif kontroller

Telomeraz ısıya duyarlı bir enzimdir. Bu nedenle negatif kontrol olarak her bir

örnek için ısıya maruz bırakılarak telomeraz enzimi inaktive edilmiş bir seri

hazırlandı. Bunun için her bir örnekten 10 µl alınarak 10 dakika 85˚C’de inkübe

edildi.

2.5.3.2. Telomeraz-pozitif hücre ekstraktı ile kontrol

Kitin içerisindeki hücre pelletleri (106 hücre) ile 200 µl 1xCHAPS lizis

tamponu kullanılarak telomeraz pozitif hücre ekstraktları hazırlandı. Bu stok çözelti

80˚C’de saklanıp her deney öncesi çıkarılıp 1:20 1xCHAPS lizis tamponu ile

seyreltilerek her bir reaksiyon için 2 µl kullanıldı (2 µl =500 hücre).

77

2.5.3.3. PCR Amlifikasyon kontrolü

Kullandığımız kit her bir reaksiyon tüpündeki PCR inhibisyonun gözlenmesi

amacıyla internal standart içermektedir. Bazı örnekler Taq polimeraz inhibitörleri

içerebilirler ve bu nedenle yanlış-negatif sonuç verebilirler. Bunu diğer

problemlerden ayırt etmek için kitteki TRAPeze primer karışımı TS primeri ile

birlikte internal kontrol oligonükleotidleri olan K1 ve TSK1’i içerir. Bunların normal

PCR koşullarında (Taq polimeraz inhibitörü yokluğunda) her bir sırada 36 bç’lik

bant (S-IC) oluşturması beklenir. S-IC bandı aynı zamanda amlifikasyonun

etkinliğini de göstermektedir.

2.5.3.4. Primer-dimer /PCR kontaminasyon kontrolü

Kalıp reaksiyon ortamında bulunan primerler kalıp DNA olmaksızın da

kalıptan bağımsız PCR ürünleri oluşturabilirler. Bu tür PCR ürünlerine primer-dimer

PCR artifaktları denir. Bu tür artifaktların neden olduğu kontaminasyonların test

edilmesi amacıyla her bir deney için hücre/doku ekstraktı yerine 2 µl 1xCHAPS lizis

tamponu kullanılarak reaksiyon kuruldu. Deneyin en uygun koşullarda çalıştığı

durumlarda primer-dimer/PCR kontaminasyon hatlarında 36 bç’lik internal kontrol

bandından başka bir ürün bulunmamasına dikkat edildi.

78

2.5.3.5. Telomeraz kantitasyon kontrol kalıbı-TSR8

TSR8 TS primerle aynı diziye sahip 8 telomerik tekrarla AG(GGTTAG)7

uzatılmış bir oligonükleotidtir. Bu kontrol telomerik tekrarların telomeraz ile

uzatıldığı verilen bir ekstraktta TS primerlerin miktarını tahmin etmek için standart

bir kontroldür. Örnek ekstraktı yerine 1-2 µl TSR8 kontrol kalıbı kullanılarak

reaksiyon kuruldu.

2.5.4. TRAP Analizinin PCR Basamağı

Her bir reaksiyon tüpü için aşağıdaki formülasyona göre reaksiyon karışımı

hazırlandı:

10xTRAP Reaksiyon Tamponu 5.0 µl

50x dNTP Karışımı 1.0 µl

TS primer 1.0 µl

TRAP primer karışımı 1.0 µl

Taq polimeraz (5 ünite/µl) 0.4 µl

Su 39.6 µl

Toplam hacim 48.0 µl

79

Bu karışımın 48 µl’si steril bir PCR tüpüne kondu ve üzerine 2 µl örnek ekstraktı,

ısı ile inaktive edilmiş örnek ekstraktı veya kontroller ilave edildi:

• Örnek ekstraktları: Her bir örnek tüpüne 2 µl ekstrakt kondu.

• Isı ile inaktive edilmiş örnek ekstraktı: Her bir örnekten 4-5 µl ekstrakt

85˚C’de 10 dakika inkübe edildi. Bu örnekler için ayrılmış her bir tüpe 2’şer

µl ısı ile inaktive edilmiş ekstrakt kondu.

• Telomeraz-pozitif kontroller: Pozitif kontrol hücre ekstraktlarından 250

hücre/µl konsantrasyonda olacak şekilde 2 µl kondu.

• Primer-dimer/PCR kontaminasyon kontrolü: Bu amaçla ayrılmış tüplere

1xCHAPS Lizis tamponu kondu.

• Kantitasyon Kontrolü: Kontrol tüplerinden birine 1 µl TSR8 (kontrol kalıbı)

ve 1 µl su diğerine 2 µl TSR8 kondu.

PCR Amplifikasyonu

Tüpler termal bloğuna yerleştirilip ve örneklerdeki olası telomeraz enzimi

etkisi ile primerlerin uzatılması amacıyla 30˚C’de 30 dakika inkübe edildi.

Daha sonra denatürasyon basamağı 94˚C’de 30 saniye, primerlerin bağlanması

basamağı 59˚C’de 30 saniye ve uzatma basamağı 72˚C’de 1 dakika olacak şekilde 32

döngü PCR işlemi uygulandı. Telomerik tekrarlara (GGTTAG) komplementer

oligonükleotid primerler kullanılan kitin üretici firması (TRAPeze, Chemicon, ABD)

tarafından sağlanmıştır.

80

2.5.5. Oluşan PCR Ürünlerinin Poliakrilamit Jelde Yürütülmesi

Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)

Akrilamitin polimerizasyonu ile hazırlanan poliakrilamit jeller küçük ya da orta

boydaki nükleik asit ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir.

Poliakrilamit jeller akrilamit ve çapraz bağlayıcı N,N’-metilen-bis-akrilamidin

serbest radikal polimerizasyonu ile hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı

(amonyum persülfat) ve katalizör (Tetrametilen etilen diamin, TEMED) tarafından

kontrol edilir.

Tablo 2.7: % 12,5’luk Poliakrilamit jelin hazırlanması (50 ml jel için)

Akrilamit/bisakrilamit (%40’lık) 15 ml

5xTBE 5 ml

%10 amonyum persülfat 250 µl

TEMED 50 µl

Distile su 30 ml

Herbir reaksiyon tüpüne 5 µl bromfenol mavisi ve ksilen siyanol içeren

yükleme boyası ilave edildi ve dikey elektroforez sistemine önceden dökülüp tarakla

birlikte dondurulmuş olan poliakrilamit jeldeki kuyucuklara yüklendi. 0.5xTBE’de

400V’da ksilen siyanol boyası 10-12 cm’lik jelin %70-75’ini katedene kadar

yaklaşık 1,5 saat yürütüldü. Elektroforez sonunda jel etidyum bromür ile yaklaşık 30

dakika boyandı ve daha sonra bağlanmamış boyanın uzaklaştırılması amacıyla

81

deiyonize su ile yaklaşık 20-30 dakika yıkanarak (destaining) UV’de görüntülendi.

S-IC internal kontrol bandı 36 bç ve en küçük PCR ürünü 50 bç olmalıdır.

Geçerli bir TRAP deneyi deney sonunda jel görüntülendiğinde şu koşulları

karşılamalıdır:

• Primer-dimer/PCR kontaminasyon kontrolü: 36 bç’lik internal kontrol bantı

dışında herhangi başka bir ürün görünmemelidir.

• Telomeraz-pozitif kontroller: 36 bç’lik internal kontrol bandı ve 50 bç’den

başlamak üzere 6 bazlık artışlar gösteren ardışık bantlar görünmelidir.

• Isı uygulanarak inaktive edilmiş örnekler: 36 bç’lik internal kontrol bantı

dışında herhangi başka bir ürün görünmemelidir.

Eğer yukarıdaki koşullar karşılanıyorsa, örnek eğer telomeraz-pozitif ise

telomeraz-pozitif kontroller ile aynı bant görüntülerine sahip olmalıdır (50 bç’den

başlamak üzere 6 bazlık artışlar gösteren ardışık bantlar). Eğer örnek telomeraz-

negatif ise sadece 36 bç’lik internal kontrol bandı görünmelidir.

2.6. Histolojik Analizler

Morfometrik inceleme için ayrılan damar segmentleri %4’lük formalin ile fikse

edilmiştir. Daha sonra 2 mm kalınlıkta olacak şekilde enine en az 4 örnek elde

edilerek doku takip işlemine alınmıştır. Doku takip cihazında (Intelsint, RV1, İtalya)

sırasıyla; artan derecedeki alkoller, ksilol ve parafin istasyonlarından geçirilerek

82

dokular parafine gömülmüştür. Histokimyasal işlemlerin detayı aşağıda

açıklanmıştır:

1. %80 alkol 2 saat

2. %95 alkol I 2 saat

3. %95 alkol II 1 saat

4. Absolu alkol I 1 saat

5. Absolu alkol II 2 saat

6. Ksilol I 20 dk

7. Ksilol II 20 dk

8. Ksilol III 20 dk

9. Parafin I 45 dk

10. Parafin II 1 saat

11. Parafin III 1 saat

Parafin bloklardan elde edilen 4 mikron kalınlığındaki kesitler bir tanesi klasik

diğer 4 tanesi ise polilisinli olmak üzere 5 lama alındı. Klasik preparatlar

Hematoksilen Eozin (HE), lizinli preparatlar ise düz kas aktini (DKA) (138),

prolifere olan hücre nükleer antijeni (proliferating cell nuclear antigen = PCNA)

(170) ve Ki67 (7) antikorları ile immunohistokimyasal boyama için ayrıldı.

83

2.6.1. Morfometrik İncelemeler

Klasik lama alınan preparatlar morfometrik incelemeler yapmak amacıyla HE

ile boyandı (101).

HE ile boyama işlemlerinin detayı aşağıda açıklanmıştır:

Prepratlar 60 ºC ayarlı etüvde 3 saat bekletildi.

Deparafinizasyon Ksilol I 10 dk

Deparafinizasyon Ksilol II 15 dk

Absolü alkol I 5 dk

Absolü alkol II 5 dk

%95 alkol 5 dk

%80 alkol 5 dk

Distile su 5 dk

Hematoksilen 4 dk

Çeşme suyu 2 dk

Asit-alkol 2 kez batırıp-çıkarma

Çesme suyu 2 kez batırıp-çıkarma

Amoyaklı su 2 kez batırıp-çıkarma

Çeşme suyu 2 kez batırıp-çıkarma

Distile su 3 dk

Eozin 1 dk

%95 alkol 2 dk

Absolü alkol 2 dk

Absolü alkol II 2 dk

Kurutma

Şeffaflandırma ksilol I 5 dk

Şeffaflandırma ksilol II 5 dk

Lam üzerine entellan damlatma

Lamel ile kaplama

84

Her bir örnek için rastlantısal olarak seçilen 3 farklı damar kesitine ait x4

büyütmedeki görüntüler yüksek çözünürlüklü video kamera (VKC220E, Hitachi,

Tokyo, Japonya) donanımı olan bir ışık mikroskobundan (Labophot-2, Nikon,

Tokyo, Japonya) IBM uyumlu bilgisayara aktarılmış ve bir görüntü analiz programı

(BS 200 Docu Version 2.0, BAB Imaging Systems, Ankara) kullanılarak lümen,

intima ve medya alanları monitör üzerinden çizilerek ölçülmüştür.

2.6.2. İmmünohistokimyasal İncelemeler

İmmunohistokimyasal uygulamada primer antikor olarak DKA (141) için 1A4

klonu (M0851, Dako; Glostrup, Danimarka) 1/200sulandırılarak, PCNA (25) için

PC10 klonu (M0879, Dako; Glostrup, Danimarka) 1/400 sulandırılarak ve Ki67 (44)

için SP6 klonu (RM-9106, Labvision; Fremont, Kanada) 1/200 sulandırılarak

kullanıldı. Ayrıca Ki67 için “clone” farkını ortaya koyabilmek amacıyla MIB-1

(N1633, Dako; Glostrup, Danimarka) için de ayrı bir boyama uygulandı. Universal

kit olarak işaretli Avidin-biyotin-peroksidaz metodu (LSAB) (Dako; Glostrup,

Danimarka), renklendirici olarak ise DAB (Zymed; South San Francisco, ABD)

kullanıldı. İmmunohistokimyasal boyamanın detayı aşağıda açıklanmıştır:

1. Parafin bloklardan distile suya kadar getirilen kesitler PBS’de (Phosphate Buffered

Saline Solution) (1 saat)

2. %3 H²O² (5 dk)

3. Çeşme suyunda yıkama

4. PBS (5 dk)

5. Blokan antikor (10 dk)

6. PBS (5 dk)

7. 10mMol sitrat solution (pH 8.5) içerisinde buhar tenceresinde 20 dk kaynatma ve

20 dk soğutma

85

8. PBS (5 dk)

9. Primer antikor (2 saat)

10. PBS (5 dk)

11. Biotinli sekonder antikor (45 dk)

12. PBS (5 dk)

13. Streptavidin/peoksidaz kompleksi (45 dk)

14. PBS (5 dk)

15. Diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB) ile 5 dk renklendirme

16. Çeşme suyu (5 dk)

17. Meyer Hematoksilen 2 dk zıt boyama

18. Çeşme suyu (2 dk)

19. %80 alkol (2 dk)

20. %95 alkol (2 dk)

21. Absolü alkol (2 dk)

22. Kurutma

23. Entellan ile lamelleme

İmmunohistokimyasal boyama sonucunda DKA için sitoplazmik, PCNA ve

Ki67 için nükleer kahverenkli boyanmalar pozitif kabul edilerek değerlendirmeye

gidilmiştir.

İmmüno boyama için kullanılan yöntem strept(avidin)- biotin peroksidaz

yöntemine dayanır. Bu yöntemde türe özgü primer antikor örnekle inkübe edildikten

sonra primer antikora bağlanması için biyotinlenmiş sekonder antikor kullanılır.

Daha sonra ortama eklenen “Horse Radish Peroxidase” (HRP) ile işaretlenmiş

streptavidin, biyotinli sekonder anikora bağlanır. Oluşan antijen/antikor/enzim

kompleksine son aşamada substrat/kromojen maddesi diaminobenzidin (DAB) ilave

edilerek peroksidaz enzimi aracılığı ile kahverengi renk reaksiyonu meydana

getirilir. Avidin yumurta akından elde edilen ve biotine karşı aşırı ilgisi olan bir

86

glikoproteindir. Avidinin yerine kullanılabilen bir molekül olan streptavidin ise

Streptococcus avidini’den elde edilir. Avidinden farklı olarak yüksüz bir moleküldür

ve özgün olmayan elektrostatik bağlanmalar daha az oluşur. Biotin ise antikor gibi

çeşitli biyolojik moleküllere konjüge olabilen düşük molekül ağırlıklı bir vitamindir.

Bu yöntem immünohistokimyasal yöntemler içerisinde en yaygın olarak kullanılan

yöntem olarak bilinmektedir (77).

2.7. Kan Örneklerinde Yapılan Ölçümler

II. Bölümde deney süresince bütiyonin sülfoksimin uygulanması sonucu kanda

indirgenmiş glutatyon/ yükseltgenmiş glutatyon oranının (GSH/GSSG), total

glutatyonun ve glutatyon peroksidazın enzim düzeylerindeki değişikliği

belirleyebilmek amacıyla tavşanların kulak arterinden 0. gün, 8. gün ve 14. günde

olmak üzere EDTA’lı tüplere alınan kan örneklerine, ölçümlerde kullanılan kitlerin

tanımladığı şekilde muamele edilmiş ve kan örnekleri ölçümlerin yapılacağı güne

dek -80˚C’de saklanmıştır.

2.7.1. Plazma Total Glutatyon (GSH) Miktarının Belirlenmesi

Alınan kan örneklerindeki total GSH miktarının belirlenmesi amacıyla

Bioxytech GSH-420 (Oxis, ABD) kiti kullanılmıştır. Bu yönteme göre örnek ilk önce

indirgen bir ajan olan tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) ilave edilerek örnekte

bulunan okside glutatyonun (GSSG) redükte forma indirgenmesi sağlanır. Daha

sonra kromojen, 4-kloro-1-metil-7-triflorometilkinolinyum metilsulfat ilave edilerek

87

tiyoeterler oluşturulur. Ortam bazik hale getirilerek kromoforik tiyon oluşturulur ve

420 nm’de absorbans okunur (30).

2.7.2. Plazma Glutatyon /Okside Glutatyon (GSH/GSSG) Oranının Tayini

Alınan kan örneklerindeki GSH/GSSG oranının tayini Bioxytech GSH/GSSG-

412 (Oxis, ABD) kiti kullanılarak yapılmıştır.Memeli hücreleri fazla oksidatif strese

maruz kaldıklarında GSH/GSSG oranı GSSG’nın birikimine bağlı olarak azalacaktır.

GSSG düzeyinin veya GSH/GSSG oranının ölçülmesi oksidatif stres için yararlı bir

indikatördür. Antioksidanlar ile girişim yapıldığında antioksidanların etkinliğinin

gözlenmesine olanak verir (71). Bu yöntemde tiyol süpürücü bir reaktif olan 1-metil-

2-vinilpiridinyum triflorometansülfonat (M2PV) kullanılarak GSSG ölçümü

yapılacak örnek hemen M2PV ile etkileştirilerek ortamdaki GSH’un uzaklaştırılması

sağlanır. Daha sonra ortama glutatyon redüktaz, NADPH ve kromojen olarak 5, 5’-

ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ilave edilerek GSSG’un GSH’a

dönüştürülmesi sağlanır ve bu dönüşüm sırasında oluşan renkteki değişim 412 nm’de

kaydedilir. Yöntemde yer alan tepkime döngüsü aşağıdaki gibidir.

88

2.7.3. Plazma Glutatyon Peroksidaz (GPx) Enzim Aktivitesinin Tayini

Alınan kan örneklerindeki glutatyon peroksidaz enzim aktivitesinin tayini

Bioxytech GPx-340 (Oxis, ABD) kiti kullanılarak yapılmıştır. Glutatyon peroksidaz

enzimi vücutta hidrojen peroksidin suya ve reaktif radikaller oluşturabilen organik

peroksitlerin de stabil organik alkollere indirgenmesini katalizler. Bu raksiyon için

indirgeyici ajan olarak glutatyonu (GSH) kullanır. Yöntemin esası GPx tarafından

organik bir peroksidin indirgenmesi sırasında ortaya çıkan okside glutatyonun

(GSSG) glutatyon redüktaz enzimi ile tekrar redükte formu olan GSH’a

indirgenmesine dayanan dolaylı bir ölçüme dayanır (140). Bu indirgenme reaksiyonu

sonucunda NADPH da NADP+’ye dönüşür. NADPH’ın NADP+’ya dönüşümüne

340nm’teki absorbansta azalma eşlik eder. Örnek; glutatyon, glutatyon redüktaz ve

NADPH bulunan ortama ilave edilir. Substrat (tert-bütil hidroperoksit) eklendiğinde

reaksiyon başlar ve 340 nm’deki absorbans 3 dk. boyunca kaydedilir. Yönteme

ilişkin reaksiyon basamakları aşağıdaki gibidir.

2.8. Aygıtlar

Birinci seri deneylerimizde kullandığımız aygıtlar Tablo 2.8 ‘de verilmiştir.

89

Tablo 2.8.: Birinci seri deneylerde kullanılan aygıtlar

Aygıt Marka

Otoklav Hirayama Hiclave HV-50L, Japonya

Jel karıştırıcı IKA K5501D, ABD

Isıtıcılı karıştırıcı kabin Thermoshake, Gerhardt, Almanya

Homojenizatör Qiagen TissuLyser®- Retech, Haan, Almanya

Vorteks IKA, MS1 Minishaker, Amerika

Manyetik karıştırıcı Elektro-mag, M22, Türkiye

Tartım cihazı Sartorius BP121S, Almanya

Santrifüj cihazı Hettich EBA12, Almanya

Soğutuculu santrifüj cihazı Hettich Mikro 200R, Almanya

Thermal cycler Techne TC-512, Cambridge, İngiltere

pHmetre Inolab pHlevel1, Wheilheim, Almanya

Derin dondurucu Nuaire -86˚C Ultralow freezer, Revco Technologies,

Asheville,NC, ABD

UVcrosslinker cihazı Vilber Lourmat, Cedex, Fransa

UV görüntüleyici Vilber Lourmat, Cedex, Fransa

Mikrodalga fırın Ariston MW211W, İtalya

Elektroforez güç kaynağı 1 EC-250-90, Thermo, New York, ABD

Elektroforez güç kaynağı 2 EC-1000-90 Thermo, New York, ABD

Yatay elektroforez sistemi 1 Thermo EC Maxicell Primo EC340,New York,ABD

Yatay elektroforez sistemi 2 Thermo EC Midicell Primo EC330,New York,ABD

Dikey elektroforez sistemi Atto AE-6200 SlabEP Chamber ve AE-6210 Gel cast,

Tokyo, Japonya

UV spektrofotometre Shimadzu, UV-1208, Japonya

UV spektrofotometre modülü Perkin Elmer Victor3, ABD

90

2.9. Verilerin Değerlendirilmesi

Veriler ortalama±ortalamanın standart hatası şeklinde verilmiştir; n damarların

alındığı tavşan sayısını göstermektedir. Çoklu karşılaştırmalar varyans analiz modülü

(one way analysis of variance, ANOVA) ile gerçekleştirilmiştir. Gruplar arasındaki

karşılaştırmalar Student t testi ile analiz edilmiştir. P değerleri 0.05’ten küçük

bulunduğunda fark istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

91

3. BULGULAR

3.1. Bölüm 1

Bu bölümde tavşan iliyak arterine anjiyoplasti uygulaması sonrası farklı lezyon

sürelerinde (0. gün, 2. gün, 7. gün ve 14. gün) vasküler düz kas hücrelerinde telomer

devamlılığı ve telomeraz aktivitesinin incelenmesine ilişkin deneyler yapılmıştır.

Elde edilen bulgular aşağıdaki gibidir;


3.1.1.1. İntima alanı

Tavşan ilyak arterine balon anjiyoplasti uygulamasına bağlı olarak intimal

kalınlaşma gelişimini saptamak üzere, uygulamanın 0., 2., 7. ve 14. günü sonunda

intimal alan ölçümleri üzerinde istatistiksel analizler yapılmıştır. Analiz sonuçları

balon anjiyoplasti uygulamasının, uygulama sonrası, 0., 2., ve 7. günlerde, intimal

kalınlaşma üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisinin olmadığını ortaya

koymaktadır (Şekil 3.1., sayısal veriler sunulmamıştır). Bunun yanı sıra, analizler

balon uygulamasının 14. gün sonunda intimal kalınlaşmayı anlamlı bir şekilde

artırdığını göstermektedir (mm2: 0.75±0.08, 0.25±0.06, sırasıyla balon anjiyoplasti

uygulanmış ve uygulanmamış ilyak arterler, Student t testi, P<0.01, n=3) (Şekil 3.2.).

92

A B

Şekil 3.1.: Balon anjiyoplasti sonrası 0. günde hasar uygulanan (A) ve uygulanmayan (B) tavşan ilyak arterlerine örnek kesitler (x 10 büyütmede alınmıştır).

A) B)

Şekil 3.2.: Balon anjiyoplasti sırasında hasar uygulanan (A) ve uygulanmayan (B) tavşan ilyak arterlerinin anjiyoplastiyi izleyen 14. günde alınan örnek kesitleri (x10 büyütmede alınmıştır).

93

3.1.1.2. Medya Alanı

Tavşan ilyak arterine balon anjiyoplasti uygulamasına bağlı olarak,

uygulamanın 0., 2., 7. ve 14. günü sonunda medya alanı üzerindeki etkilerini

saptamak üzere istatistiksel analizler yapılmıştır. Analizi sonuçları balon anjiyoplasti

uygulamasının 0., 2., 7. ve 14. günlerinde medya alanı üzerinde istatistiksel olarak

anlamlı bir etkisinin olmadığını ortaya koymaktadır (Sayısal veriler sunulmamıştır).

3.1.1.3. Lümen Alanı

Tavşan ilyak arterine balon anjiyoplasti uygulamasına bağlı olarak,

uygulamanın 0., 2., 7. ve 14. günü sonunda lümen üzerindeki etkilerini saptamak

üzere istatistiksel analizler yapılmıştır. Analiz sonuçları balon anjiplasti

uygulamasının 0., 2., 7. günlerinde balon anjiyoplasti uygulamasının lümen alanı

üzerine herhangi bir etkisinin olmadığını ortaya koymuştur (sayısal veriler

sunulmamıştır). Buna karşılık balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. gününde

lümen alanının anlamlı bir şekilde azaldığı belirlenmiştir (mm2: 0.52±0.07,

0.195±0.03; sırasıyla balon anjiyoplasti uygulanmış ve uygulanmamış ilyak arterler,

Student t testi, P<0.001, n=3).

94

3.1.2. İmmunohistokimyasal İncelemeler

3.1.2.1. Ki–67 Ekspresyonu

Tavşan ilyak arterine balon uygulamasına bağlı olarak 0., 2., 7. ve 14. günler

sonunda proliferasyon belirteci olan Ki-67’nin MIB-1 klonu (Dako, Glostrup,

Danimarka) ile herhangi bir boya görülmezken (Şekil 3.3 A), Ki-67’nin SP6 klonu

(Labvision, Fremont, Kanada) ile nükleer alanda pozitif boyanma saptanmıştır

(Şekil 3.3 B).

A) B)

Şekil 3.3.: Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. günde izole edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve A) Ki-67 MIB-1 klonu ile etkileştirilmiş ilyak arter damar kesiti -boyama (-) (X20 büyütme) B) Ki-67 SP6 klonu ile etkileştirilmiş ilyak arter damar kesiti –Boyama (+) (X40 büyütme)

95

3.1.2.2. Prolifere Olan Hücre Nükleer Antijeni (Proliferating Cell Nuclear

Antigen = PCNA) Ekspresyonu

Tavşan ilyak arterine balon uygulamasına bağlı olarak 0., 2., 7. ve 14. günler

sonunda proliferasyon belirteci olan PCNA ile nükleer alanda pozitif bir boyanma

saptanmıştır (Şekil 3.4.).

A) B)

C) D)

Şekil 3.4.: Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası A)14. günde B) 7. günde C) 2. günde D) 0. günde izole edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve PCNA ile etkileştirilmiş ilyak arter damar kesitinde intimal kalınlaşma alanında PCNA ile pozitif boyanma (X10 büyütme)

3.1.2.3. α-Aktin Ekspresyonu

Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası intimal kalınlaşma gelişen tavşan ilyak

arterlerinde düz kasa spesifik α-aktin ekspresyonu saptanmıştır (Şekil 3.5.).

96

Şekil 3.5.: Balon anjiyoplasti sırasında hasar verilen ve uygulama sonrası 14. günde izole edilen damarlarda gelişen intimal kalınlaşmada α-aktin ekspresyonu saptanmıştır (kahve renkli boyanma).

3.1.3. Telomer Fragmanlarının Uzunluğu

3.1.3.1. DNA İzolasyonu ve Miktarının Saptanması

Tavşan ilyak arterine balon anjiyoplasti uygulanmasının telomer boyu üzerine

olan etkilerini araştırmak üzere telomerik tekrar restriksiyonel fragmantasyon

(Terminal Restriction Fragments, TRF) deneyleri gerçekleştirilmiştir (Bakınız Gereç

ve Yöntem). Bu amaçla homojenize edilen dokulardan Gereç ve Yöntem bölümünde

ayrıntılı olarak belirtildiği gibi DNA izolasyonu yapılmıştır. DNA izolasyonu sonucu

elde edilen örneklerde DNA düzeyi spektrofotometrik yöntem ile belirlenmiştir.

Tablo 3.1.’de örneklerin absorbans değerleri ve DNA konsantrasyonları verilmiştir.

Bu veriler telomerik fragmanların incelenmesine yeterli olacak düzeyde genomik

DNA elde edildiğini göstermektedir. İzole edilen DNA örneklerinin agaroz jelde

yürütülmesi ve görüntülenmesi sonucu elde edilen analiz de Şekil 3.6’da

verilmektedir.

97

3.1.3.2. DNA’nın Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi

Uygulanan protokol gereği izole edilen genomik DNA Gereç ve Yöntem

bölümünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi restriksiyon endonükleazları ile

kesilmiştir. Restriksiyon sonrası elde edilen görüntü Şekil 3.6.’te verilmektedir.

Restriksiyon öncesi ve sonrasına ait olan görüntüler (Şekil 3.6. A ve B)

karşılaştırıldığında genomik DNA moleküllerinin uygulanan restriksiyon kesimine

yanıt verdiği, telomerik fragmanları kapsayan moleküllerin daha kısa fragmanlara

dönüştüğü görülmektedir.

3.1.3.3. DNA’nın Jelden Membrana Transfer Edilmesi

3.1.3.3.1. Radyoaktif Olmayan İşaretleme ile Yapılan Deneyler

Restriksiyon sonrası görüntülenen moleküllerin telomerik fragmanlara ait olup

olmadığını saptamak üzere, agaroz jelleri Southern blot tekniği ile nitroselüloz

membranlara transfer edilmişlerdir. Bu amaçla membranlar radyoaktif olmayan bir

işaretleyici olan digoksigenin ile işaretli telomerik oligo ile hibridize edilmiş ve

tabedilmiştir (Şekil 3.7). Bu görüntü incelendiğinde kısa telomerik fragmanların

beklendiği membran bölgesinde daha az yoğunlukta sürüntüler görülmektedir.

98

Tablo 3.1.: DNA izolasyonu sonrası elde edilen örneklerin absorbans değerleri.

Örnek No* Absorbans Konsantrasyon (µg/µl)

1 0.073 0.073

2 0.044 0.044

3 0.050 0.050

4 0.044 0.044

5 0.046 0.046

6 0.045 0.045

7 0.042 0.042

8 0.048 0.048

* Örnekler jele uygulama sırasına göre belirtilmiştir.

A) B) 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Şekil 3.6.: A) DNA izolasyonu sonrası genomik DNA’nın %0.8’lik agaroz jele uygulanması sonucu elde edilen 1. jele ilişkin görüntü ( 40 V/saat; toplam 160 V); B) Restriksiyon sonrası elde edilen görüntü. 1. sıra moleküler büyüklük standardı, 2. ve 3. sıra yüksek ve düşük standartlar.

99

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Şekil 3. 7.: DNA izolasyonu ve restriksiyonu yapılan örneklerin (1. jel) Southern blot ve hibridizasyon sonrası elde edilen görüntüsü.

Örneklerdeki telomerik DNA fragmanlarının uzun olup olmadığını test etmek

amacıyla deney aynı koşullarda yinelenmiştir. Bu denemeye ilişkin restriksiyon

öncesi ve sonrası elde edilen jel görüntüleri Şekil 3.8.A ve B’de verilmektedir (2.

jel). Şekil 3.8.B’de, daha önce yapılan deney sonuçlarına (Şekil 3.6.B) benzer şekilde

genomik DNA moleküllerinin uygulanan restriksiyon kesimine yanıt verdiği ve

telomerik fragmanları kapsayan moleküllerin daha kısa fragmanlara dönüştüğü

görülmektedir.

100

A) B)

Şekil 3.8.: Telomerik DNA fragmanlarının büyük ölçüde uzun olup olmadığının kontrol edilmesi amacıyla %0.8’lik agaroz jelde yürütülen ve ETBr ile görünür hale getirilmiş genomik DNA’nın restriksiyon öncesi (A) ve sonrası elde edilen fragmanların (B) jeldeki görüntüleri. Deney grubu balon anjiyoplasti uygulanan damarları, kontrol grubu ise hasar uygulanmayan damarları ifade etmektedir.

Jeldeki DNA’nın Southern blot tekniği ile membrana aktarılması, telomerik

fragmanların hibridizasyonu sonrasında tabedici (developer) kullanılarak elde edilen

görüntüler de Şekil 3.9.’de verilmektedir. Bu görüntü incelendiğinde telomerik DNA

fragmanlarının daha belirgin olduğu gözlenmektedir.

101

Şekil 3.9.: İkinci denemeye ilişkin (2. jel) DNA izolasyonu ve restriksiyonu yapılan örneklerin Southern blot ve hibridizasyon sonrası elde edilen görüntü (Deney grubu balon anjiyoplasti uygulanan damarları, kontrol grubu hasar uygulanmayan damarları ifade etmektedir). 1. sıra moleküler büyüklük standardı, 2. ve 3. sıra yüksek ve düşük standartlar.

Gereç ve Yöntem’de belirtilen protokol izlenerek bir diğer deney serisinden (3. jel)

elde edilen blot görüntüsü de Şekil 3.10.’da verilmektedir.

102

Şekil 3.10.: DNA izolasyonu ve restriksiyon sonrası Southern blot ve hibridizasyonu yapılan bir diğer deney serisine ilişkin jelin (3. jel) görüntüsü (Deney grubu balon anjiyoplasti uygulanan damarları, kontrol grubu hasar uygulanmayan damarları ifade etmektedir). 1. sıra moleküler büyüklük standardı.

3.1.3.3.2. Radyoaktif İşaretleme ile Yapılan Deneyler

Bu amaçla 32P işaretli DNA dizisi kullanılmıştır. Digoksigenin ile işaretli

telomerik oligo ile gerçekleştirilen deneylerin sonucunda elde edilen görüntülerin

duyarlığını test etmek amacıyla, aynı deney protokolu uygulanarak hazırlanan

dördüncü bir jel membrana aktarılarak ve Georgia Üniversitesi Genetik Bölümü’ne

(Dr. McEachern, ABD) gönderilmiştir. Bu deneye ilişkin sonuçlar Şekil 3.11.’da

verilmiştir.

103

Şekil 3.11.: 32P işaretleme ile elde edilen radyografi (Deney grubu balon anjiyoplasti uygulanan damarları, kontrol grubu hasar uygulanmayan damarları ifade etmektedir).

104

3.1.3.4. Telomerik Fragmanların Kantitatif Değerlendirilmesi

İkinci ve üçüncü jelin blotlanması sonucu elde edilen Şekil 3.9. ve Şekil

3.10.’da verilen telomerik fragman analizlerinin kantitatif değerlendirilmesi (Bakınız

Gereç ve Yöntem) yapılmıştır (100). Elde edilen sonuçlar sırasıyla Tablo 3.2. ve

3.3.’te verilmektedir. Yapılan incelemeler ilyak artere balon anjiyoplasti uygulaması

sonucu telomer boyunun ilk ikinci denemede 7. ve 14. günlerde sırasıyla % 71 ve %

77; üçüncü denemede 2., 7. ve 14. günlerde hasar görmeyen ilyak artere göre

sırasıyla % 64, % 85 ve % 63 oranlarında azalma gösterdiği belirlenmiştir.

Benzer şekilde radyoaktif işaretleme yapılarak elde edilen blot görüntüsündeki

(Şekil 3.11.) rölatif ortalama telomer boylarına (% OTF) ilişkin sonuçlar Tablo

3.4.’de verilmiştir. Yapılan analizler ortalama telomer uzunluğunun balon

anjiyoplasti uygulanan ilyak arterlerde, uygulamanın 2. ve 14. günlerinde %53 ve

%74 oranında anlamlı bir şekilde azaldığını göstermektedir (OTF, kbç:3.03±0.83,

1.61±0.09, 2.66±0.29, 2.27±0.19 sırasıyla 0., 2., 7. ve 14. günler, P<0.01, 0. ve 2.

gün arasında; P<0.05 0. ve 14. gün arasında, Student t testi, n=3).

105

Tablo 3.2.: Şekil 3.9’deki blot görüntüsüne ait ortalama telomerik fragman (OTF) değerleri (OTF değerleri deneysel grupta kontrol gruba göre yüzdelenmiştir).

(OTF) (%)

Gün Deneysel Grup Kontrol

Grubu

0 100 100

7 71 100

14 77 100

Tablo 3.3.: Şekil 3.10’daki blot görüntüsüne ait OTF değerleri Kontrol grubuna göre yüzdelendiğinde elde edilen % değerler.

OTF (%)

Gün Deneysel Grup Kontrol

Grubu

0 100 100

2 64 100

7 85 100

14 63 100

106

Tablo 3.4.: Şekil 3.11’de radyoaktif işaretleme sonucu elde edilen blot görüntüsü verilen örneklerin ortalama rölatif telomerik fragman (OTF) değerleri

OTF (%)

Günler Deneysel Grup Kontrol Grubu

0 100 100

2 53 73

7 87 82

14 74 88

3.1.4. Telomeraz Biyoaktivitesi

Tavşan ilyak arterine balon anjiyoplasti uygulaması sonucu telomer boy

uzunluğunu belirlemek için kullanılan örneklerde TRAP analizi yapılarak telomeraz

biyoaktivitesi araştırılmıştır. Sonuçlar Şekil 3.12.’de verilmektedir. Bulgular,

TRAPeze kitini üreten firmanın telomeraz ekspresyonu varlığında beklenen jel

görüntüsünden farklıdır (Şekil 3.13.) Buradan hareketle, TRAP analizi deneyleri

ilyak artere balon anjiyoplasti uygulamasının telomeraz ekspresyonuna neden

olmadığını ortaya koymuştur.

107

Şekil 3.12: TRAP analizi sonucu elde edilen poliakrilamid jel fotoğrafı. Deney grubu balon anjiyoplasti uygulanan damarları, kontrol grubu hasar uygulanmayan damarları ifade etmektedir.

108

Şekil 3.13. TRAPeze (Chemicon, ABD) kiti ile elde edilen telomeraz aktivitesine ilişkin ideal jel görüntüsü.

109

3.2. Bölüm II

Bu bölümde tavşan iliyak arterine balon anjiyoplasti uygulanması sonrası

vasküler düz kas hücrelerinde telomer uzunluğuna oksidatif stresin etkisinin

araştırılmasına ilişkin deneyler yapılmıştır. Elde edilen bulgular aşağıdaki gibidir;


Alınan kesitlerden, intima, medya, lümen alanı ölçümleri yapılmıştır. Aşağıda

her gruba ait deney hayvanlarından birer örnek kesit verilmektedir (Şekil 3.14).

Yapılan istatistiksel değerlendirmeler;

a. Balon hasarı oluşturulmuş damarlarda, BSO ile işlem görmenin

intimal hiperplaziyi istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artırdığını (p<0.01,

ANOVA sonrası Bonferoni testi),

b. BSO uygulamasının tek başına intimal hiperplazi oluşumuna

katkıda bulunmadığını,

c. Taurin ile tedavinin BSO ile artan intimal hiperplaziyi istatistiksel

olarak anlamlı şekilde azalttığını (p<0.01, ANOVA sonrası Bonferoni testi)ortaya

koymaktadır.

110

A) B)

C) D)

Şekil 3.14: Hematoksilin-eozin ile boyanmış tavşan iliyak arter kesitlerinin ışık mikroskobu ile x4 büyütmede saptanan görüntüleri. A) Balon anjiyoplasti ve aynı zamanda BSO uygulanan, B) Balon anjiyoplasti ve BSO+Taurin uygulanan, C) Balon anjiyoplasti ve taurin uygulanan D) Yalnız balon anjiyoplasti uygulanan damar örneklerini göstermektedir.

Intimal alan ve lümen alanlarına ait grafikler sırasıyla Şekil 3.15 ve Şekil 3.16’da

sunulmaktadır.

111

Şekil 3.15 İntimal alan (mm2) değerleri (Kontrol: Hasar görmemiş ilyak arter, B: Balon uygulaması, T: Taurin BT: BSO ve Taurinin birlikte uygulanması) (ANOVA sonrası Bonferoni test) (Herbir grup için n=3)

Şekil 3.16: Lümen alanı (mm2) değerleri (Kontrol:Herhangi bir işlem görmemiş damar, B: Balon uygulaması, T: Taurin BT: BSO ve Taurinin birlikte uygulanması) (ANOVA sonrası Bonferoni test) (Herbir grup için n=3)

112

3.2.2. İmmünohistokimyasal İncelemeler

3.2.2.1. Ki–67 Ekspresyonu

Tavşan ilyak arterine balon uygulamasına bağlı olarak her dört grubun balon

anjiyoplasti uygulanmış damarlarında proliferasyon belirteci olan Ki-67 (SP6 klonu)

ile nükleer alanda pozitif bir boyanma saptanmıştır (Şekil 3.17.).

Şekil 3.17.: Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. günde izole edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve Ki-67 ile etkileştirilmiş ilyak arter damar kesitinde intimal kalınlaşma alanında. Ki-67 ile pozitif boyama (X40 büyütme)

113

3.1.2.2. Prolifere Olan Hücre Nükleer Antijeni (Proliferating Cell Nuclear

Antigen = PCNA) Ekspresyonu


anjiyoplasti uygulanmış damarlarında proliferasyon belirteci olan PCNA ile nükleer

alanda pozitif bir boyanma saptanmıştır (Şekil 3.18.).

A) B)

C) D)

Şekil 3.18.: Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. günde izole edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve PCNA ile etkileştirilmiş ilyak arter damar kesitinde intimal kalınlaşma alanında. PCNA ile pozitif boyama (X10 büyütme) A)Balon+BSO B)Balon+BSO+T C)Balon D)Balon+Taurin

114

3.1.2.3. α-Aktin Ekspresyonu


anjiyoplasti uygulanmış damarlarında da düz kasa spesifik α-aktin’a spesigik

boyanma saptanmıştır (Şekil 3.19.).

A) B)

C) D)

Şekil 3.19.: Balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. günde izole edilerek parafin ile sabitlendirilmiş ve α-aktin ile etkileştirilmiş ilyak arter damar kesitinde intimal kalınlaşma alanında α-aktin ile pozitif boyanma (X10 büyütme) A)Balon+BSO B)Balon+BSO+T C)Balon D)Balon+T

115

3.2.3. Kanda Yapılan Ölçümler

3.2.3.1. Plazma Total Glutatyon (GSH) Miktarı

Ölçümler sonucunda yapılan istatistiksel analizler BSO ile glutatyonun

tüketilmesinin balon hasarı sonrası 7. gün ve 14. günlerde alınan kan örneklerinde

total GSH konsantrasyonunu istatiksel olarak anlamlı bir şekilde azalttığını

göstermektedir. BSO ve taurinin birlikte uygulanması bu azalmayı anlamlı bir

şekilde geri döndürmektedir (Tablo 3.5).

Tablo 3.5.: Plazmadaki total glutatyon konstrasyonu (µM)

0.gün 7.gün 14.gün

Kontrol (n=3) 1111.3±67.96 981±52.75* 1052±109.81**

BSO (n=3) 1098.1±66.18 675.73±28.06+ 431.2±34.23++,#

BSO+Taurin (n=3) 1072.1±102.96 968.81±25.61## 1049.9±53.57***

Taurin (n=3) 1259.8±60.32 1119.7±87.43§ 1036.7±56.63§§

*Kontrol 7. gün vs BSO 7. gün (p<0.05) **Kontrol 14. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) +BSO 0. gün vs BSO 7. gün (p<0.01) ++BSO 0. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) #BSO 7. gün vs BSO 14. gün (p<0.05) ## BSO 7. gün vs BSO+Taurin 7. gün (p<0.05) ***BSO 14. gün vs BSO+Taurin 14. gün (p<0.001) §BSO 7. gün vs Taurin 7. gün (p<0.01) §§BSO 14. gün vs Taurin 14. gün (p<0.01) (Değerler ortalama ± ortalamanın standart hatası olarak verilmiştir. ANOVA sonrası Bonferoni test kullanılmıştır)

116

3.2.3.2. Plazma Glutatyon /Okside Glutatyon (GSH/GSSG) Oranları



GSH/GSSG oranını istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azalttığını göstermektedir.

BSO ve taurinin birlikte uygulanması bu oranı istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde

normalize etmektedir (Tablo3.6)

Tablo 3.6.: Plazma GSH/GSSG Oranları


Kontrol (n=3) 176.99±3.49 171.72±3.28* 166.49±1.97**

BSO (n=3) 166.96±2.4 24.68±2.25+ 78.85±7.79++,#

BSO+Taurin (n=3) 172.55±5.05 164.78±4.27## 156.21±5.50***

Taurin (n=3) 175.56±3.74 173.80±2.73§ 175.19±2.92§§

*Kontrol 7. gün vs BSO 7. gün (p<0.01) **Kontrol 14. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) +BSO 0. gün vs BSO 7. gün (p<0.001) ++BSO 0. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) #BSO 7. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) ## BSO 7. gün vs BSO+Taurin 7. gün (p<0.01) *** BSO 14. gün vs BSO+Taurin 14. gün (p<0.01) §BSO 7. gün vs Taurin 7. gün (p<0.01) §§BSO 14. gün vs Taurin 14. gün (p<0.01)

(Değerler ortalama ± ortalamanın standart hatası olarak verilmiştir. ANOVA sonrası Bonferoni test kullaılmıştır)

117

3.2.3.3. Plazma Glutatyon Peroksidaz (GPx) Enzim Aktivitesi



glutatyon peroksidaz enziminin aktivitesini istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde

azalttığını göstermektedir. BSO ve taurin’in birlikte uygulanması bu azalmayı

istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde normalize etmektedir (Tablo 3.7)

Tablo 3.7: Plazma GPx (µmol/NADPH/dk/ml) Enzim Aktivitesi


Kontrol (n=3) 2.80±0.03 2.75±0.03* 2.76±0.02**

BSO (n=3) 2.72±0.04 2.12±0.08+ 1.64±0.12++,#

BSO+Taurin (n=3) 2.76±0.07 2.69±0.02## 2.65±0.09***

Taurin (n=3) 2.69±0.10 2.70±0.12§ 2.80±0.04§§

*Kontrol 7. gün vs BSO 7. gün (p<0.01) **Kontrol 14. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) +BSO 0. gün vs BSO 7. gün (p<0.01) ++BSO 0. gün vs BSO 14. gün (p<0.01) #BSO 7. gün vs BSO 14. gün (p<0.001) ## BSO 7. gün vs BSO+Taurin 7. gün (p<0.01) ***BSO 14. gün vs BSO+Taurin 14. gün (p<0.01) §BSO 7. gün vs Taurin 7. gün (p<0.01)

§§BSO 14. gün vs Taurin 14. gün (p<0.01) (Değerler ortalama ± ortalamanın standart hatası olarak verilmiştir. ANOVA sonrası Bonferoni test kullaılmıştır)

118

3.2.4. Telomer Fragmanlarının Uzunluğu

3.2.4.1. DNA İzolasyonu ve Miktarının Saptanması

Tavşan iliyak arterine uygulanan balon anjiyoplasti sonrası vasküler düz kas

hücrelerinde telomer uzunluğuna oksidatif stresin etkisinin araştırılması amacıyla bir

önceki bölümde olduğu gibi telomerik tekrar restriksiyonel fragmantasyon (Terminal

Restriction Fragments, TRF) deneyleri gerçekleştirilmiştir (Bakınız Gereç ve

Yöntem). Bu amaçla homojenize edilen dokulardan Gereç ve Yöntem bölümünde

ayrıntılı olarak belirtildiği gibi DNA izolasyonu yapılmıştır. DNA izolasyonu sonucu

elde edilen örneklerde DNA düzeyi spektrofotometrik yöntem ile belirlenmiştir.

Tablo 3.8’de örneklerin absorbans değerleri ve DNA konsantrasyonları verilmiştir.

Bu veriler telomerik fragmanların incelenmesine yeterli olacak düzeyde genomik

DNA elde edildiğini göstermektedir.

Daha sonra izole edilen ve miktarları belirlenen DNA örnekleri eşit miktarlarda

olacak şekilde % 0.8’lik agaroz jelde yürütülmüştür. Aynı örneklerin bir kısmı ise

EcoRI enzimi ile 1 saat 37˚C’de inkübe edildikten sonra % 0.8’lik jelde

yürütülmüştür. Aynı örneklere her iki uygulamanın karşılaştırılmalı olarak aynı jelde

görülebileceği örnek jel fotoğrafı Şekil 3.20’de verilmektedir. Bu jelden elde edilen

görüntü spektrofotometrik olarak yapılan miktar tayini ile paralellik göstermektedir

ve Southern blot yönteminde iyi bir jel görüntüsü elde edebilmek için her bir

kuyucuğa ~1 µg DNA uygulamasının yeterli olacağı sonucuna varılmıştır.

119

Tablo 3.8: DNA izolasyonu sonrası elde edilen örneklerin absorbans değerleri.

Örnek No. Absorbans Konsantrasyon

(µg/ml)

1 0.062 62 2 0.069 69 3 0.077 77 4 0.062 62 5 0.056 56 6 0.051 51 7 0.058 58 8 0.057 57 9 0.066 66

10 0.063 63 11 0.123 123 12 0.085 85 13 0.088 88 14 0.097 97 15 0.145 145 16 0.07 70 17 0.094 94 18 0.144 144 19 0.116 116 20 0.062 62 21 0.065 65 22 0.068 68 23 0.091 91 24 0.054 54

120

Şekil 3.20: Telomer analizi öncesi DNA miktarının gözlenebilmesi amacıyla elde edilen jel fotoğrafı. Üst sıra: EcoRI ile kesilmiş DNA, alt sıra: Aynı örneklere ait herhangi bir işlem görmemiş genomik DNA(uygulama sırası aynıdır).

3.2.4.2. DNA’nın Restriksiyon Enzimleri ile Kesilmesi

Uygulanan protokol gereği izole edilen genomik DNA Gereç ve Yöntem

bölümünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi restriksiyon endonükleazları ile

kesilmiştir. Restriksiyon sonrası elde edilen görüntü Şekil 3.21’da verilmektedir.

121

Telomerik fragmanları kapsayan moleküllerin daha kısa fragmanlara dönüştüğü

görülmektedir. BSO almış tavşanlara ait DNA örneklerinin bir kısmında

restriksiyonun tam olmadığı, hala kesilmemiş DNA’nın kaldığı görülmektedir.

Şekil 3.21: Restriksiyon sonrası jel fotoğrafı. (mw: moleküler ağırlık belirteci, B: Balon angiyoplasti yapılan damar, N: Hasar uygulanmamış damar)

122

3.2.4.3. DNA’nın Jelden Membrana Transfer Edilmesi

Restriksiyon sonrası görüntülenen moleküllerin telomerik fragmanlara ait olup

olmadığını saptamak üzere, agaroz jelleri Southern blot tekniği ile nitroselüloz

membranlara transfer edilmişlerdir. Bu amaçla membranlar radyoaktif olmayan bir

işaretleyici olan digoksigenin ile işaretli telomerik oligo ile hibridize edilmiş ve

tabedilmiştir (Şekil 3.22).

Daha önce Bölüm I’de yapılan deney sonuçlarına benzer şekilde genomik

DNA moleküllerinin uygulanan restriksiyon kesimine yanıt verdiği ve telomerik

fragmanları kapsayan moleküllerin genel daha kısa fragmanlara dönüştüğü

görülmektedir. Daha önce transfer sonrası elde edilen görüntülerden farklı olarak üst

bölgelerde de yoğun telomerik işaretlenme görülmektedir. Yine Bölüm I’de yapılan

telomer analizlerinden farklı olarak bu defa telomerik fragmanların görünür hale

gelmesi için filmin daha uzun süre (8 saat) membrana maruz bırakılması gerekmiştir.

Üst bölgelerde edilen yoğun bağlanmanın nonspesifik bağlanma olup

olmadığının belirlenmesi ve bunun doğru olduğu durumda daha kısa telomerik

bölgelere probun daha yüksek yoğunlukta bağlanması ve de böylelikle daha kısa

fragmanları da görünür hale getirebilmek amacıyla membranın kuyucuklara yakın üst

bölgeleri kesilerek hibridizasyon deneyi tekrarlanmıştır. Bu amaçla üst kısımları

kesilen membrandan bağlı substrat, enzim ve prob kompleksinin ayrılması amacıyla

membran önce denatüre edilmiş, daha sonra probla yeniden hibridize edilerek tekrar

filme aktarılmıştır. Elde edilen yeni görüntünde, beklediği gibi daha önceki

görüntüye göre fragmanların daha belirgin hale gelmediği görülmüştür. (Şekil 3.23)

123

Şekil 3.22: Transfer ve hibridizasyon sonrası film görüntüsü (mw: moleküker ağırlık belirteci, B: Balon angiyoplasti yapılan damar, N: Hasar uygulanmamış damar)(Film mebrana 8 saat boyunca maruz bırakılmıştır)

124

Şekil 3.23: 1. membranda hibridizasyonun yoğun olduğu üst bölgeler çıkarıldıktan sonra elde edilen membran fotoğrafı (film membrana 16 saat boyunca maruz bırakılmıştır)

125

Şekil 3.24: 2. denemeye ait restriksiyon sonrası jel görüntüsü (mw: moleküker ağırlık belirteci, B: Balon angiyoplasti yapılan damar, N: Hasar uygulanmamış damar)

2. denemeye ait restriksiyon sonrası jel fotoğrafında da (Şekil 3.24) telomerik

fragmanları kapsayan moleküllerin daha kısa fragmanlara dönüştüğü görülmektedir.

BSO almış tavşanlara ait DNA örneklerinin bir kısmında birinci denemeye benzer

126

şekilde restriksiyonun tam olmadığı, hala kesilmemiş bir kısım DNA’nın kaldığı

görülmektedir. Jel membrana transfer edilip hibridize edildikten sonraki görüntü

1.denemedeki membran görüntüsü ile paralellik göstermektedir (Şekil 3.25).

Şekil 3.25: 2. jelde transfer ve hibridizasyon sonrası membrana ait film görüntüsü (mw: moleküker ağırlık belirteci, B: Balon angiyoplasti yapılan damar, N: Karşı damar) (film membrana 16 saat boyunca maruz bırakılmıştır)

127

3.2.4.4. Telomerik Fragmanların Kantitatif Değerlendirilmesi

Birinci jelin blotlanması sonucu elde edilen Şekil 3.23 ve Şekil 3.24’de verilen

telomerik fragman analizlerinin kantitatif değerlendirilmesi (Bakınız Gereç ve

Yöntem) yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar Tablo 3.9 da verilmektedir. Yapılan

incelemeler bireysel farklılığı ortadan kaldırmak amacıyla hasarlı damara ait OTF

değeri karşı damara ait OTF değeri ile yüzdelediğinde BSO’lu damarların

telomerlerinin diğer gruplara göre anlamlı olarak bir şekilde daha kısa olduğunu

ortaya çıkmaktadır (Tablo 3.9)

Tablo 3.9: Ortalama Telomer Boylarının Yüzdesi

% OTF

Deneysel Grubun Karşı Damara Göre Yüzdesi

Kontrol (n=3) 72.33±1.453

BSO (n=3) 56.67±2.028*

BSO+Taurin (n=3) 66.67±2.603**

Taurin (n=3) 77.00±2.082+, ++

*

BSO vs Kontrol p<0.01, **BSO vs BT p<0.05, +BSO vs T p<0.001, ++BT vs T p<0.05

128

4. TARTIŞMA

Damar düz kas hücre proliferasyonu ve migrasyonuna bağlı olarak meydana

gelen intimal hiperplazinin aterosklerozun ve balon anjiyoplasti sonrası oluşan

restenozun patojenezinden sorumlu olduğu bilinmektedir (28, 29, 48, 92). Vasküler

düz hücre migrasyon ve proliferasyonunu düzenleyen moleküler yolakları

aydınlatmaya ve vasküler düz kas hücre hiperplazisini önlemeye yönelik stratejileri

geliştirmek üzere çok sayıda çalışma yapılmıştır. Bununla birlikte neden olan

mekanizmaların büyük oranda bilinmemesi nedeniyle etkin bir tedavi

geliştirilememiştir (52, 105).

Yakın zamanda yapılan çalışmalarda telomeraz aktivasyonu ve telomer

devamlılığının genetik hipertansiyonda vasküler yeniden modellenmenin

oluşumunun temelinde yatan artan damar düz kas hücre proliferasyonunu

yönlendirdiği ileri sürülmektedir (124, 190). Benzer şekilde, vasküler damar düz kas

hücrelerinde, hücre proliferasyonu sürecinde telomerazın aktive olduğu, buna

karşılık telomeraz aktivitesinin inhibisyonu ile hücre büyümesinin azaldığı da

gösterilmiştir (20). Diğer taraftan yapılan birçok çalışmada vasküler hastalıklarda

hücre yaşlanma sürecinin hastalık patojenezine olan katkısı üzerinde de

durulmaktadır (36, 116, 119).

129

Telomerlerin replikatif olarak kısalmasının hücre yaşlanma sürecini başlattığı

bilinmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar oksidatif stresin bu süreci kısaltarak

“Stres kaynaklı prematüre yaşlanma” (Stress-induced premature senescence= SIPS)

ya neden olduğunu ortaya koymaktadır (15, 36, 62, 181). Ateroskerozda damar

duvarının bütün katmanlarında reaktif oksijen türlerinin (reactive oxygen species=

ROS) varlığı gösterilmiştir. Bütün bu bilgiler ışığında çalışmamızın sonuçları iki

farklı başlık altında tartışılabilir:

Bölüm I: Tavşan Balon Anjiyoplasti Modelinde Telomeraz Aktivitesi ve

Telomer Devamlılığının Lezyon Süresi ile İlişkisi

Morfometri ve İmmünohistokimyasal İncelemeler

Çalışmamızda insan koroner arterine büyük oranda benzerlik gösteren tavşan

ilyak arteri kullanılmıştır. Balon anjiyoplasti sonrası, farklı zaman dilimlerinde (2., 7.

ve 14. gün) hasar gören ve görmeyen (kontrol) ilyak arterlerden alınan seri kesitlerde

gerek Ki-67 gerek PCNA antikorları ile yapılan immünohistokimyasal boyamalarda

hasar gören ilyak arterdeki intimal alanda tüm zaman dilimlerinde proliferasyon

saptanmıştır. Arter duvarı hasarı veya aterosklerozun erken döneminde vasküler düz

kas hücreleri çeşitli mitojenlere yanıt olarak kontraktil bir fenotipten sentetik bir

fenotipe geçerek prolifere olabilirler (153, 163). İnsan Ki-67 proteini

ekspresyonunun hücre proliferasyonu ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir

(162). İnterfaz süresinde nükleus içinde bol miktarda saptanabilen antijen mitoz

sırasında kromozomların yüzeyinde yerleşim gösterir. Ki-67 proteininin G1, S, G2 ve

mitoz gibi hücre siklüsünün tüm aktif fazlarında eksprese edildiği ancak istirahat

130

fazındaki (G0) hücrelerde eksprese edilmediği bilinmektedir (49). Bu özelliği

nedeniyle de protein hücre proliferasyonunun bir belirteci olarak değerlendirilmekte

ayrıca bazı kanser türlerinde de yüksek orandaki ekspresyonu ile kanser prognozu

arasında bir ilişki olduğu bildirilmektedir (186). Çalışmamızda Ki-67 ile ilgili iki

farklı bulgu söz konusudur. Çalışmamızda kullanılan iki anti-Ki-67 klonundan MIB-

1 klonu ile boyanma olmamış, buna karşılık SP6 klonu ile ise boyanma görülmüştür.

Bu farklılık tavşan iliyak arter balon anjiyoplasti modelinin anti-Ki-67 antikorunun

MIB-1 klonuna karşı dirençli olabileceğini düşündürmektedir.

Diğer bir proliferasyon belirteci olan PCNA’in ise geç G1 fazından erken S

fazına kadar eksprese olabilen bir nükleer antijen olduğu bilinmektedir (25, 44).

Aoyagi ve arkardaşları (6) tavşan karotid arteri balon hasarı modelinde tümör

baskılayıcı bir protein olan p53 proteini ile proliferasyona yanıt olarak PCNA’nın

aynı hücrelerde birlikte boyanma gösterdiğini ortaya koymuşlardır . PCNA’nın

Ki-67’ ye göre daha yoğun boyanma göstermesi bu hücrelerin hücre siklusunun G1

fazında kalıp S fazına geçmeyen sessiz (quiescent) hücreler olabileceğini

düşündürmektedir. Bu bulgu özellikle aterosklerotik hastalıklarda ateroskleroz

gelişimine hücre yaşlanma sürecinin katkısı düşünüldüğünde (27, 57, 127, 128) hücre

yaşlanması açısından önemli olabilir.

Çalışmamızda balon anjiyoplasti uygulaması sonrası 14. günde gelişen intimal

kalınlaşmada düz kasa özgül bir protein olan alfa-aktin ekspresyonunun saptanması

uyguladığımız modelde gelişen intimal kalınlaşmada medyadan intimaya göç eden

düz kas hücrelerinin de katkısı olduğunu düşündürmektedir. Yukarıda da belirtildiği

gibi değişik deneysel modellerde gelişen intimal hiperplaziye migrasyon ve

131

proliferasyonun katkısı tam olarak belirlenememiştir (7, 196, 199). Bu durum, ayrıca

hücre proliferasyonunu inhibe ettiği bilinen ve gösterilen bazı ilaçların, değişik

modellerdeki intimal hiperplaziyi engelleyememeleri bulgusu ile de uyum

göstermektedir (28, 196).

Telomeraz enzim biyoaktivitesi

Projemizde tavşanlara ilyak arter balon anjiyoplasti uygulaması sonucu gelişen

vasküler hasarda telomeraz aktivitesinin araştırılmasına yönelik olarak

gerçekleştirdiğimiz deneyler sonucunda hasar gören ve görmeyen ilyak arterlerde

telomeraz biyoaktivitesi saptanmamıştır. Son bulgular normal ve hipoksik koşullarda

insan vasküler düz kas hücrelerinin telomeraz aktivasyonu ve insan telomeraz ters

transkriptaz (human telomerase reverse transcriptase, hTERT) aracılığı ile prolifere

olduğunu göstermiştir (124,125,126). Bu bulgular telomerazın vasküler yeniden

modellenmede bir rolünün olabileceğini düşündürmektedir. Liu ve arkadaşları insan

aterosklerotik epikardiyal koroner arterlerinde yaptıkları çalışmada telomeraz

biyoaktivesi ve telomerazın katalitik birimi olan hTERT protein ekspresyonunun

upregüle olduğunu göstermişlerdir(110).

Çalışmamızın morfometrik ve immunohistokimyasal sonuçları balon

anjiyoplasti uygulanan ilyak arterlerde gelişen intimal kalınlaşmanın düz kas hücre

migrasyonu ve proliferasyonuna bağlı olarak ortaya çıktığını düşündürmektedir.

Bununla birlikte Liu ve arkadaşları yakın bir zamanda yaptıkları araştırmalarında

koroner aterosklerozlu hastaların bazılarında intima ve medyada Ki–67 ile

saptanabilen proliferasyon olmamakla birlikte telomeraz enzim aktivitesi

132

saptamışlardır (111). Ancak bu araştırmacılar koroner hastalığı olan hastaların büyük

çoğunluğunda proliferasyon ve telomeraz biyoaktivitesinin birlikte var olduğunu ve

hTERT immunoreaktivitesinin de geliştiğini göstermişlerdir.

Çalışmamızda uygulanan yöntemin duyarlık sınırları içerisinde tavşanlarda

ilyak artere balon anjiyoplasti uygulamasının telomeraz ekspresyonuna neden

olmadığı belirlenmiştir.

Telomerik Fragmanların Boyu

Hipertansiyon, ateroskleroz ve kalp yetmezliğinin patojenezinde telomer

disfonksiyonun önemli bir faktör olduğu son yıllarda giderek artan bir şekilde çok

çeşitli sayıdaki bilimsel araştırmaların konusunu oluşturmaktadır (127, 129, 160,

167). Benetos ve arkadaşları (15) son yılarda yaptıkları çalışmalarında insanda,

kronik hipertansiyon varlığında beyaz kan hücrelerinde saptanan daha kısa telomer

boylarının artan karotid arter aterosklerozu ile ilişkili olduğunu göstermişlerdir.

Diğer yandan yaşlanmanın önemli bir kardiyovasküler risk olduğu bilinmektedir.

Okuda ve arkadaşları (135) yaş ve ateroskleroz arasındaki ilişkiyi insan abdominal

aortasındaki telomer kısalmasını saptayarak araştırmışlardır. Bu çalışmanın sonuçları

telomer uzunluğunun aterosklerotik derece ile negatif korelasyon gösterdiğini ancak

bu ilişkinin yaş ile anlamlı olmadığını ortaya koymuştur.

Çalışmamızda balon hasarı uygulanan ve uygulanmayan ilyak arterlerde

yapılan denemelerde telomerik fragmanlar kantitatif olarak değerlendirilmiştir. Bu

değerlendirmelerde ortalama telomer uzunluğunun kontrol grubuna göre 2., 7., ve 14.

133

günlerde sırasıyla %64, %85 ve %63 oranında azalma gösterdiği görülmüştür

(Bakınız Bulgular; Tablo 3.3.). Benzer şekilde çalışmamızda farklı örnekler

kullanılarak elde edilen bir diğer analizde de deney grubunun ortalama telomer

uzunluğunun 7. ve 14. günler için sırasıyla %71 ve %77 oranında azalma

görülmüştür. Ancak bu azalmanın uygulamanın günleri açısından farklı olmadığı

anlaşılabilir; bu durum da kullanılan örneklerin farklı bireylere ait olması ile

ilişkilendirilebilir. Genel anlamda radyoaktif işaretli olmayan TRF sonuçlarının

telomer boy uzunluğunu, uygulanan işleme göre azalttığını her iki grup deneyde de

ifade etmek mümkün görünmektedir. Bununla birlikte bu deneylerden elde ettiğimiz

sonuçlar telomer boyundaki azalmayı balon uygulamasından sonraki (örneğin 2., 7.

ve 14. gün boyları gibi) süreler ile ilişkilendirmek açısından yeterli değildir.

Diğer yandan radyoaktif prob kullanılarak yapılan işaretlemenin radyoaktif

olmayan işaretlemeye göre çok daha duyarlı olduğu bilinmektedir. Gereç ve

Yöntem’de açıklandığı gibi radyoaktif olmayan işaretlemede telomerik fragmanı

hibridize edecek proba digoksigenin gibi non-radyoaktif bir işaretleyici bağlanır ve

bu işaretleyicinin substratı ile reaksiyona girmesi sonucu yaydığı ışımanın

(elektrokemiluminesans) röntgen filmini bozundurmasından yararlanılır. Bu yöntem

oldukça dolaylı bir yöntem olduğu için substrat konsantrasyonu, filmin reaksiyona

maruziyet süresi ve ortamdaki ışık gibi pek çok faktöre bağımlıdır. Radyoaktif

işaretlemede ise 32P işaretli prob kullanılır. Bu işaretleme ve izleyen aşamada

görüntünün fosfor görüntüleyici (phosphoimager) ile alınması çok daha etkin bir

yöntemdir.

134

Çalışmamızda radyoaktif işaretli olan ve olmayan prob kullanılarak elde edilen

sonuçları karşılaştırdığımızda duyarlık açısından çok önemli farklılık

gözlenmemektedir. Ortalama telomer uzunluğunun balon anjiyoplasti uygulamasının

2., 7., ve 14. günlerinde %53, %87 ve %74 olarak azaldığı saptanan radyoaktif

işaretli prob kullanılarak gerçekleştirilen deney sonuçları radyoaktif olmayan prob

kullanılarak elde edilen sonuçlarla uyum içindedir (175). Ancak radyoaktif işaretli

prob kullanılarak elde edilen sonuçlarda, telomer boyunun uygulamanın 2. ve 14.

günlerinde farklılık gösterdiği belirlenmektedir. Bununla birlikte genel anlamda

radyoaktif olmayan işaretleme ile gerçekleştirilen denemelerde kullanılan telomer

boyunu saptamaya yönelik kitin optimum koşulları sağladığı düşünülebilir.

Bu kapsamda metodolojik olarak aşağıda özetlenen teknik kavramlar ışığında

balon anjiyoplasti uygulanan ilyak arter örneklerinde telomeraz aktivitesinin

saptanamamasının uygulanan yöntem (ve/veya kullanılan kit) ile ilişkili

olamayabileceği düşünülmektedir. Bu düşüncemizin nedeni Şekil 3.11 de düşük ve

yüksek kopya sayılı internal standartlar kullanıldığında (Şekil 3.11, 2. ve 3.

uygulamalar) PCR işleminin beklenildiği gibi elde edilmesidir. Bütünüyle aynı

işlemlerden geçirilmiş örneklerimizle yapılan bu iki uygulama metodolojiye bağlı

kuşkuları giderecek niteliktedir. Ayrıca TRF deneyleri açısından aşağıda kısaca

özetlenen teknik ayrıntılar ışığında bu deneylerin uygulanan metodoloji ile ilgili bir

sınırlama yaratmayacağını da düşünmekteyiz:

135

i. Telomer uzunluğunun saptanması için DNA izolasyonu yapılan örnekler

Bulgular bölümünde Şekil 3.5.A’da verilmektedir. Bu şekil incelendiğinde belirli bir

miktar DNA’nın kuyucuklarda kaldığı görülmektedir. Bu genomik DNA

preparasyonlarında sıklıkla karşılaşılan bir durumdur. DNA moleküllerinin agaroz

jeli içerisindeki hareketliliği birçok başka faktörlerin yanı sıra moleküler ağırlık ve

jeldeki agaroz yüzdesi tarafından belirlendiği için yüksek molekül ağırlıklı genomik

DNA’nın bir bölümü kullandığımız agaroz jeli içinde ayrıştırılamamıştır. Ancak, bu

çalışmamızda ilgilendiğimiz DNA’nın genomik DNA olması nedeniyle bu görüntü

sonuçların yorumlanabilmesinde herhangi bir sorun oluşturmamıştır.

ii. Genomik DNA izolasyonlarının bilinen bir özelliği olarak bazı örnekler

“smear” olarak adlandırılan sürüntü görünümü göstermişlerdir (Bakınız Bulgular;

Şekil 3.5.A,). Özellikle 3 no.lu uygulamada gözlenen bu görüntünün uyguladığımız

voltajın yanı sıra, bu örneğin diğer örneklerden miktar olarak fazla olmasından

kaynaklandığını düşünmekteyiz. Gerçekten de DNA izolasyonları yapılan örneklerin

jele uygulama öncesi 260 nm’deki absorbansları incelediğinde bu görüntünün

beklenebileceği düşünülebilir. Bununla birlikte Tablo 1’deki örneklerin hepsinin

DNA konsantrasyonları ile jel üzerindeki görüntülerinin örtüşmediği de

gözlenmektedir. Bu durumun 260 nm UV aralığında spektrofotometrik ölçümlerin

DNA dışındaki aromatik yapıları da kapsamasından kaynaklanabileceği

düşünülebilir. Tüm bu teknik parametreler göz önüne alındığında telomerik

restriksiyonel frgmanların uzunluğunu belirlemeye yönelik deneylerimizin başarılı

olduğu görülmektedir.

136

Balon hasarı sonrası gelişen vasküler düz kas hücre proliferasyonunda telomer

devamlılığını aydınlatmayı amaçlayan bu bölümdeki bulgularımız telomer boyundaki

azalmanın balon anjiyoplasti uygulaması ile birlikte geliştiğini göstermektedir. 2. 7.

ve 14. günlerde gözlenen telomer boyundaki farklılık bireysel farklılıklardan

kaynaklanabileceği gibi daha önce genel bilgiler bölümünde ayrıntılı olarak söz

edilen telomerlerde oluşabilecek uç uca füzyon veya “Alternatif Telomer Uzaması”

(Alternative Lengthening of Telomeres=ALT) mekanizmalarından da

kaynaklanabileceği düşünülebilir (82, 136, 146).

Bölüm II: Tavşan Balon Anjiyoplasti Modelinde Telomer Boyu ve Oksidatif

Stres

Reaktif oksijen türlerinin hiperlipidemi, diabetes mellitus, hipertansiyon,

iskemik kalp hastalığı, kronik kalp yetmezliği ile ilişkilendirilen kardiyovasküler

disfonksiyonun ortaya çıkması ve progresyonundaki süreçte yer alan birçok olayda

rol oynadığı son yıllarda birçok çalışma ile ortaya konmuştur (1, 9, 18, 34, 99,182).

çalışmamızın amaçları kapsamında oksidatif stresin balon anjiyoplasti sonrası

vasküler düz kas hücrelerinde telomer devamlılığı üzerine etkisinin araştırılmasına

yönelik olarak balon anjiyoplasti hasarında BSO ile oluşturulan oksidatif stres

modeli uygulanmıştır. BSO ile endojen oksidatif stres oluşturma modeli hayvanlara

uzun süreli BSO verilerek glutatyon depolarının sürekli olarak tüketilmesine

dayanmaktadır (53, 198).

137

Oksidatif Stres Belirteçleri

Gluatatyonun sürekli olarak tüketilmesinin glutatyon tarafından

indirgenemeyen reaktif oksijen türlerinin açığa çıkmasına neden olduğu

bilinmektedir (198).

Çalışmamızda da kullanılan bu modelde 14 gün süre ile uygulanan BSO’nun

(75 mg/kg/gün) 14 gün süresince glutatyon metabolizmasına etkisi araştırılmıştır. Bu

amaçla deneyin başlangıcında (0. gün), ortasında (7. gün) ve son gününde (14. gün)

alınan kanda yapılan ölçümler BSO uygulamasının hem total glutatyonun, hem de

redükte glutatyon/okside glutatyon disülfit (GSH/GSSG) oranını zamana bağlı olarak

azalttığını göstermektedir. Bunun yanı sıra glutatyon peroksidaz enziminin düzeyinin

de azaldığı saptanmıştır. Bu sonuçlar aynı model kullanılarak yapılan önceki

deneylerimiz ile uyumludur (63). Ayrıca çalışmamızın sonuçları ile uyumlu bir

şekilde, söz konusu model kullanılarak yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlar da

BSO’nun karaciğer, böbrek, kalp ve dalak gibi dokularda da GSH düzeyini

azalttığını göstermektedir (53, 109, 198). Diğer yandan önceki çalışmamızda da

bildirdiğimiz gibi (64) BSO uygulaması ile azalan glutatyon düzeylerinin taurin ile

normalize edildiği bulgusu, taurinin antioksidan özelliği ile paralellik göstermektedir

(55, 86).

Morfometrik ve İmmünohistokimyasal İncelemeler

Daha önceki çalışmamız ile benzer şekilde (63) damar örneklerinde yapılan

morfometrik incelemeler BSO uygulanan grupta kontrol gruba göre intimal

138

kalınlaşmanın daha fazla olduğunu göstermektedir. Gerçekten de reaktif oksijen

türlerinin üretiminin hipertansiyon, ateroskleroz ve balon anjiyoplasti sonrası

restenozda vasküler düz kas hücrelerinde hipertrofi ve proliferasyonu ile ilişkili

olduğunu gösteren çalışmalar bulunmaktadır (57, 83, 152). Benzer şekilde konstriktif

vazoaktif bir madde olan anjiyotensin II’nin oluşturduğu hipertansiyona reaktif

oksijen türlerinin aracılık ettiği de gösterilmiştir (1). Bunun yanı sıra çeşitli büyüme

faktörlerinin oluşturduğu proliferasyonda da reaktif oksijen türlerinin rol oynadığı

gösterilmiştir (57,102). Bu kapsamda yukarıda bahsi geçen çalışmalarda olduğu gibi

bizim çalışmamızda da morfometri ve immünohistokimyasal incelemelere yönelik

olarak yapılan araştırmalardan elde edilen bulgular bu alandaki çok sayıdaki literatür

bilgileri ile uyum içindedir .

Telomer Fragmanlarının Boyu

Oksidatif stresin genel anlamda yaşlanma, endotel disfonksiyonu ve

aterosklerozda rolü olduğu son yıllarda yapılan çok sayıdaki çalışmada gösterilmiştir

(119, 143, 194). Bu açıdan, uzun yıllardan beri vasküler sistem ile ilişkili

hastalıkların başlamasının ve ilerlemesinin yaş ile ilişkili olabileceği düşünülmüştür.

Benzer bir yaklaşımla, yaşlanmanın intraselüler reaktif oksijen türleri artışı ile

telomeraz ters transkriptaz aktivitesinin kaybolması ile birlikte geliştiği de

bilinmektedir (76). Bu kapsamda çalışmamızda oksidatif stres, telomer boyu ve

antioksidan tedavi arasındaki olası ilişki tavşan ilyak arteri balon anjiyoplasti

modelinde araştırılmıştır.

139

Alınan damar örneklerinde her gruptaki telomer boylarının kontrol damara

göre yüzdelenmesi (34) ile elde ettiğimiz sonuçlar, BSO uygulamasının telomer

boyunu kısalttığını ortaya koymaktadır (176). Kurz ve arkadaşları tarafından insan

umblikal ven endotel hücre kültüründe (HUVEC) yapılan çalışmada normal durumda

telomer aşınmasının sabit (55 bç/PD) (PD-population doubling[hücre sayısının iki

katına çıkması]) olduğu ancak bu hücreler BSO ile inkübe edildiğinde telomerik

fragmanların aşınma hızının 110 bç/PD’ye yükseldiği gösterilmiştir (103). Diğer

yandan, Von Zglicki ve arkadaşları (192) tarafından insan fibroblastlarında yapılan

bir çalışmada ise oksidatif streste hafif bir artışın (%40) yaşlanma sürecini

hızlandırdığı ve hücre bölünme hızını 3 katına çıkardığı bildirilmiştir. Araştırmacılar

fibroblast hücrelerde ortaya çıkan erken yaşlanmanın telomerlere olan oksidatif

hasardan kaynaklandığını ileri sürmüşlerdir. Aynı çalışma grubundan Richter ve Von

Zglinicki (156) araştırmalarını insan ve koyundan elde edilen fibroblastlarda

sürdürmüşler ve tür farkı gözetmeden oksidatif stres ile telomer kısalma hızı arasında

pozitif bir korelasyon olduğunu bildirmişlerdir.

Diğer taraftan çalışmamızdan elde ettiğimiz diğer bir bulgu BSO alan grupta

daha uzun telomer fragmanlarına da rastlanmasıdır. Yapılan çalışmalarda hem BSO

ile glutatyon depolarının tüketilmesinin hem de oluşan serbest oksijen radikallerinin

DNA hasarına neden olabildiği gösterilmiştir (45, 83, 147). Özellikle guaninden

zengin telomer tekrarlarının reaktif oksijen türlerinin oluşturduğu DNA hasarına

hassas olduğu bilinmektedir. Çalışmamızdan elde ettiğimiz bu sonuç telomere

yönelik olarak kullanılan probun nonspesifik bağlanması olabileceği gibi BSO’nun

DNA hasarı sonucu oluşturabileceği DNA kırıkları da olabilir. Kurz ve arkadaşları,

tarafından HUVEC’te yapılan çalışmada da benzer bulgular rapor edilmektedir

140

(103). Telomerler TRF ile analiz edildiğinde ortalama telomer boyu oksidatif stres

etkisi ile prematüre kısalmaya uğrarken telomer fragmanlarının bifazikleştiği

gözlemlenmiştir. Kurz ve arkadaşları söz konusu çalışmada telomeraz biyoaktivitesi

de bulunamadığı için bu durumun alternatif telomer uzamasından (ALT)

kaynaklanabileceğini ileri sürmüşler ve immünofloresan mikroskobi ile PML

cisimciklerinin varlığını gösterilmişlerdir. Bir diğer çalışma Hensen ve arkadaşları

tarafından bildirilmiştir (82). Bu araştırma grubu ALT yolağında DNA hasar onarım

mekanizmasının devreye girdiğini saptamış ve telomerler de hasara yatkın bölgeler

olduğu için rekombinasyona uğrayarak alternatif telomer uzamasının gerçekleştiğini

ileri sürmüşlerdir. Genel olarak ALT mekanizmasının gerçekleşmesi için PML

cisimciklerinin TRF1 ve TRF2 ile asosiye halde bulunması gerektiği

düşünülmektedir (143). Diğer taraftan telomer tekrar kalıbının tüm omurgalılarda

korunmuş olduğu bilinmekle birlikte tür farklılığı da göz önünde bulundurulmalıdır

(42, 54, 123, 204). Çalışmamızda uzun telomer fragmanlarının varlığı ALT ve/veya

DNA hasar onarım mekanizmalarının rolünün olabileceğini düşündürmekle birlikte

çalışmanın amacı kapsamında bu yönde deneyler tasarlanmamıştır. Buradan

hareketle de uzun telomer fragmanları ve ALT ilişkisinin kullandığımız modelde

araştırılması için ayrıntılı deneylerin yapılmasının gerektiği düşünülmektedir.

Çalışmamızda bir antioksidan olan taurinin BSO uygulaması ile oluşan telomer

kısalmasını normalize ettiği gösterilmiştir. Taurinin çeşitli deney koşullarında, farklı

türlerde bir antioksidan olarak işlev gördüğüne ilişkin çok sayıda araştırma

bulunmaktadır. Bu açıdan bakıldığında taurinin, BSO ile oluşan telomer kısalmasını

normalize ettiği bulgusu ilk kez bu çalışmada gösterilmiştir ve antioksidan

141

mekanizmasının telomer kısalmasını yavaşlatıcı etkisini bir kez daha gündeme

getirmektedir (112).

Sonuç olarak çalışmamızda elde ettiğimiz bulguları kısaca yeniden değerlendirirsek;

i. Histopatoljik bulgularımız tavşan ilyak arterine uygulanan balon

anjiyoplastinin intimal kalınlaşmaya neden olduğunu ve söz konusu kalınlaşmanın

intimaya göç eden ve prolifere olan düz kas hücrelerinden kaynaklandığını

göstermektedir. BSO verilmesi intimal kalınlaşmayı artırmaktadır. Taurin ise bu

intimal kalınlaşmayı geri döndürmektedir.

ii. Ekspresyon çalışmalarımız ilyak artere balon anjiyoplasti uygulaması

sonucu oluşan damar düz kas hücre proliferasyonu ile ilişkili olarak telomeraz

biyoaktivitesi saptanmadığını göstermektedir.

iii. Bulgularımız telomer boyundaki azalmanın balon anjiyoplasti uygulaması

ile birlikte geliştiğini göstermektedir. Ancak azalmanın fizyolojik telomer kısalması

ile ilişkili olabileceği de göz ardı edilmemelidir.

iv. BSO uygulaması ortalama telomer boyunun azalmasına neden olmuştur.

Bir antioksidan olan taurin BSO’nun ortalama telomer boyunda oluşturduğu

azalmayı kısmen geri döndürmüştür.

142

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu sonuçlar kapsamında, ileriye dönük hedefler açısından, balon anjiyoplasti

sonrası endotel ve/veya düz kas hücre kültürü ile elde edilebilecek sonuçların

özellikle yaşlanma süreci de gözönüne alındığında restenoz ve aterosklerotik

hastalıkların oluşum mekanizmalarının aydınlatılmasına büyük katkı sağlayacağını

düşünmekteyiz. Deneysel olarak uygulanan tavşan ilyak arter balon anjiyoplasti

modelinin insanda koroner ater perkütanöz transluminal anjiyoplasi girişimi ile yakın

benzerlik gösterdiği genel olarak kabul edilmektedir. Bu açıdan hareketle,

çalışmamızdan elde edilen sonuçların klinik uygulamaya dönük yaklaşımlara destek

sağlayabileceğini düşünmekteyiz. Diğer yandan sonuçlarımız aterosklerotik

hastalıklarda antioksidan kullanımınn önemini bir kez daha gündeme getirebilir

niteliktedir.

143

ÖZET

Düz kas hücre proliferasyon ve/veya migrasyonuna bağlı olarak gelişen intimal

hiperplazinin ateroskleroz patojenezi ile balon anjiyoplasti sonrası oluşan restenozdan

sorumlu olduğu bilinmektedir. Ökaryotik hücrelerde, kromozomların uçlarında bulunan

telomerler kromozomal bütünlüğünü korumak üzere etkinlik gösterirler. Söz konusu

telomerler kromozomal replikasyon sürecinin sürdürülmesinde ve yine hücresel

yaşlanma sürecinin zamanlanmasında anahtar bir rol oynarlar. Telomer devamlılığı

telomeraz enziminin aktivitesi ile sürdürülür. Yüksek oranda proliferasyon gösteren

hücrelerde telomeraz aktivitesinin arttığı gösterilmiştir. Bunun yanı sıra, damar düz kas

hücrelerinde telomeraz aktivitesinin arttığı ve telomeraz inhibisyonunun ise damar düz

kas hücre büyümesini engellediği de gösterilmiştir.

Bu açıdan bakıldığında, ateroskleroz ve balon anjiyoplasti sonrası gelişen

restenozun patojenezindeki telomeraz aktivitesi ve telomer devamlılığının rolü tam

olarak saptanamamıştır. Diğer taraftan hücrelerdeki telomer boyu yaşlanma süreci

ilişkilendirilmiştir. Oksidatif stresin de yaşlanma sürecine katkısı birçok çalışmada

ortaya konmuştur. Bu çalışmada balon aanjiyoplasti yöntemi ile balon hasarı oluşturulan

tavşan iliyak arterlerde telomer devamlılığının araştırılması ve oksidatif stresin bu

süreçteki etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca olası bir etkinin antioksidanlar ile

modüle olup olmadığı da araştıma kapsamındadır.

144

Bu amaçla çalışmanın ilk bölümünde tavşan ilyak arterine balon anjiyoplasti

uygulanmış ve daha sonra hasar gören ve görmeyen ilyak arterler izole edilerek

telomeraz aktivitesi ve telomer devamlılığı araştırılmıştır. Çalışmanın ikinci bölümüne

ise balon anjiyoplasti uygulanan tavşanlarda BSO ile oksidaitif stres oluşturulmuş ve

telomer devamlılığına etkisi araştırılmıştır. Bunun yanı sıra her iki bölümde de ilyak

arter segmentlerinde intimal hiperplaziyi saptamak üzere morfometrik ve

immünohistokimyasal analizler gerçekleştirilmiştir.

Çalışmamızın sonuçları ilyak artere balon anjiyoplasti uygulamasının, hasar

görmüş arterlerde damar düz kas hücrelerinde proliferasyona neden olarak intimal

hiperplaziye yol açtığını göstermiştir. Ayrıca, hasar gören ilyak arter segmentlerinde

telomeraz aktivitesi saptanmamıştır. Çalışmamızın sonuçları, bunların yanı sıra, hasar

görmüş ilyak arter damar segmentlerinde telomerik restriksiyonel fragmanların

kısaldığına işaret etmektedir. BSO uygulaması ortalama telomer boyunun azalmasına

neden olmuştur. Bir antioksidan olan taurin BSO’nun ortalama telomer boyunda

oluşturduğu azalmayı kısmen geri döndürmüştür.

145

ABSTRACT

It has been reported that intimal hyperplasia, due to smooth muscle cell

proliferation and migration, is responsible for the pathogenesis of atherosclerosis and

restenosis occuring after balloon angioplasty. In eucaryotic cells, the telomer is found at

the end of linear chromosomes and acts to preserve chromosomal integrity. Telomeres

play a key role in mediating the processes of chromosomal replication and in regulating

the timing of cellular aging processes. Telomeres are maintained by the activity of the

enzyme telomerase. Telomerase activity is found to be increased in highly proliferative

cells. Besides, it has been shown that telomerase activity is increased in vascular smooth

muscle cells whereas inhibition of telomerase diminished growth of vascular smooth

muscle cells.

In this context, the role of telomere maintenance and telomerase activity in the

pathogenesis of atherosclerosis and restenosis occuring after balloon angioplasty has not

been fully determined. On the other hand, telomere length is associated with cellular

aging. The contribution of oxidative stress is also stated in many studies. This study

investigates the telomere length regulation of vascular smooth muscle cells after balloon

injury in the balloon angioplasty model and to investigate the effects of oxidative stress

in this phenomenon. The study was extended to investigate the modulation of the

possible effects of oxidative stress by antioxidants.

For this purpose, in the first part of the study, balloon angioplasty was performed in the

iliac artery of the rabbits and thereafter telomerase activity and telomer maintenance

were investigated in the isolated injured and non-injured arteries. In the second part of

the study, oxidative stress was induced by BSO and telomere maintenance was

146

investigated. In addition, morphometric and immunohistochemical analyses were

conducted in order to determine intimal hyperplasia in the arterial segments for both

parts of the study.

Our results demonstrated that balloon angioplasty in iliac arteries resulted in

intimal hyperplasia due to proliferation of the smooth muscle cells. In addition,

telomerase activity has not been detected in injured arteries. Small size telomeric

restrictional fragments were evident in injured arteries. BSO induced even shorter

telomeric fragments. In addition, an antioxidant agent, taurin,partially reversed this

effect.

147

KAYNAKLAR

1. Agarwal R., Campbell R.C., Warnock D.G. (2004). Oxidative Stress in Hypertension and Chronic Kidney Disease: Role of Angiotensin II, Semin. Nephrol., 24(2):101-14

2. Aisner D.L., Wright W.E., Shay J.W. (2002). Telomerase Regulation: Not Just Flipping the Switch, Curr. Opin. Genet. Dev., 12: 80-85

3. Alexander R.W., Dzau V.J. (2000). Vascular Biology: The Past 50 Years, Circulation,102:IV-112-IV-116

4. Altan N., Dinçel A.S., Koca C. (2006). Diabetes Mellitus and Oxidative Stress, Turk. J. Biochem., 31(2): 51-56

5. Anderson M.E. (1998). Gluthathione: An Overview of Bisynthesis and Modulation, Chem-Biol. Interact., 111-112: 1-14

6. Aoyagi M., Yamamoto M., Azuma H., Nagashima G., Niimi Y., Hirakawa K., Yamamoto K. (1997). Expression of p53 Protein and p53 Gene Transcripts in Rabbit Carotid Arteries After Balloon Denudation, Histochem. Cell. Biol., 107: 365-70

7. Arthur Y.F., Yin Z.L., Young H.M., Dusting G.J. (1997). Induction of Nitric Oxide Synthase in the Neointima Induced by a Periarterial Collar in Rabbits, Arterioscler Thromb Vasc Biol,; 17:737-40

8. Assadnia S., Rapp J.P., Nestor A.L., Pringle T., Cerilli G.J., Gunning W.T., Webb T.H., Kligman M., Allison D.C. (1999). Strain Differences in Neointimal Hyperplasia in the Rat, Circ. Res, 84: 1252–7

9. Azevedo L.C., Pedro M.A., Souza L.C., de Souza H.P., Janiszewski M., da Luz P.L., Laurindo F.R. (2000). Oxidative Stress As a Signaling Mechanism of The Vascular Response To Injury: The Redox Hypothesis of Restenosis, Cardiovasc. Res., 47: 436-45

10. Balasubramanyam M., Adaikalakoteswari A., Finny-Monickaraj S., Mohan V. (2007). Telomere Shortening and Metabolic/Vascular Diseases, Indian J. Med. Res., 125: 441-50

11. Baumgartner H.R. (1963). Eine Neue Methode Zur Erzeungung Vor Thromben Durch Gesilete Uberdehnung der Gefasswand, Z. Ges. Exp. Med.,137: 227

12. Bayes-Genis A., Campbell J.H., Carlson P.J., Holes D.R., Schwartz R.S. (2002). Macrophages, Myofibroblasts and Neointimal Hyperplasia After Coronary Artery Injury and Repair, Atherosclerosis, 163: 89-98

148

13. Bayes-Genis A., Kantor, B., Keelan, P.C., Altman, J.D., Lubbe, D.F., Kang, J.H., Schwartz, R.S. (2000). Restenosis and Hyperplasia: Animal Models, Cur.r Interv. Cardiol. Rep., 2(4): 303-8

14. Belair C.D., Yeager, T.R., Lopez, P.M., Reznikofff, C.A. (1997). Telomerase Activity:A Biomarker of Cell Proliferation, not Malignant Transformation, Proc. Natl. Acad. Sci, 94: 13677-82

15. Benetos A., Gardner J.P., Zureik M., Labat C., Xiaobin L., Adamopoulos C., Temmar M., Bean K.E., Thomas F., Aviv A. (2004). Short Telomerase are Associated with Increased Carotid Atherosclerosis in Hypertensive Subjects, Hypertension, 43: 182-5

16. Blackburn E.H. (1990). Telomeres: Structure and Synthesis, J. Biol. Chem., 265(11): 5919-21

17. Blackburn E.H. (1991). Structure and Function of Telomeres, Nature, 350(6319): 569-73

18. Blankenberg S., Rupprecht H.J., Bickel C., Torzewski M., Hafner G., Tiret L., Smieja M.,Cambien F., Meyer J., Lackner K.J. (2003). Gluthathione Peroxidase 1 Activity and Cardiovascular Events in Patients with Coronary Artery Disease, N. Engl. J. Med., 349:1605-13

19. Blasco M.A., Lee H.W., Hande M.P., Samper E., Lansdorp P.M., DePinho R.A., Greider C.W. (1997). Telomere Shortening and Tumor Formation by Mouse Cells Lacking Telomerase RNA, Cell, 91(1): 25-34

20. Bonin L.R., Madden K., Shera K., Ihle J., Matthews C., Aziz S. (1999). Perez-Reyes N., McDougall J.K., Conroy S.C. Generation and Characterization of Human Smooth Muscle Cell Lines Derived From Atherosclerotic Plaque, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 19: 575-87

21. Bouckenooghe T., Remacle C., Reusens B. (2006). Is Taurine a Functional Nutrient?. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 9: 728-33

22. Bradford M.M. (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-dye Binding, Anal. Biochem., 72: 248-54

23. Braun-Dullaeus R.C, Mann M.J., Sedding D.G., Sherwood S.W., von der Leyen H.E., Dzau V.J. (2004). Cell Cycle-Dependent Regulation of Smooth Muscle Cell Activation, Arterioscler. Tromb. Vasc. Biol., 24: 845-50

24. Braun-Dullaeus R.C. (2001). Cell Cycle Protein Expression in Vascular Smooth Muscle Cells in Vitro and in Vivo is Regulated Through Phosphatidylinositol 3-kinase and Mammalian Target of Rapamycin, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 21: 1152-58

149

25. Bravo R., Macdonald-Bravo H. (1987). Existence of two populations of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: Association with DNA Replication Sites, J. Cell Biol., 105: 1549-54

26. Breitschopf K., Zeiher A.M., Dimmeler S. (2001). Pro-atherogenic Factors Induce Telomerase Inactivation in Endothelial Cells Through an Akt-dependent Mechanism, FEBS Lett, 493: 21-25

27. Broilette S., Moore J.S., McMahon A., Thompson J.R., Ford I., Shepherd J., Packard C. J., Samani N.J. (2007). Telomere Length, Risk of Coronary Heart Disease and Statin Treatment in the West of Scotland Primary Prevention Study: A Nested Case-control Study, Lancet, 369: 107-14

28. Bruijins R.H.J., Bult H. (2001). Effects of Local Cytochalasin D Delivery on Smooth Muscle Cell Migration and on Collar-Induced Intimal Hyperplasia in the Rabbit Carotid Artery, Br. J. Pharmacol., 134: 473-83

29. Bult H. (2000). Restenosis: A Challenge for Pharmacology, TIPS, 21: 274-8

30. Burns J.A. Butler J.C.,Moran J., Whitesides G.M. (1991). Selective Reduction of Disulfides by Tris(2-carboxyethyl)phospine, J. Org. Chem., 56: 2648-50

31. Cai H., Harrison D.G. (2000). Endothelial Dysfunction in Cardiovascular Diseases: The Role of Oxidant Stress, Circ. Res., 87: 840-44

32. Calvin H.L., Medvedovsky C., Worgul B.V. (1986). Near-total Glutathione Depletion and Age-specific Cataracts Induced by Buthionine Sulfoximine in Mice, Science, 233: 553-55

33. Cao Y., Li H., Mu F-T., Ebisui O., Funder J.W., Liu J-P. (2002). Telomerase Activation Causes Smooth Muscle Cell Prolifaration in Genetic Hypertension, FASEB J., 16: 96-8

34. Cattan V., Mercier N., Gardner J.P., Regnault V., Labat C., Maki-Jouppila J., Nzietchueng R., Benetos A., Kimura M., Aviv A., Lacolley P. (2008). Chronic Oxidative Stress Induces a Tissue-specific Reduction in Telomere Length in CAST/Ei Mice, Free Radical Biol. Med., doi:10.1016/j.freeradbiomed.2008.01.007

35. Chan A.W., Chew D.P., Lincoff A.M. (2001). Update on Pharmacology For Restenosis, Curr. Int. Cardiovasc. Rep, 3: 149-55

36. Chang E., Harley C.B. (1995). Telomere Length and Replicative Aging in Human Vascular Tissues, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 11190-94

37. Chatziantoniou V.D. (2001). Telomerase: Biological Function and Potential Role in Cancer Management, Pathol. Oncol. Res., 7(3): 161-70

150

38. Cherif H., Reusens B., Dahri S. (1996). Stimulatory Effects of Taurine on Insulin Secretion by Fetal Rat Islets Cultured in vitro, J. Endocrinol., 151: 501-506

39. Christen T., Verin V., Bochaton-Piallat M-L., Popowski Y., Ramaekers F., Debruyne P., Comenzind E., van Eys G., Gabbiani G. (2001). Mechanisms of Neointima Formation and Remodeling in the Porcine Coronary Artery, Circulation, 103: 882-8

40. Cong Y.S., Wright W.E., Shay J.W. (2002). Human Telomerase and Its Regulation, Microbiol. Mol. Biol. R., 66(3):407-25

41. Corseaux D., Le Tourneau T., Six I., Ezekowitz MD., Mc Fedden E.P., Meurice T., Asseman P., Bauters C., Jude B. (1998). Enhanced Monocyte Tissue Factor Response After Experimental Balloon Angioplasty in Hypercholesterolemic Rabbit: Inhibition with Dietary L-Arginine, Circulation, 98: 1776-82

42. De Lange T. (2002). Protection of Mammalian Telomeres, Oncogene, 21(4): 532-40

43. De Meyer G.R., Bult H. (1997). Mechanisms of Neointima Formation--Lessons From Experimental Models, Vasc. Med, 2:179-89

44. Diendorck J.H. van, Wijsman J.H., Keijser R., Velde C.J.H. van de, Cornellise C.J. (1991). Cell cycle-related staining patterns of anti-proliferating cell nuclear antigen monoclonal antibodies. Comparison with BrdU labeling and Ki-67 staining, Am.J. Pathol., 138: 1165-72

45. Duan J., Duan J., Zhang Z., Tong T. (2005). Irreversible Cellular Senescence Induced by Prolonged Exposure to H2O2 involves DNA-damage-and-repair Genes and Telomere Shortening, Int. J. Biochem. Cell. Biol., 37: 1407-1420

46. Durand E., Mallat Z., Addad F., Vilde F., Desnos M., Guérot C., Tedgui A., Lafont A. (2002). Time Course of Apoptosis and Cell Proliferation and Their Relationship to Arterial Remodeling and Restenosis After Angioplasty in an Atherosclerotic Rabbit Model. J Am. Coll. Cardiol., 39:1680-5

47. Dzau V.J., Braun-Dullaeus R.C., Sedding D.G. (2002). Vascular Proliferation and Atherosclerosis: New Perspectives and Therapeutic Strategies, Nat. Med., 8(11): 1249-56

48. Dzau V.J., Gnecchi M.,Pachori A.S., Morello F., Melo L.G. (2005). Therapeutic Potential of Andothelial Progenitor Cells in Cardiovascular Diseases, Hypertension, 46: 7-18

49. Endl E., Gerdes J. (2000). The Ki-67 Protein: Fascinating Froms and Unknown Function, Exper. Cell. Res., 257: 231-7

151

50. Engin A., Altan N. (2000). Effects of Obstructive Jaundice on the Antioxidative Capacity of Human Red Blood Cells, Hematologia, 30(2): 91-96

51. Engin A., Altan N., Isik E. (2005). Erythrocyte Gluthathione Levels in Lithium-induced Hypothyroidism, Drug Dev. Res., 6(1):35-40

52. Ferns G.A.A., Avades T.Y. (2000). The Mechanisms of Coronary Restenosis: Insights from Experimental Models, Cardiovasc. Pathol., 81: 63-88

53. Ford R.J., Graham D.A., Denniss S.G., Quadrilatero J., Rush J.W.E. (2006). Glutathione Depletion in vivo Enhances Contraction and Attenuates Endothelium-dependent Relaxation of Isolated Rat Aorta, Free Radic. Biol. Med., 40:670-78

54. Fradiani P.A., Ascenzioni F., Lavitrano M., Donini P. (2004). Telomeres and Telomerase Activity in Pig Tissues, Biochimie, 86: 7-12

55. Franconi F., Di Leo M.A., Bennardini F., Ghirlanda G. (2004). Is Taurine Beneficial in Reducing Risk Factors for Diabetes Mellitus?, Neurochem. Res., 29(1):143-50

56. Furumoto K., Inoue E., Nagao N., Hiyama E., Miwa N. (1998). Age-dependent Telomere Shortening is Slowed Down by Enrichment of Intracellular Vitamin C via Suppression of Oxidative Stress, Life Sci., 3: 935-48

57. Fuster J.J., Andres V. (2006). Telomere Biology and Cardiovascular Disease, Circ. Res., 99: 1167-80

58. Gabeler E.E., van Hillegersberg R., van Eps R.G.S., Sluiter W. Gussenhoven E.J., Mulder P., van Urk H. (2002). A Comparison of Balloon Injury Models of Endovascular Lesions in Rat, BMC Cardiovasc. Disorders., 2:16-27

59. Gallo R. (1999). Inhibition of Intimal Thickening After Balloon Angioplasty in Porcine Coronary Arteries by Targeting Regulators of the Cell Cycle, Circulation, 99: 2164-70

60. Ganea E., Harding J.J. (2006). Glutathione-Related Enzymes and The Eye, Curr. Eye. Res., 31: 1-11

61. Goldschmidt-Clermont P.J., Creager M.A., Losordo D.W., Lam G.K.W., Wassef M., Dzau V.J. (2005). Atherosclerosis 2005: Recent Discoveries and Novel Hypothesis, Circulation, 112: 3348–53

62. Gorenne I., Kavurma M., Scott M., Scott S., Bennett M. (2006). Vascular Smooth Muscle Cell Senescence in Atherosclerosis, Cardiovasc. Res., 72: 9-17

152

63. Gökçe, G., Özşarlak-Sözer, G., Oran, İ., Oktay, G., Özkal, S., Kerry, Z. Oksidatif stres varlığında balon hasarı oluşturulan tavşanlarda taurinin intimal hiperplazi üzerine etkileri.Türk Farmakoloji Derneği, 19. Ulusal Farmakooji Kongresi, 24-27 Ekim 2007, Trabzon (Poster sunumu).

64. Gökçe, G., Özşarlak-Sözer, G., Oran, İ., Oktay, G., Özkal, S., Kerry, Z. Oksidatif stres varlığında izole tavşan damarlarında endotel kaynaklı gevşeme yanıtlarının taurin ile düzenlenmesi. .Türk Farmakoloji Derneği, 19. Ulusal Farmakooji Kongresi, 24-27 Ekim 2007, Trabzon (Poster sunumu).

65. Greider C.W., Blackburn E.H. (1985). Identification of a Specific Telomere Terminal Tansferase Activity in Tetrahymena Extracts, Cell, 43(2 Pt 1): 405-13

66. Greider C.W., Blackburn E.H. (1989)., A Telomeric Sequence in the RNA of Tetrahymena Telomerase Required for Telomere Repeat Synthesis, Nature, 337(6205):331-37

67. Greider C.W. (1996). Telomere Length Regulation, Annu. Rev. Biochem., 65: 337-65

68. Greider C.W. (1999). Telomerase Activation: One Step on the Road to Cancer?, Trends Genet., 15(3): 109-12

69. Griffith O.W., Meister A. (1978). Differential Inhibition of Glutamine and γ-glutamylcysteine Synthetases by α-alkyl Analogs of Methionine Sulfoximine That Induce Convulsions, J. Biol. Chem., 253: 2333-38

70. Griffith O.W., meister A. (1979). Potent and Specific Inhibition of glutathione Synthesis by Buthionine Sulfoximine (S-n-butyl homocysteine sulfoximine), J. Biol. Chem. 254: 7558-60

71. Griffith O.W. (1980). Determination of Glutathione and Glutathione DisulfideUsing Glutathione Reductase and 2-Vinylpiridine, Analytical Chemistry, 106(1):207-12

72. Griffith O.W., Meister A. (1985). Origin and turnover of Mitochondrial Glutathione, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 4668-72

73. Griffith J.D., Cameau L., Rosenfield L., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. (1999). Mammalian Telomeres End in a Large Duplex Loop, Cell, 97(4): 503-14

74. Gruentzig A.R. (1978). Transluminal Dilation of Coronary Artery Stenosis, Lancet, I: 263

75. Haendeler J., Hoffmann J., Rahman S., Zeiher A.M., Dimmeler S. (2003). Regulation of Telomerase Activity and Anti-apoptotic Function by Protein-protein Interaction and Phosphorylation, FEBS Lett., 536: 180-86

153

76. Haendeler J., Hoffmann J., Diehl J.F., Vasa M., Spyridopoulos, Zeiher A.M., Dimmeler S. (2004). Antioxidants Inhibit Nuclear Export of Telomerase Reverse Transcriptase and Delay Replicative Senescence of Endothelial Cells, Circ. Res., 94: 768-75

77. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W. (1990). Telomeres Shorten During Aging of Human Fibroblasts, Nature, 345: 458-60

78. Harley C.B, Vaziri H., Counter C.M., Allsopp R.C. (1992). The Telomere Hypothesis of Cellular Aging, Exp. Gerontol., 27: 375-82

79. Harrington L. (2003). Biomedical Aspects of Telomerase Function, Cancer Letters, 194: 139–54

80. Hasanoglu E., Altan N., Sindel P., Ongun C.O., Bali M., Altintas E. (1994). The Relationship Between Erythrocyte Superoxide Dismutase Activity and Plasma Levels of Some Trace Elements (Al, Cu, Zn) of Dialysis Patients, General Pharmacology, 25(1): 107-10

81. Hayflick L. (1965). The Limited in vitro Life Time of Human Diploid Cell Strains, Exp. Cell Res., 37: 614-36

82. Henson J.D., Neumann A.A., Yeager T.R., Reddel R.R. (2002). Alternative Lengthening of Telomeres in Mammalian Cells, Oncogene, 21: 598-610

83. Herbert K.E., Mistry Y., Hastings R., Poolman T., Niklason L., Williams B. (2008). Angiotensin II-Mediated Oxidative DNA Damage Accelerates Cellular Senescence in Cultured Human Vascular Smooth Muscle Cells via Telomere-Depent and Independent Pathways, Circ. Res. 102: 201-208

84. Holt S.E., Wright W.E., Shay J.W. (1997). Multiple Pathways for the Regulation of Telomerase Activity, Eur. J. Cancer, 33(5): 761-66

85. Houben J.M.J., Moonen H.J.J., van Schooten F.J., Hageman G.J. (2008) Telomere Length Assesment: Biomarker of Chronic Oxidative Stress?, Free Radical Bio Med, 44:235-46

86. Huxtable R.J. (1992). Physiological Actions of Taurine, Physiol. Rev., 72: 101-163

87. Inoue S., Koyama H., Miyata T., Shigematsu H. (2002). Cell Replication Induces in-Stent Lesion Growth in Rabbit Carotid Artery with Preexisting Intimal Hyperplasia., Atherosclerosis, 162: 345–53

88. Jacobsen J.G., Smith L.H. (1968). Biochemistry and Physiology of Taurine and Taurine Derivatives, Physiol. Rev., 48: 424-511

89. Janero D.R, Ewing J.F. (2000). Nitric Oxide and Postangioplasty Restenosis: Pathological Correlates and Therapeutic Potential, Free Radical Biol & Med, 29(12): 1199–221

154

90. John H.I.P., Fuster V., Badimon L., Badimon J., Taubman M.B., Chesebro J.H. (1990). Syndromes of Accelerated Atherosclerosis: Role of Vascular Injury and Smooth Muscle Cell Proliferation, 15: 1667-87

91. Kadar A., Glasz T. (2001). Development of Atherosclerosis and Plaque Biology, J. Cardiovasc. Surg, 9(2): 109-21

92. Kamenz J., Seibold W., Wohlfrom M., Hanke S., Heise N., Lenz C., Hanke H. (2000). Incidence of Intimal Proliferation and Apoptosis Following Balloon Angioplasty in an Atherosclerotic Rabbit Model, Cardiovasc. Res., 45: 766-76

93. Kannan S., Tahara H., Yokozaki H., Matthew B., Nalinakumari K.R. Nair M.K., Tahara E. (1997). Telomerase Activity in Premalignant and Malignant Lesions of Human Oral Mucosa, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 6(6): 413-20

94. Kashino G., Kodama S., Nakayama Y., Suzuki K., Fukase K., Goto M., Watanabe M. (2003). Relief of Oxidative Stress by Acorbic Acid Delays Cellular Senescence of Normal and Werner Syndrome Fibroblast Cells, Free Radical Biol. Med., 35: 438-43

95. Kawamoto R., Yamashita A., Nishihira K., Furukoji, E., Hatakeyama K., Ishikawa T., Imamura T., Itabe, H., Eto T., Asada Y. (2006). Different Inflammatory Response and Oxidative Stres in Neointimal Hyperplasia After Balloon Angioplasty and Stent Implantation in Cholesterol-fed Rabbits, Pathol. Res. Pract. 202: 447–56

96. Keith, W.N., Bilsland A., Evans T.R.J., and Glasspool R.M. (2002). Telomerase-directed molecular therapeutics, Expert Reviews in Molecular Medicine,; http://www.expertreviews.org/02004507h.htm

97. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. (1994). Specific Association of Human Telomerase Activity with Immortal Cells and Cancer, Science, 266: 2011-5

98. Kiyokawa H. (2005). Senescence and Cell Cycle Control, Results Probl. Cell Differ., 42: 257-70

99. Knopfholz, Précoma D.B., Brofman P.R.S., Bier G.E., Kuenzer C. Da Silva R.F., Silva A.P.K., Lemos A.C., Silva, L Lemos A.C.,de Olivera Silva P., Dompsin de Mores J. (2006). The Effect of L-Arginine on Neointimal Proliferation and Artery Remodeling on an Iliac Artery Lesion Caused by a Balloon Catheter in Hypercholesterolemic Rabbits, Arq. Bras. Cardiol., 87: 472-6

100. Kojima H., Miyazaki H., Shiwa M., Tanaka Y., Moriyama H. (2001). Molecular Biological Diagnosis of Congenital and Acquired Cholesteatoma

155

on the Basis of Differences in Telomere Length, Laryngoscope, 111(5): 867-73

101. Kumral A., Ozer E., Yilmaz O., Akhisarlioglu M., Gokmen N., Duman N., Ulukus C., Genc S., Ozkan H. (2003). Neuroprotective effect of erythropoietin on hypoxic-ischemic injury in neonatal rats, Biol. Neonate, 83(3): 224-8

102. Kurz D.J., Hong Y., Trivier E., Huang H., Decary S., Zang G.H., Lüscher T.F., Erusalimsky J.D. (2003). Fibroblast Growth Factor-2, But Not Vascular Endothelial Growth Factor, Upregulates Telomerase Activity in Human Endothelial Cells, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 23: 748-54

103. Kurz D.J., Decary S., Hong Y., Trivier E., Akhmedov A., Erusalimsky J.D. (2004). Chronic Oxidaitive Stress Compromises Telomere Integrity and Accelerates the Onset of Senescence in Human Endothelial Cells, J. Cell Sci., 117: 2417-26

104. Kyo S., Takakura M., Kohama T., Inoue M. (1997). Telomerase activity in human endometrium, Cancer Res., 57(4): 610-4

105. Lafont A., Faxon D. (1998). Why do Animal Models of Post-Angioplasty Restenosis Sometimes Poorly Predict the Outcome of Clinical Trials? Cardiovasc. Res., 39,50-9

106. Landmesser U., Merten R., Spiekermann S., Buttner K., Drexler H., Hornig B. (2000). Vascular Extracellular Superoxide Dismutase Activity in Patients with Coronary Artery Disease: Relation To Endothelium-dependent Vasodilation, Circulation, 101: 2264-70

107. Lehoux S., Tedgui A. (2003). Cellular Mechanics and Gene Expression in Blood Vessels, J. Biomechanics, 36: 631–43

108. Li J-J, Gao R-L. (2005).Should Atherosclerosis be Considered a Cancer of the Vascular Wall? Med. Hypothesis, 64: 694-8

109. Limon-Pacheco J.H., Hernandez N.A., Fanjul-Moles J.L., Gonsebatt M.E. (2007). Glutathione depletion activates mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway that display organ-specific responses and brain protection in mice, Free Radic. Biol. Med., 43(9): 1335-47

110. Liu J.P. (1999). Studies of the Molecular Mechanisms in the Regulation of Telomerase Activity, FASEB J., 13: 2091-104

111. Liu S-C., Wang S-S., Wu M-Z., Wu D-C., Yu F-J., Chen W-J., Chiang F-T., Yu M-F. (2005). Activation of Telomerase and Expression of Human Telomerase Reverse Transcriptase in Coronary Atherosclerosis, Cardiovasc. Pathol., 14: 232-40

156

112. Lorenz M., Saretzki G., Sitte N., Metzkow S., von Zglinicki T. (2001). BJ Fibroblasts Display High Antioxidant Capacity and Slow Telomere Shortening Independent of hTERT Transfection, Free Radic Biol. Med., 31(6): 824-831

113. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J Biol Chem, 193(1): 265-75

114. Lustig A.J. (1999). Crisis Intervention: The Role of Telomerase, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96: 3339-41

115. Mach F. (2000). Toward New Thrapeutic Strategies Against Neointimal Formation in Restenosis, Arteroscler Thromb Vasc. Biol, 20: 1699-1700

116. Malik N., Francis S.F., Holt C.M., Gunn J., Thomas G.L., Shepherd L., Chamberlain J., Newman C.M.H., Cumberland D.C., Crossman D.C.(1998). Apoptosis and Cell Proliferation After Porcine Coronary Angioplasty, Circulation, 98:1657-65

117. Martensson J., Meister A. (1989). Mitochondrial Damage in Muscle Occurs After Marked Depletion of Gluathione and is Prevented by Giving Glutathione Monoester, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 471-75

118. Martensson J., Jain A., Stole E., Frayer W., Auld P.A.M., Meister A. (1991). Inhibiton of Glutathione Synthesis in the Newborn Rat: A Model For Endogenously Produced Oxidative Stress, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 9360-64

119. Matthews C., Gorenne I., Scott S., Figg N., Kirkpatrick P., Ritchie A., Goddard M., Bennett M. (2006). Vascular Smooth Muscle Cells Undergo Telomere-Based Senescence in Human Atherosclerosis: Effects of Telomerase and Oxidative Stress, Circ. Res., 99:156-64

120. Maturo J., Kulakowski E.C.(1988). Taurine Binding to the Purified Insulin Receptor, Biochem. Pharmacol., 37: 3755-60

121. Mergny J-L., Riou J-F., Mailliet P., Teulade-Fichou M-P.,Gilson E. (2002). Natural and Pharmacological Regulation of Telomerase, Nucl. Acid. Res., 30(4): 839-65

122. Meyerson M. (2000). Role of Telomerase in Normal and Cancer Cells, J. Clin. Oncol., 18 (13): 2626-34

123. Meyne J., Ratliff R.L., Moyzis R.K. (1989). Conservation of the Human Telomere Sequence (TTAGGG)n among Vertebrates, Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A., 86(18):7049-53

124. Minamino, T., Kourembanas S. (2001). Mechanisms of Telomerase Induction During Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation, Circ. Res., 89: 237–43

157

125. Minamino T., Komuro I. (2002). Role of Telomere in Endothelial Dysfuction in Atherosclerosis, Curr. Opin. Lipidol., 13: 537-43

126. Minamino T., Komura I. (2003). The Role of Telomerase Activation in the Regulation of Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation, Drug News Perspec., 16(5): 1-6

127. Minamino T., Komuro I. (2008). Role of Telomeres in Vascular Senescence, Front. Biosci., 13: 2971-79

128. Mognoford J.E., Liu W.R., Reid R., Chiu C., Said H., Chen S., Harley C.B., Mustoe T.A. (2006). Adenoviral Human Telomerase Reverse Transcriptase Dramatically Improves Ischemic Wound Healing Without Detrimental Immune Response in an Aged Rabbit Model, Hum. Gene Ther., 17: 651-60

129. Muller F.L., Lustgarten M.S:, Jang Y., Richardson A., van Remmen H. (2007). Trends in Oxidative Aging Theories, Free Redical Bio Med, 43:477-503

130. Nakamura T.M., Cech T.R. (1998). Reversing Time: Origin of Telomerase, Cell, 92: 587-90

131. Nandhini A.T., Thirunavukkarasu V., Anuradha C.V. (2004). Stimulation of Glucose Utilization and Inhibition of Protein Glycation and AGE Products by Taurine, Acta Physiol. Scand., 181: 297-303

132. Nandhini A.T., Thirunavukkarasu V., Ravichandran M.K. (2005). Effect of Taurine on Biomarkers of Oxidative Stress in Tissues of Fructose-fed Insulin-resitant Rats, Singapore Med. J., 46: 82-87

133. Nandhini A.T., Thirunavukkarasu V., Anuradha C.V. (2005). Taurine Prevents Collagen Abnormalities in High Fructose-fed Rats, Indian J. Med. Res., 122: 171-77

134. Narayanaswamy M., Wright K., Kandarpa K. (2000). Animal Models for Atherosclerosis, Restenosis, and Endovascular Graft Research, J. Vasc. Int. Radiology, 11: 5-17

135. Okuda K., Khan Y., Skurnick J., Kimura M., Aviv H., Aviv A. (2000). Telomere attrition of the Human Abdominal Aorta: relationships with age and atherosclerosis, Atherosclerosis, 152: 391-8

136. Omaska L., McEachern M.J., Nosek J. (2004). Alternatives to Telomerase: Keeping Linear Chromosomes via Telomeric Circles, FEBS Lett, 567: 142-6

137. Onat A. (2001). Risk Factors and Cardiovascular Disease in Turkey, Atherosclerosis, 156(1): 1-10

158

138. Orford J.L., Selwyn A.P., Ganz P., Popma J.J., Rogers C. (2000). The Comparative Pathobiology of Atherosclerosis and Restenosis, Am. J. Cardiol., 86: 6H-11H

139. Oudit G.Y., Trivieri M.G., Khaper N., Husain T., Wilson G.J., Liu P., Sole M.J., Backx P.H. (2004). Taurine Supplementation Reduces Oxidative Stress and Improves Cardiovascular Function in an Iron-overload Murine Model, Circulation, 109: 1877-85.

140. Paglia D.E., Valentine W.N. (1967). Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxide, J. Lab. Clin. Med., 70(1): 158-69.

141. Pakala R., Dilcher C., Baffour R., Hellinga D., Seabron R., Joner M., Kolodgie F., Virmani R., Waksman R. (2006). Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ Ligand Pioglitazone Alters Neointimal Composition in a Balloon-Denuded and Radiated Hypercholesterolemic Rabbit, J. Cardivasc. Pharmacol., 48: 299-305

142. Passos J. F., von Zgilinicki T. (2005). Mitochondria, Telomeres and Cell Senescence, Exp. Gerontol., 40: 466-72

143. Passos J.F., Von Zglinicki T. (2006). Oxygen Free Radicals in Cell Senescence: Are They Signal Transducers?, Free Radical Res., 40 (12): 1277-83

144. Poole J.C, Andrews L.G, Tollefsbol T.O. (2001). Activity, Function and Gene Regulation of the Catalytic Subunit of Telomerase (hTERT), Gene, 269: 1-12

145. Price C.M. (1999) Telomere and telomerase: Broad Effects on Cell Growth, Curr. Opin. Genet. Dev., 9: 218-24

146. Reddel R.R., Bryan T.M., Colgin L.M., Perrem K.T., Yeager T.R. (2001). Alternative Lengthening of Telomerase in Human Cells. Radiation Res., 155: 194-200

147. Reliene R., Schiestl R.H. (2006). Gluthatione Depletion by Buthionine Sulfoximine Induces DNA Deletion in Mice, Carcinogenesis, 27(2):240-4

148. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. (2002). Telomere Architecture, EMBO Rep., 3(12): 1139-45

149. Rhyu M.S. (1995). Telomeres, Telomerase and Immortality, J Natl Cancer Inst, 87(12): 884-94

150. Richter T., von Zglinicki T. (2007). A Continous Correlation Between Oxidative Stress and Telomere Shortening in Fibroblasts, Exp. Gerontol., 42: 1039-42

159

151. Richter T.S.G., Nelson G., Melcher M., Olijslagers S., von Zglinicki T. (2007). TRF2 Overexpression Diminishes Repair of Telomeric Single Strand Breaks and Accelerates Telomere Shortening in Human Fibroblasts, Mech. Aging Dev., 128: 340-45

152. Richter T., Proctor C. (2007). The Role of Intracellular Peroxide Levels On The Development and Maintenance of Telomere-dependent Senescence, Exp. Gerontol., 42(11): 1043-52

153. Ross R. (1993). The Pathogenesis of Atherosclerosis: a Perspective for the 1990s, Nature, 362: 801-9

154. Ross R. (1986). The Pathogenesis of Atherosclerosis--an update, N.Engl. J. Med, 314: 488-500

155. Ross R. (1999).Atherosclerosis-An inflamatory disease, N Engl J Med, 340: 115-26,

156. Ross R., Glomset, J.A. (1976). The Pathogenesis of Atherosclerosis, N Engl J Med, 295(7): 369-77

157. Rowe W.B., Meister A. (1973). Studies on the Inhibition of Glutamine Sythethase by Methionine Sulfone, Biochemistry, 12: 1578-82

158. Rudolph K.L., Chang S., Lee L.W., Blasco M., Gottlieb G.J., Greider C., DePinho R.A. (1999) Longevity, Stress Response, and Cancer in Aging Telomerase-dependent Mice, Cell, 96(5):701-12

159. Saldanha S.N., Andrews L.G., Tollefsboll T.O. (2003). Assessment of Telomer Length and Factors That Contribute to its Stability., Eur. J. Biochem., 270: 389-403

160. Samani N.J., Boultby R., Butler R., Thompson J.R., Goodall A.H. (2001). Telomere Shortening in Atherosclerosis, Lancet, 358: 472-73

161. Sata M. (2003). Circulating Vascular Progenitor Cells Contribute to Vascular Repair, Remodeling, and Lesion Formation, Trends Cardiovasc. Med., 13: 249-53

162. Scholzen T., Gerdes J. (2000). The Ki-67 Protein: From the Known and the Unknown, J. Cell. Physiol, 182: 311-22

163. Schwarz S.M., Campbell G.R., Campbell J.H. (1986). Replication of Smooth Mmuscle Cells in Vacular Disease, Circ. Res., 58: 427-44

164. Schwartz, S.M., deBlois D., O’Brien E.R.M. (1995). The intima. Soil for Atherosclerosis and Restenosis, Circ. Res., 77: 445-65

165. Schuller-Levis G.B., Park E. (2004). Taurine and its Chloramine: Modulators of Immunity, Neurochem. Res., 29: 117-26

160

166. Serafini M., Del Rio D. (2004). Understanding the Association Between Dietary Antioxidants, Redox Status and Disease: Is the Total Antioxidant Capacity the Right Tool?, RedoxRep., 9(3):145-52

167. Serano A.L., Andres V. (2004). Telomerase and Cardiovascular Disease, Circ. Res., 94: 575-84

168. Shay J.W., Gazdar A.F. (1997). Telomerase in the Early Detection of Cancer, J. Clin. Pathol., 50: 106-09

169. Shi Y., Niculescu R., Wang D., Patel S., Davenpeck K.L., Zalewski A. (2001). Increased NAD(P)H Oxidase and Reactive Oxygen Species in Coronary Arteries After Balloon Injury, Arterioscler., Thromb. Vasc. Biol., 22: 21-27

170. Shinohara M., Kawashiwa S., Yamashita T., Takaya T., Toh R., Ishida T., Ueyama T., Inoue N., Hirata K., Yokoyama M. (2005). Xenogenic Smooth Muscle Cell Immunization Reduces Neointimal Formation in Balloon-injured Rabbit Carotid Arteries, Cardiovasc. Res., 68: 249-58

171. Slipcevic P. (2003). Telomeres and the Control of Cell Division, Cell Proliferation and Apoptosis, Eds: David Hughes and Huseyin Mehmet, Scientific Publishers Limited, Oxford, p:123.

172. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. (1985). Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid, Anal Biochem, 150(1): 76-85

173. Sorescu D. Weiss D., Lassegue B., Clempus R.E., Szöcs K., Sorescu G.P., Valppu L., Quinn M.T., Lambeth J.D., Vega J.D., Taylor W.R., Griendling K.K. (2002). Superoxide Production and Expression of Nox Family Proteins in Human Atherosclerosis, Circulation, 105: 1429-35

174. Southern, E.M. (1975). Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments Seperated by Gel Electrophoresis, J. Mol. Biology, 98(3): 503-17

175. Sozer G.O., Kerry Z., Oran I., Gokce G., McEachern J., Topcu Z.(2005) Telomere Length Regulation in the Proliferation of the Vascular Smooth Muscle Cells, FEBS Journal, 272:p129-129 (poster sunumu)

176. Sozer G.O. Gokce G., Oran I., Topcu Z., Kerry Z. Telomere Length Regulation of Vascular Smooth Muscle Cells in a Balloon Injury Model: Effects of Oxidative Stress, 77th EAS Congress, 26-29 Nisan 2008, Istanbul (poster sunumu)

177. Spiekermann S., Landmesser U., Dikalov S., Bredt M., Gamez G., Tatge H., Reepschlager N., Hornig B., Drexler H., Harrison D.G. (2003). Electron Spin Resonance Characterization of Vascular Xanthine and NAD(P)H Oxidase

161

Activity in Patients with Coronary Artery Disease: Relation to Endothelium-dependent Vasodilation, Circulation, 105: 1429-35

178. Strauss B.H., Chisholm R.J., Keeley F.W., Gotlieb A.I., Logan R.A., Armstrong P.W. (1994). Extracellular Matrix Remodeling After Balloon Angioplasty Injury in a Rabbit Model of Restenosis, Circ. Res., 75: 650-8

179. Sturman J.A., (1993)., Taurine in Development, Physiol. Rev., 73: 119-47

180. Suthanthiran M. Anderson M.E., Sharma V.K., Meister A. (1990). Glutathione Regulates Activation-dependent DNA Synthesis in Highly Purified T-lymphocytes Stimulated via CD2 ad CD3 Antigens, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 3343-47

181. Suzuki M., Boothman D.A. (2008). Stress-Induced Premature Senescence (SIPS), J. Radiat. Res., doi:10.1269/jrr.07081

182. Szöcs K., Lassegue B., Sorescu D., Hilenski L.L., Valppu L.L., Couse T.L., Wilcox J.N., Quinn M.T., Lambeth J.D., Griendling K.K. (2002). Upregulation of Nox-based NAD(P)H oxidases in Restenosis After Carotid Injury, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22:21-27

183. Taniyama Y., Griendling K.K. (2003). Reactive Oxygen Species in The Vasculature: Molecular and Cellular Mechanisms, Hypertension, 42: 1075-81

184. Tashiro J., Takahashi K., Yokote K. (1998). Administration of a Small Amount of Lard Enhances Intimal Thickening in the Balloon Catheter Injury Model Without Affecting Serum Lipids, Scan. J. Clin. Lab. Invest., 58: 149-54

185. Tchirkov A., Lansdorp P.M. (2003). Role of Oxidative Stress in Telomere Shortening in Cultured Fibroblasts From Normal Individuals and Patients with Ataxia-Telangiectasia, Hum. Mol. Genet., 12: 227-32

186. Urruticoechea A., Smith I.E., Dowsett M. (2005). Proliferation Marker Ki-67 in Early Breast Cancer, J. Clin. Oncology, 23(28): 7212-720

187. Van Steensel B., Smogorzewska A., de Lange T. (1998). TRF2 Protects Human Telomeres From End-to-end Fusions, Cell, 92(3): 401-13

188. Vasa M., Breitschof K., Zeiher A.M., Dimmeler S. (2000). Nitric Oxide Activates Telomerase and Delays Endothelial Cell Senescence, Circ. Res., 87: 540-42

189. Virchow R. (1989). Cellular Pathology.As Based upon Physiological and Pathological Histology. Lecture XVI-Atheromatous affection of arteries, Nutr. Rev., 47(1): 23-5

190. Vodovotz, Y., Mitchell J. B., Scott Lucia M., McKinney L., Kollum M., Cottin Y., Chan R. C., Barsellos-Hoff M. H., Waksman R. (1999).

162

Modulation of Protein Expression and Activity by Radiation: Relevance to Intracoronary Radiation for the Prevention of Restenosis, Cardiovas. Rad. Med.,1(4): 336-43

191. Von Zglinicki T., Saretzki G., Docke W., Lotze C. (1995). Mild Hyperoxia Shortens Telomeres and Inhibits Proliferation of Fibroblasts: A Model for Senescence?, Exp. Cell Res., 220: 186-93

192. Von Zglinicki T., Pilger R., Sitte N. (2000). Accumulation of Single-Strand Breaks is the Major Cause of Telomere Shortening in Human Fibroblasts, Free Radical Biol. Med., 28: 64-74

193. Von Zglinicki T. (2005). Oxidative Stress Shortens Telomeres, Trends Biochem. Sci., 27(7): 339-44

194. Von Zglinicki T., Martin-Ruiz C.M. (2005). Telomeres as Biomarkers for Ageing and Age-related Diseases, Curr. Mol. Med., 5(2): 197-203

195. Walsh K. (2000). Building a Better Mouse Model, J Mol. Cell Cardiol., 32: 1921–2

196. Walter J.R., Murphy G.J., Bicknell G.R., Sandford R., Margolin S.B., Nicholson ML. (2002). Pirfenidone Inhibits Early Myointimal Proliferation but has No Effect on Late Lesion Size in Rats, Eur J. Endovasc. Surg.,23: 234-40

197. Wassmann S., Wassmann K., Nickening G. (2004). Modulation of Oxidant and Antioxidant Enzyme Expression and Function in Vacular Cells, Hypertension, 44: 381-86

198. Watanabe T., Sagisaka H., Arakawa S., Shibaya Y., Watanabe M., Igarashi I., Tanaka K., Totsuka S., Takasaki W., Manabe S. (2003). A Novel Model of Continuous Depletion of Glutathione in Mice Treated with L-Buthionine (S,R)-Sulfoximine, J. Toxico. Sci., 28(5): 455-69

199. Wentzel J.J., Gijsen F.J.H., Stergiopulos N., Serruys P.W., Slager C.J., Krams R. (2003). Shear Stress, Vascular Remodeling and Neointimal Formation, J. Biomechanics, 35,681–8

200. Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D. (1988). Investigation of the Bicinchoninic Acid Protein Assay: Identification of the Groups Responsible for Color Formation, Anal Biochem, 15,175(1): 231-7

201. Wilcox J.N., Cipolla G.D., Martin F.H., Simonet L., Dunn B., Ross C.E., Scott N.A. (1997). Contribution of Adventitial Myofibroblasts To Vascular Remodeling and Lesion Formation After Experimental Angioplasty in Pig Coronary Arteries, Ann. N. Y. Acad. Sci., 811: 437-47

163

202. Wojtecka-Lukasik E., Czuprynska K., Maslinska D. (2006). Taurine-chloramine Is a Potent Antiinflammatory Substance, Inflamm. Res., 55: S17-S18

203. Wood J.G., Sinclair D.A. (2002). TPE or not TPE? It’s No Longer a Question, Trends Pharmacol. Sci., 23(1): 1-4

204. Xiang H., Wang J., Mao Y., Li D.W: (2000). hTERT Can Function With Rabbit Telomerase RNA: Regulation of Gene Expression and Attenuation of Apoptosis, Biochem. Bioph. Res.Co., 278: 503-10

205. Xu D., Neville R., Finkel T. (2000). Homocysteine Accelerates Endothelial Cell Senescence, FEBS Lett., 470: 20-24

206. Yardim-Akaydin S., Sepici A., Ozkan Y., Torun M., Simsek B., Sepici V. (2004). Oxidation of Uric Acid in Rheumatoid Arthritis: Is Allantoin a Marker of Oxidative Stress?, Free Radical Res., 38(6): 623-28

207. Yardim-Akaydin S., Sepici A., Ozkan Y., Simsek B., Sepici V. (2006). Evaluation of Allontoin Levels As a New Marker of Oxidative Stress in Behcet’s Disease, Scand. J. Rheumatol., 35(1):61-64

208. Yasumoto, S., Kunimura C., Kikuchi K., Tahara H., Ohji H., Yamamoto H., Ide T., Utakoji T., (1996). Telomerase Activity in Normal Human Epithelial Cells, Oncogene, 13(2): 433-9

209. Yucel D., Şeneş M., Topkaya B.C., Zengi O.(2006). Oxidative Stress/Nitrosative Stress in Chronic Heart Failure: A Critical Review, Tur. J. Biochem., 31(2): 86-95

210. Zhang M., Bi L.F., Fang J.H. (2004). Beneficial Effects of Taurine on Serum Lipids in Overweight or Obese Nondiabetic Subjects, Amino Acids, 26: 267-71

211. Zou J., Huang Y., Cao K., Yang G., Yin H., Len J., Hsieh T-chen, Wu J.M. (2000). Effect of Resveratrol on Intimal Hyperplasia After Endothelial Denudation in an Experimental Rabbit Model, Life Sci.,68: 153-63

164

ÖZGEÇMİŞ

1992 yılında Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’ne girdim ve 1997 yılında aynı

fakülteden mezun oldum. 1997’de Ege Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Farmakoloji Yüksek Lisans Programı’na kabul edildim. Aynı yıl Ege Üniversitesi

Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı’na araştırma görevlisi olarak atandım.

2000 yılında “Tavşan İzole Damar Preparatlarında Çeşitli Kastırıcı Ajanların

Yanıtlarının Endotel ile Etkileşiminin İncelenmesi” isimli tezim ile yüksek lisans

tezimi tamamladım.Halen aynı anabilim dalında görevimi sürdürmekteyim.

TAVŞANLARDA BALON HASARI SONRASI DAMAR DÜZ KAS HÜCRELERİNDE TELOMER DEVAMLILIĞI VE OKSİDAN...

Documents

Transcript of TAVŞANLARDA BALON HASARI SONRASI DAMAR DÜZ KAS HÜCRELERİNDE TELOMER DEVAMLILIĞI VE OKSİDAN...