RECUENTO DE Staphylococcus aureus

I. INTRODUCCION

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por

formas cocácicas de 0,8-1,0 μm de diámetro, que se dividen en

más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en

racimos. Son inmóviles y carecen de esporos. Son

grampositivas. Para el recuento de S. aureus se han propuesto

diversos medios específicos, estos medios difieren

principalmente en los agentes selectivos que poseen entre los

que destacan el telurito potásico, cloruro de litio, la azida

sódica, la glicina, polimixina B, etc.

En la actualidad gozan de gran aceptación los medios que

contienen yema de huevo junto a uno o más de los agentes

selectivos antes señalados. En estos medios la mayoría de las

cepas de S. aureus utilizan la lipoproteína de la yema de huevo

conocida como lipovitelina lo que da a lugar a que, en torno

y debajo de las colonias, aparezcan aéreas de aclaramiento.

Otro carácter propio de las reacciones de yema de huevo es la

aparición de un precipitado blanco en las zonas total o

parcialmente aclaradas, que es debida a la formación a sales

de calcio y magnesio de los ácidos grasos liberados. A pesar

de que estas reacciones son características de las colonias

de S. aureus hay cepas de estafilococos coagulasa positiva que

le presentan.

S. aureus es altamente vulnerable a la destrucción por

tratamiento térmico y a los agentes de saneamiento. Sin

embargo la presencia de esta bacteria o de sus toxinas en

alimentos procesados o en equipos para el procesamiento de

alimentos, indica una pobre salubridad. S. aureus puede causar

severos envenenamientos por alimentos. Los alimentos son

examinados para buscar la presencia de S. aureus o de sus

enterotoxinas y así, confirmar que S. aureus es el agente causal

de la enfermedad, para determinar si el alimento es la

fuente potencial del envenenamiento, y para demostrar la

contaminación post-procesamiento, la cual generalmente se

debe al contacto humano o por contaminación del alimento con

superficies contaminadas.

II. OBJETIVOS.

Realizar la técnica de recuento en placa para

Staphylococcus aureus mediante un medio sólido selectivo

(Agar Baird-Parker), presente en una muestra de queso.

III.METODOLOGIA

III.1 Método de Conteo Directo en

Placa

A. Según la FDA

Este método es aplicable para el análisis de alimentos en

la cual se pueden esperar mas de 100 células de S.

aureus /g

Equipos y materiales

Todos los equipos básicos para un conteo en placa.

Un incubador para secar la superficie del agar.

Una barra de cristal doblado estéril, con forma de palo

Hockey, con los extremos pulidos, de 3-4 mm de

diámetro, 15-20 cm de longitud, con una longitud para

extender la muestra de 45-55 mm.

Medios y reactivos

Medio Baird-Parker

Caldo infusión cerebro corazón (BHI)

Aislamiento y enumeración de S . aureus

Para cada dilución a ser plaqueada, transferir

asépticamente 1 ml de muestra suspendida a 3 placas

de agar Baird-Parker, distribuir 1 ml de inóculo

equitativamente a 3 placas (ej, 0.4 ml, 0.3 ml, y

0.3 ml).

Extender el inóculo sobre la superficie del agar, usando

un asa de Drigalsky estéril. Colocar las placas en

posición normal para que el inóculo sea absorbido por el

agar (cerca de 10 min. sobre placas correctamente

secadas.). Si el inoculo no es fácilmente absorbido,

colocar las placas de manera vertical en un incubador por

una hora. Invertir las placas e incubar de 45-48 h a

35°C.

Seleccionar las placas que contengan entre 20-200

colonias, a menos que las placas con menores diluciones

(>200 colonias) tengan colonias con características

típicas de S. aureus.

Conteo de colonias. Si se observan varios tipos de

colonias que se parecen a S. aureus en las placas

seleccionadas, cuente el número de colonias de cada tipo y

lleve las cuentas por separado. Cuando las placas de la

dilución más baja contienen < 20 colonias, éstas, pueden

ser utilizadas. Si las placas que contienen > 200

colonias tienen colonias con el aspecto típico de S. aureus

y las colonias típicas no aparecen en diluciones más

altas, utilice estas placas para la enumeración de S.

aureus, pero no cuente las colonias no típicas. Seleccione

a más de 1 colonia de cada tipo de conteo y

realice la prueba de la coagulasa.

Agregue el número de colonias en las

placas triplicadas representadas por las

colonias que dan la prueba positiva de la

coagulasa y multiplíquese por el factor de dilución de la

muestra. Divulgue este número como el número de S. aureus/g

del alimento.

PRUEBAS CONFIRMATIVAS

i. Prueba de coagulasa

Transferir las colonias sospechosas de S. aureus a

tubos que contengan de 0.2-0.3 ml de caldo BHI y

mezclar. Inocular el agar inclinado de un medio

conveniente para el mantenimiento, ejemplo, TSA, con

una asada de la suspensión de BHI.

Incubar la suspensión del cultivo de BHI de manera

inclinada por 18-24 h a 35°C. Conserve los cultivos

inclinados a temperatura ambiente para las pruebas

auxiliares o en caso de que los resultados de la

prueba de la coagulasa sean cuestionables.

Agregar 0.5 ml del plasma reconstituido de coagulasa con

EDTA (B-4, arriba) al caldo BHI y mezclar. Incubar a 35°C

y examine periódicamente cada 6 h y verificar la formación

del coágulo. La aparición de un coágulo firme y completo

en el lugar de inclinación del tubo, se considera como

reacción positiva para S. aureus. La coagulación parcial,

o resultados 2+ y 3+, se deben de volver a realizar.

Pruebe los cultivos positivos y negativos simultáneamente

con cultivos que se desconozca su reacción. Realizar la

coloración Gram a los tubos positivos y observar al

microscopio.

PRUEBAS AUXILIARES

i. Prueba de la Catalasa. Se realiza a partir del medio TSA

inclinado, sobre láminas o placas, y se ilumina

apropiadamente para observar la producción de las burbujas

del gas.

ii. Utilización anaeróbica de la glucosa. Inocular los tubos

con medio de fermentación de carbohidratos que contiene

glucosa (0,5%). Inocule. Haga que la picadura se

aproxima al fondo del tubo. Cubra la superficie del agar

con capa de aceite de parafina estéril de por lo menos 25

milímetros de grosor. Incube 5 días a 37°C. La producción

de ácido anaeróbico se indica por el cambio a amarillo a

través del tubo, indicando la presencia de S. aureus.

Compruebe con medios de control.

iii. Utilización anaeróbica del manitol. Repetir el paso 2,

usando el manitol como carbohidrato. S. aureus usualmente

es positivo pero algunas cepas son negativas. Verificar

los controles simultáneamente.

iv. Sensibilidad a la Lisostafina. Transfiera la colonia

aislada de la placa de agar a 0,2 ml de un buffer salino,

con un asa y emulsione. Transfiera la mitad de células

suspendidas a otro tubo (13 x 100 milímetros) y mézclese

con 0,1 ml de buffer fosfato salino, y uselo como

control. Agregue 0,1 ml de lisostafina (disuelta en el

buffer fosfato-salino 0,02 M con NaCl al 1%) al tubo

original para la concentración 25 del µg lysostaphin/ml.

Incube ambos tubos en 35°C por no más de 2 h. Si la

turbiedad aclara en esta mezcla, considere la prueba como

positiva. Si esta no se aclara a las 2 h, la prueba es

negativa. S. aureus es generalmente positivo

TABLA1: Caractecaracterísticas típicas de S. aureus, S.

epidermidis y Micrococcus

III.2 Según la ICMSF (Método empleado en el laboratorio)

Preparar el homogenizado y las diluciones de las

muestras del alimento (queso de cabra). Por

duplicado

Añadir el agar Baird Parker a las placas (15

ml),dejar solidificar

Transferir 0.1 ml del homogenizado y sus diluciones

a la superficie del medio contenido en placas

Características S. aureus S.

epidermidis

Micrococus

Actividad de Catalasa + + +

Producción de

coagulasa

+ - -

Producción de

Termonucleasa

+ - -

Sensibilidad a + + -

Utilización anaeróbica de:

Glucosa + + +

Manitol + - -

Extender el inóculo sobre la superficie del agar,

usando un asa de Drigalsky estéril. Colocar las

placas en posición normal para que el inóculo sea

absorbido por el agar (cerca de 10 min. sobre placas

correctamente secadas.).

Incubar las placas en posición invertida a 35 y 37°C

durante 30 y 48 h.

Pasadas las primeras 30 horas de incubación,

seleccionar las placas que contengan entre 20-200

colonias, y contar todas las colonias negras

brillantes de margen estrecho y blanco.

Una vez finalizado el segundo el periodo de

incubación (48 h), y contar todas las colonias con

el aspecto mencionado antes y también cuyo color sea

negro brillantes con o sin margen estrecho y no

presenten área de aclaramiento.

Llevar a cabo la prueba de la coagulasa con un

número significativo de

colonias (no menos de 5).

Conteo de colonias: Sumar el número de colonias que

presentan el número de zonas claras a las 30 horas

de incubación

i. Si se observan varios tipos de colonias que se

parecen a S. aureus en las placas seleccionadas,

cuente el número de colonias de cada tipo y

lleve las cuentas por separado.

ii. Cuando las placas de la dilución más baja

contienen < 20 colonias, éstas, pueden ser

utilizadas. Si las placas que contienen > 200

colonias tienen colonias con el aspecto típico

de S. aureus y las colonias típicas no aparecen

en diluciones más altas, utilice estas placas

para la enumeración de S. aureus, pero no cuente

las colonias no típicas.

iii. Seleccione a más de 1 colonia de cada tipo de

conteo y realice la prueba de la coagulasa.

Agregue el número de colonias en las placas

triplicadas representadas por las colonias que

dan la prueba positiva de la coagulasa y

multiplíquese por el factor de dilución de la

muestra. Divulgue este número como el número de

S. aureus/g del alimento.

Confirmación de colonias:

i. Pasar las colonias positivas a tubos de caldo

infusión cerebro corazón BHI y mezclar. Incubar

a 35°C- 37°C

ii. Pasar 0.1 ml de los cultivos a tubos 10x75 mm

conteniendo 0.3 ml de plasma de conejo e incubar de

35°C- 37°C

iii. Y examine periódicamente cada 6 h y verificar la

formación del coágulo. La aparición de un coágulo firme

y completo en el lugar de inclinación del tubo, se

considera como reacción positiva para S. aureus. La

coagulación parcial, o resultados 2+ y 3+, se deben de

volver a realizar. Pruebe los cultivos positivos y

negativos simultáneamente con cultivos que se desconozca

su reacción. Realizar la coloración Gram a los tubos

positivos y observar al microscopio.

Cuadro 01: Esquema orientativo para puntuar

las reacciones de la prueba de coagulasa.

I. MATERIAL:

A. MATERIAL BIOLÓGICO:

Queso

B. MATERIAL DE LABORATORIO:

Incubadora

Tubos de ensayo

Gradilla

Placas petri

Bombillas

Hisopos de algodón u otro material equivalente,

largo aproximado de 12 cm.

Guantes descartables de primer uso

Protector de cabello.

Mascarillas descartables.

Plumón marcador indeleble (para vidrio).

C. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Agar Baird Parker

Agua de peptonada

TTC

II. METODO:

1. RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVOS

MÉTODO (Siembra directa en placas de agar de Baird-

Parker)

A. MATERIAL Y APARATOS

1. Placas de Petri, de vidrio (100 x 15mm) 6 de

plástico (90 x 15mm).

2. Pipetas bacteriológicas de 1 ml con subdivisiones

de 0.1 ml o inferiores.

3. Baño de agua o estufa de aire para templar y

mantener el medio a 44-46°C.

4. Estufa de incubación, 35-37°C.

5. Cabina de flujo laminar o estufa de desecación

para secar la superficie del medio sólido

contenido en las placas.

6. Varillas de vidrio en forma de bastón de hockey,

pulidas al fuego o alambres doblados, para

disminuir el inóculo, cuyas medidas sean

aproximadamente: 3.5 mm de diámetro y 20 cm de

longitud, dobladas en ángulo recto a 3 cm de un

extremo.

7. Agar de Baird-Parker (Medio 6).

8. Agar de Baird-Parker, modificación de Holbrook

(Medio 7) Este medio puede emplearse en lugar del

señalado en el punto 7.

B. TÉCNICA

1. Preparar las muestras de alimento con la

dilución de los homogeneizados de alimentos.

2. Añadir el agar de Baird-Parker a las placas

(15ml a cada una), dejar solidificar y secar las

superficies en la cabina de flujo laminar o en

la estufa. Cuando se emplea la modificación del

medio de Baird-Parker propuesta por Holbrook hay

que añadir piruvato sódico al medio contenido en

las placas antes de proceder a secar las

superficies.

3. Transferir 0.1 ml del homogeneizado y de sus

diluciones a la superficie del medio contenido

en placas independientes y extender el inóculo

con ayuda de las varillas de vidrio o de los

alambres hasta que sea absorbido por el medio.

Para cada dilución deben prepararse placas por

duplicado.

4. Incubar las placas en posición invertida a 35-

37°C durante 30 y 48 horas.

5. Pasadas las primeras 30 horas de incubación,

elegir las placas que contengan entre 20 y 200

colonias aisladas y contar todas las colonias

negras y brillantes de margen estrecho y blanco

rodeadas de áreas claras que se extienden en el

medio opaco. La probabilidad de que estas

colonias correspondan a S. aureus es muy

elevada.

6. Marcar la posición de estas colonias e incubar

las placas otras 18 horas.

7. Una vez finalizado el segundo periodo de

incubación (48 horas), contar todas las colonias

que presenten el aspecto mencionado y también

aquellas cuyo color sea negro brillante con o

sin margen estrecho blanco y que no presenten el

área de aclaramiento. Llevar a cabo la prueba de

la coagulasa con un número significativo de

colonias sospechosas de corresponder a S. aureus

(no menos de cinco)

8. Con ciertas partidas de yema de huevo, las

colonias de algunas cepas de S. aureus pueden

estar rodeadas de una zona opaca a las 30 horas

de incubación, pero un número mayor de cepas

puede mostrar este aspecto a las 48 horas.

Contar estas colonias a las 48 horas y

someterlas, o a un número adecuado de ellas (no

menos de cinco) si son muchas, a la prueba de la

coagulasa.

C. RESULTADOS ESPERADOS

El aspecto de las colonias típicas de Staphylococcus

aureus sobre agar Baird-Parker es el siguiente:

Redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de

diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde

blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un

halo claro de 2-5 mm.

El cloruro de litio y el telurito potásico que

forman parte del medio inhiben el desarrollo de la

flora competitiva; el piruvato sódico y la

glicocola favorecen el crecimiento de los

estafilococos.

El medio de cultivo es opaco, debido a que se le

incorpora emulsión de yema de huevo. S. aureus

sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la

lipoproteina de la yema de huevo, produce un

aclaramiento alrededor de las colonias.

Alrededor de las colonias se forma también una zona

opaca como consecuencia de la formación de un

precipitado de sales de calcio y magnesio,

insoluble en ácidos grasos.

Esta zona opaca se hace más visible a partir de las

24 horas de incubación.

a. COLONIAS TIPICAS

El aclaramiento del medio que rodea a las colonias

junto con el color negro brillante de las mismas,

son las características típicas más visibles de las

colonias típicas.

b. COLONIAS ATIPICAS

Las colonias que no presentan ese color negro

brillante o que no tienen alrededor un halo claro

de lipolisis son consideradas atípicas y

desechadas.

D. RECUENTO DE COLONIAS SOSPECHOSAS

Para ello la cifra obtenida en las placas se

multiplica por el factor de dilución de la placa,

lo que da como resultado el recuento total de S.

aureus coagulasa positivo en 0,1 gramo del producto

analizado.

Esta cifra, multiplicada por 10, expresa el

recuento total de S. aureus por gramo o mililitro de

muestra.

Cálculos:

En las placas que se ha efectuado el recuento,

multiplicar por el inverso de la dilución y

expresar el resultado como Unidades Formadoras de

Colonias por g de alimento (UFC/g).

Dónde: 

N= Unidades formadoras de colonia por gramo de

muestra (UFC/g o UFC/mL).

C= Media del número de colonias en las dos placas.

D= Factor o inverso de la dilución.

Expresión de los resultados:

Media del número de colonias típicas en las dos

placas x inverso de la dilución x 10 = UFC/g o

UFC/Ml

N = C x D x

CONFIRMACIÓN DE LA PRUEBA DE LA COAGULASA

Se seleccionan, como minino, dos colonias típicas

para su confirmación. Con este fin, se investiga la

capacidad de la cepa en estudio para producir

Coagulasa.

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar

la fibrina del plasma. La mayoría de las cepas de

Staphylococcus aureus patógenas (enterotoxigénicas)

producen esta enzima.

Las colonias típicas seleccionadas se siembran en

caldo infusión cerebro-corazón, BHI

(BrainHeartInfusion) contenido en tubos.

Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.

COAGULASA POSITIVA

La reacción es positiva cuando

el coágulo formado es firme.

COAGULASA NEGATIVA

La reacción es negativa cuando

no se coagula el plasma

III. PROTOCOLO

RECUENTO EN PLACA DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS. ICMSF

2001

IV. RESULTADOS:

MÉTODO RECUENTO DE ESTAFILOCOCOS COAGULASA POSITIVOS

(Siembra directa en placas de agar de Baird-Parker)

(ICMSF, 2000)

A. RECUENTO DE COLONIAS

Dilución 10-1

Dilución 10-2

Dilución 10-3

Tabla N° 01: Recuento colonias sumadas en placa en las

respectivas diluciones.

B. PRUEBA DE COAGULASA :

C. RECUENTO

.

V. BIBLIOGRAFIA:

I.C.M.S.F. 2000. Los microorganismos de los

Alimentos. Vol. 1: Su significado y métodos de

enumeración 2ª Edición. Editorial Acribia, S.A. –

Zaragoza (España).

PASCUAL ANDERSON, M. del Rosario, Calderón

Pascual , Vicente 1999. Microbiología Alimen