Reaccion en cadena

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA [Seleccione la fecha]

INDICEIntroducción……………………………………………………………………………………………………………………2Resumen…………………………………………………………………………………………………………………………3Objetivos………………………………………………………………………………………………………………………..31. ¿En qué consiste? ……………………………………………………………………………………………………42. Conceptos Previos…………………………………………………………………………………………………….4

2.1 Endonucleasas de restricción………………………………………………………………………………42.2 Polimerasas………………………………………………………………………………………………………..52.3 Otras enzimas…………………………………………………………………………………………………….5

3. Un poco de historia………………………………………………………………………………………………….54. Antecedentes…………………………………………………………………………………………………………..65. Fundamento e

Importancia……………………………………………………………………………………..76. ¿Cuál es el método para la reacción de cadena de la

Polimerasa?............................87. Etapas de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa…………………………………………………..98. ¿Qué se requiere para su

realización?.......................................................................128.1 Amortiguadores………………………………………………………………………………………………..138.2 Sales………………………………………………………………………………………………………………….13

9. ¿Cómo se prepara? ………………………………………………………………………………………………..149.1 ¿Qué materiales necesitamos a nivel práctico para preparar la reacción?.........149.2 ¿Cómo se suele trabajar en este caso?................................................................149.3 Ejemplo de la PCR……………………………………………………………………………………………..14

10. Tipos de Reacción en Cadena de la Polimerasa……………………………………………………….1510.1 Anidada…………………………………………………………………………………………………………..1510.2 Extensión

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solapada………………………………………………………………………………………….1610.3 In Situ………………………………………………………………………………………………………………1610.4 Múltiple……………………………………………………………………………………………………………1610.5 Transcriptasa Inversa……………………………………………………………………………………….1610.6 En tiempo real o Cualitativa……………………………………………………………………………..17

11. Aplicaciones……………………………………………………………………………………………………………..18

12. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………….2113. Bibliografía……………………………………………………………………………………………………………….2

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INTRODUCCIÓN

Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción enCadena de la Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de BiologíaMolecular, esta es una ciencia cuyo objetivo fundamental es lacomprensión de todos aquellos procesos celulares que contribuyen aque la información genética se transmita eficientemente de unoseres a otros y se exprese en los nuevos individuos,este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales queexisten entre las especies y "colocar" genes de un organismo otrollamado hospedero, empleando técnicas de ingeniería genética.Gracias a este avance, se pueden producir fragmentosde ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a lasecuenciación de los ácidos nucleicos y por ende a nuevasdisciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o laobtención de organismos superiores recombinantes.

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Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechosque contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo dela biología molecular, por ejemplo:En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes alos principios de segregación y clasificación independiente de losgenes.En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el núcleode las células una sustancia de carácter ácido a la que llamónucleína.En los años veinte el químico alemán Robert Feulgen, utilizandouna tinción específica descubrió que el DNA estaba situado enlos cromosomas.En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el ADN es elportador de la información genética.En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del ADN.Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos queconducirían a lo que se llama tecnología del DNA Recombinante.Hablando específicamente de DNA según el modelo de Watson y Crick,la molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidoscon polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por:1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa)2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina, timina), bases púricas (Adenina, Guanina).3.- Grupos fosfato.Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas muy largas, quedando las bases nitrogenadas en laparte central unidas cada una al carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con su eje.Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas.

RESUMEN

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La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (siglas de su nombreen inglés Polymerase Chain Reaction) permite generar una grancantidad de copias de un fragmento de ADN (ácidodesoxirribonucleico). El requisito fundamental para poder llevara cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de ADN decadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento aamplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que unaenzima polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidoscomplementarios a la cadena molde. Una vez completada la reacciónla cantidad fragmento amplificado se puede visualizar mediantetécnicas sencillas de separación de fragmentos de ADN.

OBJETIVOS

El presente trabajo monográfico tiene como objetivo proporcionar toda la información indispensable para el conocimiento adecuado dela Reacción en Cadena de la Polimerasa:

Brindar conocimientos sobre la historia previa a la cadena y el proceso de su descubrimiento así como las personas involucradas en el hallazgo para así tener una mejor base para el entendimiento de este tema.

Describir el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.

Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo una PCR.

Describir las etapas y los métodos que son necesarios para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa.

Proporcionar la información necesaria sobre los requerimientos que se necesitan para este procedimiento, tomando en cuenta el equipo con el que se realiza.

Detallar las aplicaciones en las que el uso de la reacción encadena de la polimerasa es sumamente necesaria y como puede contribuir está en los diversos procesos en los que se ve involucrada.

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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

1. ¿En qué consiste?

La reacción en cadena de la polimerasa, yamás conocida como PCR, es una técnica deBiología Molecular desarrollada en 1983por Kary Mullis, que permite replicarentre cientos de miles y millones deveces, en el transcurrir de pocas horas ein vitro, pequeñas cantidades de ADN.Uno de los aportes fundamentales de estametodología a la investigación básicaconsiste, precisamente, en la rapidez yeficiencia mediante las cuales se realizauna tarea que antes requería largas ytediosas jornadas. El producto que se obtiene al finalizar lareacción -una gran cantidad de un fragmento génico con altogrado de pureza- favorece la tarea de los investigadoresempeñados en ampliar nuestros conocimientos sobre laestructura y función de los genes. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar ungen a partir de un solo cabello, una célula somática o unespermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hechoposible, la tarea de identificación de personas, por ejemplode hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestrasdel niño y de su abuela materna, virus o bacterias causantesde una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacerinvestigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos

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derivados de la amplificación han hecho que se convierta enuna técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamientodel equipo necesario para llevarla a cabo.

2. Conceptos Previos:

La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro deltérmino genérico de Ingeniería genética yreferidas indistintamente como clonación, ADNrecombinante o manipulación génica han sidola causa de pocas áreas de la biologíamolecular permanezcan inalteradas. Antes deldesarrollo de la ingeniería genética no eraposible aislar un gen concreto eucariótico encantidades suficientes para su estudiomolecular o el de su producto.Una de las sustancias más importantes y de

participación decisiva endistintos procesos de la BiologíaMolecular sonlas enzimas; existen varias quepodemos destacar:

2.1 Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizanlos ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleótidos delinterior de la cadena. Son producidas principalmentepor bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester delesqueleto del DNA de doble hebra en secuencias específicas.Las endonucleasas de restricción de tipo II son las másútiles en los métodos de DNA debido a su especificidad desecuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como parala de ruptura. Estas enzimas se denominan con tres o cuatroletras que corresponden a la primera letra del género y a lasdos o tres primeras letras e la especie del organismo deprocedencia. El número señala el orden cronológico dedescubrimiento de esa enzima en esa generación.

2.2 Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar ADN o ARN"in Vitro". La mayoría de estas enzimas requieren un molde ysintetizan una molécula complementaria al molde. Laspolimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: ADNpolimerasa I de E. Coli, el fragmento de Klenow,

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transcriptasa inversa (utiliza como molde ARN paraconvertirlo en ADN), la ADN polimerasa del bacteriófago T7,RNA polimerasa de los bacteriófagos SP6, T7 y T3 y la Taqpolimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan unpequeño cebador o primer complementario al DNA molde parainiciar la polimerización a partir de ese punto. Latransferasa terminal es una polimerasa que no requiere moldey que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de lascadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2.

2.3 Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberanteso romos), fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5 delos ácidos nucleicos), quinasas (incorporan fosfatos en elextremo 5 que han dejado las fosfatasas).

3. Un poco de historia:

En 1971, un artículo publicado por Kleppe et al. en Journalof Molecular Biology describió por primera vez un método queusaba enzimas para replicar una secuencia pequeña de ADN concebadores in vitro. Sin embargo, este temprano ejemplo delprincipio básico de la PCR no recibió mucha atención, y lainvención de la reacción en cadena de la polimerasa en 1983es generalmente atribuida a Kary Mullis. Mullis ganóel Premio Nobel por su trabajo en PCR.

El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq, eliminó losgrandes inconvenientes del método de la PCR. Este ADNpolimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendoactiva hasta después de la desnaturalización del ADN,eliminando la necesidad de añadir a la reacción nuevapolimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permitióautomatizar el proceso, antes tan tedioso, acoplándolo al usodel termociclador.

Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullistrabajaba en Emeryville, California (EE UU), para una de lasprimeras empresas biotecnológicas, Cetus Corporation, dondeera responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullisconcibió la idea para la PCR una noche mientras cruzaba laAutopista de la Costa Pacífica (EE UU) en su coche. Estabaimaginando una nueva forma de analizar mutaciones en el ADN

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cuando se percató de que, en lugar de eso, había inventado unmétodo para amplificar regiones específicas de ADN medianteciclos de duplicación repetidos usando ADN polimerasas.Mullis atribuye la invención de esta técnica a los efectos dela droga psicodélica y alucinógena LSD

En la revista Scientific American, Mullis resumió elprocedimiento: "Comenzando con una única molécula delmaterial genético ADN, la PCR puede generar 100 billones demoléculas iguales en una tarde. La reacción es fácil dehacer, no requiere más que un tubo de pruebas, unos pocosreactivos simples y una fuente de calor." Fue premiado conel Premio Nobel de Química en 1993 por su invención, y sieteaños después, él y sus colegas del Cetus llevaron a lapráctica su propuesta. Sin embargo, han aparecidocontroversias y diferentes versiones sobre las contribucionesintelectuales y prácticas de otros científicos al trabajo deMullis, y sobre si él fue el inventor único del principio dela PCR.

4. Antecedentes:

Los genes son porciones de ácido desoxirribonucleico (ADN)que tienen la información necesaria para la fabricación delos ácidos ribonucleicos (ARN) y, en última instancia, através de éstos, de las proteínas: el ARN "copia" el mensaje

contenido en el ADN y apartir de él da lugar a lacorrecta formación de lacadena o secuencia deaminoácidos que constituyenlas proteínas.

Todos los genes estáncompuestos por la mismamateria prima: una sucesiónde nucleótidos. Cadanucleótido está formado porun grupo fosfato, un azúcar

con cinco carbonos (la desoxirribosa) y una de las siguientesbases nitrogenadas: adenina, timina, guanina o citosina. Losgenes no se distinguen unos de otros por tener una

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composición fisicoquímica muy diferente, sino por el orden osecuencia en la que estas cuatro bases se disponen a lo largode la molécula de ADN. El hecho de que los genes no sedistingan por su composición fisicoquímica hace prácticamenteimposible aislarlos mediante el empleo de métodos bioquímicosde fraccionamiento del tipo de los usados para purificarproteínas como son, por ejemplo, la cromatografía, laelectroforesis o la ultracentrifugación.

Por otra parte, cada gen es una unidad de información sinsolución de continuidad respecto del resto del ADN en el queestá inmerso. Esto significa que a todo gen lo preceden ysuceden otras secuencias de ADN que, en general, no tienenrelación con él. El gen que codifica para la insulina, porejemplo, tiene una "longitud" de 1.700 bases y su masarepresenta sólo la dos millonésima parte del ADN contenido enel núcleo de una célula humana.

Hasta mediados de la década del ochenta, la única estrategiaposible para aislar un gen y obtener grandes cantidades delmismo en estado puro era el "clonado molecular". Este métodose basa en la introducción de fragmentos de ADN, uno de loscuales contendrá el gen de interés, en vectores. Éstos sonmoléculas de ADN (plásmidos o ADN de bacteriófagos) capacestanto de transportar fragmentos ajenos a su estructuraoriginal como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si seconoce un pequeño tramo de la secuencia de aminoácidos de unaproteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se puedendiseñar métodos para identificar qué bacterias llevan elvector que transporta dicho gen. Este reconocimiento tambiénse puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra laproteína resultante del gen que se desea clonar. En este casose reconoce la bacteria portadora porque fabrica la proteínacodificada por el fragmento de interés, la cual se uneespecíficamente al anticuerpo.

Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar conexactitud su secuencia de bases o analizar en detalle lainformación de la que es portador, sino que también se puedeestudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis dela proteína correspondiente) en distintos organismos y tiposcelulares, introducido en células en cultivo o en animales de

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experimentación, etcétera. Estas técnicas, ya clásicas, hanpermitido el aislamiento y caracterización de decenas demiles de genes de microrganismos, animales y plantas, lo queprovocó un cambio cualitativo en la comprensión delfuncionamiento de la célula.

En 1986, K. Mullis, un investigador de la Corporación Cetus,inventó un método para lograr la multiplicación in vitro defragmentos definidos de ADN sin necesidad de recurrir a losvectores y su replicación en bacterias. Este métodorevolucionaría en corto tiempo el conjunto de técnicas de labiología molecular. Su uso se extendió rápidamente a miles delaboratorios, no sólo de investigación básica, sino tambiénde diagnóstico clínico. Se trata de la reacción en cadena dela polimerasa, ya muy conocida como PCR, siglas provenientesdel inglés Polymerase Chain Reaction.

5. Fundamento e Importancia:

Esta técnica se fundamenta en lapropiedad natural de los ADNpolimerasas para replicar hebrasde ADN, para lo cual se empleanciclos de altas ybajas temperaturas alternadas paraseparar las hebras de ADN reciénformadas entre sí tras cada fasede replicación y, a continuación,dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poderduplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de lapolimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis en la década de1980.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasasse desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura yera necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fasesde desnaturalización del ADN) suponen la inmediatadesnaturalización de toda proteína, se emplean ADNpolimerasas termoestables, extraídas demicroorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas,restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos

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microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermusaquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcusfuriosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermusthermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas depolimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacercorrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante unaparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriarlos tubos de reacción para controlar la temperatura necesariapara cada etapa de la reacción. Muchos termocicladoresmodernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tantocalentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo lacorriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen unapared muy fina, lo que favorece una buena conductividadtérmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibriotérmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema quecalienta la tapa de cierre con el fin de evitarla condensación sobre los tubos de reacción. Lostermocicladores más antiguos carecían de este sistema ysolucionaban el problema de la condensación con una capade aceite en la parte superior de la mezcla de reacción o conun poco de cera dentro de los tubos.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmenteindispensable en laboratorios de investigación médica ybiológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellasse incluyen la clonación de ADN para la secuenciación,la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes,el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificaciónde huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test depaternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedadesinfecciosas.

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6. ¿Cuál es el método para la reacción de cadena de laPolimerasa?

El método se basa en lascaracterísticas de la estructuraquímica del ADN y su replicaciónsemiconservativa. Es decir de acuerdoal modelo de Watson y Crick, el ADN esun polímero formado por dos cadenascomplementarias (cadenas antiparalelas), constituido por unidades dedesoxirribonucleotidos de cuatro basesnitrogenadas adenina, guanina, citosinay timina unidas al azúcardesoxirribosa. La parte que no varía enla molécula del ADN consiste endesoxirribosas unidas por gruposfosfato. Específicamente el hidroxilo3’ del azúcar de undesoxirribonucleotido se une alhidroxilo 5’ del siguiente azúcar através del puente fosfodiester. Para duplicarse el ADN se separa en susdos cadenas complementarias así cada

una de ellas sirve de molde o plantilla. Al final del procesose obtendrán dos moléculas de ADN, cada una de ellas formadapor una cadena original y una cadena complementaria que hasido sintetizado “de novo”. La enzima que realiza esteproceso se denomina ADN polimerasa.Esta enzima añade los nucleótidos en el hidroxilo 3’ terminalde la cadena de DNA paterna. En otras palabras, se requierede una cadena con un grupo 3’ OH disponible, el cual es eliniciador, para formar el enlace fosfodiester 3’-5’. La reacción de alargamiento, catalizada por la ADNpolimerasa, consiste en un ataque nucleofilico del átomo defósforo del desoxirribonucleotido (Dntp) al 3’ OH deliniciador, para formar la unión covalente fosfodiester. El aspecto más importante de la doble hélice de ADN se separafácilmente cuando las uniones de hidrógeno de las bases serompen. Esto se realiza cuando una solución de DNA escalentada entre 77 y 100 °C. Las bases complementarias se re asocian espontáneamente para

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formar la doble hélice cuando la temperatura desciendeEste proceso de re naturalización se denomina alineamiento.La facilidad con la cual la doble hélice puede separarse y reasociarse es crucial para las funciones biológicas del ADN.El método RCP emplea ciclos repetidos de síntesis in vitrodel ADN dirigida por un oligonucleótido iniciador. Lassecuencias de los oligonucleótidos iniciadores se determinanen base a una parte conocida de la secuencia del ADN molde,ya que deben ser complementarias a cada una de las cadenasdel ADN, dejando libres a los lados opuestos para poder seramplificados. Dichos oligonucleótidos sirven como iniciadorespara la síntesis in vitro del ADN, la cual es catalizada porla enzima ADN polimerasa, y ellos también determinan losextremos del fragmento del ADN final que se obtiene.La distancia entre los oligonucleótidos iniciadores esdeterminada empíricamente y depende de muchos factores. La longitud entre los oligonucleótidos iniciadores paraensayos de diagnóstico puede ser entre 50 y 1500 bases denucleótidos.

7. Etapas de la Reacción en Cadena de laPolimerasa:

El proceso de PCR por lo generalconsiste en una serie de 20 a 35cambios repetidos de temperaturallamados ciclos; cada ciclo sueleconsistir en 3-5 pasos a diferentestemperaturas. La PCR común se realizacon ciclos que tienen cinco pasos detemperatura.

Los pasos de ciclos a menudo estánprecedidos por un choque térmico(llamado "hold") a alta temperatura (>90 °C), y seguido por otro hold alfinal del proceso para la extensión de producto final o elbreve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempoaplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de

parámetros. Éstos incluyen la enzimausada para la síntesis de ADN, laconcentración de iones divalentes y de

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los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de loscebadores, así como la longitud del ADN que se deseaamplificar.

Básicamente cada ciclo de RCP consiste de 5 etapas:

a) INICIO, este paso consiste en llevar la reacción hasta unatemperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando unapolimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9minutos. En la primera etapa el ADN molde es incubado a altatemperatura (92-98°C, de 30-90 s), para separar cadenascomplementarias, desnaturalización del ADN y así hacerlasaccesibles al apareamiento con el iniciador específico. Estosólo es necesario para ADN polimerasas que requieranactivación por calor.b) SE DESNATURALIZA EL ADN (se separan las dos cadenas de lascuales está constituido). Este paso puede realizarse dediferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de lamuestra la forma más habitual. La temperatura a la cual sedecide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, dela proporción de G+C que tenga la cadena, como también dellargo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en latécnica de la PCR, serían la adición de sales o agentesquímicos capaces de realizar la desnaturalización. b) LA ETAPA DE ALINEAMIENTO O UNIÓN DEL CEBADOR, en la cualla mezcla dereacción esenfriada parapermitir quelos

oligonucleótidos iniciadores se alineen o hibriden lassecuencias complementarias del ADN blanco.O sea producirá la hibridación del cebador, es decir, elcebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADNmolde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °Cdurante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así elalineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las

cadenas de ADN(unión ADN-ADN)

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sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similara la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido dela cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Loscebadores actuarán como límites de la región dela molécula que va a ser amplificada. c) LA REACCIÓN DE EXTENSIÓN, generalmente llevada a cabo auna temperatura intermedia, en la cual la DNA polimerasacopia el ADN entre las secuencias correspondientes a losoligonucleótidos iniciadores.En otras palabras, actúa la ADN polimerasa, tomando el ADNmolde para sintetizar la cadena complementaria y partiendodel cebador como soporte inicial necesario para la síntesisde nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADNcomplementaria a la hebra molde añadiendo los dNTPcomplementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de lahebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperaturapara este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para lapolimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión dependetanto del ADN polimerasa usada como de la longitud delfragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una reglacomúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa deADN polimerizará mil bases en un minuto.d) ELONGACIÓN FINAL a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se aseguraque cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmenteampliado.e) CONSERVACION, por último se lleva a cabo a 4-15 °C duranteun tiempo indefinido para conservar la reacción a cortoplazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan enel termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADNprevisto, se emplean técnicas de electroforesis, que separanlos fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, estoes, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matrizempleada, a su tamaño: típicamente se empleanla electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes;

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en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápiday aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente,la electroforesis capilar.3 El/los tamaño/s de los productosde la PCR vienen determinados por un marcador de pesomolecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN detamaño conocido, y que se corre en el gel junto con losproductos de PCR

Estas tres etapas de la reacción constituyen un ciclotérmico. Cuando cada ciclo térmico se completa, losfragmentos recientemente sintetizados sirven como ADN blanco,y en unos pocos ciclos más, el producto predominante será unaúnica clase de fragmente de ADN cuya longitud corresponde ala distancia entre los oligonucleótidos iniciadores. Así, larepetición del ciclo origina una acumulación geométrica delas secuencias amplificadas.

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8. ¿Qué se requiere para su realización?

Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de lapolimerasa es obtener muchas copias de un fragmento de ADN,para después poder visualizar este fragmento y utilizarlo enotras aplicaciones si es necesario. Paraalcanzar este resultado, ¿qué esnecesario añadir a la reacción?

El ADN a partir del cual queremosobtener una copia de un fragmento,es decir, el ADN que queremosamplificar. Este DNA se conoce comoADN molde.La concentración de ADN molde en la

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reacción depende de la fuente utilizada, y se requierenidealmente alrededor de 300 nanogramos a 1 microgramo deADN genómico.

Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partirdel DNA molde: una ADN polimerasa. La reacción se llevaa cabo en un tampón apropiado para el funcionamiento dela enzima polimerasa. Además, como cofactores de lapolimerasa se añaden cationes divalentes, generalmenteen forma de cloruro de magnesio (MgCl2).Inicialmente se empleó la ADN polimerasa de Escherichiacoli como enzima polimerizadora, pero debido a suinestabilidad térmica, era necesario agregarla en cada

ciclo, haciendo muy costosa laprueba. Tomando en cuenta losproblemas que se presentaban alusar enzimas que perdían suactividad por las altastemperaturas, se purificó unaenzima termoestable a partir de

bacterias Thermus aquaticus que actualmente se conocencomo Taq ADN polimerasa, con un peso cercano a 93.910 Day su temperatura óptima en la que se observa suactividad máxima es entre 75 a 80 °C y su tasa deincorporación de nucleótidos, Kcat, es de unos 150nucleótidos/segundos/enzima.

Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasasúnicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo3’ libre de una doble cadena de ADN. Son necesarios portanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de ADN decadena sencilla. Estas moléculas son los cebadores oprimers de la reacción. Los cebadores los que van adelimitar el fragmento a amplificar. También se les llama oligonucleótidos sintéticosiniciadores, se deben seleccionar dos que hibriden conregiones del ADN molde y que estén localizados en losextremos de las regiones de interés. Su secuencia debepresentar la mayor similitud posible con la del ADNblanco, ya que de ello depende el éxito y laespecificidad de la amplificación.

Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van acrear una cadena complementaria a la cadena moldemediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’

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libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Losnucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidostrifosfato (dNTPs). Concentraciones entre 20 y 200 μmproporcionan resultados óptimos, debiéndose iguala laconcentración de cada uno de los cuatro dNTPs deconcentraciones equimolares.

8.1Amortiguadores de reacción:Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 aTª ambiente), 50 mM KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2.Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, loscuales ayudarían en la práctica a aumentar laespecificidad y fidelidad de la reacción en cadena de lapolimerasa. El dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al bufferde la reacción en un 10% contribuye a la disminución de laestructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). También sepueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12(0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima.Existen también protocolos que incorporan polietilenglicol(PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina bovina (BSA),etc, aunque no son en ningún caso imprescindibles.

8.2Sales:Es de gran importancia la concentración de dos cationesque son añadidos en forma de sales.Cloruro potásico (KCl). Influye en la desnaturalizacióndel ADN.Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la

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desnaturalización de secuencias cortas de ADN. Bajasconcentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización desecuencias largas de ADN.Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura dehibridación del DNA. La concentración de este ion resultafundamental para la optimización de la reacción.Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidadde la reacción.Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad dela reacción.

9. ¿Cómo se prepara?

Se han detallado previamentelos componentes básicos quees necesario incorporar a lareacción para completar unaPCR. El equipo en el que selleva a cabo la reacción esel termociclador.

9.1 ¿Qué otros materialesnecesitamos a nivel prácticopara preparar la reacción? Pues necesitaremos utilizarmicro tubos, placas de PCR,un juego de micro pipetas ypuntas para las micropipetas, además de hielo

para mantener los reactivos a baja temperatura.Es frecuente que una PCR se prepare para obtener producto deamplificación a partir de más de una muestra, es decir, quese prepare más de una reacción.

9.2 ¿Cómo se suele trabajar en este caso? La forma habitual de trabajar consiste en preparar la mezclade reacción (en cantidad suficiente para todas las muestras)que contenga todos los componentes de la PCR, a excepción delDNA molde. Esta mezcla se distribuye en los microtubos o enla placa de PCR y a continuación se añade a cada reacción elDNA molde.

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9.3 Ejemplo de preparaciónde Reacción en cadena dela Polimerasa:Los volúmenes y

concentraciones son orientativos, siendo valoresfrecuentemente empleados en la práctica.

Supongamos que los reactivos de la PCR se conservan a lasconcentraciones que se indican en la tabla 1. Supongamostambién que la mezcla de reacción debe contener cada uno delos componentes a las concentraciones que se recogen en lamisma tabla. ¿Cómo determinamos el volumen a añadir a lareacción de cada uno de los componentes? Se trata simplementede saber que se debe cumplir la siguiente igualdad: Vinicial X Cinicial= Vfinal X CfinalV representa el volumen y C la concentración. Como ejemplo, si los cebadores se conservan a unaconcentración (concentración inicial) de 10 µM y los queremosa una concentración 0,4µM (concentración final), sabiendo queel volumen total de la reacción de 25 µl (volumen final),podremos aplicar la ecuación 1 para determinar el volumen quees necesario tomar del tubo original (volumen inicial).Trabajando de esta forma se calculan los volúmenes a añadirde cada uno de los componentes.

Tabla 1. Concentraciones de almacenamiento, concentracionesempleadas en la reacción y volumen a añadir de losprincipales componentes de una PCR considerando un volumentotal de 25 µl.

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Hasta completar el volumen final de 25 µl falta considerar lacantidad de ADN a añadir. Entre 40 y 100 ng de DNA (cuando setrata de ADN total de planta) son valores habituales. Esfrecuente preparar el DNA de forma que se incorpore todo elADN necesario añadiendo 1 µl a la reacción. El resto hasta elvolumen total se completaría con agua destilada. En cualquier caso, como se ha dicho previamente, se preparaen primer lugar la mezcla, sin el ADN, en cantidad suficientepara todas las muestras a incluir en el análisis. Por tanto,se multiplicarían los valores obtenidos en la tabla 1 paracada componente (además del agua destilada) por el númerototal de muestras a analizar (incluyendo el control negativo,ver cuadro 2). Una vez preparada esta mezcla, se distribuyeen microtubos o en placa de PCR: si de ADN se va a añadir 1µl por reacción, se distribuirán 24 µl de mezcla porreacción. A continuación se añade el DNA a cada muestra, y elmismo volumen de agua en el control negativo. Los componentesy la mezcla de reacción se mantendrán en hielo durante elproceso, con el fin de evitar su degradación.

10. Tipos de Reacción en Cadena de la Polimerasa:

10.1 PCR anida: Técnica muy sensible de PCR en laque el producto de unaamplificación es utilizado comomolde para realizar una segundaamplificación con cebadores quese ubican dentro de la primerasecuencia amplificada, es decir,cuando tenemos el primer amplicónse pueden unir los cebadores y se

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hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial.Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar altasensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porquecomo es amplificación de un amplicón obtenido previamente,los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de lamolécula y el resultado será una única banda. Así, evitamosposibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores.La desventaja de ésta técnica es que no nos permitecuantificar la muestra.

10.2 PCR de extensión solapada(Mutagenesis):Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos(clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers)mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y unfragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Seusan los productos en otra reacción para producir el ADNmutado de longitud completa.

10.3 PCR in situ:La PCR in situ consiste en una reacción de PCR ensecciones histológicas o células, donde los productosgenerados pueden visualizarse en el sitio de amplificación.Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. Enla técnica de PCR in situ se realiza una primeraamplificación de ADN blanco y luego detecciónmediante hibridación in situ convencional con sondas deADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidadespequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance enla capacidad de amplificar específicamente una población desecuencias de menor representación.

10.4 PCR múltiple:

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PCR en la cual seamplifica simultáneamentemás de una secuencia.Para ello, se combinandos o más pares decebadores en un mismotubo, junto con el restode los reactivos dela reacción en cantidadessuficientes, paraamplificarsimultáneamente variossegmentos de

ADN. Ventajas: información sobre varios locus en una solareacción, menor cantidad de molde para el análisis, menorcantidad de reactivos, rápida construcción de bases dedatos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sinerrores, se requiere de una cuidadosa optimización delproceso.

10.5 PCR con transcriptasa inversa(RT-PCR)Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como moldeinicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasainversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADNcomplementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrolloinicial de una RT-PCR sería:1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.3er paso: PCR estándar.

10.6 PCR en tiempo real o cuantitativa: Reacción de PCR cuya principal característica es que permitecuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestraoriginal, o para identificar con una muy alta probabilidad,muestras de ADN específicas a partir de su temperatura defusión (también denominado valor Tm, del inglés meltingtemperature).

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos noespecíficos y en las técnicas basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve

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multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une alfluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendofluorescencia que es medida por el termociclador apto paraPCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuenciapor reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadoresnormales para su realización. Es mucho más económica que laque usa sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizanuna sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zonaintermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso(reverse); cuando la sonda está intacta, presenta unatransferencia energética de fluorescencia por resonancia(FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañaday los dos fluorocromos están distantes, producto de laactividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Estopermite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia ydeducir el nivel de amplificación del gen.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con laintroducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), queelimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza laprogresión de la amplificación en el momento en que ocurre. Adiferencia de la PCR convencional (en punto final), que midela acumulación del ADN al final de un número predeterminadode ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso deamplificación usando fluorescencia, de forma que su aumentoes proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso sepuede automatizar fácilmente usando un sistema que realice laamplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz deleer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos enel mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversasopciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir,permiten programar las condiciones de amplificación y lecturade forma que su uso no queda limitado a unos reactivosdeterminados.

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11. Aplicaciones de la PCR:

Clonación: en el campo de la biología molecular el PCR seutiliza para la clonación molecular de genes y susecuenciación nucleotida. El PRC favorece la clonación si seincorporan regiones de restricción (sitios específicos dondelas enzimas endonucleasas de restricción, cortanespecíficamente el ADN) en los extremos 5’. Cuando se utilizalos oligonucleótidos, de tal manera que es posible clonar losfragmentos que se amplifiquen al aprovechar estos sitios derestricción del vector.

Análisis y cuantificación de la expresión genética basado enel estudio de la cantidad de ARN mensajero ( ARN m) en estoscasos se requiere de la síntesis de ADN copia (ADN c) apartir del ARN muestra por medio de la enzima transcriptasareversa( enzima replicasa viral que sintetiza ADN a partirdel ARN m. Este ADN c se utiliza como molde para amplificarlas secuencias de interés al utilizar los oligonucleótidosadecuados.

Diagnóstico clínico, en este campo de PCR se usa en lagenética médica para el diagnóstico de enfermedadeshereditarias y de algunas cromosomopatías comunes; en elcampo de la inmunología se emplea para determinarasociaciones en el complejo mayor de histocompatibilidad y lapredisposición genética para el desarrollo de enfermedadesautoinmunes; en el campo de la oncología para probar

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mutaciones activadoras de oncogenes, para detectar arregloscromosomáticos, presentes en procesos neoplásicos y para ladetección de un virus y de las consecuencias oncogénicas.

Entre las enfermedades genéticas en la que la técnica del PRCse ha empleado con éxito, y como apoyo al diagnóstico debemosmencionar: fenilcetonuria, debida a mutaciones autosomaticasrecesivas del gen de la fenilalanina hidrolasa, la fibrosisquitica que se presenta como resultado de las mutaciones queafectan la función de un canal de cloro; y la distrofiamuscular que resulta de mutaciones en el gen de la distrofinaque se hereda como un rasgo ligado al cromosoma X.

Detección de mutaciones, la técnica de PCR nos permitelocalizar mutaciones previamente descritas. Se emplea así enla secuenciación de ADN como un método de diagnóstico: Unavez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad deuna determinada mutación puntual (mutaciones en el gen de lagalactosa 1P uridiltransferasa en la galactosemia, mutacionesen c-Ras y cáncer, etc.) o de una pequeña deleción (deleciónde tres bases en el gen CFTR de fibrosis quística ) puededesarrollarse un método de detección rutinario , lasecuenciación automática puede implementarse como método descreening para la localización de nuevas mutaciones.

En la microbiología, la PCR, se ha utilizado en eldiagnóstico rápido y preciso de las infecciones producidaspor bacterias, hongos, virus, particularmente de esosmicroorganismos difíciles de detectar por análisismicrobiológico directo y cultivo. Por ejemplo en el caso deMycrobacteria, que consistía en un grupo de bacilos acido-resistentes los cuales incluyen a patógenos humanos yanimales existen 3 conocidas Mycobacterium tuberculosis, Mbovis y M leprae. Sin embargo en las últimas décadas, sedescubrieron un número importante de otras especies patógenasoportunistas (M avium, M intracellulare, M kansaii, y M

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simiae) las cuales pueden causar enfermedad severa cuando lasdefensas celulares normales están deprimidas temporalmente.El ejemplo más sorprendente, es probablemente la prevalenciade la infección diseminada por M avium en pacientes con SIDA.El establecimiento del diagnóstico definitivo de infecciónpor micobacterias radica en el aislamiento, cultivo eidentificación del microorganismo. Debido a su largo periodode generación las técnicas de cultivo requieren de tres aocho semanas. El diseño y empleo del método de amplificación del ADNribosomal ADNr( secuencias del ADN que codifican para el ARNribosomal de la subunidad 30S) por la técnica de PRCproporciona una identificación exacta del microorganismo porel hecho que este ADN está muy conservado en las diferentesespecies y es especifico del microorganismo a nivel especie.

Así la identificación puede ser obtenida en dos días. Actualmente se han diseñado marcadores o detectores quepermiten la identificación de los parásitos, Plasmodium sp,responsable del paludismo, Leishmania sp, responsable de laenfermedad de Chagas y Tripanosoma sp responsable de latripanosomiasis.

También se ha empleado la técnica de PCR para detectaraquellos microorganismos, que son resistentes a losantibióticos, y por ende los genes responsables, de esaresistencia. Ello se ha podido realizar en pus y en otroslíquidos corporales, sin que sea necesario aislar ycaracterizar al microorganismo. Esta práctica puede ser degran utilidad en el manejo adecuado de antibióticos a nivelhospitalario.

Uno de los campos principales de aplicación del PCR en ladetención de agentes patógenos, es el desarrollo de métodosrápidos y sensibles para detectar el virus del VIH que causael SIDA. Gracias a que se conoce la secuencia del genoma del

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VIH se utilizan partes de oligonucleótidos para amplificarlos fragmentos conservados de regiones env y gag de estevirus y que se localizan en los linfocitos humanos. Otrocampo de aplicación para el PCR es la detección del papiloma-virus del humano HPV el cual se asocia con ciertos tipos decáncer cérvico-uterino.

La amplificación PCR también se permite la detección de ADNde poco menos de 100 células por 100 gramos de muestra y esusado en la ingeniería genética de microorganismos y elmonitoreo de poblaciones indicadoras y patógenas en suelo,agua y sedimentos. El producto de la PCR puede sercuantificado, permitiendo la estimación de microorganismos yARNm especifico en muestras del medio ambiente. Otro uso esde medición de la expresión genética de los microorganismosviables. La PCR es usada para clonar genes permitiendo lasecuencialización de los mismos aun de aquellosmicroorganismos ambientales importantes que todavía no hanpodido ser cultivados.

Una de las características de la evolución es la capacidaddel cambio de especies, las que aún están cercanasfilogenéticamente pueden tener una variabilidad genéticaenorme. La PCR contribuye al conocimiento de la variabilidadde los grupos de organismos, ya que al diseñaroligonucleótidos adecuados, esta será evidente en el análisisdel resultado de amplificación. Es posible detectardiferencias tan solo en una posición y en la secuencia de ADNdonde haya ocurrido una sustitución de bases.

En el proceso de evolución, el PCR, se ha aplicado a estudiosde secuencias conservadas del ADN, acelerando la construcciónde árboles filogenéticos y se ha convertido en el instrumentomás accesible para el análisis de especies en vía deextinción. La arqueología también ha encontrado unaherramienta poderosa en el análisis genético de las muestras

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biológicas antiguas, como por ejemplo las provenientes de lasmomias y fósiles en donde se lograron amplificar algunosfragmentos de secuencias del ADN mitocondrial. En estesentido a resultado de mucho interés la amplificación del ADNa partir de muestras de tejido de un mamut siberiano cuyapreservación fue la congelación.

Secuenciación de ADNs fósiles: El uso del PCR ha abierto laposibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unaspocas copias intactas presentes en especímenes de museo ydescubrimientos arqueológicos en los cuales la mayoría de lasmoléculas están dañadas o degradadas, para procederposteriormente a su estudio mediante secuenciación.

Identificación de especies y Control de cruzasentre animales: Las técnicas para identificar especies puedenser muy importantes para descubrir fraudes comerciales, talescomo vender carne de una especie más barata a los precios deotra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro.Estos estudios pueden realizarse utilizando el ADNmitocondrial, el cual presenta secuenciasaltamente variables entre especies distintas, aunque seancercanas entre sí, y bastante conservadas dentro de la mismaespecie.Los controles de relaciones Familiares entre animales tienenimportancia forense para el control de comercio ilegal deespecies protegidas. Individuos jóvenes de especies enpeligro son sacados de sus lugares de nacimiento ydisfrazados por certificados veterinarios falsos. En estoscasos el estudio familiar es el único medio de descubrir elorigen ilegal de los individuos.

Uno de los campos más ampliamente estudiados en los últimosaños es el que concierne en el proyecto genoma humano, en elcual se ha recurrido al método PCR para identificar nuevosgenes, secuencias y mutaciones.

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Una de las áreas que más se ha visto enriquecida con laimplementación de la PCR, es la medicina legal dondeactualmente se realiza un análisis veraz de la prueba depaternidad y de la identificación de individuos a través dela tipificación de regiones cromosomaticas con secuencias deADN altamente variables o polimórficas. El principio de estaaplicación se basa en la variabilidad genética que existeentre los individuos, además de la gran sensibilidad delmétodo ya que por medio de él, se amplifican fragmentos decantidades pequeñas de ADN que se obtiene de los restos deltejido epitelial, sangre seca, cabellos o semen. Comparandolos patrones se obtiene específicamente de cada individuo, sepuede determinar a quién pertenece nuestra muestra de ADN

12. Conclusiones La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una

técnica fundamental para la mayor parte de lasaplicaciones de la biología molecular. Se ha presentadola base teórica y práctica de la PCR.

Existen muchas variantes de la PCR convencional, comoson la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (quepermite cuantificar la cantidad de producto amplificado)o la PCR por transcripción inversa (mediante la cual seobtiene una copia de DNA complementario, DNAc,utilizando como molde ácido ribonucleico, ARN). Existegran cantidad de información referida tanto a la PCRconvencional como a sus variantes

La PCR no es sólo lo una técnica exquisitamenteespecífica, sino también muy sensible, pues en principiopara practicarla bastaría una sola molécula, porejemplo, del genoma humano, aunque habitualmente seemplean cantidades excesivas de este (en el orden dehasta microgramos).

la técnica es tan robusta que puede usar como substratopara la reacción al ADN, sin tener que purificarlo de su

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fuente natural, y es común emplear productos biológicosdiversos como tejidos embebidos en parafina, semenrecuperado de escenas de violación, lavados bronquiales,exudados de mucosas, raíces de cabellos o cejas, sangre,extendidos citológicos, etc.

Muchas veces basta una simple ebullición de la muestrapara lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN,dejándolo listo para la reacción.

Teóricamente entre más ciclos de reacción integren elprograma de amplificación, más productos idénticos segeneraron. Pero al aumentar los ciclos también seaumenta proporcionalmente la posibilidad de agregarerrores en las nuevas secuencias.

La PCR ha podido sustituir a muchas técnicas dando mayorespecificidad y sensibilidad. Pero precisamente esto˙último es su principal problema. Su gran sensibilidadse ha vuelto en su contra, pues, por pequeña que sea lamenor contaminación de la muestra inicial, puede tenerserias consecuencias. Si el ADN de partida se contamina,se amplificaran también estas contaminaciones.

A 20 años de su invención, la PCR se cataloga como laestrella de las herramientas de la biología molecular.

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