Microbiología forense: una nueva perspectiva

Amparo Fernández-RodríguezLaboratorio de Microbiología

Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF), Madrid

El aspecto más glamuroso de las ciencias

forenses está de moda

Y la microbiología forense es protagonista de libros

Lo que antes se decía sobre la microbiología post-mortem…los cultivos post-mortem están contaminados

89% de los participantes consideraronla Micro post-mórtem una herramientaútil en la investigación de la causa de la muerte

Sin embargo lo que nos dice hoy la literatura…

Colaboración entre el microbiólogo + patólogo: resultados útiles en microbiología post-mortem

Arch Dis Child 2010;95:371–376.

doi:10.1136/adc.2009.162792

Microbiología post mortem: Normas /Recomendaciones

2019 2021

2018

Estudios microbiológicos en casos de muerte de etiología no aclarada. Artículos 40-44.

20122010

Recomendaciones Europeas

2015

Papel del microbiólogo forense: Cuestiones Médico-legales

MicrobiológoForense

BioterrorismoOtros

biocrímenes

Muerte natural:

Súbita-inesperada

Mala praxis

DenunciaJudicial

Muerte ViolentaInvestigación en la escena del crimen

Identificación de fluidos biológicos en agresiones sexuales

Paleomicrobiología

Trasplantes

Transmisión de la infección de Persona a persona

Lactante

Niño

Adulto

Infección de

Transmisión

Sexual (ITS)

ITS en

niños

Otras

infecciones

Atribución a

un autorSumersiones

Data de

muerte

Personas

Medio

ambiente

Estudios de

microbioma

Fines de

identificación:

localización en la

escena del crimen

Otros fines de la microbiología forense

¿Se ha cometido un delito?

¿Quién lo ha cometido: Atribución?

Comparación de cepas (bacterianas) aisladas en una víctima con las

asociadas con el presunto sospechoso

Determinar la causa de la muerte

O factores predisponentes

Aplicaciones en patología forense / clínica

Microbiología postmortem o de autopsia

“Autopsies tell communities why people are dying.Take for example West Nile Virus. When eight NewYorkers died of brain infections in 1999, most everyoneassumed they had a common virus. But New York City'smedical examiners insisted on autopsies. And, what doyou know, they discovered the first U.S. cases of WestNile Virus.”

Autopsy (post-mortem) microbiology

Necesitamos saber de qué muere una persona cuando…

No existe diagnóstico clínico antemortem

No hay cultivos previos

La histopatología no es suficiente: muchos microorganismos: idéntico cuadro clínico; los hallazgos histolológicos sólo se detectan microscópicamente

Datos epidemiológicosRelevantes

Complementar/Aclararhallazgos histopatológicos

Conocimiento más profundo de las enfermedades

infecciosas

Microbiología Forense y de Autopsia

Cuestiones sanitarias

Enfermedades de Declaración Nacional Obligatoria

Informar a las autoridades sanitarias

Tratamiento a los contactos

• ¿Por qué necesitamos algo más que un análisis histopatológico?

➢ Mismo cuadro clínico y hallazgos histopatológicos: entre ellos ...

Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus

influenzae, Pasteurella multocida y Ewingella americana. Algunos de

ellos son DNO. Alerta social

➢ A veces, las lesiones microscópicas no se pueden encontrar en la

autopsia

➢Detección de enfermedades infecciosas emergentes

El patólogo pregunta al microbiólogo:

¿Qué patógeno es responsable de estos hallazgos?

Necesidad de realizar microbiología post-

mortem: ¿en qué casos?

Photo: Drs. B. Aguilera/ MP.

Suárez Mier, INTCF

En ciertos casos: Se requiere prevención de los contactos: Quimioprofilaxis o

vacunación

• Razones legales

➢Necesidad de descartar una muerte natural por una infección enmascarada

➢Denuncia judicial por posible mala praxis

Sin patología de interés, fiebre ni convulsiones. Tercer hijo de una familia norteafricana. Tras embarazo y parto normales, comenzó repentinamente con lágrimas, y durante el traslado al hospital queda inconsciente y hace PCR.

Autopsia: 51 cm. 3669 g. Sin alteraciones externas ni internas.

MS en lactante de una semana

Bacteriología: Negativa

SangreEnterovirus genogrupado (PCR región VP1) +Enterovirus (RT-PCR; región 5NCR) +PCR Secuenciación Coxackievirus B4 Genogrupado

Bazo y corazón:- Enterovirus genogrupado PCR (región VP1)

Protocolo para virus:

ENTEROVIRUS + corazón, sangre y bazoSangre y corazón: negativos para VEB y Adenovirus

MS en lactante de una semanaHP: miocarditis aguda

Investigación de miocarditis…también en adultos jóvenes

Derrame pleural izquierdo (150 ml) sero-sanguinolento y derrame pericárdico (12 ml) amarillo cetrino. Presentó pequeños punteados blanquecinos en bases pulmonares a predominio de pulmón izquierdo.

Muerte inesperada infantil enero 2020: Niña 20 meses

Síntomas catarrales, fiebre alta e insuficiencia respiratoria ligera. Remitida a Urgencias de

un hospital cercano a Arrecife: observación (10 horas), tto antipirético. Alta con medidas

antipiréticas ambulatorias y tras 24 h regresó al hospital: fiebre pertinaz e insuficiencia

respiratoria severa; ICU, con VM, AB, soporte.

Rx: opacidad pulmonar a predominio derecho con derrame pleural izquierdo, leucopenia

severa, plaquetopenia, hipoglicemia y acidosis mixta severa. Shock, éxitus 8 h tras ingreso

Clínica

Autopsia legal

S. pyogenes (serotipo M, genes spe A, B, F, G, J y Z) en 5 lóbulos pulmonares e hisopo faríngeo + flora habitual de vías altas respiratorias

Metapneumovirus A en 3 lóbulos de pulmón derecho, en LII e hisopos nasal y faríngeo + Bocavirus en vías altas respiratorias

Muerte súbita infantil enero 2020

Áreas blanquecinas en la pleura (exudado purulento y necrosis

en el parénquima que se extiende a la pleura suprayacente.

Sección de Histopatología, Delegación de La Laguna, INTCF.

Neumonitis intersticial con

daño alveolar difuso

Epitelio bronquial con

cambios citopáticos e

inclusiones

citoplasmáticas.

SARS-CoV-2 Negativo

Éxito de la microbiología post-mortem

Toma de muestra

adecuada

En casos bien seleccionados

Diferentes estrategias,

incluyendo las moleculares

Interpretación Global

Microbio-lógica

Evaluación conjunta con los

hallazgos histopatológicos

Es una muerte violenta… o es natural?

Establecer la causa de la muerte

Data de la muerte:

intervalo post-mortem

Sumersión

Aplicaciones en Las Ciencias Forenses (1)

Estudios de

Microbioma

La presencia de flora microbiana

acuática en sangre cardiaca y órganos

cerrados y una mayor expresión del

Surfactante Proteína-A pueden ser

marcadores para el diagnóstico de

sumersión

Estudios de

microbioma

Trazar el origen del

autor

Agresión Sexual: ITS

Identificación del tipo de fluido

Microorganismos

Del suelo: Comparación

Comparación de Hongos

Medioambientales

Bioterrorismo: Identificación de

cepas

Atribución de un crimen:Vincular al autor de los hechos con la víctima &/o con la escena del crimen

Genética

evolutiva

Estudios de

Microbioma

Estudios de

Microbioma

Aplicaciones en Ciencias Forenses (2)

Microbiología del Suelo como herramienta forense

¿Pueden los suelos discriminarse de acuerdo a sus poblaciones microbianas?

Evalúa si una persona sospechosa de un delito puede haber estado en la escena

del crimen

Tanatomicrobioma en la determinación del

intervalo post-mórtem

Delito Medioambiental

Microorganismos como marcadores de polución: suelo, agua,

sedimentos

Microbiología del agua

(Vibrio fischeri NRRL B-11177)

luminiscencia

Aplicaciones en Ciencias Forenses (3)

Agresión / Abuso Sexual

A tener en cuenta…

En los niños, el aislamiento de un patógeno de transmisión

sexual puede ser la primera evidencia de que ha ocurrido un

abuso.

Dar prioridad a los pacientes víctimas de agresiones sexuales

como casos urgentes

Guías generales…algunas de ellas

en el Sistema Judicial

¡¡La mayoría carecen de recomendaciones específicas sobre

técnicas microbiológicas!!

Otros crímenes: transmisión de la infección de persona a persona

Filogenética forenseUna persona presenta

muchas variantes.

Sólo una de ellas es

transmitida cuando infecta a

una pareja nueva. Una vez

transmitida, la variante se

multiplicará y continuará

evolucionando rápidamente.

VHC, VIH : rápida

mutación de virus ARN

Secuenciación de

cepas de virus aisladas

a partir de distintos

individuos: trazar su

evolución y situarlas en

un árbol familiar

(Genealogía del Virus).

En genética forense un experto tiene que proporcionarevidencia científica para cada una de las hipótesis que sevaloran: la de la defensa y la del fiscal

Enfoque Bayesiano (teorema de Bayes)

Considera la evidencia

genética + otra

información

Probabilidad a posteriori = Likelihood ratio (LR) x Probabilidad a priori

Considera la evidencia

genética: confrontando 2

hipótesis

Otras pruebas no biológicas

✓Testigos✓Sospechosovisto cerca o en la escena del crimen✓Otra información

La LR compara estas 2 hipótesis para determinar cuál es la más probable

La probabilidad de la evidencia es X veces más probable si el patógeno procede del Sr. Smith

(paciente 1) que si procede de un individuo no relacionado desconocido

JUECES Y ABOGADOS Proceso diferente de la genética forense convencional:

“Nunca se da una identificación completa entre cepas de individuos relacionados, e incluso de

un mismo individuo. Incluso en los casos en los que los virus de dos o más individuos están

claramente relacionados”.

◆ 1º paso: Identificación de los fluidos biológicos: semen, manchas de sangre, saliva, fluido vaginal

◆ 2º paso: Análisis Genéticos para identificación humana:

◆ 10 pg ADN nuclear

◆ Mezclas mujer/varón 40/1

En genética Forense

Métodos

actuales

Negativo en

ocasiones

escaso material

biológico, efecto

hook

Identificar el tipo de

fluido mediante el

microbioma humano

¿Aplicaciones de la Microbiología Forense?

RESULTADOS PRELIMINARES

• Es posible distinguir el origen del fluido corporal en muestras reales y envejecidas (degradadas) en

un período de tiempo en el laboratorio

• Sangre menstrual y fluido vaginal: indiferenciables.

• Posibilidades de futuro: combinar distintos métodos: mRNA, microbioma etc.

¿Cómo expresar esos resultados en microbiología forense?

Mediante una aproximación probabilística en la que se valorará si la

presencia de una determinada flora microbiana apoya la hipótesis

A (procedencia corporal A) o la B (procedencia corporal B)

Los niveles de Bacteroides y Lactobacillus podrían

usarse como indicadores cuantitativos del IPM.

• Las cantidades relativas de Bacteroides y Lactobacillus relative amounts

declinan exponencialmente a medida que aumenta el IPM

• Bifidobacterium no cambió significativamente

Cuantificación de 3 bacterias intestinales mediante qPCR con primers específicos de

grupo en la región 16S rRNA

Determinación del intervalo post-mortem

interval (PMI)Se pueden distinguir poblaciones bacterianas características

a diferentes IPM y en diferentes localizaciones corporales:

Aplicaciones Forenses del microbioma humanoMuestreo

•Pelo

•Cavidad Oral

•Piel

•Heces

Cuerpo humano

• Superficies

• Aire

•Suelo

Medio ambiente Objectos

Métodos de secuenciación

Aplicaciones Forenses

Futura Aplicabilidad/desafíos

Dirigidos (16S rRNA) No-dirigidos (shotgun

metagenomic sec.)

Diferentes plataformas MPS

Análisis Estadísticos

• Mejora en recogida de muestra

• Almacenamiento de muestras

• Uso de nuevos métodos precisos

• Poder estadístico de BD

IPM Geolocalización Identificación de individuos que

interactúan con objetosOrigen del

fluido corporal

Biomasa Limitada

Variabilidad Temporal

Grado de secuenciación

Taxón raro/ desconocido

Precisión en la Predicción

Molecular Analyses in post-mortem microbiology

16S rRNA PCR and sequencing

Sequencing Sanger

Non-directed pan-bacterial assays

Single sequence

SequencesMixture

Only useful formonoinfections

Not contaminatedsamples

1500 pb

Pilot study targeted 16S-23S rDNA Next Generation sequencing: useful in identifying an infectious cause of death (COD)?

Culture

results

NGS 16S-23 S

sequencing

results

Sanger 16S

sequencing

results

Forensic and Postmortem Microbiowww.escmid.org/esgfor

a) Establishment of European guidance for standardized microbiological sampling in forensic cases

b) Cooperation between pathologists and microbiologists with shared points of interestc) Cooperation with other microbiology societies

Objetivos

Acuerdo con la

ESP

Documento consenso para el estudio de ITS en agresiones sexuales

- Recomendaciones

- Aspectos prácticos para el manejo de la ITS

Acuerdo con GEITS

(SEIMC)

Actividades actuales➢ Interpretación de cultivos post-mortem/Toma de muestra en Bioterrorismo

➢ Presentación de la prueba ante el tribunal: transmisión de patógenos

➢ Toma de muestra en paleomicrobiología (ADN antiguo)

a) Establecimiento de guías europeas: toma de muestra estandarizada en casos forensesb) Cooperación entre patólogos y microbiológos con intereses compartidosc) Cooperación con otras sociedades de microbiología: SEIMC/patología: ESP, SEAP, SEPAF

/ENFSI

ESGFOR: grupo abierto a microbiólogos /biólogos moleculares/patólogos con interés en la microbiología forense y post-mortem

¡GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN!