Métodos Químicos
35
UNIVERSIDAD DE ORIENTE NÚCLEO DE SUCRE ESCUELA DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS Bachiller: Alexandra Castillo C.I.: 24130389 Sección: 04 Profesora: Yoleida Rodríguez. Cumaná, mayo de 2015
-
Upload
independent -
Category
Documents
-
view
8 -
download
0
Transcript of Métodos Químicos
UNIVERSIDAD DE ORIENTE NÚCLEO DE SUCRE
ESCUELA DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS
Bachiller:
Alexandra Castillo
C.I.: 24130389
Sección: 04
Profesora:
Yoleida Rodríguez.
Cumaná, mayo de 2015
CROMATOGRAFÍA
En 1906 Tswett utilizó la cromatografía en columna para
separar extractos vegetales coloreados.
1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de
huevo.
1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas
descubrió que los cationes orgánicos se separaban por
migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como papel
HISTORIA:
1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía
por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por
desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948.,
mientras se aplicaba esta en el campo de la bioquímica, y así Martin
consigue separar algunos aminoácidos acetilados.
Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo
de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel por
sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.
CROMATOGRAFÍA
En 1906 Tswett la definió: “Método en el cual los componentes
de una mezcla son separados en una columna adsorbente
dentro de un sistema fluyente”.
La I.U.P.A.C la define como: “Un método utilizado inicialmente
para la separación de los componentes de una muestra en la
cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las
cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve”.
DEFINICIÓN:
Se fundamenta en la
separación entre la fase
estacionaria sólida o liquida y la
fase móvil liquida o gaseosa.
Los fenómenos rectores del
proceso de retención y
separación son la adsorción y la
absorción.
Cromatografía Escribir en colores
Chroma: Color. Graphein: escribir.
Método de separación
basado en las diferentes
velocidades con que se
mueven los solutos disueltos
en un disolvente llamado
eluente a través de un medio
estacionario o fijo.
ETIMOLOGÍA:
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS:
Pueden clasificarse atendiendo a distintos factores: estado físico
de las fases móvil y estacionaria, soporte utilizado, mecanismo de la separación e incluso el tipo de soluto.
En este tipo de cromatografía las moléculas pueden separarse en
base a las diferencias de sus tamaños si se pasan a través de una
columna que contiene partículas hidratadas de geles muy especiales
(Fase estacionaria).
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
Dextranos con enlaces cruzados
(sephadex).
Agarosa (sepharose, Bio-gel A).
Poliacrilamida (Bio-gel B).
Consta de partículas pequeñas de
substancias hidrofilias e insolubles, es
altamente polar y se hincha
considerablemente cuando se coloca en
agua.
PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
1. Las moléculas pequeñas difunden dentro del gel.
2. Las moléculas grandes son completamente excluidas.
3. Se obtiene una separación completa.
Materiales:
Columna cromatográfica.
Muestra problema.
Fase móvil (Buffer).
Fase estacionaria (geles
de sephadex).
Pipeta Pasteur.
Aro y ampolla de
decantación.
Pie universal y agarradera.
Colectores.
1. Se empaqueta el gel dentro de la columna:
Pequeña cantidad de un buffer
adecuado.
Se añade lentamente la cantidad
necesaria del gel previamente hidratado.
Se lava la columna y se regula la
velocidad de flujo.
2. Marcar diferentes tubos en los que se
recogerá la muestra eluída.
TÉCNICA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
3. Elución de la columna:
Dejar que la columna gotee.
Se siembra la muestra sobre el mismo (columna).
Dejar goteando el solvente de elución.
Recoger las distintas fracciones del eluído en los tubos numerados.
Método que permite la separación de
moléculas basada en sus propiedades de
carga eléctrica, incluyendo aminoácidos,
péptidos y proteínas.
Su fundamento se basa en que las
moléculas cargadas se adhieren a los
intercambiadores de forma reversible de
modo que dichas moléculas pueden ser
asociadas o disociadas cambiando el
ambiente iónico.
CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO IÓNICO
La separación se realiza, en dos fases:
1. Las sustancias a separar se unen al intercambiador.
2. 2. Se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente
fuerza iónica.
a. Relleno de partícula pelicular donde la superficie relativamente
grande (de 30 a 40 µm)de una partícula esférica y no porosa, de
vidrio o polimérica se recubre con una resina sintética de
intercambio iónico.
b. Relleno preparado recubriendo micropartículas porosas de sílice
con una delgada película del intercambiador.
Matriz sólida insoluble a la cual se unen
de forma covalente grupos cargados.
I. aniónicos.
Grupos aminos alifáticos o
aromáticos.
I. catiónicos: grupo sulfónico, SO-3,
carbonilo e hidroxilo fenólico.
Compuestos inorgánicos, resinas
sintéticas o polisacáridos.
RELLENOS DE INTERCAMBIADOR IÓNICO
INTERCAMBIADOR IÓNICO
Materiales:
Columna
cromatográfica.
Muestra problema.
Fase móvil (Buffer).
Fase estacionaria
(resina).
Pipeta Pasteur.
Aro y ampolla de
decantación.
Pie universal y
agarradera.
Colectores.
Esta técnica está basada en 4 etapas:
1. Equilibrio
Equilibrio de la fase estacionaria con
las condiciones iniciales deseadas. (un
intercambiador catiónico sulfonado
asociado a Na+).
2. Aplicación y lavado.
Sembrar la muestra a la cual
queremos filtrar a través de la columna
y su adsorción mediante un lavado
específico.
TÉCNICA DE LA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
3. Elución
Las moléculas captadas por el
intercambiador son eluídas
debido a cambios en la
composición del buffer.
Aumentar progresivamente la
concentración de un contra
ión (NaCl, KCl, entre otros).
Cambio en el pH del solvente,
empleándose con
intercambiadores débiles.
4. Regeneración
Remover las partículas que aún están asociadas al
intercambiador.
Los iones que se adhieren a los sitios activos de la resina son de
muy diferente tipo.
Tipos de regenerantes:
Cloruro de sodio
(NaCl).
Cloruro de potasio
(KCl).
Ácido clorhídrico
(HCl).
Amoníaco (NH4OH),
Carbonato de sodio
(Na2CO3).
Hidróxido de sodio
(NaOH), Hidróxido de
potasio (KOH).
Método de separación, donde el afinante es adsorbido de forma
reversible y específica, al ligando inmovilizada en la matriz.
1. Las partículas que se retienen son aquellas
que se unen específicamente a un ligando.
2. Las partículas que no se unen al ligando son
eluídas a través de la columna.
3. La partículas de interés se eluye mediante el
empleo de una solución.
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
SISTEMAS BIOLÓGICOS MÁS USADOS, EN LA CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDAD:
Enzima - Inhibidor, cofactor, virus
Anticuerpo - Antígeno, virus
Hormona - Receptor
Vitamina - Proteína transportadora
Macromoléculas que interactúan
con metales - Iones metálicos
Etapas fundamentales de la
cromatografía de afinidad
Inmovilización del
ligando.
Adsorción de la
sustancia a purificar.
Desorción de la
sustancia fijada.
1. Selección del ligando:
Compuesto que presenta una
afinidad reversible y más o menos
específica.
2. Selección de la matriz:
Que sea lo más inerte posible.
Que posea una porosidad
adecuada.
Estabilidad química, mecánica y
biológica.
Poseer grupos químicos para la
act.
Resistencia al ataque microbiano.
Facilidad de regeneración.
TÉCNICA DE LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Capaz de formar complejos
reversibles con la molécula a separar.
kd = 10-4-10-8 mol/L , si esta ↑: unión L-P
débil, mientras que si esta ↓: unión L-P
muy fuerte.
Estable.
Poseer al menos un grupo
químicamente reactivo que permita
su inmovilización.
3. Acoplamiento del ligando:
Activación de la matriz:
Consiste en el ataque químico de
la superficie de los soportes.
Inmovilización del ligando: Se
inmovilizan mediante el
establecimiento de enlaces
químicos covalentes.
4. Adsorción de la muestra:
Contacto el soluto con el adsorbente para
permitir que las interacciones de adsorción se
lleven a cabo.
5. Lavado de la muestra:
Se realiza con el buffer inicial de 4-10 veces
el volumen del gel. Remoción de componentes.
6. Elución:
Liberar la Proteína de de la columna.
No bioespecífica: alterar las
condiciones de la solución: cambios
de pH, fuerza iónica o temperatura. Bioespecífica: desplazar a la
molécula del sitio activo. Esta
puede ser normal o invertida.
El método del “salting out” (Precipitación por salación) es uno de
los más utilizados en la purificación de proteínas.
Permite deshacerse de una gran cantidad
de contaminantes de una forma económica.
La sal más utilizada es el sulfato de amonio
(NH4)2SO4 .
Cada proteína precipita a cierta
concentración y tipo de sal.
Se fundamenta en que al añadir una sal:
1. Aumenta la solubilidad de la
proteína (efecto “salting-in”).
2. Disminución hasta que las
proteínas precipitan (efecto “salting-
out”).
PRECIPITACIÓN POR SALES
PRINCIPIO DE LA PRECIPITACIÓN POR SALES
Material:
Suero de ternera (ST).
Disolución saturada de
(NH4)2SO4 (100% de
saturación).
Agua destilada.
Tubos de plástico de
centrífuga de 12 ml con tapón.
Tubo graduado de vidrio Corex
ó Álamo.
Pipetas de vidrio y propipetas
de plástico.
Centrífuga de rotor basculante
para tubos de 12 ml.
TÉCNICA DE PRECIPITACIÓN POR SALES
1. Realizar una dilución 1/5 del ST
en H2O destilada. Preparar un
volumen final de 6 ml. Aplicar
la fórmula: Concentracióninicial x Volumeninicial =
Concentraciónfinal x Volumenfinal.
(Ci x Vi = Cf x Vf.)
2. 5 ml de esta dilución se llevan
hasta un 30 % de saturación
con la disolución de (NH4)2SO4,
saturada aplicando la
siguiente fórmula:
Vsal=[V (S2-S1)/1-S2]
V= 5 ml; S1= 0; S2= 0,30.
Entonces, Vsal = 2,14 ml.
Mezclar, incubar x 10min en
hielo y centrifugar a 4000
r.p.m. x 10 minutos a 4ºC.
Vsal=[V (S2-S1)/1-S2]
3. Sobrenadante tubo graduado, medir el volumen. El precipitado se
disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 1). Se conserva en hielo a
4°C.
4. El sobrenadante se lleva a un 40% de
saturación con el (NH4)2SO4 saturado.
Mezclar, incubar x 10min en
hielo y centrifugar a 4000
r.p.m. x 10 minutos a 4ºC.
5. Sobrenadante tubo graduado, medir el volumen. El precipitado se
disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 2). Se conserva en hielo a
4°C.
6. El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturación con el
(NH4)2SO4 saturado. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O
destilada (fracción 3).
7. Con las tres fracciones obtenidas y la
ST(1/5) se realizarán las siguientes
diluciones (en volumen/volumen):
ST (diluido 1/5): dilución 1/450 y
dilución 1/900.
Fracción 1 dilución 1/12 y dilución
1/24.
Fracción 2 dilución 1/90 y dilución
1/180.
Fracción 3 dilución 1/90 y dilución
1/180
DIÁLISIS
Se usa para separar moléculas grandes e las pequeñas, y se basa
en el hecho de que una membrana semipermeable permite pasar
pequeñas moléculas a través de ella , pero previene el paso de las
moléculas grandes.
La velocidad de diálisis depende de los siguientes factores:
La membrana
Materiales: el celofán material mas común y el tubo recomendado
fabricado por División Visking de unión Carbide.
Preparación: hervir tubo por 30 minutos en EDTA alcalina con el fin
de evitar perdida de actividad de moléculas dializadas,
posteriormente se lava con agua destilada, se hace nudo en
extremo, se llena con material y se ata el otro extremo.
Permeabilidad: depende del tamaño y tratamiento del tubo.
Siendo la membrana permeable a compuestos cuyo peso molecular
esta por debajo de 30000 cuando la diálisis se efectúa de un día
para otro.
El solvente
Solución acuosa: la velocidad de la diálisis es mayor en agua
estilada, sin embargo es necesario utilizar soluciones acuosas de pH y
fuerza iónica definidas.
Solución de una macromolécula: el agua penetra el saco por
osmosis, por lo tanto el tubo debe llenarse completamente con el fin
de evitar la dilución excesiva del contenido.
Condiciones físicas
Temperatura: entre mas alta sea la velocidad será mayor.
Presión: la separación de moléculas grandes y pequeñas puede
hacerse también por medio de un gradiente de presión a través de la
membrana.
TÉCNICA DE LA DÍALISIS:
Ejemplo del paso de moléculas a través de una membrana de diálisis:
Materiales:
Tubo de celofán Visking
Cloruro de sodio (1 g/l amortiguado con fosfato de sodio 0.02 mol/l
a pH 6.8)
Almidón soluble (20 g/l).
Saliva.
Solucion de yodo (5 mmol/l en yoduro de potasio 30 g/l)
Solución de Benedict
Procedimiento:
Se preparan los tubos de diálisis que contengan 5 ml de solución
de almidón y 4 ml de solución salina amortiguada.
Se añade 1ml de saliva a “tubo de prueba” y 1 ml de agua al
“tubo control”.
Se colocan los tubos en vasos de precipitados que contengan
100 ml de amortiguador y se agita mecánicamente.
Se separan las porciones a intervalos de tiempo conveniente.
Se detecta maltosa y almidón.
LIOFILIZACIÓN
Se define como el proceso de secado al vacío de un producto que
previamente ha sido congelado, de forma tal que se produzca
sublimación.
Los incas implementaban una liofilización artesanal; en
las noches frías, debido a su altura, en las montañas se
presentaba una baja presión y luego mediante radiación solar se efectuara la sublimación.
HISTORIA:
También los vikingos utilizaban este método pero
menos efectivo aplicado a los pescados.
Los primeros estudios fueron realizados por Louis Pasteur pero
no obtenían buenos resultados debido a que en esa época (siglo XIX), no se contaba con los trabajos al vacio.
1905 que Benedict y Mannyn introdujeron este proceso a la liofilización
1930 se uso industrialmente, para la Segunda Guerra Mundial
en la fabricación a gran escala de plasma de sangre. Otro producto liofilizado a gran a escala fue la penicilina.
En 1935 se introdujo el término de liofilización que proviene
del griego Luen (solvente) y phileo (amigo) por E. W. Flosdorf y S. Mudd
En 1958 se empezó a emplear en la industria alimenticia pero debido a su costo solo se hizo en alimentos seleccionados.
PRINCIPIO DE LA LIOFILIZACIÓN
Se basa en el fenómeno físico de
la sublimación del agua o bien de
un disolvente orgánico o de mezclas
acuoso-orgánicas que estén congeladas;
el disolvente congelado sublima directam
ente a vapor sin pasar por el estado
líquido.
Se puede describir en cuatro fases
CONGELACIÓN
CONDENSACIÓN (o SUBLIMACIÓN INVERSA) TRATAMIENTO A VACIO
CALENTAMIENTO
Cámara seca o cámara de liofiliza-
ción: es el lugar donde se coloca la
sustancia a liofilizar.
Condensador con circuito de refri-
geración: comunica con
la cámara seca y es donde se cond
ensa el vapor que se
va produciendo en la sublimación.
Sistema de vacío:
El sistema de vacío elimina primero
el aire de la cámara
seca al iniciar el proceso de liofilizaci
ón, y luego ayuda a la sublimación.
El LIOFILIZADOR:
A nivel de laboratorio, para pequeñas cantidades de muestra se utiliz
an viales, tubos o matraces de fondo redondo (mayor resistencia,
con posibilidad de cierre dentro del liofilizador).
TÉCNICA DE LEOFILIZACIÓN
El procedimiento para liofilizar la muestra consta de varias etapas:
1. Congelación de la muestra a bajas temperaturas: habitualmente se introduce la muestra en nitrógeno líquido (-196 °C) o en un
baño de nieve carbónica y acetona (78°C) hasta que congele
totalmente.
2. Secado del producto congelado por sublimación: se introduce la
muestra congelada en uno de los recipientes de la cámara de
sublimación y se conecta el vacío con cuidado.
3. Almacenamiento del producto: los productos liofilizados y
adecuadamente cerrados se pueden guardar por largos períodos
de tiempo con la retención de las propiedades físicas, químicas,
biológicas de sus estados originales.
Ventajas respecto a otras técnicas
Se obtienen productos que se pueden volver a regenerar m
uy rápidamente.
La forma y características del producto final
son esencialmente las originales.
Es un proceso idóneo para secar sustancias termolábiles.
Los constituyentes oxidables están protegidos.
El contenido de humedad final es muy bajo.
