MANUAL DE LABORATORIO virología

1

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

PROGRAMA EDUCATIVO QUÌMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

UNIDAD DE APRENDIZAJE VIROLOGÍA

MANUAL DE LABORATORIO

ELABORARON: QFB MARTHA HILDA RUIZ MENDOZA M. en C. JONNATHAN GUADALUPE SANTILLÁN BENÍTEZ D. en C. ENRIQUE MORALES AVILA

Septiembre 2012

2

Contenido

Introducción.

Formato de la práctica y simbología

Evaluación del curso.

Reglamento de laboratorio de Virología.

Introducción ....................................................................................................................................... 3

Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje ................................ 4

Formato de la práctica y simbología ............................................................................................... 5

Evaluación del curso ......................................................................................................................... 6

Reglamento del laboratorio de Virología ........................................................................................ 7

Manejo de residuos peligrosos ......................................................................................................... 8

Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o diagnóstico. ............ 9

Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e identificación de virus.

........................................................................................................................................................... 13

Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad alantoidea. .............. 18

Práctica 4. Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en huevo fértil de pollo (1ª

parte) titulación del virus de la bronquitis infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª

parte). ............................................................................................................................................... 25

Práctica 5. Hemaglutinación .................................................................................................... 29

Práctica 6. Inhibición de la Hemaglutinación ............................................................................... 33

Práctica 7. Inoculación intracerebral de ratón lactante .............................................................. 38

Práctica 8. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers) ............................................ 42

Práctica 9. Cultivo Celular (parte 1) ............................................................................................. 46

Práctica 10. Cultivo Celular (parte 2) ........................................................................................... 51

Práctica 11. Conteo Celular............................................................................................................ 55

Práctica 12. Titulación Viral .......................................................................................................... 58

Práctica 13. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola ................................................... 62

Práctica 14. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus ..................................... 65

3

Introducción

El término virus viene del latín veneno, se utilizó a finales del siglo XIX para describir a los

agentes más pequeños que las bacterias causantes de enfermedades. En 1940 el desarrollo

del microscopio electrónico posibilitó por primera vez, la visualización de los virus, años

después la centrifuga de alta velocidad permitió concentrarlos y purificarlos.

En la década de los 50’s con el desarrollo del cultivo celular, actual soporte de la

replicación viral, junto con la inoculación de huevos embrionado y el uso de algunos

animales de laboratorio, se descubren nuevos virus, la mayoría de los cuales fueron

analizados en la década de los 60’s y 70’s con el fin de determinar sus características

físicas, químicas y antigénicas para poder establecer las metodologías apropiadas para

diagnosticarlos por el laboratorio.

El diagnóstico de la etiología viral de las infecciones se ha ido generalizando gracias al

desarrollo tecnológico que ha permitido disponer de métodos cada vez más sencillos,

rápidos y económicos como las técnicas de biología molecular (PCR y RT-PCR). Se debe

eliminar la antigua creencia de que el diagnostico viral es costoso, sumamente tardío y de

interés puramente académico o epidemiológicos.

Es necesario crear en los profesionales de la salud la conciencia de la utilidad del

diagnóstico virológico rápido y de la disponibilidad de nuevos fármacos antivirales, las

infecciones virales impactan la calidad de vida de quienes la padecen, por lo tanto, un

resultado correcto y oportuno emitido por el laboratorio, permite contribuir al diagnóstico y

seguimiento del paciente.

Este manual está dirigido a los estudiantes del noveno semestre de la licenciatura de

Químico Farmacéutico Biólogo de la facultad de química de la UAEM y pretende

proporcionar a los alumnos los conocimientos y habilidades básicas para el manejo de las

principales técnicas diagnósticas de laboratorio relacionadas con las infecciones virales

humanas.

El programa de prácticas está integrado por cuatro secciones:

1. Inoculación en embrión de pollo

2. Animales de laboratorio

3. Cultivo celular

4. Diagnóstico Inmuno virológico

4

Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje

Práctica Nombre de práctica Sesiones Tema

1 Constitución de un laboratorio de

virología de investigación o

diagnóstico.

1

2 Huevo fértil de ave como modelo

biológico para el cultivo e

identificación de virus.

1

1.3.

2.2.

Métodos de identificación y

purificación.

Relación virus huésped

3 Inoculación de huevo embrionado

en saco vitelino y cavidad

alantoidea.

2

4 Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en huevo fértil de pollo (1ª parte) titulación del virus de la bronquitis infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª parte)

2

5 Hemaglutinación 1 1.1. Relación virus célula.

6 Inhibición de hemaglutinación

7 Inoculación intracerebral de ratón

lactante.

1 3.7. Manejo de animales de

laboratorio

8 Diagnostico rápido de virus rábico

(tinción de Sellers)

1 1.3. Métodos de identificación.

9 Cultivo celular (primera parte) 2 3.4. Nutrientes necesarios para la

replicación viral 10 Cultivo celular (segunda parte)

11 Conteo celular 1 3.1 Preparación de medios de

cultivo de crecimiento y

mantenimiento viral

12 Titulación viral 1 3.0 Replicación viral

9 Inhibición de la Hemaglutinación 1 4.1. Métodos citológicos directos

13 Determinación de anticuerpos IgM

anti-rubeola

1 4.3. Métodos inmunoserológicos

14 Determinación de anticuerpos IgG

anti-citomegalovirus

1 4.3. Métodos inmunoserológicos

Nota: el manual de laboratorio se realizó tomando en cuenta los conocimientos que se generan en

una práctica y son necesarios en la mayor parte de los casos para el desarrollo de prácticas

posteriores, además los materiales obtenidos en algunas prácticas se reutilizan en las practicas

consecutivas, tal es el caso de la práctica 2, de donde se obtienen productos útiles en la prácticas 3,

6 y 9.

5

Formato de la práctica y simbología

Introducción

Objetivo

Fundamento teórico

Aspectos de seguridad e higiene

Materiales y reactivos

Procedimiento. Este puede ser considerado como actividad o ejercicios

demostrativos.

Actividades de comprobación o evaluación

Observaciones

Bibliografía

6

Evaluación del curso

Evaluación de laboratorio

Reportes

Procedimiento normalizado de operación Valor

1. Introducción (no más de ½ cuartilla) 10

2. Objetivo 10

3. Alcance

4. Responsabilidades

5. Material y equipo 5

6. Procedimiento 25

7. Anexos I y II 50

7.1. Resultados (25)

7.2. Discusión, conclusiones, cuestionario y referencias (25)

Total 100

Desempeño en laboratorio

Aspecto Valor

Conocimiento de la metodología 30

Desarrollo de la práctica 70

Total 100

Calificación final de Laboratorio Valor

Reportes 50

Desempeño en laboratorio 30

Examen (un examen por parcial) 20

Total 100

7

Reglamento del laboratorio de Virología

1. Uso obligatorio de bata blanca de manga larga y abotonada, sin bolsas y en cada

área usar batas desechables sobre la blanca.

2. Uso obligatorio de guantes en el manejo de animales y muestras clínicas.

3. Usar cubre bocas o careta en el caso de prácticas de mayor riesgo.

4. Limpiar las mesas de trabajo con solución antiséptica (benzal o hipoclorito de sodio

al 1 % al inicio y al finalizar la práctica.

5. No abandonar el laboratorio una vez que ha iniciado la práctica, salvo emergencia

justificada.

6. No correr en el laboratorio.

7. Contar con gasas o papel adsorbente en cada mesa de trabajo.

8. Prohibido tomar alimentos dentro del laboratorio.

9. Evitar corrientes de aire en el laboratorio.

10. Disponer de recipiente con agua clorada para inactivar las puntas de las

micropipetas, material contaminado con reactivos y/o muestras biológicas.

11. Utilizar jabón líquido para aseo de las manos antes de abandonar el laboratorio al

término de la sesión.

12. Esterilizar en autoclave el material que así lo requiera.

13. En caso de algún accidente o percance avisar al profesor de la práctica.

14. Respetar las normas internacionales de bioseguridad en los laboratorios para

trabajar virus.

LA REGLA DE ORO

Toda muestra: sangre, suero, cultivos bacterianos, cultivos celulares y virus deben

manipularse con extremo cuidado, como si fuesen muestras potencialmente

patógenas.

8

Manejo de residuos peligrosos

Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las

siguientes características: infecciosas, combustibles, inflamables, explosivas, reactivas,

radioactivas, volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden causar daño a la salud humana y/o al

medio ambiente. Así mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan

estado en contacto con ellos.

Al final de cada práctica se presentará una propuesta de clasificación, registro y recolección de los

residuos químicos, para su posterior almacenamiento y confinamiento.

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de

acuerdo a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que considera como R.P.B.I. los

siguientes:

Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos.

Los cultivos generados en los procedimientos diagnósticos y de investigación, asi como los

generados en la producción de agentes biológicos.

Su activación y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por métodos químicos o térmicos, es el caso

de la desinfección con hipoclorito de sodio y esterilización por calor seco o calór húmedo

frecuentemente utilizados en las áreas de microbiología.

Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).

9



PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo

UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o

diagnóstico.

Introducción

El material y equipo de un laboratorio de virología es muy parecido a muchos laboratorios,

aunque para muchas metodologías diagnósticas y de investigación se precisa de equipo

especializado como las cámaras de flujo laminar, incubadoras de CO2, instrumentos

ópticos de observación como el microscopio de epifluorescencia y el microscopio invertido,

congeladores e instalaciones de criogénia como el tanque de nitrógeno líquido,

refrigeradores de -20 °C, centrifuga refrigerada, autoclave, micropipetas multicanal,

microdilutores.

Un laboratorio de virología debe tener las paredes pintadas con pintura epóxica, las

esquinas redondeadas y tener un flujo de aire positivo en las puertas para evitar que el aire

externo entre, además debe cumplir con la normatividad vigente así como tener un control

de calidad externo.

Objetivo

El alumno investigará y conocerá el equipo y características fundamentales de un

laboratorio de virología y conocerá las diferencias que tiene respecto a otros laboratorios

biológicos.

Fundamento teórico

La esencia de un laboratorio de virología son el equipo y la asepsia, tanto de las

instalaciones como del aire. El aire se debe mantener bajo presión positiva, después de ser

pasado por un filtro, esta presión positiva creará condiciones para que el polvo y los

microorganismos sean arrastrados hacia fuera. Debe existir un área para el cultivo de

tejidos, instalada en la zona alejada de las vías de paso. Las cámaras de flujo laminar

10

reducen las necesidades del aislamiento del área, pero aun así es necesario mantener un

gradiente de esterilidad, lo ideal es disponer de una habitación aislada.

A continuación se describen los instrumentos de un laboratorio de cultivo celular.

1. Campana de flujo laminar. Su función es mantener un área libre de contaminantes, esto

se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un

filtro superficial (HEPA).

2. Incubadora de CO2. Son estufas que regulan la temperatura a 37 °C, ya que las células

en cultivo no pueden sobrevivir a temperaturas superiores a 39 ° C, además se regula la

presión de CO2 esto controla el pH que hay en el interior de la incubadora, regulan

también la humedad, teniendo todas estas condiciones ideales, se augura un buen

desarrollo y crecimiento de las células.

3. Microscopio de contraste de fases invertido. Permite monitorear el desarrollo

morfológico del cultivo, el hecho de que las muestras observadas se encuentren en

recipientes anchos, precisa el uso del invertoscopio, cuya fuente de luz y objetivos se

encuentran invertidos respecto a un microscopio óptico convencional. Como las

muestras no presentan color, el microscopio está equipado con un dispositivo de

contraste de fases que permite obtener imágenes de calidad.

4. Congeladores y equipo de criogénia. Es el sistema que permite guardar las células

durante años a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 °C).

5. Equipo de filtración, muchas soluciones y medios de cultivo que se utilizan para hacer

crecer a las células necesitan ser esterilizadas por filtración a través de un dispositivo de

filtración de 0.22 micrómetros de poro.

6. Equipo de esterilización o autoclave. Es un sistema que permite la esterilización por

calor tanto de sólidos (material e instrumentos) como de líquidos (medios de cultivo). La

esterilización habitualmente se realiza a 121 °C y 2 atmosferas de presión durante 20

minutos.

7. Centrífugas. Deben ser refrigeradas preferentemente con posibilidades de usar en ellas

tubos con volúmenes de 1 a 2 mL, hasta botellas de 250 a 500 mL, deben instalarse lejos

de las campanas de flujo laminar para evitar las turbulencias de aire que generan.

8. Contador electrónico de células. Este instrumento es capaz de medir y contar partículas

en suspensión, consta de 2 electrodos que transmiten al equipo de amplificación y

análisis los cambios de resistencia que detectan, cada vez que una célula en suspensión

los atraviesa.


1. Durante la visita al Laboratorio de Biología Molecular del CICMED será necesario el

uso de equipo de protección básico como la bata blanca de manga larga y abotonada.

11

2. Conducirse con compostura dentro del laboratorio y seguir las indicaciones del

coordinador.

Procedimiento


1. ¿Cuáles son los usos del tanque de nitrógeno líquido y que temperatura alcanzan?

2. Describe las características de las campanas de seguridad biológica o campanas de

flujo laminar.

3. Describe las diferencias que hay entre los microscopios de epifluorescencia, de luz

ordinaria y el invertoscopio.

4. Describe las diferencias elementales entre una centrifuga ordinaria y una centrifuga

refrigerada.

Observaciones

1. Se realizará una visita al

laboratorio de Biología Molecular

del CICMED UAEMéx

2. El alumno elaborará un trabajo de

investigación documental describiendo el

equipo y los aspectos más importantes de

un laboratorio de virología.

3. Investigará la normatividad que debe

cuidarse para el buen funcionamiento de

un laboratorio de virología

12

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica

2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica

Vol. 1

3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina

4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.

Editorial Masson. S.A. Barcelona.

5. http://www.virology.net/

13





Práctica 2. Huevo fértil de ave como modelo biológico para el cultivo e

identificación de virus.

Introducción

Los embriones se han utilizado como el huésped natural para el crecimiento de los virus,

propagación y caracterización de los virus aviares y para la producción de vacunas virales.

Objetivo

Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así

como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las

diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus

humanos.

Fundamento teórico

El embrión y sus membranas ayudan a proveer la diversidad de células necesarias para el

cultivo de diferentes tipos de virus, depende sobre todo de varias condiciones:

1. Vía de inoculación

2. Edad del embrión

3. Periodo de tiempo de incubación

4. Volumen y dilución del inóculo utilizado

5. Temperatura de incubación

6. El estado inmune de la parvada por el cual los embriones son obtenidos

Manejos preliminares.

La utilización de huevo fértil en el laboratorio, no debe ser obtenida de parvadas infectadas

con agentes virales conocidos u otros agentes microbianos. Después de 4 a 5 días de

incubación cuando el embrión puede ser observado fácilmente, estos son evaluados para

determinar cuáles son fértiles. La incubación es alrededor de 37° C y una humedad de 60 a

70% (un alto exceso de humedad permite un subdesarrollo de la cámara de aire, por lo tanto

una baja de humedad permitirá que haya un desarrollo menor). Los embriones deben estar

14

en movimiento varias veces al día, ya sea automáticamente o manualmente, el periodo de

incubación antes de la inoculación depende sobre todo de la vía de inoculación.

Ovoscopia.

La ovoscopia consiste en revisar los huevos embrionados contra una fuente de luz intensa

en un ovoscopio, de esta manera mostrara el embrión, las membranas asociadas y las

cavidades del embrión se observan fácilmente.

1. En un cuarto obscuro, colocar el huevo embrionado al ovoscopio y observar el

movimiento, las condiciones de las venas de sangre y el estado del embrión. Notar las

diferencias con los embriones de diferentes edades.

2. Con un lápiz, marcar la posición del embrión y la cámara de aire (esta área es mantenida

arriba en el ovoscopio).

3. Comparar los embriones fértiles y los embriones muertos de varias edades, descartar los

embriones infértiles y muertos.

Estructura del huevo embrionado.

Justo bajo el cascarón se encuentra una membrana fibrosa que se disemina a través de la

superficie interna del embrión y forma la cámara de aire en el extremo ancho del huevo.

Esta membrana en conjunto con el cascarón ayuda al intercambio de gases en el huevo.

Esta distribución de gases se facilita por la membrana corioalantoidea altamente

vascularizada que sirve como órgano respiratorio del embrión.

Esta membrana se forma de manera adyacente a la membrana del cascarón y forma una

cavidad conocida como saco alantoideo que contiene entre 5 a 10 ml de fluido alantoideo.

El embrión se encuentra envuelto por la membrana amniótica formando el saco amniótico

que contiene entre 1 y 2 ml de fluido amniótico.

El embrión se encuentra unido al saco vitelino que es su fuente de nutrientes y se encuentra

localizado aproximadamente al centro del huevo.

Técnicas y/o vías de inoculación.

Las cuatro vías más comunes para la inoculación del huevo embrionado fértil son:

La vía de saco alantoideo

La vía de saco vitelino

La vía de membrana corioalantoidea (MCA)

La vía de saco amniótico.

En situaciones de diagnóstico donde hay un agente no especifico que es sospechoso, es

conveniente utilizar muchas vías como sean posibles. Si una elección ha sido hecha, la vía

MCA es preferida a causa de su sensibilidad a un gran número de virus y porque es menos

probable para afectarse por contaminación bacteriana.

Saco vitelino. La inoculación en saco vitelino es utilizada para el aislamiento y

propagación del virus de encefalomielitis aviar. Los embriones inoculados por esta vía, son

generalmente incubados de 10 a 13 días postinoculación.

15

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones al término del periodo de

incubación es parálisis de patas.

Si los embriones se dejan nacer, a partir del tercer día de nacidos se pueden observar pollos

que se sientan en las patas, no se mueven bien y algunos caen hacia los lados. Aparece un

ligero pero rápido temblor del cuello y de la cabeza, que especialmente se nota cuando los

pollitos afectados se mantienen en la mano.

Cavidad alantoidea. La inoculación de embriones en saco alantoideo es utilizada para el

aislamiento y propagación de los Paramyxovirus, Myxovirus y Coronavirus. Los embriones

inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a 7 días postinoculación.

Las lesiones que se presentan en los embriones por los Paramyxovirus y los Myxovirus es

que pueden llegar a causar la muerte de los embriones, siempre y cuando se trate de cepas

altamente patógenas, pero tanto los Paramyxovirus como los Myxovirus normalmente se

evalua a través de fluido alantoideo de los embriones y no tanto por las lesiones.

En el fluido alantoideo lo que se tiene que hacer es una prueba de hemoaglutinación con

glóbulos rojos de ave al 5 % para determinar la presencia de hemoaglutininas en dicho

fluido, que no es otra cosa más que la formación de grumos de color rojo rodeados por

espacios transparentes fácilmente visible.

Las lesiones que normalmente se presentan en los embriones por los Coronavirus son

enanismo, encorvamiento, desarrollo anormal de la pluma y depósitos de uratos en riñones.

Membrana corioalantoidea (MCA). La inoculación de embriones en MCA es utilizada

para el aislamiento y pases de Poxvirus y virus Herpes. Los embriones inoculados por esta

vía son incubados durante 7 días postinoculación. Las lesiones que presentan los embriones

por los virus Herpes y Poxvirus es principalmente en la membrana. Presencia de áreas

focales (pústulas) engrosadas con necrosis o un engrosamiento generalizado de la

membrana.

Saco amniótico.

La inoculación de embriones en saco amniótico es utilizada para el aislamiento inicial de

los Myxovirus. Los embriones inoculados por esta vía, son generalmente incubados de 4 a

7 días postinoculación.

Las lesiones que se presentan en los embriones por los Myxovirus son hemorragias

generalizadas en todo el embrión y pueden llegar a causar la muerte, siempre y cuando se

trate de cepas altamente patógenas, pero también se evalúa por la presencia de

hemoaglutininas que se encuentran en el fluido alantoideo del embrión.

Intravenosa. La inoculación por esta vía no tiene aplicación amplia para el estudio de

infecciones experimentales en embriones de pollo. El procedimiento es generalmente

empleado para estudios hematológicos. Embriones de 10 a 15 días de edad son los más

adecuados para esta vía. La cantidad de inóculo puede variar de 0.2 a 0.5 ml.

Intracerebral. La inoculación puede ser realizada con embriones de 8 a 14 días de edad y

el inóculo es de 0.1.a 0.2 ml. Esta vía puede ser empleada en estudios de alteraciones

patológicas del cerebro. Los virus de herpes simple y rabia pueden ser cultivados por esta

vía.

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Aspectos de higiene y seguridad

El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro

inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que

contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso

desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o

en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o

tejidos de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en

una bolsa amarilla de RPBI’s.


3 Huevos no embrionados

Ovoscopio

1 Jeringas de 3 mL

2 jeringas de insulina (de aguja desmontable)

Gasas y torundas

Alcohol al 70 %

Barniz para uñas o pegamento liquido blanco

Cajas petri

Azul de metileno al 2 %

Solución de alcohol-benzal (1:1)

Procedimiento

A. Metodología de ensayo de inoculación

A. Inoculación.

1. Revisar las características de los huevos,

para verificar que se encuentren en

condiciones satisfactorias para su uso,

deben tener el cascaron completo, sin áreas

frágiles o fracturadas.

2. Con ayuda del ovoscopio

identificar las estructuras del

huevo (ver anexo 1).

4. Inocular 100 μL de colorante en las

diferentes cavidades.

3. Encontrar y marcar el saco o

cámara de aire en la parte superior

del huevo.

5. Romper los huevos en las cajas petri y

evaluar la correcta inoculación.

17

Anexo 1


1. Realiza un modelado de las estructura del huevo embrionado (puedes usar los

materiales que desees), tu trabajo se presentara la siguiente sesión de laboratorio.

Observaciones

Bibliografía.



Vol. 1



Editorail Masson. S.A. Barcelona.

18





Práctica 3. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad

alantoidea.

Introducción

Los huevos embrionados se usan de manera limitada en la actualidad para el diagnóstico

viral, pues son baratos, de fácil manipulación, estériles y contienen varias cavidades que

permiten inocular varios virus a la vez. Este sistema biológico ha sido utilizado para la

investigación viral en el laboratorio, además en la producción de ciertas vacunas.

Objetivo

Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así

como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las

diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus

humanos.

Fundamento teórico

El huevo fértil de ave es una fuente de tejido vivo empleado como un sistema sensible para

el cultivo, titulación e identificación de virus. En comparación con los animales de

laboratorio empleados en los ensayos virales, el modelo de huevo fértil ofrece diversas

ventajas tales como:

Son estériles.

No tienen funciones inmunológicas desarrolladas.

No son costosos.

Son accesibles y no requieren para su manejo de tanta destreza técnica

en comparación con otros sistemas biológicos, tales como el mantenimiento y reproducción

de Cultivos Celulares. El huevo fértil empleado para el cultivo de virus, debe obtenerse de

aves sanas ALPES, aves libres de patógenos específicos o SPF por sus siglas en inglés, para

de esta manera eliminar la presencia de virus que comúnmente afectan a las aves como

Adenovirus o Bronquitis Infecciosa Aviar, etc.

19

Para la propagación, cultivo y titulación de virus, es indispensable determinar la viabilidad

del embrión, así como dominar las técnicas para las diferentes vías de inoculación debido a

la especificidad que presentan algunos viriones por determinadas células o tejidos.

En la figura 3 se presenta en esquema de las diferentes zonas que conforman a un huevo

fértil. Una vez realizado el ensayo de la inoculación, deberá observarse el conjunto del

huevo fértil para reconocer las cavidades y fluidos que constituyen al sistema biológico

empleado.

Los virus pueden inocularse en las diferentes estructuras de los huevos embrionados de

pollo o pato, los huevos se inoculan entre los 5 a los 14 días post-fertilización, dependiendo

del estado de desarrollo de la membrana o cavidad que se desee infectar, el sitio de

inoculación se elige según el tropismo viral y puede ser:

a. En la superficie de la membrana corioalantoidea

b. En la cavidad corioalantoidea

c. En el saco vitelino

d. En el saco amniótico

e. En el sistema vascular (vena corioalantoidea)

f. En el propio embrión (intracerebral)

Para la inoculación del embrión (7-14 días) se practica un pequeño orificio en el cascarón

del huevo, previa asepsia y se inyecta el inoculo, se incuba a 37 ° C, la replicación viral

puede producir la muerte del embrión, lesiones características o la manifestación de

antígenos virales por ejemplo las hemaglutininas.

Los huevos embrionados presentan la ventaja de ser bacteriológicamente estériles y de fácil

manipulación, actualmente su uso está restringido al aislamiento, propagación y

elaboración de vacunas mixovirus, paramixovirus y poxvirus.

Vías de inoculación de huevo hembrionado

20


Embriones de pollo libres de patógenos de 9 a 11 días de incubación.

Virus de New Castle.

Solución de azul de metileno al 2 %.

Solución de alcohol-benzal (1:1)

Solución salina fisiológica.

Jeringas para insulina estériles.

Gasas y torundas.

Tubos de ensayo.

Vasos de pp de 100mL.

Lápiz y marcador.

Esmalte para uñas o pegamento blanco.

Cajas petri.

Equipo de disección (pinzas y tijeras de punta fina).

Ovoscopio.

Estufa a 37 °C.

Recipiente de desechos de RPBI.

3 jeringas de insulina con aguja No. 22

Procedimiento

a. Metodología de inoculación

B. Inoculación.

7. Con ayuda de la jeringa hipodérmica

hacer una punción en el centro de la

cámara de aire (ver anexo 2 y figura 1).

8. Usando el ovoscopio localizar la porción

del embrión para inocular en el saco

amniótico y alantoideo.

1. Al llegar los embriones al laboratorio,

revisar que se encuentren en condiciones

satisfactorias para su uso en la inoculación

de virus, deben tener el cascaron completo,

sin áreas frágiles o fracturadas (ver anexo

1).

2. Con ayuda del ovoscopio verificar

que cada huevo tenga un embrión

vivo, de tamaño adecuado al

desarrollo normal de 7-9 días de

incubación.

3. Con el ovoscopio marcar con un lápiz

sobre el cascarón la membrana que separa

al embrión de la cámara de aire.

4. Encontrar y marcar el saco o

cámara de aire en la parte superior

del huevo.

6. Desinfectar la superficie marcada

en el cascarón con la solución

alcohol-benzal o de lugol.

5. Antes de inocular, limpiar el área y

asegurarse que todos los implementos de

trabajo estén a la mano.

21

Anexo 1: CONFIRMACIÓN DE LA VIABILIDAD DEL EMBRIÓN

Trasluminar cada embrión colocando el extremo romo en la ventana del ovoscopio. Un

embrión no viable puede reconocerse a través de:

Desprendimiento de la membrana corioalantoidea de la parte interna de la cutícula.

Falta de irrigación.

Falta de movimiento.

Cualquier coloración de verde a negra que indica por lo general contaminación

bacteriana.

Anexo 2:

b. Otra formas de inoculación

Inoculación en el Saco Vitelino:

1. El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión.

2. Observar al ovoscopio y marcar el límite de la cámara de aire, marcando la posición del

embrión. La cámara de aire debe estar en el polo.

3. Realizar un pequeño agujero en el límite de las ¾ partes del huevo.

4. Tomar el inoculo con aguja de inoculación No. 22 con una jeringa de insulina.

5. Inocular en el agujero hecho en posición directa al embrión con ángulo de 90°.

Inoculación en la Cavidad Alantoidea:

1. Colocar el huevo con posición vertical y con un taladro hacer un orificio en posición

directa del embrión.

2. Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de 45° en el borde (en

relación al polo de la cámara de aire); introducir las 1½ pulgadas.

9. A través del orificio hecho en el cascaron

y con Angulo de 10 a 20° introducir

cuidadosamente la aguja dirigiéndola a un

lado del embrión. Tratando de no

lastimarlo e inocular 0.1 mL de la muestra.

10. Retirar la aguja de la región

amniótica, aproximadamente 1 cm,

para situarla en la cavidad

alantoidea e inocular 0.1 mL de

muestra.

11. Sellar el orificio del cascarón con

parafina, pegamento blanco o

esmalte de uñas e incubar a 34 ° C

por 72 h.

12. Los testigos no reciben ningún

tratamiento, y se incuban en las mismas

condiciones que los inoculados.

13. Al terminar, limpiar y desinfectar

perfectamente el área de trabajo.

22

3 . Otra forma es marcar la cámara de aire, a 0.5 cm de la marca hacer un agujero e inocular

0.3 mL del inoculo con un aguja número 26 ó 27 de insulina.

4 . Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en posición contraria al embrión e

inocular.

Inoculación en la Cavidad Amniótica:

1. Practicar un agujero en posición directa al embrión; con aguja 22 de 1½pulgadas.

Inocular directamente al embrión, introduciendo toda la aguja.

2. Podemos también abrir toda la cámara, añadir 1 gota de solución salina fisiológica o

agua destilada, para que la membrana fárfara, que inicialmente es blanca se haga

transparente.

3. Introducir la pinza y levantar la membrana de la cavidad amniótica, observar el embrión

e inocular.

Inoculación en la Cavidad Coriolantoidea:

1. Se práctica un agujero en el polo más ensanchado del huevo

2. Para inocular:

Utilizando la cámara natural: inoculando por debajo de fárfara que cubre,

depositando el líquido sobre la membrana corioalantoidea, usando jeringa de

insulina y aguja 26 ó 27.

Fabricando una cámara de aire artificial: practicar dos agujeros; uno en el

polo más ensanchado y otro en uno de los costados del huevo en posición

contraria al embrión. Colocar una jeringa en la el agujero y obtener el aire del polo más

ensanchado (cuando sale el aire). La membrana corioalantoidea baja; es decir este se

separa más de la cáscara.

3. Evitar abrir demasiado para que no se contamine.

4. Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 o 27 x 1 ó ½ de pulgada.

5. Para inocular se introduce la aguja y enseguida se inocula el fluido, en la inoculación

puede girar la jeringa para que el líquido, quede depositado en la membrana.

6. Después de realizadas las inoculaciones, los agujeros son cubiertos con parafina cera.

c. Cosecha del virus

1. Cortar con las tijeras la cáscara a

nivel del límite de la cámara de aire.

2. Con ayuda de una jeringa retirar el

líquido alantoideo.

3. Extraer con pipeta Pasteur el

líquido amniótico.

4. En caso de no haber líquido,

hacer un lavado con suero

fisiológico estéril (1mL) y luego

se colecta este líquido.

23

Figura 1. Rutas de inoculación de virus en los huevos embrionados. 1. En la cavidad

alantoidea, 2. En la cavidad amniótica, 3. En el saco vitelino, 4. En la membrana

corioalantoidea.


1. Menciona tres usos de los huevos embrionados en el laboratorio de virología.

2. Esquematiza un huevo embrionado, señalando cada una de las cavidades que los

caracterizan.

3. ¿En qué cavidad es susceptible inocular un herpes virus?

4. Los poxvirus ¿en qué cavidad se inoculan?

5. ¿Qué efecto produce el herpes virus en el embrión?

Identifica las partes de los huevos embrionados.

24

Observaciones

Bibliografía.



Vol. 1




25





Práctica 4. Replicación del virus de la bronquitis infecciosa aviar en

huevo fértil de pollo (1ª parte) titulación del virus de la bronquitis

infecciosa aviar (DI50) en huevo fértil de pollo (2ª parte).

Objetivos

El alumno dominara las técnicas para propagar y titular una cepa vacunal de virus.

El alumno determinará la DLEP50 para la vacuna del Virus de la Bronquitis Aviar (VBA),

calculando sus concentraciónes por unidad de volumen.

Introducción

Existen diversos agentes infecciosos que provocan en el humano y otros mamíferos daños

severos e incluso la muerte. En el mejor de los casos lo deseable es que esta interacción

induzca una protección inmunológica al individuo como consecuencia del reconocimiento

de antígenos específicos tanto en forma natural como artificial. En el caso de medidas

profilácticas, con el empleo de vacunas se procura inducir una Inmunidad Adquirida Activa

Artificial. Para obtener resultados satisfactorios, es indispensable evaluar la calidad de la

vacuna. Para las vacunas elaboradas con virus atenuados, la valoración se puede efectuar en

sistemas biológicos tales como huevos fértiles de ave que pueden responder a la infección

viral dando lesiones características del virión inoculado que afecte directamente al embrión

y le produce signos tales como músculos distróficos, enanismo o muerte, o bien, afectan

estructuras y líquidos extraembrionarios donde se pueden observar hemorragias, formación

de placas o pústulas así como determinar la presencia de hemaglutininas virales.

Los virus vacunales o de campo pueden titularse en conjunto de huevos fértiles de ave

huando producen su muerte calculando entonces una Dosis Letal al 50% (DLEP50) o en el

caso de virus hemaglutinantes calculando Dosis Infectivas al 50% (DIEP50) empleando la

reacción de Hemaglutinación de los fluidos cosechados.

Aspectos de higiene y seguridad

El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro

inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que

contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso

desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o

26

en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o

tejidos de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en

una bolsa amarilla de RPBI’s.


Huevo fértil de ave de 10 dias de incubación (+/- 1 dia) calidad ALPES.

Vacuna de VBA. INTERVET

Solucion salina de Dulbecco

Lápiz, pegamento blanco y perforadores

Hisopos estériles, tintura de yodo.

Estufa a 37°C.

Ovoscopio.

Jeringas de insulina.

Mechero.

Recipiente para desechos.

Procedimiento

1. Realizar con solución salina de Dulbecco diluciones seriadas de la vacuna viral

desde 10-1 hasta 10-6 a partir de una suspensión concentrada.

2. Trasluminar el huevo fértil de ave y seguir la técnica de inoculación para cavidad

alantoidea

3. Desinfectar el sitio marcado con el punto o cruz de inoculación con tintura de yodo

antes y después de perforar

4. Inocular 0.1 ml de las cuatro últimas diluciones en cada uno de 5 embriones de 9 a

11 días de incubación (20 embriones en total), vía cavidad alantoidea.

5. Desinfectar nuevamente y sellar la perforación con una gota de pegamento blanco

6. Marcar con lápiz sobre cada embrión la dilución y vacuna inoculadas

7. Incubar a 37°C durante 7 dias, revisando diariamente la viabilidad de los embriones

al ovoscopio, señalando en el primer dia los embriones que resulten muertos por

traumatismo

8. Al termino de la incubación, trasluminar los embriones al ovoscopio y realizar un

recuento de embriones vivos y muertos.

9. Anotar los resultados obtenidos y realizar los cálculos para determinar la DLEP50 /

0.1 ml empleando el método de Reed & Muench, con base en el siguiente ejemplo:

27

Para una mejor explicación, se desgloza a continuación la realización de los cálculos para

cada columna:

1. Realizar la suma acumulada de embriones muertos desde la dilución más alta hasta la

más baja.

2. Realizar la suma acumulada de embriones vivos desde la dilución más baja a la más

alta.

3. Calcular el cociente dado por los acumulados muertos sobre la suma de acumulados

muertos más acumulados vivos de cada dilución.

CALCULAR EL VALOR DE INTERPOLACIÓN (V.I.)

Localizar las diluciones entre las que se encuentra el 50% de mortalidad En el ejemplo: 10-

4 y 10-5.

Estimar la DLEP50 sumando el V.I.C. al exponente de la dilución que presente mayor al

50% de efecto.

En el ejemplo : 10-4 + (-0.49) = 10-4.49 = DLEP50

El titulo se obtiene con el inverso de la DLEP50.

Finalmente:

Titulo = 104.49

28

Actividades de evaluación

1. Además de la titulación viral, que otras pruebas se deben realizar a un lote

vacunal antes de salir al mercado.

2. Mencione otras dosis al 50% que se pueden calcular para titular una muestra viral.

Observaciones

Bibliografía



Vol. 1




29





Práctica 5. Hemaglutinación

Introducción:

La hemoaglutinación es un método donde no se mide la capacidad infecciosa de las

partículas virales. Es una técnica indirecta para medir partículas virales, pues en realidad

mediante esta técnica se mide la cantidad de partículas hemaglutinantes (proteínas virales)

independientemente si estas están incluidas en la partícula viral o libres como antígeno.

Objetivo

Se realizará el reconocimiento del virus de New Castle mediante la Hemoaglutinación

Directa, por su acción sobre los glóbulos rojos de pollo.

Fundamento teórico

La hemoaglutinación es uno de los métodos indirectos más comunes para cuantificar

partículas virales y/o antígenos virales hemaglutinantes en suspensión. En esta los

eritrocitos se pueden sensibilizar con diversos antígenos y se pueden usar como un sistema

indicador. Así, si se descubren los anticuerpos, la reacción se revelará como una

hemoaglutinación que se puede advertir a simple vista. Existe una gran cantidad de

antígenos que se pueden unir a los glóbulos rojos, entre ellos los carbohidratos que se

adhieren con rapidez. En el caso de las proteínas se requiere un proceso de pre-tratamiento

con ácido tánico o con cloruro de cromo. Este sistema se usa para demostrar anticuerpos

contra toxinas como la de la difteria o del tétanos. También para descubrir anticuerpos

contra el virus de la fiebre amarilla, VZV, influenza, parainfluenza y dengue.

Un virus hemaglutinante es aquel capaz de aglutinar glóbulos rojos de determinada especie

animal, p.ej. los virus ya mencionados anteriormente.

El título de una hemoaglutinación está determinado por la última dilución de una serie, en

donde se observa, macroscópicamente, una malla formada por la unión del virus y/o

antígeno libre a receptores en la membrana de los glóbulos rojos y en la siguiente dilución

un sedimento o “botón” de glóbulos rojos.

30


1. Desinfectar el área de trabajo al inicio y al final de la práctica.

2. Uso de protección personal.

3. Adecuada disposición de los residuos en una bolsa amarilla de RPBI’s.

4. Tratamiento químico adecuado para la desinfección del material que tuvo contacto con

los productos biológicos.


Virus New Castle.

Glóbulos Rojos de pollo lavados.

Para el caso de seres humanos: usar grupo sanguíneo “O”.

Solución Salina Fisiológica.

Gradillas.

Tubos de ensayo.

Pipetas.

Espejo.

Centrífuga.

Procedimiento:

Preparación de Glóbulos Rojos Lavados:

1. Extraer la sangre de pollo

(previamente vacunado); y conservarla

en un tubo con anticoagulante.

2. Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.

4. Extraer la sangre de pollo (previamente

vacunado); y conservarla en un tubo

con anticoagulante.

3. Eliminamos el sobrenadante (plasma).

5. Agregar al tubo (Paquete Celular)

solución salina fisiológica y mezclar.

6. Volver a centrifugar a 1500 rpm por 5

min.

8. Eliminamos el sobrenadante y

volvemos a repetir el proceso de lavado

2 – 3 veces más.

7. Luego, tomamos de 0.7 ml. de

glóbulos rojos del paquete celular y lo

suspendemos en 100 ml. de SSF, para

obtener el 0.7 % de glóbulos rojos

lavados.

31

Reacción de Hemoaglutinación:

2. Con una pipeta tomar 20 μl. de cepa de

Newcastle y depositarla en el tubo No.

1 (dilución 1/5).

4. Tomamos 100 μl. del tubo 01 y lo

depositarnos en el tubo Nº 02,

(dilución 1/10).

3. Repetir hasta obtener las diluciones

1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640,

1/1280 (el tubo N° 09 es el control se

le añadirá 0.5 ml. de la cepa New

Castle).

5. A cada tubo colocamos 100 μl. de los

glóbulos rojos lavados al 1 %

(incluyendo el tubo control).

6. Dejamos reposar al medio ambiente por

15 a 20 minutos.

7. Pasado el tiempo, colocamos debajo de

la gradilla un espejo, para observar si

hay “hemaglutinación positiva”

(formación de una malla delgada, gris)

o hemoaglutinación negativa (se

observa un punto rojo).

8. La última dilución en la cual aparece

HA es el título del virus (este es el

inverso de dicha dilución).

1. Colocamos 8 tubos en un gradilla,

colocándole al primero 180 μl. de SSF

y del tubo 2 al 8 añadir 100 μl. de

Suero Fisiológico.

32


1. Describe el fenómeno de hemaglutinación

2. ¿Cuál es la diferencia entre aglutinación directa e indirecta?

3. ¿Cuál es la utilidad de la técnica de hemaglutinación por virus?

4. Mencione tres ejemplos de virus que puedan ser analizados mediante la prueba de

HA.

5. Cite dos causas por las que se puedan obtener resultados falsos negativos en la

prueba de HA.

6. Porqué es importante determinar la dilución que contiene 4 UHA.

Observaciones

Bibliografía.



Vol. 1




33





Práctica 6. Inhibición de la Hemaglutinación

Introducción.

La prueba de Hemaglutinación es un diagnóstico presuntivo más no específico de infección

por virus del Newcastle, de manera que de resultar positiva no nos permite asegurar que

este virus sea el agente causal. La prueba de hemaglutinación se basa en una característica

inherente de la estructura de ciertos virus como lo de la influenza y rubéola, los cuales

contienen en su superficie componentes que se asocian a moléculas de superficie de los

eritrocitos y los aglutinan. El virus hemaglutinante forma puentes entre los eritrocitos y

cambia su patrón normal de asentamiento, este fenómeno se llama hemaglutinación, el

bloqueo de este fenómeno es conocido como inhibición de la hemaglutinación.

Objetivo.

Que el alumno conozca el fundamento de la técnica de la inhibición de la hemaglutinación

(IHA) y su aplicación en el diagnóstico, así como determinar si están protegidos contra la

rubéola de acuerdo al título de anticuerpos presentes en suero y principalmente en alumnas.

Fundamento teórico

Para realizar un diagnóstico definitivo se debe realizar una prueba que demuestre una

respuesta específica del huésped hacia este virus, dicha respuesta está representada por la

presencia de anticuerpos y la prueba empleada para ello se conoce como Inhibición de la

Hemaglutinación (IHA).

Esta prueba se basa en la unión de un anticuerpo específico hacia la hemaglutinina del

virión que impida la formación de puentes entre el ligando viral y el receptor celular. Este

hecho permite identificar plenamente al virus y se conoce como neutralización vírica.

Muchas de las familias de virus poseen la capacidad de aglutinar eritrocitos de diversas

especies animales (pollos, patos, bovinos, etc) Esta propiedad fue descubierta en 1941 por

Hirst y McClelland en virus de la gripe.

34

El fenómeno básico se da por la unión de hemaglutininas virales (proteínas de la membrana

de los virus) con los receptores mucoproteicos presentes en las membranas de muchas

células y que son especialmente abundantes en los eritrocitos.

Si la concentración de viriones es suficiente, se formarán múltiples puentes entre ellos y los

eritrocitos, depositándose en el fondo del tubo en forma de retículos, los eritrocitos que no

fueron aglutinados, se depositarán en el fondo del tubo en forma de botón.

Los anticuerpos presentes en el suero pueden inhibir la hemaglutinación originada por

ciertos virus. Si se hace reaccionar a un virus con capacidad de hemaglutinación con su

anticuerpo específico, este anulará su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las

hemaglutininas presentes en la envoltura del virión. La inhibición de la hemaglutinación es

un método diagnóstico utilizado con frecuencia, tanto para identificar virus, como para

determinar la presencia de anticuerpos específicos. Es necesario tratar los sueros para

eliminar inhibidores específicos de la hemaglutinación.


Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.

Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.

La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores

automáticos. Nunca pipetear con la boca.

Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan

hipoclorito de sodio al 1%.

Evitar derrames o salpicaduras del material biológico.

Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.


Equipo de microtitulación

Microplacas de 96 pozos de fondo en U

Microdilutores de 25 L

Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L

Puntas para pipeta automática estériles

Suero Humano tratado

Eritrocitos en solución de PBS al 85% (pollo, cobayo o de pato)

Vacuna viral (viriones atenuados New Castle, cepa La Sota, INTERVET )

Solución salina de fosfatos pH 7.2 (PBS)

Solución de hipoclorito de sodio.

Alcohol y algodón.

Recipiente para recolección de desechos.

35

Procedimiento

10. Agregar 75 μl de la suspensión de

glóbulos rojos a todos y cada uno de

los pozos, agitar y colocar la

microplaca a temperatura ambiente

hasta que los glóbulos rojos del pozo

que no contiene antisuero y sirve

como control haya sedimentado.

11. Determinar el título del antisuero

identificando la última dilución que

presenta IHA. En la hemaglutinación se

observa una agregación de las células

sanguíneas sobre la superficie del pozo,

formando una especie de red.

1. Estandarizacíón de los eritrocitos. Con base

en los resultados de la práctica anterior,

preparar en un tubo una dilución del virus

del Newcastle que contenga 4 UHA en un

volumen suficiente para realizar la prueba

de IHA (ver ejemplo).

2. Hacer diluciones al doble del suero

problema, desde 1:2 hasta 1:256 de

acuerdo al esquema de la figura 1;

incluir un pozo control que no

contendrá antisuero ni virus.

3. Agregar 75 μl de SSI a los pozos del

1 al 9 de la microplaca.

4. Colocar en el pozo 1 75 μl del suero

problema y mezclar por aspersión y

dispersión de dos a tres veces obteniendo

así la dilución 1:2.

5. Transferir 75 μl de ésta dilución al

pozo 2 y mezclar homogéneamente.

6. Repetir sucesivamente este

procedimiento hasta el pozo No. 8 que

corresponderá a la dilución 1:256.

7. Desechar del pozo 8 75 μl en el

recipiente para recolección de

desechos.

NOTA IMPORTANTE: No se debe

agregar dilución del suero al pozo No. 9

que sirve como control.

8. Agregar a cada uno de los 8 pozos con

suero problema, 4 UHA del antígeno viral

en un volumen de 75 μl.

9. Agitar la microplaca para que

reaccionen los sustratos y dejar en

reposo durante 10 min.

36


1. Cita 3 virus con capacidad hemaglutinante diferentes a los que se mencionan en esta

práctica

2. ¿Qué diferencia macroscópica hay entre una sedimentación eritrocitaria y una

hemaglutinación?

3. ¿Por qué se utilizan los glóbulos rojos tipo O?

Ejemplo de estandarización de eritrocitos:

a Resultado de la práctica de HA: Dilución 1:20 de la vacuna viral = 4 UHA

b Volumen suficiente para realizar IHA= 2ml

Entonces.....

Vacuna viral concentrada 100 μl

+

SSI 1900 μl

_________

Volúmen final 2000 μl de dilución con 4 UHA

PATRONES DE SEDIMENTACIÓN:

PRUEBA POSITIVA PRUEBA NEGATIVA

37


1. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado negativa en la prueba de IHA?

2. ¿Cuál es la interpretación diagnóstica de un resultado positivo en la prueba de IHA?

3. Conjuntando las pruebas de HA e IHA, ¿Cómo explica un resultado negativo en la

prueba de HA con uno positivo en la prueba de IHA? y ¿Cuál es el diagnóstico final que

daría después de analizar ambas pruebas?

Observaciones

Bibliografía


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología

médica Vol. 1

3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina

4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da

Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

38





Práctica 7. Inoculación intracerebral de ratón lactante

Introducción

La primer técnica emplead en el aislamiento de los virus fue la inoculación en animales de

experimentación. La prueba de infección se lograba si él animal moría o si se observaban

síntomas o lesiones. La aplicación de este método es limitado, los animales son caros así

como su mantenimiento, no todos los animales son susceptibles a las enfermedades que

atacan al hombre, a pesar de estas dificultades, son esenciales para el aislamiento de

algunos virus que causan enfermedades del sistema nervioso central como los arbovirus,

enterovirus, coxsackievirus y rabdovirus.

Objetivo

Que el alumno aprenda a realizar la correcta inoculación de ratones por las vías

intracerebral, intraperitoneal, subcutánea y oral.

Fundamento teórico

Los animales habitualmente utilizados en el laboratorio son ratones lactantes o adultos,

cobayos, conejos y en algunos casos primates, numerosos virus pueden aislarse y cultivarse

en animales de experimentación, resultan indispensables en la investigación de la

patogénesis e inmunidad de las enfermedades virales, en el ensayo de vacunas, en el estudio

de los virus oncogénicos y de la preparación de antisueros con fines diagnósticos.

Debido a la legislación en cuanto a su uso, el alto costo de mantenimiento, a la complejidad

de las instalaciones y al riesgo de manipulación de animales infectados, se utilizan de

manera cada vez más restringida. La inoculación en animales es el método más antiguo

para aislar y conservar virus, dependiendo del virus por aislar se elige el animal, la vía de

inoculación que asegure que el virus alcance el tejido u órgano donde se multiplique con

mayor facilidad, es importante seguir las precauciones de esterilidad necesarias para que la

muestra no se contamine con microorganismos que enmascaren el desarrollo viral. Los

ratones y hámsteres recién nacidos de menos de 48 horas son especialmente susceptibles a

39

los enterovirus, cocksakievirus y rabdovirus, pueden ser inoculados por vía intracerebral o

intraperitoneal, en cambio los ratones adultos son susceptibles a la rabia, la fiebre amarilla

y linfogranuloma, la inoculación se hace por vía intracerebral y los síntomas principales son

la falta de coordinación y ataxia.


1. Purgar las jeringas usando un tubo que contenga material absorbente para evitar

aerosoles.

2. Asegurar que el animal este completamente sedado antes de inocularlo.

3. Aplicar correctamente las técnicas de inoculación y sujetar firmemente al animal para

evitar autoinoculaciones.

4. Las jeringas usadas, jamás se re-encapuchan, desechar en el recipiente rígido para RPBI

o en el contenedor de punzocortantes.

5. Los animales que quedan vivos al final de la práctica los animales muertos se colocan en

una bolsa amarilla para RPBI, la cual será refrigerada antes de su destino final.

Material y equipo

Ratón joven de 30 días y ratón lactante de 2-3 días de nacido.

Jeringas para insulina.

Torundas y gasas.

Equipo de disección.

Ampolleta de agua inyectable estéril.

Solución de alcohol-yodo (1:1)

Solución de azul de metileno al 2 %.

Éter

Vaso de precipitado de 100 y 250 mL

Recipiente rígido para RPBI’s y bolsa amarilla de RPBI.

Procedimiento

Inoculación intracerebral. En el lactante se pueden observar los huesos y las estructuras

cerebrales por la transparencia de la piel.

2. Colocar el ratón de cúbito ventral sobre la

mesa, se selecciona el sitio de inoculación

entre el conducto auditivo externo y el ojo,

a un lado de la línea media.

3. Se desinfecta el área, evitando introducir

desinfectante al ojo.

4. Se carga la jeringa con 0.01 mL para

ratón lactante y de 0.05 mL para ratón

adulto con agua destilada estéril.

1. Anestesiar al ratón en un frasco que

contenga torunda humedecidas con éter.

40

Inoculación oral


1. Menciona tres usos de los ratones en el laboratorio de virología

2. Cita 3 vías de inoculación en animales

3. Que precauciones debes tomar en cuenta al realizar una inoculación.

4. Esquematiza la anatomía abdominal del ratón.

5. Para qué tipo de aislamiento viral es útil la inoculación intracerebral.

2. Se carga la jeringa con 0.05 mL de

solución de azul de metileno.

1. Se carga la jeringa con 0.05 mL de

solución de azul de metileno.

5. La aguja debe penetrar el cráneo en

forma perpendicular para evitar que la

punta resbale.

6. Sentir como la aguja penetra el hueso,

controlar la presión que se ejerce, la aguja

solo debe penetrar de 1 – 2 mm.

7. Se realiza la inoculación, se retira la

aguja y se desinfecta nuevamente.

8. El ratón lactante es difícil de anestesiar

por lo que se realiza la inoculación

rápido y sin anestesia.

3. Se toma al ratón en posición dorsal.

4. Se acerca la jeringa a la boca y se

deposita el inoculo.

5. Se puede seguir la trayectoria del

inoculo por la transparencia de la piel.

41

Observaciones

Bibliografía



Vol.1




42





Práctica 8. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers)

Introducción.

Los métodos para el diagnóstico de la rabia deben ofrecer condiciones óptimas de

precisión, rapidez y economía. Dentro de estas técnicas está la investigación microscópica

de los corpúsculos de Negri, que se realizan en un frótis de tejido encefálico infectado con

el virus rábico y es teñido por la técnica de Sellers.

Objetivo.

Aprender a efectuar el diagnóstico rápido del virus rábico usando la técnica de Seller

(simulando que el ratón está inoculado o infectado con este virus).

Fundamento teórico

El virus rábico pertenece a la familia Rhabdoviridae, es un RNA virus de una sola cadena,

tiene forma de bala. La rabia se transmite por mordedura o contacto directo de las mucosas

o heridas con la saliva del animal infectado, es la zoonosis más antigua, cuya importancia

radica en su letalidad cercana al 100 %.

La rabia se caracteriza por un cuadro encefálico cuyo diagnóstico diferencial con otras

encefalitis es difícil y solo el examen del laboratorio permitió establecer un diagnostico

seguro.

El diagnóstico clínico de la rabia en un animal justifica el inicio del tratamiento antirrábico

de la persona que estuvo en contacto con el virus y el diagnostico posterior permite

continuarlo o interrumpirlo. Sin embargo las pruebas de laboratorio son adecuadas cuando

se cumplen ciertos requisitos:

Buena calidad de la muestra

Condiciones de transporte correctos

43

Rapidez con la que se obtiene resultado

Notificación inmediata de los resultados

La tinción de Sellers es una técnica sencilla, rápida y de bajo costo para el diagnóstico de la

rabia, que es una de las infecciones virales de notificación obligatoria para el sector salud.

Esta tinción pone de manifiesto los corpúsculos de Negri en el cerebro del animal infectado

o que se sospecha tenia rabia. Se ha observado que los corpúsculos de Negri son

especialmente visibles en el asta de Ammon, en las células piramidales de la corteza

cerebral y en las células de Purkinje en el cerebro.

El colorante de Sellers tiñe los corpúsculos de Negri de color rojo violaceo o rojo ladrillo,

con inclusiones basófilas de color azul oscuro a negro. Dejándolos claramente

diferenciados de las células nerviosas y del tejido intersticial que se tiñe de azul claro y rosa

respectivamente. Los corpúsculos de Negri están constituidos por partículas virales y

constituyentes celulares rodeados de una matriz citoplasmática, contienen DNA (sustrato

eosinófilo) y RNA (granulaciones basófilas).


5. Uso de protección personal.

6. Asegurarse que el ratón está completamente sedado antes de sacrificarlo.

7. Sujetar firmemente al ratón para evitar accidentes.

8. Realizar los cortes con el bisturí sujeto del mango (evitar manejar el bisturí directamente

con la mano).

9. Los restos del ratón serán colocados en una bolsa amarilla para RPBI la cual deberá ser

refrigerada.


Estuche de disección

Abate lenguas

Papel filtro

Colorante de Sellers

Puente y charola de tinción

Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5

Cronómetro

Microscopio

Ratones de 3 -5 semanas de nacidos

44

Procedimiento

Preparación de la impronta

1. Con ayuda del equipo de disección y de las

tijeras de punta fina se realizará un corte

entre ambas fosas orbitales del ratón.

2. Se levanta la piel y músculos de la

cara y cabeza para exponer el cráneo.

3. Se dobla el cuello del ratón para

exponer el agujero magno.

4. Se inserta la punta de una tijera para cortar

el hueso y se corta la bóveda hasta exponer

el cerebro.

5. Se saca integro el cerebro desprendiéndolo

de la base del cráneo (incluyendo cerebelo

y parte de la medula).

6. Se saca integro el cerebro

desprendiéndolo de la base del cráneo

(incluyendo cerebelo y parte de la

medula).

7. Con el bisturí se hace una sección transversal tomando

un fragmento del cerebro que contenga el asta de

Ammon o cuerpo de Ammon del hipocampo donde los

corpúsculos de Negri son especialmente visibles.

1. En el extremo de un abate lenguas se coloca

una banda de papel filtro y sobre este se

pone el corte del cerebro del ratón.

2. Se toma un portaobjetos y se hacen

de 3 a 4 impresiones del cerebro,

tomando ligeramente y haciendo

presión hasta que quede marcado en

el porta objetos la silueta de la pieza

de cerebro a estudiar.

3. Se realiza la tinción de Sellers de acuerdo al

siguiente metodología:

a. Cubrir la impronta con el colorante de Sellers durante 15 segundos

b. En seguida enjuagar con buffer pH = 7.5.

c. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

2. Observar y describir las células

nerviosas, no se apreciarán los

corpúsculos de Negri pues el riego de

manejar virus rábico es muy alto (solo

se simulará que el ratón está infectado)

45

Figura 1. Corpúsculos de Negri en tejido neuronal


1. Mencione 3 técnicas para el diagnóstico de virus rábico.

2. Define en qué consiste un estudio histológico.

3. Realiza un esquema de la anatomía macroscópica y microscópica cerebral del ratón.

4. Cita el procedimiento para la preparación del colorante de Sellers.

5. ¿Cuál es el sustrato ideal para la obtención de vacuna antirrábica?

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1




46





Práctica 9. Cultivo Celular (parte 1)

Introducción.

Debido a que los virus, como ocurre con los plásmidos, se replican solo

de n t r o d e c é l u l a s v i v a s , l a i n v e s t i g a c i ó n s o b r e v i r u s r e q u i e r e e l u s o

d e h ospedadores ap ropiados . Para e l es tudio de los v i rus bact e r ianos se

usan cultivos axénicos en medio líquido o en medio semisólido con agar.

Como la mayor parte de las bacterias son fáciles de cultivar, resulta relativamente

simple estudiar los virus bacterianos y por esta razón se dispone de un

crecimiento detallado de la multiplicación de estos virus. En lo que respecta a los virus

de los animales, el hospedador inicial puede ser un animal susceptible al virus, pero

a efectos de investigación es deseable disponer de hospedadores más manejables.

En 1907 el biólogo estadounidense Ross Granville Harrison descubre que los tejidos

vivos pueden cultivarse, es decir, pueden crecer fuera de su órgano original. Este fue el

comienzo para el desarrollo de los cu l t ivos de t e j idos y más adel ante e l de los

cu l t ivos ce lu la res ( l íneas celulares).

Objetivo.

1. Obtener un cultivo celular primario (monocapa de células in Vitro).

2. Familiarizarse en el cultivo de tejidos.

Fundamento teórico

Muchos virus animales pueden ser cultivados en cultivos de tejidos o cu l t ivos

ce lu la res , y e l uso de t a les cu l t ivos ha fac i l i t ado enormemente l a

investigación sobre los virus. Los virus son microorganismos intracelulares y para

evidenciarlos, se deben utilizar sistemas basados en líneas celulares que

permitan su desarrollo. Los cultivos celulares son un tipo de biosustrato empleados

para la propagación de los virus, constituyen, desde 1950, el sistema más

empleado para el aislamiento y propagación de la mayoría de los virus, consisten

en un sistema formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o

tumoral, mantenidas en medios de cu l t ivo de composic ión química def in ida

y en condic iones de t emperatu ra , pH, aireación y humedad controladas. Dentro

de éstos, los más usados son los cultivos en monocapa, aunque hay otros sistemas

47

(cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en

microcarriers, etc). Los cultivos celulares en monocapa consisten en una capa

de células que crecen adheridas a la superficie del recipiente que las contiene.

Estos cultivos se preparan tratando el tejido original u otra monocapa con un

agente que dispersa las células (una enzima o un agente quelante, o ambos combinados)

para luego transferir la suspensión celular obtenida a un recipiente de vidrio o plástico

en donde las células se adhieren y multiplican. La invasión viral se evidencia a

través de un cambio celular o efecto citopático (EC) y mediante pruebas

complementarias.

No existe un cultivo celular susceptible a todos los virus, de modo que un

laboratorio de diagnóstico viral debe disponer de distintos cultivos celulares.

Por ejemplo, el virus herpes simplex crece bien in vitro en cultivos primarios,

cepas y líneas celulares (MRC-5, RK, HEp-2, HeLa, Vero u otras); en cambio, otro virus

de la misma familia, el citomegalovirus (CMV) sólo crece en cultivos primarios de

pulmónfetal humano o bien en algunas cepas celulares derivadas del mismo

órgano y especie (MRC-5). Por otro lado, una línea celular como HEp-2 puede ser

bastante sensible a adenovirus, VRS, parainfluenza, herpes simples, poliovirus y otros,

pero no permitir el crecimiento de CMV, rotavirus, influenza, etc; además, es

posible que los pasajes sucesivos de una línea hagan disminuir su sensibilidad a algunos

virus, como sucede con Hep-2 en relación a VRS

Entre los sistemas de cultivo más utilizados tenemos:

a) Cultivos primarios: Se caract e r izan por tener var ios t ipos de cé lu las .

La mayor í a son de c recimiento l imi t ado in v i t ro , genera lmente

res i s t en 5 a 10subcultivos y son permisivas a un amplio rango de virus; p.

e., células de riñónembrionario humano (REH).

b) Cepas de células diploides: Derivadas de tejidos normales, se utilizan en la

producción de vacunas, aislamiento viral y como sustratos para probar materiales

tóx icos . Es tán cons t i tu idas po r un t ipo de cé lu l as que re t i enen su

númerocromosómico diploide original; p.e., los fibroblastos de pulmón.

c) Líneas celulares: Son células inmortalizadas en el laboratorio, resisten

(n)número de pases y se caracterizan por derivarse de tejidos normales o de

tumores malignos y se han pasado por los menos 70 veces in vitro; p.e., células

Vero (riñónde mono verde africano), LLC-MK2 (riñón mono rhesus) y

BSC-1 (también detejido normal de riñón de mono) y HeLa y HEp-2

derivadas de células humanasmalignas. Éstas generalmente tienen un

número variable de cromosomas y aveces también son denominadas

líneas celulares heteroploides. Otras líneas c e l u l a r e s e x i s t e n t e s

s o n A 9 ( f i b r o b l a s t o s s u b c u t á n e o s d e r a t ó n ) , B H K 2 1 (fibroblastos

de hámster), BRL3A (epitelio de hígado de rata), GHI, GH3 (epiteliode rata),

L929, LS, S180 (fibroblastos de ratón), L1210, L5178Y, P388D1 (linfocitosde

ratón), MCF7 (epitelio humano), 3T3-L1 (fibroblastos de ratón suizo), 3T3-

A31(fibroblastos de ratón BALB/c) y NRK49F (fibroblastos de riñón de

rata).

Algunos ejemplos de líneas celulares son:

48

HEP-2: Célu l as het eroplo ides humanas der ivadas de ca rc inoma

lar íngeo . Recomendadas para RSV y Adenovirus.

MDCK: Línea celular diploide de riñón canino; para Influenza y ocasionalmente

parainfluenza.

LLC-MK2: Línea celular heteroploide de riñón de mono Rhesus. Se

recomiendapara el aislamiento del virus parainfluenza. Requiere el agregado

de tripsinacristalina al medio.

MRC5: Línea celular diploide fibroblástica de pulmón embrionario

humano. Serecomienda para el aislamiento de citomegalovirus, herpesvirus.

Entre las líneas celulares que se emplean con más frecuencia están las células

Hep-2, HeLa y Vero, en cuanto a células diploides las más utilizadas son las líneas

de fibroblastos de pulmón (MRC5) que se usan para el aislamiento

decitomegalovirus (CMV). El cultivo primario más utilizado es el riñón huma

noembrionario (RHE) que es permisible a los virus de circulación frecuente como

el herpes (HSV), adenovirus (ADV), enterovirus, virus sincicial respiratorio (RSV) etc. En

todo caso la elección por una u otra línea celular dependerá del virus que se quiera

evidenciar.


1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.

2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.

3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o

pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca.

4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que

contengan hipoclorito de sodio al 1%.

5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular.

6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.


Material Biológico:

Huevos embrionados de 10 a 11 días.

Material de Laboratorio:

Estuche de Disección (estéril).

Matraz Tripsinizador.

Agar.

Tripsina.

Diversas Soluciones y Medios de Cultivo.

Pipetas

49

Placas y frascos.

Solución de Yodo alcohol.

Ampolla de estreptomicina y ampicilina.

Agitador magnético.

Solución de Hanks Completo (750 ml):

-Solución A: NaCl (80 g.), KCl (4 g.), CaCl2 (1.4 g.), MgSO2.7H2O (2g.): cada solución

que se va pesando se va diluyendo en 450 ml. H2O.

-Solución B: Na2PO4 (0 .6 g . ) , KPO4(0 .6 g . ) , g lucosa (10 g . ) , H 2O destilada

(450 ml.).

-Solución C: Rojo de Fenol 1% (16 ml.).

Hidrolizado de Lactoalbumina 5%

Suero fetal bovino.

Solución Buffer Fosfato (PBS): NaCl: 8 g, KCl: 0.2 g, Na2PO4: 1.15 g, H2O bidestilada:

1000 ml.

Procedimiento

1. Observar al Ovoscopio para descartar embriones muertos o defectuosos.

2. Colocar los huevos seleccionados sobre un porta huevos con la cámara de

aire hacia arriba.

3. Llevar los huevos a la cámara de flujo laminar (en el caso de la práctica,

entre dos mecheros).

4. Limpiar la cáscara en su mitad superior, primera solución de alcohol

yodado y después con alcohol.

5. Colocar las pinzas y tijeras en un vaso con alcohol y agua hirviente.

6. Con la tijera larga punta curva estéril recortar el casquete o la cáscara

correspondiente a la cámara de aire (las tijeras se enjuagan con el H2O

hirviente y vuelven al alcohol para volver a usarlas).

7. Coger las pinzas largas y con la punta retirar la cáscara rota así como la

membrana de la cámara de aire (esterilizar las pinzas para volver a usar).

8. Con las pinzas curvas, tomar al embrión del cuello y llevarlo a una placa

estéril (esta operación repetirla con todos los embriones).

9. Con una tijera (estéril) eliminar la cabeza, las alas y las patas; abrir el

embrión con un corte en cruz y retirar las vísceras.

10. Lavar con solución buffer fosfato por un par de veces.

11. Luego, empezar a cortar lo que quede del embrión en pedazos cada vez más

pequeños, hasta formar una especie de papilla.

12. Luego lavar los trozitos de carne en la placa por 2 veces con solución

Buffer Fosfato (PBS).

13. Luego, llevar al matraz Tripsinizador y se agrega tripsina 25%: 4 ml.

por embrión y se deja durante 10 minutos con movimientos giratorios, para

esto se pone en un agitador magnético. Esto se puede repetir 2 veces.

14. Transcur r ido es te t i empo e l sobrenadan te s e v i er te a un mat raz , se

guarda en refrigeración (previo agregar solución de PBS) .

15. Se vuelve a tripsinizar el sedimento, utilizando igual cantidad de tripsina.

50

16. Lo que se t i ene en ref r igeración , se pasa po r f i l t ro (capa de gasa

y algodón) a otro matraz.

17. El filtrado se centrífuga a 1 000 rpm por 5 min. luego se refrigera.

18. Se elimina el sobrenadante y se queda el sedimento.

19. Lavar las células con PBS y luego centrifugar a 1 000 rpm por 2 veces más.

20. Se resuspende en el medio de multiplicación (previamente se cuenta

células usando la cámara de New Bauer para obtener 2 x 10 células/ml).

21. Se recogen de 10 a 15 ml. y se lleva a una placa estéril, luego se agrega el

suero de feto bovino (estimulará el crecimiento).

22. Incubamos a 37°C.

23. Las células caen al fondo en la placa, se multiplican por el medio y llenan los

espacios vacíos y forma la monocapa.

24. Se elimina el medio de multiplicación.

25. Cuando se tiene la capa de células homogéneas, ya está listo para el

cu l t ivo y aquí s e ag rega se puede inocu lar e l v i rus (cuando es t a l a

monocapa recién se inocula el virus).

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1



Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.

5. ACTON, J. (1967) Virología. Edit. Interamericana. México D.F.

6. JAWETZ E., J. MELNICK, E. SDELBERG (1996) Microbiología Médica. 15ºedic.

Edit. El Manual Moderno. México D.F.

51





Práctica 10. Cultivo Celular (parte 2)

Introducción.

Los cultivos celulares son actualmente una herramienta elemental en el laboratorio de

Virología. El cultivo celular es un procedimiento “in vitro” en el que se cultivan las células

disociadas que se pegan a una superficie de vidrio o plástico. Se les provee de nutrientes de

acuerdo a sus exigencias para que puedan multiplicarse, el cultivo celular se maneja bajo

estrictas condiciones de esterilidad.

Básicamente hay tres tipos de cultivos celulares:

1. Cultivos primarios los cuales derivan de tejidos, se mantienen vivos por tiempo

limitado y resistente a dos subcultivos

2. Cultivo de células diploides resisten entre 50 y 70 subcultivos

3. Líneas continuas provienen de células diploides transformadas o de tejidos

neoplásicos como VERO, HeLa, Hep- 2 y KB que pueden ser cultivadas sin límite

aparente.

Objetivo.

El alumno realizará el subcultivo celular, con el conocimiento previo de las condiciones

generales que requiere un cultivo celular.

Fundamento teórico

Enders descubrió que los virus podrían desarrollarse en cultivo de células “in vitro” y esto

constituyó un hito fundamental en el desarrollo de la Virología. Los cultivos celulares

constituyen el método de elección para la replicación de la mayoría de los virus. El cultivo

celular consiste en mantener vivas en botellas o tubos con medios nutritivos enriquecidos

con sueros y antibióticos.

Hay tres tipos de cultivos:

52

Cultivos primarios se obtienen por tratamiento con tripsina de pequeños fragmentos de

tejido humano o animal. Las células disgregadas se lavan, se cuentan en cámaras de

Neubauer o cuenta de eritrocitos y se siembran en tubos cónicos o botellas de Roux,

adicionando medios nutritivos y antibióticos. Se incuban a 37°C, luego de pocas horas las

células se adhieren a la superficie del recipiente y se multiplican formando islotes, que van

cubriendo toda la superficie plástica hasta formar una monocapa.

Estas células pueden usarse para replicar virus e identificarlos, o bien para replicarse las

células y obtener nuevos cultivos. Esto se denomina pasaje o subcultivo. Los cultivos

primarios son altamente sensibles a la replicación viral, su mayor inconveniente es que las

células mueren después de pocos pases.

Cultivo de células diploides. Provienen de células de cultivos primarios que se conserva

intacta su morfología diploide, resiste hasta 70 pases, sin perder su alta sensibilidad a

muchos virus y son aptas para la producción de vacunas. Las cepas más usadas son la

MRC-5 (de riñon de mono Rhesus) y las WI-38 (de origen humano).

Líneas Celulares. Denominadas líneas inmortales porque pueden replicarse de manera

ilimitada. Las hay de origen normal como las células VERO provenientes de riñón de mono

verde africano y las de origen neoplásico como las HeLa derivadas del carcinoma de cérvix

o Hep-2 provinientes del carcinoma de laringe. Se usan para aislar el virus de la polio,

Herpes, Rubéola, Sincitial Respiratorio, Adenovirus, etc. Sin embargo su sensibilidad es

más limitada.











Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta

(Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO)

Medio de Eagle 20X

Agua tridestilada y desionizada estéril

Suero fetal de ternera frasco de 100mL

53

Amortiguador de bicarbonato al 4.4%

Matraces de Erlenmeyer y pipetas estériles

Solución de antibióticos (penicilina/estreptomicina)

Solución de fosfatos

Microscopio invertido o invertoscopio

Incubadora de CO2

Procedimiento


1. ¿Qué condiciones fisicoquímicas son necesarias controlas en el desarrollo de un

cultivo celular?

2. ¿Qué diferencia hay entre un medio de mantenimiento y uno de crecimiento?

3. ¿Cada cuánto debe cambiarse el medio nutritivo a un cultivo celular y por qué?

4. En un cultivo celular ¿A qué se le denomina inhibición por contacto?

1. Prepara el medio de Eagle de crecimiento

y el de mantenimiento

2. Descongelar y resuspender las

células RD o Hep 2c en 5 mL de

Medio

3. Incubar A 37°C por una hora 4. Observar en el microscopio invertido el

porcentaje de células sedimentadas

5. Eliminar el medio y colocar nuevamente

10 mL e incubar toda la noche a 37°C

6. Observar el cultivo a las 24, 28 y 72

hrs hasta la formación de una

monocapa confluente.

8. Posteriormente el cultivo celular se inoculará con un

virus para demostrar el efecto citopático

54

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1



Edición. Editorail Masson. S.A. Barcelona.

55





Práctica 11. Conteo Celular

Introducción.

Para obtener monoesteratos reproducibles, los tubos o frascos deberán ser sembrados con

un número regulado de células o de una concentración celular determinada. Las células se

deben contar con el hemocitómetro y usando un colorante vital se pueden diferenciar las

células viables de las no viables.

Objetivo.

Realizar el conteo de células a partir de un subcultivo celular, determinando el número de

células viables por mililitro.

Fundamento teórico

Las propiedades de las células de adherirse a superficies adecuadas están condicionadas a la

presencia de iones de Calcio (Ca) y Magnesio (Mg). En los subcultivos el monoesterato se

puede desprender usando un agente quelante, el cual actúa retirando los iones Ca y Mg, con

lo cual se liberan las células de la superficie a la cual se hallan adheridas.

El monoesterato celular es dispersado con EDTA y tripsina, ya sea por agitación manual de

la suspensión celular durante 10 minutos o usando un agitador magnético, procediendo al

conteo celular.

El cultivo celular permite realizar subcultivos para obtener nuevas generaciones de células

disponibles para su uso inmediato o como reserva conservándolas en criogenia.

De acuerdo al nivel y equipamiento con que cuenta el laboratorio, el conteo celular puede

realizarse ya sea mediante un contador electrónico o de manera manual. El contador

electrónico de células es un instrumento capaz de medir y contar partículas en suspensión,

consta de dos electrodos que transmiten al equipo de amplificación y análisis, los cambios

de resistencia que detectan, cada vez que una de las células en suspensión los cruza. La otra

manera de realizarlo consiste en el uso de un hemocitómetro, usando un colorante que

permite diferenciar las células viables de las no viables.

56











Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta

(Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO)

Medio de Eagle 20X

Colorante azul de Tripán

EDTA

Tripsina

Pipetas Pasteur estériles

Hemocitómetro o Cámara de Newbauer

Campana de flujo laminar

Mechero

Contador de Colonias

Procedimiento

1. Observar en el invertoscopio la botella

con el monoestrato celular para verificar

viabilidad y confluencia celular.

2. En campana de flujo laminar y con

mechero, abrir la botella y decantar

el medio de cultivo.

3. Agregar 2 mL de la solución de

tripsina- verseno a la botella e incubar a

37°C

4. Observar periódicamente hasta

desprendimiento de la monocapa.

5. Adicionar 1 mL de medio por cada

integrante que vaya a realizar la

práctica.

6. Agitar vigorosamente con la pipeta

para disgregar perfectamente las células

Nota. Este paso debe realizarse rápidamente y por una

persona porque las células se unen formando coágulo y

se pierden.

57


1. ¿Qué función desempeña la solución tripsina-verseno en el cultivo celular?

2. ¿Por qué se tiñen las células no viables?

3. ¿Qué Dimensiones tiene un hemocitómetro?

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1




7. En un tubo estéril colocar 0.8 mL de

suspensión celular y añadir 0.2 mL de

azul de Tripán disuelto en soln. salina

al 0.85% se Teñirán las células no

viables

8. Dejar reposar 3 minutos y llenar

la cámara de recuento.

9. Observar al microscopio y se cuentan

los cuatro cuadrantes primarios de las

esquinas de la cámara.

10. Realizar los cálculos necesarios

58





Práctica 12. Titulación Viral

Introducción.

El desarrollo de la replicación viral, es decir, la amplificación del virus inoculado en el

cultivo, puede identificarse por diferentes procedimientos. Todos ellos tienden a detectar

las modificaciones producidas en el cultivo por efecto de la replicación viral (efecto

citopático). Muchos virus se replican produciendo alteraciones de la monocapa celular, que

pueden observarse directamente en el microscopio invertido y estas alteraciones pueden ser

las formación de sincitios o células gigantes multinucleadas, inclusiones en el núcleo y

citoplasma, redondamiento de las células, lisis o necrosis.

Objetivo.

Que el alumno utilice el cultivo celular como medio de multiplicación del virus de la

poliomielitis y determine el título viral a través del efecto citopático generado.

Fundamento teórico

La detección de los virus en cultivo celular y la replicación viral en un cultivo permite

identificarlo por las alteraciones producidas en las células, el cual es denominado efecto

citopático o acción citopatogénica, estos pueden ser observados en un microscopio

invertido, sin necesidad de efectuar alguna otra coloración.

Por ejemplo el virus de la poliomielitis y los herpesvirus producen redondamiento de las

células y desprendimiento de la monocapa. Por otra parte existen virus que tienen en su

envoltura proteínas de fusión como el virus de la influenza y el virus sincitial respiratorio

los cuales inducen unión de las células vecinas formando sincitios (células gigantes

multinucleadas). El efecto citopático también se manifiesta por cuerpos de inclusión que

pueden ser intranucleares, intracitoplasmáticos o ambos.

Algunos virus se replican en los cultivos celulares sin producir efecto citopático visible al

microscopio, sin embargo como producto de la replicación liberan al medio de cultivo

proteínas virales como las hemaglutininas, que pueden ser detectadas por otros

59

procedimientos. El recuento de placas en agarosa (plaqueo) también se puede emplear

como técnica de identificación viral, ya que se pueden cuantificar los viriones presentes en

el inóculo, por medio de unidades formadoras de placa. Para los virus replicables en cultivo

celular, que no producen placas, se utilizan las pruebas de punto final o dilución, que

permiten determinar en forma aproximada la cantidad de virus presentes en una muestra.








5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo

celular.



Equipo de microtitulación

Microplacas de 96 pozos de fondo en U

Microdilutores de 25 L

Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L

Puntas para pipeta automática estériles

Antígeno (virus polio vacunal)

Medio Eagle

Botellas de Roux con monocapa confluente entre el 80 – 100%

Solución de antibióticos (penicilina-estreptimicina)

Invertoscopio

Incubadora de CO2

Mechero

Marcador de tinta indeleble

60

Procedimiento


¿Qué caracteriza a una línea celular definida?

4. Menciona tres líneas celulares usadas para el aislamiento viral diferentes a las que

se mencionan en este manual.

5. ¿Qué significa en Virología Titulación?

1. Con el cultivo de células RD o Hep 2c

con el 100% de Confluencia

2. Desprender las células con

tripsina-EDTA

4. Ajustar a 1000000 de células /mL 4. Realizar el conteo de células viables en

cámara de Neubauer

5. En una microplaca de 96 pozos

colocar 25 L del medio Eagle de

crecimiento.

6. Adicionar 25 L de virus vacunal de

polio en los primero tres pozos.

7. Realizar las diluciones seriadas del virus de arriba

hacia abajo, es decir, de la fila A a la H con la pipeta

multicanal ajustada a 25 L, se hacen las diluciones de

la primera a la última hilera

8. Adicionar 25 L de la suspensión celular en

cada pozo

9. Se cubre la palca y se incuba a

37°C

10. Observar a las 24,48 y 72 hrs. Las

alteraciones citopatogénicas o efecto

citopático en la monocapa.

61

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1




62





Práctica 13. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola

Introducción.

La Rubéola es una enfermedad infantil de síntomas benignos, caracterizada por un

exantema generalizado, sin embargo, la rubéola en pacientes gestantes, puede asociarse con

graves complicaciones congénitas, como pueden ser ceguera, sordera, defectos cardíacos o

retraso mental. La evidencia de infección puede fácilmente obtenerse por serología

mediante la prueba ELISA específica.

Objetivo.

Determinar anticuerpos del tipo IgG o IgM contra Rubéola mediante la aplicación de un

inmunoensayo.

Fundamento teórico

La inmunidad adquirida contra el virus de la Rubéola se mantiene durante un largo tiempo,

frecuentemente durante toda la vida del individuo, ya que existe un solo serotipo. Las

mujeres en edad fértil deben vacunarse al menos 3 meses antes de embarazarse contra este

virus. Su control debe ser parte rutinaria de la asistencia prenatal, ya que el mayor riesgo de

padecer alteraciones en el feto, es más común durante el primer trimestre de gestación.

Las manifestaciones clásicas son: exantema maculopapular de inicio en cara, presencia de

linfadenopatías de localización post auricular, que aparecen antes del exantema y perdura

por más de una semana, febrícula y ocasionalmente aparecen complicaciones de vías

respiratorias altas. En los adultos son frecuentes las manifestaciones articulares como las

artralgias.

Numerosos métodos se han desarrollado para realizar el diagnóstico, la inhibición de la

hemaglutinación fue el primer método utilizado y es el considerado estándar por la

Organización Mundial de la Salud, la prueba es fundamentada en que los antígenos

glicoproteícos de superficie inducen anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación.

La evidencia de infección puede obtenerse por serología, mediante ELISA específicos el

empleado en esta práctica es inmunensayo en fase sólida. En la madre infectada los

63

anticuerpos anti- Rubéola tipo IgM o IgG aparecen poco después del comienzo de los

síntomas. En neonatos los anticuerpos IgM pueden persistir durante más de un año y son

indicativos de infección congénita.


1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.

2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la

práctica.

3. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes

que contengan hipoclorito de sodio al 1%.

4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de

la paciente.



Micropipetas de volumen variable

Puntas para micropipeta, Gradilla, Tubos de ensaye, Muestra de suero por equipo

Kit comercial para detectar IgG anti- Rubéola el cual debe contener

Controles positivo y negativo

Amortiguador de dilución de la muestra

Conjugado

Cromógeno

Solución de lavado

Solución de paro

Placa de reacción

Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 nm y 620

nm

Procedimiento

1. El procedimiento dependerá del kit

comercial que se disponga y la marca.

2. Cada integrante del equipo deberá

anotar en su bitácora el procedimiento

previo a la práctica.

3. Solicitar el inserto del kit al técnico

del laboratorio. 4. Preparar los reactivos necesarios y solicitar

las micropipetas adcuadas

5. Cada equipo deberá colocar su

muestra de suero en un tubo rotulado

en una gradilla.

6. Comparar los resultados obtenidos con

la guía de referencia del kit y controles,

anotar observaciones y concentración

obtenida de anticuerpo anti- Rubéola.

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1. Defina los siguientes términos

Artralgia

Artritis

Enfermedad congénita

Enfermedad teratógenica

2. ¿Qué tipo de inmunoglobulina se denomina de memoria?

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1




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Práctica 14. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus

Introducción.

Los citomegalovirus (CMV) es un virus con ADN de la familia de los herpesvirus, son

agentes infecciosos muy comunes en el humano ya que infecta a la mayoría de las personas

en alguna fase de la vida, el 80% de la población adulta en todo el mundo cuenta con

anticuerpos contra CMV, presentando una infección subclínica persistente, la infección es

asintomática, pero puede causar serias complicaciones; infección en el primer trimestre del

embarazo conduciendo a anormalidades en el feto y en pacientes inmunodeficientes.

Objetivo.

Determinar anticuerpos del tipo IgG anti -CMV Rubéola mediante la aplicación de un

inmunoensayo.

Fundamento teórico

La infección por CMV es especialmente grave en dos tipos de casos:

1. En pacientes inmunocomprometidos o inmunosuprimidos ya que pueden presentar

infecciones recurrentes, las cuales, se asociación con complicaciones como

neumonías, hepatitis, corioretinitis, así como la co-infección con el VIH.

2. En los recién nacidos la infección por CMV es la causa más importante de

malformación congénita, los neonatos infectados por vía transplacentaria,

desarrollan infección de inclusión citomegálica que es la responsable del 1% de

todas las muertes neonatales y la causa más importante de microcefalia.

El diagnóstico para detectar CMV puede realizarse por aislamiento del virus a partir de

orina y secreciones orales o genitales en cultivos de células diploides, el efecto citopático

llega a retardarse entre una a tres semanas. La detección de antígenos virales mediante

anticuerpos posibilita un diagnóstico rápido. El hallazgo de conversión serológica de los

títulos de anticuerpos detectados por el método de ELISA indica infección reciente. La

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determinación de anticuerpos IgG anti CMV, es utilizada para establecer el contacto previo

con CMV.


1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.




4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de la paciente.



Micropipetas de volumen variable

Puntas para micropipeta

Gradilla

Tubos de ensaye

Muestra de suero por equipo

Kit comercial para detectar IgG anti-CMV el cual debe contener

Controles positivo y negativo

Amortiguador de dilución de la muestra

Conjugado

Cromógeno

Solución de lavado

Solución de paro

Charola de reacción

Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 y 620 nm

Procedimiento inmunoensayo indirecto en fase sólida

1. Preincubar la charola de reacción 3

hrs. Antes de iniciar a temp. amb. o a

37°C durante 30 min.

2. Prediluir las muestras y controles (10

L de muestra o control + 100L de

diluyente.

3. Agregar 25 L de muestra y controles

prediluidos en la fila A de la charola y

mezclar.

4. Insertar el peine en la fila A, agitar e incubar

por 30 minutos, retirar el peine y absorber el

líquido adherido a los dientes.

5. Perforar la línea B, insertar el peine,

mezclar e incubar por 2 minutos,

retirar el peine y absorber el líquido

adherido a los dientes.

6. Perforar la línea C, insertar el peine,

mezclar e incubar por 20 minutos, retirar

el peine y absorber el líquido adherido a

los dientes.

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1. Defina los siguientes términos

Inmunoensayo indirecto

Perinatal

Postnatal

Corioretinitis

2. ¿Qué tipo de inmunoensayos se pueden emplear para diagnóstico virológico?

Observaciones

Bibliografía



médica Vol. 1




7. Perforar la línea D, insertar el peine, mezclar

e incubar por 2 minutos, retirar el peine y

absorber el líquido adherido a los dientes.

8. Perforar la línea E, insertar el peine,



los dientes.

9. Perforar la línea F, insertar el peine,



los dientes.

10. Incube el peine por 1 minuto en la línea E,

y seque al aire.

11. Realice la lectura en las áreas

sensibilizadas del diente 12. Deseche correctamente los RPBI.

MANUAL DE LABORATORIO virología

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