Kinetic Analysis of the M1 RNA Folding Pathway

7
COMMUNICATION Kinetic Analysis of the M1 RNA Folding Pathway Oliver Kent 1 , Steven G. Chaulk 2 and Andrew M. MacMillan 1 * 1 Department of Biochemistry University of Alberta, 4-74 Medical Sciences Building Edmonton, Alberta, T6G 2C6 Canada 2 Department of Chemistry University of Toronto, 80 St. George St., Toronto, Ontario M5S 3H6, Canada The biological activity of large RNAs is dependent on the formation of complex folded structures that determine function. Typically the creation of such structures requires divalent magnesium and in many cases the folding process takes place over the course of several minutes. It has been proposed that the folding paths of large RNAs proceed through dis- crete intermediates but the nature of these intermediates is not known in most cases. Here, we describe our studies on the folding of the M1 RNA sub-unit of Escherichia coli RNase P. We performed kinetic footprinting studies of M1 RNA folding with the chemical footprinting reagent perox- ynitrous acid to provide a detailed description of the folding pathway of RNase P RNA. Our results indicate that, in contrast to the Group I ribo- zyme, the M1 RNA folds into its catalytically active structure through the formation of two separately folded domains and that the folding of each proceeds through a discrete series of intermediates. Similar rates of fold- ing were observed for regions believed to form the interface between the two domains. This observation is consistent with a kinetic trap which occurs by interaction of the domains during folding. # 2000 Academic Press Keywords: RNase P; M1 RNA; peroxynitrous acid; kinetic footprinting; RNA folding *Corresponding author M1 RNA structure and the RNA folding problem RNase P is the essential and ubiquitous endonu- clease required for the maturation of the 5 0 end of precursor-tRNAs (ptRNAs). Although the activity consists of both protein and RNA components, in some cases the RNA alone is suf®cient for site- speci®c ptRNA cleavage (Guerrier-Takada et al., 1983; Altman et al., 1999). For example, the RNase P activity from Escherichia coli is a complex of the M1 RNA and C5 protein but, in the presence of high concentrations of either divalent magnesium or salt, M1 RNA alone is able to ef®ciently cleave ptRNA (Guerrier-Takada et al., 1983). The RNA components of E. coli RNase P, and the related RNA from Bacillus subtilis, are large molecules (377 and 401 nt, respectively) that require divalent magnesium to fold into their active structures and are therefore good model systems to study RNA folding. The secondary structure of M1 RNA, predicted on the basis of phylogenetic comparisons (James et al., 1988; Westhof & Altman, 1994; Massire et al., 1998), contains a series of paired (P) and joining (J) regions (Figure 1(a)). In addition, a number of ter- tiary interactions have been predicted based on phylogeny and cross-linking experiments (Massire et al., 1998; Chen et al., 1998; Figure 1(a)). M1 RNA of RNase P may be subdivided into two individual domains (Domain 1 (D1) and Domain 2 (D2); Figure 1(a)) which are analogous to the two domains of the related B. subtilis RNA. One of these domains, D2, contains the active site. Iron- EDTA footprinting experiments of Mg 2 depen- dent structure formation have suggested that the two domains of M1 RNA can fold independently (Loria & Pan, 1996; Pan et al., 1999). It has also been shown that separation of D1 and D2 in the B. subtilis RNA enables D2 to escape a kinetic trap in the overall folding of the RNA; separation of D2 from D1 speeds the overall folding of the former by >100-fold while the folding rate of D1 increases 15-fold (Loria & Pan, 1996; Fang et al., 1999; Pan et al., 1999). The formation of tertiary folded structure in M1 RNA and the catalytic sub-unit of B. subtilis RNase P have been explored using oligonucleotide hybridization/RNase H cleavage, ¯uorescence, and CD spectroscopy (Zarrinkar et al., 1996; Fang E-mail address of the corresponding author: [email protected] Abbreviations used: D1, Domain 1; D2, Domain 2; pt RNA, precursor tRNA. doi:10.1006/jmbi.2000.4263 available online at http://www.idealibrary.com on J. Mol. Biol. (2000) 304, 699±705 0022-2836/00/050699±7 $35.00/0 # 2000 Academic Press

Transcript of Kinetic Analysis of the M1 RNA Folding Pathway

��������������� ����� �� ��������� ������ �� ������������������������ �� �� ���� ����� � ���� '()� ��� !�"

�������������

������� ������ � ��� �� ��� ������ ������

����� ������ ������ �� ��� !" ��� ������ �� ��������#

����������� �� ������������������ �������� �������� �� � ��� �� ��������������� �������� !" #$!$���������������� $������������������ ���� %& ��'"���� ��'� ���� (������)� *+!� $�����

< ��� ������� �� �� ���������������!��������D����� ����

�������� ���� ����C ;�# ;��������# ��������� ����

++�� �23>@++@+-+>11E6 F3-�++@+

��� ������� �� ��� � �� ��� ���� �� �������� �� �� ����� ��� �������� ����� � ��� ���� �� �� ������ ���� ���� ������� �� ���� ����� ���� � ��� ���� �������� ������ �������� ��� �� ���� ����� ������� ������� ���� ���� ���� �� ������ �� ������ ���� ��� � ������� �������� �� �� ����� �� �� �� ��� ���� ������� ����� ��� ��� � �� ������� �� �� �� �� ��� �� ���� �� ������� �� �� �� ���!� ����� ������ "���# !� �������� ��� � ����� �� �� ����� �� �� $� ������ ��� �� �� ���� ��� �� ����� %� &� ��������� ���� �� ��� ���� ��� ����� �� $� ��� ����� !� � �� ������� ��� ���� �� ����� ����� ��� ���� ���� � ������� � �� ���� ������� ��� �� �� ����� �� �!�� ������� % ���� '�� ���� � ������ � �� # �� ��� ��� � �� (���� � ���� )���# �� $� ��� ���� �� � � � �� �� ���� �� ��� � ��� ��� ����� ������� ��� �� !� ������ �� ����� ������� ��� �� �� ����� �� ������������ ����� � ������ � ������ �� �� ������� ��� *����� �� �� �� ��� �� !��� �������� ��� ������ ������� � ���� �� �� ������ �� !��� �� !� �������� ���� ������� ��� �� ������ �� !� � � ���� �� ��� !���������� �� �� ���� ��� �� �� ������� ����� ������

� �+++ �������� %����

,��-���. ����� %, $� ���, �������� ���� ����, ���� �� ��� ���� ��,��� �����

/$���������� �����

�� ��� ��� �� �� ��� ��� ��� ����� $��%�&

����� % �� �� ����� �� ��� ������ ��� ������ ����� �������� ��� �� �� ��� ��� �� �� -� ��� ����������� ���� .� ����/� � ���� �� �� ��� ������� � �� �� � ��� ��� ��� ��� �������� �# ������ ����� �� ��� ���� �� ���0���� ��� �� � �����0� � ��� ������ .(������� ������ �� ���#�123, � ��� �� ���# �111/� 4�� ������# �� �����% �� ��� � ���� �� ���� ��� �� �� � ������ �� ��$� ��� ��� 5- ��� ��� �� # �� �� �������� ����� ������ �� ���� �� �� ��� ������ ���������� �� # $� ��� ���� �� ��� � ��0���� � ������ ��� .(������� ������ �� ���# �123/� ��� ����������� � �� �' �� ����� %# ��� �� ��� ����� ���� �� ����� ��������# ��� ��� �������.366 ��� 7+� � # ������ ����/ �� ������� ������ �������� � ��� �� � ���� �� ��� � ��� ���� ������ �������� ��� ���� ��� ��� � � ��� ���������

��� ��������� � ��� ��� �� $� ���# ������ ���� �� ����� �� ������� �� ����������� .8����

�� �� ���C

�, ;�# ;����� �, �

�� ���# �122, &�� ��� 9 � ���# �117, $������ �� ���#�112/# ��� ���� � ������ �� ������ .%/ ��� :����� .8/������ .4���� �.�//� �� ���� ���# � ������ �� �� ���� �� ���� ���� ���� ���� ������ �� ����� ��������� ��� ����� ����� ��������� � .$�������� ���# �112, 5��� �� ���# �112, 4���� �.�//� $� ����� ����� % ��� �� ���������� �� � !� ���������������� .;����� � .;�/ ��� ;����� � .;�/,4���� �.�// !���� ��� ������� � �� !�������� �� �� ��� �� �' �������� ���� '�� �� ���� �������# ;�# ��� ���� �� �� ��� �� �� ���� <;�� ��� ���� �� ��������� � �� $�� ����� ��� � ��� ��� ����� ��� ���� ���� �� �� �� !� ������� �� $� ��� ��� ��� ���������� �.=���� 9 %��# �11>, %�� �� ���# �111/� � ��� ������� ���!� �� ������ ��� �� ;� ��� ;� �� ���' �������� ��� ������ ;� � ������ � ���� �� ����� �� ����� ����� �� �� ���, ������ ��� �� ;����� ;� ������ �� ����� ����� �� �� �������� ?�++ ��� !��� �� ����� �� � �� ;� ����������- ��� .=���� 9 %��# �11>, 4�� �� ���# �111, %���� ���# �111/�

��� ����� ��� �� �� ���� ����� � ��� ��� �� $���� ��� �� �� �� �� ��� ��� �� �' �������� �����% ���� ���� ������� ���� �������� ����������)� ���@����� " ������# A����������#��� 5; ���� ������� .B�������� �� ���# �11>, 4��

� �+++ �������� %����

������ �� .�/ *�������� � ��� ��� �� $� ��� ���!�� �� !� ������� ��� �� ���� � ��� ��� �� ���� ����.�� !��� ��� ������� ������/ �������� �� �� ����� ��������� .�� �� $������ �� ���# �112/� .�/ <��������� ����� ����� �� �� �������� �������� ����� � 36 �5 �� �� $� ��� ���� �' �� �� � ���� ��� �� ���.%�� �� ���# �111/� ��� ����� �� � �� ��� ����� !���� ������� �� �������� �� �� �� �� �� ��� � �� ����� �� � ���� ��� �� ��� ���!�� �� ���� ��� ��$�� � ����� ���� ����� 4���� ��� �� �� 1 ���� �� �� ����� �� �� ������� �� ���� �� �� $� ��� ������� �� � � ��� !��� �������� �� �6 ��� ��� �������� ��� ���� 20� ���� �� ������� �8��� ��� ���� �� �� ��� %�� ������ !�� ��� ����� ���� I� 3�%J��%.�<�/ ��� �7 �������� ��� ������ ��� ��� �� �� ���� �� ��� �� �� ����� �� � �� $� ������ ����� � .�+ �/���� � ����)��� � ��� ��� ��� .�+ �$ ����)���#��+ �$ K5# �- �$ $5�# -+ �$ ��"�%'7@���"%'7 .�" 6//# !��� �������� !� � ����� � .�+ �#� � �+- ���/ �� � ���� �� � � ��� ��� ��� .- �$ -� �������� ���� �� �# -++ �$ K5# �++ �$ $5�# -+ �$

!�� ����� ��������� �� �� �����

�� ��'� �111/� '������� ��� �������)� ���@�����" ������ !�� ������� �� &������� ��� �� !������ � ������� �� ����� �� ����� % �������� �� � �' �� ��� �' �������� .B�������� �� ���#�11>/� ����� � ����� ���� �0�� � � ���� � �� ������� ��� �� �� ����� � ��� ��� �� �� � �������� �� �� ����� ��� �� �� %> ����� �����.4���� �.�//� 4���������� ��� 5; � ����� �� ������� �� �� ������ ������� � $� ��� ;����� �' �������� ����� % ��� ���� ���!� �� �� !� ������� �� ����� % ��� ��� ��� ������� ��� �� �� ���� ���# � ��� ���� ���� �� �� ��� ��� � �� ������� �� ��� ������� �� �� ����� ����� � 0�� �� ��� � ��� ��� � ���� �� ���� �� ����� ���� �� ������� �� ������� ������ .=���� 9%��# �11>, 4�� �� ���# �111, %�� �� ���# �111/� ������� � ������� � ���� ����� � ��� ��� �� ������� �� $�# !� ���� ��������� ���� �� ��� ���� �� ��������� � �� $� ����� ���� ���� !� ��������� ���� ����� ����� � ����� ������ �� ��� �� �� � �� ��� $� ��� ���� ����0��� ������ ����� �� !��� � ��� �� ����� �� � �� �� ���������� �� ����

����� !������� � �� ��� �����

G����� �������� �� ����� �� �!�� �� �� $����# !� �� ������� �� ����� ����� �� � ���� �� ��������������� �� ��� � �� $� .4���� �.�//�� � ������� �� �� ����� �� ��� ����� $� ��� ��� �� � ���� ��� .%�� �� ���# �111/� &� ��� ����)��$� ��� �� �6 ������ �������� ��� ���� �� �� ������ �8��� ��� ��� �� �� ��� ����� �� ������ ��� �� �������� ������� � � 0�� ������ �� ��� �� �- �$� &� ����� � 3�% ����� $���� ���� �� �# � ������ ���� �' �� � �� ��� �� ���� ��� � ������� ����# ��!�� ������ ������ ��� �+ �������# ��� ����)�� �� ���� � ������ ���� %�(<� H���� ���� ����� ����# ������� �� ��� �� ���� ����� �� ���� ��� ����� ��� �������� � �� ����� �� ��� ����� �� �� ������� �� ���� �� �� ��� ��� ��� �� �������� !�� �� ������� � �� ��������� �� ������� �, 0 �� ��� �� � � � 0�� ����� �� ����� ��� ��� � �� � ���� �� ��� �����# 0�#�� �+�+� ��� .4���� �.�//# !���� ����� !� �

��"�%'7@���"%'7 .�" 6// � �� ����� �� ���� �� �!�� $5� ���� ��� � �� ����)��� � ��� ��� �������� ���� ��������� ��� �+ ������� ������ ��������!� � �� ���� ����� �� � �� ��� ��� .�++ �$���<;��# >�7 $ ����# +�7 �@� ���������� ���#+�7 �@� ����� ������# +�7 $ ���� ����# +�7 $ ���������/� ���� ���� !��� ��� ���:�� �� � ���� ���� �- L.�1C�/ %�(< ��� ��- ����� � 6- &� (�� !��� ������� � � $������ ;������� %������� *����� �� !�� ��� ������� �� � $������ ;������� * ��� 2>+ %��� ���������� <� �� � �� ���� ��� !��� ���� �0�� .���� M��� -�+/ ��� � �� �� ������)�� �� �� �� ���� ��������� ����� ��� !�� 0 �� � � 0�� ����� ������� ��.(��4� 3�++/ ���� �� � ���� ���� ��������� ��

��� �� �� �� �� ����� ��� ������ �� $� ����������� ���� �������� ���� ���� �� � ���� �� ��� ���� �� �����

����� � ����� ���� ��� �� �� �� � .���/�

%7 >2 6� +�+>%- 67 6> +�+6%>.-�/ 27 +�+7%6 2> 1+ +�+>%2.-�/ 1- +�+6%2.3�/ �+� �+3 +�+>%1 �+2 ��+ +�+>=1 ��3 ��- +�+-%�+ ��+ ��� +�+6%�� �77 �7> +��6%��� �67 �6> +��>%�3� �17 �1> +��+8�3@�7� �+� �+7 +�+3%�7� ��7 ��6 +�+�%��� ��1 �3� +�+-%6� �7+ �7� +�+7%>� �6� �6> +�+�

-� ��� ����� $� ����� 3� ��� ����� $� ����� H���� ��� ��� �� �� �� ��� ��� � ������ ����� ��� ���� ��

����� �� �����

����� ��������� �� �� ����� !��

��������� ����� �� ���� � ��� �� �� � ���� �� ������� ��� �� ��� �� �' �������� ��� .%�� �� ���#�111/�

������� ���$������� � �� ��� ����$���*����� � ����

H��� ����� �� ���� �� � ���� �� ���� � ��� ����# ������ ������ ��� ��� �� �� ���� ������������� ������� ������, �� ��� �� �� �� NN��� ���� ��OO ������ ��� ������ ��� �� �� ����� � � ��� �� ���� &� �� ������� �� ���������� ��� ���� �� ����� $� ��� �� ���:�� �� �� �������� ��� ����� ��� � ������ !� � ��������� ������ ������ �������� ���� ���� .K���� ��'� �11�# �113, 5���� 9 $��$���# �+++�#�/���!�� �� � ���������� �� �� ������ �� ������ ����� �� �� � ������ &��� ���� ��������� �!��� ��������� !� � �� � -� ��� 3� ��� ���������# �� ���� �� �������� �������� ��� �� ��� ������ �� !� � �� ����� ��� �� � ������ ��� ��� ��� ������ �� !� � �� ���� � �� ���� <;�� ��� ���� �� .=���� 9 %��# �11>/ !����������� .�� � �� ���!�/� ��� ��� ��� ��� �� ��������� ���� -+ 1+ L ��� !��� ����� ������� �� �������� �� �� $� ����

�� ����� � ������� � ����� �� �� �������� ��$� ����� !� ���� ��� �� �� ���� �� ��� ���� �������� ��� �� �������� ���� ���� .5���� 9$��$���# �+++�#�/� ���� ����� �� ��� ��� ��������� ��� ��� � ��� �� �" ��� ������������� �� ������ � ������� ������� ��������� �� ���� �������� ��� ��������� ��� ��������� ����� �������� !� � � ��� ��� �� ��������� ����� ������ � �" 6� ���������# �������� ���� ������ ��� ��� ��� ��� �� ������� �� NN���� ��OO ��� ���� �� � ����� ��� ��� �� ���� � � ��� ��� ������ !� � ��� ���� �� �������� �� ����������� �� ��� ��� 4�� ������# !� ���� ��� ������ � ��)�� �� ����� � ����)� ���� � �� �� ����� �� �!�� �� �� (���� � ����)���!���� ��� ���� !� � ��� ���� ����� ���� ���� � 3+ ������� .5���� 9 $��$���# �+++�#�/� ����� ������ �� �� �������� ���� ���� �� � ��� ������� ��� ��� ��� �������� �������� � ��������� ����� �� � ���� �� ����� � &� �������� � ������ ���� �� �� ������ �������� �� � �� ����� ����� �� ���� ���� ���!�� �� ����0�� ��� !� � �� ������ ��������� .K�� �� ��'� �11�# �113, 5����9 $��$���# �+++�#�/� "������ ������ ����� ������� ��� �� ��� �� �� �� ����� ���� ��� �� ������������ � ���� ���� �������� � �" 6�

&� ������� �� ���� �� ��� ���� �� � ����� !� ��� � -� ��� 3� ��� ����� $� ���� &� ��� �� ������� �� -� ����� $� �� ����� ������ �� ������ � ����� ���� ���� ���!�� �� ������ ��� �� �� ������ �������� �� � � ������� ����� ���� ���� !��� ���� �� �� ������� � ������ ����)�� �� ���� ���� %�(< .4���� �.�//��� !�� �������� �� ���������� ��� ���� �� ����� ���� �# ���� !��� ������ �� ����0��� ��� �� ����������� ���� ����� �� �� $� ���� ������ ���# � !�� ���� �� �� ����� �� ��� �� ���

!�� ��� �������� ��� ������ �� �������� �������� �� ���� �� ����� � ������ �� ������� ��� ��������� ���������� �� ���� ��� �� ����# !� ���� �0�� ������� ���� �����0� ������ ��� �� �� ���� �� � ���� ��� �� ��� ��� ��� �� ��� ������ ���.5���� 9 $��$���# �+++�#�/� ������� � 0�� ����� �������# !� 0 ���� �� � � � 0�� ������������ �� � ���� �� �� ��� ��������� ��� �� ����.4���� �.�/ ��� ���� �/�

�� � ������ !��# !� �������� 3� ��� ����� $���� ��� ������� �� ���� �� ��� ���� �� ����� ���� � �� �� ����� �� �!�� ���� �������� �������� �� ��������� ����� .4���� �.�//� '��� ����#� ������ �� ��� �������� ��� �� ���� !������������ &� ���� �0�� ���� ��� �� ���� �� ����� ��� �� ��� ��� 0 �� �� � � � 0�� ������������ �� .4���� �.�// � ��� �� � ���� �� � ��� �� ��������� ��� �� ���� .���� �/�

+&$�������� � !������ ���$����� �� ��� ����� ����� $���

��� ��� �� ���� �������� �� ��� � ��� ��������!� � �� � ���� �� � ����� ���� +��+ +�+� ���

!���� ���������� � ��� ���� �� ��� �� ��� ��� �� ���� ���� � 3- ������� .���� �/� *���� ��������� � ���� �� ��� ���� � !��� ���� �0�� ���������� �� �� $� �������� .����� ��� �� �� ���� -���� 3� ���� �� �� ���, 4���� � ��� ���� �/�K��� ��� �� ��� �� ��� �� �� %> ���� ��� �� ���������� !� � �� � �� ����� ���� �������� ����������)� ���@����� " ������ !���� !�� ���� � ������� � � � ���� �� $� ����� .B���������� ���# �11>/�

��� ���� �� ��� ���� � �� $� ����� �� �� � ��� ��� ������ ��� ��� �� ������ �� ����)�� ��

������ �� .3����� ������/

����� ��������� �� �� ����� !��

��� # ������# ��� ��! ���� � .4���� 3/� ������������ ���� ���� ������ ���� ��� �� � �� ������� � �� �� $� ��� �� !� �� �� �� ��� �� ��0�� �� ���� � ��� ���� ��� ������ ����� ���� ��������� ���� ������ �� %�� ��� %�3 ������ ��;� .4���� 3/ �� ������ �������� � �� ���� ��� �� ���� �� ���� ���� .$������ �� ���# �112/� ��� ���������� ��� �� � ��� ��� �� ��� ����� �� ���������� �� �� ����� ��� �� �� %7@%> ���� �� �� (���� �����)���� "�!����# �� ��� ��� � �� (���� ������ �� �!��# � �� ������ �� ���� ���� ��� �� ���� � ����� �� � ������� ��� ����� ���� � ��� ������ � ������ ����� � ��� ���� ������ �� �� �� ;� ��� ���� �� �� ������� �� ;� .=���� 9%��# �11>, %�� �� ���# �111/�

�� ������� � �� �� �� ����� .��� ���� �� �+ �6�������/ !��� �������� ��� ������ �� �� � ;� ���;� .���� �/� %�� �� ��� �� �� %6 ����� %�������� �������� � �� ����� ��� �� �� ����� ������� � �� ;� !��� ��� �� ��� �� %7# %-# ��� ��-� ���� �� %> ���������� � � ��� ��� ����� ��� ��;� .4���� 3/� ���������# ����� �� ����� �� � �� �� (���� � ���# �� ����� ��� �� �� !�������� �� $� ��� �� ��������� �� ����� �� � ������ �� K��� �� ��� ���� �� !� � ������� ������������ �� �� ������� ��� P ��� ������� ��� �������� �� �� ������ ��� �� �� �� ���� � ��!�������� �� �!�� �� �� (���� � ����)��� .*������ ���# �116# �112/# !���� ���� �� � � � �� ��� � ��� ��� ����� � ����� �� ����� �� ���� ���# ����� ����� ��� P ��� � ��� ��� �� � ��� ������ �� �� (���� � ��� ��� ���� �� ������� .(������ ���# �112/ ��� ������ � �� �� ���� %7@%> ������!���� � ����)�� � �� �� ������ !���� ��� ����� ��� !������ ������ � , �� ������� ��� �� %7@%> ���� ������ !� � ������ � �� ��� �� ����� �������� ������� !� !� � ��� � ��� ����"�!����# �� ��� �� �� � ;� ��� ;� �� $���� ��� !� � ������ �� �� ���� � �� ���� ���� � ����� �� ���� ��� �� ����� ����� ��� ����� ���� �� ��� ������ �� !� � !� ����� �� $� �� ���� � ��� ��� �� !���� �� ����� � ��� ��� ���

������ �� K��� �� ��� ���� �� �� �� $� ��� ����� ��������� �� -� ��� ����� ��� ��� �� !� � �������� ���� � �� ����� ���� ���� .�/ ;��� ���� %�(< ������� �� 3� ��� �� �� ���� ���!�� ���� ��� �� $�� � �� ����� ���� ����� ��! .%>, �/ ����� ������ �� �� $� ��� .>++ ��� 1+�� � ����� !�� -� ��� ����� ���� I� 3�%J��% ��� �7 ������ .�<�/ ��� ���� ���.�/ ��������� .�������� =��� *�$5� .0�� ������ �� ��� �- �$/ � � ��� ��� .0�� ����-+ �$ ��"�%'7@���"%'7 .�" 6/# - �$ -� �� 3� ��� ���!�� ��� ����� �� �� �� ���� ��� �� �������� ���� ���� .� � ���� !��� ��!�� � ������� ��� �+ ������� ������ ����)��.+�3 ��+ � �+> ���/ !��� ��� ���:�� �� � ���� ���� > L .��� ��- ����� ��� 3� ��� ����� ���/� ;���� �� !��� ���� ��� ������� �� � $������ ;������� * ��� 2>+ %�������� �� ��� .��� ���� /# ��������� �� ���� � .����M��� -�+��� ����� !�� ������� ���� �� �� ���� � �� � ����� � ����� � ��� )��� . �� ��� ���� �� �� ������� �� ����� $�� ���� ��� !��� ������)�� ���� + � �� %� � �� ������)��0�� ����� ������� �� .(��4� 3�++/ ���� �� � ������� ����

��� � �� �� ����� �� ����� ��� � ����� ������.5��� �� ���# �112, $������ �� ���# �112, 4���� 3.�//�� �� �� ����� �� �� ������� � � ��� �� �� ��� �� �� $� ��� ����� � �� �� ������ �� �� ;���� ;� �������� ���� ����� !� � �� ������� ����� � ���� �� ��� �� �� ����� ������� ��������� ���� ���� �� !��� ;� ��� ;� .4�� �� ���# �111,%�� �� ���# �111/�

����� ���� ���� �� � �� ��� �� ���� ��� ���������� �� ���� �� ����� � ���C �� 3� ���� �� %># ��%�7 ���� ��� 8�3@�7 ����� ��� ��� �� �� !� ���� ���� �� ��3 � 3- ������� .���� �/� %> �� ��� �� ;� !��� �� � %�7 ��� 8�3@�7 ������ �� ;�� %>�� ������ ���� ����� ���� ��� ���� �� �� ������������� �� ;� ��� ���� ������ � ��� ;� �� � �� ���� ��� .4���� �.�//� ��� ��� �� ��� ���������� ������� ��� � � � �� ���� ���� !� � %6 �� ;���� %- �� ;� .5��� �� ���# �112, $������ �� ���#�112/� ��� ��� �� ��� �������� �� %�7 �� ���� ��� � � � �� ���� �� ���� ��� !� � %2 �� �� 7 ����:��� ��� !��� ��� �� ��� �� 8�3@�7 ��� �� ��� �� � �� ���� ��� !� � �� %�+ %�� ������ .5��� �� ���#�112, $������ �� ���# �112/� ��� %�7 ��� 8�3@�7 ��� �� ���� �������� � � � ����������� �� �� ����� ��� ��� !� ��� ;�# !������ �� ��� �� ��� �� %>�������� � � ������� �� �� ������ �� ���� ����� !��� %> ��� %6 �� ;� .5��� �� ���# �112,$������ �� ���# �112/� G� � �� ���� ��� �� ���� ������ � �� �� �� �!�� � �� 0�� �� ��� ����� � ��� ��� .4���� 3.�//� ����� ��� �� ���� ��� �������������� �� !� � ������ ���� �� ������ ���� �� ���������� �� 3� ���� �� %> .4�� �� ���# �111, %���� ���# �111/�

� �� �� ���� �� �� ���� �� �� ��� �� ������������ �� �� ������ � ��� ���������� � ������� �� � �� ����� �� �������� �� �� ������ ��������� �� ��� � ����� .4���� �.�/ ��� ���� �/�� ���� ��� ��� �� ��� � ����������� �� !��� �� !� ����� ������# � �� ������ �� !� � ��� ������������ � �� ��� �� �������� ��� �� ��� �� ��� �� � ��� �� ��� � ��� ���� *����� ��� �� �� !� ������� �� �' �������� ���� � �� ��� ����� ��

�!�� ���� �������� ���� ����� .�/ ;��� ���� %�(<��� � �� ������ �� ���� ���!�� ���� ��� �� $�� ������ ��� ��� �� !� � �������� ���� ���� � �� ���� �� .�/ �������� � ��� ��� ��� ��� �� ���� �� ��� .%��, �/+ ������ ��� ���� � ��� �� ���!�/� ��� ��� ��� ���� ����� ��� ������ �� 3� ��� ����� ���� I� 3�%J������� �����/� $� ��� ����� !�� ��� �� �� �� �� ���� ��� ��� �+ �/ ��� ����� 0�� ������ �� ���� �� ��+ �$ K5#�� ����)��� .+�- 3�+ � �+> ���/ � 36 �5� 4�� ���� ��# 2+ �3+ �$/ � �� ������ �� ����� 4�� ���� �� ���� �� ��� ��� ���!�� �� � ���� ������� � ���� ���� ����

�1C�/ %�(< � 2- & . !� ����� ��� -� ��� ����� ������ � � $������ ;������� %������� *����� �� !��

�������� �� ����� � �� ���� ���� �������� ���� ����/ !�� 0�� ��� ��� �� ��� � ������ ��� ��� ����������� ��� ���� ��� !�� ������� �� �� �� ���� � �� �� ����

�� �������� �� ������� ���/� ��� ���� �� ���� �������� ���� ��� �� ��� ������ ����� ��� !��� 0 �� � � ���� ������ � ��������� ��

������ �� 4���� �� �!�� �� ����� % $� ���� .�/ *�������� � ��� ��� .$������ �� ���# �112/ �� �� $� ��� ��� ��� �� !� � ������ �� �� ���� � ��� ��� ���!�� �� ��������� �� ��� �� ���� �������� ��� � �� ����� ��� �� ���� ��� ��� ����� �� ����� ��������� C ��� .����/# ������ .���!/# ��� ��! .���/� .�/ * ��!��� ����� ��� �� ���� ��� �� ���� � ��� ��� �� $� ��� ���� �� ������� .H/ � �� ��� .�/ � � �� ���!�� ��� .����/# ������.���!/# ��� ��! .���/ ���� � .�� �� �� ���� �� $������ �� ���# �112/� ;���� ������ ����! �������� � ��������� �� ������ �� ���� ���� ����� $� ������

!�� ����� ��������� �� �� �����

;� �� �� ����� �� �� �� � �� ����� �� ;� .%���� ���# �111/, �� ���� ��� �� �� �� �������� �� �������� � ��� ���� � �� � ���� �� ��� �� ������� �� $� ��� �� ���� � �� �� ���� ���� �� �� ����� �� �!���

��� ������ � ��� ���� � �� �������# ������� �!�� ��� ��������� ����� �� �� !� ��������� $� ���# ���!�� �� ����������� �� ���� !� ������� �� � �� �������� �� ��� ����� ������ �� �� ������� � �� �� �� ����� !����������� �� �� � ������� ������ �� �� �� ��� �� �� ��� �� �� �������� �� �� ����� � ��� �� �� �� � ���� ��� ������� ��� �� ���� �� ������ ����� �� ���� ��� $� � ��� ��� ����� ���#������� � �� %7@%> ������ �� �� ������������ ��� �� ������ �� !� � �� !� ������ � ��� ����� $�� ������# ��� ����� !� � !� ��������

����� �� $� �� !���� � ������ �� � ����� ���������� � ������� � ��� ��� ��� ����� �� �� ��� �� �!� ��� � ������ ���� ����� .$������ �� ���# �112,5��� �� ���# �112, 4���� 3.�//� �� ��� �����# $������ �� ��� � �������� �������� � �� ���� ��� ��� ��� ����� �� � !���� ��� ���� � � ���� �� �� ��# �� �� �� (���� � ����)���� ����� ����# � ���� �� ������� �� �!�� �� ����� ������ ���� ��� �� �����# �� �� ���� ������ ��� �� ����� �� ������ � � �����0� ����

��!������&����

���� !��� !�� ������ �� �� �� �� ��� *������� ���<�������� �������� 5����� �� 5����� .�*<�5/� &�

����� ��������� �� �� ����� !�"

���� ;���� %������) K����� ��� *����� � ������ �������� �� � �8��� ��� ���� ��� ���� 5���� �������� ������������

�� �������

� ���# *� 9 K�������# =� .�111/� ����������� %� �� �� 45� 6��� .(�� ����# �� 4�# 5���# �� �� 9� ����# 8� 4�# ���/# ��� ��� �# ��� 3-� 32+# 5��*���� "����� =����� ��� %����# 5�� *����"�����# �Q�

G� ��# �� ��# �����# �� %� 9 ;�����# 8� �� .�111/���� ���� �� ��� �� ��� � ��� ��� ��� ����������-' $���' 7��' ��' ��# �3�> �373�

5����# *� (� 9 $��$���# �� $� .�+++�/� 5����� ���) � ��� �� �� ���������� ����)��� ����� �� �!������ �� ���� �� ��� ���� �� ����� �������� ��������� �� ��������� ��# � 2�

5����# *� (� 9 $��$���# �� $� .�+++�/� K��� �� ��� ���� �� �� �� ��� ����� �� �!�� ���� ������ �� ���� ����� ����-' $���' 7��' ��' ��# -�� -�3�

5���# 8� =�# ����# 8� $�# "�����# $� <� 9 %���# �� ��.�112/� 5������ ��� ��� ������ ����� ������� �� �� �� ���� � ��� ���� �� �� ���� ��� �� ��� �� ������������� ����� % ����� ���( 8' ��# �-�- �-�-�

4��# P�# %��# �� 9 *������# �� �� .�111/� $�� ����� ��� ����� �� � ��� ����)��� !� ��� ���� �� ����� 5����� ���� �' ���' �# �+1� �+1-�

(����# G� =�# (�����# �� ��# %���# <� �� 9 5���# �� ��.�112/� � ��������)�� �� ��� �� � �� �� ���� �� ��� ��� �� �� ���������� ����)���� � ��� �� ���#�-1 �>7�

(������� ������# 5�# (�������# K�# $����# ��# %���# �� ��9 � ���# *� .�123/� ��� ��� ���� � �� ������ ����� % �� �� �� �� �� ������ �� �� ��)���� $������# 271 2-6�

8����# G� ;�# '���# (� 8�# =��# 8� 9 %���# �� �� .�122/���� ��������� � ��� ��� �� ����������� % ���# ��

�� �� �� ����� �� � ������������ ��� ��)����$���� ��# �1 �>�

K��# %� ��# ��������# R� <�# <�!����# 8� '�# (�� �����#(�# %���# �� 5� 9 *��# 8� &� .�11�/� � � ������� �� ����� �� ������� ������ ���� ����� � ��� �� ������� ��� ����C ���� ��� !� � ��� ������� ������ ����� 8' ��' $���' � ' ���# -73+ -73��

K��# %� ��# 8������# <�# * ����# ;�# ��������# R� <� 9G����!� )# $� .�113/� NN4�� ���� ��OO ��� ���� ��;�� !� � �������� ���� ����� 5� �' � ��� 4��' ��#�763 �762�

=����# �� 9 %��# �� .�11>/� ;����� � ��� ��� �� ������)��� ���� ����� ���� ����������� %� 45�� �#--� ->3�

$������# 5�# 8����# =� 9 &�� ���# <� .�112/� ;����� ����� �� ���� ���������� ����� �� ��� �� ��� ��������������� % ���� ���� ������� ��� ���������������� 8' ��' ���' ���# 663 613�

%��# ��# 4��# P� 9 *������# �� .�111/� %� �!�� ���� � ���# ������� ����� � ��� ��� ����� ��� ���������� ���� �� ��� ��� 8' ��' ���' ���# 6�� 63��

*����# G�# &������# *�# *�����# $�# 5�����# $� �� 9G����!� )# $� .�116/� ���� ������� ������� ���P ��� NN��� ���� ��OO# � ��! �������� � �� � ����� ������ ���� � ��� ��� ��� ���� ���C ������ ��� � ��� ��� ;�� �� ���� ���� ��� ��� ������8' ��' ���' ���# �77 �-1�

*����# G�# *�����# $�# 5�����# $� ��# G����!� )# $� 9&������# *� �� .�112/� ��� ����� � ����������� ����� �� ������� ��� ������� ������ ��� ���� ��� � ��� �� ���# �17+ �173�

&�� ���# <� 9 � ���# *� .�117/� ����� ����������!����� ���� �� $� ���# �� �� �� �� ��� ��� ��� �� ����������� % ���� �� ���� ��� ��� 9� '5��� � ��' � �' ���� ��# -�33 -�36�

B��������# %� %�# &��# 8� 9 &�������# 8� �� .�11>/�*�! ����� ���� ��� �� ����� % ���� 45�� �#->7 -63�

������ �� � �� ���

:4� ����� % ��������� #&&&; �� ����� �� ������� �� <! ( ���� #&&&; � ����� #& ( ���� #&&&=