KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NUÔI CẤY PHÔI CÂY CÓC ĐỎ ...

299

Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển; Tập 17, Số 4A; 2017: 299-310 DOI: 10.15625/1859-3097/17/4A/13231

http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NUÔI CẤY PHÔI CÂY CÓC ĐỎ

(Lumnitzera littorea (Jack) Voigt. 1845) IN VITRO

Nguyễn Nhật Nhƣ Thủy

1*, Lê Thị Thủy Tiên

2, Nguyễn Xuân Hòa

1,

Nguyễn Xuân Vỵ1, Nguyễn Trung Hiếu

1

1Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

*E-mail: [email protected]

Ngày nhận bài: 20-9-2017

TÓM TẮT: Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) là loài cây ngập mặn quý hiếm và bị đe dọa tiệt

chủng. Tỷ lệ nảy mầm thấp là nguyên nhân chính khiến việc tái sinh tự nhiên loài này kém. Với

mục tiêu tạo cơ sở khoa học xây dựng quy trình nhân giống nhanh bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi,

nghiên cứu xác định điều kiện môi trường phù hợp cho sự nảy mầm của phôi cây cóc đỏ được thực

hiện. Phôi được khử trùng bề mặt. Tiếp đó, sự phát triển của phôi in vitro được khảo sát lần lượt qua

điều kiện môi trường nuôi cấy: (1) Môi trường khoáng và vitamin (MS, ½ MS, WPM); (2) Môi

trường khoáng bổ sung sucrose với 3 nồng độ (20, 30 và 40 g/l); và (3) Môi trường khoáng bổ sung

sucrose và chất điều hòa sinh trưởng thực vật GA3, IAA, BA riêng lẻ ở các nồng độ khác nhau (0,5;

1,0; 1,5; 2,0 mg/l) hoặc tổ hợp IAA (0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/l) với BA 0,5 mg/l. Kết quả thí nghiệm

trước là tiền đề của thí nghiệm sau. Các thí nghiệm này được duy trì ở điều kiện tối, nhiệt độ 25 ±

2oC, pH môi trường 5,8 trong vòng 14 ngày. Kết quả khảo sát ở thí nghiệm đầu tiên về ảnh hưởng

của môi trường khoáng và vitamin đến sự phát triển phôi cho thấy phôi cóc đỏ đạt nảy mầm cao

nhất (50%) tại môi trường MS. Thứ hai, sự gia tăng nồng độ sucrose bổ sung vào môi trường MS

làm giảm khả năng phát triển phôi. Thứ ba, sự bổ sung riêng lẻ từng chất điều hòa sinh trưởng vào

môi trường MS có tác dụng khác nhau đối với sự phát triển phôi cóc đỏ. GA3 ở 2 nồng độ cao

(1,5 mg/l và 2,0 mg/l) hoặc BA ở nồng độ thấp (1 mg/l) có khả năng cải thiện tỷ lệ nảy mầm. Trong

khi đó, IAA không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi cóc đỏ một cách rõ rệt. Sự bổ sung kết hợp

IAA/BA giúp tăng tỷ lệ nảy mầm. Thành phần môi trường nuôi cấy phôi cho hiệu quả nảy mầm cao

nhất là môi trường khoáng và vitamin MS, có bổ sung sucrose 20 g/l, kết hợp IAA 0,5 mg/l và BA

0,5 mg/l với tỷ lệ nảy mầm của phôi đạt 88,89% sau 14 ngày nuôi cấy. Cuối cùng, sau 3 tháng tiếp

tục nuôi cấy in vitro, các cây cóc đỏ con thu được vẫn đạt tỷ lệ sống 100%, chiều cao trung bình đạt

2,103 ± 0,159 cm, tốc độ tăng trưởng 0,453 ± 0,081 cm/tháng và đã có 1 lá thật. Như vậy, kỹ thuật

nuôi cấy phôi in vitro giúp cải thiện khả năng nảy mầm của phôi cây cóc đỏ.

Từ khóa: Lumnitzera littorea, nuôi cấy phôi, IAA, BA, GA3.

MỞ ĐẦU

Cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt.

1845) là loài cây ngập mặn thật sự (true

mangrove). Cóc đỏ có vai trò quan trọng đối

với ổn định môi trường và phát triển kinh tế -

xã hội ở vùng ven bờ [1]. Gỗ cóc đỏ rất có giá

trị vì chúng rất bền chắc, đẹp và có mùi thơm.

Hoa cóc đỏ màu đỏ, đẹp nên có giá trị trong

nghệ thuật, trang trí [2]. Ngoài ra, các hợp chất

từ dịch chiết lá cóc đỏ có khả năng kháng

khuẩn [3]. Trên thế giới, loài cóc đỏ phân bố rất

http://dx.doi.org/10.15625/1859-3097/14/2/4475

mailto:[email protected]

Nguyễn Nhật Như Thủy, Lê Thị Thủy Tiên,…

300

ít ở vùng Đông Phi, Bắc Australia, Polynesia và

Đông Nam Á [1, 4]. Những tác động của con

người và thiên nhiên đã làm cho những quần

thể loài này bị cô lập và phân mảnh, điều này

có thể dẫn đến giảm khả năng sinh sản hoặc tồn

tại của chúng. Do bị đe dọa tuyệt chủng cao,

loài cóc đỏ đã được đưa vào sách đỏ cần được

bảo tồn ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó

có Việt Nam [1, 5]. Trong gần 10 năm qua, các

nhà khoa học Việt Nam đã có những công bố

liên quan đến khả năng tái sinh tự nhiên của

loài cóc đỏ. Độ hữu thụ của hạt phấn cóc đỏ ở

Thừa Thiên-Huế rất thấp, chỉ đạt khoảng 9,85%

[6]. Nghiên cứu về hiện tượng học sinh sản của

loài này ở vịnh Cam Ranh cho thấy chỉ có

52,67% trái không bị sâu [7]. Tỷ lệ nảy mầm

của hạt cóc đỏ chỉ đạt 2% sau 3 tháng gieo [8].

Trong một nghiên cứu khác, một số nhân tố

sinh thái tự nhiên như yếu tố mùa, chất hữu cơ

và pH đất cũng có ảnh hưởng đến khả năng tái

sinh tự nhiên của loài cóc đỏ [9]. Thêm vào đó,

cây con trong tự nhiên thường bị cua, còng cắn

đứt [8]. Vì vậy, khả năng tái sinh tự nhiên của

loài cóc đỏ rất kém, khiến cho công tác trồng

phục hồi các quần thể cóc đỏ gặp rất nhiều khó

khăn do thiếu nguồn giống.

Nuôi cấy phôi là kỹ thuật kích thích phôi

phát triển thành cây con trong điều kiện in

vitro. Kỹ thuật này tách kịp thời những phôi có

nguy cơ không hình thành cây con, thường gặp

ở những loài có phôi yếu hoặc loài lai. Trong

trường hợp nuôi cấy phôi yếu, nguyên nhân bắt

nguồn từ hạt có khả năng nảy mầm thấp do

thiếu dinh dưỡng hoặc yếu tố sinh lý, như hạt

của quả đầu mùa, quả hạch và nho chín sớm.

Tukey (1933) quan sát thấy một số giống sơ ri

ngọt chín sau 50 ngày nở hoa nhưng hạt của

chúng chứa phôi chưa phát triển hoàn thiện đều

không nảy mầm. Tuy nhiên, nếu những phôi

này được tách ra và nuôi cấy thì phôi có thể

phát triển thành cây nguyên vẹn. Kể từ đó nuôi

cấy phôi được thực hiện như là phương pháp

phổ biến ở lĩnh vực trồng cây ăn quả như bơ

(Skene & Barlass (1983), Torres và nnk.,

(1986)), đào, xuân đào và mận (Ramming

(1985)), nho (Gray và nnk., (1987), Tsolova,

(1990)), Pelargonium (Scemama & Raquin

(1990)) và Ornithogalum (Niederwieser và

nnk., (1990)) [10]. Đối với loài lai, Laibach

(1925) đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy phôi

nhằm phục dựng cây lai từ phép lai giữa Linum

perenne × L. austriacum. Mặc dù quả của cây

lai phát triển bình thường, nhưng hạt lại bị teo

và nhẹ hơn so với hạt bình thường. Những hạt

này không thể nảy mầm trong đất nhưng phôi

được tách ra từ hạt lại nảy mầm bình thường

trên miếng bông gòn thấm dung dịch sucrose.

Thành công này là viên gạch đầu tiên, mở ra

hướng đi mới cho hàng loạt những ứng dụng kỹ

thuật nuôi cấy phôi trong công tác phục dựng

cây lai của nhiều chi khác như Solanum

(Jorgensen (1928)), Oryza (Niles (1951)),

Phaseolus (Honma (1955)), Medicago

(Fridriksson & Bolton (1963)), Hordeum

(Kasha & Kao (1970), Bozorgipour & Snape

(1991)), Populus (Thakur & Khosla (1991),

Raquin và nnk., (1993)), Helianthus (Krauter &

Friedt (1990), Krauter và nnk., (1991))… [10].

Nuôi cấy phôi bao gồm những nghiên cứu về phá vỡ miên trạng hạt, kiểm tra khả năng sống của hạt, rút ngắn quy trình nuôi cấy một cách hiệu quả… Bài báo này lần đầu tiên nêu lên kết quả nghiên cứu về khả năng nuôi cấy phôi in vitro của một loài cây ngập mặn - Lumnitzera littorea. Từ đó, điều kiện và môi trường nuôi cấy phù hợp với phôi cây cóc đỏ đã được xác định, góp phần tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu cho kỹ thuật vi nhân giống loài cây quý này.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

Vật liệu

Trái Cóc đỏ (Lumnitzera littorea) được thu từ rừng ngập mặn tự nhiên ở khu vực vịnh Cam Ranh (tỉnh Khánh Hòa). Thời điểm thu trái vào tháng 6/2016. Ước tính thời gian ra hoa đến khi thu trái khoảng 60 ngày. Mẫu trái cóc đỏ được rửa sạch, hong khô trong mát và bảo quản trong túi nhựa PE ở nhiệt độ phòng. Trái được lột bỏ lớp vỏ xơ bên ngoài. Sử dụng kềm bấm nhỏ tách vỏ cứng làm đôi, thu hạt một cách cẩn thận, tránh làm tổn thương hạt. Hạt cóc đỏ có kích thước rất nhỏ với chiều dài chỉ khoảng 4 - 5 mm và đường kính khoảng 1 mm (hình 1), nên việc tách phôi từ hạt gặp khó khăn và phôi thu được rất dễ bị tổn thương. Do đó, để đảm

Khảo sát khả năng nuôi cấy phôi cây cóc đỏ…

301

bảo được sự toàn vẹn của phôi, hạt được sử dụng trực tiếp trong các thí nghiệm nuôi cấy

tiếp theo.

theo. 1

2 3

Hình 1. a) Trái Cóc đỏ; b) Trái Cóc đỏ chứa hạt; c) Hạt Cóc đỏ 4

2. Phƣơng pháp 5

2.1. Bố trí thí nghiệm 6

a b c

Hình 1. a) Trái cóc đỏ, b) Trái cóc đỏ chứa hạt, c) Hạt cóc đỏ

Phƣơng pháp

Bố trí thí nghiệm

Hiệu quả của khử trùng bề mặt hạt đến tính sống của phôi cóc đỏ

Thí nghiệm được bố trí thành 2 nghiệm thức gồm: Hạt được khử trùng bề mặt và hạt không được khử trùng bề mặt (đối chứng). Mỗi nghiệm thức gồm 45 hạt, lặp lại 3 lần.

Đối với nghiệm thức hạt được khử trùng, tiến trình khử trùng bề mặt hạt bằng hóa chất được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Cho hạt vào lắc trong nước cất tiệt trùng và vài giọt Tween 20 với thời gian 10 phút. Tiếp tục lắc hạt trong dung dịch Ethanol 70% (v/v) với thời gian 1 phút. Sau cùng hạt cóc đỏ được lắc trong dung dịch NaOCl 10% (v/v) khoảng 5 phút và rửa lại 6 lần bằng nước cất tiệt trùng. Đối với lô đối chứng, hạt sau khi tách từ trái không được khử trùng bề mặt.

Tiếp đó, trắc nghiệm tính sống của phôi cây cóc đỏ ở cả 2 nghiệm thức nhằm đánh giá hiệu quả của khử trùng đến tính sống của phôi. Mô phôi chết có thể được phát hiện bằng triphenyl tetrazolium chloride (TTC, C19H15ClN4). Hợp chất không màu này bị khử tạo thành màu đỏ formazan bởi các tế bào còn sống [11]. Đối với phôi cóc đỏ, chúng tôi thực hiện trắc nghiệm tính sống bằng cách ngâm hạt cắt dọc với dung dịch TTC 1% trong tối. Thời gian ngâm 24 giờ [11]. Sự sống của phôi ở 2 nghiệm thức được ghi nhận khi có sự xuất hiện màu đỏ trên hạt.

Cuối cùng, phôi của nghiệm thức khử trùng bề mặt được nuôi cấy trên môi trường MS

(Murashige và Skoog (1962)) để đánh giá tỷ lệ phôi bị tạp nhiễm. Điều kiện nuôi cấy được duy trì ở điều kiện tối hoàn toàn và nhiệt độ là 25 ± 2oC trong vòng 14 ngày. Tỷ lệ phôi bị tạp nhiễm được ghi nhận khi có sự phát triển của vi sinh vật. Thí nghiệm gồm 45 phôi, lặp lại 3 lần.

Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sự phát triển của phôi cây cóc đỏ

Trước hết, chúng tôi thử nghiệm nuôi cấy phôi trên 3 loại môi trường khác nhau gồm ½ MS, MS và WPM nhằm xác định môi trường khoáng và vitamin phù hợp với sự phát triển phôi cóc đỏ. Môi trường khoáng được thử nghiệm gồm 3 môi trường: MS, ½ MS và WPM (Lloyd và McCown (1981)) bổ sung agar 0,8%. pH môi trường được điều chỉnh ở mức 5,8 bằng NaOH 1N và HCl 1N trước khi hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong thời gian 15 phút. Phôi Cóc đỏ được nuôi cấy trong ống nghiệm ở điều kiện tối hoàn toàn và nhiệt độ 25 ± 2oC. Mỗi nghiệm thức gồm 36 phôi, được lặp lại 3 lần. Thời gian thí nghiệm kéo dài 14 ngày. Đánh giá tỷ lệ nảy mầm của phôi cóc đỏ. Sự nảy mầm được ghi nhận khi có sự xuất hiện của rễ mầm, lá mầm. Kết quả môi trường khoáng phù hợp cho sự phát triển phôi được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến sự phát triển của phôi cây cóc đỏ

Môi trường khoáng MS phù hợp với phôi cóc đỏ đã xác định ở thí nghiệm trên được bổ sung sucrose làm nguồn cung cấp cacbon với các nồng độ 20, 30 và 40 g/l. Mỗi nghiệm thức gồm 36 phôi, được lặp lại 3 lần. Thời gian thí


302

nghiệm kéo dài 14 ngày. Đánh giá tỷ lệ nảy mầm của phôi cóc đỏ. Môi trường MS bổ sung sucrose ở nồng độ phù hợp sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực

vật đến sự phát triển của phôi cây cóc đỏ

Phôi cóc đỏ được nuôi cấy trên môi trường

MS bổ sung sucrose 20 g/l và các chất điều hòa

sinh trưởng khác nhau gồm GA3 (0,5; 1,0; 1,5;

2,0 mg/l) hoặc IAA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l)

hoặc BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) một cách

riêng lẻ. Riêng đối với 4 nghiệm thức kết hợp

auxin và cytokinin theo các tỷ lệ nồng độ khác

nhau, BA 0,5 mg/l được bổ sung kết hợp với

IAA với 4 nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 2,0 và

3,0 mg/l. Mỗi nghiệm thức gồm 36 phôi, được

lặp lại 3 lần. Thời gian thí nghiệm kéo dài 14

ngày. Đánh giá tỷ lệ nảy mầm của phôi cóc đỏ.

Khảo sát sự tăng trưởng của cây con cóc đỏ in

vitro

Nhằm khảo sát sự tăng trưởng của cây cóc

đỏ in vitro, cây con nảy mầm từ môi trường MS

bổ sung sucrose 20 g/l và kết hợp IAA 0,5 mg/l

với BA 0,5 mg/l (tối ưu dựa trên các thí nghiệm

trước) với đầy đủ rễ mầm ngắn, trụ hạ diệp và 2

lá mầm được cấy chuyền sang môi trường MS

bổ sung agar 0,8%. Điều kiện nuôi cấy cây con

được duy trì ở nhiệt độ 30 ± 2oC, ánh sáng

2.500 ± 100 lux và pH môi trường 5,8 trong

thời gian 3 tháng. Thí nghiệm gồm 30 cây con,

lặp lại 3 lần. Theo dõi và đo đạc tỷ lệ sống, sự

phát triển chiều cao, số lượng lá… của cây con.

Đo đạc các thông số và xử lý số liệu

Ở thí nghiệm đánh giá hiệu quả của khử

trùng bề mặt hạt đến tính sống của phôi cóc

đỏ, tỷ lệ phôi sống được xác định theo công

thức sau:

Tỷ lệ phôi sống (%) = (Số hạt hiện

màu đỏ/tổng số hạt ngâm) × 100

Hàng ngày quan sát và ghi nhận thời điểm

hình thành chồi và rễ từ phôi cóc đỏ ở từng

nghiệm thức. Ở các thí nghiệm khảo sát ảnh

hưởng môi trường khoáng, nồng độ sucrose và

chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự phát

triển phôi cây cóc đỏ, tỷ lệ nảy mầm của phôi

cóc đỏ (%) sau 14 ngày nuôi cấy được xác định

theo công thức sau:

Tỷ lệ nảy mầm của phôi (%) = (Số phôi

hình thành rễ mầm, lá mầm/tổng số phôi

nuôi cấy) × 100

Ở thí nghiệm khảo sát tăng trưởng của cây

con cóc đỏ, sự tăng trưởng của cây con được

đánh giá theo các thông số sau:

Tỷ lệ sống (%) = (Số cây sống khi kết thúc thí

nghiệm/tổng số cây ban đầu)*100

Chiều cao của cây con (l, cm) được đo

bằng thước bên ngoài ống nghiệm, đo khoảng

cách từ cô rễ đến ngọn cây

Tốc độ tăng trưởng (cm/tháng) = chiều cao

cây tháng sau - chiều cao cây tháng trước

Các số liệu thu nhận được thống kê bằng

phần mềm MSTATC. Phân tích số liệu

ANOVA một chiều với bài kiểm định trắc

nghiệm phân hạng LSD (Least Significant

Difference) hoặc Duncan.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hiệu quả của khử trùng bề mặt hạt đến tính

sống của phôi cóc đỏ

Sau 24 giờ ngâm với TTC 1% trong tối,

phôi cóc đỏ bị nhuộm đỏ chứng minh tính sống

của phôi (hình 2). Kết quả trắc nghiệm tính

sống của phôi cóc đỏ được khử trùng đạt

73,33%. Trong khi đó tại nghiệm thức phôi

không được khử trùng (đối chứng), tỷ lệ phôi

sống trung bình đạt khoảng 84,44% (bảng 1).

Tuy nhiên, sự sai khác này không có ý nghĩa

thống kê (P = 0,0667). Vì vậy, hiệu quả của

khử trùng bề mặt không ảnh hưởng đến tính

sống của phôi cóc đỏ.

Trong khi đó, những nghiên cứu trước đây

cho thấy các nguyên nhân dẫn đến khả năng tái

sinh của loài cóc đỏ rất thấp là độ hữu thụ của

hạt phấn cóc đỏ chỉ đạt 9,85%, tỷ lệ trái không

bị sâu là 52,67% và tỷ lệ nảy mầm của hạt chỉ

đạt 2% [6, 9, 10]. Tỷ lệ phôi sống cao ở nghiên


303

cứu này mở ra một hướng giải pháp tái sinh cho

loài cóc đỏ là phương pháp nuôi cấy phôi in

vitro để tạo ra nguồn cây giống hiệu quả.

Hơn nữa, đối với nuôi cấy mô thực vật nói chung và phôi nói riêng, một trong những yếu tố tác động đến sự thành công chính là quá trình khử trùng bề mặt mô. Sự khó khăn trong việc tạo mẫu khử trùng bắt nguồn từ sự cần

thiết tuyệt đối phải loại bỏ hoàn toàn các vi sinh vật bằng các hóa chất mà không làm chết tế bào trên mô thực vật [12]. Quan sát sự tạp nhiễm từ nghiệm thức phôi được khử trùng bề mặt cho thấy không phát hiện có sự tạp nhiễm từ phôi. Như vậy, quá trình khử trùng bề mặt phôi không ảnh hưởng đến tính sống của phôi cóc đỏ và đáp ứng yêu cầu cho các thử nghiệm nuôi cấy in vitro tiếp theo.

Hình 2. a) Kết quả thí nghiệm trắc nghiệm tính sống của phôi cóc đỏ, b) Hạt cóc đỏ nhuộm đỏ một phần

Bảng 1. Tỷ lệ phôi sống ở các nghiệm thức phôi có khử trùng và không khử trùng

Nghiệm thức Số phôi trắc nghiệm Tỷ lệ phôi sống trung bình (%)

Phôi có khử trùng bề mặt 45 73,33 ± 6,67

Phôi không khử trùng bề mặt (đối chứng) 45 84,44 ± 3,85

Prob. - 0,0667

Ảnh hƣởng của môi trƣờng khoáng đến sự

phát triển của phôi cây cóc đỏ

Sau 14 ngày nuôi cấy, hạt cóc đỏ ở cả ba

nghiệm thức đều nảy mầm. Quá trình nảy mầm

của hạt cóc đỏ nuôi cấy in vitro bắt đầu vào

khoảng ngày thứ 8, hạt trương nước, nứt vỏ và

trụ hạ diệp và rễ mầm xuất hiện (hình 3a, 3b).

Sau 10 đến 12 ngày, trụ hạ diệp kéo dài, xuất

hiện lá mầm màu trắng ngà (hình 3c). Từ ngày

16 đến ngày thứ 21, lá mầm chuyển sang màu

đỏ nhạt được trụ hạ diệp đưa lên cao (hình 3d).

Tuy nhiên, tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ ở

mỗi nghiệm thức lại khác nhau (bảng 2). Phôi

cóc đỏ nuôi cấy trên môi trường khoáng MS

đạt tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ cao nhất,

khoảng 50%. Khi thành phần khoáng giảm

xuống một nửa, tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ

giảm xuống còn 44,44% ở nghiệm thức ½ MS.

Cuối cùng, tỷ lệ này đạt thấp nhất, 38,89% ở

môi trường WPM. Nhưng sự sai khác của tỷ lệ

phôi hình thành chồi, rễ ở 3 nghiệm thức không

có ý nghĩa thống kê (P = 0,2961). Mặc dù vậy,

với tỷ lệ phôi hình chồi, rễ cao nhất, chúng tôi

quyết định lựa chọn sử dụng môi trường MS

làm môi trường khoáng cơ bản cho những thí

nghiệm tiếp theo.

a b


304

1

2

3 Hình 3. Sự nảy mầm của hạt Cóc đỏ: a) Hạt trương phồng; b) Hạt nứt vỏ, xuất hiện rễ mầm; 4

c) Xuất hiện lá mầm; d) Cây con 5

Tuy nhiên, tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ ở mỗi nghiệm thức lại khác nhau (Bảng 2). Phôi Cóc 6

đỏ nuôi cấy trên môi trường khoáng MS đạt tỷ lệ phôi 7

a

b

c

Lá mầm

Trụ hạ diệp

Rễ

mầm

Vỏ hạt

d

Hình 3. Sự nảy mầm của hạt cóc đỏ: a) Hạt trương phồng, b) Hạt nứt vỏ, xuất hiện rễ mầm, c) Xuất hiện lá mầm, d) Cây con

Bảng 2. Tỷ lệ phôi cóc đỏ nảy mầm ở các nghiệm thức môi trường khoáng khác nhau

Nghiệm thức Số hạt nuôi cấy Số phôi hình thành chồi, rễ Tỷ lệ phôi nảy mầm (%)

½ MS 36 5,33 ± 0,58 44,44 ± 4,81

MS 36 6,00 ± 1,00 50,00 ± 8,33

WPM 36 4,67 ± 1,15 38,89 ± 9,62

Prob. - - 0,2961

Ảnh hƣởng của nồng độ sucrose đến sự phát triển của phôi cây cóc đỏ

Đường sucrose đóng vai trò là nguồn cung cấp cacbon và là chất tham gia tạo áp suất thẩm thấu. Khi tăng nồng độ sucrose (20, 30 và 40 g/l) bổ sung vào môi trường MS, khả năng phát triển phôi cóc đỏ giảm xuống (bảng 3). Cụ thể, tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ cao nhất, đạt 52,78% ở nghiệm thức sucrose 20 g/l. Tỷ lệ này giảm xuống 33,33% khi nồng độ sucrose tăng lên 30 g/l và thấp nhất ở nghiệm thức

sucrose 40 g/l. Hơn nữa, hình thái cây mầm sau 14 ngày nuôi cấy ở cả ba nghiệm thức có sự tương đồng, đều có rễ mầm, trụ hạ diệp và hai lá mầm. So với đối chứng, kết quả trắc nghiệm phân hạng LSD cho thấy nồng độ sucrose cao (40 g/l) có khả năng ức chế sự phát triển phôi cóc đỏ và sucrose 20 g/l phù hợp với sự phát triển của phôi cóc đỏ. Vì vậy, môi trường MS bổ sung sucrose 20 g/l được sử dụng ở các thử nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật tiếp theo.

Bảng 3. Tỷ lệ phôi cóc đỏ nảy mầm khi bổ sung sucrose ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ sucrose Số hạt nuôi cấy Số phôi hình thành chồi, rễ Tỷ lệ phôi nảy mầm (%)

Sucrose 20 g/l 36 6,33 ± 0,58 52,78 ± 4,81a

Sucrose 30 g/l 36 4,00 ± 1,00 33,33 ± 8,33bc

Sucrose 40 g/l 36 3,67 ± 1,15 30,56 ± 12,73c

Đối chứng 36 6,00 ± 1,00 50,00 ± 8,33ab

Prob. - - 0,0345

Ghi chú: Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95%.


305

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự phát triển của phôi cây cóc đỏ

Đối với nhóm chất điều hòa sinh trưởng gibberellin, GA3 được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 4 nồng độ khác nhau, gồm 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l. Một điều thú vị chính là sự phát triển của phôi cóc đỏ ở các nghiệm thức môi trường bổ sung GA3 khác so với đối chứng. Phôi vẫn hình thành rễ mầm và lá mầm nhưng trụ hạ diệp kéo dài hơn. Hơn nữa, kết

quả khảo sát tỷ lệ phôi nảy mầm càng cho thấy tác dụng của GA3 một cách rõ rệt hơn. Sau 14 ngày nuôi cấy, tỷ lệ phôi nảy mầm cao lần lượt ở 2 nghiệm thức GA3 nồng độ cao 1,5 mg/l và 2,0 mg/l, cả hai tỷ lệ đều đạt trên 70%. Ngược lại, tỷ lệ này 2 nghiệm thức GA3 nồng độ 0,5 mg/l và 1,0 mg/l thấp hơn đáng kể, chỉ đạt lần lượt từ 27,78% đến 38,89%. Như vậy, so với đối chứng, môi trường bổ sung GA3 1,5 mg/l có khả năng cải thiện sự nảy mầm của phôi cóc đỏ (P < 0,01) (bảng 4).

Bảng 4. Tỷ lệ phôi cóc đỏ nảy mầm khi bổ sung GA3 ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ GA3 Số hạt nuôi cấy Số phôi hình thành chồi, rễ Tỷ lệ phôi nảy mầm (%)

GA3 0,5 mg/l 36 3,33 ± 1,15 27,78 ± 9,62c

GA3 1,0 mg/l 36 4,67 ± 0,58 38,89 ± 4,81bc

GA3 1,5 mg/l 36 9,33 ± 1,15 77,78 ± 9,62a

GA3 2,0 mg/l 36 8,67 ± 0,58 72,22 ± 4,81a

Đối chứng 36 6,33 ± 0,58 52,78 ± 4,81b

Prob. - - 0,0000


Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều

hòa sinh trưởng auxin IAA đến sự phát triển phôi cóc đỏ trong điều kiện thí nghiệm được trình bày ở bảng 5. Tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ thấp nhất (33,33%) ở 3 nghiệm thức tương ứng với nồng độ IAA từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l. Trong khi, nghiệm thức IAA 2,0 mg/l cho tỷ lệ

nảy mầm cao hơn, đạt 47,22%. Nhìn chung, tỷ lệ nảy mầm của phôi cóc đỏ ở các nghiệm thức bổ sung auxin IAA thấp hơn đối chứng. Tuy nhiên, sự sai khác của tỷ lệ này giữa các nghiệm thức không có ý nghĩa thống kê (P = 0,3394). Như vậy, IAA không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi cóc đỏ một cách rõ rệt.

Bảng 5. Tỷ lệ phôi cóc đỏ nảy mầm khi bổ sung IAA ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ IAA Số hạt nuôi cấy Số phôi hình thành chồi, rễ Tỷ lệ phôi nảy mầm (%)

IAA 0,5 mg/l 36 4,00 ± 1,00 33,33 ± 8,33

IAA 1,0 mg/l 36 4,00 ± 1,73 33,33 ± 14,43

IAA 1,5 mg/l 36 4,00 ± 2,00 33,33 ± 16,67

IAA 2,0 mg/l 36 5,67 ± 2,52 47,22 ± 20,97

Đối chứng 36 6,33 ± 0,58 52,78 ± 4,81

Prob. - - 0,3394

Sự bổ sung BA có ảnh hưởng mạnh đến sự

nảy mầm của hạt cóc đỏ. BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy phôi cóc đỏ với 4 nồng độ khác nhau, từ 0,5 mg/l đến 2,0 mg/l. Trong thời gian nuôi cấy, tiến trình nảy mầm của hạt cóc đỏ ở nghiệm thức này khác so với các nghiệm thức trước. Đầu tiên, trụ hạ diệp gia tăng kích thước làm nứt vỏ hạt vào ngày thứ 6. Tiếp đó, vào ngày thứ 8, trụ hạ diệp kéo dài mang theo hai lá mầm xuất hiện. Cuối cùng, đến ngày thứ

14, rễ mầm mới nhú ra. Kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ BA khác nhau đến tỷ lệ hình thành chồi, rễ của phôi cóc đỏ được trình bày ở bảng 6. Cụ thể, tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ cao nhất (86,11%) ở nghiệm thức tương ứng với nồng độ BA 1,0 mg/l. Tiếp đến, tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ vẫn duy trì ở mức cao, đạt khoảng 63,89% ở nghiệm thức BA 0,5 mg/l. Tuy nhiên, khi nồng độ BA tăng lên, tỷ lệ này giảm xuống đáng kể và thấp hơn


306

cả đối chứng (50%). Sự sai khác tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ giữa các nghiệm thức có ý nghĩa thống kê (P < 0,01). Như vậy, chất điều hòa

sinh trưởng BA ở nồng độ thấp (1 mg/l) có khả năng kích thích sự phát triển phôi cóc đỏ.

Bảng 6. Tỷ lệ phôi cóc đỏ nảy mầm khi bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ BA Số hạt nuôi cấy Số phôi hình thành chồi, rễ Tỷ lệ phôi nảy mầm (%)

BA 0,5 mg/l 36 7,67 ± 1,53 63,89 ± 12,73b

BA 1,0 mg/l 36 10,33 ± 0,58 86,11 ± 4,81a

BA 1,5 mg/l 36 4,00 ± 1,00 33,33 ± 8,33c

BA 2,0 mg/l 36 1,33 ± 0,58 11,11 ± 4,81d

Đối chứng 36 6,33 ± 0,58 52,78 ± 4,81bc

Prob. - - 0,0000


Nhìn chung, phôi được nuôi cấy trên môi

trường bổ sung đồng thời IAA và BA phát sinh chồi và rễ đồng thời. Trong thí nghiệm này, BA được sử dụng ở nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với IAA nồng độ biến thiên từ 0,5 - 3 mg/l. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 7. Sau 14 ngày nuôi cấy trong ống nghiệm, phôi cóc đỏ hình thành chồi, rễ với tỷ lệ rất cao, đạt 88,89% và 86,11% lần lượt ở nghiệm thức IAA 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l và IAA 1,0 mg/l + BA 0,5 mg/l. Thế nhưng, khi tăng nồng độ IAA lên

đến 2,0 mg/l và 3,0 mg/l tương ứng với các nghiệm thức IAA 2,0 mg/l + BA 0,5 mg/l và IAA 3,0 mg/l + BA 0,5 mg/l, số lượng phôi hình thành chồi, rễ chỉ đạt xấp xỉ với đối chứng. Sự khác biệt của tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ giữa các nghiệm thức kết hợp bổ sung IAA và BA có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Vì vậy, tỷ lệ nồng độ IAA:BA thấp (1:1 và 2:1) tương ứng với mức IAA 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l và IAA 1,0 mg/l + BA 0,5 mg/l giúp tăng khả năng tăng trưởng của phôi.

Bảng 7. Tỷ lệ phôi cóc đỏ nảy mầm khi bổ sung kết hợp IAA và BA

theo các tỷ lệ nồng độ khác nhau

Tỷ lệ nồng độ IAA:BA Số hạt nuôi cấy Số phôi hình thành chồi, rễ Tỷ lệ phôi nảy mầm (%)

IAA 0,5 mg/l + BA 0,5 mg/l 36 10,67 ± 1,15 88,89 ± 9,62a

IAA 1,0 mg/l + BA 0,5 mg/l 36 10,33 ± 2,89 86,11 ± 24,06a

IAA 2,0 mg/l + BA 0,5 mg/l 36 6,00 ± 2,00 50,00 ± 16,67b

IAA 3,0 mg/l + BA 0,5 mg/l 36 6,67 ± 1,53 55,56 ± 12,73b

Đối chứng 36 6,33 ± 0,58 52,78 ± 4,81b

Prob. - - 0,0196


Điều kiện đầu tiên để hạt nảy mầm là sự

trưởng thành của mọi thành phần cấu tạo của hạt: Vỏ, mô dự trữ và nhất là phôi phải hoàn toàn phân hóa về mặt hình thái. Tuy nhiên, trưởng thành không có nghĩa là có khả năng nảy mầm vì hạt có thể vào trạng thái ngủ, mọi hoạt động sống trong hạt ở mức tối thiểu. Và hạt có thể nảy mầm khi hấp thụ nước hoặc cần xử lý hay tín hiệu bổ sung để nảy mầm. Trạng thái ngủ của hạt được phân thành ngủ do vỏ và ngủ do phôi. Vỏ có thể gây ngủ cho hạt do vỏ quá cứng, không thấm nước và oxy hoặc bản thân vỏ chứa chất cản [13]. Trong trường hợp

của loài cóc đỏ, hạt được bảo vệ bởi lớp vỏ trái xơ và lớp vỏ hạt cứng. Vấn đề được khắc phục ở nghiên cứu này bằng cách tách bỏ lớp vỏ trái và vỏ hạt, tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 50% so với 5% của trái khô đã xử lý với nước ấm [8].

Hơn nữa, trong rừng ngập mặn tự nhiên, trái cóc đỏ xuất hiện từ tháng 4 đến tháng 8 [8]. Thời điểm trái chín và rụng vào mùa mưa, mực thủy triều lên cao không phù hợp cho sự nảy mầm của hạt. Ngoài lớp vỏ bảo vệ, hạt có thể ngủ cấp hai để chờ đến thời điểm điều kiện phù hợp vào mùa khô để nảy mầm. Theo Bùi Trang


307

Việt (2016) [13], acid abscisic (ABA) là chất bảo vệ phôi tránh bị khô, cản nảy mầm sớm, cảm ứng và duy trì ở trạng thái ngủ cho phôi trưởng thành. Monier (1978) cho rằng bản thân phôi đã sẵn có những chất điều hòa sinh trưởng nội sinh. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp phôi phát triển chậm hoặc dị thường, môi trường nuôi cấy phôi cần được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh ở nồng độ thấp. Lúc này, sự phát triển của phôi được cải thiện [14]. Trong nghiên cứu này, ở điều kiện nuôi cấy in vitro, ba nhóm chất điều hòa sinh trưởng gibberellin, auxin và cytokinin đều tác động đến sự phát triển của phôi cóc đỏ một cách khác nhau. Vì ABA và GA đối kháng nên cân bằng GA/ABA quyết định con đường nảy mầm hay trưởng thành và mức độ ngủ của nhiều loại hạt. GA thường được dùng để thay thế ánh sáng hay lạnh để phá vỡ sự ngủ, kích thích hạt nảy mầm. Trong nghiên cứu này, GA3 nồng độ 1,5 mg/l và 2,0 mg/l đã có tác dụng cải thiện tỷ lệ nảy mầm của hạt cóc đỏ, tăng từ 50% (môi

trường không có GA3) lên đến trên 70%. Nảy mầm của hạt là quá trình phát triển được điều hòa bởi mạng lưới truyền tín hiệu phức tạp, tích hợp các tín hiệu môi trường vào các con đường truyền tín hiệu nội sinh. Trong khi ABA và GA được nghiên cứu rộng rãi, nhưng vai trò auxin và cytokinin chưa được biết nhiều trong sự nảy mầm của hạt. Trong điều kiện tăng trưởng bình thường, auxin không ảnh hưởng đến nảy mầm của hạt. Cytokinin kích thích tăng rộng tế bào. Cân bằng giữa auxin và cytokinin là một nhân tố kiểm soát phát triển thực vật vì auxin giúp tạo rễ trong khi cytokinin giúp tạo chồi. Từ kết quả so sánh tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ của cả 16 nghiệm thức với đối chứng, sự kết hợp giữa IAA 0,5 mg/l và BA 0,5 mg/l được xem là thích hợp nhất để bổ sung vào môi trường MS kết hợp với sucrose 20 g/l để nuôi cấy phôi cóc đỏ (hình 4). Điều này nhằm tạo cơ sở khoa học để xây dựng quy trình nhân giống nhanh loài cóc đỏ bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi.

Hình 4. So sánh tỷ lệ phôi hình thành chồi, rễ giữa các nghiệm thức bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Trong đó, các cột màu xanh tương ứng với các nghiệm thức bổ chất điều hòa

sinh trưởng; cột màu trắng là đối chứng. Các mẫu tự trên cột khác nhau thể hiện sự sai khác ý nghĩa ở độ tin cậy 99% bằng trắc nghiệm phân hạng Duncan


308

So với phương pháp gieo ương từ quả khô, phương pháp nuôi cấy phôi in vitro đã rút ngắn được thời gian nảy mầm và cải thiện tỷ lệ nảy mầm của hạt cóc đỏ. Cụ thể, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Xuân Hòa và nnk., (2013) cho thấy quả cóc đỏ được xử lý bằng nước ấm có tỷ lệ nảy mầm đạt khoảng 5% sau 3 tháng [8]. Trong khi đó, phôi cóc đỏ nuôi cấy trên môi trường bổ sung GA3 1,5 mg/l hay kết hợp IAA và BA với tỷ lệ nồng độ thấp (1:1 và 2:1) đều hình thành chồi, rễ với tỷ lệ từ 70 - 80% chỉ sau 14 ngày.

Sự tăng trƣởng của cây con cóc đỏ thu đƣợc in vitro

Trong suốt thời gian theo dõi, tỷ lệ sống

của cây cóc đỏ con trong ống nghiệm đạt 100% (bảng 8). Sau một tháng nuôi cấy, chiều cao trung bình của cây con chỉ đạt 1,187 ± 0,025 cm. Với tốc độ tăng trưởng 0,480 ± 0,044 cm/tháng, chiều cao trung bình cây con đạt 1,650 ± 0,078 cm ở tháng thứ hai. Cuối cùng, sau 3 tháng, các cây cóc đỏ con phát triển bên trong ống nghiệm đạt chiều cao trung bình 2,103 ± 0,159 cm và tốc độ tăng trưởng 0,453 ± 0,081 cm/tháng. Tuy nhiên, ở điều kiện in vitro, cây cóc đỏ con tăng trưởng chậm hơn so với điều kiện gieo ương trên thể nền đất. Sau 3 tháng, chiều cao của những cây nảy mầm từ hạt được xử lý bằng nước ấm đạt khoảng 7,37 cm, và tốc độ tăng trưởng ở mức 2,46 cm/tháng [8].

Bảng 8. Theo dõi tăng trưởng của cây cóc đỏ con in vitro

Ban đầu Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng

Tỷ lệ sống (%) 100 100 100 100

Chiều cao cây (cm) 0,707 ± 0,031 1,187 ± 0,025 1,650 ± 0,078 2,103 ± 0,159

Tốc độ tăng trưởng (cm/tháng) - 0,480 ± 0,044 0,463 ± 0,055 0,453 ± 0,081

Từ khi được nuôi cấy ở điều kiện có ánh

sáng, lá mầm của cây cóc đỏ con chuyển từ màu đỏ nhạt sang màu xanh. Ở tháng thứ nhất, 2 lá mầm vẫn còn khép vào nhau (hình 5a). Đến tháng tiếp theo, 2 lá mầm bắt đầu mở ra dần (hình 5b). Đến tháng thứ ba của quá trình

theo dõi, bên cạnh 2 lá mầm, 1 lá thật to hơn mọc ra từ ngọn cây (hình 5c). Thời điểm và tiến trình của cây con in vitro tương đồng với sự tăng trưởng của cây cóc đỏ con được gieo ươm trên nền đất trước đây [8].

đây [8]. 1

` 2

Hình 5. Cây Cóc đỏ con sau: a) 1 tháng; b) 2 tháng và c) 3 tháng 3

a b c

Hình 5. Cây cóc đỏ con sau: a) 1 tháng, b) 2 tháng và c) 3 tháng nuôi cấy


309

Các thông số đo đạc về tỷ lệ sống, sự phát triển chiều cao và phát triển lá đều cho thấy cây cóc đỏ con thu được từ kỹ thuật nuôi cấy phôi in vitro vẫn trong tình trạng tăng trưởng tốt, đáp ứng yêu cầu trở thành nguồn nguyên liệu đầu vào cho những nghiên cứu vi nhân giống loài cây quý hiếm này.

KẾT LUẬN

Những kết quả nghiên cứu cho thấy kỹ thuật nuôi cấy phôi in vitro giúp cải thiện khả năng nảy mầm của phôi cóc đỏ. Môi trường nuôi cấy MS bổ sung sucrose 20 g/l, GA3 (1,5 - 2,0 mg/l), hoặc BA 1,0 mg/l, hoặc kết hợp IAA (0,5 - 1,0 mg/l) với BA 0,5 mg/l phù hợp với sự phát triển của phôi cây cóc đỏ.

Lời cảm ơn: Bài báo sử dụng kết quả nghiên cứu của đề tài cơ sở “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin và cytokinin đến sự phát triển của phôi cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack) Voigt. 1845)” do kinh phí của Viện Hải dương học hỗ trợ. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào (Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Thành phố Hồ Chí Minh). Tập thể tác giả xin chân thành cảm ơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Su, G., Huang, Y., Tan, F., Ni, X., Tang, T., and Shi, S., 2007. Conservation genetics of Lumnitzera littorea (Combretaceae), an endangered mangrove, from the Indo-West Pacific. Marine Biology, 150(3), 321-328.

2. Rotaquio Jr, E. L., Nakagoshi, N., and Rotaquio, R. L., 2007. Species composition of mangrove forests in Aurora, Philippines: a special reference to the presence of Kandelia candel (L.) Druce. Journal of International Development and Cooperation, 13(1), 61-78.

3. Saad, S., Taher, M., Susanti, D., Qaralleh, H., and Rahim, N. A. B. A., 2011. Antimicrobial activity of mangrove plant (Lumnitzera littorea). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 4(7), 523-525.

4. Wim, G., Stephan, W., Max, Z., and Liesbeth, S., 2006. Mangrove guidebook

for Southeast Asia. FAO and Wetland International, Wagenugen The Netherlands.

5. Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường,

2007. Sách đỏ Việt Nam. Phần II. Thực

vật. Nxb. Khoa học Tự nhiên và Công

nghệ, 609 tr.

6. Trần Quốc Dung và Nguyễn Khoa Lân,

2010. Xác định kích thước, số lượng và

chất lượng của hạt phấn Cóc đỏ

(Lumnitzera littorea (Jack) Voigt. 1845).

Tuyển tập “Phục hồi và quản lý hệ sinh thái

rừng ngập mặn trong bối cảnh biến đổi khí

hậu”. Pp. 275-279.

7. Nguyễn Xuân Hòa, Phạm Thị Lan, Nguyễn

Xuân Trường và Nguyễn Nhật Như Thủy,

2013. Nghiên cứu đặc điểm sinh thái quần

thể cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack)

Voigt. 1845) ở vịnh Cam Ranh (tỉnh Khánh

Hòa). Kỷ yếu Hội nghị Quốc tế “Biển Đông

2012”. Tập 1. Pp. 316-323.

8. Pham Van Quy and Vien Ngoc Nam, 2006.

Initial nursing of a rare mangrove species

(Lumnitzera littorea (Jack) Voigt) in Can

Gio district, Ho Chi Minh city. In Proc. The

role of mangrove and coral reef ecosystems

in natural disaster mitigation life

improvement, IUCN, MERD, Hanoi,

Vietnam. Pp. 365-370.

9. Quách Văn Toàn Em và Viên Ngọc Nam,

2010. Nghiên cứu một số nhân tố sinh thái

ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên

của cây cóc đỏ (Lumnitzera littorea (Jack)

Voigt.) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập

mặn Cần Giờ. Tạp chí khoa học Trường

Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh, 24(58),

87-95.

10. Sharma, D. R., Kaur, R., and Kumar, K.,

1996. Embryo rescue in plants-a review.

Euphytica, 89(3), 325-337.

11. Lakon, G., 1949. The topographical

tetrazolium method for determining the

germinating capacity of seeds. Plant

Physiology, 24(3), 389-394.

12. Dương Công Kiên, 2002. Nuôi cấy mô thực

vật. Nxb. Đại học Quốc gia thành phố Hồ

Chí Minh.


310

13. Bùi Trang Việt, 2016. Sinh lý Thực vật Đại cương. Nxb. Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.

14. Chin, H. F., Krishnapillay, B., and Alang, Z. C., 1988. Media for embryo culture of some tropical recalcitrant species. Pertanika, 11(3), 357-363.

CULTURE OF Lumnitzera littorea (Jack) Voigt. 1845 EMBRYOS

Nguyen Nhat Nhu Thuy

1, Le Thi Thuy Tien

2, Nguyen Xuan Hoa

1,

Nguyen Xuan Vy1, Nguyen Trung Hieu

1

1Institute of Oceanography, VAST 2Ho Chi Minh city University of Technology, Vietnam National University Ho Chi Minh city

ABSTRACT: Lumnitzera littorea is an endangered mangrove species. Poor germination is the

major cause for low regeneration of this species. With an objective to augment the species

population in the natural and allied habitats through embryo culture, the study focus on the suitable

medium for the germination of Lumnitzera littorea embryos. Initially, the embryos were sterilized.

Then the effects of (1) the mineral and vitamin medium (MS, ½ MS, WPM), (2) the MS medium

supplemented with sucrose at concentrations (20; 30; 40 g/l), (3) MS medium supplemented with

sucrose 20 g/l and phytohormones GA3, IAA, BA at concentrations (0.5; 1.0; 1.5; 2.0 mg/l)

individually or combination of IAA (0.5; 1.0; 2.0; 3.0 mg/l) with BA (0.5 mg/l) on the germination

of embryos were studied. Each experiment was based on the results of the previous one. The

cultures were in the dark condition, and at a temperature of 25 ± 2ºC for 14 days. In the influence of

mineral and vitamins medium, MS medium was the best result for germination Lumnitzera littorea

embryos (50%). Secondly, the increasing sucrose concentration decreased germination Lumnitzera

littorea embryos. Thirdly, among the phytohormones, the higher concentrations of GA3 (1.5 and 2.0

mg/l) or the lower concentration of BA (1 mg/l) proved more effective for the percentage of

germination Lumnitzera littorea embryos. However, IAA did not affect on germination

significantly. MS medium supplemented with 20 g/l sucrose and combination of 0.5 mg/l IAA with

0.5 mg/l BA showed the maximum percentage of germination Lumnitzera littorea embryos

(88.89%). After three months, the survival rate of Lumnitzera littorea seedlings remained 100%.

The average height of seedlings reached 2.103 ± 0.159 cm. The growth rate of seedlings was 0.453

± 0.081 cm/month. The seedling had 1 leave. The embryo culture improved the germination of

Lumnitzera littorea embryos.

Keywords: Lumnitzera littorea, embryo culture, IAA, BA, GA3.

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NUÔI CẤY PHÔI CÂY CÓC ĐỎ ...

Documents

Transcript of KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NUÔI CẤY PHÔI CÂY CÓC ĐỎ ...