NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY ...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-------------------------------

HUỲNH THỊ LŨY

NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH

VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM

(Schefflera octophylla Lour. Harms)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

------------------------------

NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH

VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY NGŨ GIA BÌ CHÂN CHIM

(Schefflera octophylla Lour. Harms)

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Mã số: 9 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. Nguyễn Hữu Hổ

2. PGS.TS. Bùi Văn Lệ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022

HUỲNH THỊ LŨY

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất

định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)” là công trình

nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Hổ và PGS.TS.

Bùi Văn Lệ. Nội dung nghiên cứu và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung

thực. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu chưa từng được sử dụng để công bố trong

các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này

đều được trích dẫn nguồn gốc rõ ràng. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam

đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 05 năm 2022

Tác giả

Huỳnh Thị Lũy

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Bùi Văn Lệ và đặc

biệt TS. Nguyễn Hữu Hổ, là những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ, truyền

đạt những kiến thức quý báu để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Sinh học nhiệt đới đã

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện nghiên cứu đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Sở Giáo dục và Đào tạo Phú Yên,

Trường THPT chuyên Lương Văn Chánh Phú Yên, đã tạo điều kiện cho tôi học tập,

nghiên cứu.

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các anh chị em của phòng Công nghệ gen

– Viện Sinh học nhiệt đới, đã rất tận tình tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng

như thời gian quý báu để tôi thực hiện nghiên cứu đề tài.

Sự quan tâm và động viên của các Thầy Cô, anh chị em của Viện Sinh học

nhiệt đới là động lực lớn cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu. Chân thành cảm ơn!

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 05 năm 2022

Tác giả

Huỳnh Thị Lũy

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................... vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ ix

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ......................................................................... xi

TÓM TẮT ................................................................................................................. xv

SUMMARY ........................................................................................................... xvii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1

2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................................. 2

2.1. Mục tiêu tổng quát .......................................................................................................... 2

2.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................................................... 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................ 3

3.1. Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................ 3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................................. 3

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 3

4.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 3

4.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................................................ 3

5. Tính mới của đề tài .................................................................................................. 4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5

1.1. Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms) .......... 5

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố ................................................................................................. 5

1.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái ...................................................................................... 6

1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng .............................................................................. 7

1.1.3.1. Thành phần hóa học .................................................................................................. 7

1.1.3.2. Công dụng ............................................................................................................... 10

1.2. Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các chi

quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ................................................................... 11

1.2.1. Chi Panax .................................................................................................................. 11

1.2.1.1. Phôi vô tính ............................................................................................................. 11

1.2.1.2. Rễ bất định .............................................................................................................. 14

1.2.2. Chi Acanthopanax ...................................................................................................... 15

1.2.2.1. Phôi vô tính ............................................................................................................. 15

1.2.2.2. Rễ bất định .............................................................................................................. 16

1.2.3. Chi Polyscias ............................................................................................................. 17

1.2.4. Chi Schefflera ............................................................................................................ 18

1.2.4.1. Schefflera octophylla (Lour.) Harms ...................................................................... 18

iv

1.2.4.2. Schefflera arboricola (Hayata) Merr. ..................................................................... 18

1.2.4.3. Schefflera leucantha Viguier ................................................................................. 19`

1.2.4.4. Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon. .................................... 19

1.3. Sự phát sinh phôi vô tính ................................................................................... 20

1.3.1. Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính ........................................................... 20

1.3.2. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính ........................................................ 22

1.4. Sự hình thành rễ bất định .............................................................................................. 29

1.4.1. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định ........................................................... 29

1.4.2. Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định ........................................................ 31

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 35

2.1. Nguồn mẫu – Vật liệu nuôi cấy .................................................................................... 35

2.1.1. Nguồn mẫu ...................................................................................................... 35

2.1.2. Tạo vật liệu nuôi cấy ban đầu ......................................................................... 35

2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 36

2.2.1. Nội dung 1. Tạo phôi vô tính .......................................................................... 36

2.2.2. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính ........................................................................ 36

2.2.3. Nội dung 3. Tạo rễ bất định ............................................................................ 36

2.2.4. Nội dung 4. Nhân rễ bất định .......................................................................... 36

2.3. Nội dung 1. Tạo phôi vô tính ............................................................................. 39

2.3.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............................................................................ 39

2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp

từ mô lá ................................................................................................................................ 39

2.3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá ........... 39

2.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ

mô lá .................................................................................................................................... 40

2.3.1.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá .................................. 40

2.3.1.5. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính ..................................................... 40

2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất ........................................................................................ 41

2.3.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá .......................................... 41

2.3.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm) ............................... 41

2.3.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ................................. 43

2.4. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính ........................................................................... 44

2.4.1. Nhân phôi trên môi trường đặc ....................................................................... 44

2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng .............................................................................. 44

2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc

............................................................................................................................................. 44

2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....... 45

2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp ......................... 45

v

2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....................... 45

2.4.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi.................. 45

2.4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp ......................................... 46

2.4.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc ........................................................................... 46

2.4.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp ................................................... 46

2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định ......................................................... 46

2.5. Nội dung 3. Tạo rễ bất định .......................................................................................... 46

2.5.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .............................................................................. 46

2.5.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định

trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 46

2.5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .............. 47

2.5.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá ...... 47

2.5.1.4. Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá ...................................... 48

2.5.2. Tạo rễ bất định từ chồi ............................................................................................... 48

2.5.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm ........................... 48

2.5.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro ........................................................... 49

2.5.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính ................................................. 49

2.6. Nội dung 4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng ........................................ 50

2.6.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ ....................... 50

2.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ .............................. 50

2.6.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ .................. 50

2.6.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian ....................................... 50

2.7. Điều kiện nuôi cấy in vitro ........................................................................................... 51

2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu ......................................................................... 51

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 52

3.1. Tạo phôi vô tính ................................................................................................. 52

3.1.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............................................................................ 52

3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính

trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 52

3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá

............................................................................................................................................. 57

3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô tính

trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 60

3.1.1.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá ............. 62

3.1.1.5. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính .................................................................. 64

3.1.1.6. Trồng cây con ở chậu đất ........................................................................................ 66

3.1.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp .......................................................................................... 66

3.1.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm) ............................... 66

3.1.2.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ................................. 76

vi

3.2. Nhân phôi vô tính ............................................................................................... 80

3.2.1. Nhân phôi trên môi trường đặc .................................................................................. 80

3.2.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng .............................................................................. 82

3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp ........................ 82

3.2.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....... 83

3.2.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp ....................................... 86

3.2.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi ....................... 88

3.2.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi.................. 90

3.2.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp ............................. 91

3.2.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc ........................................................................... 92

3.2.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp ........................................... 93

3.3. Tạo rễ bất định ................................................................................................... 96

3.3.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .............................................................................. 96

3.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định

trực tiếp từ mô lá .................................................................................................................. 96

3.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá ............ 104

3.1.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá .... 106

3.1.1.4. Minh họa sự tái sinh rễ trực tiếp và khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp

........................................................................................................................................... 109

3.3.2. Tạo rễ bất định từ chồi ............................................................................................. 111

3.3.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm ......................... 111

3.3.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro ......................................................... 113

3.3.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính ............................................... 115

3.4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng .......................................................... 117

3.4.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ ........................................ 117

3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ ............................ 121

3.4.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối của rễ ............... 123

3.4.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian ..................................... 124

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 127

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 127

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 128

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 130

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AUX Auxin

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2-iP 6-dimethylallylamino purine

ABA Abscisic acid

BA Benzyl adenine

CK Cytokinin

ĐC Đối chứng

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

GA3 Gibberellic acid

HPLC High-Performance Liquid Chromatography

IAA Indole-3-acetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

IEDC Induced Embryogenic Determined Cell

KNSP Khả năng sinh phôi

KLP Khối lượng phôi

KLTP Khối lượng tươi phôi

LMTB Lát mỏng tế bào

MS Murashige và Skoog

MSSP Mô sẹo sinh phôi

NAA α-Naphthaleneacetic acid

NGBCC Ngũ gia bì chân chim

NSC Ngày sau cấy

PEDC Pre-Embryogenic Determined Cell

RSV Respiratory Syncytial Virus

RN Rễ nhánh

RSC Rễ sơ cấp

SCV Settled Cell Volume

SEM Scanning Electron Microscope

SH Schenk và Hildebrandt

T_TCL transverse_Thin Cell layer

viii

TDZ Thidiazuron

TEM Transmission Electron Microscope

TIBA 2,3,5-triiodobenzoic acid

VDC Vein-Derived Cell

WPM Woody Plant Medium

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô

tính trực tiếp từ mô lá ở 60 NSC ..................................................

55

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực

tiếp từ mảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC .................................

58

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự

tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá, ở môi trường SH, 60 NSC ....

61

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp

từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường SH, 60 NSC .................

63

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năng

sinh phôi, ở môi trường SH, 30NSC.............................................

68

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá

(10 x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC ..................................

70

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA và BA đến tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3

x 10 mm), ở môi trường SH, 30 NSC .........................................

77

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trên môi

trường đặc SH, 30 NSC ...............................................................

80

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi

trường lỏng SH, 30 NSC .............................................................

82

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh

khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC ..........................

84

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự hình thành phôi thứ cấp,

trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ............................................

87

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ..................................

89

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ...................................

90

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong

môi trường lỏng SH, 21 NSC ......................................................

91

x

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất

định trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30

NSC ............................................................................................

98

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến tạo rễ bất định

trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC

.....................................................................................................

101

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp

từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường ½MS, 30 NSC .............

104

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp

từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ..............

106

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến tạo rễ bất định trực tiếp

từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC ...............

107

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực

tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC .........

108

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có

nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm, ở môi trường ½MS, 60

NSC ............................................................................................

111

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi đốt

thân cây in vitro, ở môi trường ½MS, 60 NSC ............................

113

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có

nguồn gốc phôi vô tính, ở môi trường ½MS, 30 NSC ................

115

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ, ở môi trường

½MS, 21 NSC .............................................................................

118

Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ,

ở môi trường ½MS, 30 NSC ........................................................

121

Bảng 3.26. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh

khối rễ, ở môi trường ½MS, 45 NSC ..........................................

123

xi

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình thái một số bộ phận của cây Ngũ gia bì chân chim

(Schefflera octophylla) .............................................................

5

Hình 2.1. Cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla) ................... 35

Hình 2.2. Lá kép Ngũ gia bì chân chim và vật liệu nuôi cấy ................... 35

Hình 2.3. Vật liệu đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi .................................. 48

Hình 3.1. Các dạng phát triển của phôi vô tính hình thành trực tiếp từ mô

lá ...............................................................................................

52

Hình 3.2. Mảnh lá tạo phôi ở môi trường ½MS, MS, B5, SH có NAA,

60 NSC .....................................................................................

56

Hình 3.3. Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính và hình thái giải phẫu

phôi tương ứng .........................................................................

57

Hình 3.4. Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở môi trường SH có NAA kết hợp

với BA, 60 NSC .......................................................................

59

Hình 3.5. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH,

có đường và điều kiện sáng, tối, 60 NSC .................................

62

Hình 3.6. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH,

có bổ sung nước dừa, 60 NSC ..................................................

64

Hình 3.7 Phôi bình thường và một số dạng bất thường của phôi vô tính

...................................................................................................

64

Hình 3.8. Tạo cây con từ phôi vô tính trên môi trường MS, ½MS không

có chất ĐHST ...........................................................................

65

Hình 3.9. Trồng cây từ phôi vô tính ra chậu đất ở vườn ươm ................... 66

Hình 3.10. Ảnh hưởng của cách cấy mảnh lá đến hiệu quả tạo mô sẹo ...... 66

Hình 3.11. Tạo mô sẹo từ mảnh lá (10 x 10 mm)nuôi cấy trên môi trường

SH .............................................................................................

67

Hình 3.12. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có khả năng

sinh phôi ở môi trường SH, 30 NSC .........................................

69

Hình 3.13. Tái sinh phôi từ mô sẹo có khả năng sinh phôi trên môi trường

đặc SH, 30 NSC và hình thái giải phẫu phôi tái sinh từ mô sẹo

...................................................................................................

71

xii

Hình 3.14. Các dạng phát triển của phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá, cây

con hoàn chỉnh từ phôi .............................................................

73

Hình 3.15. Tạo phôi từ mô sẹo có KNSP bằng phương pháp nuôi lỏng lắc,

hình thái cụm tế bào phân chia, cụm mô tạo phôi .....................

74

Hình 3.16. So sánh kết quả tái sinh phôi ở môi trường SH đặc và lỏng, 30

NSC ..........................................................................................

75

Hình 3.17. Mô sẹo hình thành từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH

có 2,4-D, 20 – 30 NSC ..............................................................

76

Hình 3.18. Tạo phôi gián tiếp từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) trên môi

trường SH, 30 NSC ..................................................................

78

Hình 3.19. Phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH,

60 NSC .....................................................................................

79

Hình 3.20. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự nhân phôi trên môi trường

đặc SH, 30 NSC .......................................................................

81

Hình 3.21. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp nuôi lỏng

trong môi trường SH, 30 NSC .................................................

83

Hình 3.22. Ảnh hưởng của khối lượng phôi (w/v) nuôi cấy đến tăng

trưởng sinh khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 45 NSC .......

84

Hình 3.23. Nhân phôi qua nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường SH, 30 – 60

NSC ..........................................................................................

85

Hình 3.24. Sự đa dạng của kích thước phôi từ quá trình nuôi lỏng lắc trong

môi trường SH ..........................................................................

86

Hình 3.25. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp trong

môi trường lỏng SH, 30 NSC ....................................................

88

Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối phôi,

trong môi trường lỏng SH, 30 NSC ...........................................

89

Hình 3.27. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng sinh

khối phôi, trong môi trường lỏng SH, 30 NSC .........................

91

Hình 3.28. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp, trong

môi trường lỏng SH, 21 NSC ...................................................

92

Hình 3.29. Tạo cây con từ phôi vô tính nuôi lỏng lắc trong môi trường

MS, ½MS .................................................................................

93

xiii

Hình 3.30. Hình thái giải phẫu của phôi sơ cấp và thứ cấp ....................... 94

Hình 3.31. Đĩa cấy mảnh lá trên môi trường ½MS có 3 mg/L NAA, 30

NSC ..........................................................................................

96

Hình 3.32. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường MS, có

NAA, 30 NSC .....................................................................

99

Hình 3.33. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường ½MS,

có NAA, 30 NSC .....................................................................

99

Hình 3.34. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường B5, có

NAA, 30 NSC ...........................................................................

99

Hình 3.35. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm) ở môi trường SH, có

NAA, 30 NSC ...........................................................................

99

Hình 3.36. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường MS, có

NAA, 30 NSC ...........................................................................

102

Hình 3.37. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường ½MS,

có NAA, 30 NSC ......................................................................

102

Hình 3.38. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường B5, có

NAA, 30 NSC ...........................................................................

102

Hình 3.39. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH, có

NAA, 30 NSC ...........................................................................

102

Hình 3.40. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ trực tiếp từ mảnh

lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC .........................

105

Hình 3.41. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ từ mảnh lá (3 x

10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC .......................................

106

Hình 3.42. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từ

mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC .................

107

Hình 3.43. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từ

mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC .................

108

Hình 3.44. Minh họa cận cảnh sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ mảnh lá

nuôi cấy trên môi trường ½MS, 12 – 20 NSC ...........................

109

Hình 3.45. Hình thái giải phẫu sơ khởi rễ bất định hình thành trực tiếp từ

mảnh lá .....................................................................................

110

xiv

Hình 3.46. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân, ở môi trường

½MS, 60 NSC ..........................................................................

112

Hình 3.47. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro, ở môi trường

½MS, 60 NSC ...........................................................................

114

Hình 3.48. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính, ở môi trường

½MS, 30 NSC ...........................................................................

116

Hình 3.49. Vật liệu rễ bất định sơ cấp ở 20 NSC ....................................... 117

Hình 3.50. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến hình thành rễ nhánh từ rễ đơn,

ở môi trường ½MS ....................................................................

119

Hình 3.51. Rễ tăng trưởng sinh khối liên tục qua quá trình phân nhánh của

rễ đơn ........................................................................................

120

Hình 3.52. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối

rễ, ở môi trường ½MS, 30 NSC ................................................

122

Hình 3.53. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh

khối rễ, ở môi trường ½MS, 45 NSC ........................................

124

Hình 3.54. Diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian, 7 –

49 NSC .....................................................................................

126

Biểu đồ 3.1. Tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian ...................... 125

xv

TÓM TẮT

Đề tài: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì

chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)” được thực hiện tại Viện Sinh học

nhiệt đới –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 9 năm 2015 đến

tháng 9 năm 2019.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián

tiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc. Tạo

được rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc.

Mục tiêu cụ thể của đề tài là: (1) Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng (môi

trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, đường,…) đến tái sinh trực tiếp hoặc/và

gián tiếp phôi vô tính và rễ bất định từ mô lá nuôi cấy in vitro; (2) Xác định được một

số yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, số/khối lượng

phôi/rễ, đường,…) đến nhân phôi vô tính và rễ bất định có nguồn gốc từ mô lá nuôi

cấy in vitro; (3) Tạo được cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (4) Tạo được

rễ bất định từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (5) Xác định được hình thái

giải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn phát triển khác nhau, nguồn gốc tế bào

phát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹ thuật nhuộm hai màu.

Đề tài gồm có các nội dung cơ bản như: (i) Tạo phôi vô tính trực tiếp và gián

tiếp từ mô lá; (ii) Nhân phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng

lắc; (iii) Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (iv) Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô

lá, từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (v) Nhân rễ bất định trong môi trường

lỏng lắc; (vi) Khảo sát hình thái giải phẫu phôi vô tính và rễ bất định.

Qua nghiên cứu, kết quả cho thấy môi trường thích hợp cho sự hình thành phôi

vô tính trực tiếp từ nuôi cấy in vitro mô lá cây Ngũ gia bì chân chim là SH có bổ sung

5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA; 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa kết hợp với nuôi

mô ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux. Môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo từ mô lá

là môi trường SH có 2 mg/L 2,4-D. Phôi vô tính tái sinh (gián tiếp) từ mô sẹo trên

môi trường SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 30 g/L sucrose. Đã nhân in vitro

thành công phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sự

hình thành phôi thứ cấp theo cơ chế bất định. Nhân phôi trong môi trường lỏng hiệu

quả hơn so với môi trường đặc. Môi trường lỏng thích hợp dùng nhân nhanh phôi vô

xvi

tính là môi trường SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10%

(v/v) nước dừa; khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), kích thước

phôi thích hợp dùng nuôi cấy ~ 10 mm, điều kiện chiếu sáng ~ 4.000 lux. Phôi vô

tính phát triển thành cây con có khả năng sinh trưởng bình thường trong điều kiện in

vitro và ex vitro.

Môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá là môi trường đặc

½MS có 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; cường độ ánh sáng ~ 4.000 lux. Đã nhân thành

công sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng phương pháp nuôi

lỏng lắc dùng môi trường ½MS có bổ sung 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose. Khối lượng

rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), sinh khối rễ phát triển rất nhanh ở giai

đoạn 21–35 ngày, đạt mức cao nhất ở giai đoạn 42 ngày sau cấy.

Cũng đã tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân (cây vườn ươm,

cây in vitro) và phôi vô tính (đã cắt bỏ rễ trụ), ghi nhận được hình thái giải phẫu phôi

vô tính và rễ bất định bằng phương pháp nhuộm hai màu.

xvii

SUMMARY

The study “In vitro induction and multiplication of somatic embryos and

adventitious roots of Schefflera octophylla Lour. Harms” was carried out at the

Institute of Tropical Biology (ITB) – Vietnam Academy of Science and Technology

(VAST) from September of 2015 to September of 2019.

The general objective of this study was to generate directly/indirectly somatic

embryos and multiply somatic embryos on solid and shaking liquid media, to generate

directly adventitious roots and mutiply adventitious roots in shaking liquid medium.

The specific objectives of the study were to identify: (1) The optimal culture

conditions for inducing direct and indirect formation of somatic embryos and

adventitious roots from leaf explants cultured in vitro; (2) The optimal culture

conditions for multiplication of somatic embryos and adventitious roots originated

from leaf explants on solid and/or shaking liquid media; (3) The condition for

generation of in vitro plantlets from somatic embryos; (4) The condition for induction

of adventitious roots from shoots originated from nodal explants/somatic embryos (5)

The morphological and histological properties of somatic embryos at many different

stages of development, cellular origin of somatic embryo and adventitious root

formation through double staining with carmine alum and iodine green.

The study comprised of four contents: (i) To generate directly/indirectly

somatic embryos from leaf explants; (ii) To multiply somatic embryos on the solid

and liquid media; (iii) To generate the plantlets originated from somatic embryos; (iv)

To generate directly adventitious roots from leaf explants, from shoots originated

from nodal explants/somatic embryos; (v) To multiply adventitious roots in liquid

medium; (vi) To examine the morphology and histology of somatic embryo and

adventitious root.

The results showed that the suitable medium for the direct induction of somatic

embryos from the leaf explants cultured in vitro was SH + 5 mg/L NAA + 0.25 mg/L

BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose, in light condition ~ 4,000 lux. The

suitable media for callus induction from the leaf explants, for regeneration of somatic

embryos from callus, were SH + 2 mg/L 2,4-D; SH + 2 mg/L NAA + 0.25 mg/L BA,

30 g/L sucrose, respectively. Successfully in vitro multiplied somatic embryos on

xviii

solid and shaking liquid media through secondary embryogenesis by an adventitious

mechanism. Somatic embryo multiplication in liquid medium was more efficient than

on solid media. The suitable liquid medium for multiplication of somatic embryos

was SH + 2 mg/L + 0.25 mg/L BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose; the

suitable somatic embryo inoculum density/size for culture was 2% (w/v), the suitable

size of somatic embryos for multiplication in liquid medium was ~ 10 mm, light

condition was 4,000 lux. The somatic embryos developed into plantlets with normal

growth under in vitro/ex vitro conditions.

The suitable medium for direct adventitious roots from leaf explants was ½MS

+ 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, light condition was ~ 4,000 lux. Through secondary

rhizogenesis by an adventitious mechanism, successfully in vitro multiplied

adventitious roots in liquid medium ½MS + 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; suitable

root inoculum density for culture was 2% (w/v), root biomass developed quickly at

the period of 21-35 days, reaching the highest level at 42 days after culturing.

The adventitious roots from shoots originated from nodal explants

(greenhouse and in vitro plants) and somatic embryos (with the tap roots removed),

the morphology and anatomy of somatic embryos and adventitious roots via double

staining method were also achieved.

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms), là loài cây thuộc

họ Ngũ gia bì/Nhân sâm (Araliaceae) – họ các loài thực vật có nguồn hoạt chất sinh

học quan trọng, trong đó có Ngũ gia bì chân chim (NGBCC) [1]. Trong Đông y và y

học hiện đại, có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên cứu về các hợp chất thứ

cấp ở NGBCC với nhiều tác dụng như tăng cường sức khỏe [2], kháng virus [3][4][5]

kháng một số dòng tế bào ung thư [6], làm giảm đau [7] kháng viêm [8], đông máu

[9],... Ở Việt Nam, các vật liệu như lá, vỏ của thân/rễ và rễ nhỏ Ngũ gia bì chân chim

đều được dùng để làm thuốc [10].

Đến nay, một số công trình có liên quan đến NGBCC đã được ghi nhận như

nhân giống bằng phương pháp giâm cành, và bằng phương pháp nuôi cấy mô [3].

Đặng Thị Thanh Tâm (2012) đã nghiên cứu tạo rễ tơ thông qua biến nạp gen dùng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes và thử nghiệm sản xuất sinh khối loại rễ này bằng

hệ thống bioreactor [11].

Trong những năm gần đây, nghiên cứu ở lĩnh vực sinh học nói chung, sinh lý

học thực vật nói riêng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trong đó phương pháp

nuôi cấy mô tế bào luôn được các nhà nghiên cứu quan tâm sử dụng như một công

cụ nhằm tìm hiểu sâu các khía cạnh sinh lý của tính toàn thế của tế bào như vai trò

sinh lý của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) ngoại sinh, nội sinh và tương tác của

chúng, vai trò của các hệ thống di chuyển và phân bố auxin trong mối quan hệ với hệ

thống gene điều hòa, tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy,.. đối với sự hình thành, phát triển

hai con đường phát sinh hình thái phôi vô tính/rễ bất định thông qua hai kiểu tái sinh

trực tiếp/gián tiếp của hai dạng hình thái phát sinh nói trên [12][13][14][15].

Theo nhiều tài liệu, hệ thống phôi vô tính không chỉ là mục tiêu đối với nghiên

cứu về phát sinh hình thái mà còn là vật liệu được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

nhằm các mục đích khác nhau như nhân giống [16], thu hợp chất thứ cấp [17], bảo

quản nguồn gen in vitro [18], tạo hạt nhân tạo [19], biến nạp gen [20], nuôi cấy quang

tự dưỡng [21], chuyển giao công nghệ và thương mại hóa sản phẩm phôi vô tính [22].

Tương tự phôi vô tính, rễ bất định cũng là mục tiêu trong các nghiên cứu về phát sinh

hình thái; ngoài ra, nuôi cấy rễ bất định cũng là một trong các hướng nghiên cứu rất

2

quan trọng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp. Hệ thống nuôi cấy này khắc phục

được các nhược điểm của hệ thống nuôi cấy tế bào trong một số trường hợp, do các

ưu điểm sau: một là, rễ là một tập hợp có hệ thống các tế bào biệt hóa và như vậy đã

mang một nhiệm vụ nhất định đối với hoạt động sống của cây, do vậy cũng liên kết

với năng lực sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp; hai là, đối với một số cây dược liệu,

rễ là nơi sinh tổng hợp/tích tụ các hợp chất thứ cấp; ba là, có thể nhân nhanh sinh

khối rễ trong môi trường lỏng mà không bị hạn chế vì hiện tượng hóa kính/hóa trong

(vitrification) như trường hợp nuôi thể chồi; bốn là, tương tự như ở một số hệ thống

nuôi cấy khác, có thể nuôi nhân quy mô lớn rễ trong điều kiện khống chế, không phụ

thuộc vào điều kiện môi trường bên ngoài.

Đến nay đã ghi nhận được một số công bố về kết quả nghiên cứu nhân sinh

khối rễ, phôi vô tính phục vụ chiết xuất, thu nhận hợp chất thứ cấp với nhiều quy mô

khác nhau, ví dụ như ở trường hợp Panax ginseng, Panax vietnamensis, Panax

quinquefolius [ 23][24][17]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa ghi nhận được công bố nào

trên thế giới và trong nước nghiên cứu về nuôi cấy phôi vô tính và rễ bất định cây

NGBCC.

Dựa vào các cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên và góp phần phát triển nghiên

cứu trên đối tượng NGBCC, luận án được thực hiện với tên đề tài: “Nghiên cứu tạo,

nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla

Lour. Harms)” phục vụ định hướng dài hạn sử dụng nguồn phôi vô tính, rễ bất định

cho các nghiên cứu về nhân giống, thu nhận hợp chất thứ cấp và cho một số nghiên

cứu quan trọng khác trong tương lai.

2. Mục tiêu của đề tài

2.1. Mục tiêu tổng quát

Tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tính

trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc. Tạo được rễ bất định tái sinh trực

tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc.

2.2. Mục tiêu cụ thể

Xác định được điều kiện môi trường thích hợp cho sự cảm ứng hình thành phôi

vô tính trực tiếp và gián tiếp từ mô lá (môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin và

cytokinin, nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa, điều kiện chiếu sáng,…).

3

Xác định được điều kiện thích hợp (chất ĐHST, khối lượng/kích thước phôi,

nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa) cho sự nhân sinh khối và tăng sinh phôi.

Xác định được điều kiện thích hợp cho sự cảm ứng hình thành và tăng sinh rễ

bất định từ mô lá (môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin, nồng độ đường, điều

kiện chiếu sáng,…).

Tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính.

Xác định được hình thái giải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn phát

triển khác nhau, nguồn gốc tế bào phát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹ

thuật nhuộm hai màu.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học

Cung cấp những dẫn liệu khoa học mới có giá trị nghiên cứu về hai con đường

phát sinh hình thái phôi vô tính và rễ bất định, hai kiểu tái sinh trực tiếp/gián tiếp phôi

vô tính và rễ bất định; về nhân phôi vô tính và rễ bất định thông qua cơ chế tạo phôi

và rễ bất định thứ cấp ở NGBCC - một trong các đối tượng thực vật/cây dược liệu

quan trọng thuộc họ Ngũ gia bì. Đồng thời, luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu

ích phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực sinh lý thực vật, nuôi cấy mô,

tế bào thực vật.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả từ nghiên cứu này là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu nhân sinh khối

phôi vô tính, rễ bất định trên quy lớn và sản phẩm sinh khối tạo được có thể được sử

dụng trong nghiên cứu nhân giống (phôi vô tính), thu hợp chất thứ cấp (rễ bất định)

phục vụ lĩnh vực y dược và mỹ phẩm.

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1. Đối tượng nghiên cứu

Phôi vô tính từ nuôi cấy mảnh lá; rễ bất định từ nuôi cấy mảnh lá/chồi có nguồn

gốc đốt thân/phôi vô tính.

4.2. Phạm vi nghiên cứu

Đề tài thực hiện trên cơ sở ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô nhằm tạo và

nhân phôi vô tính, tạo và nhân rễ bất định dưới ảnh hưởng của một số yếu tố như môi

trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, đường, ánh sáng,…, tạo cây con in vitro

4

hoàn chỉnh từ phôi vô tính và ứng dụng phương pháp khảo sát hình thái/hình thái giải

phẫu mô tế bào nhằm xác định nguồn gốc phát sinh phôi vô tính và rễ bất định.

Do giới hạn về thời gian nên chưa đề cập đến nghiên cứu nhân rễ bất định từ

chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính bằng phương pháp nuôi lỏng lắc, nhân phôi

vô tính/rễ bất định bằng hệ thống bioreactor cũng như không thu thập số liệu các chỉ

tiêu sinh trưởng của cây từ phôi vô tính ở giai đoạn ex vitro.

5. Tính mới của đề tài

Nghiên cứu này đã xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy

thích hợp cho sự phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC, đồng thời cũng

xây dựng quy trình tạo phôi gián tiếp thông qua mô sẹo mảnh lá. Nhân in vitro phôi

vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sự hình thành phôi

thứ cấp theo cơ chế bất định. Phôi vô tính phát triển thành cây con có khả năng sinh

trưởng bình thường trong điều kiện in vitro và ex vitro. Kết quả này có ý nghĩa rất

lớn trong nhân giống loài dược liệu này.

Xác định được môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá

nuôi cấy in vitro. Nhân sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng

phương pháp nuôi lỏng lắc. Kết quả này có thể ứng dụng cho hướng nghiên cứu sản

xuất thu các hợp chất thứ cấp.

5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố

Giới : Plantae

Ngành: Magnoliopsida

Lớp : Magnoliopsida

Bộ : Apiales

Họ : Araliaceae

Chi : Schefflera

Loài : Schefflera octophylla

`

Họ Ngũ gia bì/họ Nhân sâm (Araliaceae) là họ rất đa dạng về thành phần loài,

có khoảng 70 chi, 900 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, rất ít đại

diện ở vùng ôn đới, phần lớn các chi và loài phân bố ở Đông nam Á, châu Úc, châu

Mỹ nhiệt đới. Ở Việt Nam thực vật thuộc họ Ngũ gia bì cũng khá đa dạng về thành

phần loài, đặc điểm sinh thái – sinh học, hiện thống kê được 141 loài thuộc 19 chi,

phân bố rộng thường mọc rải rác ở vùng rừng núi nhưng mọc tập trung nhiều ở những

vùng núi cao có khí hậu ôn hòa, có nhiều loài sống ở những nơi quang đãng, ẩm ướt,

ven rừng, ven suối…Thực vật họ Ngũ gia bì còn rất đa dạng và phong phú về các hợp

chất thứ cấp, có khả năng tổng hợp và tích lũy các hợp chất triterpenoid saponin,

steroidal saponin, ginsenosides, polysaccharid, các flavonoid, tinh dầu, các hợp chất

Hình 1.1. Hình thái một số bộ phận của cây NGBCC (Schefflera octophylla)

A. Lá; B. Hoa; C. Quả

(Nguồn: A: Wikipedia – Việt Nam; B,C: Wang và cộng sự, 2021[25])

6

hữu cơ khác…[1]. Đây chính là nguồn hợp chất sinh học có hoạt tính rất tốt, vì thế

rất nhiều loài trong họ này đã được sử dụng làm nguồn dược liệu quý có giá trị cao

trong ứng dụng bảo vệ sức khỏe cho con người.

Chi Schefflera là chi lớn nhất trong họ Ngũ gia bì, thành phần loài rất đa dạng

với khoảng 450 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Á như

Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Sri

Lanka, Philippines, Indonesia, New Zealand, Singapore, Australia và một số đảo ở

Thái Bình Dương [10]. Ở Việt Nam cũng đã thống kê được 56 loài (chiếm 39,7%

tổng số loài của họ Ngũ gia bì), 4 thứ [1]. Nhiều loài trong chi này đã được sử dụng

làm thuốc chữa trị bệnh phong thấp, đau nhức xương khớp ngoài ra còn có tác dụng

điều trị bệnh tiêu hóa, ho, cầm máu…như NGBCC (Schefflera octophylla Lour.

Harms), Chân chim Bắc bộ (Schefflera tonkinensis R. Vig), Chân chim lá nhỏ

(Schefflera pes-avis R. Vig), Ngũ gia bì lá láng (Schefflera nitidifolia Harms), Chân

chim Sapa (Schefflera vietnamensis Grush, N. Skvorts/Schefflera chapana Hamrs), ở

loài Chân chim núi – Chân chim Petelot (Schefflera petelotii Merr.) còn được sử dụng

chữa gãy xương [10].

NGBCC có danh pháp khoa học là Schefflera octophylla (Lour.) Harms [26],

tên khoa học khác Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, Aralia octophylla Lour, còn có

tên gọi khác là Sâm nam, cây Đáng, Lá lằng, Kotan (Lào). Đây là loài thực vật thường

xanh, có hoa, có nguồn gốc từ Đông Á là Nhật Bản và miền nam Trung Quốc. Ở Nhật

Bản NGBCC mọc hoang từ miền nam Kyushu đến Okinawa, nó là loài thực vật đại

diện cho vùng Yanbaru của Okinawa Nhật Bản. Ở Trung Quốc NGBCC phân bố chủ

yếu ở Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam, Phúc Kiến [8]. Ở Việt Nam, NGBCC mọc

rải rác ở vùng núi cao phía bắc, phía nam của dãy Trường Sơn, có nơi mọc tập trung

có diện tích lớn khoảng 5 - 10 hecta, gặp ở các tỉnh như Lạng Sơn, Cao Bằng, Lào

Cai, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang,

Ninh Bình, Quảng Ngãi, Đắc Lắc, Bình Phước, Lâm Đồng [27][10].

1.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái

NGBCC thuộc loài cây nhỏ hoặc cây to, cao khoảng 2 - 8 m. Lá chét hình chân

vịt, mọc so le có 6 - 8 lá chét, cuống lá dài 8 - 30 cm, lá chét nguyên, hình trứng, đầu

nhọn hay hơi tù, dài 7 - 17 cm, rộng 3 - 6 cm, cuống lá chét ngắn 1,5 - 2,5 cm, cuống

lá chét giữa dài hơn có thể tới 5 cm, mặt trên lá xanh sẫm bóng, mặt dưới lá nhạt hơn.

7

Cụm hoa mọc thành chùm tán, hoa nhỏ màu trắng thơm, mẫu 5, bao phấn có 2 ngăn,

bầu dưới, trên cuống phụ của cụm hoa đôi khi có hoa riêng lẻ. Quả mọng hình cầu,

đường kính ~ 5 mm, khi chín có màu tím sẫm đen, cây thường ra hoa vào tháng 2 -

3, ra quả vào tháng 4 - 5 [27][10].

NGBCC thuộc cây gỗ trung sinh, ưa ẩm, ưa sáng nhưng ở giai đoạn còn nhỏ

cây chịu bóng, chịu hạn, mọc xen với một số loài cây gỗ, cây bụi ven suối, ven rừng,

ẩm ướt…ngoài ra còn gặp ở rừng non phục hồi hoặc vùng nương rẫy. NGBCC sống

được ở nhiều loại đất khác nhau, thích hợp nhất ở đất feralit vàng đỏ. Đây là loài cây

gỗ phát triển nhanh, nhất là giai đoạn từ 5 - 15 năm tuổi, cây có thể sống đến 45 năm

tuổi, chiều cao khoảng 20 m, đường kính thân khoảng 43 cm, NGBCC có khả năng

tái sinh bằng hạt và bằng chồi rất tốt, những cây tái sinh từ hạt có bộ rễ phát triển tốt

hơn cây tái sinh từ chồi [10].

1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng

1.1.3.1. Thành phần hóa học

Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của NGBCC thông qua chiết

xuất, phân tách và phân lập các chất từ các bộ phận lá, thân, rễ. Kết quả thu được

nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính tốt được sử dụng trong y học. Chen và cộng sự

(2015) cho rằng thành phần hóa học chính là triterpenoid, đã có hơn 40 loại

triterpenoid được chiết xuất từ các bộ phận của loài thực vật này [7], bao gồm

oleanane [29][30], ursane [31], lupane [2][29][30].

Lá

Phân lập hoạt chất từ lá NGBCC thu được 2 triterpenoid glycoside mới là 3-

epi-betulinic acid 3-O-β-D-glucopyranoside (1); 3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-

dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-

glucopyranoside (2); khác với lup-20(29)-ene-23,28-dioic acid [2].

Nghiên cứu của Sung và cộng sự (1991) phân lập hoạt chất từ lá khô, thu nhận

một glucoside triterpenoid sulfate mới, từ dữ liệu quang phổ và biến đổi hóa học đã

xác định là 3-epi-betulinic axid 3-O-sulfate 28-O-[α-L- rhamnopyranosyl (1→4)-O-

β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside [28]. Tiếp tục phân lập từ lá, Sung

và cộng sự thu nhận được một saponin triterpenoid 3,28-bidesmosidic mới, một

trisaccharid mới và oleanonic acid. Dựa trên dữ liệu quang phổ và sự biến đổi hóa

học, các thành phần mới được xác định là 3-epi-betulinic acid 3-O-β-D-

8

glucopyranoside 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-glucopyranosyl

(1→6)]-β-D-glucopyranoside; α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-D-glucopyranosyl

(1→6)-β-D-glucopyranoside [29]. Phân lập lá, dùng dữ liệu quang phổ và biến đổi

hóa học, Sung và cộng sự thu nhận được 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-

D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside của 3α-hydroxylup-20(29)-ene-

23,28-dioic acid (1); 3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (2); 3-epi-

betulinic acid (3), trong đó hợp chất (2) và (3) được tìm thấy lần đầu tiên trong giới

thực vật [29].

Li và cộng sự (2005) đã phân lập từ cuống lá NGBCC thu được ba dẫn xuất

caffeoylquinic acid là 3,4-di-O-caffeoylquinic axid (1); 3,5-di-O-caffeoylquinic axid

(2); 3-O-caffeoylquinic axid (3). Những hợp chất này có hoạt tính kháng virus - chống

lại virus thể hợp bào gây bệnh hô hấp Respiratory Syncytial Virus (RSV), trong đó

3,4-di-O-caffeoylquinic axid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid có hoạt tính chống RSV

rất mạnh mẽ. Các hợp chất này phát huy tác dụng chống RSV, thông qua việc ức chế

sự dung hợp tế bào-virus trong giai đoạn đầu và ức chế sự dung hợp tế bào-virus ở

giai đoạn cuối [4]. Li và cộng sự (2007) chiết xuất từ lá, tiến hành phân đoạn và phân

lập đã thu được hai triterpenoid tinh khiết có hoạt tính cao, kháng virus hợp bào hô

hấp (RSV) rất mạnh, là 3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1); 3-epi-

betulinic acid 3-O-sulfate (2), và một saponin không hoạt động là 3α-hydroxylup-

20(29)-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside [5]. Tiếp tục phân tích thành phần hóa

học tinh dầu được chiết xuất từ lá, Li và cộng sự (2009) đã thu được 27 hợp chất dễ

bay hơi, trong đó có 17 hợp chất thuộc về monoterpene hoặc sesquiterpene. Tinh dầu

này có hoạt tính kháng sinh với ba dòng tế bào ung thư: tế bào MCF-7, A375 và Hep

G2 [6].

Từ nguyên liệu lá tươi của NGBCC, Liu và cộng sự (2019) đã phân lập và xác

định được 03 lupanine triterpenes có tác dụng đông máu hiệu quả, đó là 3α-hydroxy-

lup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1); betulinic acid 3-0-sulfate (2); 3α-hydroxylup-

20(29)-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D-

glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside (3). Trong đó chất betulinic acid 3-0-

sulfate thúc đẩy sự đông máu rất đáng kể, tác dụng cầm máu hiệu quả cao [9].

9

Thân

Một triterpenoid mới và glycoside được phân lập từ vỏ thân của NGBCC là

asiatic acid; và các asiaticoside được xác định là 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic

acid; 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-

O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside. Lần đầu tiên asiaticoside được

phân lập từ một loài thực vật không phải của Centella Asiatica [31].

Wu Chun và cộng sự (2013) đã phân lập từ vỏ thân, trên cơ sở phân tích quang

phổ và phương pháp hóa học đã thu được chín saponin triterpenoid mới gồm bốn

saponin triterpenoid loại ursane là heptursosides AD (1-4), saponin triterpenoid loại

oleanane là heptoleosides AD (5-8), một saponin triterpenoid loại damarane,

heptdamoside A, cùng với hai saponin đã biết là asiaticoside D và scheffoleoside B.

Lần đầu tiên sự hiện diện của saponin triterpenoid tetracyclic từ Schefflera, các

saponin có vai trò chống viêm [32]. Tiếp tục nghiên cứu các hợp chất chiết xuất từ

vỏ thân, Wu Chun và cộng sự (2014) phân lập được năm saponin triterpenoid loại

ursane mới (1-5), các hợp chất được phân lập từ cây này đều được đánh giá về các

hoạt động ức chế sản xuất oxide nitric do lipopolysaccharide gây ra trong tế bào

RAW264.7, và các hợp chất 2 và 5 cho thấy hoạt động chống viêm yếu ở nồng độ

không gây độc tế bào của chúng [33].

Trung tâm Sâm Việt Nam đã hợp tác với Đại học Hiroshima Nhật Bản đã chiết

xuất từ vỏ thân đã xác định được 12 glycozid triterpenoid trong đó có 3 hợp chất đã

biết là asiaticozid, caulozid, 3-α-hydroxylup-ene-23,28-dioic acid 28-α-rhamnosyl

(1→4)-β-D-glucopyranozid (1→6)-β-D-glucopyranozid và chín hợp chất mới. Trong

12 hợp chất được xác định từ vỏ thân có 6 cặp có cấu trúc ursen và oleanen tương

ứng, các cặp glycozid ursen và oleanen tương ứng được đặt tên là scheffursozid A,

B, C, D, E, F và scheffoleozid A, B, C, D, E, F [27].

Rễ

Rễ NGBCC dùng làm thuốc bổ nên còn gọi là Sâm nam [10]. Từ nguồn nguyên

liệu là vỏ rễ của NGBCC được thu thập từ Quảng Châu, tỉnh Quảng Đông, Trung

Quốc, Chen và cộng sự (2015) đã phân lập, dùng kỹ thuật sắc ký, phân tích dữ liệu

quang phổ đã xác định được 6 triterpenoid là taraxerone (1), 3-epi-taraxerol (2),

aleuritolic acid (3), 3-oxofriedelan-28-oic acid (4), 3β,19α-dihydroxy-urs-12-ene-

24,28-dioic acid (5), asiatic aicd (6). Trong đó, các hợp chất từ 1-5 lần đầu tiên thu

10

được từ loài cây này. Những chất hóa học này có vai trò chống viêm, chống ung thư

và chống viêm khớp dạng thấp [7].

1.1.3.2. Công dụng

Trung tâm Sâm Việt Nam hợp tác với Viện nghiên cứu cây thuốc Poznan (Ba

Lan) cho thấy NGBCC có nhiều tác dụng [32].

Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: NGBCC tác động hai hướng trên hệ

thần kinh trung ương liều nhỏ (1/500 của LD50) kích thích nhẹ trên hệ thần kinh trung

ương, liều cao (1/20 của LD50) làm ức chế hệ thần kinh trung ương.

Tác dụng trên nội tiết tố sinh dục: Thực hiện trên hai nhóm súc vật có cơ địa

bình thường, trưởng thành và nhóm súc vật bị suy nhược sinh dục. Nhóm súc vật có

cơ địa bình thường, trưởng thành kết quả cho thấy sự tác động không có biểu hiện rõ

rệt. Ở nhóm súc vật bị suy nhược sinh dục đều có sự gia tăng trọng lượng cơ quan

sinh dục so với đối chứng, đồng thời sự tác động của oestrogen và androgen đều biểu

hiện ở liều thấp. Sự tác động của bộ phận lá mạnh hơn so với tác động của bộ phận

thân NGBCC.

Tác dụng kháng viêm, giảm đau: Nghiên cứu tiến hành trên bột chiết từ lá

NGBCC có tính kháng viêm rõ ở 2 liều thử 0,1 g/kg và 0,5 g/kg trong đó ở liều 0,1

g/kg tác dụng điển hình hơn. Nghiên cứu về tác dụng giảm đau cho kết quả 50% -

60%.

Những nghiên cứu về dược lý những năm gần đây cho thấy, các chất hóa học

được chiết xuất, phân tách, phân lập từ các bộ phận của NGBCC có nhiều hoạt tính

sinh học khác nhau như: kháng virus rất mạnh [3][4][5], tác dụng chống các tế bào

ung thư [6][7], chống viêm [7][32][33], chống viêm khớp [7], giảm đau [7], ngoài ra

NGBCC còn được sử dụng theo cách truyền thống để chữa chảy máu do chấn thương,

và tác dụng tăng đông máu có liên quan đến việc điều hòa mạch hoạt chất nội mô và

các thông số huyết học [8].

Trong nghiên cứu về dược lý saponin triterpenoid loại damarane cũng như các

dẫn xuất của chúng có hoạt tính sinh học chống khối u, chống viêm, kích thích miễn

dịch, tăng sinh tế bào thần kinh, chống lão hóa, chống vi khuẩn, chống tiểu đường,

chống loãng xương.

Từ lâu trong dân gian ở Trung Quốc, Việt Nam các bộ phận của cây NGBCC

(lá, vỏ thân, vỏ rễ, rễ nhỏ) được sử dụng làm thuốc, như rễ dùng làm thuốc bổ, vỏ

11

thân chữa thấp khớp, viêm họng, cảm sốt, vết thương sưng đau, ngoài ra vỏ còn giúp

ăn ngon, ngủ tốt, phục hồi và tăng cường sức khỏe, hạ nhiệt, chống viêm, giảm đau,

trị thấp khớp, đau xương, chữa bệnh gan, tác dụng tốt đến hệ thần kinh trung ương,

chống suy nhược thần kinh, giúp tăng cường trí nhớ [27][10].

1.2. Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các

chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

1.2.1. Chi Panax

1.2.1.1. Phôi vô tính

Qua sử dụng phôi hợp tử non Panax ginseng, Arya và cộng sự (1993) đã

nghiên cứu sự hình thành phôi vô tính và mô sẹo có khả năng sinh phôi. Các phôi sơ

cấp đã tạo phôi thứ cấp cấp 1, cấp 2 và sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào chất

điều hòa sinh trưởng (ĐHST). Một số loại auxin được sử dụng như 2,4-D, NAA và

IAA 1 mg/L rất thích hợp cho tạo phôi thứ cấp; ngược lại, kinetin, BA ức chế tạo

phôi thứ cấp [34].

Choi và cộng sự (2003) đã sử dụng các mảnh lá mầm phôi hợp tử sâm Panax

ginseng tạo phôi vô tính trực tiếp trên môi trường đặc MS không bổ sung chất ĐHST,

có 30 g/L đường; ngược lại, môi trường có nồng độ khoáng NH4NO3 cao (60 mM)

chỉ cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi. Mô sẹo có khả năng sinh phôi được

cấy chuyển nhiều lần trên môi trường vẫn có khả năng phát triển tiếp tục dù không

bổ sung chất ĐHST. Mô sẹo được nuôi cấy trong bình tam giác (V500 mL) chứa môi

trường MS/½MS có 30 g/L đường để nhân lên phục vụ cho nuôi cấy quy mô lớn hơn

trong bioreactor (V20 lít); khối lượng tươi mô tăng lên 7,1 lần sau 5 tuần nuôi cấy

trong bioreactor chứa môi trường 1/3MS có 30 g/L đường. Hàm lượng ginsenoside

tổng số thấp hơn 6 lần so với rễ cây sâm sinh trưởng ở điều kiện tự nhiên [35].

Cũng từ vật liệu mảnh lá mầm phôi hợp tử, Zhou và Brown (2006) đã xây

dựng được quy trình tạo cây sâm Bắc Mỹ (Panax quinquefolius) có hiệu quả thông

qua nuôi cấy tạo phôi vô tính. Tiền xử lý mảnh lá mầm với 1 M đường ở 4oC đã cải

thiện được số lượng phôi hình thành. Việc kết hợp tiền xử lý với nuôi cấy dùng nồng

độ đường cao (7%) cũng đã nâng cao được tỷ lệ phát sinh phôi từ 40% lên 75%, số

lượng phôi/mẫu cấy từ 10 lên 21. Tỷ lệ hình thành phôi thứ cấp đạt 90% khi mô phôi

vô tính sơ cấp được nuôi cấy trên môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L NAA.

Phôi phát triển đến giai đoạn trưởng thành (trong đó có ½ lượng phôi nẩy chồi) trên

12

môi trường SH có 1% than hoạt tính và 85% phôi phát triển thành cây con (đầy đủ rễ

thân và lá) khi được nuôi cấy trên môi trường ½SH có 0,5% than hoạt tính. Cây con

có kiểu hình bình thường ở giai đoạn ex vitro [36].

Nghiên cứu của Kim và cộng sự (2012) đã thiết lập hệ thống tái sinh phôi vô

tính thứ cấp Panax ginseng trực tiếp từ phôi vô tính sơ cấp, nuôi cấy trên môi trường

MS không bổ sung chất ĐHST. Môi trường EM (1/3MS, với ½ lượng NH4NO3 và

KNO3, có 20 - 30 g/L sucrose) tạo điều kiện thích hợp cho sự phát triển của phôi thứ

cấp đến giai đoạn cây con. Cây con có rễ cọc hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trên môi

trường ½SH có 0,5% than hoạt tính. Tần suất cao của hệ thống tái sinh này thông qua

quá trình phát sinh phôi thứ cấp theo chu kỳ (cyclic manner). Sự tăng sinh liên tục

của phôi vô tính thông qua tạo phôi thứ cấp, nên rất hữu ích cho nhân giống.[37].

Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào (LMTB) đã được sử dụng trong tạo phôi

trực tiếp từ một số bộ phận khác nhau của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)

in vitro (3 tháng tuổi) như lá, cuống lá và củ. Mô được nuôi cấy trên môi trường MS

bổ sung NAA và 2,4-D ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/L. Sau 10 tuần nuôi

cấy, kết quả thu được cho thấy nguồn mẫu từ lá là thích hợp nhất cho sự hình thành

phôi trực tiếp. Mẫu cấy lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L NAA

cho hiệu quả phát sinh phôi trực tiếp cao nhất (29,49 phôi/mẫu). Kết quả khảo sát

hình thái giải phẫu cho thấy phôi phát triển trực tiếp từ các mẫu nuôi cấy [38]. Trong

nghiên cứu của Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái

từ LMTB (TCL) mẫu lá, cuống lá và thân rễ sâm Ngọc Linh in vitro. Mẫu được nuôi

cấy trên môi trường đặc MS có bổ sung 30 g/L đường, các chất ĐHST (NAA, 2,4-D,

BA và TDZ riêng lẻ hoặc kết hợp). Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy mẫu lá

tTCL_L, mẫu cuống lá lTCL_C, mẫu thân rễ tTCL_R đều cho sự phát sinh phôi, mô

sẹo, rễ, trong khi mẫu cuống lá tTCL_C chỉ cho sự phát sinh mô sẹo và rễ. Trong đó,

tỷ lệ phát sinh phôi cao nhất (89,6%), tỷ lệ phát sinh mô sẹo cao nhất (91 - 98,8%),

tỷ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,8%) đã được ghi nhận tương ứng khi mẫu lá tTCL_L

được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2 mg/L NAA và được đặt dưới điều kiện chiếu

sáng 16 h/ngày; lá tTCL_L, cuống lá tTCL_C, lTCL_C, thân rễ tTCL_R được nuôi

cấy trên môi trường có 2,4-D kết hợp với BA dưới điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày,

điều kiện tối hoàn toàn; môi trường có bổ sung 1 mg/L NAA và đặt trong điều kiện

tối hoàn toàn. Điều kiện chiếu sáng có tác động đáng kể lên khả năng phát sinh hình

13

thái của mẫu cấy. Việc sử dụng đèn huỳnh quang chiếu sáng 16 h/ngày phù hợp cho

khả năng phát sinh phôi của mẫu cấy, những phôi thu được có dạng hình cầu, hình

tim, hình thủy lôi và cả dạng lá mầm. Ngược lại, điều kiện tối lại kích thích sự hình

thành rễ và mô sẹo tốt hơn. Rễ thu được có màu trắng đục, có phân nhánh, trong khi

mô sẹo lại xốp và có màu vàng nhạt [39]. Ở sâm Ngọc Linh, Mai Trường và cộng sự

(2014) đã nghiên cứu tạo và nhân phôi vô tính trong môi trường lỏng. Lá chét của

cây sâm 6 tháng tuổi ở vườn ươm (sau khử trùng) được nuôi cấy trên môi trường MS

có 1 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L kinetin để tạo mô sẹo. Sau đó, mô sẹo được cấy chuyền

sang môi trường MS lỏng (lắc) có 1 mg/L 2,4-D với 0,2 mg/L kinetin, 500 mg/L

casein hydrolysate để tạo huyền phù tế bào. Sau 2 tháng, huyền phù tế bào được

chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 lỏng (lắc) có 3 mg/L IBA. Sau nhiều tháng

nuôi, rất nhiều phôi vô tính dạng cầu hình thành và có khả năng nhân ổn định. Mảnh

lá mầm (của cây mầm từ phôi) và phôi vô tính non được nuôi cấy trên môi trường

MS có 10% nước dừa, có hoặc không có 0,2 mg/L IBA để tạo mô sẹo sinh phôi và

phôi thứ cấp. Mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp này cũng đã được dùng để nuôi nhân

trong môi trường lỏng có và không có chất ĐHST ở quy mô bình tam giác và

bioreactor [40]. Những kết quả đã tạo cơ sở để nhân giống quy mô lớn và thu hợp

chất thứ cấp.

Rễ bất định của cây Panax ginseng hoang dại và cây đột biến được nuôi cấy

tạo mô sẹo trên môi trường MS có 0,5 mg/L 2,4-D và 0,3 mg/L kinetin. Mô sẹo có

khả năng sinh phôi được cấy chuyển sang môi trường MS có 0,5 mg/L 2,4-D nhằm

cảm ứng tạo phôi. Các phôi hình thành trưởng thành trên môi trường MS có 5 mg/L

GA3 và 85% phôi nẩy mầm [41].

Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2020) đã nghiên cứu làm tăng tỷ lệ phát sinh

phôi vô tính sâm Ngọc Linh qua khử trùng lá sâm bằng dung dịch nano bạc và nuôi

cấy dùng môi trường cũng bổ sung nano bạc. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo mô sẹo có

khả năng sinh phôi cao nhất (72,22%), khối lượng tươi cao nhất (0,77 g) khi sử dụng

dung dịch nano bạc xử lý trong 20 phút. Tỷ lệ phát sinh phôi và phôi nẩy mầm cao

nhất trên môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D; 0,5 mg/L NAA; 02 mg/L Kin và 1,6 mg/L

nano bạc. Việc bổ sung 1 mg/L NAA và 1,2 mg/L nano bạc cho kết quả tốt nhất về

chiều cao chồi, chiều dài rễ, số rễ, khối lượng tươi/khô cây con [42].

14

Nguyễn Thị Ngọc Hương và cộng sự (2018) đã nghiên cứu hình thái học và tế

bào học quá trình phát sinh phôi vô tính gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo ở Tam thất

hoang (Panax stipuleanatus). Ở nghiên cứu này, mô sẹo được cảm ứng từ mô thân rễ

nuôi cấy trên môi trường MS (½ khoáng đa lượng) có bổ sung 2 mg/L 2,4-D (giai

đoạn nuôi 8 tuần) và 1 mg/L (giai đoạn nuôi 16 tuần). Khối mô sẹo bao gồm các cụm

tế bào rời rạc và cụm tế bào đẳng kính được cấy chuyển sang nuôi cấy trên môi trường

có bổ sung 5 m/L NAA để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi, kết quả cho thấy khối

mô sẹo trở nên mềm hơn với các cụm tế bào có khả năng tái sinh cao: kích thước nhỏ,

đẳng kính, nhân to, nhân rõ và có tế bào chất đậm đặc. Sự hình thành các thể giống

phôi cầu được ghi nhận sau 28 tuần nuôi trên môi trường có NAA nêu trên. Các cấu

trúc giống phôi này tiếp tục phát triển đến giai đoạn hậu phôi cầu, phôi dạng trái tim

và dạng có lá mầm trên môi trường MS như trên có bổ sung 0,5 mg/L BA và 1 mg/L

GA3. Ngoài ra, cũng ghi nhận được một số dạng phát triển bất thường của phôi như

chỉ phát triển rễ/chồi hoặc chỉ có lá mầm [43].

1.2.1.2. Rễ bất định

Gao và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ đoạn

cuống lá (0,5-0,8 cm) và từ đoạn rễ nhánh (~ 1 cm) cây Panax notoginseng (3 năm

tuổi). Kết quả cho thấy rễ bất định hình thành tốt từ mô cuống lá nuôi cấy trên môi

trường MS có 3 mg/L IBA, có hoặc không bổ sung 0,1 mg/L kinetin. Mô rễ nhánh

mẫn cảm hơn đối với IBA trong quá trình nuôi cấy tạo rễ bất định so với mô cuống

lá. Khối lượng khô rễ bất định tăng 5,25 lần sau quá trình nuôi lỏng lắc trong môi

trường ½MS có 3 mg/L IBA [44].

Ba loại mô dùng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh bao gồm mô sẹo lá chét,

phôi/cụm phôi trưởng thành mang chồi và mô sẹo cứng. Rễ bất định hình thành ngay

trong giai đoạn nuôi cấy mảnh lá (nuôi cấy một giai đoạn, không qua cấy chuyền)

trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D và 10% nước dừa; rễ bất định cũng hình

thành từ mô sẹo cấy chuyền (nuôi cấy hai giai đoạn) trên môi trường MS có 3 mg/L

NAA, MS có 3 mg/L NAA, 2 mg/L 2,4-D, 5% (v/v) nước dừa và môi trường B5 có

5 mg/L IBA. Ngoài ra, sự hình thành rễ bất định từ phôi/cụm phôi (đã loại bỏ hoàn

toàn rễ trụ) cũng đã được ghi nhận qua nuôi cấy trên môi trường ½MS bổ sung 2 - 3

mg/L NAA. Rễ bất định từ mô sẹo cứng (từ môi trường B5 có 5 mg/L IBA) đã được

nghiên cứu nuôi cấy tiếp tục trên môi trường đặc/lỏng White có 5 mg/L NAA, B5 có

15

1 - 5 mg/L IBA/NAA nhằm tìm hiểu khả năng tăng sinh khối qua quá trình tạo rễ thứ

cấp. Nghiên cứu khả năng hình thành các sơ khởi rễ và phân nhánh rễ trên các môi

trường White/B5 có 1 - 5 mg/L IBA/NAA từ khúc cắt rễ bất định cũng đã được thực

hiện [45].

Nguyễn Thị Ngọc Hương và cộng sự (2016) đã sử dụng các khúc cắt thân rễ

Panax stipuleanatus có đường kính 1 - 1,5 cm và dày 1 cm được nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung 30 g/L đường, 6 g/L agar, 0,5 mg/L 2,4-D và đặt trong tối. Mô

sẹo hình thành trên bề mặt thân rễ sau bốn tuần. Sự phân chia đầu tiên trong quá trình

hình thành mô sẹo xảy ra trong hai tuần đầu, ở các tế bào nhu mô vỏ cấp hai và tượng

tầng libe – mộc. Mô sẹo 26 tuần tuổi với các tế bào bên trong cụm chậm tăng trưởng

và các tế bào ở phía ngoài cụm có xu hướng kéo dài được chuyển sang môi trường

hoạt hóa có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L TDZ trong 6 tuần. Mô sẹo phát triển

trên môi trường này trở nên chặt hơn và hình thành nhiều cụm. Sự hình thành rễ bất

định xảy ra sau 10 tuần khi mô sẹo được chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,5

mg/L NAA. Mô sẹo hình thành các cấu trúc hình cầu giống phôi tuy nhiên chỉ phát

triển một cực rễ. Trong các rễ hình thành từ mô sẹo thân rễ có sự hiện diện của saponin

thuộc nhóm olean [46].

Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân nhanh sinh khối rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh

từ rễ bất định in vitro thông qua việc tối ưu nguồn mẫu, môi trường nuôi cấy và điều

kiện nuôi cấy đã được thực hiện. Kết quả cho thấy, các rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh

được hình thành từ vùng trụ bì tại vị trí của bó mạch dẫn trung tâm. Các mẫu rễ bất

định dài 2 cm tái sinh từ cuống lá với 8 g rễ bất định/1,5 L môi trường nuôi cấy trong

bioreactor hình cầu có sục khí cho kết quả hình thành rễ thứ cấp tốt nhất trên môi

trường MS cải biên với tỷ lệ ½NH4+/NO3

- bổ sung 7 mg/L IBA, 0,5 mg/L BA và 30

g/L đường trong 56 ngày (45 ngày đầu trong tối, 11 ngày sau ngoài sáng) ở 22oC và

pH 5,3 [47].

1.2.2. Chi Acanthopanax

1.2.2.1. Phôi vô tính

Chi Aucanthopanax còn có tên gọi khác là Eleutherococcus, đây là chi đã được

nghiên cứu khá nhiều về phôi vô tính. Các mảnh lá mầm và thân phôi hợp tử

Acanthopanax senticosus tạo phôi vô tính qua nuôi cấy trên môi trường MS có 0,5

mg/L 2,4-D. Phôi thứ cấp hình thành từ phôi vô tính sơ cấp khi được nuôi cấy trên

16

môi trường MS có 2,4-D (0,5 mg/L) hoặc IAA (1-3 mg/L) hoặc Zeatin (0,5 mg/L) và

NAA (0,2 mg/L). Các phôi vô tính nẩy mầm (93%) trên môi trường MS không bổ

sung 2,4-D. Phôi vô tính có nguồn gốc từ cụm tế bào biểu mô và dưới biểu mô [48].

Các đoạn thân cây Acanthopanax koreanum Nakai tạo mô sẹo có khả năng

phát sinh phôi tốt qua nuôi cấy trên môi trường MS chỉ bổ sung 4,5 µM 2,4-D. Mô

sẹo có khả năng phát sinh phôi chỉ tạo phôi cầu khi được nuôi cấy trong môi trường

lỏng có 0,45 µM 2,4-D; ngược lại, ghi nhận phôi phát triển đến giai đoạn trưởng

thành, nẩy mầm khi được nuôi cấy trong môi trường không có 2,4-D. Cytokinin ức

chế sự phát triển bình thường của phôi nhưng kích thích sự phát sinh phôi thứ cấp

trên bề mặt của phôi sơ cấp [49].

Park và cộng sự (2005) đã thực hiện nghiên cứu tạo phôi vô tính

Eleutherococcus koreanum từ nuôi cấy các đoạn rễ bất định trong môi trường lỏng

lắc. Kết quả cho thấy môi trường 1/3MS có 60 g/L đường, không bổ sung chất ĐHST

là thích hợp cho sự hình thành phôi vô tính. Phôi vô tính phát triển đến giai đoạn

trưởng thành và nẩy mầm trong môi trường 1/3MS không bổ sung chất ĐHST. Rễ

bất định, phôi và cây con đã được thu nhận đồng thời sau 12 tuần nuôi cấy rễ bất định

bằng bioreactor trong môi trường như trên [50]. Các kết quả nghiên cứu trên có ý

nghĩa trong nhân giống và thu hợp chất thứ cấp.

Shohael và cộng sự (2007) đã nghiên cứu thu nhận các sản phẩm có giá trị như

eleutherosides và acid chlorogenic từ phôi vô tính có nguồn gốc nuôi cấy huyền phù

tế bào có khả năng sinh phôi Eleutherococcus senticosus. Mô tế bào được xử lý

methyl jasmonate (50 - 400 µM), kết quả cho thấy hàm lượng eleutherosides, acid

chlorogenic, khối lượng tươi/khô, tỷ lệ tăng trường phôi cao nhất khi được xử lý 200

µM methyl jasmonate [51].

1.2.2.2. Rễ bất định

Seo và cộng sự (2003) đã nghiên cứu nhân sinh khối rễ bất định Eleutherococcus

sessiliflorus bằng phương pháp nuôi lỏng lắc và bioreactor. Cảm ứng tạo rễ được thực

hiện bằng nuôi cấy mảnh mô trụ dưới lá mầm, đoạn rễ phôi vô tính trên môi trường đặc

½MS có bổ sung NAA, IBA và IAA. Kết quả cho thấy rễ hình thành từ mô trụ dưới lá

mầm tốt hơn từ đoạn rễ. Trong các auxin được thí nghiệm, nhận thấy tỷ lệ tạo rễ cao nhất

trên môi trường có 0,5 mg/L NAA. Ở nuôi cấy lỏng lắc, hiệu quả tạo rễ ở môi trường

MS (không có NH4NO3) cao hơn trong môi trường MS và ½MS. Rễ tăng khối lượng

17

tươi tốt trong môi trường có 0,5 mg/L IBA. Hệ số nhân (5,5 lần) sau 1 tháng khi rễ được

nuôi trong bioreactor (V10 lít) [52].

Lee và Paek (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đạm đến phát triển

sinh khối rễ bất định Eleutherococcus koreanum Nakai và sự sản sinh các chất có

hoạt tính sinh học từ rễ qua nuôi cấy trong bioreactor sục khí (3 lít). Kết quả cho thấy

tỷ lệ đạm NH4+:NO3

- (5:25 mM và 10:20 mM) cho kết quả sinh khối tươi/khô cao

nhất sau 5 tuần nuôi cấy, hàm lượng eleutherosides B và E đạt cao nhất ở tỷ lệ

NH4+:NO3

- là 5:25. Tăng lượng NH4+ làm giảm sinh khối, đạm nitrate thích hợp hơn

đạm ammonium trong nhân sinh khối rễ và thu hợp chất thứ cấp [53]. Kết quả tạo

tiền đề cho sản xuất sinh khối rễ thu hoạt chất ở quy mô pilot nhằm thương mại hóa

sản phẩm.

1.2.3. Chi Polyscias

Sliwinska và cộng sự (2008) đã tạo thành công phôi vô tính loài đinh lăng lá

to (Polyscias filicifolia). Sau khử trùng, các mảnh lá (5 - 10 mm) của cây 2 năm tuổi

được nuôi cấy để tạo mô sẹo. Mô sẹo loại I hình thành trên môi trường MS có 0,5

mg/L 2,4-D, 1 mg/L BAP và mô sẹo loại II hình thành trên môi trường MS có 2,4-D

2 mg/L, kinetin 0,01 mg/L. Mô sẹo loại I là loại mô sẹo chắc và có màu xanh, mô sẹo

loại II là loại mô sẹo có cấu trúc xốp và màu trắng kem (cả hai loại mô sẹo trên đều

có khả năng tạo phôi). Phôi vô tính sơ cấp và phôi thứ cấp được hình thành trong môi

trường lỏng ½MS không bổ sung chất ĐHST. Phôi tạo cây con tốt nhất trên môi

trường Nitsch và Nitsch cải tiến có bổ sung 0,5 mg/L kinetin, 0,1 mg/L IBA và 10

mg/L adenine sulfate [54].

Phôi vô tính đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) nuôi lỏng lắc tăng sinh khối

do sự hình thành phôi bất định thứ cấp. Phôi vô tính tăng trưởng sinh khối tốt khi

được nhân in vitro bằng hệ thống nuôi lỏng lắc với khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu

là 1 g (1,25% - w/v), tốc độ lắc 100 vòng/phút; khối lượng tăng sinh đạt 7,5 g, hệ số

tăng sinh khối phôi đạt 8,5 lần tại thời điểm 30 ngày sau cấy. Đã xây dựng được

đường biểu diễn tăng trưởng khối lượng, hệ số tăng trưởng sinh khối phôi dưới ảnh

hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu và tốc độ lắc. Phôi vô tính đinh lăng lá

nhỏ có cấu trúc điển hình, trưởng thành và tạo cây hoàn chỉnh với tỷ lệ cao (95%) khi

được nuôi cấy trên môi trường ½MS không bổ sung chất ĐHST, cây có kiểu hình và

sinh trưởng bình thường trên môi trường nuôi cấy [55].

18

1.2.4. Chi Schefflera

1.2.4.1. Schefflera octophylla (Lour.) Harms

Li và cộng sự (2004) đã xây dựng thành công quy trình nhân giống Schefflera

octophylla bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trong đó có giai đoạn tạo rễ bất định.

Các đốt thân (mang chồi ngủ) của cây ở bầu đất, sau khử trùng, được nuôi cấy trên

môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA và 2 mg/L kinetin nhằm thích chồi ngủ phát

triển. Kết quả cho thấy, các chồi ngủ phát triển ở 5 ngày sau cấy (NSC) và tạo thành

cụm chồi nhỏ ở 20 NSC với tỷ lệ 91%. Tiếp theo, các chồi nhỏ này phát triển chiều

cao (3 - 4 cm), phát triển số lượng cá thể với hệ số nhân 3,4 lần ở giai đoạn 22 NSC

qua nuôi cấy trên môi trường MS có 0,5 mg/L NAA và 1,5 mg/L BA. Để tạo rễ, các

chồi được nuôi cấy trên môi trường ½MS và 0,2 mg/L NAA có 0,3% than hoạt tính

và kết quả cho thấy, rễ hình thành rất nhiều với chiều dài trung bình ~ 4 cm ở 30

NSC. Các cây con (cao 3 - 4 cm) đã được trồng thành công trong chậu chứa hỗn hợp

perlite, vermiculite và cát mịn (1:1:1) với tỷ lệ sống ~ 75% [3].

1.2.4.2. Schefflera arboricola (Hayata) Merr.

Sau khử trùng, các đốt thân được nuôi cấy trên môi trường nhằm kích thích

chồi ngủ phát triển và tạo cụm chồi; các mảnh lá và trục lá cũng được nuôi cấy nhằm

tạo mô sẹo và tái sinh chồi. Kết quả cho thấy, ở nuôi cấy đốt thân, 0,5 mg/L BA ở

môi trường MS kích thích chồi phát triển tốt trong 8 - 10 ngày, chồi cao 0,5 cm với 4

lá. Thí nghiệm tạo cụm chồi đã cho kết quả âm tính dù đã bố trí thực hiện một số

nghiệm thức khác nhau về tổ hợp chất ĐHST như (NAA và BA); (IAA và kinetin);

(2,4-D và BA) và (BA và kinetin). Mảnh lá tạo mô sẹo trên môi trường MS có 1 - 2

mg/L 2,4-D sau 13 - 16 ngày nuôi cấy; trục lá tạo mô sẹo trên môi trường MS có

NH4NO3 200 mg/L bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BAP sau 6 ngày. Chỉ thu

được kết quả tái sinh rễ trên môi trường có BA/kinetin/BA và adenine sulphate qua

nuôi cấy tái sinh dùng mô sẹo [56].

Misra (2001) đã nêu một số kết luận như các chồi ngủ được cảm ứng, phát

triển trên môi trường MS có bổ sung 2,21 µM BA; nồng độ BA cao hơn (8,87 µM)

đã cảm ứng sự hình thành cụm chồi; các chồi tạo rễ sau khi được cấy chuyển sang

môi trường tạo rễ MS có bổ sung 2,63 µM NAA. Các cây con được trồng thành công

trong chậu chứa hỗn hợp vermiculite và perlite (tỷ lệ 1:1) và ở chậu đất giai đoạn tiếp

theo [57].

19

Schefflera arboricola (dạng lùn – dwarf schefflera) là một trong các loại cây

cảnh dùng trang trí nội thất, thân và lá cây chứa tinh dầu ức chế đối với nhiều loài vi

khuẩn [58]. Nhân giống vô tính in vitro 03 dòng (‘Luseane’, ‘Charlotte’ và ‘Gold

Capella’) đã được thực hiện [59]. Sau khử trùng, các đốt thân được nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung cytokinin khác nhau. Kết quả cho thấy số lượng chồi đạt giá

trị cao nhất trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/L thidiazuron (TDZ) đối với dòng

‘Luseane’, hoặc 8 mg/L BA đối với 02 dòng ‘Charlotte’ và ‘Gold Capella’. Nuôi cấy

các đốt thân cây in vitro cũng cho kết quả nhân giống tương tự. Hai dòng ‘Luseane’

và ‘Gold Capella’ 100% chồi tạo rễ trên môi trường có bổ sung 2 mg/L NAA trong

khi dòng ‘Charlotte’ tạo rễ với tỷ lệ 93,75% trên môi trường có nồng độ NAA thấp

hơn - 1 mg/L. Các cây hoàn chỉnh của 03 dòng nói trên đã được trồng thành công

trong chậu với các giá loại giá thể khác nhau.

1.2.4.3. Schefflera leucantha Viguier

Schefflera leucantha, tương tự các loài trên, cũng chứa nhiều thành phần hóa

học có khả năng ức chế khá nhiều loài vi khuẩn gây bệnh [60]. Chirakiattikun và

Prakaisrithongkham (2004) đã thực hiện có kết quả nghiên cứu xây dựng môi trường

thích hợp cho vi nhân giống Schefflera leucantha Viguier. – loài cũng hàm chứa nhiều

hợp chất có hoạt tính sinh học. Chồi đã được bố trí nuôi cấy trên môi trường MS

không bổ sung chất ĐHST hoặc có (BA, IAA) với các nồng độ khác nhau, và nước

dừa 15%. Kết quả cho thấy, nghiệm thức ở môi trường có 2 mg/L BA kích thích tạo

chồi tốt nhất so với các nghiệm thức khác với chiều cao chồi 1,4 cm, số lá 3,6, số đốt

6,9, số chồi nách 3,4, chiều cao chồi nách 0,5 cm. Để tạo rễ bất định, chồi được nuôi

cấy trên môi trường có bổ sung 0; 1; 1,5; 2 và 2,5 mg/L IAA và kết quả cho thấy,

chồi trên môi trường MS có 2 mg/L IAA tạo rễ tốt nhất ở các chỉ tiêu như tỷ lệ tạo

rễ, số rễ và chiều dài rễ, lần lượt là 66,7%; 3,2 rễ và 2 cm [61].

Như vậy, đến nay chưa ghi nhận được bất kỳ công bố kết quả nghiên cứu nào

liên quan đến tạo phôi vô tính ở 03 loài Schefflera nêu trên.

1.2.4.4. Didymopanax morototoni (Aublet) Decaisne et Planchon.

Didymopanax morototoni còn có tên đồng nghĩa là Schefflera morototoni

(Aublet) Macguire, Steyerm. et Frodin.

Schefflera morototoni – loài thân gỗ, cây có thân cao, quả có thể sử dụng vì có

giá trị dinh dưỡng; thành phần hóa học trong thân và lá cũng đã được nghiên cứu

20

[62]. Franco và cộng sự (2006) [63] đã sử dụng một số vật liệu từ hạt nẩy mầm như

rễ, chồi, đốt thân và lá mầm để nghiên cứu tạo mô sẹo/phôi vô tính và tạo cây từ phôi.

Kết quả cho thấy mẫu lá mầm, đốt thân có đáp ứng tạo mô sẹo/phôi tốt hơn so với

hai vật liệu còn lại; môi trường WPM [64] có bổ sung 5 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L

kinetin cho tỷ lệ tạo phôi cao nhất (60%), thấp nhất là trên môi trường có 1 mg/L 2,4-

D và 1 mg/L kinetin (20%). Phôi được cấy chuyển sang môi trường WPM không bổ

sung chất ĐHST, có 10 g/L đường (hoặc có bổ sung 0,1 mg/L BAP và 0,5 mg/L GA3)

để tạo cây; cây được trồng ra đất với tỷ lệ sống 33%.

1.3. Sự phát sinh phôi vô tính

1.3.1. Cơ sở khoa học của sự phát sinh phôi vô tính

Phôi vô tính/phôi soma/phôi sinh dưỡng (somatic embryogenis) đều là khái

niệm mô tả một cấu trúc lưỡng cực gồm cực chồi và cực rễ, bắt nguồn từ tế bào sinh

dưỡng hay tế bào soma, dưới những điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một cơ

thể có chức năng hoàn chỉnh. Quá trình hình thành phôi vô tính trải qua các giai đoạn

tương tự như phát sinh phôi hợp tử, trải qua các giai đoạn phôi hình cầu, hình trái tim,

dạng thủy lôi và giai đoạn lá mầm, và sau đó phát triển thành cây con hoàn chỉnh.

Trong quá trình phát triển phôi vô tính, các giai đoạn hình thái không có kết nối với

mô mạch [65]. Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính về mặt hình thái, quá trình phát

triển cũng như về mặt sinh lý nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao

tử đực và giao tử cái, không có quá trình tái tổ hợp di truyền, các phôi vô tính mang

thông tin di truyền giống hệt tế bào soma đã sinh ra nó. Phôi vô tính có thể được hình

thành từ một tế bào đơn hay từ cả một cụm tế bào. Thông qua một quá trình phân chia

có thứ tự phôi diễn ra sự biệt hóa, trưởng thành và phát triển thành cây con [66].

Quá trình phát sinh phôi vô tính đại diện cho mô hình toàn thế hoàn chỉnh, liên

quan đến hoạt động của các tín hiệu phức tạp, cũng như việc lập trình lại sự biểu hiện

gen được điều chỉnh cụ thể. Sự điều hòa này đáp ứng với các kích thích ngoại sinh

được tạo ra do các chất ĐHST thực vật [65]. Cảm ứng phát sinh phôi vô tính có tính

năng kích hoạt lại chu kỳ tế bào trong các tế bào thực vật đã được biệt hóa, dưới tác

động của các kích thích bên ngoài. Từ đó, mở ra con đường chuyển từ loại tế bào

soma sang loại tế bào sinh phôi [67]. Các kích thích này khởi động chương trình di

truyền dẫn đến thiết lập các dòng tế bào có kiểu gen phiên mã bị thay đổi, đầu tiên là

sự hình thành cấu trúc không đối xứng đỉnh – đáy. Phôi vô tính trưởng thành giống

21

phôi hợp tử đều thể hiện đỉnh – đáy và phân cực hướng tâm, có chồi sơ cấp và mô

phân sinh rễ, chứa các cơ quan phôi điển hình, lá mầm, rễ mầm [66] .

Tế bào thực vật có tính toàn thế do vậy có thể tái tạo thành cây hoàn chỉnh

thông qua con đường phát sinh phôi vô tính (nhờ vai trò quan trọng của auxin và

cytokinin, ABA, các stress,..) hoặc/và con đường phát sinh cơ quan. Theo Von Arnold

và cộng sự (2002), sự phát sinh phôi vô tính được xác định là quá trình hình thành

cấu trúc có hai cực chồi và rễ tương tự như phôi hợp tử, mỗi cực đều có mô phân sinh

và hệ thống tiền mạch (provascular) phân biệt với hệ mạch ở thể chồi/cụm chồi tái

sinh theo con đường phát sinh cơ quan. Phôi vô tính hình thành và phát triển từ tế bào

sinh dưỡng, có thể tái sinh trực tiếp từ mô nuôi cấy mà không qua giai đoạn trung

gian là mô sẹo hoặc/và tái sinh từ mô sẹo (tái sinh gián tiếp) [68]. Theo tài liệu, ở tạo

phôi vô tính trực tiếp, phôi có nguồn gốc từ tế bào PEDC (Pre-Embryogenic

Determined Cell) – tế bào được xác định có khả năng tạo phôi; ở tạo phôi gián tiếp,

phôi hình thành từ tế bào IECD (Induced Embryogenic Determined Cell) – tế bào

được xác định có khả năng tạo phôi thông qua cảm ứng.

Ở tạo phôi trực tiếp, theo một số tài liệu, ghi nhận có các bước tạo phôi vô tính

cơ bản như: (1) Khởi tạo loại tế bào có khả năng sinh phôi từ một số loại tế bào khác

nhau ở mô cấy ban đầu như tế bào biểu bì/dưới biểu bì hoặc tế bào ở/gần vùng hệ

mạch dưới tác động của auxin (có hoặc không có cytokinin) ngoại sinh, tác nhân tạo

áp suất thẩm thấu cao,..; (2) Khởi tạo phôi với các giai đoạn phát triển khác nhau, và

(3) Phôi phát triển với hệ mạch độc lập với mô mẹ.

Ở tạo phôi gián tiếp, theo Von Arnold và cộng sự (2002), có 5 bước từ lúc tạo

vật liệu tế bào có khả năng sinh phôi đến giai đoạn nhận được cây hoàn chỉnh, là (1)

Tạo được vật liệu tế bào có khả năng sinh phôi từ nuôi cấy vật liệu ban đầu (như

mảnh lá,..) trên môi trường có auxin (có hoặc không có cytokinin); (2) Nuôi cấy nhân

sinh khối tế bào có khả năng sinh phôi trên môi trường đặc hoặc trong môi trường

lỏng với chất ĐHST như trên; (3) Nuôi cấy ‘tiền trưởng thành’ phôi ở môi trường

không có chất ĐHST, điều này ức chế sự tiếp tục tăng sinh khối và kích thích sự hình

thành và phát triển phôi ở giai đoạn ban đầu; (4) Tạo phôi trưởng thành qua nuôi cấy

trên môi trường có ABA hoặc/và có áp suất thẩm thấu giảm; (5) Tạo cây con qua nuôi

cấy trên môi trường không có chất ĐHST [68].

22

Đến nay, quá trình và cơ chế sinh phôi ở thực vật mô hình Arabidopsis đã được

chỉ rõ. Ở tạo phôi trực tiếp, tế bào xác định đi vào con đường tạo phôi chỉ một thời

gian ngắn sau bước tái lập trình di truyền, không cần trải qua phân bào trước; ngược

lại, ở tạo phôi gián tiếp, khả năng sinh phôi (embryogenic competence) vẫn giữ ở

mức tương đối sau giai đoạn tạo mô sẹo [69].

Phương pháp tạo phôi vô tính trực tiếp có nhiều ưu điểm so với tạo phôi vô

tính gián tiếp:

Do không thông qua giai đoạn nuôi cấy tạo mô sẹo, hơn nữa phôi hình thành

trên bề mặt mô cấy do vậy hiện tượng tái lập trình (reprogramming) về mặt di truyền

ở mức tối thiểu, lại hình thành trong thời gian tương đối ngắn [68], nên phôi tái sinh

ít bị biến dị, do vậy có tiềm năng ứng dụng cao thể phôi này đặc biệt trong trong

nghiên cứu nhân giống, bảo quản lạnh phôi và biến nạp gen,... Tạo phôi trực tiếp đơn

giản hơn trong kỹ thuật nuôi cấy; ngược lại quá trình tái sinh phôi gián tiếp trải qua

các bước cảm ứng và tăng sinh mô sẹo tạo phôi, phải lập trình lại nên đòi hỏi dài về

mặt thời gian, vì vậy, cơ chế điều hòa và cảm ứng phức tạp hơn so với sự hình thành

phôi vô tính trực tiếp. Mức độ phụ thuộc vào chất ĐHST khác nhau giữa tạo phôi

trực tiếp và gián tiếp [70].

Có thể nhân sinh khối phôi thông qua cơ chế tạo phôi thứ cấp bằng phương

pháp nuôi lỏng lắc và phương pháp dùng bioreactor dùng cho nhiều mục đích khác

nhau đặc biệt cho nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp.

1.3.2. Một số nghiên cứu về sự phát sinh phôi vô tính

Nói chung, sự phát sinh phôi vô tính (ở các giai đoạn nêu trên) đều chịu ảnh

hưởng bởi một số yếu tố như kiểu gen thực vật, tuổi sinh lý và loại mẫu nuôi cấy,

thành phần môi trường khoáng, chất ĐHST, đường, cường độ ánh sáng,.. Ở

Arabidopsis, khá nhiều loại, kích thước mẫu với tuổi sinh lý khác nhau đã được sử

dụng để tạo phôi vô tính như phôi hợp tử trưởng thành và phôi non, chồi, nụ hoa. Ở

Sapindus mukorosi, lá 6 ngày tuổi là thích hợp cho cảm ứng tạo phôi. Ở Eucalyptus

camaldulensis, lá mầm 10 ngày tuổi cho tỷ lệ tạo mô sẹo sinh phôi cao nhất [70].

Ở nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a), kết quả cho thấy môi

trường khoáng MS có 5 mg/L 2,4-D thích hợp cho nuôi cấy tạo mô sẹo và mô sẹo có

khả năng sinh phôi (từ vật liệu LMTB thân rễ) Panax pseudoginseng so với môi

trường SH [71]. Trong 3 loại môi trường sử dụng (MS, B5, và SH) để nghiên cứu tạo

23

phôi vô tính Panax ginseng trực tiếp từ mảnh lá mầm phôi hợp tử, kết quả cho thấy

môi trường MS (tỷ lệ NH4+:NO3- là 21:39) là thích hợp nhất (MS có 50 g/L đường,

1% agar) [72].

Đường là yếu tố cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của các thể nuôi cấy

mô trong đó có phôi vô tính, nồng độ sử dụng phù hợp với nhu cầu của từng loại mô

nuôi cấy, dao động từ 20 - 50 g/L. Kim và cộng sự (2012) đã sử dụng 20 - 30 g/L

đường cho nuôi cấy phôi thứ cấp Panax ginseng, tùy giai đoạn [73]. Nồng độ đường

50 g/L là thích hợp cho tạo phôi vô tính từ mô sẹo có nguồn gốc từ LMTB cắt ngang

thân rễ Panax vietnamensis [74].

Ánh sáng cũng là yếu tố được quan tâm nghiên cứu đặc biệt đối với thể phôi

vô tính đang trong quá trình chuyển giai đoạn phát triển hay trong quá trình nhân sinh

khối. Thông thường, sử dụng cường độ ánh sáng 4.000 lux để nuôi cấy. Nuôi cấy

phôi vô tính sơ cấp Chrysanthemum nhằm tạo phôi thứ cấp được thực hiện ở điều

kiện chiếu sáng cường độ cao ~ 4.500 - 7.500 lux (16 h sáng : 8 h tối) [75]. Sử dụng

cường độ ánh sáng ~ 3.000 lux đối với nuôi cấy tạo phôi thứ cấp Polyscias filicifolia

[5454]. Tuy nhiên, ở tạo phôi thứ cấp Quercus robur, nuôi cấy được thực hiện trong

điều kiện tối như nuôi cấy vật liệu phôi sơ cấp [76].

Nước dừa (10 - 20% - v/v) cũng được sử dụng trong nghiên cứu liên quan đến

phôi vô tính, vì chứa nhiều chất dinh dưỡng (đường, muối khoáng, acid amin) và chất

ĐHST tự nhiên. Khierallah và Hussein (2013) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nước

dừa (% - v/v) với nhiều nồng độ khác nhau trên sự tạo mô sẹo và tái sinh phôi vô tính

Phoenix dactylifera từ nuôi cấy chồi đỉnh. Kết quả cho thấy tỷ lệ nước dừa 20% là

tốt nhất cho tạo mô sẹo (chỉ tiêu khối lượng tươi) và tái sinh phôi vô tính (chỉ tiêu số

phôi) [77]. Tương tự, Tô Thị Nhã Trầm và cộng sự (2020) cũng đã sử dụng nước dừa

trong tạo mô sẹo và tạo phôi đinh lăng lá xẻ nhỏ (Polyscias fruticosa). Kết quả cho

thấy mô sẹo cho tỷ lệ (%) phát sinh phôi vô tính tối ưu trên môi trường MS bổ sung

100 mL/L nước dừa kết hợp với 0,5 mg/L BA sau 6 tuần nuôi cấy. Phôi phát sinh từ

nuôi cấy mô sẹo mẫu lá trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/L kinetin kết hợp với

150 mL/L nước dừa cho tỷ lệ tái sinh chồi (%) và số chồi/mẫu cao hơn các nghiệm

thức khác sau 8 tuần nuôi cấy. Ngoài ra, cây in vitro được nuôi cấy trên môi trường

có bổ sung 30 g/L đường và 100 mL/L nước dừa cho số rễ/cây cao nhất [78].

24

Chất ĐHST là yếu tố mang tính quyết định đến sự hình thành và phát triển

phôi vô tính tái sinh trực tiếp (từ mảnh lá, mảnh lá mầm,..) và gián tiếp (từ mô sẹo

hoặc cụm tế bào huyền phù có khả năng sinh phôi). Auxin (IAA, NAA, IBA, 2,4-

D,..) và cytokinin (BA, kinetin, TDZ), ngoài tác động ở dạng riêng lẻ, việc kết hợp

chúng cũng có tác động trong kích thích tạo phôi. Việc sử dụng 2,4-D là rất cần thiết

trong khởi tạo phôi vô tính và giúp phôi phát triển ở giai đoạn đầu [79]. Ví dụ sản

lượng cụm tế bào có khả năng sinh phôi chà là tăng 20 lần nhờ bổ sung 2,4-D nồng

độ thấp vào môi trường nuôi cấy [80]. Auxin làm thay đổi biến dưỡng nội sinh theo

cách tích cực, ví dụ ở cà rốt, sử dụng 2,4-D làm tăng khả năng đáp ứng sinh phôi qua

làm tăng hàm lượng IAA nội sinh; 2,4-D tạo điều hòa và cân bằng lượng auxin nội

sinh [81]. Tiền xử lý thực vật với auxin trước khi thực hiện cảm ứng tạo phôi ở C.

canephora cũng đã làm thay đổi biến dưỡng IAA nội sinh; và trong quá trình cảm

ứng tạo phôi C. canephora có sự gia tăng hàm lượng IAA nội sinh và sự biểu hiện

của gen mã hóa enzyme tryptophan aminotransferase (tryptophan aminotransferase

of Arabidopsis 1; CcTAA1) và enzyme flavin mono-oxygenase (YUCCA; CcYUC1 và

CcYUC3). Cả hai enzyme này tạo sinh tổng hợp IAA (Ayil-Gutiérrez và cộng sự,

2013). NAA (2 mg/L) thích hợp cho nuôi cấy tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá sâm Ngọc

Linh (Panax vietnamensis) [38]. Chất ĐHST khác, như cytokinin cũng tham gia vào

sự phát triển của thực vật, kích thích sự hình thành nụ, làm chậm sự lão hóa lá và

cùng với auxin kích thích sự phân bào; cả hai auxin và cytokinin có tác động cộng

hưởng [82]. Tỷ lệ cao giữa cytokinin và auxin kích thích sự tạo chồi; ngược lại, tỷ lệ

này thấp cảm ứng tạo rễ và sự hình thành mô phân sinh hoàn chỉnh ở Pisum sativum.

Hai chất ĐHST này hoặc có tác động cộng hưởng hoặc đối kháng trong suốt quá trình

tạo phôi [83]. Ở C. canephora, sự di chuyển phân cực của IAA là cần thiết cho sự

hình thành trục ngọn-gốc [84]. Cytokinin cũng cần thiết để duy trì mức sinh tổng

hợp auxin cơ bản trong quá trình phát triển rễ và chồi, do vậy, có thể có một hệ thống

điều hòa thống nhất nhằm tạo hàm lượng thích hợp giữa auxin và sự phát triển của

thực vật [85].

Quá trình hình thành phôi vô tính có sự tích hợp của các tín hiệu nội sinh và

sự tái lập trình gen nhằm giải phóng tín hiệu khởi tạo quá trình phát sinh phôi. Các

auxin ngoại sinh, ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất ĐHST khác hoặc stress,

cảm ứng sự biểu hiện của các gen khác dẫn đến sự thay đổi chương trình di truyền

25

của tế bào soma và điều hòa quá trình dịch chuyển qua từng giai đoạn phát triển của

phôi [86]. Hầu hết các gen trên thuộc về một trong 4 nhóm: các yếu tố phiên mã

(transcription factors - TFs), các protein tác động ở chu kỳ tế bào, sinh tổng hợp chất

ĐHST, chủ yếu là auxin, cũng như các protein tham gia vào con đường tín hiệu [87].

Ở cà rốt (Daucus carota), Michalczuk và cộng sự (1992) đã nghiên cứu các

mức auxin nội sinh của tế bào ở các giai đoạn nuôi cấy tạo phôi khác nhau: (1) Nuôi

cấy tế bào huyền phù trong môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D; (2) Sau đó chuyển sang

nuôi cấy trong môi trường không có 2,4-D nhằm tạo phôi. Kết quả cho thấy có sự

thay đổi con đường sinh tổng hợp IAA trong suốt quá trình phát sinh phôi vô tính. Ở

nuôi cấy huyền phù tế bào tăng sinh trong môi trường có 2,4-D, nhận thấy IAA nội

sinh hình thành đầu tiên từ cơ chất tryptophan, nhưng ở quá trình phát triển của phôi

vô tính, con đường sinh tổng hợp IAA không từ tryptophan lại có vai trò nổi trội hơn

đối với sinh tổng hợp IAA nội sinh. Như vậy, sự thay đổi về nồng độ auxin ngoại

sinh có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp auxin nội sinh - dẫn đến tạo phôi vô tính [88].

Ribnicky và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của auxin ngoại sinh ở

dạng tự do và phức hợp đến biến dưỡng auxin ở nuôi cấy đoạn trụ dưới lá mầm (1 -

2 cm, của cây 7 ngày tuổi từ hạt Daucus carota L. cv Danvers) trên môi trường MS

có hoặc không có auxin 2,4-D, [2H4]IAA, NAA (10 mM) và có 250 mM [2H5]L-

tryptophan. Kết quả cho thấy 2,4-D kích thích sự hình thành và tăng sinh mô sẹo, 2,4-

D tích lũy ở dạng tự do với lượng lớn và tác động không nhiều lên nồng độ IAA nội

sinh. NAA kích thích sự hình thành và tăng sinh mô sẹo dẫn đến mô ở trạng thái có

thể phát sinh cơ quan – chồi và rễ. NAA được phát hiện chủ yếu ở dạng phức hợp và

cũng có tác động không nhiều lên nồng độ IAA nội sinh. Như vậy, 2,4-D và NAA đã

có tác động trực tiếp lên mô cấy dẫn đến sự hình thành các loại mô tế bào khác nhau,

không do sự thay đổi hàm lượng IAA nội sinh. Không ghi nhận được ảnh hưởng của

[2H4]IAA lên mô cấy có thể do [2H4]IAA bị biến đổi nhanh chóng sang dạng bất

hoạt hoặc có thể [2H4]IAA làm giảm nồng độ IAA nội sinh theo cơ chế phản hồi. Sự

hiện diện của auxin ngoại sinh đã không gây ảnh hưởng đến tryptophan nội sinh hoặc

nguồn (pool) IAA. Như vậy, auxin ngoại sinh không làm thay đổi con đường sinh

tổng hợp IAA nhưng cần thiết cho cảm ứng sự hình thành và tăng sinh mô sẹo cũng

như cảm ứng hình thành tế bào có khả năng sinh phôi [89].

26

Ayil-Gutiérrez và cộng sự (2013) cho rằng hầu hết quá trình phát sinh phôi vô

tính đòi hỏi sự hiện diện của ít nhất của một loại auxin ngoại sinh, hoặc hiện diện

trước đó hoặc hiện diện trong suốt quá trình phát sinh phôi; ngoài ra, còn kể đến vai

trò của auxin nội sinh. Auxin ngoại sinh cảm ứng sự hình thành auxin nội sinh – cũng

cần thiết cho sự phát sinh phôi. Các tác giả trên đã nghiên cứu động học của nồng độ

IAA và một số phức hợp của IAA (IAA-Ala, IAA-Glu) trong suốt thời kỳ cảm ứng

phát sinh phôi vô tính ở cà phê (Coffea canephora) qua nuôi cấy các mảnh lá (0,25

cm2, dùng môi trường lỏng lắc có 5 µM BA) của cây có nguồn gốc phôi vô tính (40

tuần tuổi, có 6 cặp lá, được tiền nuôi cấy trong môi trường MS có 0,54 µM NAA và

2,32 µM kinetin trong 14 ngày). Trong suốt thời gian tiền nuôi cấy cây trong môi

trường nuôi cấy có auxin NAA nói trên, nhận thấy có sự gia tăng mạnh của cả IAA ở

dạng tự do, IAA ở dạng phức hợp và IBA. Sự gia tăng này đi kèm với sự gia tăng

biểu hiện của các gen có liên quan. Sự cân bằng giữa IAA tự do và IAA ở dạng phức

hợp là rất cần thiết cho sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tạo phôi. Như

vậy, ở nghiên cứu này, quá trình phát sinh phôi vô tính bao gồm 2 pha cơ bản: Pha 1

cần có auxin NAA và kinetin (2 tuần), pha 2 chỉ cần có sự hiện diện của BA [90].

Nghiên cứu của Verma và cộng sự (2018) đã cho thấy vai trò của auxin và sự

di chuyển phân cực của auxin đã ảnh hưởng đến sự tạo phôi Digitalis trojana qua

nuôi cấy các đoạn trụ dưới lá mầm (5 mm) phôi hợp tử trên môi trường MS có IAA

(0,1 - 1 mg/l), TIBA (chất ức chế sự di chuyển auxin) (0,1 - 1 mg/l), IAA và TIBA.

Kết quả cho thấy ở nghiệm thức chỉ có IAA (0,5 mg/L), tỷ lệ tạo phôi cao nhất -

52%, số phôi 10 phôi/mẫu; ngược lại, ở NT có 0,5 mg/L IAA, 1 mg/L TIBA, tỷ lệ

tạo phôi chỉ đạt 24%; 3,6 phôi/mẫu, và có nhiều phôi bất thường. TIBA đã gây đáp

ứng chậm đối với tạo phôi và tái sinh nhiều phôi bất thường. Như vậy, auxin và sự di

chuyển phân cực của auxin có vai trò quan trọng đối với tạo phôi vô tính ở Digitalis

trojana [14].

Gaoyin và cộng sự (2020) đã nghiên cứu sự thay đổi các đặc tính hóa sinh

trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở Ormosia henryi Prain qua nuôi cấy phôi hợp

tử trưởng thành trên các môi trường theo thứ tự: (1) Môi trường tạo mô sẹo: B5 có 2

mg/L 2,4-D (auxin mạnh), 0,2 mg/L BA, 30 g/L đường, 500 mg/L glutamine, thời

gian nuôi 6 tuần; (2) Môi trường tăng sinh mô sẹo đồng thời thu nhận mô sẹo có khả

năng sinh phôi: B5 có 1 mg/L 2,4-D (giảm nồng độ), 0,5 mg/L kinetin, thời gian nuôi

27

4 tuần; (3) Môi trường nuôi mô sẹo có khả năng sinh phôi nhằm tạo phôi cầu: như

trên, nuôi 2 tuần trong tối ở 25 ± 2oC; (4) Môi trường nuôi phôi cầu tạo phôi có lá

mầm: B5 có 0,2 mg/L NAA (auxin yếu), 0,5 mg/L thidiazuron, thời gian nuôi 60

ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy: (1) Các hợp chất cung cấp năng lượng: Hàm

lượng đường hòa tan và tinh bột giảm dần trong suốt quá trình sinh phôi do nhu cầu

tiêu thụ lượng lớn các hợp chất này; ngược lại, hàm lượng protein lại tăng lên. Ở mô

sẹo có khả năng sinh phôi, sự tích lũy đường hòa tan, tinh bột và protein cao – cơ sở

quan trọng về năng lượng cho quá trình tạo phôi so với mô sẹo không có khả năng

sinh phôi; (2) chất ĐHST nội sinh: Ở các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi,

hàm lượng IAA tăng có ý nghĩa ở giai đoạn phôi có lá mầm – có liên quan đến sự

hình thành cực phôi. Tương tự, hàm lượng cytokinin cũng tăng ở phôi giai đoạn này

– có liên quan đến sự trưởng thành và nẩy mầm của phôi. IAA cũng cao ở mô sẹo có

khả năng sinh phôi so với mô sẹo không có khả năng sinh phôi; (3) Về tỷ lệ giữa các

chất ĐHST nội sinh: Tương tác giữa các chất ĐHST nội sinh ở các giai đoạn phát

triển khác nhau của quá trình phát sinh phôi vô tính có thể được thể hiện qua tỷ lệ

giữa chúng và được xem như chỉ số sinh lý để tìm hiểu sự phản biệt hóa và tái biệt

hóa của tế bào. Tỷ lệ IAA/ABA, IAA/GAs, AUX/GAs và AUX/ABA giảm dần, tỷ lệ

IAA/CKs, AUX/CKs, ABA/CKs and GAs/CKs lúc đầu tăng và sau đó giảm. Tỷ lệ

IAA/CKs và AUX/CKs thấp nhất ở phôi có lá mầm [12].

Huyền phù tế bào đơn của dòng Medicago falcata 47/1/150 có khả năng sinh

phôi cao đã được thực hiện. Huyền phù tế bào này bao gồm nhiều loại tế bào đơn

khác nhau. Hầu hết các tế bào đều có khả năng tạo phôi sau quá trình phân chia không

đối xứng. Nhằm khảo sát rõ quá trình phân chia này, huyền phù tế bào mang gen gusA

(mã hóa enzyme β-glucoronidase) cũng đã được thực hiện và nuôi cấy theo hướng

phân bào tạo phôi trực tiếp. Từ đó, các bước phát triển của phôi đã được khảo sát chi

tiết bắt đầu từ sự phân chia không đối xứng – tín hiệu đầu tiên của quá trình hình

thành phôi vô tính [67].

Quy trình tạo phôi trực tiếp, tạo phôi thứ cấp và tái sinh cây từ phôi ở

Dendrobium cv. Chiengmai Pink đã được thực hiện. Kết quả cho thấy phôi tái sinh

tốt nhất trên môi trường có bổ sung 1 mg/L TDZ. Phôi tái sinh trực tiếp nhiều ở vị trí

gần vết cắt mẫu và ít hơn ở vị trí đầu lá. Quá trình cấy chuyền cho thấy có hiện tượng

28

tạo phôi thứ cấp trực tiếp từ phôi sơ cấp. Khảo sát hình thái giải phẫu cho thấy phôi

thứ cấp hình thành từ lớp tế bào bên ngoài của phôi sơ cấp [91].

Gow và cộng sự (2009) đã ghi nhận được phôi vô tính Phalaenopsis amabilis

Shimadzu var. formosa và Phalaenopsis ‘Nebula’ tái sinh tái sinh trực tiếp từ mảnh

lá (1-2 cm, cấy úp) trên môi trường ½MS có bổ sung 3 mg/L TDZ hoặc 3 mg/L BA.

Qua quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, nhận thấy phôi vô tính với nhiều dạng

khác nhau hình thành trực tiếp từ lớp tế bào bề mặt của mảnh lá ở cả 2 giống [92].

Phôi Curcuma amada Roxb. hình thành trực tiếp qua nuôi cấy 2 giai đoạn (1)

Nuôi cấy 2 tuần trên môi trường có bổ sung 2,24 μM và 1,11 μM BA, sau đó (2) Nuôi

cấy tiếp tục trên môi trường có 9,10 μM TDZ và 1,33 μM NAA. Qua khảo sát hóa

mô tế bào và quan sát dưới kính hiển vi điện tử, kết quả cho thấy phôi có nguồn gốc

từ quá trình phân chia tế bào ở biểu mô và tế bào dưới biểu mô [93].

Cũng qua khảo sát mô tế bào, Wang và cộng sự (2014) cho rằng ngoài tái sinh

phôi theo cách thông qua mô sẹo, các tiền phôi đa bào cũng được hình thành trực tiếp

từ lớp tế bào bề mặt của phôi non Tapiscia sinensis qua nuôi cấy trên môi trường MS

có 1 mg/L 2,4-D và 0,5% than hoạt tính [94].

Các mẫu cấy lá sâm Ngọc Linh có kích thước 0,5 x 0,5 cm được nuôi cấy trên

môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L NAA để cảm ứng tạo mô sẹo. Các mẫu

mô sẹo này được cắt thành mảnh nhỏ có đường kính 0,5 cm và nuôi cấy trên môi

trường MS bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với NAA và/hoặc kinetin ở các nồng độ

khác nhau để cảm ứng quá trình phát sinh phôi vô tính. Sau 8 tuần nuôi cấy, các cấu

trúc hình cầu bắt đầu được ghi nhận. Tần suất phát sinh phôi đạt được cao nhất trên

môi trường MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D, 0,2 mg/L kinetin và 0,5 mg/L NAA. Sau

12 tuần nuôi cấy, tất cả các giai đoạn phát triển của phôi vô tính, bao gồm phôi hình

cầu, hình tim, hình thủy lôi và phôi giai đoạn lá mầm đều được phát hiện trong các

cụm phôi. Các quan sát hình thái giải phẫu và phân tích dưới kính hiển vi điện tử quét

cho thấy phôi có cấu trúc lưỡng cực với cực chồi và cực rễ phát triển rõ ràng [95].

Trong phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo Tam thất hoang (Panax stipuleanatus)

sau 24 tuần nuôi cấy trên môi trường có 2,4-D. Mô sẹo có các cụm tế bào đẳng kính

rời rạc được chuyển sang môi trường có bổ sung 0,5 mg/L NAA để thu nhận tế bào

có khả năng sinh phôi. Mô sẹo phát triển trên môi trường này trở nên nhão hơn với

các cụm tế bào có đặc tính của tế bào sinh phôi: kích thước nhỏ, đẳng kính, nhân to,

29

thấy rõ hạch nhân và tế bào chất đậm đặc. Sự hình thành những cụm gồm các cấu

trúc hình cầu, kích thước đồng đều xảy ra tại thời điểm 28 tuần trên môi trường có bổ

sung NAA. Các cấu trúc giống phôi này trải qua các giai đoạn phát triển: phôi hình

cầu muộn, hình tim và tử diệp trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/L BA, 1 mg/L GA3.

Bên cạnh đó, có sự xuất hiện của phôi bất thường chỉ chỉ tạo rễ, tạo chồi hoặc lá [43].

Mảnh lá (~ 10 mm) cây in vitro Tolumnia Louise Elmore ‘Elsa’ được nuôi cấy

trên môi trường ½MS có bổ sung 5 loại cytokinin khác nhau (2-iP, BA, kinetin, TDZ

và zeatin) với các nồng độ 0,3; 1; 3 mg/L và nuôi trong tối. Kết quả cho thấy, sau 90

ngày nuôi, nồng độ 3 mg/L TDZ cho kết quả tái sinh trực tiếp phôi cầu tốt nhất. Khảo

sát hình thái giải phẫu cho thấy phôi có nguồn gốc từ các tế bào mô phân sinh (kích

thước nhỏ, tế bào chất đậm đặc) có nguồn gốc từ lớp tế bào biểu mô và dưới biểu mô

(tế bào diệp lục) ở mảnh lá [96].

Liang và cộng sự (2020) đã nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh chồi bất định và

phôi vô tính Scaevola sericea qua nuôi cấy mảnh lá (1 x 1 cm, từ cây in vitro) và đoạn

rễ (dài 0,5 cm, bao gồm đầu rễ, cũng từ cây in vitro) trên môi trường MS có 0,5 - 2,5

mg/L NAA, MS có 2,5 mg/L NAA, theo thứ tự. Đã xác định được môi trường tối ưu

cho tái sinh gián tiếp chồi bất định và phôi vô tính từ mô sẹo lá, rễ là MS có bổ sung

2,5 mg/L BA, MS có 2,5 mg/L TDZ, theo thứ tự. Phôi vô tính tái sinh có nguồn gốc

từ nhu mô nằm bên dưới lớp tế bào biểu mô của lá [97].

1.4. Sự hình thành rễ bất định

1.4.1. Cơ sở khoa học của sự hình thành rễ bất định

Rễ bất định là rễ được phát sinh từ những vùng khác nhau trên cơ thể thực vật

như thân, cành, lá; nhưng không phát sinh từ rễ.

Tương tự trường hợp tạo phôi vô tính, tế bào với đặc điểm có tính toàn thế có

thể tái sinh rễ bất định theo cách trực tiếp và gián tiếp. Rễ có thể được tái sinh trực

tiếp/gián tiếp từ một số loại mô nuôi cấy ban đầu khác nhau như mảnh lá/lá mầm,

đoạn cuống lá, đoạn rễ, LMTB thân rễ,..

Quá trình tạo rễ bất định trực tiếp và gián tiếp bao gồm 3 giai đoạn: (1) Cảm

ứng; (2) Khởi tạo sơ khởi rễ từ tế bào liên kết với mô mạch hoặc thuộc bó mạch hoặc

từ tế bào nhu mô khuyết (đối với vật liệu nuôi cấy là mô lá), hoặc từ vòng tế bào

tượng tầng bên ngoài bó mạch/trụ bì (đối với vật liệu nuôi cấy là mô thân/rễ); (3)

Biểu hiện/hình thành rễ. Mỗi giai đoạn có sự tương tác giữa các yếu tố như tín hiệu

30

bên ngoài, sự thay đổi hàm lượng các chất ĐHST nội sinh, và sự biểu hện của một số

gen. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm xác định

cơ chế phân tử của sự tạo rễ bất định, có nhiều gen liên quan trực tiếp đến cảm ứng

và khởi tạo rễ bất định đã được xác định ở nhiều loài thực vật khác nhau như

Arabidopsis thaliana, Solanum lycopersicon, Medicago sativa,.. Auxin được biết như

yếu tố trung tâm điều hòa các giai đoạn của quá trình tạo rễ bất định như đã nêu trên;

có 3 gen tín hiệu auxin (auxin signaling) tham gia vào quá trình này bao gồm gen

sinh tổng hợp auxin và điều hòa cân bằng nội sinh (homeostasis), gen vận chuyển

auxin và gen đáp ứng với auxin, trong đó gen sinh tổng hợp auxin và điều hòa cân

bằng nội sinh có tác động trực tiếp, ví dụ như gen YUCCA mã hóa flavin

monooxygenase – tham gia trong sinh tổng hợp IAA (từ tryptophan) nhằm duy trì

mức IAA ở mô phân sinh đầu rễ [98].

Yu và cộng sự (2017) đã thực hiện nuôi cấy mảnh lá Arabidopsis thaliana trên

môi trường B5 không có auxin nhằm tạo rễ bất định trực tiếp và nuôi cấy mảnh lá

trên môi trường có auxin nồng độ cao để tạo mô sẹo và sau đó cấy chuyển mô sẹo

sang môi trường có nồng độ auxin thấp/không có auxin để tái sinh rễ (gián tiếp). Từ

kết quả thu được, các tác giả trên cho rằng ở tái sinh rễ trực tiếp có 4 hiện tượng sinh

lý tuần tự xảy ra: (1) Bước ‘tạo mồi’: auxin nội sinh được vận chuyển đến các tế bào

có khả năng tái sinh (procambium và tế bào nhu mô mạch), kích chuyển các tế bào

này thành các tế bào ‘nguồn’; (2) Bước ‘khởi tạo’: các tế bào ‘nguồn’ phát triển thành

sơ khởi rễ - nơi tích tụ auxin cao; (3) Bước ‘tạo hình’: các tế bào sơ khởi rễ tiếp tục

phân chia tạo mô phân sinh đầu rễ - nơi auxin giảm tích tụ; (4) Bước ‘hiện hình’: đầu

rễ đạt mức trưởng thành, tiếp tục phát triển ra khỏi mảnh lá. Ở trường hợp tái sinh

gián tiếp, cũng có các bước tương tự như trên: (1) Bước ‘tạo mồi’ tạo tế bào ‘nguồn’;

(2) Bước ‘khởi tạo’: tạo mô sẹo thay vì sơ khởi rễ; (3) Bước tạo rễ khi mô sẹo được

cấy chuyển sang môi trường có nồng độ auxin giảm/không có auxin [99]

Tương tự trường hợp phôi vô tính, tạo rễ bất định cũng là một quá trình phức

tạp, chịu ảnh hưởng bởi một số yếu tố cơ bản như vai trò sinh lý của auxin (loại và

nồng độ sử dụng), sự di chuyển phân cực của auxin, sự tích tụ auxin ở vị trí nhất

định,… và ở mức độ phân tử có sự biểu hiện của các gen có liên quan. Như vậy, tạo

rễ bất định là đặc tính di truyền số lượng, được điều hòa bởi cả các yếu tố môi trường

bên ngoài và yếu tố nội sinh. Auxin đóng vai trò quyết định trong điều hòa phát triển

31

rễ, quá trình này có liên quan đến các gen cảm ứng bởi auxin và con đường tín hiệu

auxin.

1.4.2. Một số nghiên cứu về sự hình thành rễ bất định

Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến các giai đoạn hình thành rễ bất định bao

gồm chất ĐHST, thành phần môi trường khoáng, nguồn carbon, mật độ mô/tế bào

nuôi cấy, độ pH,.. Các loại môi trường nuôi cấy khác nhau có tác dụng khác nhau đối

với cảm ứng phân nhánh và gia tăng sinh khối rễ. MS, ½MS là môi trường thích hợp

trên nhiều đối tượng cây trồng như Boesenbergia rotunda, Vernonia amygdalina,

Camellia sinensis và Echinacea purpurea.

Nguồn carbon cần thiết cho sự hình thành rễ cũng khác nhau do khả năng hấp

thụ của từng loài thực vật và quá trình chuyển hóa nguồn carbon có khác nhau. Nồng

độ đường 50 g/L là rất thích hợp cho Boesenbergia rotunda và Eurycoma longifolia,

trong khi nồng độ đường 30 g/L thích hợp đối với Camellia sinensis... Ngoài ra, nồng

độ đường thích hợp cũng ảnh hưởng đến việc tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp.

Nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy rễ Gynura procumbens, các môi trường MS

(½ - 2), nồng độ đường (1 – 10%), độ pH (5 - 6,5), và điều kiện tối/sáng đã được

nghiên cứu. Kết quả cho thấy đường 2% là thích hợp nhất cho sự tăng trưởng rễ. Dựa

trên nghiên cứu của Cui và cộng sự (2010), nồng độ cao của đường (5%, 7%, 9%) đã

ảnh hưởng đến sinh khối do ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu - là rất cao. Hơn nữa,

trong nghiên cứu nuôi rễ Psammosilene tunicoide với các điều kiện nuôi cấy như

nồng độ đường (0 - 50 g/L); các chu kỳ sáng (0 - 12 h/ngày); pH ban đầu (5 - 6,5); và

cường độ ánh sáng 2.000 lux, kết quả cho thấy các yếu tố ảnh hưởng thích hợp là 30

g/L đường, chu kỳ sáng 10 h/ngày, và pH ban đầu là 5,8 [100].

Ahkami và cộng sự (2013) đã nghiên cứu vai trò của sự di chuyển phân cực

của auxin đối với sự tích tụ auxin và sự hình thành rễ bất định ở đoạn thân mang chồi

của Petunia hybrida. Sau cắt và trồng đoạn thân trong khay nhựa, nhận thấy IAA tăng

lên ở gốc đoạn thân và đạt đỉnh cao ở thời điểm 2 h và 24 h, giảm mạnh ở ở 48 h và

giảm tối đa ở thời điểm 192 h. Xử lý Naphthylphthalamic acid (NPA) (chất ức chế

vận chuyển auxin) đã gây ức chế tạo đỉnh IAA ở 24 h dẫn đến ức chế hoàn toàn sự

tạo rễ. Các tác giả trên kết luận sự phát sinh rễ bất định ở Petunia phụ thuộc vào (1)

Sự vận chuyển phân cực của auxin, và (2) Đỉnh IAA ở thời điểm 24 h ở vùng tạo rễ

- tạo bể và cảm ứng sự phân chia đầu tiên của tế bào mô phân sinh rễ. IAA giảm sau

32

thời điểm 24 h tạo thuận lợi cho quá trình phát triển tiếp theo của rễ. Sự phát triển

tiếp theo của rễ kích thích sự đường phân và hoạt động của con đường pentose

phosphate – giúp tạo năng lượng, khung carbon dùng sinh tổng hợp acid amin, protein

và acid nucleic ở các tế bào trong quá trình tăng sinh, biệt hóa và tăng trưởng [101].

Guan và cộng sự (2019) đã nghiên cứu vai trò điều hòa của auxin đối với quá

trình tạo rễ bất định từ đoạn thân mang chồi (~ 4 cm) dòng cà chua Alisa Craig (AC)

và dòng chuyển gen DR5pro:YFP trans nuôi trong dung dịch dinh dưỡng Hoagland.

Kết quả cho thấy rễ bất định bắt nguồn từ tế bào nguồn ở lớp tế bào trụ bì của đoạn

thân. Sau đó rễ bất định kéo dài sau quá trình chết của tế bào biểu bì. Mức auxin và

ethylene tăng lên ở phần gốc đoạn thân trong vòng 1 h, có sự phân bố auxin gia tăng

ở pha khởi tạo rễ, tập trung ở mô phân sinh đang phát triển; ngược lại, zeatin, acid

salicylic và acid abscisic chỉ đóng vai trò nhỏ trong quá trình tạo rễ. Các tác gỉả trên

còn ghi nhận sự biểu hiện của gen vận chuyển auxin đặc hiệu tăng lên trong suốt pha

phát triển của rễ [102].

Guan và cộng sự (2020) đã nghiên cứu sự di chuyển phân cực của auxin thông

qua sự tạo rễ bất định từ đoạn thân của giống táo lùn (Malus domestica) M.9. Các tác

giả cho rằng sự hình thành rễ bất định bắt đầu bằng sự phân chia và kéo dài của các

tế bào nguồn – là tế bào tượng tầng đã phản biệt hóa, ở vị trí gần kề hai bó mạch, quá

trình này xảy ra ở điều kiện có mức tương đối cao của IAA trong mô và có sự phân

giải các hạt tinh bột dùng cung cấp năng lượng. Auxin ngoại sinh đã kích thích sự

phân chia tế bào, sự tăng sinh và tái cấu trúc hệ võng nội chất và thể golgi. Ngược

lại, ở nghiệm thức xử lý N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) - tác nhân gây ức chế

sự di chuyển auxin, nhận thấy có hiện tượng ức chế sự phân chia tế bào ở vùng gốc

của đoạn thân dẫn đến sự phân bào bất thường ở suốt giai đoạn sớm của quá trình

hình thành rễ [13].

Auxin là chất ĐHST có tính quyết định đối với nuôi cấy rễ bất định, một số

auxin thường được sử dụng là IAA, IBA, NAA, kể cả 2,4-D. Hiệu quả đến tăng

trưởng rễ khá phụ thuộc vào loài thực vật. Dựa trên các báo cáo khác nhau cho thấy

IBA là auxin thích hợp để cảm ứng và phát triển nuôi cấy rễ của một số cây thuốc/cây

trồng như Centella asiatica, Costus igneus, Couroupita guianensis Aubl., Labisia

pumila, Psoralea coryfolia, Silyabum marianum. Nồng độ IBA 7 m/L; 0,5 mg/L là

nồng độ tối ưu cho sự hình thành rễ bất định so với NAA/IAA ở Centella asiatica,

33

Costus igneus, theo thứ tự. Bên cạnh IBA, NAA cũng có ảnh hưởng mạnh đến cảm

ứng và gia tăng sinh khối rễ. NAA là auxin tốt nhất đối với nuôi cấy rễ nhiều loài như

Andrographis paniculata, Boesenbergia rotunda, Eurycoma longifolia, Fagonia

indica, Mondia whitei, và Rumex crispus. Trong nghiên cứu nuôi cấy rễ cây thuốc

Andrographis paniculata, NAA ở nồng độ 2,7 µM tạo sinh khối rễ khô/tươi và hàm

lượng andrographolide cao sau 4 tuần nuôi cấy so với IAA và IBA. Đối với Rumex

crispus, 5 µM NAA là nồng độ rất thích hợp để tạo và tăng sinh rễ. Trong khi đó,

nồng độ cao hơn, 10 µM NAA - tối ưu cho nuôi cấy rễ của Mondia whitei. So với

IBA và NAA, IAA có hiệu quả thấp trong thúc đẩy phát triển rễ cây thuốc, trừ ở

trường hợp Orthosiphon stamineus (nồng độ 3 mg/L là tốt nhất để thúc đẩy sự ra rễ

từ mẫu cấy lá). Ngoài ra, một số nghiên cứu cũng cho rằng IBA và NAA có thể được

kết hợp với nhau để tạo ra các điều kiện tăng trưởng tối ưu cho nuôi cấy rễ cây thuốc.

Ví dụ, sự kết hợp 1 mg/L IBA và 1 mg/L NAA rất thích hợp cho rễ Luffa acutangula

(L.) Roxb. và sự kết hợp của 0,05 mg/L IBA và 0,1 mg/L NAA là điều kiện tối ưu

cho rễ Psammosilene tunicoides [98]. Ở họ Ngũ gia bì, cũng nhận thấy có sự đa dạng

về loại môi trường, loại và nồng độ chất ĐHST,.. sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ. Ví

dụ rễ bất định Panax notoginseng tái sinh tốt từ mô cuống lá, đoạn rễ nhánh nuôi cấy

trên môi trường MS có 3 mg/L IBA, có hoặc không bổ sung kinetin; nuôi lỏng lắc rễ

bất định được thực hiện trong môi trường ½MS có 3 mg/L IBA [44]. Đối với tạo rễ

bất định thứ cấp từ rễ bất định sơ cấp Panax vietnamensis, rễ thứ cấp phát triển tốt

nhất trên môi trường MS cải biên (½NH4+/NO3

-) có IBA và BA, 30 g/L đường, ở

22oC và pH 5,3 [47]. Li và cộng sự (2004) đã tạo rễ cho các chồi (có nguồn gốc từ

đốt thân) Schefflera octophylla qua sử dụng môi trường ½MS có bổ sung chất ĐHST

thích hợp là NAA (0,2 mg/L). Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA sử dụng để

tái sinh rễ bất định Panax stipuleanatus từ mô sẹo có nguồn gốc từ thân rễ [43].

Lo (1997) cũng nghiên cứu sự tái sinh rễ bất định Saintpaulia ionantha

(African violet) đồng thời với nghiên cứu tái sinh chồi từ mảnh lá theo cơ chế phát

sinh cơ quan dưới ảnh hưởng của một số yếu tố như tuổi sinh lý, tạo vết thương, cách

đặt mẫu cấy vào môi trường và sự trao đổi khí. Kết quả thu được cho thấy rễ bất định

có nguồn gốc từ tế bào nhu mô diệp lục khuyết [103].

Mảnh lá Medicago truncatula được sử dụng để nghiên cứu sự cảm ứng tạo rễ

bởi auxin từ nuôi cấy mảnh lá trên môi trường P4 có 10 µM NAA. Rễ tái sinh sau

34

giai đoạn mô sẹo chỉ mới bắt đầu hình thành. Khảo sát mô tế bào cho thấy, sau nuôi

cấy, có các lớp tế bào khác biệt hình thành từ bó mạch của mảnh lá và từ đây sơ khởi

rễ và tế bào mô mạch mới hình thành. Như vậy, các tế bào có nguồn gốc mô mạch

(VDC) lá tương tự như tế bào tiền tượng tầng và có chức năng của tế bào gốc, qua

đáp ứng với auxin ngoại sinh sẽ có xu hướng tạo tế bào mô phân sinh sơ khởi rễ và

mô mạch của rễ mới hình thành (kết quả đã được chứng minh qua sử dụng đột biến

sickle ‘skl’ – bị hư hại ở khả năng truyền tín hiệu ethylene trong khi dòng hoang dại

và dòng đột biến ‘sunn’ - khiếm khuyết ở chức năng di chuyển phân cực của auxin).

VDC có thể có nguồn gốc từ mô libe hoặc gần mô libe [104].

Qua các thông tin cho thấy, phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã và đang có

nhiều đóng góp trong lĩnh vực nghiên cứu thực vật ở khía cạnh sinh lý. Cơ sở khoa

học của phương pháp này là tính toàn thế của tế bào. Qua nuôi cấy trong điều kiện

thích hợp, tế bào có thể phát triển qua nhiều bước tiếp theo thành các cấu trúc mới

như phôi vô tính/chồi/rễ và thành cây hoàn chỉnh theo hình thức tái sinh trực tiếp

hoặc gián tiếp. Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tạo các sản phẩm

mục tiêu như phôi/chồi/rễ như vai trò sinh lý của chất ĐHST, tuổi sinh lý mẫu cấy,

điều kiện nuôi cấy, kiểu gene thực vật,… Theo nhiều tài liệu, trong các nhóm chất

ĐHST, auxin là tác nhân đóng vai trò quan trọng của quá trình tái lập trình để tế bào

sinh dưỡng (ở trạng thái biệt hóa hoặc phản biệt hóa) chuyển sang trạng thái mang

tính toàn thế (founder cell) - hướng đích tạo phôi vô tính hoặc rễ bất định. Phương

pháp khảo sát hình thái/hình thái giải phẫu mô tế bào với đối tượng nghiên cứu là các

loại mô/tế bào, hình thức tổ chức và phát triển của chúng cũng đã góp phần quan

trọng trong tìm hiểu về tính toàn thế của tế bào.

Tóm lại, các thông tin tổng quan nêu trên đã khái quát tầm quan trọng của một

số loài thực vật quan trọng thuộc họ Ngũ gia bì nói chung và NGBCC nói riêng, trong

lĩnh vực nghiên cứu khoa học và thực tiễn cuộc sống. Như đã trình bày, điểm tồn

tại/hạn chế hiện nay là các nghiên cứu liên quan đến xây dựng hai hệ thống nuôi cấy

là phôi vô tính và rễ bất định - vốn có rất nhiều ưu điểm còn rất hạn chế trên đối tượng

thực vật này. Do vậy, đề tài này với nội dung triển khai thực nghiệm nghiên cứu tạo

và nhân sinh khối phôi vô tính và rễ bất định hy vọng sẽ góp phần phát triển hướng

nghiên cứu quan trọng này, đồng thời cung cấp một số dẫn liệu khoa học mới về hai

hệ thống nêu trên.

35

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguồn mẫu – Vật liệu nuôi cấy

2.1.1. Nguồn mẫu

Cây NGBCC khoảng 8 năm tuổi được thu thập từ nhà vườn, trồng trong chậu

(Hình 2.1), được lưu trữ ở nhà lưới Phòng thí nghiệm trọng điểm phía nam về Công

nghệ tế bào thực vật (Viện Sinh học nhiệt đới) để tạo vật liệu nuôi cấy cho các thí

nghiệm.

Hình 2.1. Cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla)

2.1.2. Tạo vật liệu nuôi cấy ban đầu

Sử dụng tất cả các lá chét (lá đơn) (Hình 2.2A) được cắt ra từ lá kép thứ 2 (tính

từ ngọn) cây NGBCC khoảng 8 năm tuổi (Hình 2.1). Các lá chét được rửa bằng nước

xà phòng, rửa lại dưới vòi nước chảy trong 10 phút, khử trùng tiếp bằng cồn 70%

trong 10 phút, bằng nước Javel (NaOCl, hàm lượng chlor hoạt chất 38 g/L) 30% (v/v)

trong 20 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau khử trùng, cắt phiến lá chét

thành các mảnh lá kích thước 10 x 10 mm (mảnh lá I), 3 x 10 mm (mảnh lá II) làm

vật liệu nuôi cấy (Hình 2.2B,C,D).

Hình 2.2. Lá kép Ngũ gia bì chân chim và vật liệu nuôi cấy

A. Lá kép, LC: Lá chét, B. Cách cắt mẫu; Mảnh lá 10 x 10 mm (C), 3 x 10 mm (D)

36

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.2.1. Nội dung 1. Tạo phôi vô tính

Nghiên cứu sự cảm ứng phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá thông qua

khảo sát ảnh hưởng bởi loại và nồng độ chất ĐHST auxin (NAA/IBA), nồng độ của

cytokinin (BA), loại môi trường khoáng (½MS, MS, B5, SH), nồng độ sucrose, tỷ lệ

% nước dừa, điều kiện chiếu sáng. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính, trồng cây

con ra chậu đất ở vườn ươm. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá nuôi cấy

ở môi trường đặc và lỏng, mô sẹo hình thành từ mảnh lá ở môi trường SH có bổ sung

2,4-D.

Quan sát, theo dõi các giai đoạn phát sinh phôi: phôi cầu, phôi trái tim, phôi

thủy lôi, phôi trưởng thành có dạng hai lá mầm. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi;

hình thái cụm tế bào/cụm mô trong quá trình nuôi cấy lỏng.

2.2.2. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính

Sử dụng nguồn phôi vô tính được hình thành từ thí nghiệm tạo phôi vô tính

làm vật liệu cho nuôi cấy nhân phôi. Nhân phôi ở môi trường lỏng: khảo sát chất

ĐHST, khối lượng và kích thước phôi nuôi cấy, nồng độ đường, tỷ lệ % nước dừa,

cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến tạo phôi thứ cấp.

Giải phẫu phôi thứ cấp và xác định nguồn gốc hình thành của phôi thứ cấp.

2.2.3. Nội dung 3. Tạo rễ bất định

Khảo sát các yếu tố như: loại và nồng độ auxin thích hợp (NAA/IBA), loại

môi trường khoáng, nồng độ đường, điều kiện chiếu sáng ảnh hưởng đến cảm ứng

tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá NGBCC. Tiến hành khảo sát giải phẫu sơ khởi rễ.

Ngoài ra, khảo sát ảnh hưởng NAA/IBA đến cảm ứng tạo rễ bất định từ chồi có nguồn

gốc từ đốt thân vườn ươm/đốt thân in vitro, chồi có nguồn gốc phôi vô tính.

2.2.4. Nội dung 4. Nhân rễ bất định

Sử dụng các rễ đơn 20 ngày tuổi làm vật liệu nuôi cấy cho nhân rễ bất định.

Tiến hành khảo sát chất ĐHST (NAA/IBA) ảnh hưởng đến sự phân nhánh rễ;

ảnh hưởng của nồng độ đường, khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối rễ.

Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian.

37

Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu

TN 1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường

khoáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá

TN 2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự

tạo phôi trực tiếp từ mô lá

TN 3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu

sáng đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá

TN 4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp

từ mô lá

TN 6. Trồng cây con ở chậu đất

Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi

TN 7. Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (10 x 10 mm)

TN 5. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính

TN 8. Tạo phôi từ mô sẹo nuôi cấy mảnh lá (10 x 10 mm)

trên môi trường đặc

Quan sát hình thái cụm tế bào/cụm mô nuôi lỏng lắc

TN 10. Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (3 x 10 mm)

TN 11. Tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)

NỘI DUNG 1

Tạo phôi vô tính

TN 13. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến sự tạo phôi thứ cấp

Vậ

t liệu

TN 9. Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trong môi trường lỏng

Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi tái sinh trên môi

trường đặc

TN 14. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự

tăng trưởng sinh khối phôi

TN 17. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng

trưởng sinh khối phôi

NỘI DUNG 2

Nhân phôi vô tính

TN 15. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự

tạo phôi thứ cấp

TN 18. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp

Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp.

TN 16. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng

sinh khối phôi

TN 19. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc

Nh

ân

ph

ôi tro

ng

mô

i trườ

ng lỏ

ng

TN 12. Nhân phôi trên môi trường đặc

Tạ

o p

hô

i vô

tính

trự

c tiếp từ

mô

lá

Tạ

o p

hô

i vô

tính

giá

n tiếp

qu

a m

ô sẹo

mả

nh

lá

38

Tạ

o rễ b

ất đ

ịnh

trự

c tiếp

từ m

ô lá

TN 20. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường

khoáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá

TN 22. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ

bất định trực tiếp từ mô lá

Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô

lá

TN 23. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định

từ chồi in vitro của đốt thân cây vườn ươm


từ chồi của đốt thân cây in vitro


từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính

NỘI DUNG 4

Nhân rễ bất định

TN 26. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ

TN 27. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng

sinh khối rễ

TN 28. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng

trưởng sinh khối rễ

TN 29. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo

thời gian

Tạo rễ b

ất đ

ịnh

từ

chồi

Vậ

t liệu

TN 21. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất

định trực tiếp từ mô lá

NỘI DUNG 3

Tạo rễ bất định

39

2.3. Nội dung 1. Tạo phôi vô tính

2.3.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá

2.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi

trực tiếp từ mô lá

Để khảo sát ảnh hưởng riêng rẽ của loại auxin với nồng độ thích hợp và môi

trường khoáng đến sự phát sinh phôi trực tiếp từ mảnh lá, tiến hành bố trí thí nghiệm

theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST với các mức nồng độ khác nhau; yếu tố về

môi trường khoáng với 4 loại môi trường.

Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm.

Môi trường nuôi cấy là ½MS, MS [105], B5 [106] và SH [107] bổ sung loại

auxin riêng lẻ (NAA hoặc IBA) ở các nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 mg/L), có

chứa 30 g/L đường (sucrose). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên,

tiến hành cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Ghi nhận các

chỉ tiêu về tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu tạo phôi tại thời điểm 60 NSC.


Cắt dọc phôi (cầu, trái tim, thủy lôi) thành lát mỏng bằng dao lam, ngâm vi

phẫu vào nước javel đến khi mẫu trắng (loại bỏ nội chất tế bào), rửa sạch mẫu bằng

nước cất. Sau đó, ngâm vi phẫu trong dung dịch acid acetic 10% trong 10 phút (loại

bỏ javel trước khi nhuộm). Thực hiện nhuộm kép vi phẫu bằng thuốc nhuộm son phèn

- lục iod trong 15 phút, rửa sạch mẫu [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi

nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.

Chỉ tiêu theo dõi: Các dạng hình thái của phôi vô tính (dạng phôi cầu, phôi

tim, phôi thủy lôi, phôi dạng hai lá mầm)

2.3.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và BA đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá

Nhằm xác định nồng độ BA tối ưu kết hợp với loại auxin có nồng độ thích hợp

đến cảm ứng tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá.

Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá kích thước 10 x 10 mm

Môi trường nuôi cấy là môi trường khoáng có loại auxin với các nồng độ có

tác động tích cực đến sự hình thành phôi (kế thừa kết quả từ thí nghiệm 2.3.1.1) và

có bổ sung BA với các nồng độ khác nhau (0; 0,25; 0,5; 1mg/L), 30 g/Lsucrose. Thí

nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về nồng độ của loại auxin với các mức nồng

độ tác động tích cực đến tạo phôi (kết quả thí nghiệm trên), yếu tố về nồng độ của

40

BA (có 4 mức nồng độ). Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3

lần. Ghi nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 60 NSC: tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu.

2.3.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi

trực tiếp từ mô lá

Khảo sát nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng thích hợp đến cảm ứng tạo

phôi. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường khoáng có nồng độ của loại

auxin (NAA/IBA); nồng độ BA (kế thừa kết quả từ hai thí nghiệm trên) có bổ sung

sucrose với các nồng độ khác nhau (10, 30, 50, 70 g/L) và nuôi mẫu ở điều kiện chiếu

sáng/tối. Ở điều kiện chiếu sáng, mẫu đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang, chiếu sáng

12 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ sáng ~ 4.000 lux; ở điều kiện tối mẫu đặt trong

điều kiện tối hoàn toàn.


Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố sucrose với 4 mức nồng độ

khác nhau (10, 30, 50, 70 g/L), yếu tố điều kiện chiếu sáng với 2 mức sáng (4.000

lux)/tối. Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi

nhận các chỉ tiêu tại thời điểm 60 NSC: tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số phôi/mẫu.

2.3.1.4. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự tạo phôi trực tiếp từ mô lá

Các điều kiện tối ưu của thí nghiệm 2.3.1.3 được áp dụng làm môi trường nuôi

cấy có bổ sung nước dừa với các tỷ lệ khác nhau 0, 5, 10, 15, 20% (v/v); để khảo sát

ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá.


Cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu

theo dõi được ghi nhận tại thời điểm 60 NSC gồm tỷ lệ mẫu tạo phôi (%); số

phôi/mẫu. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố.

2.3.1.5. Tạo cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính

Nhằm xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo cây con in vitro hoàn

chỉnh, từ đó tạo cây con có thân, bộ lá, rễ tốt phục vụ việc trồng cây ra chậu đất.

Vật liệu nuôi cấy là các cây con có thân cao ~ 1 cm, đã có lá thật 3 – 4 mm

(nguồn gốc từ phôi vô tính).

Tách các cây con, nuôi cấy trên các đĩa petri có chứa 30 mL môi trường nuôi

cấy là MS hoặc ½MS, có chứa 20 g/L sucrose, không bổ sung chất ĐHST. Cấy 5 cây

con/đĩa với 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát hình thái cơ bản,

41

thu thập số liệu về các chỉ tiêu theo dõi sau cấy 90 ngày. Tại thời điểm 90 NSC tiến

hành đo đếm các chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao cây (cm), số lá/cây, số rễ/cây; chiều dài

rễ (mm): được xác định từ gốc rễ đến chóp rễ; quan sát hình thái cơ bản.

Sử dụng môi trường tốt nhất của thí nghiệm làm môi trường nuôi cấy tạo nguồn

cây con in vitro khỏe mạnh. Sử dụng các cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính như

trên cấy vào bình tam giác chứa 50 mL môi trường nuôi cấy, cấy 3 cây/bình, 10

bình/lần lặp lại, lặp lại 3 lần. Sau 3 tháng thu các cây con để trồng ra chậu đất ở vườn

ươm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.

2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất

Các cây con 3 tháng tuổi được nuôi cấy trong bình tam giác (từ kết quả thí

nghiệm trên), lấy ra khỏi bình tam giác, rửa sạch agar, bảo quản và đảm bảo độ ẩm

tránh mất nước cho cây, sau đó được trồng ra chậu (có Ø ~ 20 cm) chứa đất sạch

thương hiệu Tribat (Cty TNHH Công nghệ sinh học Sài Gòn Xanh, TP. HCM). Các

chậu cây được đặt trong vườn ươm, trồng 1 cây con/chậu, 10 chậu/lần lặp lại, 3 lần

lặp lại, ghi nhận tỷ lệ sống (%) và hình thái cơ bản của cây con ở thời điểm 3 tuần

sau trồng.

Tỷ lệ sống (%) = (Số cây sống/số cây trồng) x 100%

Trồng cây ở vườn ươm với điều kiện che sáng ~ 50% bằng lưới đen (cường độ

sáng ~ 8.000 lux), tưới phun 2 ngày/lần, nhiệt độ 30 - 32oC, độ ẩm 60 - 70%. Theo

dõi, ghi nhận, đánh giá cảm quan hình thái cây đến giai đoạn 3 - 12 tháng sau trồng.

2.3.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo từ nuôi cấy mô lá

2.3.2.1. Tạo phôi vô tính gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá (10 x 10 mm)

Tạo mô sẹo

Vật liệu nuôi cấy: các mảnh lá có kích thước 10 x 10 mm

Mẫu được cấy vào môi trường tạo mô sẹo SH có bổ sung 2,4-D với các nồng

độ (0; 1; 2; 3 mg/L), 30 g/L sucrose. Sau cấy 40 ngày, cấy chuyền các mẫu và nuôi

tiếp trong 20 ngày nhằm để mô sẹo hình thành trên toàn bộ bề mặt mảnh lá. Thí

nghiệm được thực hiện trên các đĩa petri, cấy 5 mảnh lá/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại. Quan

sát, theo dõi sự hình thành mô sẹo ở 20, 40, 60 NSC.

Cắt các mảnh lá mang mô sẹo (sau đây gọi tắt là mảnh mô sẹo) ở 60 NSC nói

trên thành các mảnh có kích thước (~ 10 x 10 mm/~ 1 cm2), nuôi cấy tiếp trong thời

42

gian 30 ngày để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi (KNSP). Tiến hành cấy 5 mảnh

mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu ở thời điểm 30 NSC: tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo có

KNSP (%), số cụm mô sẹo có KNSP/mẫu mô sẹo.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.

Xác định mô sẹo có KNSP dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, cấu trúc, mô

sẹo có KNSP: có dạng cứng, trắng hơi vàng, vàng, cấu trúc chắc, dạng cụm hoặc hạt,

phát triển chậm. Mô sẹo không có KNSP có cấu trúc xốp, phát triển nhanh, màu trắng

hoặc xám, mềm.

Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường đặc

Vật liệu nuôi cấy: các cụm mô sẹo có KNSP

Các cụm mô sẹo có KNSP thu từ thí nghiệm trên được cắt thành các cụm nhỏ

có kích thước ~ 5 mm, cấy vào môi trường tạo phôi là môi trường nuôi cấy có bổ

sung loại auxin và nồng độ thích hợp của BA (kế thừa kết quả thí nghiệm tạo phôi

trực tiếp). Loại auxin này được bố trí với các nồng độ 1; 2; 3; 4; 5 mg/L; có 30 g/L

sucrose.

Tiến hành cấy 5 cụm mô sẹo có KNSP/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức

được lặp lại 3 lần, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố . Theo

dõi, ghi nhận số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu theo dõi: số cụm mô sẹo có

KNSP tạo phôi, số phôi/cụm mô sẹo có KNSP, đặc điểm hình thái phôi.

Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi tái sinh trên môi trường đặc

Sử dụng dao lam cắt ngang phôi tái sinh từ cụm mô sẹo có KNSP nuôi trên

môi trường đặc để tạo các lát mỏng tế bào, tiếp theo các mẫu cắt được nhuộm bằng

phương pháp nhuộm màu kép như trên [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi

nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.

Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường lỏng

Thí nghiệm được tiến hành với nguồn vật liệu là các cụm mô sẹo có KNSP có

đường kính khoảng 5 mm, cấy 30 cụm mô sẹo có KNSP vào bình tam giác V250 mL

chứa 60 mL môi trường kế thừa từ kết quả thí nghiệm trên, mỗi nghiệm thức lặp lại

3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành phôi ở 10, 14, 30 NSC.

Quan sát hình thái cụm tế bào/cụm mô nuôi lỏng lắc

43

Quan sát, ghi nhận hình thái cụm tế bào sống (không nhuộm màu), cụm đa bào

sinh phôi (qua nhuộm màu) (ở giai đoạn ~ 10 ngày nuôi lỏng lắc mô sẹo có khả năng

sinh phôi) dưới kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 50X, 20X, theo thứ tự.


Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (3 x 10 mm)

Thí nghiệm này nhằm tạo nguồn vật liệu mô sẹo cho sự khảo sát tạo phôi sau

đó. Vật liệu nuôi cấy được sử dụng là mảnh lá có kích thước 3 x 10 mm. Thí nghiệm

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.

Mẫu được cấy trên môi trường tạo mô sẹo là SH có bổ sung 2,4-D với các

nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L, 30 g/L sucrose. Tiến hành cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại,

mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mô sẹo, mô sẹo có

KNSP ở thời điểm 30 NSC.

Tạo phôi

Vật liệu nuôi cấy: mô sẹo hình thành từ thí nghiệm 2.3.2.2

Mẫu mô sẹo được cấy vào môi trường tạo phôi giống môi trường nuôi cấy của

thí nghiệm tạo phôi ở môi trường đặc. Tiến hành cấy 5 mẫu mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần

lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và

hoàn toàn ngẫu nhiên. Theo dõi, quan sát sự hình thành phôi; thu thập số liệu ở thời

điểm 30 NSC với các chỉ tiêu: số mẫu mô sẹo tạo phôi, số phôi/mẫu mô sẹo. Tiếp tục

quan sát, ghi nhận sự phát triển của phôi ở giai đoạn 60 NSC (không thu thập số liệu).

2.3.3. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi

Phôi vô tính được xác định là một trong bốn dạng hình thái phát triển của phôi:

dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, dạng phôi trưởng thành (dạng phân cực có tiền

lá mầm và tiền rễ). Đếm phôi bằng cách quan sát dưới kính lúp và ghi nhận số phôi.

Tiến hành lấy chỉ tiêu theo dõi với 30 mẫu cho mỗi nghiệm thức.

Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phôi trực tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời

điểm ngày thứ 60 sau cấy:

Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) = (Số mẫu tạo phôi/số mẫu cấy) x 100%

Số phôi/mẫu = Tổng số phôi/số mẫu tạo phôi

Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phôi gián tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời

điểm ngày thứ 30 sau cấy:

Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo có KNSP (%) = (𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑡ạ𝑜 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑐ó 𝐾𝑁𝑆𝑃

𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑐ấ𝑦) x 100%

44

Số cụm mô sẹo có KNSP/mẫu = 𝑆ố 𝑐ụ𝑚 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑐ó 𝐾𝑁𝑆𝑃

𝑠ố 𝑚ẫ𝑢 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑐ó 𝐾𝑁𝑆𝑃

Số phôi/cụm mô sẹo = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑝ℎô𝑖

𝑆ố 𝑐ụ𝑚 𝑚ô 𝑠ẹ𝑜 𝑡ạ𝑜 𝑝ℎô𝑖

2.4. Nội dung 2. Nhân phôi vô tính

2.4.1. Nhân phôi trên môi trường đặc

Vật liệu nuôi cấy là các cụm phôi vô tính sơ cấp (hình thành từ mảnh lá).

Môi trường nhân phôi được sử dụng từ kết quả của thí nghiệm tạo phôi trực

tiếp từ mảnh lá về môi trường khoáng, loại auxin, nồng độ BA. Loại auxin này được

sử dụng với các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/L), 30 g/L sucrose. Thí nghiệm

được bố trí trên các đĩa petri, theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Cấy 5

cụm phôi/đĩa (3 phôi/cụm), 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thu thập

số liệu về số phôi/cụm phôi, hệ số nhân phôi, quan sát đặc điểm hình thái phôi, cụm

phôi ở 30 NSC. Chú ý quan sát sự hình thành phôi thứ cấp ở các bộ phận (từ thân, lá,

rễ) của phôi sơ cấp.

2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng

2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp qua

nuôi lỏng lắc

Sử dụng kết quả của thí nghiệm trên làm cơ sở cho thí nghiệm khảo sát tác

động của các chất ĐHST đến sự phát sinh phôi thứ cấp trong môi trường lỏng. Do

đó, môi trường nuôi cấy được kế thừa về môi trường khoáng, các mức nồng độ của

loại auxin có phát sinh phôi tích cực và nồng độ BA; nuôi cấy lỏng lắc. Sử dụng máy

lắc hiệu SARTORIUS của Đức, thực hiện nuôi lỏng lắc với 80 vòng/phút.

Vật liệu nuôi cấy là các phôi đơn 60 ngày tuổi (từ thí nghiệm tạo phôi vô tính

trực tiếp từ mô lá).

Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác V250 mL, chứa 60 mL môi

trường nuôi cấy, nuôi lỏng lắc 80 vòng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí

nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 30 phôi/bình. Quan sát, theo dõi thí

nghiệm, thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái và màu sắc

phôi ở 30 NSC.

45

2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi

Vật liệu nuôi cấy: sử dụng phôi qua nuôi cấy lỏng lắc sau 60 ngày nuôi cấy từ

phôi 60 ngày tuổi của các thí nghiệm tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá.

Để khảo sát ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi, sử dụng khối lượng phôi ban đầu như sau: 0,3; 0,6; 1,2; 1,8 g tương ứng với

0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường nuôi

cấy kế thừa thí nghiệm ảnh hưởng chất ĐHST, 30 g/L đường. Thu thập số liệu về

khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái phôi/cụm phôi

ở 30 NSC.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức

lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi

2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi nuôi cấy đến sự tạo phôi thứ cấp

Sử dụng vật liệu là các phôi vô tính với các kích thước khác nhau: kích thước

nhỏ (7 - 8 mm), trung bình (~ 10 mm), to (~ 15 mm). Tiến hành cấy 30 phôi nhỏ/trung

bình/to vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường nuôi cấy giống thí

nghiệm ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy, có 30 g/L đường.

Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức

lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc

điểm hình thái, màu sắc phôi/ cụm phôi hình thành ở 30 NSC.

2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Cấy khối lượng phôi 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60

mL môi trường như thí nghiệm trên, sucrose được khảo sát với các mức nồng độ (20,

30, 40, 50 g/L); mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về khối lượng

tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi ở

45 NSC. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố

2.4.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Cấy khối lượng phôi 0,30 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60

mL môi trường như trên, 30 g/L sucrose, nuôi ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau:

tối (0 lux), chiếu sáng với cường độ 2.000 lux (~ 27 μmol m-2 s-1), 4.000 lux (~ 54

μmol m-2 s-1), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi, thu thập số liệu về

46

khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần), đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm

phôi ở 30 NSC. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.

2.4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp

Các phôi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm) được cấy vào bình tam giác

V250 mL chứa 60 mL môi trường thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy

trên, 30 g/L sucrose, nước dừa được khảo sát với các mức tỷ lệ (0%, 5%, 10%). Cấy

30 phôi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về số phôi hình

thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi ở 21 NSC.

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố

2.4.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc

Sử dụng các phôi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm), cấy vào bình tam

giác V250 mL chứa 60 mL môi trường MS hoặc ½MS (1/2 khoáng đa lượng) [105]

không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, 20 g/L sucrose, cấy 30 phôi đơn/bình, mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần; quan sát, ghi nhận sự phát triển phôi đến giai đoạn trưởng

thành ở 14 NSC. Sau đó, cấy chuyển phôi sang môi trường đặc thích hợp (kế thừa kết

quả thí nghiệm) để phôi phát triển thành cây con trong 60 ngày.

2.4.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp

Cắt tạo các LMTB dọc thân phôi/rễ, ngang phiến lá mầm (của phôi sơ cấp)

mang phôi thứ cấp bằng dao lam, mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm

kép của Bộ môn Thực vật - Khoa Dược, ĐH. Y Dược TP. HCM [43]. Quan sát tiêu

bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.

2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định

Số phôi/cụm phôi = Tổng số phôi/số cụm phôi

Hệ số nhân phôi = Số phôi/cụm phôi

𝑆ố 𝑝ℎô𝑖 𝑐ấ𝑦/𝑐ụ𝑚

Khối lượng tươi phôi thu nhận (g): Thu và cân sinh khối lượng phôi ở mỗi

nghiệm thức sau 30 ngày nuôi.

Hệ số nhân sinh khối phôi (lần) = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡ươ𝑖 𝑝ℎô𝑖 𝑡ℎ𝑢 𝑛ℎậ𝑛(𝑔)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑝ℎô𝑖 𝑛𝑢ô𝑖 𝑐ấ𝑦 (𝑔)

2.5. Nội dung 3. Tạo rễ bất định

2.5.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá

2.5.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất


47

Khảo sát tác động của riêng lẻ của auxin và môi trường khoáng lên sự cảm

ứng tạo rễ bất định của mô lá, nhằm xác định loại và nồng độ auxin thích hợp, trên

môi trường khoáng thích hợp.

Sử dụng vật liệu là các mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm), cấy

úp mặt trên lá tiếp xúc vào môi trường MS, ½MS, B5 và SH có bổ sung các chất

ĐHST riêng lẻ NAA/IBA có cùng nồng độ (0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5) mg/L, 30 g/L sucrose,

chiếu sáng 4.000 lux, 12 h chiếu sáng/ngày. Cấy 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10

mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về các

mức nồng độ của NAA/IBA và yếu tố về môi trường khoáng với 4 môi trường khác

nhau (MS, ½MS, B5, SH). Theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ

(%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) ở thời điểm 30 NSC.

2.5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá

Nhằm khảo sát sự tác động của nồng độ đường đến sự phát sinh rễ từ các mẫu

cấy mảnh lá, sử dụng môi trường khoáng với chất ĐHST (NAA/IBA) có nồng độ tạo

rễ tích cực nhất (kế thừa từ thí nghiệm trên), có đường với các nồng độ khác nhau

(20; 30; 40; 50 g/L) làm môi trường nuôi cấy.

Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm). Mẫu được

cấy vào môi trường nuôi cấy trên với 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá

II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí hoàn

toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố. Theo dõi thí nghiệm, số liệu về tỷ lệ mẫu tạo

rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) được thu thập ở thời điểm 30 NSC.

2.5.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô

lá

Để khảo sát điều kiện chiếu sáng có tác động đến sự phát sinh rễ bất định từ

mảnh lá, tiến hành cấy mẫu trên môi trường khoáng, có loại và nồng độ auxin thích

hợp, nồng độ sucrose có tác động hiệu quả nhất đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh

lá (kế thừa kết quả từ hai thí nghiệm trên). Các đĩa mẫu cấy được đặt ở điều kiện

chiếu sáng khác nhau 4.000 lux, 2.000 lux, tối hoàn toàn.

Sử dụng vật liệu nuôi cấy là các mảnh lá I (10 x 10 mm) và mảnh lá II (3 x 10

mm). Với mảnh lá I cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; mảnh lá II cấy 10 mẫu/đĩa, 3

đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu

48

nhiên, theo kiểu đơn yếu tố. Quan sát, theo dõi thí nghiệm, ghi nhận số liệu về tỷ lệ

mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu (tạo rễ), chiều dài rễ (mm) thu thập ở thời điểm 30 NSC.

2.5.1.4. Khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái sinh trực tiếp từ mô lá

Cắt dọc các sơ khởi rễ 10 ngày tuổi, dài ~ 4 mm (hình thành trực tiếp ở mặt

trên của mảnh lá nuôi cấy trên môi trường ½MS có 3 mg/L NAA) tạo LMTB bằng

dao lam, vi phẫu được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép [43]. Quan sát tiêu bản

bằng kính hiển vi soi nổi Leica (độ phóng đại 20X) và chụp hình.

2.5.2. Tạo rễ bất định từ chồi

2.5.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm

Khử trùng mẫu.

Hình 2.3. Vật liệu đốt thân dùng nuôi cấy tạo chồi.

A. Nhánh cây (vạch ngang là vị trí cắt tạo các đốt thân; CL: cuống lá); B, C. Các đốt

thân dùng nuôi cấy tạo chồi (mũi tên chỉ vị trí chồi ở trạng thái ngủ) (thanh ngang 10

mm).

Sử dụng nhánh non (8 - 10 cm) cây NGBCC (Hình 2.3 A). Trước hết cắt bỏ

lá, rửa nhánh dưới vòi nước chảy trong 10 phút, rửa tiếp bằng nước xà phòng. Cắt

nhánh thành các đoạn mang chồi ngủ - đốt nhánh (sau đây gọi là đốt thân) dài ~ 1,5

cm, không sử dụng chồi ngọn, tiếp theo khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, bằng

nước Javel 30% (v/v) trong 30 phút, rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Các đốt

thân, sau khử trùng, cắt bỏ phần mô chết ở hai đầu (Hình 2.3 B, C) được dùng làm

vật liệu nuôi cấy trong thí nghiệm tạo chồi.

Tạo chồi từ đốt thân cây vườn ươm

Cấy các đốt thân sau khử trùng vào môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA

và 2 mg/L kinetin, 30 g/L sucrose [3]. Ghi nhận sự tạo chồi ở 60 NSC.

Tạo rễ bất định từ chồi

Tách các chồi (cao ~ 1 cm) và cấy vào môi trường tạo rễ bất định ½MS có bổ

sung 0,2 mg/L NAA [3], 20 g/L sucrose, 10 g/L agar, pH 5,8; IBA cũng được sử dụng

49

với nồng độ 0,2 mg/L. Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức

lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số rễ/chồi,

chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố

2.5.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro

Tạo chồi từ đốt thân cây in vitro

Cây in vitro ~ 5 tháng tuổi (có nguồn gốc từ phôi vô tính được nuôi trên môi

trường ½MS không bổ sung chất ĐHST, có 30 g/L sucrose) được cắt bỏ toàn bộ lá,

sau đó cắt thân thành các đoạn dài ~ 8 mm mang chồi nách và cấy vào môi trường

tạo chồi như trên. Theo dõi sự tạo chồi ở 60 NSC.

Tạo rễ bất định từ chồi

Tách các chồi nách 60 ngày tuổi (cao 0,7 - 1 cm), cấy vào môi trường tạo rễ

bất định như trường hợp trên. Cấy 2 chồi nách/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại, mỗi

nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu: tỷ lệ chồi tạo rễ

(%), số rễ/chồi, chiều dài rễ (mm) ở 60 NSC.

2.5.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính

Sử dụng vật liệu cây con có nguồn gốc từ phôi vô tính có chiều cao thân ~ 15

mm, cắt bỏ phần rễ trụ, giữ phần thân (trụ dưới lá mầm) và các lá phía trên, dùng như

vật liệu tạo rễ bất định. Mẫu được cấy vào môi trường ½MS có bổ sung NAA hoặc

IBA cùng nồng độ 0,1 mg/L, 20 g/L sucrose. Cấy 2 chồi/bình, cấy 15 bình/lần lặp lại,

mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%); số rễ/mẫu;

chiều dài rễ (mm) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ tại thời điểm 30 NSC


Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = (Số mẫu tạo rễ/số mẫu cấy) x 100%

Số rễ/mẫu = Tổng số rễ/số mẫu tạo rễ

Chiều dài rễ (mm) = Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo

Các chỉ tiêu của thí nghiệm tạo rễ từ chồi đốt thân cây in vitro được thu thập

ở 60 NSC:

Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) = (Số chồi tạo rễ/số chồi cấy) x 100%

Số rễ/chồi = Số rễ hình thành/số chồi tạo rễ

Chiều dài rễ (mm) = Tổng chiều dài các rễ/số rễ được đo

50

2.6. Nội dung 4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng

2.6.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phân nhánh của rễ

Sử dụng các rễ đơn (rễ sơ cấp, dài ~ 1 cm) tái sinh trực tiếp từ mảnh lá trên

môi trường đặc ½MS có 3 mg/L NAA ở thời điểm 20 NSC làm vật liệu nuôi cấy.

Cấy ~ 120 rễ đơn vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL (~ 0,5% - w/v) môi

trường lỏng ½MS có bổ sung NAA hoặc IBA với các nồng độ khác nhau 0, 1, 2, 3

mg/L. Sau 20 ngày nuôi cấy lấy ngẫu nhiên 30 rễ/lần, 3 lần đo đếm, thu thập số liệu

về chiều dài rễ sơ cấp (mm), số rễ thứ cấp cấp 1, chiều dài rễ thứ cấp cấp 1 (mm), số

rễ thứ cấp (sau đây gọi là rễ nhánh) cấp 2 hình thành và đặc điểm hình thái rễ.

2.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ

Cấy khối lượng rễ 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL

môi trường ½MS bổ sung NAA/IBA với nồng độ kế thừa kết quả thí nghiệm (2.6.1);

sucrose với các nồng độ (20, 30 và 40 g/L). Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ

(g), hệ số nhân rễ (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở thời điểm 30 NSC,

mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất

ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố nồng độ sucrose với ba mức nồng độ (20, 30, 40 g/L).

2.6.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối rễ

Để khảo sát ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng sinh khối rễ, sử

dụng khối lượng rễ 0,35 g; 0,70 g; 1,4 g; 2,1 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3%

(w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 70 mL môi trường ½MS có bổ sung NAA

hoặc IBA có nồng độ kế thừa thí nghiệm (2.6.1), nồng độ sucrose được sử dụng từ

thí nghiệm (2.6.2). Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân rễ (lần) và

đặc điểm hình thái, màu sắc rễ, cụm rễ ở 30 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí

nghiệm bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố khối

lượng rễ nuôi cấy với bốn mức nồng độ (0,35; 0,7; 1,4; 2,1%).

2.6.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian

Cấy khối lượng rễ thích hợp nhất (từ kết quả của thí nghiệm 2.6.3) vào bình

tam giác V250 mL chứa 70 mL môi trường nuôi cấy giống với thí nghiệm (2.6.3).

Sau thời gian nuôi cấy 28 ngày, tiến hành thay 70 mL môi trường nuôi cấy có thành

phần giống môi trường ban đầu. Thu thập số liệu về khối lượng tươi rễ (g), hệ số nhân

rễ (lần) ở 7, 14, 21, 28, 35, 42 và 49 NSC, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm

51

bố trí theo kiểu hai yếu tố: yếu tố chất ĐHST (NAA, IBA) và yếu tố thời gian với các

mức thời gian (7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 ngày).


Chiều dài rễ sơ cấp (mm) = Chiều dài các rễ/số rễ được đo

Số rễ nhánh cấp 1 = Số rễ hình thành từ rễ sơ cấp/số rễ sơ cấp

Chiều dài rễ nhánh cấp 1 (mm) = Chiều dài của các rễ nhánh/số rễ nhánh

Số rễ nhánh cấp 2 = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑟ễ 𝑛ℎá𝑛ℎ ℎì𝑛ℎ 𝑡ℎà𝑛ℎ 𝑡ừ 𝑟ễ 𝑐ấ𝑝 1

𝑆ố 𝑟ễ 𝑛ℎá𝑛ℎ 𝑐ấ𝑝 1

Khối lượng tươi rễ (g): khối lượng rễ tươi thu nhận được 30 NSC

Hệ số nhân (lần) = 𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑟ễ 𝑡ℎ𝑢 𝑛ℎậ𝑛 (𝑔)

𝐾ℎố𝑖 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑟ễ 𝑛𝑢ô𝑖 𝑐ấ𝑦 (𝑔)

2.7. Điều kiện nuôi cấy in vitro

Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng 25 - 28oC, độ ẩm trung bình

50 – 60%, các thí nghiệm đều được đặt ở ngoài sáng để dưới ánh sáng đèn huỳnh

quang, chiếu sáng 12 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ sáng ~ 4.000 lux (trừ thí nghiệm

tạo phôi trực tiếp ở điều kiện tối đặt trong điều kiện tối hoàn toàn; thí nghiệm ảnh

hưởng của cường độ ánh sáng đến tăng trưởng sinh khối phôi; thí nghiệm ảnh hưởng

của điều kiện chiếu sáng đến tạo rễ bất định ở điều kiện sáng 2.000 lux, ở điều kiện

tối mẫu đặt ở điều kiện tối hoàn toàn). Sử dụng môi trường đặc (agar 10 g/L, pH 5,8;

hấp khử trùng ở 1 atm/121oC trong 20 phút); thí nghiệm trong môi trường lỏng lắc

với tốc độ lắc 80 vòng/phút.

2.8. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.

Các kết quả trung bình của 3 lần lặp lại được xử lý và phân tích bằng ANOVA một

yếu tố, kiểm tra mức độ khác biệt giữa các nghiệm thức bằng LSD hoặc Duncan. Các

thí nghiệm 2 yếu tố được xử lý theo phân tích phương sai đa biến một chiều (One-

way MANOVA) của phép thử Duncan với p ≤ 0,05 bằng phần mềm SPSS 25.0. (Số

liệu tỷ lệ % biến động từ 0 – 100% chuyển đổi sang arcsin √𝑥 khi xử lý thống kê,

hoặc từ 70 – 100% được chuyển đổi sang (x + 0,5)1/2.

52

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tạo phôi vô tính

Trong nghiên cứu này, phôi vô tính hình thành trực tiếp được định nghĩa là

phôi tái sinh ngay ở lần nuôi cấy đầu tiên, khác với phôi tái sinh gián tiếp qua hai giai

đoạn nuôi cấy là giai đoạn tạo mô sẹo và phát sinh phôi từ mô sẹo [108][109].

3.1.1. Tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá

3.1.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo phôi

vô tính trực tiếp từ mô lá

Hình 3.1. Các dạng phát triển của phôi vô tính hình thành trực tiếp từ mô lá.

A,B. Phôi cầu đơn, cụm phôi cầu; C. Phôi dạng tim (1) và dạng cầu (2); D. Phôi dạng

thủy lôi; E,F,G,H. Phôi có lá mầm và rễ mầm phát triển; I. Cây con hoàn chỉnh lá

mầm, lá thật (đơn, kép), rễ cọc điển hình. Mũi tên chỉ lá mầm (trắng), rễ mầm (đen).

Thanh ngang 2 mm.

Sau 5 tuần nuôi cấy, phôi vô tính xuất hiện ở nhiều nghiệm thức, ở môi trường

SH có bổ sung 5 mg/L NAA phôi xuất hiện sớm và nhiều nhất, môi trường ½MS phôi

phát sinh chậm, ít hơn. Sự phân hóa cấu trúc trong quá trình phát sinh phôi từ mảnh

lá NGBCC bắt đầu từ dạng phôi cầu, xuất hiện khoảng 32 – 35 NSC, có màu vàng

nhạt (Hình 3.1A), giai đoạn phôi hình tim có màu xanh, xuất hiện sau đó khoảng 10

ngày, đây là dấu hiệu tiền hai lá mầm, dạng đặc trưng của sự hình thành phôi ở cây

hai lá mầm (Hình 3.1C). Dạng phôi thủy lôi (Hình 3.1D) phát triển tiếp đến giai đoạn

có hai lá mầm khoảng 15 – 20 ngày tiếp theo (Hình 3.1E,F,G,H). Phôi phát sinh trực

53

tiếp từ mảnh lá NGBCC đã trải qua tuần tự 04 dạng phát triển của phôi.

Quan sát sự phát sinh phôi từ mảnh lá NGBCC nhận thấy, các hình dạng khác

nhau và các giai đoạn phát triển của phôi cùng xuất hiện trên cùng mẫu cấy (Hình

3.1C1,C2), điều đó chứng tỏ quá trình phát sinh phôi không đồng bộ và các tế bào

khi đủ điều kiện sẽ phát sinh phôi.

Sau 60 ngày nuôi cấy, ở môi trường không bổ sung NAA/IBA, các mẫu cấy

đều không phát sinh hình thái, không xuất hiện phôi, mẫu cấy hóa nâu và chết sau đó,

điều đó chứng tỏ lượng chất ĐHST nội sinh ít không đủ cảm ứng phát sinh phôi. Tất

cả các mẫu cấy trên môi trường ½MS, MS, B5, SH có bổ sung IBA (1; 2; 3; 4; 5; 6

mg/L), đều không ghi nhận được cấu trúc phôi xuất hiện trong suốt 60 ngày nuôi cấy

(không trình bày số liệu). Ngược lại, các nghiệm thức bổ sung NAA (1; 2; 3; 4; 5; 6

mg/L) vào môi trường nuôi cấy đều có cảm ứng tạo phôi vô tính theo hướng tích cực

(Hình 3.2). Điều đó chứng tỏ, sự cảm ứng tạo phôi của mảnh lá NGBCC đối với mỗi

loại auxin trong môi trường nuôi cấy là khác nhau và cần có loại auxin ngoại sinh

thích hợp là NAA, còn IBA hoàn toàn không thích hợp cho sự cảm ứng tạo phôi.

Kết quả (Bảng 3.1) cho thấy, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu tăng khi tăng

nồng độ NAA (1 – 5 mg/L) trong môi trường nuôi cấy, khi tăng nồng độ 6 mg/L NAA

thì tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm. Khi xét các mức nồng độ NAA và

các loại môi trường khoáng, nhận thấy môi trường ½MS có bổ sung 1 mg/L NAA có

tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) và số phôi/mẫu thấp nhất (24,44% và 6,18 phôi/mẫu). Các chỉ

tiêu này đạt giá trị cao nhất khi môi trường SH có bổ sung 5 mg/L NAA với tỷ lệ mẫu

tạo phôi 88,89% và 19,95 phôi/mẫu (Hình 3.2L). Kết quả này có ý nghĩa khác biệt về

thống kê so với tất cả các nghiệm thức còn lại. Điều đó chứng tỏ, tỷ lệ mẫu tạo phôi

(%) và số phôi/mẫu chịu ảnh hưởng bởi các mức nồng độ của loại auxin thích hợp

(NAA) và loại môi trường khoáng phù hợp. Như vậy, nồng độ 5 mg/L NAA là tối ưu

để kích thích tạo phôi đạt hiệu quả cao nhất từ mảnh lá NGBCC, trong môi trường

nuôi cấy có hàm lượng và thành phần khoáng thích hợp là SH.

Sự cảm ứng phát sinh phôi từ mô lá NGBCC chỉ ở những nghiệm thức có bổ

sung NAA, số phôi phát sinh ít hoặc nhiều tùy thuộc nồng độ NAA sử dụng, điều này

cho thấy vai trò của auxin ngoại sinh là mang tính quyết định. Qua vết thương của

mẫu cấy làm tăng sự hấp thụ auxin ngoại sinh, sự hiện diện của auxin ngoại sinh

(NAA) trong tế bào làm tăng IAA nội sinh thông qua quá trình tổng hợp IAA nội

54

sinh, sự gia tăng của IAA nội sinh không thể thiếu để thay đổi chương trình di truyền

dẫn đến phát sinh phôi, sự cân bằng nội môi của các auxin rất quan trọng cho cảm

ứng tạo phôi [90]. Sự khác nhau về loại và nồng độ auxin ngoại sinh áp dụng trong

mối tương tác với sinh tổng hợp auxin nội sinh có vai trò quan trọng trong phát sinh

phôi vô tính [88][89]. Vai trò của auxin ngoại sinh và sự vận chuyển phân cực của

auxin, đóng vai trò quan trọng trong sự phát sinh phôi vô tính, điều này được Verma

và cộng sự (2018) chứng minh trong nghiên cứu tác động của auxin ngoại sinh đến

phát sinh phôi vô tính trực tiếp của Digitalis trojana [14].

Như vậy, auxin trong đó có NAA là yếu tố truyền tín hiệu cảm ứng phát sinh

phôi, có vai trò quan trọng kênh thông tin tế bào - làm tế bào biến đổi đến trạng thái

cuối cùng đã được chương trình hóa là phát sinh phôi vô tính [65]. Tuy nhiên khả

năng đáp ứng tạo phôi của mô thực vật khác nhau đối với các loại auxin trong môi

trường là khác nhau [70].

Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong nuôi cấy

in vitro, chứa thành phần và hàm lượng các chất khoáng cần thiết cho sự phát sinh

phôi. Trong thí nghiệm này, sử dụng các môi trường khoáng thường sử dụng trong

nghiên cứu phát sinh phôi vô tính ở họ Ngũ gia bì là MS, B5, SH [72][71][38] và

½MS. Kết quả sau 60 ngày nuôi cấy, phôi phát sinh cao nhất ở môi trường SH và

thấp nhất ở môi trường ½MS, điều đó chứng tỏ thành phần và hàm lượng chất khoáng

có tác động đến sự phát sinh phôi và môi trường khoáng SH thích hợp nhất cho cảm

ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá NGBCC.

Như vậy, hiệu quả phát sinh phôi chịu ảnh hưởng bởi loại, nồng độ auxin thích

hợp, hàm lượng và thành phần khoáng của môi trường nuôi cấy, trong đó auxin có

vai trò quyết định. Trong nghiên cứu này, tỷ lệ % mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu nhiều

nhất ở môi trường nuôi cấy SH có 5 mg/L NAA. Đây là nghiên cứu đầu tiên thực

hiện thành công tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC.

Thí nghiệm này, 2,4-D cũng đã được bố trí thực hiện trên NGBCC nhưng với

kết quả âm tính trong tạo phôi, chỉ ghi nhận được hiện tượng hình thành mô sẹo.

Theo một số tác giả, kiểu gen thực vật [109], loại môi trường khoáng cơ bản

[110], một số thành phần khoáng đơn lẻ [111], công thức môi trường nuôi cấy bao

gồm chất ĐHST,..[112][70] có ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành phôi vô tính

trực tiếp/gián tiếp.

55

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo phôi vô tính

trực tiếp từ mô lá ở 60 NSC.

NAA

(mg/L)

Môi trường

khoáng

Tỷ lệ mẫu tạo

phôi (%)

Số phôi/mẫu

0 ½MS 0.00q* 0,00r

1 ½MS 24,44p 6,18v

2 ½MS 33,33o 6,29u

3 ½MS 42,22n 7,02s

4 ½MS 52,22l 7,74n

5 ½MS 56,67k 8,71k

6 ½MS 46,67m 7,16p

0 MS 0.00q 0,00r

1 MS 57,78k 6,58t

2 MS 61,11j 7,29p

3 MS 66,67gh 8,67k

4 MS 75,56c 10,00h

5 MS 78,89b 11,69e

6 MS 68,89f 9,07j

0 B5 0.00q 0,00r

1 B5 47,78m 7,11st

2 B5 51,11l 7,47p

3 B5 56,67k 8,36l

4 B5 65,56hi 9,19i

5 B5 73,33d 12,48d

6 B5 64,44i 10,23g

0 SH 0.00q 0,00r

1 SH 60.00j 7,89m

2 SH 67,78fg 9,11ij

3 SH 71,11e 11,27f

4 SH 78,89b 15,24b

5 SH 88,89a 19,95a

6 SH 74,44cd 13,57c

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức

p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √𝑥

khi phân tích thống kê.

56

Hình 3.2. Mảnh lá tạo phôi ở môi trường ½MS, MS, B5, SH có NAA, 60 NSC.

A,B,C,D. Môi trường ½MS, MS, B5, SH có 3 mg/L NAA; E,F,G,H. Môi trường

½MS, MS, B5, SH có 4 mg/L NAA; I,J,K,L. Môi trường ½MS, MS, B5, SH có 5

mg/L NAA; thanh ngang 10 mm.

Khác với cảm ứng tạo phôi trực tiếp, quá trình tạo phôi gián tiếp có thể gây ra

biến dị dòng soma ở chuỗi DNA do trải qua giai đoạn mô sẹo [113]. Do vậy, theo

chúng tôi tạo phôi trực tiếp rất có ý nghĩa trong nhân giống cây trồng – nghiên cứu

dựa trên nguyên tắc đồng nhất về mặt di truyền.


Khảo sát cấu trúc giải phẫu phôi bằng phương pháp nhuộm hai màu đối với 03

thể phôi (cầu, trái tim, thủy lôi) đã được thực hiện. Quan sát dưới kính hiển vi, đã ghi

nhận được lớp tế bào biểu bì (epidermis) đặc trưng ở cả 03 dạng phôi, và sự hiện diện

của mạch dẫn ở cấu trúc phôi dạng thủy lôi (Hình 3.3).

57

Hình 3.3. Các giai đoạn phát triển của phôi vô tính và hình thái giải phẫu phôi

tương ứng.

A,B,C. Dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi; D,E,F. Hình thái giải phẫu tương ứng

dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, (LM: Lá mầm, BB: Biểu bì, M: Mạch; thanh

ngang 1 mm).

3.1.1.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ

mô lá

Phân tích số liệu (Bảng 3.2) cho thấy, môi trường nuôi cấy có NAA được bổ

sung BA với các mức nồng độ (0,25; 0,5; 1 mg/L) thì kết quả tạo phôi có khác biệt

về thống kê giữa các nghiệm thức. Điều đó chứng tỏ, sự kết hợp của NAA và BA có

ảnh hưởng đến sự phát sinh phôi. Nhận thấy, khi sử dụng BA (0,25; 0,5; mg/L) kết

hợp với NAA (3, 4, 5 mg/L) mô lá có biểu hiện đáp ứng tích cực, các chỉ tiêu theo

dõi đều cao hơn khi môi trường nuôi cấy bổ sung auxin (NAA) riêng lẻ, không kết

hợp với BA, cụ thể tỷ lệ mẫu cấy tạo phôi và số phôi/mẫu tăng, cao nhất ở nghiệm

thức có 5 mg/L NAA kết hợp với 0,25 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi là 94,44% và

28,56 phôi/mẫu), cao hơn nghiệm thức đối chứng 5 mg/L NAA (tỷ lệ mẫu tạo phôi

88,89% và 19,95 phôi/mẫu). Nhưng các nghiệm thức có NAA (3, 4, 5 mg/L) khi bổ

sung 1 mg/L BA, thì mẫu cấy tạo phôi chậm, tỷ lệ tạo phôi và số phôi/mẫu đều giảm,

thấp nhất ở nghiệm thức có 5 mg/L NAA và 1 mg/L BA (tỷ lệ mẫu tạo phôi 57,78%

và 9,67 phôi/mẫu). Như vậy, khi bổ sung BA với nồng độ tối ưu đã phát huy vai trò

của NAA trong quá trình phân bào và phát sinh phôi vô tính trực tiếp với hiệu quả

58

cao nhất. Từ kết quả trên cho thấy, sự hiện diện của auxin (NAA) kết hợp với

cytokinin (BA) là cần thiết cho quá trình phát sinh phôi NGBCC, sự tương tác này có

tác động tích cực và hiệu quả khi nồng độ của chất ĐHST thích hợp (Hình 3.4D,E).

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của kết hợp NAA và BA đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ

mảnh lá, ở môi trường SH, 60 NSC.

NAA

(mg/L)

BA

(mg/L)

Tỷ lệ mẫu

tạo phôi (%)

Số phôi/mẫu

3 0 71,11g* 11,27h

4 0 78,89e 15,24e

5 0 88,89c 19,95b

3 0,25 75,56f 15,78e

4 0,25 82,22d 18,83c

5 0,25 94,44a 28,56a

3 0,5 72,22g 12,67g

4 0,5 80,00e 18,00d

5 0,5 91,11b 20,67b

3 1 67,78h 10,67i

4 1 65,56i 14,33f

5 1 57,78j 9,67j


p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √𝑥


Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái sinh phôi)

đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phôi vô tính. Auxin ngoại

sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin cùng với

auxin kích thích sự phân bào, và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều quá

trình sinh học ở thực vật và mô nuôi cấy, do vậy cũng có vai trò quan trọng trong tạo

phôi [82]. Ở NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo

phôi tích cực - phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin

đối với tạo phôi như đã nêu trên.

59

Hình 3.4. Mảnh lá tạo phôi trực tiếp ở môi trường SH có NAA và BA, 60 NSC.

A,B,C. Môi trường SH có 4 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L; D,E,F. Môi trường

SH có 5 mg/L NAA và BA 0,25; 0,5; 1 mg/L. Thanh ngang 5 mm.

Kết quả tác động tích cực của BA đối với sự hình thành phôi NGBCC ở nghiên

cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Kharwanlang và cộng sự (2016a) khi bổ

sung thêm kinetin/BA (0,25 – 5 mg/L) vào môi trường dùng tạo phôi Panax

pseudoginseng [71]. Trong nuôi cấy in vitro, đa số các thực vật (có khuynh hướng tái

sinh phôi) đều có nhu cầu auxin và cytokinin nhằm đáp ứng tạo phôi vô tính. Auxin

ngoại sinh/bổ sung giúp điều hòa và cân bằng lượng auxin nội sinh [70], cytokinin

cùng với auxin kích thích sự phân bào và cả hai có tác động cộng hưởng đối với nhiều

quá trình sinh học ở thực vật và mô nuôi cấy và do vậy cũng có vai trò quan trọng

trong tạo phôi [82]. Từ nuôi cấy mảnh lá mầm phôi hợp tử Cucumis sativa trên môi

trường có BA ở điều kiện chiếu sáng, Li và cộng sự (2007) nhận thấy BA, ngoài tác

động làm tăng kích thước mảnh lá mầm cũng đã làm tăng hàm lượng cytokinin nội

sinh [5]. Qua nghiên cứu mối liên quan giữa hàm lượng chất ĐHST nội sinh với các

giai đoạn phát triển khác nhau của phôi vô tính từ nuôi cấy mô phôi hợp tử Ormosia

henryi, Gaoyin và cộng sự (2020) [12] nhận thấy hàm lượng auxin đạt cao ở giai

đoạn phát triển và sự phân cực của phôi (tỷ lệ IAA/CKs, AUX/CKs cao), và hàm

60

lượng cytokinin cũng cao ở giai đoạn trưởng thành và nẩy mầm của phôi (tỷ lệ

IAA/CKs, AUX/CKs giảm).

Như vậy, chất ĐHST ngoại sinh có vai trò không thể thay thế trong cảm ứng

tạo phôi vô tính và nồng độ của chúng ảnh hưởng đến sự cân bằng chất ĐHST nội

sinh trong đó có cytokinin, giúp điều hòa sự tăng trưởng và phát sinh hình thái. Ở

NGBCC, tổ hợp NAA và BA ở nồng độ thích hợp đã cho kết quả tạo phôi tích cực -

phù hợp với nhận định chung về vai trò kết hợp của auxin và cytokinin đối với tạo

phôi như đã nêu trên.

3.1.1.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô

tính trực tiếp từ mô lá

Kết quả sau 60 ngày nuôi cấy (Bảng 3.3, Hình 3.5) cho thấy, nồng độ sucrose

50 g/L ở trường hợp chiếu sáng đã có ảnh hưởng tích cực nhất đến sự phát sinh phôi

vô tính (Hình 3.5C) so với các trường hợp nồng độ sucrose còn lại và so với trường

hợp để mẫu trong tối, tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu lần lượt là 98,89% và 35,95

phôi/mẫu. Khi nồng độ sucrose cao đã làm tăng khả năng giữ nước của môi trường,

tế bào nhận nước từ môi trường kém thuận lợi - mô khô hơn do vậy kích thích sinh

lý tế bào biến đổi mạnh, tạo thuận lợi cho quá trình phát sinh phôi. Khi nồng độ

sucrose ở môi trường nuôi cấy tăng cao 70 g/L làm tỷ lệ mẫu tạo phôi và số phôi/mẫu

giảm (tương ứng là 87,78% và 18,72 phôi/mẫu), do áp suất thẩm thấu tăng cao nên tế

bào bị ‘sốc’ thiếu nước, sinh lý tế bào bị ức chế, trao đổi chất giảm. Khi nồng độ

sucrose giảm còn 10 g/L thì quá trình tạo phôi giảm rõ rệt, phát sinh hình thái chậm

dù vẫn ở điều kiện sáng. Nghiệm thức có 50 g/L sucrose ở điều kiện tối không khác

biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức 10 g/L sucrose ở điều kiện sáng khi xét về

tỷ lệ % mẫu tạo phôi, nhưng số phôi/mẫu có khác biệt rõ. Như vậy, với các mức nồng

độ sucrose khác nhau trong điều kiện chiếu sáng khác nhau đã có ảnh hưởng khác

biệt lên hiệu quả phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mô lá NGBCC, ở điều kiện chiếu

sáng phát sinh phôi hiệu quả hơn trong điều kiện tối hoàn toàn, vì ở điều kiện chiếu

sáng có ảnh hưởng đến quang hợp của mẫu cấy.

Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo

phương thức dị dưỡng hoặc bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp

có khả năng quang hợp, mẫu cấy chủ yếu sử dụng dinh dưỡng từ môi trường nuôi

cấy. Vì vậy, việc bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy và bố trí mẫu cấy ở những

61

điều kiện chiếu sáng khác nhau có ý nghĩa rất lớn cho sự phát sinh hình thái, phát

sinh phôi. Đường đối với cơ thể thực vật là yếu tố không thể thiếu trong cung cấp

năng lượng và khung carbon cho sự phát triển của tế bào. Đường còn giúp điều hòa

áp suất thẩm thấu, bảo vệ tính toàn vẹn của màng tế bào, quyết định hình dạng và sự

phát triển của tế bào [12].

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện chiếu sáng đến sự tạo phôi vô

tính trực tiếp từ mô lá, ở môi trường SH, 60 NSC

Điều kiện

nuôi cấy

Nồng độ

sucrose (g/L)


phôi (%)

Số phôi/mẫu

Sáng 10 91,11c* 23,19c

30 94,44b 28,56b

50 98,89a 35,95a

70 87,78d 18,72d

Tối 10 78,89f 10,08g

30 82,22e 11,28f

50 90,00cd 15,93e

70 71,11g 9,72g

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở

mức p ≤ 0, 05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng

(x+0,5)1/2 khi xử lý thống kê.

Đã ghi nhận được công trình công bố đường ở nồng độ 50 g/L thúc đẩy khả

năng phát sinh phôi vô tính từ mô sẹo phôi hợp tử cây dược liệu quan trọng

Terminalia chebula [114]. Nồng độ đường 50 g/L là nồng độ tối ưu cho sự phát sinh

phôi vô tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [74]. Ở họ Ngũ gia bì, nhiều kết

quả nghiên cứu cho thấy đường được sử dụng như vừa là tác nhân tạo áp suất thẩm

thấu cao và chất dinh dưỡng đã tạo ảnh hưởng rất tích cực lên quá trình tạo phôi, ví

dụ [36] đã cải thiện được chất lượng và tần số tạo phôi Panax quinquefolius trực tiếp

qua kết hợp tiền xử lý (pretreatment) mẫu lá mầm với tác nhân đường (342,3 g/L, ở

4oC) với nuôi cấy mẫu sau đó trên môi trường cảm ứng tạo phôi có nồng độ đường

cao (70 g/L); ngoài ra, Kim và cộng sự (2010) cũng đã ghi nhận tần số tạo phôi đơn

Panax ginseng trực tiếp (ở 2 giống Yun-Poong và Chun-Poong) cao nhất khi mảnh

lá mầm phôi non được nuôi cấy trên môi trường MS có 70 g/L đường và tần số tạo

62

phôi đơn tăng cao khi xử lý gây co nguyên sinh (plasmolysis) mẫu bằng đường (0,1

– 0,5 – 1 M, trong 24 h) trước khi cấy mẫu vào môi trường [115].

Hình 3.5. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH, có đường và

điều kiện sáng, tối, 60 NSC

A,B,C,D. Phôi hình thành ở môi trường SH có sucrose 10, 30, 50 và 70 g/L, điều kiện

sáng. E,F,G,H. Phôi hình thành ở môi trường SH có sucrose 10, 30, 50 và 70 g/L,

điều kiện tối. Thanh ngang 10 mm.

3.1.1.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mô lá

Qua tối ưu hóa các yếu tố đã khảo sát, môi trường SH có 5 mg/L NAA và 0,25

mg/L BA, 50 g/L đường được sử dụng làm môi trường nuôi cấy để xác định nồng độ

thích hợp của nước dừa (%) cho sự cảm ứng tạo phôi vô tính từ mảnh lá nuôi ở điều

kiện chiếu sáng ở 4000 lux.

Kết quả cho thấy ở 60 NSC, nghiệm thức có tỷ lệ nước dừa 10% đã có ảnh

hưởng tích cực nhất so với các nồng độ còn lại, tất cả mẫu cấy đều tạo phôi, với 39,50

phôi/mẫu (Bảng 3.4; Hình 3.6), nghiệm thức có tỷ lệ nước dừa 5% và 10% không có

khác biệt thống kê về chỉ tiêu số mẫu tạo phôi nhưng có sự khác biệt về số phôi/mẫu.

Các mẫu cấy ở môi trường có tỷ lệ nước dừa cao 15%, 20% làm giảm khả năng tạo

phôi vô tính (tỷ lệ mẫu tạo phôi là 95,56%, 94,44%), số phôi/mẫu giảm rõ rệt ở

nghiệm thức có 20% nước dừa (29,78 phôi/mẫu). Ở nghiệm thức đối chứng không bổ

sung nước dừa và nghiệm thức có tỷ lệ nước dừa 15% không khác biệt về thống kê

về số phôi/mẫu nhưng khác biệt rõ về tỷ lệ mẫu tạo phôi. Như vậy, khi bổ sung nước

dừa với các tỷ lệ khác nhau đã có tác động rõ rệt đến kết quả tạo phôi vô tính.

63

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá,

ở môi trường SH, 60 NSC.

Tỷ lệ nước

dừa (%)


phôi (%)

Số phôi/mẫu

0 98,89b* 35,95c

5 100,00a 38,19b

10 100,00a 39,50a

15 95,56c 35,19c

20 94,44d 29,78d


mức p ≤ 0, 05 trong phép thử LSD. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng

(x+0,5)1/2 khi xử lý thống kê.

Theo Prades và cộng sự (2012) [116], trong nước dừa xanh có chứa đường,

vitamin, muối khoáng, acid amin và một số phytohormone quan trọng nhất là

cytokinin. Cũng theo các tác giả trên, IAA tham gia vào nhiều quá trình liên quan đến

tăng trưởng và phát triển của thực vật, sự di chuyển phân cực của auxin tạo lượng

auxin cực đại (auxin maximum)/gradient về nồng độ nhằm điều hòa nhiều quá trình

sinh lý dẫn đến sự phát sinh hình thái trong đó có phát sinh phôi vô tính. Trong nước

dừa cũng có nhiều loại cytokinin khác nhau như trans-zeatin, trans-zeatin riboside-

5’- monophosphate, kinetin riboside, kinetin, N6-isopentenyladenine,...- có tác dụng

trong phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa, tăng khả năng biến dưỡng,.. và như vậy

cũng kích thích tăng trưởng thực vật. Do đó, khi bổ sung nước dừa vào môi trường

với lượng phù hợp sẽ làm tăng khả năng tạo và phát triển phôi, chồi/cây. Khierallah

và Hussein (2013) đã sử dụng nước dừa trong nghiên cứu và kết luận nước dừa 20%

(v/v) rất thích hợp cho tạo phôi vô tính Phoenix dactylifera (date palm) [77]. Ở họ

Ngũ gia bì trong đó có loài NGBCC đã ghi nhận được ảnh hưởng tích cực của nước

dừa (10%) lên quá trình hình thành phôi từ mô sẹo/mô sẹo có khả năng sinh phôi sâm

Ngọc Linh - Panax vietnamensis [117].

64

Hình 3.6. Phôi vô tính phát sinh trực tiếp từ mảnh lá ở môi trường SH, có bổ sung

nước dừa, 60 NSC.

A,B,C,D. Mảnh lá tạo phôi ở môi trường SH có nước dừa 5%, 10%, 15%, 20%; E.

Đĩa cấy mảnh lá tạo phôi trên môi trường SH có 10% nước dừa. Thanh ngang 10 mm.

3.1.1.5. Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính

Trong quá trình nuôi cấy tái sinh, trước và sau giai đoạn trưởng thành hầu hết

các phôi tiếp tục sinh trưởng dẫn đến phát triển thân, lá mầm, rễ mầm, chồi/lá bình

thường (Hình 3.7A). Ngược lại, bên cạnh dạng phôi vô tính hình thái tiêu biểu cũng

đã ghi nhận được trường hợp phôi tái sinh (với số lượng không đáng kể) có hình dạng

bất thường như phôi dính nhau ở phần lá mầm/thân, không có rễ mầm, chồi không

phát triển (Hình 3.7B,C).

Hình 3.7. Phôi bình thường và một số dạng bất thường của phôi vô tính

A. Hình thái phôi bình thường; B. Hình thái phôi có lá mầm dị dạng, rễ mầm phát

triển bình thường; C. Các phôi dính nhau với lá mầm dị dạng, có chung phần thân và

không có rễ mầm. Thanh ngang 5 mm.

Sự phân chia tế bào ở vùng mô phân sinh xảy ra trước khi có sự biệt hóa của

cực chồi và lá mầm, nếu sự phân bào vẫn tiếp tục sau khi hình thành sơ khởi lá mầm,

65

dẫn đến hình thành phôi bất thường có hai hay nhiều phôi dính lại với nhau (Hình

3.7C). Miekle và cộng sự, (1995) cho rằng, các lá mầm hợp nhất như vậy cũng là đặc

điểm của phôi soma dạng sừng thường được phục hồi từ nuôi cấy tế bào, có thể là

auxin ngoại sinh hiện diện trong môi trường có thể đủ làm nhiễu loạn sự vận chuyển

bình thường của auxin trong phôi ở giai đoạn hình cầu, làm cho sự phát triển lá mầm

bình thường bị ngăn cản [108].

Phôi phát triển với 2 lá thật nhỏ ban đầu (Hình 3.8A) được nuôi cấy trên môi

trường MS và ½MS [54] không bổ sung chất ĐHST để so sánh khả năng tạo cây hoàn

chỉnh. Kết quả cho thấy, cây con ở hai môi trường này phát triển khá khác biệt ở 90

NSC. Chiều cao cây, số lá, số rễ và chiều dài rễ trung bình của cây ở môi trường

½MS, MS lần lượt là 2,63 cm; 5,2; 7,3; 9,6 cm; là 2,58 cm; 4,9; 6,5 và 6,9 cm, theo

thứ tự (không trình bày bảng số liệu). Như vậy, môi trường ½MS là thích hợp cho

việc tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính (Hình 3.8C). Điểm đặc biệt là các lá thật

hình thành ban đầu ở cây con đều là các lá đơn, sau đó mới tạo các lá kép có thùy (lá

đơn) đặc trưng (Hình 3.8B,C).

Hình 3.8. Tạo cây con từ phôi vô tính trên môi trường MS, ½MS không có chất

ĐHST.

A. Vật liệu phôi dùng thí nghiệm tạo cây con; B,C. Cây con từ phôi nuôi cấy trên

môi trường MS, ½MS.

Điểm đặc biệt ở NGBCC là phôi có thể tạo chồi khá thuận lợi trên môi trường

không bổ sung chất ĐHST; theo chúng tôi, có thể do phôi không ở trạng thái ngủ/hưu

miên (dormancy) như ở một số trường hợp khác như phôi các dòng Panax ginseng

đột biến [41] và dòng lai khác loài giữa Panax ginseng và Panax quinquefolius [118]

- đều cần được nuôi cấy trên môi trường có GA3 (5 mg/L); và cũng cần được nuôi

trên môi trường có bổ sung BA (1 mg/L), NAA (0,2 mg/L) đối với Coriandrum

sativum [119]. Qua thử nghiệm nuôi cấy ban đầu 200 phôi, ghi nhận được số phôi tạo

chồi (sau ~ 3 tháng nuôi) là 196 (tỷ lệ 98%). Theo Sliwinska và cộng sự (2008), môi

66

trường ½MS không bổ sung chất ĐHST là thích hợp cho sự tạo cây từ phôi chỉ trong

một lần nuôi cấy đối với Đinh lăng Polyscias filicifolia [54].

3.1.1.6. Trồng cây con ở chậu đất

Hình 3.9. Trồng cây từ phôi vô tính ra chậu đất ở vườn ươm

A. Bình cây chuẩn bị đưa ra trồng ở vườn ươm, ở 90 NSC; B,C. Cây từ phôi ở chậu

đất vườn ươm sau 3 - 6 tháng trồng. D. Cây sau 12 tháng trồng.

Các cây con (nuôi trong bình tam giác chứa môi trường ½MS) (Hình 3.9A)

được đem trồng ra chậu chậu đất, kết quả cho thấy các lá mầm dần thoái hóa, cây có

tỷ lệ sống rất cao (≥ 95%) tính đến thời điểm 3 tuần sau trồng và cây có sinh

trưởng/kiểu hình bình thường trong điều kiện vườn ươm; số lá chét ban đầu thường

thấp hơn so với cây mẹ, tăng dần ở thời gian sau đó (Hình 3.9B,C).

3.1.2. Tạo phôi vô tính gián tiếp


Tạo mô sẹo

Hình 3.10. Ảnh hưởng của cách cấy mảnh lá đến hiệu quả tạo mô sẹo.

A. Cấy mặt trên mảnh lá tiếp xúc với môi trường (a,c), cấy mặt dưới mảnh lá tiếp xúc

với môi trường (b); B. Mảnh lá nuôi cấy trên môi trường SH không có 2,4-D.

Trước khi bố trí thí nghiệm tạo mô sẹo, tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của

02 cách cấy mảnh lá (trên môi trường SH có 2 mg/L 2,4-D) đến hiệu quả tạo mô sẹo

đã được thực hiện; một là, cấy mặt trên mảnh lá (có màu xanh đậm, sáng bóng) tiếp

67

xúc với môi trường; hai là, cấy mặt dưới mảnh lá (màu xanh nhạt, mờ) trên mặt môi

trường.

Kết quả cho thấy cách cấy thứ nhất cho kết quả tạo nhiều mô sẹo hơn ở mép

cắt (Hình 3.10Aa,c) so với cách cấy thứ hai (Hình 3.10Ab), có thể do mặt trên lá tiếp

xúc với môi trường nên sự hấp thu chất dinh dưỡng ở môi trường tốt hơn, đồng thời

mặt dưới lá có nhiều khí khổng, sự trao đổi khí thuận lợi hơn. Không ghi nhận sự

hình thành mô sẹo trường hợp nuôi cấy mảnh lá trên môi trường không bổ sung 2,4-

D (Hình 3.10B). Do vậy, cách đặt mẫu mặt trên lá tiếp xúc với môi trường được sử

dụng cho nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.11. Tạo mô sẹo từ mảnh lá (10 x 10 mm) nuôi cấy trên môi trường SH.

A,B,C. Mảnh lá tạo mô sẹo ở môi trường có 2,4-D 1, 2, 3 mg/L, 20 NSC; D,E,F.

Mảnh lá tạo mô sẹo (và rễ) ở môi trường có 2,4-D 1, 2, 3 mg/L, 40 NSC; G,H,I. Cụm

mô sẹo (sau bỏ rễ, cấy chuyền) trên môi trường có 2,4-D 1, 2, 3 mg/L, 60 NSC (thanh

ngang 10 mm).

Đã ghi nhận nhiều công bố kết quả nghiên cứu như tạo mô sẹo Coffea arabica

[120], tạo phôi Coffea arabica và Coffea canephora [121], và kể cả tạo chồi Petunia

hybrida [122] và Sinningia speciosa [123] từ mảnh lá sử dụng thao tác cấy mẫu theo

cách này. Ngược lại, cấy đặt mặt dưới mảnh lá Malus sieversii tiếp xúc với môi trường

lại cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh chồi tốt hơn [124]. Như vậy, cách cấy phụ thuộc

vào loài thực vật nghiên cứu và ở NGBCC, cấy mặt trên mảnh lá tiếp xúc với môi

68

trường đã tạo ảnh hưởng tích cực đến quá trình tạo mô sẹo và nhìn chung phù hợp

với các kết quả công bố chung như đã nêu trên.

Kết quả thí nghiệm tạo mô sẹo cho thấy, ở 20 ngày sau cấy, mô cấy đã tăng

kích thước, mô sẹo hình thành ở xung quanh mép cắt của tất cả các mẫu cấy mảnh lá

trên môi trường có bổ sung 2,4-D (tỷ lệ 100%); hiệu quả cao nhất ở 3 mg/L 2,4-D, ít

nhất ở nghiệm thức có 1 mg/L 2,4-D (Hình 3.11A,B,C). Ngày thứ 40 sau nuôi cấy,

nhận thấy các mẫu cấy hình thành khá nhiều rễ ngắn có nhiều lông hút, đầu rễ tròn,

nhiều nhất ở 1 mg/L 2,4-D (Hình 3.11D,E,F). Mẫu cấy sau khi cắt bỏ rễ, cấy chuyền

vào môi trường tạo mô sẹo trong 20 ngày tiếp theo, kết quả cho thấy mô sẹo hình

thành trên khắp bề mặt của mảnh lá, hình thành nhiều ở các mẫu cấy trên môi trường

có 2,4-D ở nồng độ 2 và 3 mg/L), mô sẹo phát triển kém ở 1 mg/L 2,4-D. Các mẫu

cấy ở 2 mg/L 2,4-D, ghi nhận có sự hình thành một số cụm mô hơi cứng, màu hơi

vàng/trắng tương tự mô sẹo có KNSP, (Hình 3.12H); mô sẹo xốp hơn ở 3 mg/L 2,4-

D (Hình 3.12I). Như vậy, việc cắt bỏ rễ đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành

mô sẹo.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có KNSP, ở môi trường

SH, 30NSC.

2,4-D

(mg/L)

Tỷ lệ (%) mẫu tạo

mô sẹo có KNSP

Số cụm mô sẹo có

KNSP/mẫu

1 100 2,20b*

2 100 3,43a

3 100 1,87c

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa

ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Theo tài liệu, đối với cây một và hai lá mầm, 2,4-D có tác dụng rất hiệu quả

đến sự hình thành mô sẹo từ nhiều loại vật liệu nuôi cấy khác nhau như mảnh lá/lá

mầm, đoạn thân/trụ mầm/rễ, phôi non,… ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau

[125][126]. Tương tự, đối với một số loài thuộc họ Ngũ gia bì [127], mô sẹo hình

thành có nhiều dạng khác nhau như xốp/cứng và màu sắc khác nhau như trắng

đục/trắng trong, hơi vàng/vàng. Ở NGBCC khoảng dao động nồng độ 2,4-D để tạo

mô sẹo, nhận được với các dạng mô sẹo và màu sắc khác nhau phù hợp với kết quả

nghiên cứu chung ở lĩnh vực này.

69

Sau 30 ngày cấy các mảnh mô sẹo để tạo mô sẹo có KNSP, kết quả cho thấy

có sự hình thành các cụm mô sẹo hơi cứng, màu vàng sáng/hơi đục hình thành trên

bề mặt cụm mô sẹo nuôi cấy, đây là các cụm mô sẹo có KNSP, số lượng cụm mô sẹo

hình thành khác nhau tùy thuộc nồng độ 2,4-D nhiều nhất ở 2 mg/L 2,4-D (3,43), thấp

nhất ở 3 mg/L 2,4-D (1,87) (Bảng 3.5, Hình 3.12A,B,C).

Hình 3.12. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự hình thành mô sẹo có KNSP, ở môi trường

SH, 30 NSC.

A,B,C. Cụm mô sẹo có KNSP (vị trí mũi tên) hình thành trên môi trường có 2,4-D

1; 2; 3 mg/L (thanh ngang 10 mm)

Trong nghiên cứu tạo/duy trì/phát triển sinh khối mô sẹo có khả năng sinh phôi

ở nhiều loài thực vật thì auxin ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với cytokinin là yếu tố

mang tính quyết định, và loại mô có khả năng tái sinh này có vai trò rất quan trọng

đối với nghiên cứu tái sinh cây theo con đường tạo phôi vô tính (somatic

embryogenesis) [68][128][129], kể cả theo con đường tạo chồi. Mô sẹo có KNSP có

thể hình thành ngay ở lần nuôi cấy đầu tiên hoặc/và ở một số lần cấy chuyền nuôi cấy

tiếp theo. Theo Von Arnold và cộng sự (2002), sự khác biệt giữa mô sẹo có KNSP và

mô sẹo không có KNSP dễ ghi nhận, dựa trên hình thái, màu sắc; mô sẹo có KNSP

là thể mô mang các cụm tế bào có khả năng sinh tiền phôi (proembryogenic masses -

PEMs) [68]. Mô sẹo có KNSP (embryogenic) là thể mô cứng, trắng hơi vàng, ở dạng

cụm/hạt và phát triển chậm – khác với mô sẹo không có KNSP thường có cấu trúc

xốp, phát triển nhanh, màu trắng/xám [130]. Theo Gaoyin và cộng sự (2020), ở mô

sẹo có khả năng sinh phôi có sự tích lũy lượng IAA nội sinh, đường hòa tan, tinh bột

và protein cao – cơ sở quan trọng về năng lượng cho quá trình tạo phôi so với mô sẹo

không có khả năng sinh phôi [12]. Như đã trình bày, ở NGBCC, sự phát sinh mô sẹo

có KNSP được ghi nhận sau giai đoạn cấy chuyền mô sẹo có thể do ở lần nuôi cấy

đầu tiên sự hiện diện của rễ tái sinh đã gây hạn chế sự hình thành loại mô này. Từ các

70

kết quả trên đây, mảnh lá được nuôi cấy trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D để thu mô

sẹo có KNSP phục vụ nghiên cứu tái sinh phôi ở giai đoạn tiếp theo.

Tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x10 mm) trên môi trường đặc

Từ kết quả thí nghiệm trên thu được các cụm mô sẹo có KNSP (Hình 3.13A)

sử dụng làm vật liệu tạo phôi, được nuôi cấy trên môi trường SH có 0,25 mg/L BA

kết hợp với NAA (1, 2, 3, 4, 5 mg/L). Quan sát mẫu sau 30 ngày cấy, kết quả cho

thấy ở tất cả các cụm mô sẹo có KNSP trên môi trường nuôi cấy SH đều có hiện

tượng tái sinh phôi (tỷ lệ 100%), số phôi hình thành nhiều nhất ở môi trường có 2 –

3mg/L NAA tương ứng số phôi tái sinh/cụm là 15,5; 15,8 ít nhất ở môi trường có

NAA 1 mg/L với số phôi/cụm mô sẹo là 7,2. Ở nghiệm thức có 2, 3 mg/L NAA không

có sự khác biệt về thống kê cả hai chỉ tiêu theo dõi, nhưng khác biệt so với các nghiệm

thức còn lại (Bảng 3.6, Hình 3.13).

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x 10

mm), ở môi trường SH, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA

(mg/L)

Số cụm mô

sẹo có KNSP

dùng nuôi cấy

Số phôi

tái

sinh/cụm

Đánh giá định tính về phôi tái sinh

1 0,25 30 7,20d* Phôi dài, rễ phôi ngắn

2 0,25 30 15,50a Phôi dài, rễ phôi ngắn

3 0,25 30 15,80a Phôi ngắn, rễ phôi ngắn có lông hút

4 0,25 30 10,80b Phôi ngắn; một số phôi có rễ dài,

nhiều lông hút

5 0,25 30 9,50c Phôi rất ngắn, nhiều rễ có lông hút

trên cụm phôi; cụm có nhiều mô

sẹo


p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Tương tự trường hợp tạo mô sẹo có KNSP, cũng sử dụng auxin (2,4-D/NAA)

kết hợp với cytokinin (BA/kinetin) trong tạo phôi vì cytokinin thường giúp kích thích

phôi hình thành và phát triển; trong một số trường hợp, sự tạo phôi và sự trưởng thành

của phôi được ghi nhận trong điều kiện sử dụng cùng nồng độ chất điều hòa sinh

trưởng [131]. Tuy nhiên, ở đa số trường hợp tạo phôi, mô sẹo có khả năng sinh phôi

71

cần được nuôi cấy trên môi trường có nồng độ auxin giảm hoặc không bổ sung auxin

[132]. Theo hướng này, auxin NAA (có hoạt tính sinh lý thấp hơn 2,4-D) thường

được sử dụng nhằm kích thích tái sinh phôi và kích thích phát triển phôi tiếp tục sau

khi đã hình thành và ở nghiên cứu này, auxin NAA được lựa chọn sử dụng phục vụ

nghiên cứu tái sinh phôi. Tương tự như ở nghiên cứu của Gaoyin và cộng sự (2020)

[12]. Theo Yu và cộng sự (2017) [99], tuy ở điều kiện nuôi cấy có nồng độ auxin cao

nhưng ở khối mô sẹo luôn có sự phân bố không đồng đều của auxin theo không gian

(spatial) do sự di chuyển phân cực của auxin có khác nhau ở các vị trí khác nhau, do

vậy có thể xảy ra hiện tượng biệt hóa từng phần/toàn phần khi ở điều kiện thuận lợi

(ví dụ chuyển sang nuôi cấy sử dụng nồng độ auxin thấp, hoặc dùng loại auxin nuôi

cấy phù hợp) – các cấu trúc như phôi/rễ bất định có thể được tái sinh.

Hình 3.13. Tái sinh phôi từ mô sẹo có khả năng sinh phôi trên môi trường đặc SH,

30 NSC và hình thái giải phẫu phôi tái sinh từ mô sẹo.

A. Vật liệu mô sẹo có KNSP (vị trí mũi tên); B,C,D,E,F. Phôi tái sinh trên môi trường

có NAA 1; 2; 3; 4; 5 mg/L; G,H. Phôi bước đầu hình thành (vị trí mũi tên) từ cụm

mô sẹo có KNSP và hình thái giải phẫu phôi tương ứng (vạch chéo đen chỉ vị trí cắt

thu lát mỏng tế bào phục vụ nhuộm màu kép); I. Cụm mô sẹo xốp không có KNSP.

72

Đến nay đã ghi nhận nhiều nghiên cứu tạo phôi hiệu quả khi kết hợp 2,4-D và

BA/kinetin, như trường hợp tạo phôi Passiflora mollissima từ mô sẹo lá mầm trên

môi trường MS có 4,5 μM 2,4-D và 4,5 μM BA [133]. Với Psoralea corylifolia, sự

kết hợp NAA và BA rất quan trọng đối với tạo mô sẹo có KNSP (từ vật liệu trụ dưới

lá mầm) với NAA (2,7 - 10,8 µM), BA 2,2 µM và tái sinh phôi từ mô sẹo với NAA

1,4 µM, BA 2,2 µM [134]. Sự kết hợp của NAA (0,5 - 5 mg/L) với BA 0,5 mg/L luôn

cần thiết đối với tạo phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá/lá mầm Solanum nigrum [135].

Tương tự, tổ hợp NAA và BA cũng rất thích hợp để tạo phôi từ mô sẹo lá Citrullus

colocynthis [136], mô sẹo phôi hạt non Tapiscia sinensis [94], mô sẹo phôi hợp tử

non Picea abies và P. omorika [137]. Kết quả thí nghiệm cho thấy, lần nữa NAA đã

chứng tỏ rất thích hợp cho tái sinh phôi gián tiếp từ mô sẹo với nồng độ 2 mg/L và

cytokinin BA cũng rất cần thiết cho quá trình tái sinh phôi với nồng độ sử dụng là

0,25 mg/L – tương tự như ở nghiên cứu tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá.


Khảo sát hình thái giải phẫu phôi tái sinh từ cụm mô sẹo có khả năng sinh phôi

(Hình 3.13G) bằng phương pháp nhuộm hai màu và quan sát mẫu vật dưới kính hiển

vi đã được thực hiện. Kết quả cho thấy phôi cầu hình thành trên bề mặt khối mô sẹo

với lớp biểu mô đặc trưng (Hình 3.13H). Qua khảo sát tế bào học, Sakr và Sayed

(2018) kết luận phôi Oryza sativa có nguồn gốc từ một số tế bào phôi ở phần ngoài

của các cụm mô sẹo phôi hợp tử đang phát triển sinh khối trên môi trường MS có (2

- 2,5 mg/L) 2,4-D [138]. Ở trường hợp tạo phôi Carica papaya từ mô sẹo lá mầm

phôi hạt, phôi tái sinh bắt nguồn từ các cấu trúc dạng cầu có có khả năng sinh tiền

phôi (pre-embryogenic globular structures) hình thành từ các tế bào vùng bề mặt và

dưới bề mặt của cụm mô sẹo [139]. Tương tự, các tiền phôi Tapiscia sinensis hình

thành từ lớp tế bào bề mặt (surface layer) và dưới bề mặt hoặc bên trong (internally)

của cụm mô sẹo có KNSP [94]. Như vậy, theo chúng tôi, phôi NGBCC tạo từ mô sẹo

có KNSP cũng bắt nguồn từ hoạt động phân chia của loại mô tế bào đặc trưng tương

tự như ở kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên và cơ sở sinh lý của quá trình

tạo phôi là do sự di chuyển phân cực của auxin, làm thay đổi lập trình di truyền của

tế bào mô sẹo dẫn đến sự hình thành tế bào mang tính toàn thế - có khả năng tái sinh

cơ quan [15].

73

Hình 3.14. Các dạng phát triển của phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá, cây con hoàn

chỉnh từ phôi.

A. Phôi cầu đơn; B. Phôi dạng tim; C. Giai đoạn đầu của phôi dạng thủy lôi; D,E.

Phôi thủy lôi đơn và cụm 2 phôi thủy lôi phát triển; F,G,H. Phôi có lá mầm và rễ

mầm phát triển đến giai đoạn trưởng thành; I. Cây con hoàn chỉnh từ phôi với lá mầm,

lá thật (đơn và kép), rễ cọc điển hình và nhiều rễ phụ

Tương tự như ở quá trình nghiên cứu tạo phôi trực tiếp từ mảnh lá, trong quá

trình tái sinh phôi từ mô sẹo, cũng đã ghi nhận được đầy đủ các dạng phát triển khác

nhau của phôi như phôi dạng cầu (Hình 3.14A), dạng tim (Hình 3.14B), dạng thuỷ

lôi (Hình 3.14C,D,E), dạng bước đầu có lá mầm, rễ mầm (Hình 3.14F,G) và dạng

phôi trưởng thành (Hình 3.14H). Phôi trưởng thành phát triển bình thường thành cây

con qua nuôi cấy tiếp tục trên môi trường ½MS không bổ sung chất điều hòa sinh

trưởng (Hình 3.14I).

Tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (10 x10 mm) trong môi trường lỏng

Từ vật liệu là các cụm mô sẹo có KNSP (Hình 3.15A), nuôi cấy tái sinh phôi

trong môi trường lỏng lắc cũng đã được thực hiện dùng môi trường SH có 2 mg/L

NAA và 0,25 mg/L BA (kế thừa từ thí nghiệm trên). Kết quả cho thấy, phôi hình

thành dần theo thời gian ở 7, 10, 14 và 30 NSC (Hình 3.15B,C,D,E,F,G).

74

Hình 3.15. Tạo phôi từ mô sẹo có KNSP bằng phương pháp nuôi lỏng lắc, hình thái

cụm tế bào phân chia, cụm mô tạo phôi.

A. Các cụm mô sẹo có KNSP làm vật liệu tạo phôi (vị trí mũi tên); B,C,D. Bình nuôi

các cụm mô sẹo có KNSP giai đoạn mới cấy, 7 NSC, 30 NSC; E,F,G. Cận cảnh tạo

phôi từ cụm mô sẹo có KNSP ở 10, 14, 30 NSC; H. Hình thái cụm tế bào phân chia

theo hướng tạo phôi (vòng tròn (a) chỉ vị trí tế bào phân chia không cân xứng và vòng

tròn (b) chỉ vị trí cụm tế bào nhỏ đẳng kính); I. Phôi dạng cầu hình thành ở giai đoạn

đầu ở cụm mô có KNSP (vị trí mũi tên); J. Phôi dạng cầu phát triển (các hình H,I,J

được chụp dưới kính hiển vi với độ phóng đại 50X, 20X, 20X, theo thứ tự)

Quan sát hình thái cụm tế bào/cụm mô (có nguồn gốc mô sẹo có khả năng sinh

phôi) nuôi lỏng lắc

Trong quá trình theo dõi, quan sát mô sẹo nuôi lỏng lắc, ghi nhận được hai

hiện tượng xảy ra có thể liên quan đến sự tạo phôi, một là, sự phân chia tế bào không

đối xứng (asymmetric division/ unequal division pattern) dẫn đến sự hình thành hai

tế bào không cùng kích cỡ (Hình 3.15Ha) – tương tự như ở trường hợp hình thành

phôi hợp tử và nhiều trường hợp hình thành phôi vô tính [68]; hai là, sự hình thành

cụm tế bào tròn nhỏ, đẳng kính (isometric), có vách dày (Hình 3.15Hb). Grzebelus

và cộng sự (2012) đã ghi nhận được hiện tượng phân chia tế bào không đối xứng ở

75

nuôi cấy tế bào trần có nguồn gốc từ mô lá, trụ dưới lá mầm Daucus carota dẫn đến

sự hình thành cụm đa bào (multi-cell colonies) có kết cấu chặt (tightly packed), tế

bào dạng tròn, tế bào chất đậm đặc ở 5 – 10 NSC, với kích cỡ nhỏ hơn tế bào ban

đầu; sau đó các cụm này phát triển thành cụm tiền phôi (proembryonic mass), tạo

phôi cầu ở 21 – 28 NSC và phôi có lá mầm ở 30 – 60 NSC [140]. Iantcheva và cộng

sự (2004) đã nghiên cứu chi tiết sự phân chia không đối xứng của quần thể tế bào đơn

(100 - 200 µm) Medicago falcata đối chứng và chuyển gen (gusA) và kết luận hầu

hết các tế bào có sự phân chia không đối xứng (~ 80%, 50 – 75% tế bào phân chia

không đối xứng ở đối chứng và chuyển gen, theo thứ tự, ở ngày thứ 15 sau cấy) đều

dẫn đến tạo phôi cầu ở giai đoạn sau cấy 20 ngày, tạo phôi trưởng thành và tạo cây

con ở ngày thứ 15 – 20 sau cấy sau khi được cấy chuyển sang môi trường thích hợp

[67]. Trong quần thể tế bào huyền phù Coffea arabica cv. Catimor, các tế bào dạng

tròn, kích thước nhỏ, vách dày, tế bào chất đậm đặc có phân sự chia tế bào theo kiểu

không đối xứng cũng dẫn đến tạo phôi [109].

Theo Friml và cộng sự (2003), ở Arabidopsis thaliana, sau sự phân chia lần

thứ nhất không đối xứng thành hai tế bào gốc (basal) to và tế bào ngọn (apical) nhỏ,

auxin di chuyển phân cực từ tế bào gốc đến tế bào ngọn - kích hoạt chương trình di

truyền chuyển dịch tế bào ngọn sang quá trình tạo phôi [141].

Hình 3.16. So sánh kết quả tái sinh phôi ở môi trường SH đặc và lỏng, 30 NSC.

A,B. Cụm phôi tái sinh trên môi trường đặc, lỏng (thanh ngang 10 mm).

Tuy không bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả phương pháp nuôi cấy tái sinh

nhưng bước đầu so sánh kết quả tái sinh phôi ở môi trường SH có 2 mg/L NAA và

0,25 mg/L BA đã được thực hiện. Kết quả cho thấy phôi tái sinh từ mô sẹo nuôi lỏng

lắc đạt số lượng gần gấp đôi (21,4) số phôi tái sinh trên môi trường đặc (12,6) (Hình

76

3.16A,B), có thể do sự hấp thu nước, chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng của

mô tế bào trong môi trường lỏng tốt hơn [142]. Kết quả tái sinh phôi tích cực trong

môi trường lỏng tạo điều kiện cho thí nghiệm nhân phôi quy mô lớn phục vụ nhân

giống, nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp,...


Tạo mô sẹo

Tương tự trường hợp tạo mô sẹo từ mảnh lá (10 x 10 mm), các mảnh lá kích thước

nhỏ (3 x 10 mm) cũng được nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường SH có 2,4-D với

các nồng độ khác nhau (0, 1, 2, 3 mg/L).

Hình 3.17. Mô sẹo hình thành từ mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH có 2,4-D,

20 – 30 NSC.

A,B,C,D. Môi trường ĐC, có 2 mg/L 2,4-D ở 20 NSC, có 1 mg/L 2,4-D 30 NSC, có

2 mg/L 2,4-D 30 NSC; E. Cận cảnh sự hình thành các cụm mô sẹo nhỏ có KNSP/phôi

cầu (ô vuông được phóng to thành hình E); F. Môi trường có 3 mg/L 2,4-D. Cụm mô

sẹo nhỏ có KNSP, MSSP (mô sẹo sinh phôi - mũi tên đen); vị trí phôi cầu (mũi tên

trắng).

Sau 20 ngày nuôi cấy, mô sẹo hình thành nhiều ở vị trí vết cắt (Hình 3.17B),

đặc biệt không có hiện tượng tái sinh rễ như ở nuôi cấy mảnh lá. Ở ngày 30 sau nuôi

77

cấy, mô sẹo hình thành trên khắp bề mặt mẫu cấy mảnh lá; không ghi nhận có sự hình

thành mô sẹo ở nghiệm thức đối chứng (Hình 3.17A). Qua quan sát dưới kính hiển vi

nhận thấy trên bề mặt mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức có 2,4-D đều có các cụm mô

nhỏ có bề mặt khô, màu hơi trắng/vàng, xuất hiện rải rác trên bề mặt mô sẹo, đây là

các cụm mô sẹo nhỏ có KNSP (không thu thập số liệu). Điểm đặc biệt các mẫu cấy ở

2 mg/L 2,4-D, ngoài sự hình thành các cụm mô sẹo nhỏ nêu trên còn ghi nhận có sự

hình thành một số phôi dạng cầu có màu hơi xanh ở một số mẫu (Hình 3.17D,E). Do

vậy, 2 mg/L 2,4-D được sử dụng để tạo vật liệu mô sẹo phục vụ nghiên cứu tạo phôi.

Tạo phôi

Mô sẹo hình thành từ mảnh lá (3 x 10 mm) được nuôi cấy tái sinh trên môi

trường SH có sự kết hợp của NAA với các nồng độ khác nhau và 0,25 mg/L BA. Kết

quả thu được, ở ngày thứ 30 sau nuôi cấy, sự tái sinh phôi rất hiệu quả, phôi xuất hiện

trên tất cả các mẫu cấy mô sẹo, số lượng phôi nhiều ở môi trường có NAA từ 2 - 5

mg/L (Bảng 3.7) (Hình 3.18B,C,D,E,F).

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của NAA và BA đến tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm),

ở môi trường SH, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA

(mg/L)

Số mẫu mô

sẹo tạo phôi

Số phôi/mẫu

mô sẹo

Đặc điểm hình thái về phôi tái

sinh

1 0,25 30 4,47d* Phôi chưa có rễ, mô sẹo kém

phát triển

2 0,25 30 15,10a Một số phôi có rễ, phôi dài,

nhiều phôi nhỏ đang trong quá

trình phát sinh/phát triển

3 0,25 30 14,84a Một số phôi có rễ, phôi dài, lá

mầm to; mô sẹo phát triển to

4 0,25 30 9,37b Một số phôi có rễ, lá mầm to;

mô sẹo phát triển mạnh

5 0,25 30 7,80c Một số phôi có rễ, lá mầm to;

mô sẹo phát triển mạnh

* Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa


78

Tương tự trường hợp nuôi cấy tạo phôi từ mô sẹo mảnh lá, ở thí nghiệm này,

cũng đã ghi nhận được đầy đủ các dạng phát triển khác nhau của phôi như dạng cầu,

dạng tim, dạng thủy lôi, dạng có lá mầm và rễ mầm (Hình 3.18G,H).

Hình 3.18. Tạo phôi gián tiếp từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) trên môi trường SH,

30 NSC.

A. Mẫu mô sẹo làm vật liệu nuôi cấy; B,C,D,E,F. Phôi tái sinh trên môi trường SH

có NAA 1, 2, 3, 4, 5 mg/L (thanh ngang 5 mm); G. Sự hình thành phôi dạng cầu (C),

dạng có lá mầm và rễ mầm (vị trí mũi tên); H. Phôi dạng tim (T) và dạng thủy lôi

(TL) (vị trí mũi tên).

Phôi tái sinh tạo cây con hoàn chỉnh qua nuôi cấy trên môi trường đặc ½MS

không bổ sung chất ĐHST (Hình 3.19F).

Trong nghiên cứu nuôi cấy mô, vật liệu LMTB cũng được sử dụng khá phổ

biến với ưu điểm là khả năng phát sinh hình thái cao hơn vì có sự tương tác tốt giữa

tế bào với môi trường so với các mẫu cấy có kích thước to/dày [143].

Sự phát triển tiếp tục của phôi tái sinh cũng đã được theo dõi đến giai đoạn

sau nuôi cấy 60 ngày (không thu thập số liệu) (Hình 3.19). Ở cuối giai đoạn này, nhận

thấy phôi phủ kín bề mặt khối mô sẹo ở môi trường có NAA 2 mg/L (Hình 3.19B).

Nhìn chung, các cụm phôi hình thành đều có màu xanh rõ, ở môi trường có NAA (3

- 5 mg/L) phôi có rễ mang nhiều lông hút (Hình 3.19C,D,E).

79

Hình 3.19. Phôi tái sinh từ mô sẹo mảnh lá (3 x 10 mm) ở môi trường SH, 60 NSC.

A,B,C,D,E. Phôi phát triển trên môi trường SH có 0,25 mg/L BA và NAA (1, 2, 3,

4, 5 mg/L), thanh ngang 6 mm; F. Cây con từ phôi qua nuôi cấy ở môi trường ½MS,

20 NSC.

Auxin (hoặc kết hợp với cytokinin) thường được sử dụng để tạo mô sẹo/phôi

từ LMTB. Vu Thi Hien và cộng sự (2016) đã sử dụng 2,4-D 1 mg/L kết hợp với BA

0,5 mg/L hoặc TDZ 0,1 mg/L để tạo mô sẹo sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) từ

nuôi cấy lát mỏng tế bào cắt ngang (t-TCL) lá cây in vitro trên môi trường MS [144];

tương tự, mô sẹo rễ cây Panax vietnamensis in vitro 3 tháng tuổi cũng đã được tạo

thành công qua nuôi cấy t-TCL (dày ~ 1 mm) trên môi trường MS có 2,4-D 1 mg/L

kết hợp với NAA 0,5 mg/L hoặc/và kết hợp với kinetin 0,2 mg/L [74]. Trong nghiên

cứu tạo phôi từ mô sẹo t-TCL chồi in vitro 02 giống Blackberry (Rubus sanctus và

Rubus hirtus), Sabooni và Shekafandeh, (2017) đã sử dụng NAA 10,84 μM và BA

8,88 μM [145]. Scherwinski-Pereira và cộng sự (2010) đã sử dụng môi trường MS có

bổ sung 0 – 450 µM Picloram, 2,4-D, 3% sucrose, 500 mg/L glutamine, 0,6 µM NAA

và 12,30 µM 2iP để duy trì mô sẹo có KNSP cây cọ dầu Elaeis guineensis [146].

Từ kết quả của các thí nghiệm tạo phôi gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá NGBCC

ngoài vật liệu mảnh lá (10 x10 mm), thì mảnh lá kích thước nhỏ (3 x 10 mm) đã

chứng tỏ là vật liệu tốt đối với nghiên cứu tạo mô sẹo có khả năng phát sinh hình thái

phôi/tái sinh phôi qua các bước phát triển khác nhau.

80

3.2. Nhân phôi vô tính

3.2.1. Nhân phôi trên môi trường đặc

Ở 30 NSC, kết quả (Bảng 3.8, Hình 3.20) cho thấy số phôi/cụm cao ở các

nghiệm thức có 2; 3; 4; và 5 mg/L NAA, lần lượt là 20,8; 22,6; 25,3 và 26,8; nhiều ở

nghiệm thức 4 mg/L và 5 mg/L NAA và ít nhất ở nghiệm thức 1 mg/L NAA (16,20).

Ở các nồng độ khác nhau của NAA khi kết hợp với 0,25 mg/L BA kết quả tạo phôi

có khác biệt về thống kê. Kết quả này, một lần nữa chứng minh NAA, không chỉ có

tác động hiệu quả đến tạo phôi trực tiếp từ mô lá mà còn có ảnh hưởng tích cực đến

tạo phôi thứ cấp từ phôi sơ cấp. Nhận thấy kích thước phôi tăng với lá mầm to, số rễ

và kích thước rễ tăng khi nồng độ NAA tăng. Ở nghiệm thức đối chứng (0 mg/L

NAA), phôi phát triển chiều cao, không ghi nhận tạo phôi thứ cấp (Hình 3.20C).

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp, ở môi trường đặc SH,

30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA

(mg/L)

Số

phôi/cụm

Hệ số

nhân

Đặc điểm hình thái cụm phôi/phôi

0 0,25 3,00f* 1,00f Phôi phát triển chiều cao, không ghi

nhận hiện tượng tạo phôi thứ cấp; lá

mầm phôi to, rễ ít, ngắn

1 0,25 16,20e 5,40e Kích thước cụm phôi nhỏ; thân phôi

thấp, lá mầm phôi nhỏ, rễ ít, nhỏ và

ngắn

2 0,25 20,80d 6,93d Kích thước cụm phôi to; thân phôi

thấp, lá mầm phôi trung bình, rễ ít,

nhỏ và ngắn

3 0,25 22,60c 7,50c Kích thước cụm phôi to; lá mầm

phôi to, rễ nhiều, to và dài

4 0,25 25,30b 8,40b Kích thước cụm phôi rất to; thân

phôi cao, lá mầm phôi to, rễ rất

nhiều, to và dài

5 0,25 26,80a 8,93a Kích thước cụm phôi rất to; thân

phôi cao, lá mầm phôi rất to, rễ rất

nhiều, rất to và rất dài

* Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức

p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.

81

Hình 3.20. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự nhân phôi trên môi trường đặc SH,

30 NSC.

A. Đĩa phôi nuôi cấy ban đầu; B. Cụm phôi nuôi cấy ban đầu; C. Cụm phôi ĐC

(không bổ sung NAA); D,E,F,G,H. Môi trường SH có bổ sung 1, 2, 3, 4, 5 mg/L

NAA, (thanh ngang 1 cm); I,J,K. Vị trí phát sinh phôi thứ cấp (mũi tên) trên thân

phôi; L. Vị trí phát sinh phôi thứ cấp từ rễ phôi (mũi tên). Hình chụp dưới kính hiển

vi soi nổi với độ phóng đại 10X (I,J,K); 20 X (L).

Tương tự trường hợp tạo mô sẹo có KNSP và tạo phôi sơ cấp từ mô sẹo,

auxin (2,4-D/NAA,…) ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với cytokinin (BA/kinetin) cũng

có vai trò rất quan trọng trong kích thích sự hình thành phôi thứ cấp từ phôi sơ cấp

ở nhiều loài thực vật [129]. Môi trường tạo phôi thứ cấp Castanea sativa [136],

Solanum nigrum [135] thích hợp là MS có (0,1 mg/L NAA; 0,1 mg/L BA), (2 mg/L

NAA và 0,5 mg/L BA), theo thứ tự. Tương tự, tổ hợp (NAA và BA) cũng được xác

định là thích hợp trong một số trường hợp khác, ví dụ (2 µM NAA và 2 µM BA)

dùng cho tạo phôi thứ cấp Angelica glauca Edgew [147]; môi trường SH chứa (0,5

mg/L NAA và 2 mg/L BA) rất thích hợp đối với tạo phôi thứ cấp Crocus vernus

[148]. Arya và cộng sự (1993) kết luận 2,4-D, NAA, và IAA ở nồng độ 1 mg/L có

82

tác động rất hiệu quả đến sự hình thành phôi thứ cấp cấp 1, cấp 2 ở Panax ginseng

[34]. Và ở NGBCC, NAA và BA cũng đóng vai trò quan trọng trong tạo phôi thứ

cấp tương tự như ở các trường hợp trên.

3.2.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng

3.2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự tạo phôi thứ cấp

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp, ở môi trường lỏng

SH, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

BA

(mg/L)

Số phôi

thứ cấp

Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/ cụm phôi

0 0,25 0,00e* Không có hiện tượng tạo phôi thứ cấp; phôi sơ cấp

phát triển với hình thái rễ, thân và lá mầm rõ rệt

1 0,25 15,23d Phôi thứ cấp nhỏ, dạng nốt tròn, màu hơi xanh; cụm

phôi ít rễ

2 0,25 17,30c Phôi thứ cấp nhỏ, dạng nốt tròn/thon dài, màu hơi

xanh; cụm phôi ít rễ

3 0,25 19,37a Phôi thứ cấp to, màu hơi xanh; cụm phôi có nhiều

rễ. Có hiện tượng sùi mô sẹo ở viền lá mầm phôi

cấy ban đầu.

4 0,25 18,56b Phôi thứ cấp to, màu hơi xanh; cụm phôi có nhiều

rễ. Có hiện tượng sùi mô sẹo ở viền lá mầm phôi

cấy ban đầu và ở rễ


mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Từ kết quả trên, 04 nghiệm thức NAA (1; 2; 3; 4 mg/L) được tiếp tục sử dụng

cho nghiên cứu tạo phôi thứ cấp trong môi trường lỏng vì ở nồng độ 5 mg/L NAA,

phôi có lá mầm rất to, rễ rất to và rất dài có thể gây hạn chế quá trình nhân phôi. Kết

quả cho thấy số phôi thứ cấp phát sinh từ phôi sơ cấp đơn nuôi cấy trong môi trường

có 1; 2; 3; 4 mg/L NAA lần lượt là 15,23; 17,30; 19,37; 18,56 (Bảng 3.9) và phôi thứ

cấp hình thành ở phần thân phôi sơ cấp (Hình 3.21D,E,F,G). Ở phôi nuôi cấy trong

môi trường không bổ sung NAA, không ghi nhận hiện tượng tạo phôi thứ cấp (Hình

3.21C). Tuy số phôi ở nghiệm thức 2 mg/L NAA không nhiều như ở 02 nghiệm thức

3 mg/L và 4 mg/L NAA nhưng phôi thứ cấp hình thành có dạng nốt tròn/thon dài với

83

số lượng khá nhiều, rễ phôi ngắn - tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu nhân phôi

sau này.

Như đã nêu trên, vai trò của auxin và cytokinin là rất quan trọng đối với sự

hình thành/phát triển phôi nói chung và nói riêng đối với phôi nuôi lỏng [22][149].

Môi trường lỏng MS có bổ sung 0,5 μM NAA và 5 μM BA tạo hiệu quả cao đối với

sự hình thành phôi Narcissus từ nuôi cấy mô sẹo có KNSP có nguồn gốc mô bầu

noãn [150]. Tương tự, môi trường lỏng MM có 2 mg/L NAA kích thích sự tạo phôi

từ mô sẹo có KNSP (từ nuôi cấy mảnh lá non) và môi trường có 2 mg/L BA tạo

phôi Coffea arabica với lá mầm phát triển [151].

Hình 3.21. Ảnh hưởng của NAA và BA đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi trường

lỏng SH, 30 NSC.

A. Bình phôi đơn thu thập dùng thí nghiệm; B. Cận cảnh phôi đơn dùng nuôi cấy; C.

Cận cảnh phôi nuôi trong môi trường không bổ sung NAA (ĐC); D,E,F,G. Phôi thứ

cấp hình thành ở môi trường SH có 1, 2, 3, 4 mg/L NAA.

3.2.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối

phôi

Sau 45 ngày nuôi cấy, kết quả thí nghiệm thu được ở (Bảng 3.10) cho thấy, KLP

nuôi cấy là 0,3 g (0,5%) có hệ số nhân sinh khối có giá trị thấp nhất là 10,40 và KLTP

thu nhận được là 3,12 g (Hình 3.22A); khi KLP nuôi cấy là 1,2 g (2%) thu được KLTP

là 17,85 g có hệ số nhân sinh khối cao nhất 14,88 (Hình 3.22C); KLP thu nhận được

84

đạt giá trị cao nhất là 23,45 g nhưng hệ số nhân sinh khối chỉ đạt 13,03 ở trường hợp

KLP nuôi cấy là 1,8 g (3%) (Hình 3.22D). Như vậy, khối lượng phôi nuôi cấy ban

đầu có ảnh hưởng đến sinh khối phôi thu nhận được, do liên quan đến mật độ trong

bình nuôi cấy.

Trong nuôi cấy mô sinh phôi/phôi nói chung, mật độ mẫu cấy (khối lượng mẫu

cấy - g hoặc số phôi)/đơn vị thể tích môi trường có vai trò quan trọng. Khi mật độ

nuôi cấy cao, làm hạn chế tiếp xúc của phôi cấy với chất dinh dưỡng và oxygen của

môi trường nuôi cấy, gây ra sự cạnh tranh, do đó làm giảm sự hấp thu chất dinh dưỡng

và oxygen, nên ảnh hưởng không tốt đến sinh trưởng của phôi [152]. Vì vậy, xác định

khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu rất quan trọng cho sự tăng trưởng sinh khối phôi.

Như vậy, trong thí nghiệm này, sử dụng khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu là 1,2 g

(tương ứng 2% w/v) thì sự tăng trưởng sinh khối phôi NGBCC đáp ứng sinh trưởng

tốt với hệ số nhân cao nhất.

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối phôi,

trong môi trường lỏng SH, 45 NSC

KLP nuôi

cấy (g)

KLTP thu

nhận (g)

Hệ số nhân

sinh khối (lần)

Đặc điểm hình thái cụm phôi

0,30 (0,5%) 3,12d* 10,40d Cụm phôi nhỏ, lá mầm to

0,60 (1%) 6,75c 11,25c Cụm phôi to, lá mầm to

1,20 (2%) 17,85b 14,88a Cụm phôi rất to, lá mầm nhỏ

1,80 (3%) 23,45a 13,03b Cụm phôi rất to, lá mầm nhỏ

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤

0,05 trong phép thử LSD.

Hình 3.22. Ảnh hưởng của khối lượng phôi (w/v) nuôi cấy đến tăng trưởng sinh

khối phôi trong môi trường lỏng SH, 45 NSC.

A,B,C,D. Môi trường nuôi cấy SH có 2 mg/L NAA và 0,25 mg/L BA, với khối lượng

phôi nuôi cấy 0,3 g; 0,6 g; 1,2 g; 1,8 g.

85

Đã ghi nhận một số nghiên cứu về khối lượng mẫu cấy ban đầu ảnh hưởng đến

hiệu quả của sự phát sinh phôi, như C. Guillou và cộng sự (2018) nghiên cứu về phát

sinh phôi của Theobroma cacao khi nuôi cấy trong bình tam giác đã sử dụng 1 – 2%

(w/v) mô sinh phôi PEMs (pro-embryogenic masses) là phù hợp; ngược lại, 5% gây

ức chế sinh trưởng [153]. Tương tự, B.B. Misra và S. Dey (2013), khi nuôi cấy mô

sinh phôi Santalum album (trong bioreactor 1,5 – 7,5 L) với khối lượng cấy ban đầu

là 1 – 2% là thích hợp nhất [154]. Đối với nuôi cấy phôi chuối lá [plantain FHIA-21

AAAB)] trong bình tam giác, García-Águila và cộng sự (2016) kết luận khối lượng

cấy ban đầu thích hợp là 2% (qua so sánh các khối lượng phôi nuôi cấy từ 0,7% đến

2,7%) [155].

Hình 3.23. Nhân phôi qua nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường SH, 30 – 60 NSC.

A. Cụm phôi dùng nuôi cấy; B,C. Bình nuôi phôi ở 30 NSC, 60 NSC; D,E. Phôi với

các dạng phát triển và kích thước khác nhau; F. Tập hợp phôi thu được ở 60 NSC; G,

H. Các dạng phôi điển hình (PC: phôi cầu, PTL: Phôi thủy lôi, PT: Phôi tim); I. Các

dạng phát triển phôi từ dạng cầu đến dạng trưởng thành; J. Phôi trưởng thành sau cấy

chuyển sang môi trường đặc. Hình được chụp dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng

đại 10X (I,J), 20X (G,H).

86

Trong quá trình nuôi lỏng lắc, nhận thấy có hiện tượng tạo phôi thứ cấp liên

tục theo chu kỳ để tạo các phôi/cụm phôi mới - phù hợp với kết quả nghiên cứu của

[156][157] về sự hình thành cụm phôi theo chu kỳ (cyclic manner) từ cực rễ của phôi

Piper nigrum và từ cực chồi của phôi Elaeis guineensis, theo thứ tự. Theo dõi trong

thời gian dài (đến 60 ngày) cho thấy, các phôi do tác động cơ học của quá trình lắc

và do tương tác với nhau đã treo vào môi trường với nhiều hình dạng (dạng cầu, tim,

thủy lôi, hai lá mầm) và kích cỡ khác nhau (nhỏ, to, trung bình) (qua quan sát đáy

bình nuôi) (Hình 3.23D,E,F,G,H).

Qua sàng lọc, tập hợp các phôi có kích thước khác nhau được dùng cho các

nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.24). Sự hình thành phôi/cụm phôi với các kích cỡ và

hình dạng khác nhau đã được ghi nhận trong quá trình tạo/nhân phôi trên môi trường

đặc [158] và trong môi trường lỏng [22].

Hình 3.24. Sự đa dạng của kích thước phôi từ quá trình nuôi lỏng lắc trong môi

trường SH.

A. Tập hợp các loại phôi có kích thước khác nhau; B,C,D. Tập hợp các phôi có kích

thước nhỏ, trung bình, to, theo thứ tự.

3.2.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp

Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả (Bảng 3.11) cho thấy, trong 03 loại kích thước

phôi, với phôi có kích thước trung bình (~ 10 mm) tạo số phôi thứ cấp cao nhất

(17,84) ở 30 NSC; ở phôi nhỏ và phôi to có số phôi thứ cấp là 7,51 và 13,92. Quan

sát về hình thái của phôi thứ cấp nhận thấy phôi cấy ban đầu có kích thước nhỏ (~ 7

mm, Hình 3.25A), hầu như tạo phôi có dạng cầu (Hình 3.25B,C,D,E), còn phôi cấy

87

có kích thước trung bình (~ 10 mm, Hình 3.25F) phôi hình thành rất đa dạng, từ dạng

cầu đến dạng có lá mầm (Hình 3.25G,H,I), với phôi cấy có kích thước lớn (~ 15 mm,

Hình 3.25J) phôi hình thành có dạng có lá mầm (Hình 3.25K,L,M). Điều đó chứng

tỏ, sự khác nhau về kích thước phôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến số phôi thứ cấp

hình thành và sự phát sinh hình thái phôi thứ cấp. Như vậy, ở NGBCC vật liệu sử

dụng có kích thước trung bình (bước đầu có lá mầm) là thích hợp cho nhân phôi.

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường

lỏng SH, 30 NSC.

Kích thước

phôi (mm)

Số phôi thứ

cấp

Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi

~ 7 7,51c* Phôi nhỏ, thường có dạng cầu hình thành

trên các bộ phận của phôi

~ 10 17,84a Phôi to, nhiều dạng phôi khác nhau: dạng

nốt tròn, dạng thon dài và dạng có lá mầm

và hình thành trên các bộ phận của phôi

~ 15 13,92b Phôi to, thường ở dạng có lá mầm, hình

thành trên các bộ phận của phôi



Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp đã được nghiên cứu

trên một số đối tượng cây trồng. Phôi hợp tử Brassica oleracea (var. gongylodes) ở

giai đoạn mới có lá mầm là vật liệu nuôi cấy cho tỷ lệ tạo phôi thứ cấp cao (80,7%)

khi được nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng [159]. Phôi vô

tính giai đoạn thủy lôi của dòng cà phê Arabica Arabica (AS2K) tạo phôi thứ cấp tốt

trên môi trường MS (đặc và bán rắn) có bổ sung Thidiazuron ở nồng độ 9,08 μM

[160]. Corredoira và cộng sự (2015) sử dụng phôi vô tính giai đoạn có lá mầm và

cụm phôi cầu và thủy lôi Eucalyptus globulus và E. saligna × E. maidenii nuôi cấy

trên môi trường có 16,11 µM NAA nhằm phát triển sinh khối [161]. Tuy nhiên, đối

với Malus x domestica Borkh. (cv. 'Gloster 69'), phôi vô tính kích thước to lại cho tỷ

lệ tạo phôi thứ cấp cao (> 73%) khi được nuôi cấy trên môi trường có tổ hợp

NAA/BAP/KIN hoặc chỉ có TDZ (10 μM) [162].

88

Hình 3.25. Ảnh hưởng của kích thước phôi đến sự tạo phôi thứ cấp trong môi

trường lỏng SH, 30 NSC.

A. Phôi kích thước nhỏ dùng nuôi cấy; phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (B,C),

rễ (D), lá (E) (vị trí mũi tên). F. Phôi kích thước trung bình dùng nuôi cấy; phôi thứ

cấp hình thành trên thân phôi (G), rễ (H), lá (I). J. Phôi kích thước to dùng nuôi cấy;

phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi (K), rễ (L), lá (M).

3.2.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Ở 30 NSC, kết quả (Bảng 3.12) cho thấy, KLT phôi đạt giá trị cao nhất (4,67

g) và hệ số nhân phôi cũng đạt cao nhất 15,57 ở môi trường nuôi cấy SH có bổ sung

50 g/L sucrose. Nghiệm thức có nồng độ sucrose thấp (20 g/L) KLT phôi thu nhận

được là thấp nhất (2,14 g) phôi có màu xanh, lá mầm to, rễ dài so với phôi trong môi

trường có nồng độ sucrose cao (40 – 50 g/L) - phôi màu hơi vàng, lá mầm nhỏ, và rễ

ngắn (Hình 3.26).

89

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi trong

môi trường lỏng SH, 30 NSC.

Nồng độ

sucrose (g/L)

KLT phôi

thu nhận (g)

Hệ số

nhân phôi

Đặc điểm hình thái, màu sắc

cụm phôi

20 2,14d* 7,29d Cụm phôi màu xanh, phôi có lá

mầm to, rễ dài

30 2,87c 9,57c Cụm phôi màu xanh, phôi có lá

mầm to, rễ dài

40 3,56b 11,87b Cụm phôi màu hơi vàng, phôi có

lá mầm nhỏ, rễ ngắn

50 4,67a 15,57a Cụm phôi màu hơi vàng, phôi có

lá mầm nhỏ, rễ ngắn



Hình 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng sinh khối phôi, trong môi

trường lỏng SH, 30 NSC.

A,B,C,D. Sự phát sinh phôi thứ cấp trong môi trường có nồng độ sucrose 20, 30, 40,

50 g/L

Naing và cộng sự (2013) kết luận cảm ứng tạo phôi thứ cấp Chrysanthemum

cv. Euro tốt hơn trên môi trường (MS có 2 mg/L 2,4-D, 2 mg/L kinetin) có 60 g/L

đường so với 30 g/L [75]. Ngược lại, phôi thứ cấp Panax ginseng phát sinh trên môi

trường MS, không có chất điều hòa sinh trưởng, với nồng độ đường tương đối thấp

(20 - 30 g/L); và nồng độ 20 g/L kích thích sự phát triển tiếp tục của phôi nhưng nồng

độ 30 g/L gây hạn chế dù kích thích tăng sinh khối [73]. Tương tự, Al Shamari và

cộng sự (2018) kết luận phôi thứ cấp Brassica oleraceae var. Botrytis phát sinh tốt

từ trụ dưới lá mầm phôi sơ cấp cũng trên môi trường bán rắn MS (không bổ sung chất

90

điều hòa sinh trưởng) có 30 g/L đường [163]. Nhìn chung, sự phát triển sinh khối

phôi NGBCC có nhu cầu về đường khá cao – tương tự một số trường hợp nêu trên.

3.2.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi

Kết quả cho thấy (Bảng 3.13, Hình 3.27), cường độ ánh sáng 2.000 - 4.000 lux

đã có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng sinh khối phôi so với nuôi phôi trong

điều kiện tối. Hệ số nhân phôi ở nghiệm thức tối, 2.000 lux và 4,000 lux lần lượt là

8,42; 9,37 và 10,40. Nói chung, phôi nuôi ngoài sáng xanh hơn phôi nuôi trong tối.

Phôi là cấu trúc mang nhiều lục lạp nên thường được nuôi cấy trong điều kiện có

chiếu sáng. Naing và cộng sự (2013) đã thực hiện nuôi cấy phôi sơ cấp

Chrysanthemum cv. Euro (môi trường MS có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L kinetin) nhằm

tạo phôi thứ cấp ở điều kiện chiếu sáng cao 60 - 100 µmol m-2 s-1 (~ 4.500 – 7.500

lux) (16 h sáng : 8 h tối) [75]. Sử dụng cường độ ánh sáng 80 µmol m-2 s-1 (~ 6.000

lux), 40 µmol m-2 s-1 (~ 3.000 lux) đối với nuôi cấy tạo phôi thứ cấp Brassica oleracea

var. Botrytis [163], Polyscias filicifolia [54], theo thứ tự, cũng đã được ghi nhận.

Ngược lại, ở tạo phôi thứ cấp Quercus robur, nuôi cấy được thực hiện trong cùng

điều kiện tối [76] như nuôi cấy vật liệu phôi sơ cấp. Ở NGBCC, nuôi nhân phôi ở

điều kiện ánh sáng cao đã thúc đẩy sự hình thành phôi thứ cấp dẫn đến tăng sinh khối

tốt – phù hợp với tình hình chung về bố trí điều kiện sáng khi dùng vật liệu chứa

nhiều lục lạp.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi,

trong môi trường lỏng SH, 30 NSC.

Cường độ ánh

sáng (lux)

KLT phôi

thu nhận (g)

Hệ số

nhân phôi

Đặc điểm hình thái, màu sắc

phôi

0 (tối) 2,53c* 8,42c Phôi màu hơi vàng, lá mầm

nhỏ, rễ phôi nhiều, dài

2.000 2,81b 9,37b Phôi màu xanh, lá mầm to, rễ

phôi trung bình

4.000 3,12a 10,40a Phôi màu xanh, lá mầm to, rễ

phôi ít, ngắn


mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

91

Hình 3.27. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi,

trong môi trường lỏng SH, 30 NSC

A. Phôi nuôi trong tối (ĐC); B,C. Phôi nuôi ngoài sáng cường độ 2.000 lux, 4.000

lux; D,E. Cận cảnh phôi nuôi trong tối, ánh sáng 4.000 lux.

3.2.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự hình thành phôi thứ cấp

Ở 21 NSC, kết quả cho thấy nước dừa đã ảnh hưởng tích cực đến quá trình

hình thành và phát triển phôi thứ cấp. Ở nghiệm thức 10% nước dừa, số phôi trung

bình đạt giá trị cao nhất (17,20) so với nghiệm thức không bổ sung nước dừa (13,40);

ngoài ra, cũng ghi nhận được lá mầm to và rễ dài (Bảng 3.14, Hình 3.28). Nước dừa

chứa nhiều thành phần dinh dưỡng tự nhiên như đường, vitamin, muối khoáng, acid

amin, các chất điều hòa sinh trưởng [164]. Vì vậy, bổ sung 10% nước dừa vào môi

trường nhân phôi ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh và phát triển phôi thứ cấp.

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường

lỏng SH, 21 NSC.

Nước

dừa (%)

Số phôi

thứ cấp

Đặc điểm hình thái, màu sắc phôi/cụm phôi

0 13,40c* Cụm phôi nhỏ, lá mầm phôi nhỏ, ngắn; rễ phôi ít, ngắn

5 14,27b Cụm phôi trung bình, lá mầm phôi trung bình; rễ phôi

nhiều, dài

10 17,20a Cụm phôi to, lá mầm phôi to, dài; rễ phôi nhiều, dài



92

Hình 3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp, trong môi trường

lỏng SH, 21 NSC.

A. Bình vật liệu phôi nuôi cấy. B,C,D. Phôi nuôi trong môi trường SH có nước dừa

0%, 5%, 10%.

Qua nuôi cấy mô sẹo có KNSP mang phôi sơ cấp (từ mô hoa đực non chuối

Musa spp. AAB cv. Dwarf Brazilian) trên môi trường MS chỉ có 10% nước dừa, kết

quả cho thấy có sự hình thành phôi thứ cấp với tỷ lệ 39,8%, ở các nghiệm thức không

có nước dừa đều không có sự hình thành phôi thứ cấp [165]. Nước dừa (2 – 10%) có

ảnh hưởng tích cực đến cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo có KNSP (từ nuôi cấy mảnh lá)

Kalopanax septemlobus [166]; nước dừa ngoài làm tăng sự phát sinh phôi từ mô sẹo

(ở nồng độ 20%), còn làm tăng sự tạo chồi từ phôi trưởng thành (ở nồng độ 10%) đối

với chà là Phoenix dactylifera [77]. Trong tạo phôi Phoenix dactylifera, nước dừa (10

– 15%) có tác động rất quan trọng [167]. Đối với loài Schefflera leucantha cùng chi

Ngũ gia bì, với tỷ lệ nước dừa 15% đã ảnh hưởng rất tốt đến chiều cao chồi, số lá, số

đốt thân,.. [168]. Như vậy, ở NGBCC nước dừa cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng

đến sự phát sinh, phát triển phôi thứ cấp, với tỷ lệ thích hợp là 10%.

3.2.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc

Các phôi đơn (Hình 3.29A) được nuôi cấy trong môi trường lỏng MS hoặc

½MS (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, 20 g/L sucrose) nhằm thử nghiệm

tạo cây con. Kết quả cho thấy, tương tự như tạo cây đối với phôi nuôi trên môi trường

đặc, phôi phát triển trong môi trường khoáng lỏng ½MS tốt hơn so với môi trường

MS ở các chỉ tiêu tạo rễ, tạo lá (Hình 3.29B,C,D,E) (không thu thập số liệu). Ở 14

NSC, các phôi được cấy chuyển sang môi trường đặc ½MS để tạo chồi và phát triển

thành cây con (Hình 3.29F,G,H,I ). Các cây (đã có lá thật) sau đó được trồng ra chậu

đất ở vườn ươm (Hình 3.29J,K,L).

93

Hình 3.29. Tạo cây con từ phôi vô tính nuôi lỏng lắc trong môi trường MS, ½MS

A. Vật liệu phôi đơn nuôi cấy tạo cây; B,C. Phôi nuôi trong môi trường MS, ½MS ở

14 NSC; D,E. Phôi đơn trong môi trường MS, ½MS ở 14 NSC; F. Cụm phôi mới cấy

chuyển sang môi trường đặc ½MS. G,H,I. Phôi nuôi cấy trên môi trường đặc ½MS

ở 15, 30 và 60 NSC; J,K,L. Cây từ phôi trồng ra đất ở 7, 30, 45 ngày sau trồng.

Việc sử dụng môi trường có hàm lượng khoáng thấp (½MS), không hoặc có

bổ sung chất ĐHST với nồng độ thấp và lượng đường thấp (10 – 20 g/L) nhằm nuôi

phôi nhằm mục đích tạo cây được ghi nhận là mang tính quyết định.. Môi trường

½MS cũng đã được kết luận là phù hợp đối với phôi Brassica oleracea L. var. Italica

(từ nuôi cấy trong môi trường lỏng) nhằm tạo chồi (½MS, 1 mg/L BA) và tạo cây

trên môi trường đặc (½MS không có chất điều hòa sinh trưởng) [169]. Phôi mang

chồi Ranunculus sceleratus (chưa có rễ, 1 - 2 cm) cũng được cấy chuyển sang môi

trường ½MS, ½vit B5, 10 g/L đường để tạo rễ và phát triển thành cây con [170]. Nói

chung, việc sử dụng môi trường có hàm lượng khoáng thấp, giảm thiểu hàm

lượng/không sử dụng chất điều hòa sinh trưởng và đường là nguyên tắc nuôi cấy phổ

biến ở giai đoạn này [68][149], và nuôi cấy phôi nhằm tạo cây ở NGBCC là phù hợp

với các nghiên cứu.

3.2.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và phôi thứ cấp

Khảo sát hình thái giải phẫu mô tế bào phôi bắt đầu có lá mầm phát sinh từ

thân (trụ dưới lá mầm) phôi sơ cấp nuôi cấy trên môi trường đặc (Hình 3.30A), phôi

cầu tạo từ thân phôi sơ cấp nuôi cấy trong môi trường lỏng (Hình 3.30D), phôi cầu

hình thành từ lá mầm (Hình 3.30H) và rễ phôi sơ cấp (Hình 3.30J) đã được thực hiện.

Từ kết quả thu được, theo chúng tôi, phôi thứ cấp phát sinh từ sự phân chia của

một/vài/nhiều tế bào/lớp tế bào bên ngoài thuộc vùng vỏ (cortex) của thân phôi sơ

cấp (Hình 3.30B,C,E,F), cũng không ghi nhận được sự thay đổi nhiều của mô tế bào

94

ở gần/vị trí mạch dẫn. Tương tự, phôi thứ cấp phát sinh từ lá mầm có nguồn gốc từ

lớp biểu mô của lá mầm phôi sơ cấp (Hình 3.30I) và phôi thứ cấp từ rễ có nguồn gốc

từ biểu mô vùng vỏ rễ phôi sơ cấp (Hình 3.30K).

Hình 3.30. Hình thái giải phẫu của phôi sơ cấp và thứ cấp.

A,B,C. Phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi sơ cấp ở môi trường đặc, hình thái giải

phẫu tương ứng. D,E,F. Phôi thứ cấp hình thành trên thân phôi sơ cấp ở môi trường

lỏng, hình thái giải phẫu tương ứng. G,H,I. Phôi thứ cấp hình thành từ lá mầm phôi

sơ cấp ở mặt dưới, mặt trên, hình thái giải phẫu tương ứng, (vạch đen chỉ vị trí cắt

thu lát mỏng tế bào); J,K. Phôi thứ cấp hình thành ở phần rễ phôi sơ cấp, hình thái

giải phẫu tương ứng, hình vuông chỉ vị trí vùng rễ khảo sát; mũi tên đen/trắng chỉ vị

trí phôi thứ cấp; M: mạch dẫn ở thân phôi, ở lá mầm và rễ phôi; hình chụp dưới kính

hiển vi soi nổi với độ phóng đại 20X)

Sukhada và cộng sự (2010) đã sử dụng kỹ thuật hóa mô để khảo sát sự hình

thành phôi thứ cấp từ phôi sơ cấp chuối (cv. Nanjangud Rasbale) (tái sinh từ mô sẹo

có khả năng sinh phôi từ hoa đực non nuôi cấy trên môi trường MS có 18,10 μM 2,4-

D, 5,37 μM NAA và 5,71 μM IAA) với kết quả đã ghi nhận được phôi thứ cấp hình

thành trực tiếp từ lớp biểu bì (epidermis) của phôi sơ cấp, không qua trung gian giai

đoạn mô sẹo theo hai cách, một là, phôi thứ cấp có nguồn gốc từ tế bào đơn biểu mô

95

của phôi cầu sơ cấp non; hai là, phôi thứ cấp có nguồn gốc từ nhiều tế bào biểu mô

lá mầm của phôi sơ cấp trưởng thành [171]. Trong nghiên cứu tạo phôi NGBCC, đã

ghi nhận được sự hình thành phôi cầu thứ cấp cấp 2 (tertiary) ở mặt dưới của lá (Hình

3.30G, vị trí mũi tên trắng) từ phôi cầu thứ cấp cấp 1; theo chúng tôi, phôi này cũng

có thể có nguồn gốc từ tế bào biểu mô phôi cầu tương tự kết luận của các tác giả vừa

nêu trên.

Phôi thứ cấp Arabidopsis thaliana (L.) Heynh hình thành trực tiếp từ lớp tế

bào bề mặt và dưới bề mặt, mặt trên lá mầm phôi hợp tử non nuôi cấy trên môi trường

B5 có 5 µM 2,4-D [172]; tương tự, ở Dendrobium cv. Chiengmai Pink, phôi thứ cấp

phát sinh từ các lớp tế bào biểu bì mặt trên, ở vị trí đầu lá và gần vị trí cắt của đoạn

lá mầm phôi sơ cấp (1 tháng tuổi, nuôi cấy trên môi trường ½MS có 1 mg/L TDZ)

[91]. Và ở Pistacia vera, phôi hình thành có nguồn gốc tế bào biểu mô hoặc dưới biểu

mô của lá [173].

Cũng qua khảo sát mô tế bào, Wang và cộng sự (2014) cho rằng ngoài tái sinh

phôi theo cách thông qua mô sẹo, các tiền phôi đa bào (multicellular proembryos)

cũng được hình thành trực tiếp từ lớp tế bào bề mặt (surface layer) của phôi non

Tapiscia sinensis qua nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D, 0,5%

than hoạt tính [94].

Xu và cộng sự (2019) đã ghi nhận được sự hình thành trực tiếp phôi thứ cấp

Ranunculus sceleratus từ bề mặt các loại mẫu cấy nh mảnh lá (1 – 1,5 cm2), đoạn

thân và đoạn rễ (1 - 2 cm) của cây mầm (2 tuần tuổi, cao 4 – 5 cm, có nguồn gốc phôi

hợp tử) nuôi cấy trên môi trường MS có nồng độ NAA cao (10 mg/L) [170]. Phôi thứ

cấp hình thành trực tiếp từ đoạn rễ (~ 8 mm) cây mầm (7 ngày tuổi, từ phôi hợp tử

Brassica oleracea L. var. Italica) nuôi cấy trong môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D,

tuy nhiên phôi thứ cấp lại có nguồn gốc từ các lớp tế bào trụ bì (pericycle cell layers)

gần hệ mạch [169]. Ở Quercus robur L., Zegzouti và cộng sự (2001) đã ghi nhận

được hai kiểu sinh phôi thứ cấp khác nhau từ vật liệu nuôi cấy là thân và rễ phôi sơ

cấp (đã bỏ lá mầm): một là, sinh phôi gián tiếp, ở trường hợp này có sự phân chia tế

bào ở mô vùng vỏ dẫn đến sự hình thành mô sẹo, sau đó tạo các khối phôi thứ cấp

tròn từ vùng mô có khả năng phân bào mạnh ở mặt ngoài) mô sẹo; hai là, sinh phôi

trực tiếp, có hai trường hợp xảy ra: (1) sự phân chia tế bào biểu bì trên diện rộng, và

96

(2) sự phân chia của một số tế bào biểu bì (3 – 4 tế bào) dẫn đến kết quả tạo phôi thứ

cấp [76].

Như vậy, sự sinh phôi thứ cấp từ thân, lá và rễ phôi sơ cấp ở NGBCC cũng

theo hướng chung của sự sinh phôi thứ cấp nói chung ở thực vật/cây trồng – tương tự

như kết quả của một số tác giả nêu trên.

3.3. Tạo rễ bất định

3.3.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá

3.3.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất


Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất

định trực tiếp từ mảnh lá (10 x10 mm)

Ở nghiệm thức đối chứng, môi trường nuôi cấy không bổ sung chất ĐHST

(NAA/IBA), các mẫu cấy đều không có biểu hiện đáp ứng tạo rễ 30 NSC.

Trên môi trường nuôi cấy MS, ½MS, B5, SH có bổ sung IBA ở nồng độ từ

(0,5 – 5mg/L), kết quả cho thấy sau 30 ngày nuôi cấy các mẫu cấy mảnh lá hoàn toàn

không có biểu hiện cảm ứng tạo rễ ở tất cả các nghiệm thức (không trình bày số liệu,

Hình 3.31A,B).

Hình 3.31. Đĩa cấy mảnh lá trên môi trường ½MS có 3 mg/L NAA, 30 NSC.

A. Mặt trên của đĩa cấy mảnh lá, B. Mặt dưới của đĩa cấy mảnh lá

Sau 30 ngày nuôi cấy mẫu trên môi trường MS, ½MS, B5 và SH có NAA ở

tất cả các nghiệm thức, kết quả cho thấy có sự tác động rõ rệt của NAA đến khả năng

tạo rễ xét ở tất cả các chỉ tiêu như tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm)

thể hiện ở (Bảng 3.15, Hình 3.32, Hình 3.33, Hình 3.34, Hình 3.35).

Quan sát mẫu cấy ở nghiệm thức có bổ sung NAA sau 7 ngày cho thấy, mô

xung quanh vết cắt có biểu hiện trương to và rễ xuất hiện ở ngày thứ 12 – 15. Tỷ lệ

97

mẫu ra rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ tăng theo nồng độ NAA (0,5 - 3 mg/L), hiệu quả

cao nhất ở 3 mg/L NAA. Khi nồng độ NAA tăng trong khoảng 4, 5 mg/L, giá trị các

chỉ tiêu theo dõi đều giảm. Mặt khác, trên các môi trường nuôi cấy khác nhau khi bổ

sung NAA có cùng nồng độ, kết quả về các chỉ tiêu theo dõi khác nhau, chứng tỏ sự

phát sinh rễ bất định chịu ảnh hưởng bởi các mức nồng độ khác nhau của NAA và

các môi trường khoáng khác nhau. Trong nghiên cứu này cho thấy, hiệu quả tạo rễ

trên môi trường ½MS là cao nhất với tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100%, số rễ/mẫu 69,78;

chiều dài rễ (mm) 16,96, kết quả này khác biệt với các nghiệm thức còn lại, rễ hình

thành sớm hơn ở ngày thứ 12 sau cấy, so với các môi trường còn lại. Rễ hình thành

nhiều ở xung quanh vết cắt, có màu trắng, nhiều lông hút trên tất cả các loại môi

trường.

Trên môi trường B5 có 3 mg/L NAA, rễ có kích thước dài nhất (18,68 mm).

Ở nghiệm thức có bổ sung 3 mg/L NAA, rễ ngắn nhất ghi nhận được khi mẫu nuôi

cấy ở môi trường MS (11,33 mm).

98

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực

tiếp từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

Môi trường

khoáng

Tỷ lệ mẫu

tạo rễ (%)

Số rễ/mẫu Chiều dài rễ

(mm)

0 MS 00,0r* 00,0p 0,00o

0,5 MS 62,22q 11,61n 8,63l

1 MS 64,45o 15,92l 9,22k

2 MS 70,00lm 23,71g 10,44j

3 MS 84,45h 30,32e 11,33i

4 MS 81,11ij 26,60f 8,25m

5 MS 66,67n 20,82j 7,54n

0 ½MS 00,0o 00,0p 0,00o

0,5 ½MS 80,00j 18,49k 12,28h

1 ½MS 84,44h 26,76f 13,50f

2 ½MS 91,11cd 43,56c 15,54d

3 ½MS 100,00a 69,78a 16,96b

4 ½MS 94,45b 56,41b 10,56j

5 ½MS 88,89ef 36,05d 9,54k

0 B5 00,0o 00,0p 0,00o

0,5 B5 68,89m 9,46o 13,71f

1 B5 75,56k 12,72mn 14,50e

2 B5 86,67g 18,68k 16,57c

3 B5 92,22c 26,53f 18,68a

4 B5 90,00de 23,15gh 11,52i

5 B5 82,22i 16,33l 10,66j

0 SH 00,0o 00,0p 0,00o

0,5 SH 63,33po 11,67n 9,56k

1 SH 66,67n 13,98m 10,81j

2 SH 74,45k 21,89hi 11,38i

3 SH 87,78fg 29,08e 12,69g

4 SH 82,22i 26,15f 9,22k

5 SH 71,11l 16,89l 8,69l


p ≤ 0, 05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang dạng arcsin √𝑥


99

Hình 3.32. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá

(10 x 10 mm) ở môi trường MS, có

NAA, 30 NSC.

A. 0,5 mg/L, B. 1 mg/L, C. 2 mg/L,

D. 3 mg/L, E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.

Hình 3.33. Tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (10

x 10 mm) ở môi trường ½MS, có NAA,

30 NSC.

A. 0,5 mg/L, B. 1 mg/L, C. 2 mg/L,

D. 3 mg/L, E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.


(10 x 10 mm) ở môi trường B5, có

NAA, 30 NSC.

A. 0,5 mg/L, B. 1 mg/L, C. 2 mg/L,

D. 3 mg/L, E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.


(10 x 10 mm) ở môi trường SH, có

NAA, 30 NSC.

A. 0,5 mg/L, B. 1 mg/L, C. 2 mg/L,

D. 3 mg/L, E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.

Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất

định trực tiếp từ mảnh lá ( 3 x 10 mm)

Tương tự như trường hợp mẫu cấy mảnh lá (10 x10 mm), sau 30 ngày cấy ở

nghiệm thức đối chứng (không có NAA) và tất cả các nghiệm thức có IBA (0,5 – 5

100

mg/L) hoàn toàn không ghi nhận được hiện tượng tạo rễ. Như vậy, lần nữa cho thấy

mô lá hoàn toàn không có biểu hiện cảm ứng phát sinh rễ bất định đối với IBA.

NAA có tác động tích cực đến cảm ứng tạo rễ, mẫu cũng có đáp ứng tạo mô

sẹo tuy không nhiều sau 5 ngày sau nuôi cấy trên môi trường MS và rễ xuất hiện sớm

ở ngày thứ 12 nuôi cấy. Các nồng độ khác nhau của NAA đều có tác động kích thích

quá trình tạo rễ, giá trị các chỉ tiêu theo dõi tăng tỷ lệ thuận với nồng độ NAA (0,5 -

3 mg/L), giảm khi nồng độ NAA cao hơn 3 mg/L (Bảng 3.16). Môi trường tạo rễ bất

định hiệu quả nhất vẫn là ½MS có 3 mg/L NAA cụ thể tỷ lệ mẫu tạo rễ 100%; số

rễ/mẫu 19,67; chiều dài rễ (6,29 mm), rễ hình thành sớm sau 10 ngày cấy. Rễ hình

thành trên môi trường ½MS và B5 (Hình 3.37, 3.38) đều dài hơn rễ ở môi trường MS,

SH (Hình 3.36, 3.39). Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu theo dõi đều có sự khác

biệt về mặt thống kê.

Kết quả đáp ứng nhanh của mẫu cấy mảnh lá có kích thước nhỏ (3 x 10 mm),

tỷ lệ mẫu tạo rễ cao hơn so với mẫu cấy mảnh lá có thể do mẫu cấy có kích thước

nhỏ, bề mặt tiếp xúc với môi trường lớn; nên tiếp nhận các chất từ môi trường nhanh

hơn. Tuy nhiên, chiều dài rễ ngắn hơn so với rễ từ mảnh lá ở cùng điều kiện nuôi cấy,

có thể do hàm lượng chất nội sinh trong mẫu ít hơn.

Nói chung, vật liệu mô lá, như một hệ thống nuôi cấy chứa protein sắc tố nhạy

sáng phytochrome, thường được sử dụng trong nghiên cứu tạo rễ bất định vì: (1)

auxin ngoại sinh có thể tác động dễ dàng đến loại tế bào có nhiều tiềm năng (tế bào

liên kết với mạch dẫn) dẫn đến phân chia, biệt hóa tạo một cơ quan nhất định trong

đó có rễ [174][175]; (2) lá còn chứa mô tế bào khuyết cũng có thể phản biệt hóa và

tái biệt hóa tạo sơ khởi rễ dưới tác động của auxin ngoại sinh trong quá trình nuôi cấy

như ở trường hợp tái sinh rễ Sainpaulia ionantha [103]; (3) lá cũng là cơ quan có khả

năng sinh tổng hợp auxin nội sinh - có thể có liên quan nhất định đến sự tạo sơ khởi

rễ [176]. Theo Yu và cộng sự (2017), rễ bất định tái sinh từ mảnh lá Arabidopsis

thaliana là kết quả của một số hoạt động sinh lý trong mô tế bào như: (1) Auxin nội

sinh được vận chuyển đến các tế bào có khả năng tái sinh (procambium và tế bào nhu

mô mạch), kích chuyển tái lập trình di truyền các tế bào này thành các tế bào ‘nguồn’;

(2) Các tế bào ‘nguồn’ phát triển thành sơ khởi rễ - nơi tích tụ auxin cao; (3) Các tế

bào sơ khởi rễ tiếp tục phân chia tạo mô phân sinh đầu rễ - nơi auxin giảm tích tụ; (4)

Đầu rễ đạt mức trưởng thành, tiếp tục phát triển ra khỏi mảnh lá [176].

101

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của NAA và môi trường khoáng đến sự tạo rễ bất định trực

tiếp từ mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

NAA

(mg/L)

Môi trường

khoáng


rễ (%)

Số rễ/mẫu Chiều dài rễ

(mm)

0 MS 00,0o* 00,0s 0,00p

0,5 MS 63,33n 8,46q 8,23m

1 MS 66,67m 9,52mn 8,61k

2 MS 78,89j 12,39h 9,28i

3 MS 87,78e 15,78d 10,79g

4 MS 82,22f 13,46f 7,29l

5 MS 72,22h 10,69l 6,45o

0 ½MS 00,0o 00,0s 0,00p

0,5 ½MS 82,22h 9,67m 10,50h

1 ½MS 86,67fg 11,74i 11,48e

2 ½MS 93,33c 15,52e 12,32d

3 ½MS 100,00a 19,67a 16,29a

4 ½MS 96,67b 17,33b 9,41i

5 ½MS 88,89e 13,06g 8,48kl

0 B5 00,0o 00,0s 0,00p

0,5 B5 71,11l 6,89r 11,46ef

1 B5 81,11hi 8,22q 12,43d

2 B5 88,89e 9,33n 13,51c

3 B5 95,56b 11,50j 14,65b

4 B5 92,22cd 10,50l 10,41h

5 B5 85,56g 8,80o 9,31i

0 SH 00,0o 00,0s 0,00p

0,5 SH 65,56m 8,41qr 8,81j

1 SH 71,11l 9,52mn 9,28i

2 SH 80,00ij 12,46h 11,28f

3 SH 91,11d 16,59c 12,29d

4 SH 85,56g 13,36f 8,36l

5 SH 75,56k 11,04k 7,76n


p ≤ 0, 05 trong phép thử Duncan. Số liệu (%) được chuyển đổi sang arcsin√𝑥 khi

phân tích thống kê.

102


x 10 mm) ở môi trường MS, có NAA, 30

NSC.

A. 0,5 mg/L B. 1 mg/L C. 2 mg/L

D. 3 mg/L E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.


x 10 mm) ở môi trường ½MS, có NAA,

30 NSC.

A. 0,5 mg/L B. 1 mg/L C. 2 mg/L

D. 3 mg/L, E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.


x 10 mm) ở môi trường B5, có NAA, 30

NSC.

A. 0,5 mg/L B. 1 mg/L C. 2 mg/L

D. 3 mg/L E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.


x 10 mm) ở môi trường SH, có NAA, 30

NSC.

A. 0,5 mg/L B. 1 mg/L C. 2 mg/L

D. 3 mg/L E. 4 mg/L, F. 5 mg/L.

Hệ thống LMTB gồm những mẫu cấy có kích thước nhỏ (1 - vài mm), hàm

chứa ít chất điều hòa sinh trưởng nội sinh, nên sự phát sinh hình thái phụ thuộc chủ

yếu vào chất ĐHST bổ sung vào môi trường. Hệ thống này có ưu điểm là thời gian

phát sinh hình thái tương đối ngắn do đáp ứng nhanh với nuôi cấy, tỷ lệ phát sinh

hình thái cao, đa dạng về hình thái phát sinh tùy môi trường nuôi cấy. Do đó, hệ thống

này đã được ứng dụng hiệu quả trong thực tiễn nuôi cấy in vitro nhằm nghiên cứu cơ

103

bản về phát sinh hình thái, nhân giống cây trồng [178].

Kết quả của thí nghiệm tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá NGBCC cho thấy,

môi trường ½MS có 3 mg/L NAA được xem là rất thích hợp cho tạo rễ bất định trực

tiếp từ mô lá của NGBCC; ngược lại, IBA hoàn toàn không gây đáp ứng tạo rễ bất

định. Ling và cộng sự (2013) cho rằng trường hợp NAA có tác động tốt đối với tạo

rễ là do NAA được oxy hóa hiệu quả thành IAA để tế bào sử dụng [179]. Tác động

âm tính đối với tạo rễ có thể do IBA không được chuyển đổi thành IAA bởi quá trình

β-oxy hóa ở các thể peroxisome trong tế bào [180].

Đã ghi nhận NAA, ở dạng riêng lẻ hoặc kết hợp với auxin khác, là tác nhân

kích thích tạo rễ tốt từ mành lá nhiều loài thực vật được nuôi cấy in vitro như

Eurycoma longifolia khi dùng 3 mg/L NAA [181] hoặc 3 mg/L NAA (kết hợp với 1

mg/L IBA) là thích hợp nhất cho tạo rễ từ mảnh lá Gynura procumbens [182]. IBA

cũng là chất điều hòa sinh trưởng rất thích hợp trong sử dụng tạo rễ đối với nhiều cây

dược liệu [98]. Tuy nhiên, ở một số đối tượng thực vật, IBA (kể cả IAA) hoàn toàn

không thích hợp, ví dụ như ở trường hợp tạo rễ bất định từ mảnh lá Andrographis

paniculata trên môi trường MS chỉ tạo được rễ bất định khi sử dụng NAA (1 mg/L)

[183]; cũng nhận thấy chồi Diospyros crassiflora không tạo rễ bất định trên môi

trường ½MS có IBA (2,5 - 19,6 µM). Nói chung, loại và nồng độ auxin thích hợp cho

cảm ứng tạo rễ và kéo dài rễ bất định phụ thuộc chủ yếu vào loài thực vật [184].

Như đã trình bày mô lá tạo rễ bất định tốt nhất trên môi trường khoáng ½MS

ở tất cả các chỉ tiêu theo dõi so với các môi trường MS, B5 và SH. Theo Khalafalla

và cộng sự (2009), đáp ứng tạo rễ từ mô lá phụ thuộc vào thành phần khoáng cơ bản

của môi trường và hàm lượng đạm nitrate. Tương tự như một số loài thực vật khác,

theo chúng tôi, có thể do nhu cầu về khoáng đa lượng đối với NGBCC ở mức tương

đối thấp, cụ thể tổng khoáng đa lượng ở môi trường ½MS là thấp nhất (2.116 mg/L)

so với tổng khoáng đa lượng ở các môi trường MS, B5 và SH cao hơn nhiều, lần lượt

là 4.232 mg/L, 2.999 mg/L và 3.146 mg/L; và trong đó có thể nhu cầu về đạm nitrate

cũng ở mức thấp hơn – 1.775 mg/L ở ½MS so với các môi trường MS, B5 và SH -

cao hơn nhiều là 3.550 mg, 2.500 mg và 2.500 mg, theo thứ tự. Cũng theo Khalafalla

và cộng sự (2009), trong mối tương quan với đạm nitrate, đạm ammonium (NH4)

cũng đóng vai trò quan trọng trong tạo rễ và cho rằng số rễ Vernonia amygdalina tái

sinh từ mảnh lá trên môi trường B5 ít hơn so với môi trường MS có thể do thành phần

104

đạm ammonium (NH4)2SO4 trong môi trường B5 ít hơn (134 mg/L) ở môi trường MS

(NH4NO3, 1.650 mg/L) [185]. Ở NGBCC, số rễ tái sinh ít trên môi trường B5 cũng

có thể do yếu tố ammonium tương tự như trường hợp của các tác giả nêu trên. Trong

môi trường SH có đạm NH4PO4 phôi Panax quinquefolius nẩy mầm tạo rễ trụ tốt trên

môi trường có khoáng thấp - ½SH [36]; tương tự, chồi Panax ginseng (có nguồn gốc

phôi vô tính) phát triển rễ trụ tốt trên môi trường 1/3SH [41]. Rễ Panax ginseng tạo

sinh khối tốt trong môi trường SH chỉ có ½NH4PO4 [186]. Ở NGBCC, đáp ứng tái

sinh rễ không tốt có thể do nồng độ NH4PO4 ở môi trường SH không phù hợp hoặc

loại đạm ammonium này khác với NH4NO3, loại thích hợp hơn cho loài thực vật này

ở môi trường MS, ½MS hoặc/và khác với (NH4)2SO4 ở môi trường B5.

Như vậy, kết quả của nghiên cứu này cho thấy NAA có vai trò quan trọng

trong việc tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá, tỷ lệ % mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu và chiều

dài rễ khác nhau chịu ảnh hưởng bởi các mức nồng độ của NAA và hàm lượng –

thành phần của môi trường khoáng.

3.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá

(10 x 10 mm)

Kế thừa kết quả thí nghiệm trên, môi trường ½MS có bổ sung 3 mg/L NAA

được sử dụng để nghiên cứu xác định nồng độ đường thích hợp cho tạo rễ bất định.

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh

lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

Nồng độ

sucrose (g/L)

Tỷ lệ mẫu

tạo rễ (%)

Số rễ/mẫu

Chiều dài rễ

(mm)

20 92,22b* 58,35b 14,63b

30 100,00a 70,50a 16,70a

40 87,78c 46,44c 12,26c

50 85,56d 36,24d 10,47d


p ≤ 0, 05 trong phép kiểm định LSD. Số liệu (%) được chuyển đổi sang (x+0,5)1/2 khi

xử lý thống kê.

Ở 30 ngày sau nuôi cấy, kết quả thí nghiệm cho thấy các nghiệm thức có nồng

độ sucrose khác nhau cho kết quả khác biệt về mặt thống kê ở tất cả các chỉ tiêu theo

105

dõi, trong đó nồng độ sucrose 30 g/L là tối ưu cho tạo rễ ở mảnh lá có tỷ lệ mẫu tạo

rễ 100%, số rễ/mẫu 70,50; chiều dài rễ 16,70 mm (Bảng 3.17), ở nồng độ sucrose cao

50 g/L các chỉ tiêu theo dõi đều giảm (tỷ lệ mẫu tạo rễ 85,56%, số rễ/mẫu 36,24; chiều

dài rễ 10,47 mm) rễ hơi vàng, ít lông hút hơn, rễ ngắn hơn (Hình 3.40).

Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro ít hoặc không có khả năng tự dưỡng nên

cần bổ sung nguồn carbon. Đường là nguồn carbon được sử dụng phổ biến, trong

nuôi cấy mô giúp hỗ trợ quá trình phân bào và phát sinh hình thái; ngoài ra, nồng độ

đường thích hợp còn làm gia tăng hàm lượng hợp chất thứ cấp trong rễ [98].

Hình 3.40. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ từ mảnh lá (10 x 10 mm), ở

môi trường ½MS, 30 NSC.

A,B,C,D. Đĩa cấy mảnh lá tạo rễ ở môi trường ½MS có sucrose 20, 30, 40, 50 g/L.

Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá

(3 x 10 mm)

Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau nuôi cấy 30 ngày các mẫu cấy ở môi trường có

30 g/L sucrose tạo rễ tốt nhất với tỷ lệ mẫu tạo rễ 100%; số rễ/mẫu 22,65; chiều dài

rễ 15,40 mm; thấp nhất khi môi trường có bổ sung sucrose với nồng độ cao 50 g/L,

các chỉ tiêu theo dõi đều giảm 82,59%; số rễ/mẫu 9,37; chiều dài rễ 9,54 mm. Ở các

nghiệm thức có nồng độ sucrose 20 g/L, 40 g/L chỉ tiêu tỷ lệ mẫu tạo rễ, chiều dài rễ

có khác biệt thống kê nhưng số rễ/mẫu không khác biệt về thống kê. Từ kết quả này

cho thấy, các mức nồng độ sucrose khác nhau có ảnh hưởng khác biệt đến tạo rễ bất

định. Tỷ lệ % mẫu tạo rễ ở mẫu cấy mảnh lá có kích thước nhỏ (3 x 10 mm) cao hơn

mẫu cấy mảnh lá (10 x 10 mm) do đáp ứng của mẫu cấy với môi trường nuôi cấy tốt

hơn. Tuy nhiên, ở nghiệm thức nồng độ sucrose cao 50 g/L, ở mẫu cấy mảnh lá kích

thước nhỏ (3 x 10 mm) lại có tỷ lệ mẫu tạo rễ ít hơn so với mẫu cấy mảnh lá do ở

nồng độ đường cao làm áp suất thẩm thấu tăng, mô cấy thiếu nước ảnh hưởng đến

sinh lý của mô cấy.

106

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh

lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

Nồng độ

sucrose (g/L)

Tỷ lệ mẫu

tạo rễ (%)

Số rễ/mẫu

Chiều dài rễ

(mm)

20 95,19b* 11,59b 13,61b

30 100,00a 22,65a 15,40a

40 91,11c 11,54b 11,53c

50 82,59d 9,37c 9,54d

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt ý nghĩa với p ≤ 0,05

trong phép thử LSD. Số liệu (%) được chuyển đổi sang (x+0,5)1/2 khi xử lý thống kê.

Hình 3.41. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ trực tiếp từ mảnh lá (3 x 10

mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

A,B,C,D. Đĩa cấy mảnh lá (3 x 10 mm) tạo rễ ở môi trường ½MS có sucrose 20, 30,

40, 50 g/L.

Như vậy, môi trường ½MS có bổ sung 3 mg/L NAA với 30 g/L sucrose là

thích hợp nhất cho tạo rễ bất định từ mô lá NGBCC. Kết quả này cũng phù hợp với

một số kết quả nghiên cứu sử dụng đường sucrose 30 g/L để tạo rễ bất định Panax

vietnamensis [187], Panax stipuleanatus [46], sucrose 30 g/L là tối ưu cho rễ Panax

ginseng phát triển [188].

3.1.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô

lá

Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ

mảnh lá (10 x 10 mm)

Trong nghiên cứu tạo rễ bất định, ánh sáng được cho là tác nhân ức chế sự

hình thành rễ, nhất là giai đoạn hình thành sơ khởi rễ, điều kiện tối cần cho giai đoạn

đầu của quá trình ra rễ, chu kỳ tối thích hợp để rễ phát triển 3 - 10 ngày tùy thuộc vào

loài thực vật khác nhau [189]. Nhiều nghiên cứu tạo rễ bất định đạt kết quả tốt trong

107

điều kiện tối. Tuy nhiên ở đối tượng NGBCC, nhận thấy ánh sáng lại có tác động tích

cực đến sự thành rễ bất định từ mô lá. Số liệu (Bảng 3.19) cho thấy, các chỉ tiêu theo

dõi có sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức. Ở điều kiện chiếu sáng, mẫu tạo rễ

với tỷ lệ rất cao, chiếm 95,56% (2.000 lux), 100% (4.000 lux); rễ hình thành với số

lượng nhiều nhất 68,80 rễ/mẫu (4.000 lux), thấp nhất mẫu cấy ở điều kiện tối. Các

mẫu cấy mảnh lá nuôi cấy ở cường độ chiếu sáng khác nhau, thì rễ hình thành có

chiều dài khác nhau, mẫu cấy mảnh lá ở điều kiện tối rễ hình thành dài nhất (19,77

mm), mẫu cấy mảnh lá ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux tạo rễ có chiều dài cũng khá

tốt (16,53 mm). Như vậy, sự khác biệt về các chỉ tiêu theo dõi ở các nghiệm thức cho

thấy, điều kiện sáng, tối có ảnh hưởng đến sự phát sinh rễ từ mảnh lá (Hình 3.42)

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ

mảnh lá (10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC

Điều kiện chiếu

sáng (lux)

Tỷ lệ mẫu

tạo rễ (%)

Số

rễ/mẫu

Chiều dài

rễ (mm)

Đặc điểm rễ

4.000 100a* 68,80a 16,53b Rễ dài, nhiều lông hút, màu

trắng đục

2.000 95,56b 30,03b 15,37c Rễ dài, nhiều lông hút, màu

trắng

Tối 93,33c 27,20c 19,77a Rễ rất dài, ít lông hút, một số

rễ màu hơi vàng



Hình 3.42. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từ mảnh lá

(10 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

A,B,C. Đĩa cấy mảnh lá tạo rễ ở cường độ chiếu sáng 4.000 lux, 2.000 lux, tối; D.

Mảnh lá tạo rễ ở môi trường ½MS có 3 mg/L NAA, 4000 lux. Thanh ngang 10 mm.

108

Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ

mảnh lá (3 x 10 mm)

Đối với mẫu cấy mảnh lá (3 x 10 mm), nhận thấy hiệu quả tạo rễ cao nhất ở

nghiệm thức có cường độ chiếu sáng 4.000 lux (100% mẫu tạo rễ; 21,96 rễ/mẫu; chiều

dài rễ 15,53 mm) so với mẫu cấy ở cường độ chiếu sáng 2.000 lux và điều kiện tối

(Bảng 3.20, Hình 3.41). Ở điều kiện chiếu sáng khác nhau, kết quả tạo rễ khác nhau

về tỷ lệ % mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm).

Bảng 3.20. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ

mảnh lá (3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

Điều kiện chiếu

sáng (lux)

Tỷ lệ mẫu

tạo rễ (%)

Số

rễ/mẫu

Chiều dài

rễ (mm)

Đặc điểm rễ

4.000 100a* 21,96a 15,53a Rễ dài, nhiều lông hút, màu

trắng đục

2.000 94,44b 16,19b 13,43b Rễ ngắn, nhiều lông hút,

màu trắng

Tối 91,11c 14,11c 14,37c Rễ ngắn, nhiều lông hút,

một số rễ màu hơi vàng



Hình 3.43. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định từ mảnh lá

(3 x 10 mm), ở môi trường ½MS, 30 NSC.

A,B,C. Đĩa cấy mảnh lá tạo rễ ở cường độ chiếu sáng 4.000 lux, 2.000 lux, tối; D.

Mảnh lá tạo rễ ở môi trường ½MS có 3 mg/L NAA, 4000 lux. Thanh ngang 10 mm.

Như vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy sự cảm ứng tạo rễ bất định từ mô lá,

hiệu quả cao nhất ở điều kiện chiếu sáng 4000 lux, các chỉ tiêu theo dõi đều có giá trị

cao nhất. Trong tự nhiên, sự tạo rễ bất định thuận lợi hơn khi ở điều kiện tối, nhưng

trong nuôi cấy mô với điều kiện môi trường tối ưu (khoáng, chất ĐHST,..), nhiều

109

nghiên cứu cho thấy sự phát sinh rễ bất định thuận lợi hơn ở điều kiện sáng (phụ

thuộc kiểu gen thực vật); ngoài ra, nhiều công bố cho thấy khi nuôi ở điều kiện sáng

mạnh, ở rễ nhiều loài thực vật hình thành cấu trúc tương tự như lục lạp (chloroplast-

like structure) có thể liên quan đến sự hình thành và tăng trưởng của rễ.

Đến nay đã ghi nhận nhiều nghiên cứu tạo rễ bất định với kết quả tốt với các

điều kiện chiếu sáng khác nhau như tối - ví dụ trường hợp nuôi cấy mảnh lá Cichorium

intybus [184], Centella asiatica [190], 40 µmol m-2 s-1 (3.000 lux) đối với Artemisia

amygdalina [191], và 4.000 - 5.000 lux ở nuôi cấy tạo rễ từ mô lá Vernonia

amygdalina [185]. Tương tự một số trường hợp nuôi cấy tạo rễ nêu trên, kết quả

nghiên cứu này cho thấy mảnh lá NGBCC tái sinh rễ bất định tốt nhất ở nghiệm thức

có cường độ chiếu sáng 4.000 lux.

3.1.1.4. Minh họa sự tái sinh rễ trực tiếp và khảo sát hình thái giải phẫu rễ tái

sinh trực tiếp

Như đã trình bày, trong nghiên cứu này rễ bất định hình thành từ mô lá được

định nghĩa theo cách tái sinh trực tiếp ngay ở lần nuôi cấy đầu tiên, khác với tái sinh

gián tiếp qua trung gian giai đoạn mô sẹo.

Hình 3.44. Minh họa cận cảnh sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ mảnh lá nuôi cấy

trên môi trường ½MS, 12 – 20 NSC.

A,B,C. Cận cảnh sự hình thành giai đoạn đầu của rễ đơn, cụm 2 rễ và cụm nhiều rễ ở

12 NSC; D,E,F. Sự phát triển tiếp theo của rễ đơn, cụm 2 rễ và cụm nhiều rễ, ở 20

ngày sau cấy.

Khá nhiều kết quả nghiên cứu về tái sinh trực tiếp rễ bất định từ mô lá đã được

ghi nhận như tạo rễ Ophiorrhiza prostrata dùng môi trường ½MS với 10,74 µM NAA

110

và 2,32 µM kinetin [, tạo rễ Centella asiatica trên môi trường MS có 1 mg/L IBA

[190], tạo rễ Rauwolfia serpentina trên môi trường MS có 1 mg/L PABA (para-amino

benzoic acid) và 4 mg/L NAA [192]. Rễ Gynura procumbens tái sinh trực tiếp trên

môi trường MS có bổ sung 3 mg/L IBA; ngược lại, ở môi trường MS có 3 mg/L NAA

rễ tái sinh gián tiếp thông qua mô sẹo [182]. Ở NGBCC đây là kết quả nghiên cứu

đầu tiên về tái sinh rễ trực tiếp từ vật liệu mảnh lá, được minh họa bằng các hình rễ

tái sinh sau 12 đến 20 ngày nuôi cấy qua chụp cận cảnh (Hình 3.44).

Các sơ khởi rễ (giai đoạn ngày thứ 10 sau cấy) cũng đã được khảo sát hình thái

giải phẫu với kết quả được trình bày dưới đây (Hình 3.45).

Hình 3.45. Hình thái giải phẫu sơ khởi rễ bất định hình thành trực tiếp từ mảnh lá.

A,B. Sơ khởi rễ hình thành ở vị trí gân phụ của lá và hình thái giải phẫu tương ứng;

C,D. Sơ khởi rễ hình thành không ở vị trí gân phụ của lá và hình thái giải phẫu tương

ứng (hình chụp dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 20X) (GP: Gân phụ của lá,

BBD: Biểu bì mặt dưới của phiến lá, CR: Chóp rễ, M: vị trí bó mạch (cắt dọc), NMK:

Nhu mô khuyết phiến lá, NMG: Nhu mô giậu phiến lá; vòng tròn chỉ vị trí mạch dẫn

phụ của lá; thanh ngang 1 mm).

Sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường ½MS, dưới tác động của NAA (3 mg/L

NAA) nhận thấy mép cắt và mô ở vị trí sát mép cắt của mẫu phiến lá phù ra, sơ khởi

rễ hình thành trên bề mặt mẫu phiến lá gần mép cắt. Ở nghiên cứu này, có hai trường

hợp khác nhau về vị trí tạo sơ khởi rễ đã được ghi nhận, một là, sơ khởi rễ hình thành

ở ngay vị trí gân phụ của mẫu cấy với các cụm tế bào đang phân chia mạnh xuất phát

từ các tế bào ở vị trí gần kề mạch (Hình 3.45A,B), hai là, sơ khởi rễ hình thành ở vị

trí không có gân phụ - cũng ghi nhận có các cụm tế bào đang phân chia mạnh nhưng

xuất phát từ các tế bào ở vị trí lục mô khuyết (Hình 3.45C,D). Ở trường hợp 1 sơ khởi

rễ hình thành từ các tế bào liên kết với mô mạch, dưới tác động của NAA, các tế bào

111

này phân chia hình thành lớp tế bào tương tự tế bào tiền tượng tầng (procambial-like

cells) đóng vai trò như tế bào gốc có nhiều tiềm năng (pluripotent stem cells) trong

phân chia, phân hóa tạo sơ khởi rễ - tương tự kết quả nuôi cấy tạo rễ từ mảnh lá

Medicago truncatula dưới tác động của auxin NAA [104], nuôi cấy tạo rễ từ mảnh lá

Orthosiphon stamineus dưới ảnh hưởng của IAA /IBA/ NAA [193] và tạo rễ từ mảnh

lá Labisia pumila dưới tác động của IBA/NAA [179]. Trước đó, Samaj và cộng sự

(1999) cũng đã kết luận các lớp tế bào thuộc bó mạch (bundle sheet cells) chịu trách

nhiệm phân chia, phân hóa tạo rễ trực tiếp ở Helianthus occidentalis [194]. Ở trường

hợp 2, theo chúng tôi, sơ khởi rễ hình thành từ mô tế bào khuyết của mô thịt lá (spongy

parenchyma/mesophyll cells) tương tự trường hợp nuôi cấy tái sinh chồi/rễ từ mảnh

lá cây African violet (Sainpaulia ionantha) dưới ảnh hưởng của BA/ IBA [103]. Tái

sinh rễ bất định ở hai trường hợp trên, theo chúng tôi, được giải thích là do các tế bào

ở vị trí gần mạch và tế bào nhu mô khuyết, dưới tác động của sự di chuyển phân cực

auxin đã được kích hoạt thay đổi lập trình di truyền dẫn đến tái sinh rễ [15].

3.3.2. Tạo rễ bất định từ chồi

3.3.2.1. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân cây vườn ươm

Bảng 3.21. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ

đốt thân cây vườn ươm, ở môi trường ½MS, 60 NSC.

Nghiệm

thức

Tỷ lệ chồi

tạo rễ (%)

Số

rễ/chồi

Chiều dài

rễ (mm)

Đặc điểm hình thái,

màu sắc rễ

ĐC 100 4,33c* 69,37c Rễ mảnh, có rễ hơi nâu, ít lông

hút, rễ nhánh dài

NAA 100 13,53a 80,00a Rễ có đường kính to, trắng,

nhiều lông hút, rễ nhánh ngắn

IBA 100 11,67b 74,56b Rễ có đường kính trung bình,

ít lông hút, rễ nhánh ngắn

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt ý nghĩa với p ≤


Các đoạn thân sau khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS có 0,5 mg/L

BA và 2 mg/L kinetin. Kết quả cho thấy, dưới tác động kích thích của BA và kinetin,

sau nuôi cấy từ 20 đến 45 ngày, chồi nách hình thành và phát triển, đến ngày thứ 60

sau cấy đạt kích thước (7 – 10 mm), xuất hiện 4 – 5 lá, có hình thái đặc trưng. Chồi

112

nách được tách ra cấy chuyển sang môi trường tạo rễ bất định, nhận thấy phần gốc

mẫu cấy tiếp xúc với môi trường phù to do sùi mô sẹo, theo chúng tôi, đây là hiện

tượng thường gặp trong nuôi cấy mô cây thân gỗ.

Các chồi in vitro được nuôi cấy tạo rễ bất định dùng môi trường ½MS có hoặc

không bổ sung 0,2 mg/L IBA/NAA. Kết quả cho thấy trên môi trường không có

NAA/IBA, rễ hình thành ít, rễ dài, có rễ màu hơi nâu, có ít lông hút, rễ nhánh dài

(Hình 3.46A,D). Ở môi trường có IBA, chồi cũng tạo nhiều rễ, có ít lông hút, rễ nhánh

ngắn (Hình 3.46B,E). Trên môi trường có NAA, chồi tạo rễ nhiều, rễ có đường kính

to, dài, màu trắng, có nhiều lông hút, rễ nhánh cũng ngắn (Hình 3.46C,F). Kết quả

(Bảng 3.19) cho thấy 100% chồi nuôi cấy ở tất cả các nghiệm thức đều tạo rễ bất

định. Số rễ của chồi ở môi trường có NAA, IBA lần lượt là 13,53 và 11,67 so với ĐC

là 4,3; chiều dài rễ tương ứng là 80 mm và 74,56 mm, theo thứ tự (so với ĐC 69,37

mm).

Hình 3.46. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc từ đốt thân, 60 NSC.

A,B,C. Cây 60 NSC ở môi trường ½MS (không có chất ĐHST); có 0,2 mg/L IBA;

có 0,2 mg/L NAA. D,E,F. Rễ hình thành dưới đáy bình tương ứng của A,B,C. G, H.

Cây hình thành ở môi trường ½MS có 0,2 mg/L IBA; 0,2 mg/L NAA. I. Cây từ phôi

vô tính (thanh ngang 20 mm).

Đến nay, đã ghi nhận được một số công bố kết quả nghiên cứu dùng chồi

(nguồn gốc từ thực địa) để tạo rễ bất định cây dược liệu, ví dụ, ngoài vật liệu mảnh

lá, đoạn thân, Martin và cộng sự (2008) còn sử dụng chồi Ophiorrhiza prostrata (30

113

– 50 mm) nuôi cấy trên môi trường đặc MS có 10,74 µM NAA và 2,32 µM kinetin

để tạo rễ, sau đó nuôi nhân thu sinh khối rễ nhằm nghiên cứu hợp chất thứ cấp

camptothecin [131]. Yusuf và cộng sự (2018) cũng đã sử dụng chồi nụ (bud)

Boesenbergia rotunda qua nuôi cấy trên môi trường đặc MS có 2 mg/L NAA để tạo

rễ - như là nguồn vật liệu dùng nghiên cứu pinostrobin [195]. Rễ bất định loài sâm

Java (Javanese ginseng) Talinum paniculatum được cảm ứng hình thành, thu thập từ

chồi nuôi cấy trên môi trường đặc MS có 10 µM IBA, 30 g/L đường nhằm mục đích

nghiên cứu sự tích lũy saponin [196].

3.3.2.2. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro

Sau cắt bỏ các lá, thân cây được cắt thành các đoạn thân mang chồi nách, do

thân cây in vitro có đường kính nhỏ, các chồi nách lại khá gần nhau nên khó cắt chính

xác các đoạn thân chỉ mang 1 chồi nách, do vậy ở ngày thứ 30 và 45 sau cấy nhận

thấy một số mẫu cấy có 2 chồi phát triển. Sau nuôi cấy 60 ngày, các chồi được tách

ra cấy sang môi trường tạo rễ bất định, nhận thấy thân chồi có đường kính nhỏ hơn

thân chồi từ cây vườn ươm, phần thân trong môi trường nuôi cấy phù ra, mô sẹo hình

thành nhưng ít hơn so với mẫu cấy cây vườn ươm, có thể do cây in vitro ở trạng thái

“trẻ” hơn vì đã được nuôi cấy trong thời gian khá dài ở điều kiện in vitro.

Bảng 3.22. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây

in vitro, ở môi trường ½MS, 60 NSC.

Nghiệm

thức

Tỷ lệ chồi

tạo rễ (%)

Số

rễ/chồi

Chiều

dài rễ

(mm)


màu sắc rễ

ĐC 100 3,84c* 52,20c Rễ mảnh, dài, trắng, ít lông hút,

rễ nhánh dài

NAA 100 12,65a 64,45a Rễ có đường kính to, dài, trắng,

nhiều lông hút, rễ nhánh ngắn

IBA 100 10,47b 62,20b Rễ có đường kính trung bình, dài,

trắng, ít lông hút, rễ nhánh ngắn

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt ý nghĩa với p

≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Tương tự trường hợp tạo rễ từ chồi có nguồn gốc cây vườn ươm, kết quả tạo

rễ cho thấy trên môi trường không có NAA/IBA (ĐC), rễ hình thành ít, rễ dài, ít lông

114

hút, rễ nhánh dài. Trên môi trường có IBA, chồi tạo nhiều rễ, rễ dài, ít lông hút, rễ

nhánh ngắn (Hình 3.47B); trên môi trường có NAA, chồi tạo nhiều rễ, rễ có đường

kính to, rễ dài, nhiều lông hút, rễ cũng ít phân nhánh (Hình 3.47C). Bảng 3.20 cho

thấy 100% chồi nuôi cấy ở tất cả các nghiệm thức đều tạo rễ bất định. Số rễ của chồi

ở môi trường có NAA, IBA lần lượt là 12,65 và 10,47 so với ĐC là 3,84; chiều dài rễ

tương ứng là 64,45 mm và 62,20 mm, theo thứ tự (so với ĐC 52,20 mm). Nhận thấy

số rễ, chiều dài rễ của chồi ở trường hợp này ít hơn, ngắn hơn so với rễ của chồi từ

cây vườn ươm có thể do đường kính chồi từ cây in vitro nhỏ hơn – ảnh hưởng đến

khả năng tạo rễ bất định.

Hình 3.47. Tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây in vitro, ở môi trường ½MS, 60 NSC

A. Thân cây in vitro cắt bỏ lá (vạch vàng vị trí cắt) B. Vật liệu tạo chồi nách C,D,E.

Chồi nách phát triển ở 30 NSC, 40 NSC, 60 NSC (thanh ngang trắng 3 – 4 mm) F,G.

Cây hình thành trên môi trường ½MS có 0,2 mg/L IBA; 0,2 mg/L NAA ở 60 NSC

(thanh ngang 20 mm).

Cây/chồi in vitro là vật liệu tiền đề rất thuận lợi trong thực hiện thí nghiệm vì

đây là nguồn mẫu sẵn ở trạng thái vô trùng, có thể thu các loại vật liệu khác nhau như

chồi ngọn/chồi nách, lá, thân, rễ dùng trực tiếp trong nhiều nghiên cứu khác nhau về

nhân giống, sự tích lũy hợp chất thứ cấp. Các chồi, có nguồn gốc chồi nách cây in

vitro Ophiorrhiza mungos qua nuôi cấy trên môi trường MS có 0,25 mg/L BA và 025

mg/L kinetin, tạo rễ bất định (trên môi trường ½MS có 100 mg/L than hoạt tính)

thành cây hoàn chỉnh được sử dụng trong nghiên cứu hợp chất thứ cấp kháng ung thư

camptothecin [197].

115

3.3.2.3. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính

Cây con từ phôi vô tính (Hình 3.48A), sau khi cắt bỏ phần rễ trụ, phần thân

mang các lá được cấy vào môi trường ½MS có chứa 0,1 mg/L NAA/IBA để tạo rễ

bất định. Sau 40 ngày nuôi cấy, trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng

(NAA/IBA), chồi tạo rễ khá tốt, rễ ít lông hút, có số rễ/chồi là 3,13 với chiều dài rễ

trung bình là 25,67 mm (Hình 3.48B); môi trường nuôi cấy có 0,1 mg/L IBA, rễ dài,

ít lông hút, có rễ nhánh; môi trường có 0,1 mg/L NAA rễ hình thành nhiều, cũng có

hình thành rễ nhánh, nhưng rễ có nhiều lông hút đây là sự khác biệt khác biệt so với

rễ hình thành ở môi trường có IBA, (Hình 3.48C,D). Như vậy, ở môi trường tạo rễ có

bổ sung NAA/IBA hoặc không có chất ĐHST có ảnh hưởng khác biệt lên sự tạo rễ,

NAA hiệu quả hơn IBA.

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của NAA và IBA đến sự tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc

phôi vô tính, môi trường ½MS, 30 NSC.

Nghiệm

thức

Tỷ lệ chồi

tạo rễ (%)

Số

rễ/chồi

Chiều dài

rễ (mm)


màu sắc rễ

ĐC 100 3,13c* 25,67b Rễ dài, trắng, ít lông hút, không có

rễ nhánh

IBA 100 4,37a 37,67a Rễ dài, trắng, ít lông hút, có rễ

nhánh

NAA 100 6,33b 39,78b Rễ dài, trắng, nhiều lông hút, gốc

rễ to, có rễ nhánh

*Các chữ cái khác nhau trong một cột thể hiện sự khác biệt ý nghĩa với p ≤


Phôi nói chung, phôi vô tính hoặc phôi hạt nói riêng và dạng phát triển tiếp

theo của chúng (cây con) cũng là nguồn vật liệu được các nhà nghiên cứu sử dụng

trong một số trường hợp, ví dụ như trường hợp tạo phôi vô tính từ nuôi cấy mảnh lá

mầm phôi hạt sâm Mỹ Panax quinquefolius trên môi trường MS có 50 g/L đường,

tạo rễ trụ thành cây hoàn chỉnh trên môi trường 1/3SH, có bổ sung 0,25 mg/L NAA,

1% sucrose với mục đích nhân giống [36]. Baskaran và Jayabalan (2009) đã dùng

đoạn mô trụ dưới lá mầm (10 mm) cây từ phôi hạt Psoralea coryfolia (10 ngày tuổi)

nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 4 µM IAA, NAA để tạo rễ bất định và sau

116

đó rễ bất định được nuôi nhân thu sinh khối trong môi trường ½MS có 3 µM IBA

dùng nghiên cứu hàm lượng psoralen [198].

Hình 3.48. Tạo rễ bất định từ chồi có nguồn gốc phôi vô tính, ở môi trường ½MS,

30 NSC.

A. Vật liệu tạo rễ bất định. Rễ bất định hình thành ở môi trường không có chất điều

hòa sinh trưởng (B); có 0,1 mg/L IBA (C); 0,1 mg/L NAA (D), (thanh ngang 10mm).

Như vậy, ở NGBCC, chồi cũng là vật liệu khá thuận lợi trong tạo rễ bất định

và NAA là tác nhân rất thích hợp trong kích thích tạo rễ từ chồi. Kết quả tác động của

NAA trong nghiên cứu này phù hợp với kết quả đáp ứng tích cực đối với tạo rễ của

mô lá trong điều kiện nuôi cấy có NAA như đã trình bày ở trên. Sự tác động của chất

điều hòa sinh trưởng thực vật lên mô lá, mô thân có sự khác biệt rất rõ nét, với mô lá

hoàn toàn không có biểu hiện cảm ứng với IBA ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1; 2; 3;

4; 5 mg/L trên các môi trường nuôi cấy cơ bản là MS; ½MS; B5; SH. Nhưng với các

thí nghiệm sử dụng vật liệu chồi, IBA có tác động gây cảm ứng tạo rễ bất định trên

môi trường có ½MS. Điều đó chứng tỏ rằng, sự tác động của mỗi loại chất điều hòa

sinh trưởng là khác nhau và trên từng loại mô là khác nhau. Đồng thời, vật liệu mô lá

cho kết quả tạo rễ hiệu quả hơn so với vật liệu từ chồi, do vậy, chỉ rễ bất định từ mô

lá mới được sử dụng trong nhân rễ.

Akhami và cộng sự (2013) [101] đã ghi nhận hiện tượng IAA tăng lên ở vị trí

gốc đoạn thân mang chồi Petunia hybrida (trồng trong khay nhựa) ở thời điểm 2 h và

24 h sau cắt đoạn và kết luận sự phát sinh rễ bất định phụ thuộc vào đỉnh IAA ở thời

điểm 24 h và sự di chuyển phân cực của auxin - cảm ứng sự phân chia đầu tiên của

tế bào meristem dẫn đến tạo sơ khởi rễ, IAA giảm xuống sau thời điểm 24 h tạo thuận

lợi cho quá trình phát triển tiếp theo của rễ. Guan và cộng sự (2019) [101] cho rằng

rễ bất định ở đoạn thân mang chồi 2 dòng cà chua (dòng Alisa Craig và dòng chuyển

gen DR5pro:YFP trans, nuôi trong dung dịch dinh dưỡng Hoagland) bắt nguồn từ tế

117

bào vùng trụ bì (pericycle) ở gốc đoạn thân – kết quả tác động của mức auxin tăng

lên trong vòng 1 h sau cắt đoạn. Có sự phân bố auxin gia tăng ở pha khởi tạo rễ, tập

trung ở mô phân sinh đang phát triển. Tương tự, Guan và cộng sự (2020) [13] cho

rằng sự hình thành rễ bất định ở đoạn thân táo lùn Malus domestica bắt đầu bằng sự

phân chia và kéo dài của các tế bào tượng tầng, ở vị trí gần kề hai bó mạch; quá trình

này xảy ra ở điều kiện có mức tương đối cao của IAA trong mô.

Ở tạo rễ bất định từ chồi đốt thân cây vườn ươm/cây in vitro và từ chồi có

nguồn gốc phôi vô tính NGBCC, theo chúng tôi, cũng có cơ chế sinh lý tạo rễ tương

tự như ở kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên với hai hệ thống vận chuyển

auxin riêng biệt nhưng có liên kết với nhau tương tự như: Hệ thống 1: Vận chuyển

auxin nhanh, không định hướng trong mô li-be cùng với sản phẩm quang hợp, và hệ

thống 2: Vận chuyển phân cực của auxin từ tế bào này sang tế bào khác dẫn đến sự

phân phối auxin không cân xứng, chậm, cần năng lượng, và có định hướng. Hệ thống

vận chuyển auxin trong mô li-be cung cấp auxin từ các vị trí tổng hợp (chủ yếu là ở

lá non) cho các cơ quan nhận; còn sự vận chuyển phân cực phân phối auxin một cách

chính xác cho tế bào, điều này cực kỳ quan trọng đối với sự hình thành ‘cực đại auxin

cục bộ’ (local auxin maxima), xảy ra chủ yếu trong các mô đang phát triển mạnh dẫn

đến kết quả tạo rễ bất định.

3.4. Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng

3.4.1. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ

Ở thí nghiệm này, các rễ sơ cấp đơn (20 ngày tuổi, có nguồn gốc từ nuôi cấy

mảnh lá) sử dụng làm vật liệu nuôi cấy (Hình 3.49)

Hình 3.49. Vật liệu rễ bất định sơ cấp ở 20 NSC

A. Rễ đơn; B. Cụm 2 rễ; C. Cụm 3 rễ; D. Cụm 4 rễ (vạch ngang và dọc chỉ vị trí cắt

thu rễ đơn, thanh ngang 1 cm).

118

Bảng 3.24. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến sự phân nhánh rễ, ở môi trường ½MS, 21

NSC.

Nồng độ

(mg/L)

Chiều dài

RSC

(mm)

Số RN

cấp 1

Chiều dài

RN cấp 1

(mm)

Số

RN

cấp 2

Đặc điểm hình thái, màu sắc rễ

NAA 1 18,20 d* 10,36b 3,40c 0,20c RN cấp 1 to, ngắn; đầu tròn, có

lông hút, rễ màu trắng xám.

2 19,72c 12,44a 3,90b 7,20b RN cấp 1 to, ngắn; đầu tròn, có

lông hút, rễ màu trắng xám. Có sự

hình thành RN cấp 2.

3 20,11c 12,95a 4,20a 7,33a RN cấp 1 to, ngắn; đầu tròn, có

lông hút; gốc, thân rễ sơ cấp và

đầu RN bị phù, rễ màu trắng xám.

Có sự hình thành RN cấp 2.

IBA 1 15,33e 2,62e 2,00e 0,10e RN cấp 1 nhỏ, dài; đầu RN thon,

không có lông hút, rễ màu hơi

vàng.

2 21,11b 4,43d 3,00d 3,33d RN cấp 1 nhỏ, dài, không có lông

hút, rễ màu hơi vàng. Có sự hình

thành RN cấp 2

3 22,43a 5,20c 3,00d 3,60c RN cấp 1 nhỏ, dài, không có lông

hút; gốc và thân rễ sơ cấp bị phù,

rễ hơi vàng. Hình thành RN cấp 2


mức p ≤ 0,05 trong phép thử Duncan.

Kết quả (Bảng 3.22) cho thấy, nói chung rễ trong môi trường không bổ sung

NAA/IBA (đối chứng) không có khả năng phân nhánh (do vậy không đưa số liệu và

bảng), rễ nhánh trong môi trường có bổ sung NAA hình thành tốt hơn so với rễ trong

môi trường có IBA ở cả ba chỉ tiêu là số rễ nhánh cấp 1, cấp 2 và chiều dài rễ nhánh

cấp 1 ở 20 NSC. Lông hút rễ bị thoái hóa trong môi trường có IBA. Ở môi trường có

3 mg/L NAA, số rễ nhánh cấp 1 là cao nhất - 12,95 so với số rễ trong hai môi trường

có 1 mg/L, 2 mg/L NAA lần lượt là l0,36; 12,44. Đối với hai chỉ tiêu số RN cấp 1 và

119

cấp 2, các giá trị ghi nhận được ở hai nghiệm thức 2 mg/L và 3 mg/L là tương đương

nhau. Ở các nghiệm thức IBA, số RN cấp 1 ở nghiệm thức 3 mg/L là cao nhất – 5,20.

Tuy nhiên, thực tế cho thấy rễ trong môi trường có NAA và IBA với 3 mg/L đều có

hiện tượng phù ở gốc rễ (Hình 3.50C,H); riêng ở trường hợp 3 mg/L NAA, cũng ghi

nhận được hiện tượng phù ở các đầu rễ (Hình 3.50C). Do vậy, nồng độ 2 mg/L

NAA/IBA được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thời gian nuôi lâu hơn, 30

NSC và 45 NSC, ở cả hai nghiệm thức NAA/IBA (2 mg/L), rễ phân nhánh nhiều hơn

(Hình 3. 50D,I) và bước đầu hình thành dạng rễ cụm (Hình 3.50E,J), theo thứ tự.

Hình 3.50. Ảnh hưởng của NAA, IBA đến hình thành rễ nhánh từ rễ đơn, ở môi

trường lỏng ½MS.

A,B,C. Hình thành rễ nhánh ở môi trường có 1, 2, 3 mg/L NAA, ở 20 NSC; D. Rễ

nhánh dài ở môi trường có 2 mg/L NAA, 30 NSC; E. Cụm rễ nhỏ hình thành ở môi

trường có 2 mg/L NAA, 40 NSC; F,G,H. Hình thành rễ nhánh ở môi trường có 1, 2,

3 mg/L IBA, NSC; I. Rễ nhánh dài ở môi trường có 2 mg/L IBA, 30 NSC; J. Cụm rễ

nhỏ hình thành ở môi trường có 2 mg/L IBA, 45 NSC (Mũi tên chỉ lên: RN cấp 1,

mũi tên chỉ ngang: RN cấp 2, thanh ngang 0,5 cm).

Quá trình phân nhánh dẫn đến tăng trưởng sinh khối trong môi trường có

NAA/IBA tạo thành cụm rễ to (Hình 3.51 A,B,C,D,E,F). Các cụm rễ to tiếp theo được

nhân lên trong cùng môi trường nhằm thu vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình

3.51G,H).

120

Hình 3.51. Rễ tăng trưởng sinh khối liên tục qua quá trình phân nhánh của rễ đơn.

A,B. Bình rễ sơ cấp nuôi trong môi trường có 2 mg/L NAA, 2 mg/L IBA, 20 NSC

(thanh ngang 2 cm); C,D. Rễ đơn phân nhánh tạo cụm, sau cấy chuyền, 30 NSC,

(thanh ngang 1 cm); E,F. Cụm rễ to, sau cấy chuyển, 60 NSC (thanh ngang 2 cm);

G,H. Rễ được nhân sinh khối, sau cấy chuyền, 60 NSC (thanh ngang 2 cm).

Trong nuôi cấy in vitro, khả năng nhân rễ bất định phụ thuộc vào việc bổ sung

auxin (loại và nồng độ) vào môi trường nuôi cấy [98] trong đó các auxin như IBA và

NAA được sử dụng phổ biến ở dạng riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau; ngoài ra, nhân

rễ còn phụ thuộc vào yếu tố quan trọng khác là họ/ loài thực vật nghiên cứu [198].

Tác động lắc cơ học tạo điều kiện cho mô hấp thu chất ĐHST, chất dinh dưỡng,

nước,… đồng đều (không tạo gradient phân bố), trao đổi khí đều hơn, khác với trường

hợp mô nuôi cấy trên môi trường đặc [142]. Đáp ứng phân nhánh của rễ trong nuôi

cấy mang tính quyết định đối với tăng trưởng sinh khối [184]. Hiện tượng phù ở gốc

rễ hoặc/và đầu rễ trong trường hợp dùng NAA, IBA với nồng độ 3 mg/L ở nghiên

cứu này, theo chúng tôi, sẽ dẫn đến giảm năng suất sinh khối rễ tương tự như kết quả

ghi nhận được ở nuôi lỏng rễ Cichorium intybus [184]. NAA được ghi nhận là thích

hợp trong kích thích phân nhánh rễ đối với khá nhiều loài cây dược liệu như

Andrographis paniculata [199], Eurycoma longifolia [181]. NAA 1 mg/L, 2 mg/L là

các nồng độ tối ưu cho nhân rễ Fagonia indica [200], rễ Boesenbergia rotunda [195],

theo thứ tự. IBA cũng rất thích hợp cho nuôi cấy rễ bất định; nhận thấy 2 mg/L IBA

là nồng độ tối ưu cho phát triển sinh khối rễ khá nhiều loài cây dược liệu như Vernonia

amygdalina [185]. Ở NGBCC, kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này phù hợp với kết

quả công bố của một số tác giả đã sử dụng 2 mg/L NAA/IBA như đã nêu trên để nhân

rễ thông qua hiện tượng tạo rễ nhánh.

121

3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ

Kết quả (Bảng 3.25) cho thấy trong môi trường có NAA, khối lượng tươi rễ

rễ đạt giá trị cao 2,10 g; 2,16 g lần lượt ở hai nghiệm thức có 30 g/L; 40 g/L sucrose;

hệ số nhân tương ứng là 7,00 và 7,20; tuy nhiên các giá trị sinh khối và hệ số nhân

giữa hai nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Khối lượng

rễ, hệ số nhân thấp nhất lần lượt là 1,62 g; 5,40 ở nghiệm thức 20 g/L sucrose. Tương

tự ở môi trường có IBA, khối lượng tươi đạt 1,80 g; 1,86 g lần lượt ở hai nghiệm thức

30 g/L, 40 g/L sucrose; hệ số nhân tương ứng là 6,00; 6,21 – cao hơn so với nghiệm

thức 30 g/L sucrose (1,45 g; 4,85). Do vậy, 30 g/L sucrose được sử dụng cho các

nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ, ở môi

trường ½MS, 30 NSC.

Chất

ĐHST

Nồng độ

sucrose

(g/L)

KLT rễ

thu nhận

(g)

Hệ số

nhân sinh

khối (lần)

Đặc điểm hình thái, màu sắc rễ,

cụm rễ

NAA 20 1,62c* 5,40c Rễ nhỏ, có lông hút; cụm rễ màu

trắng xám, mềm

30 2,10a 7,00a Rễ to, có lông hút; cụm rễ màu

trắng xám, mềm

40 2,16a 7,20a Rễ to, có lông hút; cụm rễ màu

trắng xám, mềm

IBA 20 1,45d 4,83d Rễ nhỏ, không có lông hút; cụm

rễ màu hơi vàng đục, cứng

30 1,80b 6,00b Rễ to, không có lông hút; cụm rễ

màu hơi vàng đục, cứng

40 1,86b 6,20b Rễ to, không có lông hút; cụm rễ

màu hơi vàng đục, cứng



Có sự khác biệt về hình thái, màu sắc rễ/cụm rễ nuôi trong môi trường có NAA,

IBA. Nói chung, ở cả hai trường hợp môi trường có NAA, IBA với nồng độ sucrose

cao (30 - 40 g/L), sợi rễ to so với rễ ở môi trường có 20 g/L sucrose. Như đã nêu ở

122

trên, rễ ở môi trường bổ sung NAA có nhiều lông hút ở phần đầu rễ; ngược lại, lông

hút rễ khó quan sát ở môi trường có IBA; cụm rễ ở môi trường bổ sung NAA có màu

trắng xám, cụm rễ ở môi trường chứa IBA có màu hơi vàng đục (Hình 3.52).

Hình 3.52. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến tăng trưởng sinh khối rễ ở môi

trường ½MS, 30 NSC.

A,B,C. Cụm rễ nuôi ở môi trường ½MS bổ sung 2 mg/L NAA, có sucrose 20, 30, 40

g/L; D,E,F. Cụm rễ nuôi ở môi trường bổ sung 2 mg/L IBA, có sucrose 20, 30, 40

g/L. Thanh ngang 2 cm.

Ngoài môi trường khoáng và chất ĐHST, sự tăng trưởng của rễ bất định còn

chịu ảnh hưởng của đường - nguồn carbon quan trọng trong trao đổi chất nhằm tăng

sinh khối thông qua sự hình thành rễ nhánh và nồng độ sử dụng thích hợp tùy thuộc

vào loài thực vật. Theo nhiều tài liệu, nồng độ đường sử dụng dao động từ 20 - 50

g/L, trường hợp cao hơn thường tạo áp suất thẩm thấu bất lợi cho tăng trưởng rễ [100].

Nồng độ đường 20 g/L là tối ưu đối với nuôi rễ Gynura procumbens [182], 30 g/L

thích hợp cho nuôi rễ khá nhiều loài thực vật như Hypericum perporatum [100]. Nồng

độ đường sucrose khá cao (50 g/L) lại thích hợp cho nuôi lỏng rễ bất định Eurycoma

longifolia [181], rễ Boesenbergia rotunda [195]. Rễ NGBCC tăng trưởng tốt trong

môi trường có 30 g/L sucrose - phù hợp với kết quả công bố của một số tác giả trên.

Ngoài ra, nồng độ đường khác nhau còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp hợp chất thứ

cấp đối với cây dược liệu [98], do vậy kết quả này cũng tạo tiền đề cho nghiên cứu

tiếp theo về hợp chất thứ cấp ở rễ NGBCC.

123

3.4.3. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối của rễ

Kết quả (Bảng 3.26, Hình 3.53) cho thấy trong môi trường có 2 mg/L NAA, ở

nghiệm thức cấy 2% (w/v) rễ đạt hệ số nhân sinh khối cao nhất (9,96) so với các

nghiệm thức cấy 0,5%, 1% và 3% (hệ số nhân tương ứng là 6,74; 8,13 và 9,15). Ở

nghiệm thức 3% tuy thu được khối lượng tươi rễ cao nhất (19,22 g) nhưng hệ số nhân

thấp hơn so với nghiệm thức cấy 2%. Tương tự, trong môi trường có 2 mg/L IBA,

kết quả cũng cho thấy hệ số nhân sinh khối rễ đạt cao nhất ở trường hợp cấy 2% (khối

lượng tươi rễ và hệ số nhân sinh khối lần lượt là 12,85 g và 9,18) so với các trường

hợp còn lại.

Bảng 3.26. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối rễ, ở


Chất

ĐHST

KLR nuôi

cấy ban đầu

(g)

KLT rễ

thu nhận

(g)

Hệ số

nhân sinh

khối (lần)

Đặc điểm hình thái, màu sắc rễ,

cụm rễ

NAA 0,35 (0,5%) 2,36g* 6,74g Rễ dài, có lông hút; cụm rễ màu

trắng xám, mềm

0,70 (1%) 5,69e 8,13e Rễ dài, có lông hút; cụm rễ màu

trắng xám, mềm

1,40 (2%) 13,95c 9,96a Rễ dài, có lông hút; cụm rễ màu

trắng xám, mềm

2,10 (3%) 19,22a 9,15c Rễ dài, có lông hút, cụm rễ màu

trắng xám, mềm

IBA 0,35 (0,5%) 2,22g 6,34g Rễ ngắn, không có lông hút;

cụm rễ màu hơi vàng đục, cứng

0,70 (1%) 5,16f 7,37f Rễ ngắn, không có lông hút;


1,40 (2%) 12,85d 9,18b Rễ ngắn, không có lông hút;


2,10 (3%) 18,03b 8,58d Rễ ngắn, không có lông hút;




124

Hình 3.53. Ảnh hưởng của khối lượng rễ nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối rễ, ở


A,B,C,D. Khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu 0,5%, 1%, 2%, 3% trong môi trường có 2

mg/L NAA; E,F,G,H. Khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu 0,5%, 1%, 2%, 3%, trong môi

trường có 2 mg/L IBA. Thanh ngang 2 cm.

Khối lượng rễ ban đầu dùng nuôi cấy (inoculum density/size) là yếu tố quan

trọng ảnh hưởng đến chỉ số tăng trưởng (growth index) của vật liệu nuôi cấy, chỉ số

tăng trưởng giảm ở trường hợp dùng khối lượng rễ cao không phù hợp [201]. Ngoài

ra, khối lượng rễ cấy còn ảnh hưởng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong điều kiện

nuôi cấy nhất định [202]. Đối với nuôi lỏng lắc, khối lượng rễ sử dụng thường dao

động từ 0,1% đến 5% (w/v) tùy thuộc vào loài thực vật nghiên cứu. Cụ thể khối lượng

rễ 0,1% là thích hợp để nuôi rễ Mondia whitei [198], 1% cho nuôi rễ cây dược liệu

Echinacea angustifolia [202]; 1,6% đối với rễ sâm Panax ginseng [203], khối lượng

rễ 2% là tốt nhất đối với nuôi rễ Panax ginseng, Gynura procumbens, theo thứ tự

[182]. Nhưng ở trường hợp Curcuma amada, rễ đạt tỷ lệ tăng trưởng sinh khối cao

nhất khi được nuôi cấy với khối lượng rễ nuôi cấy cao là 5% [93]. Kết quả khối lượng

rễ 2% là thích hợp đối với nhân rễ NGBCC và cũng phù hợp với kết luận về thông số

nuôi cấy này của một số tác giả đã nêu ở trên.

3.4.4. Khảo sát diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ theo thời gian

Kết quả (Biểu đồ 3.1, Hình 3.54) cho thấy rễ nuôi trong môi trường NAA tăng

sinh khối chậm ở giai đoạn 7 NSC (sinh khối đạt 2,62 g, hệ số nhân 1,87), tăng trưởng

rất nhanh ở ba giai đoạn 21, 28 và 35 NSC, khối lượng tươi rễ đạt lần lượt 7,90 g;

13,92 g và 17,42 g; hệ số nhân tương ứng là 5,64; 9,94 và 12,44. Ở các thời điểm 42

và 49 NSC, rễ đạt giá trị khối lượng tối đa lần lượt là 18,26 g và 18,47 g, tuy nhiên

khối lượng tươi rễ ở thời điểm 49 NSC khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê

125

so với khối lượng tươi rễ thu nhận ở 42 NSC (do đã ở thời kỳ ổn định); ngoài ra, nhận

thấy ở giai đoạn 49 NSC, một số rễ có hiện tượng hóa nâu (Hình 3.55) có thể do hàm

lượng dinh dưỡng môi trường đã giảm nhiều. Tương tự, rễ nuôi trong môi trường IBA

cũng có xu hướng tăng sinh khối rất nhanh ở 28 NSC và đạt mức tối đa ở 42 NSC

(Hình 3.54G,H) (khối lượng tươi rễ lần lượt là 12,83 g và 16,91 g; hệ số nhân tương

ứng là 9,16 và 12,08), đến giai đoạn 49 NSC nhận thấy khối lượng rễ tươi thu nhận

được không có sự khác biệt về mặt thống kê so với thời điểm 42 NSC. Rễ nuôi trong

môi trường có NAA phát triển nhanh hơn về khối lượng ở từng thời điểm và từng

nồng độ so với rễ trong môi trường có IBA (Hình 3.54G,H).

Biểu đồ 3.1. Diễn biến tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian, 7 – 49 NSC.

Nhằm thu sinh khối ở mức tối ưu dùng cho các mục đích khác nhau, đối với

bất kỳ hệ thống nuôi cấy (lỏng lắc, bioreactor) và vật liệu nuôi cấy nào (tế bào, phôi,

rễ,..), khảo sát động học tăng trưởng theo thời gian của vật liệu nuôi cấy là yêu cầu

quan trọng. Trong điều kiện nuôi lỏng lắc, nhiều tài liệu cho thấy giai đoạn rễ đạt giá

trị khối lượng tối đa ở một thời điểm nuôi cấy nhất định tùy thuộc vào loài thực vật,

cụ thể Ahmad và cộng sự (2020) ghi nhận 3 pha tăng trưởng của rễ bao gồm pha mở

đầu (7 – 9 ngày), pha tăng trưởng rất nhanh (12 - 27 ngày) và đạt mức ổn định từ 27

2.62k

5.13i

7.90g

13.92e

17.42b

18.26a 18.47a

2.18l

4.52j

7.15h

12.83f

16.12d

16.91c 17.07bc

1.87k

3.66i

5.64g

9.94e

12.44b13.04a 13.19a

1.56l

3.23j

5.11h

9.16f

11.50d12.08c 12.19bc

0.00

4.00

8.00

12.00

16.00

20.00

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

14.00

16.00

18.00

20.00

7 14 21 28 35 42 49

Hệ

số n

hân

sin

h k

hố

i (l

ần)

Khố

i lư

ợng r

ễ th

u n

hận

(g)

Thời gian (ngày)

Khối lượng rễ thu nhận (NAA) Khối lượng rễ thu nhận (IBA)

Hệ số nhân sinh khối (NAA) Hệ số nhân sinh khối (IBA)

126

– 30 ngày qua nghiên cứu nuôi rễ bất định Stevia rebaudiana [204]; cũng qua nghiên

cứu sự phát triển sinh khối theo thời gian (từ 7 – 49 ngày) của rễ bất định Prunella

vulgaris, Fazal và cộng sự (2014) cho thấy khối lượng tươi rễ đạt mức cao nhất chỉ

sau 21 ngày nuôi [196]. Sinh khối rễ Psoralea corylifolia đạt mức tối đa sau 4 tuần

nuôi cấy [198]; cần 5 tuần đối với rễ Panax notoginseng [44], Vernonia amygdalina

[185], 6 tuần đối với rễ chicory (Cichorium intybus) tuy nhiên, rễ Cichorium intybus

mất dần khả năng tạo rễ nhánh khi duy trì nuôi cấy dài hạn [184].

Hình 3.54. Tăng trưởng sinh khối rễ bất định theo thời gian.

A,B. Sinh khối rễ trong môi trường có 2 mg/L NAA ở 14 NSC, 21 NSC; C,D. Sinh

khối rễ trong môi trường có 2 mg/L NAA ở 28 NSC, 35 NSC; E,F. Sinh khối rễ trong

môi trường có 2 mg/L NAA ở 42 NSC, 49 NSC; G,H. Sinh khối rễ trong môi trường

có 2 mg/L IBA ở 28 NSC, 42 NSC, theo thứ tự (thanh ngang 2 cm).

Nói chung, rễ NGBCC đã thể hiện các pha tăng trưởng trong nuôi cấy như pha

mở đầu, tăng trưởng rất nhanh, pha ổn định và cần thời lượng 5 – 6 tuần để đạt mức

khối lượng tươi rễ cao nhất (Biểu đồ 3.1) - phù hợp với nghiên cứu nuôi rễ của một

số tác giả nêu trên. Qua nuôi cấy dài hạn rễ NGBCC, không ghi nhận được trường

hợp hóa thuỷ tinh thể dẫn đến mô ở trạng thái bị ‘trong’, có thể hoại tử sau đó – hiện

tượng sinh lý thường gặp ở nuôi cấy mẫu ngập một phần/toàn phần (thường là chồi)

trong môi trường lỏng [205]; cũng nhận thấy rễ không giảm khả năng phát sinh rễ thứ

cấp, tạo tiền đề thuận lợi cho thử nghiệm nuôi nhân rễ ở quy mô lớn hơn.

127

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Trên cơ sở ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, lần đầu

tiên trên đối tượng NGBCC, đã xác định được:

Sự phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mô lá hiệu quả nhất ở môi trường đặc SH

có bổ sung 5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10% nước dừa; điều kiện

chiếu sáng 4.000 lux. Phát sinh phôi gián tiếp qua mô sẹo mảnh lá ở môi trường đặc

SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 30 g/L sucrose.

Môi trường nuôi cấy lỏng SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L

sucrose, 10% nước dừa ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux là tối ưu cho sự phát sinh

phôi thứ cấp, với khối lượng phôi nuôi cấy 2% và kích thước phôi nuôi cấy ~ 10 mm

là hiệu quả nhất. Phôi thứ cấp hình thành trong môi trường lỏng lắc hiệu quả hơn so

với môi trường đặc.

Sự tăng trưởng của cây con từ phôi vô tính hiệu quả nhất ở môi trường ½MS

(20 g/L sucrose), cây con sinh trưởng bình thường ở điều kiện ex vitro.

Rễ bất định phát sinh trực tiếp từ mô lá hiệu quả cao nhất trên môi trường đặc

½MS có bổ sung 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, điều kiện chiếu sáng 4.000 lux.

Thu nhận sinh khối rễ bất định thông qua sự tạo rễ thứ cấp bằng phương pháp

nuôi lỏng lắc trong môi trường ½MS có bổ sung 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; khối

lượng rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% đạt hiệu quả cao nhất.

Rễ bất định phát sinh từ chồi đốt thân (cây vườn ươm/in vitro) nuôi cấy trên

môi trường thích hợp ½MS có 0,2 mg/L NAA có 20 g/L sucrose. Chồi có nguồn gốc

phôi vô tính tạo rễ hiệu quả qua nuôi cấy trên môi trường đặc ½MS có 0,1 mg/L NAA

(20 g/L sucrose).

Khảo sát hình thái giải phẫu phôi vô tính (ở các giai đoạn phát triển khác nhau)

và rễ bất định bằng phương pháp nhuộm kép đã được thực hiện có kết quả.

Các kết quả nghiên cứu trên góp phần phát triển hướng nghiên cứu về cơ sở

sinh lý của tính toàn thế của tế bào thực vật nói chung, ở đối tượng Schefflera

octophylla nói riêng.

128

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu nuôi nhân phôi vô tính, rễ bất định ở quy mô lớn bằng hệ thống

bioreactor.

Sử dụng sản phẩm sinh khối phôi vô tính (từ kết quả nhân phôi theo cơ chế tạo

phôi thứ cấp), rễ bất định trong nghiên cứu nhân giống, thu nhận các hợp chất thứ cấp

phục vụ lĩnh vực y dược/mỹ phẩm và trong một số nghiên cứu quan trọng khác như

bảo quản nguồn gen, biến nạp gen,...

129

DANH MỤC CÔNG TRÌNH

1. Huỳnh Thị Lũy, Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ, Tạo phôi vô tính trực tiếp

từ nuôi cấy in vitro mô lá cây Ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla (Lour.)

Harms, Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, TP. HCM, 2019, 405-410.

2. Huỳnh Thị Lũy, Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ, Tạo rễ bất định trực tiếp từ

mô lá cây Ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla (Lour.) Harms nuôi cấy in

vitro, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2021, 19(3), 495-507.

3. Huỳnh Thị Lũy, Nguyễn Hữu Hổ, Bùi Văn Lệ, Nhân rễ bất định cây Ngũ

gia bì chân chim Schefflera octophylla (Lour.) Harms bằng phương pháp nuôi lỏng

lắc, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2021, 6(3), 12-20.

130

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lã Đình Mỡi, Châu Văn Minh, Trần Văn Sung, Phạm Quốc Long, Phan Văn

Kiệm, Trần Huy Thái, Trần Minh Hợi, Ninh Khắc Bản, Lê Mai Hương, Họ

Nhân sâm (Araliaceae Juss.) - Nguồn hoạt chất sinh học đa dạng và đầy triển

vọng ở Việt Nam, Tuyển tập Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 5 về Sinh thái

và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,

2013, 1152-1158.

2. J. Kitajima, M. Shindo, Y. Tanaka, Two new triterpenoid sulfates from the

leaves of Schefflera octophylla, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 1990, 38(3),

714-716.

3. Y.L. Li, D.X. Shi, M.L. Wang, Tissue culture and rapid propagation of

Schefflera octophylla, Plant Physiology Communications, 2004, 40(2), 193.

4. Y.L. Li, P.P. But, V.E.C. Ooi, Antiviral activity and mode of action of

caffeoylquinic acids from Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, Antiviral

Research, 2005, 68(1), 1-9.

5. Y.L. Li, R.W. Jiang, L.M.S. Ooi, P.P.H. But , V.E.C. Ooi, Antiviral

triterpenoids from the medicinal plant Schefflera heptaphylla. Phytother

Research, 2007, 21(5), 466-470.

6. Y.L. Li, C.M. Yeung, L.C.M. Chiu, Y.Z. Cen, V.E.C. Ooi, Chemical

composition and antiproliferative activity of essential oil from the leaves of a

medicinal herb, Schefflera heptaphylla, Phytother Research, 2009, 23(1), 140-

142.

7. Y.F. Chen, S.H. Tao, F.L. Zeng, L.W. Xie, Z.B. Shen, Antinociceptive and anti-

inflammatory activities of Schefflera octophylla extracts, Journal

Ethnopharmacology, 2015, 171, 42-50.

8. X. Liu, Y. Niu, J. Liu, R. Xu, M. Shi, W. Kang, Efficient extraction of anti-

inflammatory active ingredients from Schefflera octophylla leaves using ionic

liquid-based ultrasonic-assisted extraction coupled with HPLC, Molecules,

2019a, 24(16), 2942.

9. X. Liu, J. Dong, Q. Liang, H.M.D. Wang, X.H. Liu, Coagulant effects and

mechanism of Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, Molecules, 2019b, 24(24),

4547.

http://m.riss.kr/search/Search.do?queryText=znCreator,%22Li+Y.%22&searchGubun=true&colName=re_a_over&detailSearch=true

http://m.riss.kr/search/Search.do?queryText=znCreator,%22Shi+D.-X.%22&searchGubun=true&colName=re_a_over&detailSearch=true

http://m.riss.kr/search/Search.do?queryText=znCreator,%22Wang+M.-L.%22&searchGubun=true&colName=re_a_over&detailSearch=true

http://www.pubfacts.com/author/Yaolan+Li

http://www.pubfacts.com/author/Paul+P+H+But

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17357972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jiang%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17357972

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ooi%20LS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17357972



131

10. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong,

Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mẫn,

Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt

Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Viện Dược liệu, 2006, 2, 411-414.

11. Đặng Thị Thanh Tâm, Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Tam thất, Ngũ gia bì chân

chim và thử nghiệm quá trình sản xuất sinh khối bằng bioreactor, Báo cáo tổng

hợp đề tài KC.04.TN10/11-15 thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà

nước (KC.04/11-15), Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2012.

12. W. Gaoyin, W. Xiaoli, W. Xiao, L. Xian, W. Yi, Changes in biochemistry and

histochemical characteristics during somatic embryogenesis in Ormosia henryi

Prain, BioRxiv, 2020; https://doi.org/10.1101/2020.09.21.307009.

13. L. Guan, Y. Li, K. Huang, Z.M. Cheng, Auxin regulalation and MdPIN

expression during adventitious root initiation in apple cuttings, Hoticulture

Reseach, 2020, 7: 143.

14. S.K.Verma, A.K.Das, S.Gantait, S. Gurel, E. Gurel, Influence of auxxin and its

polar transport inhibitor on the development of somatic embryos in Digitalis

trojana, 2018, 8 (2), 99.

15. Y.H. Su, L.P. Tang, X.Y. Zhao, X.S. Zhang, Plant cell totipotency: Insights into

cellular reprogramming, Plant Biology Journal of Integrative, 2021, 63, 228–

240.

16. N. Vidal, C. Sanchez, Use of bioreactor systems in the propagation of forest

trees, Engineering in Life Sciences, 2019, 19 (12), 896-915.

17. B. Qiang, J. Miao, N. Phillips, K. Wei, Y. Gao, Recent advances in the tissue

culture of American ginseng (Panax quinquefolius), Chemistry and

Biodiversity, 2020, 17(10), e2000366.

18. F. Engelmann, In vitro conservation of tropical plant germplasm - a review,

Euphytica, 1991, 57, 227-243.

19. Y. Guan, S.G. Li, X.F. Fan, Z.H. Su, Application of somatic embryogenesis in

woody plants, Front Plant Science, 2016, 7, 938.

20. V. Pikulthong, T. Teerakathiti, A. Thamchaipenet, S. Peyachoknagul,

Development of somatic embryos for genetic transformation in Curcuma longa

https://doi.org/10.1101/2020.09.21.307009

132

L. and Curcuma mangga Valeton & Zijp. Agriculture and Natural Resources,

2016, 50, 276-285.

21. F. Afreen, S.M.A. Zobayed, T. Kozai, Photoautotrophic culture of Coffea

arabusta somatic embryos: Development of a bioreactor for large-scale plantlet

conversion from cotyledonary embryos. Annals of Botany, 2002, 90, 21-29.

22. H. Etienne, D. Breton, J.C. Breitler, B. Bertrand, E. Déchamp, R. Awada, P.

Marraccini, S. Léran, E. Alpizar, C. Campa, P. Courte, F. Georget, J.P. Ducos,

Coffee somatic embryogenesis: How did research, experience gained and

innovations promote the commercial propagation of elite clones from the two

cultivated species? Frontiers in Plant Science, 2018, 9, 01630.

23. Nguyễn Trung Thành và Paek Kee Yoeup, Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm

Panax ginseng C. A. Meyer: Ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng

trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides, Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 2008, 24, 318-323.

24. Dương Tấn Nhựt, Trần Hiếu, Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Thanh Tùng,

Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền. Tối ưu hóa

quá trình nhân nhanh và tích lũy saponin của rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) trong các hệ thống nuôi cấy, Tạp chí Công nghệ

Sinh học, 2015, 13(3), 853-864.

25. Y. Wang, S. Jia, Z. Wang, Y. Chen, S. Mo, N.N. Sze, Planning considerations

of green corridors for the improvement of biodiversity resilience in suburban

areas, Journal of Infrastructure Preservation and Resilience, 2021, 2:6.

26. H.G.A. Engler and K.A.E. Prantl, Die Natürlichen Pflanzenfamilien, 1894,

3(8): 38, Angelmann Publisher.

27. Tự điển Bách khoa Dược học, Nhà xuất bản Từ điển Bách khoa Hà Nội, 1999,

433-434.

28. Trần Văn Sung, G. Adam, A sulphated triterpenoid saponin from Schefflera

octophylla. Phytochemistry, 1991, 30 (8), 2717-2720.

29. Trần Văn Sung, J. Peter, Katalinic, G. Adam, A bisdesmosidic triterpenoid

saponin from Schefflera octophylla, Phytochemistry, 1991a, 30 (11), 3717-

3720.

30. Trần Văn Sung, Steglich, G. Adam, Triterpenoid glycosides from Schefflera

133

octophylla, Phytochemistry, 1991b, 30 (7), 2349-2356.

31. Trần Văn Sung, C. Lavaud, A. Porzel, W. Steglich, G. Adam, Triterpenoids and

their glycosides from the bark of Schefflera octophylla, Phytochemistry, 1992,

31(1), 227-231.

32. C. Wu, Y.H. Duan, M.M. Li, W. Tang, X. Wu, G.C. Wang, Triterpenoid

saponins from the stem barks of Schefflera heptaphylla, Planta Medica, 2013,

79(14), 1348-1355.

33. C. Wu, Y.H. Duan, W. Tang, M.M. Li, X. Wu, G.C. Wang, W.C. Ye, G.X.

Zhou, New ursane-type triterpenoid saponins from the stem bark of Schefflera

heptaphylla, Fitoterapia, 2014, 92, 127-132.

34. S. Arya, I.D. Arya, T. Eriksson, Rapid multiplication of adventitious somatic

embryos of Panax ginseng, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1993, 34, 157-

162.

35. Y.E. Choi, J.H. Jeong, C.K. Shin, Hormone-independent embryogenic callus

production from ginseng cotyledons using high concentrations of NH4NO3 and

progress towards bioreactor production. Plant Cell Tissue and Organ Culture,

2003, 72(3), 229-235.

36. S. Zhou and D.C. Brown, High efficiency plant production of North American

ginseng via somatic embryogenesis from cotyledon explants, Plant Cell Reports,

2006, 25(3), 166-173.

37. Y.L. Kim, K. Kim, O.R. Lee, D.C. Yang, High frequency of plant regeneration

through cyclic secondary somatic embryogenesis in Panax ginseng. Journal

Ginseng Research, 2012, 36(4), 442-448.

38. Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Bùi Văn

Thế Vinh, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhựt, Phát sinh phôi trực tiếp từ lá, cuống

lá và thân rễ cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí

Sinh học, 2014, 36(1), 277-282.

39. Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị

Kim Loan, Nguyễn Thanh Sang, Vũ Thị Thủy, Nguyễn Hồng Hoàng, Thái Xuân

Du, Dương Tấn Nhựt, Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong nghiên

cứu quá trìmh phát sinh hình thái của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis

Ha et Grushv.) in vitro, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2015, 13(4), 657-664.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wu%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23925903

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Duan%20YH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23925903

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23925903

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23925903

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24144797/

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24144797/

javascript:;

javascript:;

javascript:;

https://link.springer.com/journal/11240

https://pubag.nal.usda.gov/?q=%22Choi%2C+Y.E.%22&search_field=author

https://pubag.nal.usda.gov/?q=%22Jeong%2C+J.H.%22&search_field=author

https://pubag.nal.usda.gov/?q=%22Shin%2C+C.K.%22&search_field=author

https://pubag.nal.usda.gov/?f%5Bjournal_name%5D%5B%5D=Plant+cell%2C+tissue%2C+and+organ+culture&f%5Bpublication_year_rev%5D%5B%5D=7997-2003&f%5Bsource%5D%5B%5D=2003+v.72+no.3

https://pubag.nal.usda.gov/?f%5Bjournal_name%5D%5B%5D=Plant+cell%2C+tissue%2C+and+organ+culture&f%5Bpublication_year_rev%5D%5B%5D=7997-2003&f%5Bsource%5D%5B%5D=2003+v.72+no.3

https://www.researchgate.net/scientific-contributions/Sijun-Zhou-32594147

https://www.researchgate.net/profile/Daniel-Brown-44

https://www.researchgate.net/journal/Plant-Cell-Reports-1432-203X

134

40. Mai Trường, Trần Thị Ngọc Hà, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Trần Trọng

Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Đức Trí,

Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ,

Nghiên cứu tạo và nhân phôi soma sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et

Grushv.) trong môi trường lỏng, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 2014, 12(7),

1085-1095.

41. J.Y. Zhang, H.J. Sun, I.J. Song, T.W. Bae, H.G. Kang, S.M. Ko, Y.I. Kwon,

I.W. Kim, J. Lee, S.Y. Park, P.O. Lim, Y.H. Kim, H.Y. Lee, Plant regeneration

of Korean wild ginseng (Panax ginseng Meyer) mutant lines induced by γ-

irradiation (60Co) of adventitious roots. Journal Ginseng Research. 2014, 38(3),

220-225.

42. Đỗ Mạnh Cường, Hoàng Thanh Tùng, Hoàng Đắc Khải, Vũ Quốc Luận,Vũ Thị

Hiền, Trương Thị Bích Phượng, Dương Tấn Nhựt, Increasing the somatic

embryogenesis frequency of Panax vietnamensis Ha et Grushv. by disinfection

of leaf explant using nano silver and the addition of nano silver in culture

medium, Vietnam Journal of Biotechnology, 2020, 18, 517-527.

43. Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng, Trương Thị Đẹp, Biến đổi hình thái trong

phát sinh phôi soma thông qua nuôi cấy mô sẹo Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2018, 16(2),

279-284.

44. X. Gao, C. Zhu, W. Jia, W. Gao, M. Qiu, Y. Zhang, P. Xiao, Induction and

characterization of adventitious roots directly from the explants of Panax

notoginseng, Biotechnology Letters, 2005, 27(22), 1771-1775.


Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Thanh, Phạm Đức Trí,

Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ,

Một số kết quả nghiên cứu tạo và nuôi rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2014, 12(2), 355-

364.

46. Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng, Trương Thị Đẹp, Tìm hiểu các biến đổi

hình thái trong sự phát sinh rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai

et K.M.Feng) nuôi cấy in vitro và bước đầu định tính oleanolic acid trong rễ

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4213868/

https://www.researchgate.net/profile/Cuong-Do-Manh

https://www.researchgate.net/profile/Tung-Hoang-5

https://www.researchgate.net/scientific-contributions/Truong-Thi-Bich-Phuong-68575310

https://www.researchgate.net/profile/Nhut-Duong-Tan

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Gao+X&cauthor_id=16314969

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Zhu+C&cauthor_id=16314969

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Jia+W&cauthor_id=16314969

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Gao+W&cauthor_id=16314969

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Qiu+M&cauthor_id=16314969

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Zhang+Y&cauthor_id=16314969

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Xiao+P&cauthor_id=16314969

135

tạo thành, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2016, 14(1), 49-54.

47. Nguyễn Thị Nhật Linh, Nghiên cứu nuôi cấy rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha et Grushv.) và khảo sát ảnh hưởng của một số elicitor lên sự

tích lũy saponin, Luận án TS chuyên ngành Sinh lý học Thực vật (Mã số:

62.42.01.12), Trường ĐH Khoa học Huế - ĐH Huế, 2017.

48. Z. Gui, Z. Guo, S. Ke, R.M. Skirvin, Somatic embryogenesis and plant

regeneration in Acanthopanax senticosus, Plant Cell Reports, 1991, 9(9), 514-

516.

49. Y.E. Choi, J.W. Kim, W.Y. Soh, Somatic embryogenesis and plant

regeneration from suspension cultures of Acanthopanax koreanum Nakai, Plant

Cell Reports, 1997, 17(2), 84-88.

50. S.Y. Park, J.K. Ahn, W.Y. Lee, H.N. Murthy, K.Y. Paek, Mass production

of Eleutherococcus koreanum plantlets via somatic embryogenesis from root

cultures and accumulation of eleutherosides in regenerants, Plant Science,

2005, 168(5), 1221-1225.

51. A.M. Shohael, H.N. Murthy, E.J. Hahn, K.Y. Paek, Methyl jasmonate induced

overproduction of eleutherosides in somatic embryos of Eleutherococcus

senticosus cultured in bioreactors. Electronic Journal of Biotechnology, 2007,

10(4), 633-637.

52. J.M. Seo, C.G. Shin, Y.E. Choi, Mass production of adventitious roots of

Eleutherococcus sessiliflorus through the bioreactor culture, Journal of Plant

Biotechnology, 2003, 5(3), 187-191.

53. E.J. Lee and K. Y. Paek, Effect of nitrogen source on biomass and bioactive

compound production in submerged cultures of Eleutherococcus koreanum

Nakai adventitious roots, Biotechnology Progress, 2012, 28(2), 508-514.

54. A. Sliwinska, O. Olszowska, M. Furmanowa, A. Nosov, Rapid multiplication

of Polyscias filicifolia by secondary somatic embryogenesis, In vitro Cellular

and Developmental Biology, Plant, 2008, 44(2), 69-77.

55. Trịnh Việt Nga, Nguyễn Đức Minh Hùng, Bùi Minh Trí, Ngô Thị Anh Khôi,

Triệu Thị Bích, Phạm Thị Minh Tâm, Nguyễn Hữu Hổ, Nuôi nhân in vitro phôi

vô tính cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) trên hệ thống nuôi

cấy lỏng lắc, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2019, 5, 25-34.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Gui+Y&cauthor_id=24213792

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Guo+Z&cauthor_id=24213792

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Ke+S&cauthor_id=24213792

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Skirvin+RM&cauthor_id=24213792

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Choi+YE&cauthor_id=30732408

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0168945204005278#!




https://www.sciencedirect.com/author/36741782200/keeyoeup-paek

https://www.sciencedirect.com/science/journal/01689452

https://www.sciencedirect.com/science/journal/01689452/168/5

http://doi.or.kr/10.PSN/ADPER8900147469

https://www.koreascience.or.kr/publisher/kspbt.page

https://www.koreascience.or.kr/publisher/kspbt.page

https://www.koreascience.or.kr/journal/E1PBAN/v5n3.page

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Lee+EJ&cauthor_id=22213626

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Paek+KY&cauthor_id=22213626

136

56. T.P. Murali, P.K. Rajeevan, K. Sheeja, V.V. Ranjan, In vitro propagation and

improvement of foliage plants, Final Report, Department of Pomology and

Floriculture, College of Horticulture, Kerala Agricultural University,

Velhmikkara, India, 2000, 52 pages.

57. A.S. Misra, Micropropagation studies with some ornamental plants, PhD

Thesis in Botany, Department of Botany, Faculty of Science, Maharaja

Sayajirao University of Baroda, Vadodara, India, 2001, 390002.

58. Thuc Dinh Ngoc and Thanh Le Nguyen, Chemical composition and

antimicrobial activity of essential oils from the leaves and stems of Schefflera

arboricola (Hayata) Merr. collected in Vietnam. Journal of Essential Oil

Bearing Plants, 2019, 22(5), 1401-1406.

59. O.R. Baghbidi and A. Jowkar, Micropropagation of dwarf Schefflera

[Schefflera arboricola (Hayata) Merr.] via direct shoot regeneration. Advances

in Horticultural Science, 2018, 32(2), 205-212.

60. B. Potduang, C. Chongsiriroeg, Y. Benmart, R. Giwanon, W. Supatanakul, S.

Tanpanich, Biological activities of Schefflera leucantha, African Journal of

Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 2007, 4 (2), 157-164.

61. Y. Chirakiattikun and S. Prakaisrithongkham, Micropropagation of Schefflera

leucantha, Thai Science and Technology Journal, 2004, 12(2), 34-40.

62. T.B.C. Da Silva, C.O. D’Sousa Costa, A.F.C. Galvao, L.M. Bomfim, A.B.C.

Da C. Rodrigues, M.C.S. Mota, A.A. Dantas, T.R. Dos Santos, M.B.P. Soares,

D.P. Bezerra, Cytotoxic potential of selected medicinal plants in northeast

Brazil, BMC Complementary and Alternative Medicine, 2016, 16(1), 199.

63. E.T.H Franco, L.B. Gavioli, A.G. Ferreira, In vitro regeneration of

Didymopanax morototoni, Brazilan Journal Biology, 2006, 66(2A), 455-462.

64. G. Lloy and B. McCown, Commercially feasible micropropagation of moutain

leurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Combined Proceedings -

International Plant Propagator Society. Soc, 1980, 30(5), 421-427.

65. H.A. Méndez-Hernández, M. Ledezma-Rodríguez, R.N. Avilez-Montalvo, Y.L.

Juárez-Gómez, A. Skeete, J. Avilez-Montalvo, C. De-la-Peña, V.M. Loyola-

Vargas, Signaling overview of plant somatic embryogenesis. Frontiers in Plant

Science, 2019, 10,77.

https://www.researchgate.net/journal/BMC-Complementary-and-Alternative-Medicine-1472-6882

137

66. A. Smertenko and P.V. Bozhkov, Somatic embryogenesis: life and death

processes during apical-basal patterning, Jounal of Experimental Botany,

2014, 65 (5), 1343-1360.

67. A. Iantcheva, A. Barbulova, M. Vlahova, A. Atanassov, Primary asymmetric

division and embryo formation in a single cell suspension of embryogenic

Medicago falcata, Biotechnology and Biotechnological Equipment, 2004,

18(3), 27-33.

68. S. Von Arnold, I. Sabala, P. Bozhkov, J. Dyachok, L. Filonova, Developmental

pathways of somatic embryogenesis, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2002,

69, 233-249.

69. S. Kadokura, K. Sugimoto, P. Tarr, T. Suzuki, S. Matsunaga, Characterization

of somatic embryogenesis initiated from the Arabidopsis shoot

apex, Developmental Biology, 2018, 442 (1), 13-27.

70. M. Zhang, A. Wang, M. Qin, X. Qin, S. Yang, S. Su, Y. Sun, L. Zhang, Direct

and indirect somatic embryogenesis induction in Camellia oleifera Abel,

Frontiers in Plant Science, 2021, 12, 644389.

71. L. Kharwanlang, MC. Das, S. Kumaria, P. Tandon, High frequency somatic

embryos induction from the rhizome explant of Panax pseudoginseng Wall.

using thin cell layer section. International Journal of Applied Biology and

Pharmaceutical Technology, 2016a, 7(3), 32-40.

72. O.T. Kim, T.S. Kim, D.S. In, K.H. Bang, Y.C. Kim, Y.E. Choi, S.W. Cha, N.S.

Seong, Optimization of direct somatic embryogenesis from mature zygotic

embryo78s of Panax ginseng C.A. Meyer, Journal of Plant Biology, 2006, 49(5),

348-352.

73. Y.J. Kim, K. Kim, O.R. Lee, D.C. Yang, High frequency of plant regeneration

through cyclic secondary somatic embryogenesis in Panax ginseng, Journal of

Ginseng Research, 2012, 36(4), 442-448.

74. D.T. Nhut, B.V.T. Vinh, T.T. Hien, N.P. Huy, N.B. Nam, H.X. Chien, Effects

of spermidine, proline and carbohydrate sources on somatic embryogenesis

from main root transverse thin cell layers of Vietnamese ginseng (Panax

vietnamensis Ha et. Grushv.), African Journal of Biotechnology, 2012, 11(5),

1084-1091.

https://www.frontiersin.org/people/u/1049200




138

75. A.H. Naing, C.K. Kim, B.J. Yun, J.Y. Jin, K.B. Lim, Primary and secondary

somatic embryogenesis in Chrysanthemum cv. Euro. Plant Cell Tiss Organ

Culture, 2013, 112, 361-368.

76. R. Zegzouti, M.F. Arnould, J.M. Favre, Histological investigation of the

multiplication step in secondary somatic embryogenesis of Quercus robur L.,

Annals of Forest Science, 2001, 58(6), 681-690.

77. H.S.M. Khierallah and N.H. Hussein, The role of coconut water and casein

hydrolysate in somatic embryogenesis of date palm and genetic stability

detection using RAPD markers. Research in Biotechnology, 2013, 4(3), 20-28.

78. Tô Thị Nhã Trầm, Trương Phi Yến, Tôn Trang Ánh, Hoàng Thanh Tùng, Hà

Thị Mỹ Ngân, Dương Tấn Nhựt, Phát sinh phôi soma cây đinh lăng lá xẻ nhỏ

(Polyscias fruticosa L. Harms) thông qua nuôi cấy mẫu lá ex vitro, Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 2020, 18(3), 497-506.

79. G.I. Nic-Can and V.M. Loyola-Vargas, The role of the auxins during somatic

embryogenesis, Somatic Embryogenesis: Fundamental Aspects and

Applications, 2016, 171-181.

80. M.A. Abohatem, Y. Bakil, M. Baaziz, Plant regeneration from Somatic

Embryogenic Suspension Cultures of Date Palm, Methods in Molecular

Biology, 2017, 1637, 203-214.

81. T. Keshvari, A. Najaphy, D. Kahrizi, A. Zebarjadi, Callus induction and

somatic embryogenesis in Stevia rebaudiana Bertoni as a medicinal

plant, Cellular and Molecular Biology, 2018, 64(2), 46-49.

82. O. Novák and K. Ljung K, Zooming in on plant hormone analysis: tissueand

cell-specific approaches, Annual review of Plant Biology, 2017, 68, 323-348.

83. X. Yang and X. Zhang, Regulation of somatic embryogenesis in higher plants.

Critical Reviews Plant Science, 2010, 29, 36-57.

84. R.E. Márquez-López, C.A. Pérez-Hernández, Á. Kú-González, R.M. Galaz-

Ávalos, V.M. Loyola-Vargas, Localization and transport of indole-3-acetic

acid during somatic embryogenesis in Coffea canephora. Protoplasma, 2018,

255, 695-708.

85. B. Jones, S.A. Gunneras, S.V. Petersson, P. Tarkowski, N. Graham, S. May, K.

Dolezal, G. Sandberg, K.Ljung, Cytokinin regulation of auxin synthesis in

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Abohatem+MA&cauthor_id=28755347

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Bakil+Y&cauthor_id=28755347

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Baaziz+M&cauthor_id=28755347

139

Arabidopsis involves a homeostatic feedback loop regulated via auxin and

cytokinin signal transduction, Plant Cell, 2010, 22(9), 2956-2969.

86. V. M. Loyola-Vargas and N. Ochoa-Alejo, Somatic Embryogenesis. An

Overeview, Somatic Embryogenesis: Fundamental Aspects and Applications,

2016, 1-8.

87. D. Leljak-Levanic, S. Mihaljevic, and N. Bauer, Somatic and zygotic embryos

share common developmental features at the onset of plant embryogenesis. Acta

Physiologiae Plantarum, 2015, 37, 1-14.

88. L. Michalczuk, T.J. Cooke, J.D. Cohen, Auxin levels at different stages of carrot

somatic embryogenesis, Phytochemistry, 1992, 31, 1097-1103.

89. D.M. Ribnicky, N. IliC, J.D. Cohen, T.J. Cooke, The effects of exogenous

auxins on endogenous indole-3-acetic acid metabolism - The implications for

carrot somatic embryogenesis, Plant Physiol, 1996, 112, 549-558.

90. B. Ayil-Gutiérrez, R.M. Galaz-Ávalos, E. Peña-Cabrera, V.M. Loyola-Vargas,

Dynamics of the concentration of IAA and some of its conjugates during the

induction of somatic embryogenesis in Coffea canephora, Plant Signaling &

Behavior, 2013, 8, e26998.

91. H.H. Chung, J.T. Chen, W.C. Chang, Plant regeneration through direct

somatic embryogenesis from leaf explants of Dendrobium. Biologia Plantarum,

2007, 51, 346-350.

92. W.P. Gow, J.T. Chen, W.C. Chang, Effects of genotype, light regime explants

possion and orientation on direct somatic embryogenesis from leaf explants of

Phalaenopsis orchids, Acta Physiologiae Plantarum, 2009, 31(2), 363-369.

93. C.S. Raju, A. Aslam, K. Kathiravan, P. Palani, A. Shajahan, Direct somatic

embryogenesis and plant regeneration from leaf sheath explants of mango

ginger (Curcuma amada Roxb.), In Vitro Cellular & Developmental Biology –

Plant, 2014, 50, 752-759.

94. Y. Wang, F. Chen, Y. Wang, X. Li, H. Liang, Plant regeneration from immature

embryos of Tapiscia sinensis Oliv., an endemic and endangered species in

China, Hortscience, 2014, 49(12), 1558-1562.

95. Bùi Văn Thế Vinh, Vũ Thị Thủy, Thái Thương Hiền, Đỗ Khắc Thịnh, Dương

Tấn Nhựt, Nghiên cứu hình thái giải phẫu và cấu trúc phôi trong quá trình phát

javascript:;

javascript:;

javascript:;


140

sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí

Khoa học và Phát triển, 2014, 7, 1140-1148.

96. H.J. Shen, J.T. Chen, H.H. Chung, W.C. Chang, Plant regeneration via direct

somatic embryogenesis from leaf explants of Tolumnia Louise Elmore ‘Elsa’.

Botanical Studies, 2018, 59, 4.

97. H. Liang, Y. Xiong, B. Guo, H. Yan, S. Jian, H. Ren, X. Zhang, Y. Li, S. Zeng,

K. Wu, F. Zheng, J.A. Teixeira da Silva, Y. Xiong, G. Ma, Shoot organogenesis

and somatic embryogenesis from leaf and root explants of Scaevola sericea.

Scientific Reports, 2020, 10, 11343.

98. E. Rahmat and Y. Kang, Adventitious root culture for secondary metabolite

production in medicinal plants, A Review, Journal of Plant Biotechnology,

2019, 46(3), 143-157.

99. J. Yu, W. Liu, J. Liu, P. Qin, L. Xu, Auxin control of root organogenesis from

callus in tissue culture, Frontiers in Plant Science, 2017, 8, 1835.

100. X.H. Cui, H.N. Murthy, C.H. Wu, K.Y. Paek, Sucrose-induced osmotic stress

affects biomass, metabolite, and antioxidant levels in root suspension cultures

of Hypericum perforatum L., Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2010, 103,

7-14.

101. A.H. Ahkami, M. Melzer, M.R. Ghaffari, S. Pollmann, M.G. Javid, F.

Shahinnia, M.R. Hajirezaei, U. Druege, Distribution of indole-3-acetic acid in

Petunia hybrida shoot tip cuttings and relationship between auxin transport,

carbohydrate metabolism and adventitious root formation, Planta, 2013, 238,

499–517.

102. L. Guan, R. Tayengwa, Z. Cheng, W.A. Peer, A.S. Murphy, M. Zhao, Auxin

regulates adventitious root formation in tomato cuttings, Plant Biology, 2019,

19, 435.

103. K.H. Lo, Factor affecting shoot organogenesis in leaf disc culture of African

violet, Scientia Hoticulturae, 1997, 72(1), 49-57.

104. R.J. Rose, X.D. Wang, K.E. Nolan and B.G. Rolfe, Root meristems in Medicago

truncatula tissue culture arise from vascular-derived procambial-like cells in a

process regulated by ethylene, Journal of Experimental Botany, 2006, 57(10),

2227-2235.

141

105. T. Murashige and F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassay

with tobacco tissue culture, Physiol Plant, 1962, 15, 473-497.

106. O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima, Nutrient requirement of suspensions

cultures of soybean root cells, Experimental cell research, 1962, 50(1), 151-158.

107. R.U. Schenk and A.C. Hildebrandt, Medium and techniques for induction and

growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell culture, Canadian

Journal Botany, 1972, 50, 199-204.

108. S. Merkle, W. Parrott, B. Flinn, Morphogenic Aspects of Somatic

Embryogenesis, In vitro Embryogenesis in Plants (Current Plant Science and

Biotechnology in Agriculture), 1995, 20, 155-203.

109. R. Fernández-Da Silva, L. Hermoso-Gallardo, A. Menéndez-Yuffá, Primary

and secondary somatic enbryogenesis in leaf sections and cell suspensions of

Coffea arabica cv. Catimor, Interciencia, 2005, 30(11), 694-698.

110. H.M.S. Aboshama, Direct somatic embryogenesis of pepper (Capsicum

annuum L.), World Journal of Agricultural Sciences, 2011, 7 (6), 755-762.

111. E. Minyaka, N. Niemenak, Fotso, A. Sangare, D.N. Omokolo, Effect of MgSO4

and K2SO4 on somatic embryo diffirentiation in Theobroma cacao L., Plant Cell

Tissue and Organ Culture, 2008, 94(2), 149-160.

112. M.S.D. Ibrahima, R.S. Hartatib, R. Rubiyoa, A. Purwitoc, S. Sudarsono, Direct

and indirect somatic embryogenesis on Arabica coffee (Coffea arabica),

Indonesian Journal of Agricutural Science, 2013, 14(2), 79-86.

113. Y. Aoshima Y, Efficient embryogenesis in the callus of tea (Camellia sinensis)

enhanced by the osmotic stress or antibiotics treatment, Plant Biotechnol, 2005,

22, 277-280.

114. C. Anjaneyulu, B. Shyamkuma, C. Giri, Somatic embryogenesis from callus

cultures of Terminalia chebula Retz.: An important medicinal tree, Trees –

Structure and function, 2004, 18(5), 547-552.

115. Y.J. Kim, M.K. Kim, J.S. Shim, R.K. Pulla, D.C. Yang, Somatic embryogenesis

of two new Panax ginseng cultivars, Yun-Poong and Chun-Poong, Russian

Journal of Plant Physiology, 2010, 57(2), 283-289.

116. A. Prades, M. Dornier, N. Diop, J.P. Pain, Coconut water uses, composition and

properties: A review, Fruits, 2012, 67, 87–107.

http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_serial&pid=0378-1844&lng=es&nrm=iso

https://www.researchgate.net/journal/Russian-Journal-of-Plant-Physiology-1608-3407

https://www.researchgate.net/journal/Russian-Journal-of-Plant-Physiology-1608-3407

142


Tuấn, Đỗ Đăng Giáp, Bùi Đình Thạch, Phạm Đức Trí, Nguyễn Đức Minh Hùng,

Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Kết, Trần Công Luận, Nguyễn Hữu Hổ,

Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo có khả năng sinh phôi và mô phôi sâm Ngọc Linh

(Panax vietnamensis Ha et Grushv., Tạp chí Sinh học, 2013, 35(3se), 145-157.

118. J.Y. Kim, P.B. Adhikari, C.H. Ahn, D.H. Kim, Y.C. Kim, J.K. Han, S. Kondeti,

Y.E. Choi, High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration of

interspecific ginseng hybrid between Panax ginseng and Panax quinquefolius,

Journal Ginseng Research, 2019, 43,38-48.

119. M. Ali, A. Mujib, D. Tonk, N. Zafar, Plant regeneration through somatic

embryogenesis and genome size analysis of Coriandrum sativum L,

Protoplasma, 2017, 254(1), 343-352.

120. W.M. Irene, H.L. Alumiro, K.K. Asava, C.O. Agwanda, S.E. Anami, Effects of

genotype and plant growth regulators on callus induction in leaf cultures of

Coffea arabica L. F1 hybrid, Journal Plant Biochemistry Physiology, 2019, 7,

236.

121. P. Giridhar, V. Kumar, E.P. Indu, G.A. Ravishankar, A. Chandrasekar,

Thidiazuron induced somatic embryogenesis in Coffea arabica L. and Coffea

canephora P ex Fr, Acta Botanica Croatica, 2004, 63 (1), 25–33.

122. N. Burbulis, A. Blinstrubiene, V. Jonytiene, In vitro regeneration from leaf

explants of Petunia hybrida L. Propag Ornam Plants, 2015, 15, 47–52.

123. A. Blinstrubiene, N. Burbulis, V. Jonytiene, R. Masiene R, Evaluation of factors

affecting direct organogenesis in a somatic tissue culture of Sinningia speciosa

(Lodd.) Hiern, Agronomy, 2020, 10(11), 1783.

124. Y. Zhang, T.A. Bozorov, D.X. Li, P. Zhou, X.J. Wen, Y. Ding, D.Y. Zhang, An

efficient in vitro regeneration system from different wild apple (Malus sieversii)

explants, Plant Methods, 2020, 16,56.

125. S.B. Mostafiz, A. Wagiran, Efficient callus induction and regeneration in

selected indica rice, Agronomy, 2018, 8, 77.

126. X. Deng, Y. Xiong, J. Li, D. Yang, J. Liu, H. Sun, H. Song, Y. Wang, J. Ma, Y.

Liu, M. Yang, The establishment of an efficient callus induction system for lotus

(Nelumbo nucifera), Plants, 2020, 9(11),1436.

143

127. S.L. Zhong, S.G. Zhong, Morphological and ultrastructural characteristics of

the embryogenic callus of American ginseng, Chin J Bot, 1992, 4, 92-98.

128. M.D. Gaj, Factors influencing somatic embryogenesis induction and plant

regeneration with particular reference to Arabidopsis thaliana (L.) Heynh,

Plant Growth Regulation, 2004, 43: 27–47.

129. S. Hussein, R. Ibrahim, A.L.P. Kiong, Somatic embryogenesis: an alternative

method for in vitro micropropagation, Iranian Journal of Biotechnology, 2006,

4(3), 156-161.

130. Y. Sun, X. Zhang, S. Jin, S. Liang, Y. Nie, Somatic embryogenesis and plant

regeneration in wild cotton (Gossypium klotzschianum), Plant Cell Tissue

Organ Culture, 2003, 75, 247-253.

131. K.P. Martin, Plant regeneration through direct somatic embryogenesis on seed

coat explants of cashew (Anacardium occidentale L.), Science Horticulturae,

2003, 98(3), 299-304.

132. M. Umehara and H. Kamada H, Development of the embryo proper and the

suspensor during plant embryogenesis, Plant Biotechnology, 2005, 22, 253-260

133. O.J. Parra-Penalosa and G.O. Cancino-Escalante, Evaluation of induction of

somatic embryogenesis from cotyledonary leaves of banana passion fruit

(Passiflora mollissima) L.H Bailey, Respuestas, 2019, 24(3), 31-38.

134. SA. Kahrawat and S. Chand, Continuous somatic embyogenesis and plant

regeneration from hypocotyl segments of Psoralea corylifolia Linn., an

endangered and medicinally important Fabaceae plant, Current Science

Assocation, 2001, 81, 1328-1331.

135. D. Sharada, P.S. Krishna, N.R. Swamy, Plant Regeneration via somatic

embryogenesis in Solanum nigrum L. (Black nightshade) (Solanaceae),

Biotechnology Journal International, 2019, 23(1), 1-9.

136. E. Corredoira, A. Ballester, A.M. Vieitez, Proliferation, maturation and

germination of Castanea sativa Mill. somatic embryos originated from leaf

explants, Annals of Botany, 2003, 92(1), 129–136.

137. T. Hazubska-Przybyl, E. Ratajczak, A. Obarska, E. Pers-Kamczyc, Different

roles of auxins in somatic embryogenesis efficiency in two Picea species,

International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(9), 3394.

144

138. D.E. Sakr and R.M.S. Sayed, Morpho- histological observations on somatic

embryogenesis in mature embryo derived callus of Oryza sativa L. cv. Sakha,

101, Journal of Scientific Reseach in Science, 2018, 35(1), 126-141.

139. J.L.D. Cipriano, A.C.F. Cruz, K.C. Mancini, E.R. Schmildt, J.C. Lopes, W.C.

Otoni, R.S. Alexandre, Somatic embryogenesis in Carica papaya as affected by

auxins and explants, and morphoanatomical-related aspects. Anais da

Academia Brasileia de Ciencias, 2018, 90(1), 385-400.

140. E. Grzebelus, M. Szklarczyk, R. Baranski, An improved protocol for plant

regeneration from leaf and hypocotyl-derived protoplasts of carrot. Plant Cell

Tissue Organ Culture, 2012, 109, 101-109.

141. J. Friml, A. Vieten, M. Sauer, D. Weijers, H. Schwartz, T. Hamann, R. Offringa,

G. Jürgens, Efflux-dependent auxin gradients establish the apical basal axis of

Arabidopsis. Nature, 2003, 426, 147-153.

142. G.D. Ascough and C.W. Fennell, The regulation of plant growth and

development in liquid culture, South African Journal of Botany, 2004, 70(2),

181–190.

143. J.A. Teixeira da Silva, J. Dobranszki, Plant thin cell layers: update and

perspectives, Folia Hort, 2015, 27(2), 183-190.

144. V.T. Hien, N.P. Huy, B.V.T. Vinh, H.X. Chien, H.T. Tung, N.B. Nam, V.Q.

Luan, D.T. Nhut. Somatic embryogenesis from leaf transverse thin cell layer

derived-callus of Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 2016, 14(1), 63-73.

145. N. Sabooni and A. Shekafandeh, Somatic embryogenesis and plant

regeneration of blackberry using the thin cell layer technique, Plant Cell Tissue

Organ Culture, 2017, 130: 313–321.

146. J.E. Scherwinski-Pereira, R.S. da Guedes, Jr P.C.P Fermino, T.L. Silva, F.H.S.

Costa, Somatic embryogenesis and plant regeneration in oil palm using the thin

cell layer technique, In Vitro Cellular and Development Biology Plant, 2010,

46, 378-385.

147. M. Pandey, U. Dhar, S.S. Samant, M.V. Shirgurkar, S.R. Thengane, Recurrent

somatic embryogenesis and plant regeneration in Angelica glauca Edgew., a

145

critically endangered medicinal plant of the Western Himalaya, Journal of

Horticultural Science & Biotechnology, 2011, 86(5), 493–498.

148. I. Sivanesan, M.S. Son, S. Jana, B.R. Jeong, Secondary somatic enbryogenesis

in Crocus vernus (L.) Hill, Propagation of Ornamental Plants, 2012, 12(3), 163-

170.

149. G. Wang, C. Xu, S. Yan, B. Xu, An efficient somatic embryo liquid culture

system for potential use in large-scale and synchronic production of Anthurium

andraeanum seedlings, Fronties in Plant Science, 2019, 10,29.

150. M. Malik, Comparison of different liquid/solid culture systems in the production

of somatic embryos from Narcissus L. ovary explants, Plant Cell Tissue and

Organ Culture, 2008, 94, 337–345.

151. A.L. De Rezende Maciel, F.A. Rodrigues, M. Moacir Pasqual, C.H.S. De

Carvalho, Large-scale, high-efficiency production of coffee somatic embryos,

Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2016, 16, 102-107.

152. T.S. Mariani, Sjafrullatif, N.G. Wardjo, H. Miyake, Initiation and proliferation

of globular somatic embryos of oil palm (Elaeis guineensis, Jacq.) observed by

inverted and transmission electron microscopy. International Journal of Basic

& Applied Sciences, IJBAS-IJENS 2014, 14(1), 1-7.

153. C. Guillou, A. Fillodeau, E. Brulard, D. Breton, S. De Faria Maraschin, D.

Verdier, M. Simon, J.D. Ducos, Indirect somatic embryogenesis of Theobroma

cacao L. in liquid medium and improvement of embryo-to-plantlet conversion

rate, In Vitro Cellular & Developmental Biology, Plant, 2018, 54, 377-391.

154. B.B. Misra and S. Dey, Culture of East Indian sandalwood tree somatic

embryos in air-lift bioreactors for production of santalols, phenolics and

arabinogalactan proteins, AoB Plants, 2013, 5, plt 025.

155. L. García-Águila, R. Gómez-Kosky, Y. Alvarado Capó, Z. Sarría Hernández,

N. Albany, J. Vílchez, M. Reyes Vega, B. Pérez Pérez, A. Rodríguez

Concepción, Effect of inoculation density of somatic embryos for obtaining

plantain FHIA-21 (AAAB) cultivars, Cultivos Tropicales, 2016, 37(1), 57-64.

156. R.R. Nair and S.D. Gupta, High-frequency plant regeneration through cyclic

secondary somatic embryogenesis in black pepper (Piper nigrum L.), Plant Cell

Reports, 2006, 24(12), 699-707.

146

157. S. Te-chato and A. Hilae, High-frequency plant regeneration through

secondary somatic embryogenesis in oil palm (Elaeis guineensis Jacq. var.

Tenera). Journal of Agricultural Technology, 2007, 3(2), 345-357.

158. S. Hussein, R. Ibrahim, A.L.P. Kiong, N.M. Fadzillah, S.K. Daud,

Micropropagation of Eurycoma longifolia Jack via formation of somatic

embryogenesis, Asian Journal of Plant Sciences, 2005, 4(5),472-485.

159. T. Cosic, B. Vinterhalter, D. Vinterhalter, N. Mitic, A. Cingel, J. Savic, B.

Bohanec, S. Ninkovic, In vitro plant regeneration from immature zygotic

embryos and repetitive somatic embryogenesis in kohlrabi (Brassica oleracea

var. gongylodes), In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 2013, 49(3),

294-303.

160. M.S.D. Ibrahima, R.S. Hartatib, Rubiyoa, A. Purwitoc, Sudarsono. Direct and

indirect somatic embryogenesis on Arabica coffee (Coffea arabica), Indonesian

Journal of Agricultural Science, 2013, 14(2), 79-86.

161. E. Corredoira, A. Ballester, M. Ibarra, A.M. Vieitez, Induction of somatic

embryogenesis in explants of shoot cultures established from adult Eucalyptus

globulus and E. saligna × E. maidenii trees. Tree Physiology, 2015, 35, 678-

690.

162. G. Daigny, H. Paul, R.S. Sangwan, B.S. Sangwan-Norreel, Factors influencing

secondary somatic embryogenesis in Malus x domestica Borkh. (cv 'Gloster

69'), Plant Cell Reports, 1996, 16(3-4), 153-157.

163. M. Al Shamari, H.Z. Rihan, M.P. Fuller, An effective protocol for the

production of primary and secondary somatic embryos in cauliflower (Brassica

oleraceae var. Botrytis), Agri Res & Tech, 2018, 14(1), 38-46.

164. J.W.H. Yong, L. Ge, Y.F. Ng, S.N. Tan, The chemical composition and

biological properties of coconut (Cocos nucifera L.) water, Molecules, 2009,

14, 5144-5164.

165. S.M. Khalil, K.T. Cheah, E.A. Perez, D.A. Gaskill, J.S. Hu, Regeneration of

banana (Musa spp. AAB cv. Dwarf Brazilian) via secondary somatic

embryogenesis, Plant Cell Reports, 2002, 20,1128-1134.

166. H.K. Moon, S.Y. Park, Y.W. Kim, S.H. Kim, Somatic embryogenesis and

plantlet production using rejuvenated tissues from serial grafting of a mature

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Daigny+G&cauthor_id=24177542

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Paul+H&cauthor_id=24177542

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Sangwan+RS&cauthor_id=24177542

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Sangwan-Norreel+BS&cauthor_id=24177542

147

Kalopanax septemlobus tree, In Vitro Cellular & Developmental Biology.-

Plant, 2008, 44(2), 119-127.

167. I.M. Al-Khayri, Somatic Embryogenesis of Date Palm (Phoenix dactylifera L.)

Improved by Coconut Water. Biotechnology, 2010, 9(4), 477-484.

168. Y. Chirakiattikun and S. Prakaisrithongkham, Micropropagation of Schefflera

leucantha. Thai Science and Technology Journal, 2004, 12(2), 34-40.

169. J.L. Yang, E.S. Seong, M.J. Kim, B.K. Ghimire, W.H. Kang, C.Y. Yu, C.H,

Direct somatic embryogenesis from pericycle cells of broccoli (Brassica

oleracea L. var. Italica) root explants. Plant Cell Tissue and Organ Culture,

2010, 100(1), 49-58.

170. K.D. Xu, W. Wang, D.S. Yu, X.L. Li, J.M. Chen, B.J. Feng, Y. Zhao, M.J.

Cheng, X.X. Liu, C.W. Li, NAA at a high concentration promotes efficient plant

regeneration via direct somatic embryogenesis and SE-mediated

transformation system in Ranunculus sceleratus, Scientific Reports, 2019, 9,

18321.

171. M. Sukhada, K.Y. Prathibha, H.D. Soumya, R.M. Ranganath, The origin and

development of secondary somatic embryos in banana cv. Nanjangud Rasbale

(Silk GP. Rasthali, AAB). Acta Horticulture, 2010, 865, 349-351.

172. E.U. Kurczynska, M.D. Gaj, A. Ujczak, E. Mazur, Histological analysis of

direct somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Planta, 2007,

226(3), 619-628.

173. A. Onay, Histology of somatic embryogenesis in cultured leaf explants of

pistachio (Pistacia vera L.), Turkisk Journal Botany, 2000, 24, 91-95.

174. N. Imin, M. Nizamidin, D. Daniher, K.E. Nolan, R.J. Rose and B.G. Rolfe.

Proteomic analysis of somatic embryogenesis in Medicago truncatula, Plant

Physiology, 2005, 137, 1250-1260.

175. C. Thomas, D. Meyer, C. Himber C and A. Steinmetz, Spatial expression of a

sunflower SERK gene during induction of somatic embryogenesis and shoot

organogenesis. Plant Physiology and Biochemistry, 2004, 42, 35-42.

176. S.V. Eduardo, In vitro root induction and plumule explants of Helianthus

annuus, Environmental and Experimental Botany, 1998, 39, 271-277.

177. J. Yu, W. Liu, J. Liu, P. Qin, L. Xu, Auxin control of root organogenesis

148

from callus in tissue culture, Frontiers in Plant Science, 2017, 8, 1835.

178. Dương Tấn Nhựt, Một số phương pháp, hệ thống mới trong nghiên cứu công

nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp TP. HCM, 2010, 218 tr.

179. A.P.K. Ling, K.P. Tan, S. Hussein, Comparative effects of plant growth

regulators on leaf and stem explants of Labisia pumila var, Alata. Journal of

Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology), 2013, 14(7),

621-631.

180. K. Roberts, Auxin, In: Handbook of Plant Science, John Wiley & Sons Ltd.,

USA, 2007, 352-360.

181. S. Hussein, A.P.K. Ling, T.H. Ng, R. Ibrahim and K.Y. Paek, Adventitious roots

induction of recalcitrant tropical woody plant, Eurycoma longifolia. Romanian

Biotechnological Letters, 2012, 17(1), 7026-7025.

182. M.Z. Saiman, N.R. Mustafa, A.E. Schulte, R. Verpoorte, Y.H. Choi, Induction,

characterization, and NMR-based metabolic profiling of adventitious root

cultures from leaf explants of Gynura procumbens, Plant Cell Tissue Organ

Culture, 2012, 109, 465–475.

183. S.N. Sharmaa, Z. Jhaa and R.K. Sinha, Establishment of in vitro adventitious

root cultures and analysis of andrographolide in Andrographis paniculata,

Natural Product Communications, 2013, 8(8), 1045-1047.

184. S. Nandagopal and B.D.R. Kumari, Effectiveness of auxin induced in vitro root

culture in chicor, Journal of Central European Agriculture, 2007, 8(1), 73-80.

185. M.M. Khalafalla, H.M. Daffalla, H.A. El-Shemy and E. Abdellatef,

Establishment of in vitro fast-growing normal root culture of Vernonia

amygdalina - a potent African medicinal plant, African Journal of

Biotechnology, 2009, 8(21), 5952-5957.

186. K.W. Yu, W.Y. Gao, E.J. Hahn and K.Y. Paek, Effects of macro elements and

nitrogen source on adventitious root growth and ginsenoside production in

ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer), Journal of Plant Biology, 2001, 44(4),

179-184.

187. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết, Nghiên cứu khả

năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

trong nuôi cấy in vitro, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và

149

Công nghệ, 2011, 27, 30-36.

188. H.J. Kim, E.J. Chang, H.I. Oh, Saponin production in submerged adventitious

root culture of Panax ginseng as affected by culture conditions and elicitors.

Asia Pacific Journal Molecular Biology Biotechnology, 2005, (13), 87-91.

189. D.J. James, Adventitious root formation in vitro in apple rookstock (Malus

pumila), Phyosilogia Plantarum, 1983, 57, 213 -218.

190. A.P.K. Ling, M.F. Chin, S. Hussein, Adventitious roots production of Centella

asiatica in response to plant regulators and sucrose concentration, Medicinal

and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 2009a, 3(1), 36-41.

191. F. Taj, M.A. Khan, H. Ali and R.S. Khan, Improved production of industrially

important essential oils through elicitation in the adventitious roots of Artemisia

amygdalina, Plants, 2019, 8(10), 430.

192. V.P. Pandey, E. Cherian and G. Patani, Effect of growth regulators and culture

conditions on direct root induction of Rauwolfia serpentina L. (Apocynaceae)

Benth by leaf explants, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2010,

9(1), 27-34.

193. A.P.K. Ling, K.M. Kok, S. Hussein and S.L. Ong SL, Effects of plant growth

regulators on adventitious roots induction from different explants of

Orthosiphon stamineus, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture,

2009b, 3(3), 493-501.

194. J. Samaj, M. Bobak, D. Kubosnikova, J. Kristin, E. Kolarik, M. Ovecka,

A. Blehova, Bundle sheet cells are responsible for direct root regeneration from

leaf explants of Helianthus occidentalis, Journal Plant Physiology, 1999, 154,

89-94.

195. N.A. Yusuf, N.S.M. Rahim, S.Z.A. Azhar, K.A. Ghani, S. Sommano, N. Khalid,

Adventitious root cultures of Boesenbergia rotunda as a source of pinostrobin.

International Journal on Advanced Science, Engineering and Information

Technology, 2018, 8(2), 377-383.

196. H. Fazal, B.H. Abbasi, N. Ahmad, Optimization of adventitious root culture for

production of biomass and secondary metabolites in Prunella vulgaris L,

Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 174(6), 2085-2095.

150

197. P.S. Kaushik, M.K. Swamy, S. Balasubramanya, M. Anuradha, Rapid plant

regeneration, analysis of genetic fidelity and camptothecin content of

micropropagated plants of Ophiorrhiza mungos Linn. - a potent anticancer

plant, Journal of Crop Science and Biotechnology, 2015, 18, 1-8.

198. P. Baskaran and N. Jayabalan, Psoralen production in hairy roots and

adventitious roots cultures of Psoralea coryfolia, Biotechnology Letters, 2009,

31, 1073-1077.

199. N. Praveen, S.H. Manohar, P.M. Naik, A. Nayeem, J.H. Jeong, H.N. Murthy,

Production of andrographolide from adventitious root cultures of Andrographis

paniculata, Current Science, 2009, 96(5), 694-697.

200. T. Khan, B.H. Abbasi, M.A. Khan, M. Azeem, Production of biomass and

useful compounds through elicitation in adventitious root cultures of Fagonia

indica. Industrial Crops and Products, 2017, 108(1), 451-457.

201. P.K. Silja and K. Satheeshkumar, Establishment of adventitious root cultures

from leaf explants of Plumbago rosea and enhanced plumbagin production

through elicitation, Industrial Crops and Products, 2015, 76, 479-486.

202. H. Wu, Y.H. Dewir, E.J. Hahn, K.Y. Paek, Optimization of culturing conditions

for the production of biomass and phenolics from adventitious roots of

Echinacea angustifolia, Journal of Plant Biology, 2006, 49(3), 193-199.

203. J.Y. Zhang, T.W. Bae, K.H. Boo, H.J. Sun, I.J. Song, C.H. Pham, M. Ganesan,

D.H. Yang, H.G. Kang, S.M. Ko, K.Z. Riu, P.O. Lim, H.Y. Lee, Ginsenoside

Production and morphological characterization of wild ginseng (Panax ginseng

Meyer) mutant lines induced by g-irradiation (60Co) of adventitious roots,

Journal Ginseng Research, 2011, 35(3), 283-293.

204. A. Ahmad, H. Ali, H. Khan, A. Begam, S. Khan, S.S. Ali, N. Ahmad, H. Fazal,

M. Ali, C. Hano, N. Ahmad and B.H. Abbasi, Effect of gibberellic acid on

production of biomass, polyphenolics and steviol glycosides in adventitious root

cultures of Stevia rebaudiana (Bert.), Plants, 2020, 9, 420.

205. M. Ziv, Quality of micropropagated plants - vitrification. In Vitro Cellular

Biology, 1991, 27, 64–69.

javascript:;

javascript:;

javascript:;

javascript:;


0

PHỤ LỤC

Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), SH (Schenk và

Hildebrandt, 1972) và B5 (Gamborg và cs., 1968)

Thành phần MS (mg/L) SH (mg/L) B5 (mg/L)

Khoáng đa lượng

KNO3 1.900 2.500 2.500

NH4NO3 1.650

NH4H2PO4 300

(NH4)2SO4 134

MgSO4.·7H2O 370 400 250

CaCl2·2H2O 440 200 150

KH2PO4 170

NaH2PO4·H2O 150

Khoáng vi lượng

MnSO4·H2O 10,0 10,0

MnSO4·4H2O 22,3

KI 0,83 1,0 0,75

H3BO3 6,2 5,0 3,0

ZnSO4·7H2O 8,6 1,0 2,0

CuSO4·5H2O 0,025 0,2 0,025

Na2MoO4·2H2O 0,25 0,1 0,25

CoCl2·6H2O 0,025 0,1 0,025

FeSO4·7H2O 27,8 15,0 27,8

Na2EDTA 37,3 20,0 37,3

Vitamin

Nicotinic acid 0,5 5,0 1,0

Pyridoxine-HCl 0,5 0,5 1,0

Thiamine-HCl 0,1 5,0 10,0

myo-Inositol 100 1.000 100

Glycine 2.0

NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY ...

Documents

Transcript of NGHIÊN CỨU TẠO, NHÂN PHÔI VÔ TÍNH VÀ RỄ BẤT ĐỊNH CÂY ...