juliana frança dos reis costa

JULIANA FRANÇA DOS REIS COSTA

Influência dos leucócitos do colostro no desenvolvi mento da

microbiota intestinal, resposta imune inata e incid ência de diarreias

em bezerras recém-nascidas

São Paulo

2016

JULIANA FRANÇA DOS REIS COSTA

Influência dos leucócitos do colostro no desenvolvi mento da

microbiota intestinal, resposta imune inata e incid ência de

diarreias em bezerras recém-nascidas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento:

Clínica Médica

Área de concentração:

Clínica Veterinária

Orientadora:

Profa. Dra. Viviani Gomes

São Paulo

2016

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.3332 Costa, Juliana França dos Reis FMVZ Influência dos leucócitos do colostro no desenvolvimento da microbiota intestinal,

resposta imune inata e incidência de diarreias em bezerras recém-nascidas / Juliana França dos Reis Costa. -- 2016.

156 f. : il. Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia. Departamento de Clínica Médica, São Paulo, 2016.

Programa de Pós-Graduação: Clínica Veterinária. Área de concentração: Clínica Veterinária.

Orientador: Profa. Dra. Viviani Gomes.

1. Colostro congelado. 2. Colostro fresco. 3. Contagem bacteriana. 4. Neutrófilos.5. Fagocitose. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Autor: COSTA, Juliana França dos Reis

Título: Influência dos leucócitos do colostro no desenvolvi mento da microbiota

intestinal, resposta imune inata e incidência de di arreias em bezerras

recém-nascidas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do titulo de Mestre em Ciências

Data: _____/_____/_____

Banca Examinadora

Prof. Dr._____________________________________________________________

Instituição:__________________________ Julgamento:_______________________

Prof. Dr._____________________________________________________________


Prof. Dr._____________________________________________________________


DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a Deus que sempre guiou

meus passos, permitindo-me ter saúde e força para

enfrentar todos os obstáculos impostos pela vida e

também por me cobrir de bênçãos e alegrias.

À minha mãe Sylvia que nunca mediu esforços para

me ajudar em todos os momentos da minha vida; ao

meu pai Esio, que de onde estiver sei que sente

imenso orgulho de mim; ao meu irmão Bruno, que

desempenhou papel importante ao me guiar nos

primeiros estudos, me ensinando muito.

Ao meu marido Thiago, pelo amor, carinho e

companheirismo que me inspira e motiva

diariamente. Juntos, iremos sempre mais longe.

À minha orientadora Profa. Dra. Viviani Gomes, por

toda determinação e excelência com que

desempenha seu trabalho diariamente.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela minha saúde... pela incrível força, paz e serenidade que me

fez seguir adiante nos momentos de dificuldade e por ser tão bom e generoso ao

proporcionar inúmeras realizações e alegrias em minha vida.

À minha mãe, Sylvia de França Guimarães, companheira e melhor amiga de uma

vida inteira. Obrigada por todas as ajudas, pelos nossos momentos “mãe e filha”, por

me orientar, aconselhar, me salvar sempre que precisei de última hora, jamais

medindo esforços para isso. Muito obrigada por sacrificar a sua vida, pela minha.

Serei eternamente grata e espero conseguir ser uma mãe tão boa para meus filhos!

Ao meu pai, Esio dos Reis Filho, que me deixou em meio à correria do experimento,

em que tivemos a oportunidade de nos vermos pela última vez num domingo, dentro

do laboratório da FMVZ, na sala do fluxo já que infelizmente estava muito difícil

conciliar tempo para ir visitá-lo. Me desculpe pelos momentos de ausência! Sei do

tanto que valorizava o estudo e principalmente a USP. Sei que você foi embora

orgulhoso do que viu por mais que, apesar de médico, tenha achado “complexo

demais” acompanhar todo este avanço. Obrigada por ter exigido tanto de mim

durante a vida inteira. Inúmeras vezes eu achei essa cobrança excessiva; mas, sem

isso, talvez eu não tivesse chegado até aqui. Obrigada! Saudades, pai!

Ao meu irmão, Bruno França dos Reis, a pessoa mais inteligente que já conheci,

meu grande orgulho. Obrigada por ter dividido comigo sempre seu imenso

conhecimento sobre tudo e ter me ensinado sobre tantas coisas nesta vida.

Obrigada pela amizade, parceria e irmandade que nos une e unirá eternamente.

Ao meu querido marido Thiago João Costa, meu grande companheiro, amor da

minha vida. Obrigada por tudo. Por sempre me incentivar a crescer, estar ao meu

lado e por valorizar cada conquista. Você é um exemplo de profissional,

comprometido, batalhador e merecedor de todas as suas conquistas. Obrigada por

entender e aceitar sempre que precisei estar longe de casa, por ser um marido tão

dedicado à nossa família e por estarmos juntos construindo, dia após dia, cada um

dos nossos sonhos. Te amo muito!

À minha orientadora, Profa. Dra. Viviani Gomes, primeiramente pela oportunidade

que me proporcionou ao abrir as portas de sua equipe desde a Iniciação Científica

em 2013, sem ainda me conhecer muito bem, proporcionando-me não apenas esta

conquista, mas também inúmeras outras oportunidades nesta trajetória. Obrigada

pela confiança depositada em mim e no meu trabalho. Você é um exemplo de

persistência e a prova de que com muito empenho, força de vontade e dedicação

chegaremos lá! Muito obrigada!

Ao ilustre diretor da FMVZ/USP Prof. Dr. José Antonio Visintin e aos admirados

professores do Departamento de Clínica Médica: Profa. Dra. Alice Maria Melville

Paiva Della Libera, Prof. Dr. Archivaldo Reche Junior, Profa. Dra. Carla Bargi Belli,

Prof. Dr. Carlos Eduardo Larsson, Profa. Dra. Denise Saretta Schwartz, Prof. Dr.

Enrico Lippi Ortolani, Prof. Dr. Fábio Celidonio Pogliani, Prof. Dr. Fernando José

Benesi, Profa. Dra. Lílian Gregory, Profa. Dra. Márcia de Oliveira Sampaio Gomes,

Profa. Dra. Marcia Mery Kogika, Profa. Dra. Maria Cláudia Araripe Sucupira, Profa.

Dra. Maria Helena Matiko Akao Larsson, Profa. Dra. Mitika Kuribayashi Hagiwara,

Profa. Dra. Raquel Yvona Arantes Baccarin, Profa. Dra. Silvia Regina Ricci, Profa.

Dra. Viviani Gomes e Prof. Dr. Wilson Roberto Fernandes.

À Profa. Dra. Karina Medici Madureira pela parceria, colaboração nas análises

laboratoriais e artigos, bem como pelos momentos de descontração em suas vindas

à FMVZ/USP. Ao Jean Silva Ramos pela prontidão em ajudar a todos à sua volta.

Obrigada!

À Rejane dos Santos Sousa pela ajuda nas análises de cortisol e por ser sempre

atenciosa com a nossa equipe.

Ao Prof. Dr. David John Hurley, da "University of Georgia" por auxiliar nas ideias,

técnicas e análises da proposta inicial deste trabalho, além de transmitir seus

conhecimentos e sugestões sempre que solicitamos sua ajuda. Obrigada por me

receber em sua Universidade durante o pós doc da professora Viviani e me mostrar

um pouco da fascinante realidade da pesquisa nos Estados Unidos.

À Profa. Dra. Alice Maria Melville Paiva Della Libera pelo carinho comigo nesses

anos, e por sempre nos mostrar que é possível buscar um equilíbrio saudável entre

a vida pessoal e uma carreira de sucesso. À Profa. Dra. Carla Maria Bittar por já ter

contribuído bastante com seu conhecimento à nossa equipe, e agora agradeço por

terem aceito o convite para compor a banca desta dissertação.

Aos colegas de equipe: Sylvia Marquart Fontes Novo e Camila Costa Baccili além de

excelentes profissionais, por terem sido maravilhosos seres humanos ao agarrarem

como de vocês toda a minha parte a campo do experimento, no momento em que

precisei me ausentar pelo súbito falecimento do meu pai. Agradeço do fundo do meu

coração, pois vocês foram além do limite para me ajudar nesse momento tão difícil e

só por isso foi possível finalizar este trabalho com a máxima qualidade. Agradeço

também à nossa orientadora que mesmo estando em seu pós doc nos EUA, soube

nos auxiliar e conduzir esta situação, ajudando da melhor forma a todos. Muito

obrigada por, acima de tudo, terem demonstrado apoio, carinho e amizade!

Aos membros da equipe que, mesmo já tendo saído, tiveram participação

importante em minha trajetória: Cynthia Pereira da Costa e Silva, Vinicius Alvim

Passos Baldacim pelos saudosos momentos do IC e Bruno Toledo Silva, muito

obrigada! Aos mais novos: Camila Cecília Martin obrigada pelo apoio, convívio

alegre e diário e Natalia Meirelles Sobreira pela ajuda com os animais na fazenda.

Boa sorte nesta fase que se inicia! A todos, muito sucesso!

Stephanie Blima e Milena Maia, obrigada pela ajuda durante o experimento. Pamella

Lorenci, amiga de tantos anos, obrigada pela ajuda na fazenda e por me mostrar

que tudo sempre tem o lado bom. À Ana Pérola por toda a atenção, pelas inúmeras

vezes que me ajudou e por ser muito querida comigo. À Karen Nascimento da Silva,

muito obrigada pela ajuda na reta final da dissertação. Ao nosso padrinho Luciano

Donizeti Varanda pela amizade, companheirismo e ensinamentos em todos os

momentos.

Aos colegas do Programa de Pós-Graduação, boa sorte a todos!

À minha família, amigos do Colégio Santa Cruz (G8) e amigas da Universidade

Anhembi Morumbi, muito obrigada pelo carinho, por me apoiarem, me ajudarem, me

darem força e coragem mesmo sem entender inúmeras vezes o que eu realmente

fazia por aqui. Obrigada por aceitarem e respeitarem os momentos em que eu

precisei me ausentar e por nunca me cobrarem por isso. À Franciane Corrêa

Cardoso que desde a minha graduação me ensina muito na área da veterinária e,

hoje em dia, principalmente, sobre a vida. Amo vocês! Obrigada a todos!

À biomédica Cláudia Regina Stricagnolo pela fundamental e inigualável ajuda

durante o período em que estive aqui, desde a Iniciação Científica até o mestrado.

Muito obrigada por todas as bactérias identificadas, placas na estufa, empréstimos

de material e companhia nas tardes de laboratório.

À Samantha Ive Miyashiro por toda a ajuda com o citômetro e pelo carinho de

sempre! Muito obrigada! À Dinha por tornar o ambiente mais alegre e engraçado,

além de manter sempre os materiais impecáveis para a nossa equipe! Obrigada! À

toda equipe dos Laboratórios da FMVZ/USP, Clara Mori, Maria Helena da Silva

Pelissari e Marly Elizabeth Ferreira. À Nicolle Gilda Teixeira de Queiroz

Hazarbassanov do Laboratório do Departamento de Patologia pelos conhecimentos

transmitidos, sempre pronta a ajudar desde a época da Iniciação.

Gostaria de agradecer a toda a equipe da Fazenda Colorado que nos abriu as portas

para que o experimento pudesse ser realizado lá. Aos veterinários Natália Meirelles

Sobreira e Sergio Soriano, além de todos os funcionários que colaboraram direta ou

indiretamente, muito obrigada!

Aos residentes da Clínica de Bovinos e Pequenos Ruminantes (CBPR) de 2013 a

2016, muito obrigada! Todos vocês sempre nos ajudaram prontamente em algum

momento! Em especial aos residentes Rodrigo, Camila, Marcela, Joel, Mailson e

Giuliana que nos ajudaram nas coletas do mestrado. Muito obrigada e sucesso para

vocês!

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Pa ulo - FAPESP pela

concessão do auxílio de pesquisa (2013/06152-7).

“O saber a gente aprende com os mestres e os livros. A sabedoria, se

aprende é com a vida e com os humildes.”

Cora Coralina

“Seja quem você for, seja qualquer posição que você tenha na vida,

do nível altíssimo ao mais baixo, tenha sempre como meta muita força,

muita determinação e sempre faça tudo com muito amor

e com muita fé em Deus que um dia você chega lá,

de alguma maneira você chega lá...”

Ayrton Senna

RESUMO

COSTA, J. F. R. Influência dos leucócitos do colostro no desenvolv imento da microbiota intestinal, resposta imune inata e incid ência de diarreias em bezerras recém-nascidas. [The influence of colostrum leukocytes in the development of intestinal microbiota, innate immune response, and incidence of diarrhea in newborn calves]. 2016. 156 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a influência dos leucócitos do colostro

bovino na imunidade inata, desenvolvimento da microbiota intestinal e ocorrência de

diarreias em bezerras Holandesas recém-nascidas. Para isso, 20 bezerras

Holandesas foram acompanhadas nos seguintes momentos: antes da mamada do

colostro (D0); 1-2 (D2); 7 (D7); 14 (D14); 21 (D21) e 28 (D28) dias após nascimento

e foram distribuídas em dois grupos experimentais: grupo COL+ recebeu colostro

fresco (4L) proveniente de suas respectivas mães; e grupo COL- recebeu colostro

congelado e acelular (4L) de vacas doadoras. Capítulo 1 – O objetivo deste capítulo

foi avaliar a presença e influência dos leucócitos do colostro na colonização do trato

gastrintestinal. Para isso, amostras de colostro foram semeadas em TSA e

MacConkey para CBT e CCT; e amostras de fezes em agar sangue, MacConkey e

Salmonella-Shiguella. Bezerras apresentaram maior frequência de diarreia no D14

(COL+=78%; COL-=60%). O grupo COL- apresentou maior CBT e CCT/mL

(3,93x106 ufc/mL e 3,01x105 ufc/mL) em relação ao COL+ (0,94x106 ufc/mL e

0,78x105ufc/mL). Sobre as espécies bacterianas isoladas, as que foram mais

frequentes no COL+ foram Proteus mirabilis (29,91%), Escherichia coli (28,04%),

Citrobacter freundii (5,61%) e Staphylococcus spp (5,61%), no COL- foram

Escherichia coli (28,70%), Proteus mirabilis (27,78%), Klebsiella pneumoniae

(11,32%) e Morganella morganii (5,66%). O momento com maior isolamento em

ambos os grupos foi o D2 (COL+ = 26 cepas; COL- = 27 cepas), período em que

iniciou a diarreia nas bezerras. Não foi possível detectar diferenças entre as

frequências de microrganismos entre os grupos COL+ e COL-. A administração de

colostro COL+ e COL- não influenciou na proporção de bactérias aeróbias presentes

nas fezes e na ocorrência de diarreia das bezerras durante o período neonatal.

Capítulo 2 – O objetivo deste capítulo foi avaliar a influência dos leucócitos do

colostro na resposta imune inata em bezerras Holandesas. Os animais foram

submetidos ao exame clínico, seguido da colheita das amostras sanguíneas para

realização das provas laboratoriais. As concentrações de cortisol sérico e

haptoglobina não apresentaram diferenças estatísticas, enquanto a concentração de

ferro foi diferente entre os grupos no D7. No leucograma não foi detectada diferença

para os leucócitos totais e neutrófilos absolutos, mas houve tendência entre os

grupos no D7 para os valores de neutrófilos relativos. O marcador CH138+CD62L+

não apresentou diferença entre os grupos, apesar da maior expressão ter sido

detectada no COL-. A expressão de CH138+CD62L- foi maior no COL+ no D14. A

fagocitose e produção de H2O2 pelos neutrófilos sanguíneos apresentou perfil

semelhante em relação ao S. aureus e E. coli entre os grupos, apesar do COL-

apresentar maior intensidade de fagocitose do D7 ao D14. Houve tendência para o

aumento da proporção de granulócitos liberando H2O2 basal no D14 para o COL-,

entretanto o COL + apresentou tendência para maior intensidade da fagocitose no

D21. A proporção de granulócitos (%), estimulados com S. aureus, liberando H2O2

foi maior no COL+ em D7, enquanto o estímulo com a E. coli não resultou em

diferenças entre os grupos. A intensidade de fluorescência foi maior e gradual no

COL+ quando as células foram estimuladas, porém não foram encontradas

diferenças estatísticas. As células do colostro influenciaram no perfil sanitário

apresentado pelas bezerras, observando-se maior intensidade de diarreias, menores

teores de ferro sérico e anemias no grupo que recebeu colostro congelado. A

migração dos granulócitos sanguíneos foi mais rápida e intensa no COL+ em relação

ao COL-, após exposição natural aos patógenos causadores de diarreia. O índice de

fagocitose (%) dos granulócitos apresentou semelhança entre os grupos, entretanto

a intensidade da fluorescência foi mais intensa no COL-. Em contrapartida, o COL+

demonstrou maior habilidade em produzir H2O2.

Palavras-chave: Colostro congelado. Colostro fresco. Contagem bacteriana.

Neutrófilos. Fagocitose.

ABSTRACT

COSTA, J. F. R. The influence of colostrum leukocytes in the devel opment of intestinal microbiota, innate immune response, and incidence of diarrhea in newborn calves. [Influência dos leucócitos do colostro no desenvolvimento da microbiota intestinal, resposta imune inata e incidência de diarreias em bezerras recém-nascidas]. 2016. 156 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2016.

The aim of this study was to evaluate the influence of bovine colostrum leukocytes in

innate immunity, in the development of the intestinal microbiota and the occurrence

of diarrhea in newborn Holstein calves. For this, 20 Holstein calves were followed in

the following moments: before colostrum intake (D0); 1-2 (D2); 7 (D7); 14 (D14); 21

(D21) and 28 (D28) days after birth. They were divided into two experimental groups:

COL+ group, which received fresh colostrum (4L) from their mothers; and COL-

group which received frozen and acellular colostrum (4L) of donor cows. Chapter 1 -

The aim of this chapter was to evaluate the presence and influence of colostrum

leukocytes in the colonization of the gastrointestinal tract. For this, colostrum samples

were seeded in TSA and MacConkey for TPC and TCC; and stool samples on blood

agar, MacConkey and Salmonella-Shiguella. Calves presented higher frequency of

diarrhea in D14 (COL+ = 78%; COL- = 60%). The COL- group showed higher TPC

and TCC/mL (3,93x106cfu/mL and 3,01x105 cfu/mL) compared to COL+ (0,94x106

cfu/mL and 0,78x105 cfu/mL). Regarding the isolated bacterial species, those that

were more frequent in the COL+ were Proteus mirabilis (29.91%), Escherichia coli

(28.04%), Citrobacter freundii (5.61%) and Staphylococcus spp (5.61%); in the COL-

were Escherichia coli (28.70%), Proteus mirabilis (27.78%), Klebsiella pneumoniae

(11.32%) and Morganella morganii (5.66%). The moment with more insolation in both

groups was the D2 (COL+ = 26 strains; COL- = 27 strains), period in which started

the diarrhea in calves. It was not possible to detect differences between the

frequencies of microorganisms between the COL+ and COL- groups. The COL+ and

COL- colostrum management did not influence the proportion of aerobic bacteria

present in feces and the occurrence of diarrhea in calves during the neonatal period.

Chapter 2 – The aim of this chapter was to evaluate the influence of colostrum

leukocytes in the innate immune response in Holstein calves. The animals were

submitted to clinical examination, followed by blood samples collection to perform

laboratory tests. The serum cortisol and haptoglobin concentrations did not show

statistical differences while the iron concentration was different between groups at

D7. The leukogram did not show difference to total leukocytes and absolute

neutrophils, but there was a trend between groups at D7 for relative values of

neutrophils. The CH138+CD62L+ marker showed no difference between groups,

despite an increased expression was detected in COL-. The expression of

CH138+CD62L- was greater in COL+ at D14. The phagocytosis and production of

H2O2 by blood neutrophils showed similar profile in relation to S. aureus and E. coli

between groups, although COL- presented greater phagocytosis intensity from D7 to

D14. There was a trend for the increase of granulocyte proportion, releasing basal

H2O2 at D14 for COL-, however COL+ presented trend to a higher intensity of

phagocytosis at D21. The proportion of granulocytes (%) stimulated with S. aureus

releasing H2O2 was greater in COL+ at D7, while stimulation with E. coli resulted in

no differences between the groups. The fluorescence intensity was higher and

gradual in COL+ when cells were stimulated; however, it was not detected statistical

differences. The colostrum cells influenced in the health profile presented by the

calves, with a higher intensity of diarrhea, lower levels of serum iron and anemia in

the group that received frozen colostrum. The migration of blood granulocytes was

faster and more intense in COL+ in relation to COL- after natural exposure to

pathogens that cause diarrhea. The phagocytosis rate (%) of granulocytes showed

similarity between groups, although the fluorescence intensity of COL- was more

intense. In contrast, the COL+ demonstrated greater ability in producing H2O2.

Keywords: Frozen colostrum. Fresh colostrum. Bacterial count. Neutrophils.

Phagocytosis

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema da transferência de leucócitos do colostro materno até a

absorção pelo epitélio intestinal dos bezerros recém-nascidos –

São Paulo – 2016 ................................................................................. 35

Figura 2 - Resposta imune intestinal para bactérias entéricas e seus antígenos –

São Paulo – 2016 ................................................................................. 41

Figura 3 - Nascimento em baias de parição (a); colostragem em baias de

transição (b), localizadas na maternidade – São Paulo – 2016 ........... 46

Figura 4 - Esfregaço da secreção mamária do colostro fresco fornecido para as

bezerras do grupo com células viáveis (COL+) – São Paulo – 2016 ... 48

Figura 5 - Alojamento das bezerras durante o primeiro mês de vida – São Paulo

– 2016 .................................................................................................. 50

Figura 6 - Escores de fezes adotados para detecção da diarreia em bezerras no

primeiro mês de vida – São Paulo – 2016 ............................................ 52

Figura 7 - Etapas para a diluição seriada e plaqueamento das amostras de

colostro fornecido às bezerras (COL+) e (COL-) – São Paulo –

2016 ..................................................................................................... 53

Figura 8 - Crescimentos bacterianos na placa de TSA – CBT (a); crescimento de

bactérias Gram-negativas na placa com meio de cultura

MacConkey (b) – São Paulo – 2016..................................................... 54

Figura 9 - Demonstração da coleta de fezes com luva estéril direto da ampola

retal – São Paulo – 2016 ...................................................................... 55

Figura 10 - Fezes foram semeadas no fluxo, na presença do fogo em placas

agar sangue, agar MacConkey e SS – São Paulo – 2016 ................... 56

Figura 11 - Esquema do procedimento realizado no laboratório para identificação

das bactérias aeróbias das fezes – São Paulo – 2016......................... 57

Figura 12 - Exemplos dos crescimentos obtidos após 24 a 48 horas de

incubação das placas em estufa a 37°C – São Paulo – 2016 .............. 57

Figura 13 - Frequências (%) do escore fecal em bezerras Holandesas

amamentadas com colostro fresco (COL+) e colostro sem células

viáveis (COL- ) durante o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016 ... 61

Figura 14 - Contagem bacteriana total (CBT/mL) e contagem de coliformes totais

(CCT/mL) nas amostras de colostro com (COL+) e sem células

(COL-) – São Paulo – 2016 .................................................................. 63

Figura 15 - Correlações entre IgG, contagem bacteriana total (CBT), contagem

de coliformes totais (CCT) em amostras de colostro com (COL+) e

sem células viáveis (COL-) - São Paulo – 2016 ................................... 65

Figura 16 - Correlação entre sólidos totais, contagem bacteriana total (CBT),

contagem de coliformes totais (CCT) em amostras de colostro com

(COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016 .................. 66

Figura 17 - Comparação entre as diferentes espécies bacterianas isoladas a

partir das fezes das bezerras Holandesas (COL+) e (COL-) durante

o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016 ......................................... 71

Figura 18 - Número de isolamentos dos principais gêneros bacterianos isolados

nas amostras de fezes das bezerras Holandesas que ingeriram

colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo –

2016 ..................................................................................................... 73


transição (b), localizadas na maternidade – São Paulo – 2016 ........... 95

Figura 20 - Esfregaço da secreção mamária do colostro fresco fornecido para as

bezerras do grupo com células viáveis (COL+) – São Paulo – 2016 ... 97

Figura 21 - Alojamento das bezerras durante o primeiro mês de vida – São Paulo

– 2016 .................................................................................................. 98

Figura 22 - Escores de fezes adotado para detecção da diarreia em bezerras no

primeiro mês de vida – São Paulo – 2016 .......................................... 100

Figura 23 - Avaliação da proporção de granulócitos no sangue de bezerras

Holandesas no primeiro mês de vida – São Paulo – 2016 ................. 104

Figura 24 - Ensaio de avaliação da L-selectina – São Paulo – 2016 ...................... 105

Figura 25 - Ensaio de avaliação do CH138+ – São Paulo – 2016 .......................... 105

Figura 26 - Ensaio de avaliação do duplo positivo para CD62L+ e CH138+ – São

Paulo – 2016 ...................................................................................... 106

Figura 27 - Avaliação da proporção de PMN no sangue de bezerras Holandesas

– São Paulo – 2016 ............................................................................ 108

Figura 28 - Avaliação da produção de H2O2 basal, sem estímulos bacterianos,

pelas células PMN com DCFH-DA. Seleção do eixo FL1+ para

avaliação da produção de H2O2 pelos PMN sem estímulo

bacteriano – São Paulo – 2016 .......................................................... 108

Figura 29 - Avaliação da fagocitose das células PMN do sangue de bezerras

Holandesas que fagocitaram Staphylococcus aureus e Escherichia

coli – São Paulo – 2016 ..................................................................... 109

Figura 30 - Avaliação da produção de H2O2 e fagocitose pelas células PMN do

sangue de bezerras Holandesas com DCFH-DA e Staphylococcus

aureus – São Paulo – 2016 ................................................................ 110

Figura 31 - Avaliação da produção de H2O2 e fagocitose pelas células PMN do

sangue de bezerras Holandesas com DCFH-DA e Escherichia coli

– São Paulo – 2016 ............................................................................ 111

Figura 32 - Frequência do escore fecal e incidência de diarreia em bezerras

Holandesas (COL+) e (COL-) durante o primeiro mês de vida – São

Paulo – 2016 ...................................................................................... 114

Figura 33 - Frequência de anemias em bezerras Holandesas (COL+) e (COL-)

durante o primeiro mês de vida - São Paulo - 2016 ........................... 115

Figura 34 - Concentração de cortisol sérico (µg/dL) em bezerras Holandesas que

receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-),


Figura 35 - Haptoglobina sérica em bezerras Holandesas recém-nascidas que

receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) –

São Paulo – 2016 ............................................................................... 118

Figura 36 - Valores de concentração sérica de ferro (µM/L) em bezerras

Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com (COL+) e

sem células (COL-) - São Paulo – 2016 ............................................. 119

Figura 37 - Leucócitos totais (WBC) e neutrófilos (NEUTR) do sangue de

bezerras Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com

(COL+) e sem células (COL-) - São Paulo – 2016 ............................ 121

Figura 38 - Proporção de granulócitos CH138+ expressando o receptor CD62L

em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e

sem células viáveis (COL-), no primeiro mês de vida - São Paulo –

2016 ................................................................................................... 123

Figura 39 - Proporção (%) e intensidade da fagocitose (Média Geométrica– Geo

Mean) da fagocitose pelos granulócitos mediante liberação

espontânea ou estimulados, em bezerras Holandesas recém-

nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células

viáveis (COL-) – São Paulo - 2016 ..................................................... 128

Figura 40 - Produção de peróxido de hidrogênio (% e intensidade – Média

Geométrica – Geo Mean) pelos granulócitos, mediante liberação

espontânea ou estimulados, em bezerras Holandesas recém-

nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células

viáveis (COL-) - São Paulo - 2016...................................................... 129

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores médios, mínimos e máximos de imunoglobulinas avaliados

pelo colostrômetro e Brix para (COL+) e (COL-) – São Paulo –

2016 ..................................................................................................... 59

Tabela 2 - Mediana, mínimo, máximo, média e desvio padrão da CBT/mL (x106 e

log10) e CCT/mL (x105 e log10) nas amostras de colostro com

(COL+) e sem células (COL-) – São Paulo – 2016 .............................. 62

Tabela 3 - Distribuição das amostras de colostro com (COL+) e sem células

viáveis (COL-) de acordo com a CBT e CCT/mL – São Paulo –

2016 ..................................................................................................... 64

Tabela 4 - Valores de P para a correlação de Pearson em relação às

concentrações de IgG e sólidos totais correlacionados com CBT e

CCT obtidas a partir das amostras de colostro com (COL+) e sem

células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016 .......................................... 64

Tabela 5 - Frequências (%) e número de isolamentos por gêneros bacterianos

nas amostras de fezes das bezerras que ingeriram colostro com

(COL+) e sem células viáveis (COL-) do nascimento aos 28 dias de

vida – São Paulo – 2016 ...................................................................... 68

Tabela 6 - Número de espécies bacterianas e frequência dos isolamentos das

amostras de fezes das bezerras que ingeriram colostro com

(COL+) e sem células viáveis (COL-) do nascimento aos 28 dias de

vida – São Paulo – 2016 ...................................................................... 70

Tabela 7 - Concentração de cortisol sérico (µg/dL) em bezerras Holandesas que

receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-),


Tabela 8 - Valores da concentração (mg/dL) e densidade óptica (DO) para a

haptoglobina sérica em bezerras Holandesas que receberam

colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-), durante o

primeiro mês de vida - São Paulo - 2016 ........................................... 117

Tabela 9 - Valores da concentração de ferro sérico (µM/L) em bezerras

Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células

(COL-), durante o primeiro mês de vida - São Paulo – 2016 ............. 118

Tabela 10 - Médias e desvios-padrão para os leucócitos totais (WBC) e

neutrófilos (NEUTR) do sangue de bezerras Holandesas que

receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) - São

Paulo - 2016 ....................................................................................... 120

Tabela 11 - Médias e desvios-padrão para as proporções de granulócitos

CH138+ expressando o receptor CD62-L em bezerras Holandesas

que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-),

no primeiro mês de vida - São Paulo – 2016 .................................... 122

Tabela 12 - Proporção (%) e intensidade da fagocitose (Média Geométrica – Geo

Mean) e produção de peróxido de hidrogênio pelos granulócitos em

bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem

células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016 ........................................ 127

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Intervalos de referência para as funções vitais em bezerras no

primeiro mês de vida ............................................................................ 47

Quadro 2 - Escores de fezes adotado para detecção da diarreia em bezerras

no primeiro mês de vida ....................................................................... 51

Quadro 3 - Escores de broncopneumonia adotados para detecção da doença

em bezerras no primeiro mês de vida .................................................. 52

Quadro 4 - Fatores para conversão de números de colônias na placa TSA e

MacConkey para CBT/mL ou CCT/mL de colostro .............................. 54

Quadro 5 - Intervalos de referência para as funções vitais em bezerras no

primeiro mês de vida ............................................................................ 96

Quadro 6 - Escores de fezes adotado para detecção da diarreia em bezerras

no primeiro mês de vida ..................................................................... 100

Quadro 7 - Escores de broncopneumonia adotado para detecção da doença

em bezerras no primeiro mês de vida ................................................ 101

Quadro 8 - Ensaio de fagocitose e produção de H2O2 do sangue de bezerras

Holandesas ........................................................................................ 107

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

FC Frequência Cardíaca

FR Frequência Respiratória

bpm Batimentos por minuto

mpm Movimentos por minuto

T Temperatura

L Litros

Igs Imunoglobulinas

g gramas

ML mililitros

m metro

D dia

FITC Fluorescent Isothiocyanate

CBT Contagem Bacteriana Total

CCT Contagem de Coliformes Totais

TSA Tryptic Soy Agar

MC MacConkey

SOL Solução

SS Solmonella Shigella

PBS Phosphate-Buffered Saline

h Horas

mg miligramas

n número

DP Desvio Padrão

mM milimolar

q.s.p. quantidade suficiente para

VCM Volume Corpuscular Médio

HCM Hemoglobina Corpuscular Média

nm Nanômetro

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

PE Phycoerythrin

FSC Forward Scatter

SSC Side Scatter

E. coli Escherichia coli

PMN Polimorfonucleares

WBC White Blood Cells

CD Cluster of Differentiation

BHI Brain Heart Infusion

PAMPs Pathogen Associated Molecular Pattern

PRRs Pattern Recognition Receptors

RBC Red Blood Cells

APC Allophycocyanin

SFB Soro Fetal Bovino

NEUTR Neutrófilos

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

PI Iodeto de Propídio

µl Microlitro

µg Micrograma

ufc Unidades formadoras de colônia

LISTA DE SÍMBOLOS

°C Graus Celsius

- Negativo

± Mais ou menos

% Porcentagem

® Marca Registrada

> Maior que

≤ Menor ou igual que

< Menor que

= Igual

G Força G

β Beta

* Diferença estatística

† Tendênca

≥ Maior ou igual que

n° Número

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO GERAL ............................... ............................................... 29

2 REVISÃO DE LITERATURA .......................... ............................................ 30

2.1 TRANSFERÊNCIA DE IMUNIDADE PASSIVA .......................................... 30

2.1.1 Aspectos gerais ........................................................................................ 30

2.1.2 Células do colostro e seus produtos ...................................................... 32

2.1.3 Papel das células na resposta imune dos recé m-nascidos .................. 35

2.1.4 Papel das células do colostro como carreador as de bactérias ........... 38

2.1.5 Desenvolvimento da Resposta Imune de mucosa intestinal ................ 39

CAPÍTULO 1 - INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS DO COLOSTRO NA COLONIZAÇÃO

DO INTESTINO POR BACTÉRIAS AERÓBIAS ............... ....................................... 42

3 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 43

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................. .............................................. 46

4.1 BEZERRAS ................................................................................................ 46

4.2 MOMENTOS DE AVALIAÇÃO ................................................................... 50

4.3 AVALIAÇÃO CLÍNICA PERIÓDICA ........................................................... 51

4.4 ANÁLISES .................................................................................................. 52

4.4.1 CBT e CCT ................................................................................................. 53

4.4.2 Isolamento das bactérias das fezes ........................................................ 54

4.4.2.1 Amostra de fezes ........................................................................................ 55

4.4.2.2 Processamento das amostras de fezes ...................................................... 55

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 58

5 RESULTADOS ..................................... ...................................................... 59

5.1 QUALIDADE DO COLOSTRO ................................................................... 59

5.2 STATUS SANITÁRIO ................................................................................. 59

5.2.1 CBT e CCT no colostro ............................................................................ 62

5.2.2 Relação entre a CBT / CCT com a concentração de Igs no colostro ... 64

5.2.3 Isolamento enteropatógenos aeróbios ................................................... 66

6 DISCUSSÃO .............................................................................................. 75

6.1 QUALIDADE DO COLOSTRO ................................................................... 75

6.2 STATUS SANITÁRIO ................................................................................. 76

6.2.1 CBT e CCT no colostro ............................................................................ 77

6.2.2 Isolamentos bacterianos das fezes ........................................................ 80

7 CONCLUSÃO ...................................... ...................................................... 85

REFERÊNCIAS .......................................................................................... 86

CAPÍTULO 2 - INFLUÊNCIA DOS LEUCÓCITOS DO COLOSTRO NA RESPOSTA

IMUNE INATA DE BEZERRAS HOLANDESAS RECÉM-NASCIDAS . ................... 91

8 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 92

9 MATERIAL E MÉTODOS ............................. .............................................. 95

9.1 BEZERRAS ................................................................................................ 95

9.2 MOMENTOS DE AVALIAÇÃO ................................................................... 99

9.3 AVALIAÇÃO CLÍNICA PERIÓDICA ........................................................... 99

9.4 AMOSTRAS ............................................................................................. 101

9.5 ANÁLISES ................................................................................................ 101

9.5.1 Hemograma ............................................................................................. 101

9.5.2 Cortisol .................................................................................................... 102

9.5.3 Haptoglobina ........................................................................................... 102

9.5.4 Ferro ........................................................................................................ 103

9.5.5 Imunofenotipagem dos Neutrófilos ...................................................... 103

9.5.6 Fagocitose e Produção Peróxido de Hidrogênio ................................. 106

9.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................... 112

10 RESULTADOS .................................... ..................................................... 113

10.1 STATUS SANITÁRIO ............................................................................... 113

10.2 CORTISOL ............................................................................................... 115

10.3 HAPTOGLOBINA ..................................................................................... 117

10.4 FERRO ..................................................................................................... 118

10.5 LEUCÓCITOS TOTAIS E NEUTRÓFILOS SANGUÍNEOS ...................... 119

10.6 EXPRESSÃO DE MARCADORES NOS GRANULÓCITOS ..................... 121

10.7 FUNÇÃO DOS NEUTRÓFILOS ............................................................... 123

11 DISCUSSÃO ............................................................................................ 130

11.1 QUALIDADE DO COLOSTRO ................................................................. 130

11.2 STATUS SANITÁRIO DAS BEZERRAS................................................... 131

11.3 CORTISOL ............................................................................................... 134

11.4 HAPTOGLOBINA ..................................................................................... 135

11.5 FERRO ..................................................................................................... 136

11.6 PROPORÇÃO E FUNÇÃO DOS NEUTRÓFILOS .................................... 137

12 CONCLUSÕES ........................................................................................ 142

REFERÊNCIAS ........................................................................................ 143

13 CONCLUSÃO GERAL ............................... .............................................. 148

REFERÊNCIAS ........................................................................................ 149

ANEXOS .................................................................................................. 153

29

1 INTRODUÇÃO GERAL

Os bezerros recém-nascidos são agamaglobulinêmicos, imunossuprimidos e

possuem sistema imune específico imaturo ao nascimento, sendo dependentes do

colostro materno no primeiro mês de vida (CORTESE, 2009).

O colostro bovino é rico em componentes imunológicos como leucócitos,

citocinas e imunoglobulinas (NOCEK; BRAUND; WARNER, 1984; WILLIAMS, 1993;

CROSS; GILL, 2000; KORHONEN; MARNILA; GILL, 2000). O papel dos anticorpos

do colostro nos mecanismos imunes para a defesa das bezerras recém-nascidas

está bem consolidado, entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos que

envolvem as células e seus produtos.

As células do colostro são absorvidas pelos enterócitos e transferidas para o

sangue e órgãos linfoides das bezerras após colostragem (TUBOLY et al., 1988

LIEBLER-TENORIO; RIEDEL-CASPARI; POHLENZ, 2002; REBER et al., 2006). A

participação dessas células na resposta imune é amplamente aceita, porém pouco

se sabe sobre a intersecção e os mecanismos que envolvem as células maternas e

a imunidade dos recém-nascidos.

As poucas pesquisas realizadas nesta linha focaram seus estudos na

influência dos leucócitos do colostro, através da marcação de linfócitos sanguíneos,

na resposta imune de bezerras que ingeriram colostro celular e acelular. A resposta

imune inata das bezerras que receberam colostro fresco e congelado foi avaliada

apenas por Riedel-Caspari e Schimidt (1991a,b) e Riedel-Caspari (1993).

Diante do contexto apresentado, esta pesquisa avaliou a influência das

células do colostro na resposta imune inata e ocorrência de doenças em bezerras

Holandesas do nascimento aos 28 dias de vida, motivada pela busca de novas

estratégias de manejo de colostro para a otimização da imunidade e sanidade em

bezerras, durante a fase de desenvolvimento.

O objetivo geral desta pesquisa foi avaliar se os leucócitos do colostro

influenciam na colonização da microbiota intestinal, resposta imune inata e na

ocorrência de diarreias no período neonatal.

30

2 REVISÃO DE LITERATURA

Este tópico apresentará os principais aspectos relacionados à transferência

de imunidade passiva com ênfase no papel das células do colostro em relação à

colonização intestinal e desenvolvimento da resposta imune de bezerros recém-

nascidos.

2.1 TRANSFERÊNCIA DE IMUNIDADE PASSIVA

Os bezerros recém-nascidos são agamaglobulinêmicos, imunossuprimidos e

possuem sistema imune específico imaturo ao nascimento, sendo dependentes do

colostro materno no primeiro mês de vida (CORTESE, 2009).

2.1.1 Aspectos gerais

O colostro dos bovinos é composto por fatores imunes como imunoglobulinas

(Igs), células e seus subprodutos (GONZÁLEZ et al., 2013). Além disso, a secreção

mamária também possui elevadas concentrações de gordura, vitaminas solúveis em

gordura (retinol, tocoferol e β-caroteno), vitaminas solúveis em água (niacina,

tiamina, riboflavina, vitamina B12, piridoxal, piridoxamina e piridoxina), minerais (Ca,

P, Mg, Na, K, Zn, Fe, Cu, S e Mn), fatores antimicrobianos (lactoferrina, lisozima e

lactoperoxidase) e fator de crescimento semelhante à insulina que estimula o

crescimento dos recém-nascidos (REITER, 1978; TODHUNTER; SMITH;

SCHOENBERGER, 1985; KEHOE; JAYARAO; HEINRICHS, 2007).

A qualidade imunológica do colostro tem sido avaliada pelas concentrações

de imunoglobulinas (Igs). O colostro bovino é composto por aproximadamente 85-

90% de IgG, 5% de IgA e 7% de IgM que atravessam a barreira do epitélio da

glândula mamária migrando do fluido extracelular para a glândula mamária através

do mecanismo de endocitose (LARSON; HEARY; DEVERY, 1980).

31

Esta avaliação pode ser feita através do imunoensaio para a determinação

direta dos teores de IgG (IgG > 50g/L), entretanto esse teste é caro e sua leitura

deve ser realizada entre 18 a 24 horas de incubação. Este fato torna a escolha de

testes rápidos a campo mais adequada, tais como colostrômetro e refratômetro

(CHIGERWE et al., 2008; BIELMANN et al., 2010; QUIGLEY et al., 2013).

Recentemente foram estabelecidos novos pontos de corte para o teor de IgG (IgG ≥

80g/L) e sólidos totais (≥ 23%), respectivamente, determinados pelo colostrômetro e

refratômetro Brix (BARTIER; WINDEYER; DOEPEL, 2015).

A absorção das Igs pelas células epiteliais intestinais ocorre por pinocitose.

Durante as primeiras horas de vida, o abomaso das bezerras apresenta pequena

produção de ácido clorídrico, atividade mínima da pepsina gástrica, presença de

fator inibidor de tripsina e baixa atividade proteolítica intestinal. Estes fatores

protegem as Igs do colostro do processo de digestão (KRUSE, 1983). No intestino,

as Igs se ligam aos receptores Fc dos enterócitos (FcRn) responsáveis pelo

transporte ativo dessa substância do lúmen intestinal para a circulação sanguínea

dos neonatos. A permeabilidade do epitélio intestinal às macromoléculas ocorre

apenas entre as primeiras 18 a 24 horas de vida, possivelmente devido à

substituição das células intestinais que expressavam os receptores FcRn (GODDEN,

2008).

A quantidade de colostro fornecida para os bezerros é outro fator importante.

Recentemente vem sendo indicado o fornecimento de volume equivalente a 15% do

peso vivo ao nascimento, dentro das primeiras 12 horas de vida (PAULA, 2016),

entretanto McGuirk e Collins (2004) recomendaram o volume equivalente a 8-10%

do peso vivo ao nascimento, considerando que neste volume há a quantidade

suficiente de imunoglobulinas necessária para a transferência de imunidade passiva

e garantia da saúde e desenvolvimento das bezerras.

Após a ingestão do colostro, os níveis séricos de imunoglobulinas atingem

concentrações significativas em poucas horas. Bezerras apresentam falha na

transferência de imunidade passiva quando ocorrem concentrações de IgG menores

que 10mg/dL, quando avaliadas entre 24 e 48 horas de vida (NATIONAL ANIMAL

HEALTH MONITORING SYSTEM, 1996; WEAVER et al., 2000).

32

2.1.2 Células do colostro e seus produtos

Os leucócitos foram observados no colostro humano pela primeira vez por

Alexander Donné (1844) 1 apud Mandyla et al. (1982, p.995). Entretanto, a

transferência de imunidade celular da mãe ao recém-nascido foi sugerida no artigo

de revisão de Watson (1980).

Estima-se que o colostro bovino possui entre 1x106 e 2,5x106 células

somáticas/mL, dentre as quais cerca de 32% são viáveis (MCDONALD;

ANDERSON, 1981; LIEBLER-TENORIO; RIEDEL-CASPARI; POHLENZ, 2002;

GOMES et al., 2011; SILVA, 2014).

Os leucócitos colostrais apresentam perfil diferenciado em relação ao sangue

periférico. A população de leucócitos no colostro de primeira ordenha, colhido até

seis horas pós-parto, consiste em 13,3% de neutrófilos, 16,4% de linfócitos, 69,5%

de monócitos e células epiteliais e 0,27% de eosinófilos (GOMES et al., 2011).

Megank et al. (2014) avaliaram os leucócitos colostrais através da separação das

células por centrifugação e densidade de gradiente e obtiveram a proporção de

25,4% de linfócitos T, 2,9% de linfócitos B, e 32,7% de macrófagos.

A avaliação da atividade funcional das células do colostro é limitada pela

dificuldade do seu isolamento, devido à quantidade abundante de debris celulares,

gordura, proteínas e partículas auto-fluorescentes, que dificultam a separação das

células do colostro para sua avaliação funcional (GOMES et al., 2014).

Tuboly et al. (1988) foram os primeiros autores a comprovarem a

transferência de células do colostro para 23 leitões filhos de quatro porcas (A a D).

Os leucócitos do colostro foram isolados por gradiente de densidade com uso de

Ficoll-Paque, sendo posteriormente coradas com Tecnécio (Na99mTcO4) em solução

de NaCl. Após sete a dez horas de nascimento, 5mL da solução contendo as células

marcadas foram injetados por laparotomia diretamente no estômago dos leitões da

porca A e no jejuno dos leitões provenientes da porca B. Os leitões oriundos das

porcas C e D receberam a suspensão celular através de sonda naso-esofágica. Os

animais dos referidos grupos receberam células oriundas do colostro da própria mãe

ou doadoras. Três leitões das porcas B e C receberam células inativadas a 56ºC.

1 DONNÉ, A. Cours de microscopie: Complementaire des études medicales, v.1, n.1, Bailliere, Paris, 1844.

33

Após oito horas da aplicação do colostro os animais foram eutanasiados e os

fragmentos de duodeno, jejuno e linfonodos foram examinados por autorradiografia.

Tuboly et al. (1988) observaram que os leitões que mamaram colostro oriundo

de suas próprias mães apresentaram células colostrais na região cortical dos

linfonodos mesentéricos, enquanto os leitões que receberam colostro de doadoras

não apresentaram células nos ductos linfáticos, nem nos linfonodos, mas sim no

tecido epitelial do intestino. Em leitões que mamaram colostro de suas próprias

mães foram encontrados linfócitos no lúmen e frequentemente nas micro-

vilosidades, sozinhos ou agrupados. Em animais que mamaram colostro de

doadoras, muitas células colostrais foram encontradas no lúmen intestinal, porém,

no epitélio intestinal, foram encontradas apenas ocasionalmente. Assim, os autores

concluem que há migração intracelular dos leucócitos do colostro. Não houve

absorção de linfócitos que receberam colostro com células inativadas pela alta

temperatura.

Tuboly et al. (1995) também confirmaram a transferência de células maternas

para ovinos recém-nascidos.

Williams (1993) estudou a absorção intestinal de leucócitos colostrais

marcados com FITC em 49 leitões. Este autor observou a presença dos leucócitos

marcados na circulação sanguínea dos leitões em duas horas após a alimentação,

observando-se pico em relação à presença dessas células entre 5-7 horas após a

ingestão. Após 24 horas de ingestão, as células foram encontradas também no

fígado, pulmão, linfonodos, baço e tecidos gastrintestinais. Os autores encontraram

células marcadas no duodeno e jejuno, porém não foram encontradas células na

região do íleo, fora da placa de Peyer.

Liebler-Tenorio, Riedel-Caspari e Pohlenz (2002) comprovaram a absorção

dos leucócitos do colostro proveniente de vacas através da marcação dessas

células. O colostro foi ordenhado em até 15 minutos após o parto e as células

separadas por mecanismo de centrifugação. Ao pellet celular foi adicionado

fluorescent isothiocyanate (FITC). Os animais foram anestesiados e através de

laparotomia foi obtido acesso a duas regiões do intestino: no jejuno médio onde não

existe placa de Peyer e na região distal do íleo onde as placas de Peyer estão

presentes. Nestas regiões foram injetados 10 a 15 mL da suspensão celular

contendo as células maternas marcadas. Após 1h30 e 2 horas de exposição, uma

porção da alça intestinal de cada região previamente estabelecida foi removida e

34

fixada com solução de formalina. Em seguida, animais foram eutanasiados com

pentobarbital. Os fragmentos teciduais foram submetidos à imuno-histoquímica para

a detecção das células maternas.

Liebler-Tenorio, Riedel-Caspari e Pohlenz (2002) detectaram células

maternas marcadas no lúmen intestinal, na superfície, entre vilosidades e nas placas

de Peyer em todos os animais (n=3). Apenas macrófagos e linfócitos puderam ser

discernidos pela morfologia. Foi possível notar diferença na quantidade de leucócitos

observados no corte intestinal, provavelmente por diferenças na proporção das

células efetivamente marcadas ou perda de células durante o procedimento de

coloração, considerando que foi injetada a mesma quantidade da suspensão celular

(10-15mL). Foram encontradas mais células coradas nos seios ao redor dos

folículos linfóides das placas de Peyer em comparação ao epitélio e espaço

subepitelial, indicando rápido e eficiente transporte através do epitélio. Os autores

acreditam que através dos seios linfáticos ocorre a drenagem das células para os

linfonodos mesentéricos; além disso, os linfócitos absorvidos do colostro podem

recircular e serem encontrados em outros órgãos e tecidos que não o intestino.

Reber et al. (2006) compararam o efeito do colostro acelular e sem gordura

(congelados a -20ºC), acrescidos de células mononucleares do sangue periférico

materno, na resposta imune de bezerros recém-nascidos. As células foram isoladas

do sangue e marcadas com substância fluorescente (PKH26-GL, lido em FL2),

sendo administradas aos bezerros com seis horas de nascimento. Foram coletadas

amostras sanguíneas dos bezerros com 4, 8, 12, 24, 36 e 48 horas pós ingestão do

colostro. As células maternas no colostro foram encontradas na corrente sanguínea

de bezerros, avaliando assim, a capacidade de absorção e sua resposta imune. A

circulação destas células nos recém-nascidos foi monitorada por citometria de fluxo.

Os autores observaram que células maternas marcadas ganharam a circulação dos

bezerros após absorção pelo epitélio intestinal. Os autores consideraram que o

fenótipo das células maternas da glândula mamária pode facilitar a transferência dos

leucócitos maternos para a circulação do neonato. O pico de leucócitos na

circulação sanguínea dos bezerros ocorreu entre 12 a 24 horas após a ingestão do

colostro e grande parte das células que foram marcadas, foram encontradas no

sangue e, por fim, as células marcadas desapareceram da circulação apos 36 horas

de ingestão do colostro (Figura 1).

35

Reber et al. (2006) compararam bezerros que mamaram colostro fresco,

colostro com células mononucleares periféricas oriundas do sangue materno

marcadas com substância fluorescente, com bezerros que mamaram colostro

acelular. Os autores encontraram em seu experimento maior quantidade de

expressão de receptores indicativos de inflamação no grupo que mamou colostro

sem células (CD11a, CD11c, CD43 e CD62L).

Figura 1 - Esquema da transferência de leucócitos do colostro materno até a absorção pelo

epitélio intestinal dos bezerros recém-nascidos – São Paulo – 2016

Fonte: adaptado de: Reber (2000) por Costa, J. F. R. (2016)

2.1.3 Papel das células na resposta imune dos recém -nascidos

Experimentos recentes têm demonstrado que a presença das células no

colostro é um diferencial na resposta imune das bezerras recém-nascidas.

Entretanto, o papel destas células nos diferentes mecanismos da resposta imune

que conduzem ao amadurecimento imunológico das bezerras ainda são pobremente

compreendidos.

36

Riedel-Caspari (1993) administrou 109 unidades formadoras de colônia da

Escherichia coli enteropatogênica de forma oral para 20 bezerros em até três horas

pós-nascimento. Após a infecção e durante os próximos dois dias, 10 bezerros

receberam pool de colostro suplementado com células colostrais (COL+) e 10

bezerros receberam pool de colostro acelular (COL-). As bezerras pertencentes ao

grupo COL+ excretaram significativamente menor quantidade de bactérias E. coli

enteropatogênica nas fezes durante a primeira semana após a infecção e atingiram

o limite mínimo de detecção antes que o grupo COL-. A concentração de IgA e IgM

específicos contra E. coli no soro das bezerras COL+ foi significativamente superior

no período pós-natal do que no grupo COL-, e permaneceu um pouco acima durante

todo o período estudado.

Reber et al. (2008a) buscaram entender o impacto que as células do colostro

materno, quando absorvidas pelo epitélio intestinal, causam no desenvolvimento do

sistema imune dos recém-nascidos, avaliando a resposta adaptativa por meio da

fenotipagem de linfócitos. Para isso, 10 bezerros foram alimentados com colostro

com (COL+) e sem (COL-) células. Amostras de sangue foram colhidas

semanalmente durante o primeiro mês de vida. Todos os bezerros apresentaram

uma baixa quantidade de anticorpos circulantes ao nascimento, e após a ingestão

do colostro, receberam quantidade semelhante de IgG, o que aumentou a

concentração sérica de IgG no sangue para aproximadamente 4.000 mg/dL.

Reber et al. (2008a) também observaram que os bezerros que receberam

colostro acelular (COL-) apresentaram maior número e intensidade de fluorescência

para os linfócitos expressando CD11a, quando comparados ao grupo que recebeu

colostro com células (COL+). O CD11a é relacionado pelos autores como um

marcador que indica inflamação sistêmica, sugerindo aumento na susceptibilidade

dos bezerros que não receberam leucócitos colostrais aos desafios ambientais e

agentes infecciosos. Bezerros COL- apresentaram demora no desenvolvimento do

sistema imune em 1 a 2 semanas quando comparados ao COL+, demonstrada pela

baixa expressão de receptores CD25+ e CD26+ pelos linfócitos e produção de

citocinas abaixo do valor considerado ótimo para as células responsivas. A

expressão de MHC de classe I rapidamente aumentou durante a primeira semana

de vida em ambos os grupos. Os autores concluem que cada vez mais tem sido

comprovado que as células do colostro representam uma importante arma para o

desenvolvimento do sistema imune do recém-nascido e que o grupo que mamou

37

colostro com células apresentou uma menor expressão dos marcadores que estão

relacionados com ativação linfocitária e estresse fisiológico.

Reber et al. (2008b) também examinaram o efeito dos leucócitos do colostro

materno no desenvolvimento e maturação das células apresentadoras de antígeno

dos neonatos. Ao nascimento, bezerros receberam colostro com (COL+) e sem

células (COL-). Semanalmente, amostras de sangue foram coletadas e marcadores

de células associadas com estresse fisiológico da linhagem dos monócitos foram

adicionados aos leucócitos sanguíneos. A maior diferença encontrada entre os

marcadores ocorreu nos primeiros sete dias de vida. Os bezerros que receberam

colostro sem células apresentaram maior expressão dos marcadores indicativos de

processos inflamatórios (CD11a, CD11c e CD14), quando comparados com o grupo

que mamou colostro com células. Os bezerros do COL- apresentaram um aumento

no número de monócitos no sangue periférico durante as primeiras duas semanas,

entretanto, essas células apresentaram menores níveis de expressão do CD25 e

MHC de classe I comparado com o grupo COL+, que apresentou maior ativação

celular e apresentação de antígenos. Os autores demonstram assim que a

transferência de leucócitos colostrais afeta a maturação da linhagem celular de

monócitos. Isso inclui um aumento na capacidade de apresentação de antígeno,

como indicado pelo aumento do MHC de classe I nos monócitos.

Langel et al. (2015) examinaram o efeito das células do colostro materno na

saúde e perfil imune das células de bezerras leiteiras, tendo como hipótese que

bezerras alimentadas com colostro fresco, contendo células viáveis (COL+), teriam

níveis de parâmetros sanguíneos aumentados no primeiro mês de vida, quando

comparados aos bezerros que fossem alimentados com colostro sem células viáveis

(COL-). Para isso, 37 bezerras das raças Holandesas e Jersey receberam colostro

fresco com (COL+) e sem células viáveis (COL-). O colostro fornecido foi de boa

qualidade (índice Brix > 32%). Os momentos avaliados foram: antes da mamada do

colostro (0h), 6h, D1, D3, D7, D14, D21 e D28. As células sanguíneas foram

avaliadas através da imunofenotipagem, além do acompanhamento da sanidade por

meio dos escores de fezes e broncopneumonia.

Langel et al. (2015) não observaram diferenças para os tratamentos nas

concentrações de IgG, IgM e IgA antes e depois da ingestão do colostro. Não foram

encontradas diferenças para o perfil sanitário das bezerras durante o estudo. O

momento de maior ocorrência de diarreias ocorreu no D14 para ambos os grupos.

38

Escores respiratórios aumentaram para os dois grupos no D12. O grupo COL-

apresentou valores inferiores de T auxiliar CD4+ e TCD4+CD62L+CD45RO- no D1, e

menos também de TCD4+CD62L+CD45RO+ no D1 e D3 do COL-, quando

comparado ao COL+. Em contrapartida, as bezerras COL- apresentaram maior

expressão de TCD4+CD62L-CD45RO+ com 6h de vida, 1, 3 e 7 dias e maior

proporção de monócitos no D7. A diferença entre a proporção de células

CD4+CD62L+CD45RO- no D1 para o grupo COL- pode ser explicado pela migração

das células que expressam CD62L através do intestino para o sangue. Não foram

detectadas diferenças entre os tratamentos para as células T gamma-delta. Desta

forma, os autores concluem que a transferência de células imunes intactas através

do colostro fresco pode desempenhar um papel importante no status imune do

neonato. Aumentando a capacidade imune da bezerra recém-nascida, aumentará a

resistência a doenças, resultando em animais saudáveis para o rebanho.

2.1.4 Papel das células do colostro como carreadora s de bactérias

O papel das células do colostro como carreadoras de bactérias maternas para

o intestino dos recém-nascidos tem sido suscitado. O isolamento de microrganismos

do colostro humano empregando-se técnicas tradicionais de cultivo bacteriano tem

sido mal sucedida. Entretanto, material genético de bactérias intestinais tem sido

detectado no interior das células presentes na secreção mamária em humanos

(PÉREZ et al., 2007).

Em bovinos, bactérias do grupo Staphylococcus foram detectadas a partir das

células do colostro cultivadas em meio enriquecido para Staphylococcus (24/72),

ágar sangue (26/72) e manitol (32/72). As principais células identificadas no colostro

foram células apresentadoras de antígenos - macrófagos (ADKINS et al., 2015).

A similaridade entre a microbiota das fezes e leite materno com as fezes dos

recém-nascidos tem suscitado a hipótese de que existe uma via entero-mamária, na

qual as bactérias do intestino materno são capturadas pelas células dendríticas e

transferidas para a secreção mamária. A maior biodiversidade bacteriana presente

nas células dendríticas de mulheres gestantes e lactentes, quando comparada com

39

as não gestantes e não lactentes, reforçam a retro-referida hipótese (PÉREZ et al.,

2007).

Os microrganismos apresentam padrões repetidos em sua superfície

conhecidos como PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Pattern) reconhecidos

pelos PRRs (Pattern Recognition Receptors) presentes nas células apresentadoras

de antígenos. Acredita-se que as células maternas migram para os linfonodos

mesentéricos e Placa de Peyer, induzindo a ativação e diferenciação dos linfócitos

naïve.

2.1.5 Desenvolvimento da Resposta Imune de mucosa i ntestinal

A resposta imune inata das mucosas possui mecanismos para impedir o

contato dos microrganismos residentes com o epitélio intestinal e circulação

sistêmica, pois não são inócuos e podem induzir resposta inflamatória intensa e

sepse (BRANDTZAEG, 2010; VERHASSELT, 2010; RESCIGNO, 2011; KOBOZIEV

et al., 2014).

Mecanismos da imunidade inata impedem o contato e destroem

microrganismos da microbiota residente para controle populacional. A barreira

intestinal é composta por muco e fatores antimicrobianos, secretados por diferentes

tipos celulares que compõem a mucosa intestinal, como as células Globet que

secretam grande quantidade de muco e proteína glicosilada altamente resistente à

digestão enzimática. A perda da camada de muco, penetração e aderência de

bactérias ao epitélio intestinal pode desencadear processo inflamatório. Outras

células epiteliais intestinais secretam potentes peptídeos microbianos como a

lecitina, capazes de destruir diretamente bactérias Gram-positivas. Células Paneth

localizadas nas criptas intestinais secretam defensinas e catelicidinas que

permeabilizam a membrana das bactérias. Também são produzidas lipocalina-2 e

catepsina-K (BRANDTZAEG, 2010; VERHASSELT, 2010; RESCIGNO, 2011;

KOBOZIEV et al., 2014).

A secreção de IgA é outro mecanismo usado para impedir o contato da

bactéria com o epitélio intestinal. Evidências sugerem que as células dendríticas da

Placa de Peyer do intestino delgado podem penetrar o epitélio intestinal, capturando

40

continuamente a microbiota residente do lúmen intestinal via endocitose. Estes

microrganismos são carregados pelas células dendríticas aos linfonodos

mesentéricos ou permanecem na Placa de Peyer, induzindo a ativação e

diferenciação das células B naïve para produção de IgA específica para bactérias

comensais. Estas células migram através da circulação sistêmica para a lâmina

própria do epitélio intestinal e secretam IgA no interstício intestinal. As IgA são

transportadas pelas células epiteliais até seu ápice e secretadas no lúmen intestinal

para ligar-se à microbiota residente, limitando sua habilidade em penetrar a mucosa

intestinal (BRANDTZAEG, 2010; KOBOZIEV et al., 2014).

Em função do grande número de bactérias no lúmen intestinal, é inevitável

que algumas consigam violar a barreira epitelial e alcançar a lâmina própria. Neste

caso, os invasores encontram a segunda linha de defesa do sistema imune

composta por fagócitos. Geralmente estes microrganimos são fagocitados e

destruídos por macrófagos intestinais através de ação enzimática ou produção de

radicais livres. É importante ressaltar que macrófagos intestinais produzem menores

concentrações de citocinas pró-inflamatórias que aqueles da circulação sistêmica

para limitação do processo inflamatório. Além disso, o macrófago intestinal é

extremamente hábil para reparação tecidual (BRANDTZAEG, 2010; VERHASSELT,

2010; RESCIGNO, 2011; KOBOZIEV et al., 2014).

Os microrganismos que colonizam a microbiota intestinal podem ajudar a

suprimir respostas imunes inadvertidas que poderiam ser desencadeadas por outros

patógenos (SARTOR, 2008).

Microrganimos invasores dispararam resposta imune envolvendo células T,

associadas a macrófagos e células mielóides. Antígenos associados às células

dendríticas nos linfonodos mesentéricos podem ativar, diferenciar e proliferar células

T para produzir resposta Th1 (celular) ou Th17. Estas células também migram dos

linfonodos para a lâmina própria intestinal onde estão as bactérias residentes, via

circulação sistêmica. Células Th1 e Th17 liberam citocinas pró-inflamatórias, como

IFN-gama, IL-17, IL-22, IL-21 e TNF-alfa, que ativam células apresentadoras de

antígeno presentes no tecido (macrófagos), resultando na geração adicional das

citocinas pró-inflamatórias IL-1 beta, IL-6, IL-8 e IL-12 e espécies reativas do

oxigênio (superóxido, peróxido de hidrogênio) e óxido nítrico. Estes mediadores

inflamatórios amplificam a atividade microbicida de macrófagos e aumentam a

expressão de moléculas de adesão (ICAM-1, VICAM-1 e E-selectina) na superfície

41

das células endoteliais, facilitando o recrutamento adicional de neutrófilos,

macrófagos e linfócitos para o tecido epitelial, colaborando com a defesa do

hospedeiro. A supressão da resposta inflamatória é realizada pelas células T CD4+

reguladoras (Treg). As bactérias também podem ser fagocitadas por endocitose

diretamente pelas células dendríticas e seguirem diretamente para os linfonodos

mesentéricos realizando o mesmo processo de apresentação aos linfócitos T e

expansão clonal (AUJLA; DUBIN; KOLLS, 2007; BRANDTZAEG, 2010;

VERHASSELT, 2010; IVANOV; LITTMAN, 2011; RESCIGNO, 2011; KOBOZIEV et

al., 2014) (Figura 2).

Figura 2 - Resposta imune intestinal para bactérias entéricas e seus antígenos – São Paulo – 2016

.

Fonte: adaptado de: Mowat (2003); Koboziev et al. (2014) por Costa, J. F. R. (2016). Legenda: Gut: intestino; Peyer`s Patch: placa de Peyer

42

CAPÍTULO 1 - INFLUÊNCIA DAS CÉLULAS DO COLOSTRO NA COLONIZAÇÃO

DO INTESTINO POR BACTÉRIAS AERÓBIAS

43

3 INTRODUÇÃO

O colostro apresenta uma diversidade de bactérias que possuem duas

origens distintas: microbiota materna e aquelas oriundas do processo de

contaminação entre a colheita e o fornecimento de colostro para as bezerras. O

papel das bactérias oriundas destes distintos grupos ainda é pobremente discutido

no que se refere à espécie bovina.

McGuire e McGuire (2015) ressaltam que a secreção mamária pode ser

considerada um probiótico devido à presença de microrganismos oriundos da

microbiota materna.

Staphylococcus, Streptococcus e Enterobacteriaceae representam os

principais grupos de bactérias aeróbias isoladas no leite materno humano (MARTIN

et al., 2012). O perfil de bactérias aeróbias também foi determinado no colostro e

leite de vacas em transição, observando-se a presença de Staphylococcus

coagulase negativa, Staphylococcus aureus, Streptococcus, Corynebacterium e

Serratia (SILVA, 2014).

Bifidobacterium e Lactobacilllus são os principais anaeróbios isolados no leite

materno humano (MARTIN et al., 2009), porém estes dados ainda não foram

relatados para os bovinos.

A importância das células do colostro como carreadoras de bactérias

maternas participantes do processo de colonização do intestino dos recém-nascidos

tem sido suscitada. Em bovinos, bactérias do grupo Staphylococcus foram

detectadas a partir das células do colostro cultivadas em meio enriquecido para

Staphylococcus (24/72), agar sangue (26/72) e manitol (33/72). As principais células

identificadas no colostro foram células apresentadoras de antígenos - macrófagos

(ADKINS et al., 2015).

Apesar da conotação positiva das bactérias do colostro provenientes da

microbiota materna, as pesquisas em bovinos têm sido focadas na presença do

grupo de bactérias oriundas da contaminação desse alimento da ordenha à

mamadeira das bezerras recém-nascidas. Nesta linha, os pesquisadores da área

buscam alternativas para reduzir a contagem bacteriana total (CBT) e a contagem

de coliformes totais (CCT) nas amostras de colostro fornecidas às bezerras.

44

Godden et al. (2012) comprovaram que a pasteurização do colostro a 60oC

por 30 minutos reduziu a CBT e CCT/mL (Log10 = 3,5 e 2,1; respectivamente) em

relação ao colostro fresco (Log10 = 5,6 e 4,7; respectivamente). A CBT e CCT/mL

apresentou correlação negativa com a concentração sérica de IgG, fato que explica

a maior incidência de diarreias e doenças totais nas bezerras que receberam o

colostro fresco.

Elizondo-Salazar e Heinrichs (2009) também determinaram o efeito do uso de

três diferentes tratamentos de colostro: sem aquecimento e congelado a -20oC

imediatamente após ordenha – baixa concentração de bactérias; pasteurização:

60oC por 30 minutos e em seguida congelados a -20oC; e sem aquecimento – alta

concentração de bactérias devido à exposição ambiental do colostro por 24 horas a

20oC. Os valores encontrados para CBT/mL e CCT/mL (log10) foi igual a 3,97 e 2,02;

5,61 e 3,16; 2,81 e 0,00 para os grupos sem aquecimento – baixa bactéria, sem

aquecimento – alta bactéria e pasteurização, respectivamente. As amostras de

colostro foram descongeladas e examinadas para Staphylococcus coagulase-

negativa, Streptococcus ambiental, não-coliforme Gram-negativos, Streptococcus

agalactiae e Staphylococcus aureus, de acordo com Jayarao et al. (2004). Não

foram observadas diferenças entre as concentrações de IgG em relação aos grupos

experimentais.

Muitas propriedades vêm utilizando colostro pasteurizado com o intuito de

diminuir a contaminação por microrganismos. Neste processo, o colostro é

submetido a alta temperatura (60ºC) e os leucócitos presentes nessa secreção são

destruídos (GODDEN et al., 2012). Apesar deste fato, Johnson et al. (2007) não

encontraram alterações no número total de leucócitos periféricos, neutrófilos e

linfócitos em animais que receberam colostro fresco ou pasteurizado.

A colonização bacteriana do intestino é um processo complexo, que se inicia

em pequena escala durante o período fetal, que é comprovada pela presença de

bactérias no líquido amniótico, mecônio e cordão umbilical de recém-nascidos

humanos. O contato com microrganismos pertencentes à microbiota vaginal,

intestinal e mamária da mãe, além daqueles pertencentes ao meio ambiente ao qual

o neonato está inserido, intensifica o processo de colonização intestinal após seu

nascimento. A composição da microbiota materna, local, forma de nascimento e

padrão de dieta desempenham importante papel na colonização intestinal (MARTIN

et al., 2012).

45

Staphylococcus, Bifidobacterium, Lactobacilllus, Streptococcus e

Enterobacteriaceae são os principais grupos bacterianos isolados no leite materno e

fezes de recém-nascidos humanos (MARTIN et al., 2012; FERNÁNDEZ et al., 2013).

Testes de biologia molecular confirmaram que mãe e recém-nascido compartilham

as mesmas cepas bacterianas, indicando que o leite materno pode contribuir para a

transferência de bactérias e colaborar com a colonização do intestino infantil

(MARTIN et al., 2012).

O perfil da microbiota das fezes das bezerras em aleitamento parece ser

semelhante aos humanos, observando-se predomínio de coliformes, Lactobacillus e

Bifidobacterium nos primeiros 21 dias de vida (RADA et al., 2006; VLKOVÁ;

TROJANOVÁ; RADA, 2006).

As pesquisas relatadas buscaram bactérias específicas e não foram

encontrados trabalhos que avaliassem o perfil dos microrganismos nas fezes das

bezerras por métodos tradicionais de cultivo. A desvantagem desta metodologia está

associada à ineficiência na detecção de anaeróbios como os Lactobacillus e

Bifidobacterium. Por outro lado, a identificação destes microrganismos requer o

emprego de técnicas de biologia molecular que exige treinamento e maior

investimento financeiro.

Apesar da grande relevância dos bovinos para a economia mundial, muitos

aspectos da sua biologia são ainda desconhecidos, incluindo a composição da sua

microflora normal e alterações relacionadas às doenças. A diversidade da população

bacteriana em bovinos ainda é muito pouco conhecida. Saber a complexidade e

ecologia de microrganismos presentes no intestino dos bovinos, principalmente no

período neonatal e suas alterações decorrentes das mudanças na forma de

aleitamento e alimentação é de extrema importância para o desenvolvimento de

estratégias eficazes para reduzir ou bloquear os distúrbios gastrintestinais.

A hipótese desta pesquisa é de que as células do colostro bovino influenciam

no perfil de enterobactérias aeróbias do trato gastrintestinal de bezerras Holandesas

recém-nascidas. Assim, o objetivo desta pesquisa foi avaliar se o fornecimento de

colostro com (fresco) e sem células viáveis (congelado) influencia na proporção das

espécies de bactérias aeróbias do trato gastrintestinal e ocorrência de diarreias no

período neonatal.

46

4 MATERIAL E MÉTODOS

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, protocolo nº 2934/2013.

4.1 BEZERRAS

As bezerras desta pesquisa eram oriundas de fazenda comercial de alta

produção, localizada no município de Araras – São Paulo. Este experimento foi

conduzido de julho a outubro de 2014.

Os partos foram assistidos pelos funcionários e veterinários da propriedade

para auxílio obstétrico, separação das recém-nascidas e controle do manejo de

colostro (Figura 3).

A equipe de pesquisa era acionada assim que os funcionários detectavam o

início do trabalho de parto para o deslocamento de pessoal e preparo do material

para a colheita das amostras.


transição (b), localizadas na maternidade – São Paulo – 2016

(a) (b) Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016).

47

Bezerras hígidas advindas de partos eutócicos foram selecionadas por meio

do exame clínico geral, segundo os procedimentos descritos por Dirksen et al.

(2008). Foram aferidas as frequências cardíaca (FC), respiratória (FR) e temperatura

corpórea (Quadro 1). Outros critérios foram usados para determinar a vitalidade das

bezerras, tais como: tônus muscular, irritabilidade reflexa e coloração das mucosas

oculares (RODRIGUES, 2008).

Quadro 1 - Intervalos de referência para as funções vitais em bezerras no primeiro mês de vida

Parâmetros Intervalos de Referência

1hora após nascimento 1ª semana 2ª semana 3ª semana 4ª semana

FC (bpm) 100,0-150,0 124,0±2,0 105,0±3,0 101,0±3,0 86,0±2,0

FR (mpm) 50,0-75,0 59,0±8,8 46,0±7,0 40,0±8,4 33,0±9,0

TEMP (°C) 39,0-39,5 38,6±0,3 39,0±1,0 39,0±0,4 39,0±0,3,0 Fonte: (SILVA et al., 2016, no prelo)2

Vinte bezerras hígidas foram triadas e distribuídas em dois grupos

denominados COL+ (n=10) e COL- (n=10). As bezerras do grupo COL+ receberam

colostro fresco com células proveniente de suas respectivas mães, enquanto os

animais COL- receberam colostro congelado sem células viáveis, oriundo de vacas

doadoras.

Vacas e doadoras foram ordenhadas imediatamente após a parição em

tronco de contenção localizado no interior da maternidade. Inicialmente foi realizada

a lavagem com solução clorada e secagem dos tetos com papel toalha individual.

O colostro das doadoras foi armazenado pelos funcionários da fazenda em

garrafas plásticas de 2L, mantidas sob refrigeração (4 - 8°C), por 24 horas. Por fim,

as garrafas foram estocadas a -20°C durante o período mínimo de 24 horas e

máximo de 3 meses.

Inicialmente, para justificar a ausência de leucócitos viáveis nas amostras

congeladas, foi realizado um projeto piloto pela equipe. Alíquotas de colostro fresco, 2 SILVA, B. T.; HENKLEN, A.; MARQUES, R. S.; OLIVEIRA, P.; L.; LEITE, S. B. P.; NOVO, S. M. F.; BACCILI, C. C.; REIS, J. F.; GOMES, V. Vital parameters of Holstein calves from birth to weaning. Revista Brasileira de Medicina Veterinária. [200-]. (no prelo).

48

refrigerado e congelado foram avaliadas quanto à sua viabilidade celular, de hora

em hora, durante as primeiras seis horas e, após, entre 18-24 horas. Com esse

estudo foi possível comprovar que as amostras de colostro congeladas não

apresentaram viabilidade celular após o congelamento (0%) desde os momentos

iniciais (NOVO et al., 2014).

A avaliação indireta da concentração de Igs do colostro foi realizada por meio

de colostrômetro e refratômetro Brix (23-32%). Foi possível determinar amplitudes

de variação entre 80 e 120g/L de Igs no colostro das vacas COL+; e 70 a 120g/L

para as vacas COL-.

A quantidade de células somáticas (1,9 milhões/mL; log10: 6,28) encontrada

no colostro foi estimada a partir das amostras de colostro fresco utilizando-se como

metodologia a contagem microscópica direta adaptada por Gomes et al. (2011)

(Figura 4).

Figura 4 - Esfregaço da secreção mamária do colostro fresco fornecido para as bezerras do grupo com células viáveis (COL+) – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: (a) macrófagos presentes em predominância no colostro; (b) neutrófilo; (c) glóbulos de gordura.

A primeira garrafa de colostro foi descongelada lentamente a 37°C para

alimentar as bezerras COL– dentro das primeiras seis horas de vida. A segunda

alimentação foi realizada no intervalo máximo de doze horas de vida, utilizando-se

outra garrafa de colostro descongelado.

(a)

(b)

(c)

49

Bezerras COL+ foram alimentadas com dois litros de colostro fresco nas

primeiras seis horas de vida. O colostro para a segunda mamada foi mantido sob

refrigeração a 4°C, levemente aquecido a 37°C pouco antes da sua administração

entre seis a 12 horas pós-nascimento.

A cura do umbigo foi realizada pela imersão completa do cordão umbilical em

recipiente contendo tintura de iodo a 10% por pelo menos 1 minuto e meio,

repetindo-se o processo após 12 horas. A partir do segundo dia, foi utilizada tintura

de iodo a 5% duas vezes ao dia até mumificação do cordão umbilical.

As bezerras COL+ e COL- foram mantidas inicialmente nas baias dentro da

maternidade, local onde foram realizados os exames clínicos iniciais, colostragem e

cura do umbigo, sendo posteriormente transferidas para o bezerreiro às 6 horas de

vida, onde permaneceram em baias de transição feitas de madeira não suspensas

até os primeiros três primeiros dias pós-nascimento. Por fim, os animais foram

transferidos e permaneceram em gaiolas de metal individuais suspensas, medindo

1,2m x 1m, em local com capacidade para 100 gaiolas (Figura 5).

50

Figura 5 - Alojamento das bezerras durante o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016

(a)

(c) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: (a) alojamento das bezerras recém-nascidas durante as primeiras horas de vida para exame clínico geral, colostragem e cura do umbigo; (b) baia de transição não suspensa onde ficaram até o terceiro dia de vida; (c) bezerreiro para onde as bezerras foram transferidas e permaneceram até o fim do experimento.

A partir deste momento, os animais foram alimentados em baldes, duas vezes

ao dia, sendo fornecido um total de seis litros de leite sem antibiótico proveniente do

rebanho, além do fornecimento de ração comercial3 e água ad libitum.

4.2 MOMENTOS DE AVALIAÇÃO

As bezerras foram avaliadas periodicamente logo após o nascimento (D0),

entre 24 a 48 horas de vida (D2) e nos dias 7, 14, 21 e 28 pós-nascimento (D7 a

D28). 3 Rumileite 20®, Guabi

51

4.3 AVALIAÇÃO CLÍNICA PERIÓDICA

Os animais foram avaliados clinicamente utilizando-se os escores de diarreia

e broncopneumonia de acordo com o Calf Heath Scoring Criteria previamente

publicado na University of Wiscosin - Madison (McGUIRK, 2008).

A consistência das fezes foi categorizada em escores, sendo 0 – consistência

normal, 1 – consistência pastosa e semi-formada, 2 – consistência aquosa com

maior quantidade de água, com conteúdo fecal aderido no períneo e cauda, 3 –

líquida, conteúdo fecal aderido no períneo e cauda. Diarreia foi considerada quando

o escore obtido foi 2 ou 3 (Quadro 2 e Figura 6).

Broncopneumonia foi estabelecida considerando-se os seguintes parâmetros:

temperatura retal, tosse, secreção nasal e ocular e posição de orelhas. Para cada

item foi atribuído o escore de zero a 3 de acordo com a severidade dos sintomas. A

soma dos sintomas acima de 5 foi utilizada para a detecção da Doença Respiratória

Bovina (Quadro 3).

A região umbilical externa foi avaliada por inspeção e palpação periódica para

a detecção de sinais inflamatórios.

Quadro 2 - Escores de fezes adotado para detecção da diarreia em bezerras no primeiro mês de vida

Parâmetros Escores

Consistência normal: firme, coloração amarronzada, períneo e cauda limpos e secos 0 Pastosa, semi-formada 1 Pastosa com maior quantidade de água: permanece sobre a “cama”; conteúdo fecal aderido ao períneo e cauda 2

Líquida: aquosa, conteúdo fecal aderido ao períneo e cauda 3 Fonte: (McGUIRK, 2008).

52

Figura 6 - Escores de fezes adotados para detecção da diarreia em bezerras no primeiro mês de vida – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016).

Quadro 3 - Escores de broncopneumonia adotados para detecção da doença em bezerras no primeiro mês de vida

Escores Temperatura retal ( OC) Tosse Secreção nasal Secreção ocular Posicionamento

das orelhas 0 Ausente Serosa Serosa Normal

1 38,3 - 38,8 Presente e única,

quando estimulada

Pouca quantidade,

unilateral Pouca quantidade

Balançar das orelhas ou

cabeça

2 38,9 - 39,3

Presente e repetida quando estimulada, ou

ocasional quando espontânea

Excessiva, mucosa e bilateral

Moderada quantidade

bilateral

Ligeiramente pendente, unilateral

3 ≥ 39,4 Presente, repetida

e espontânea

Abundante, mucopurulenta,

bilateral

Intensa quantidade,

bilateral

Pendentes intensamente,

bilateral ou torção da cabeça

Fonte: (POULSEN; McGUIRK, 2009).

4.4 ANÁLISES

A contagem bacteriana total (CBT) e de coliformes totais (CCT) do colostro foi

analisada através da cultura das amostras em meio Tryptic Soy agar (TSA) (Anexo

A) e agar MacConkey (MC) (Anexo B).

53

4.4.1 CBT e CCT

Amostras de colostro fornecidas às bezerras dos grupos COL+ e COL- foram

coletadas de forma asséptica de dentro da mamadeira e armazenadas em tubos

plásticos estéreis com capacidade para 15 mL. Os tubos foram armazenados em

freezer a -80°C até o momento do processamento das amostras.

Amostras de colostro foram descongeladas até 4°C, homogeneizadas com o

uso de vortex e submetidas a 5 diluições seriadas 1:10. Cada diluição foi pipetada

(100 µL) em placa de Petri contendo meio agar MacConkey para a CCT e meio TSA

para a CBT, conforme descrito por Godden (2012) (Figuras 7 e 8). As placas foram

incubadas por 48 horas, a 37°C, e o número de colônias foi convertido para ufc/mL

de acordo com quadro 4.

Figura 7 - Etapas para a diluição seriada e plaqueamento das amostras de colostro

fornecido às bezerras (COL+) e (COL-) – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: SOL: Solução

54

Figura 8 - Crescimentos bacterianos na placa de TSA – CBT (a); crescimento de bactérias Gram-negativas na placa com meio de cultura MacConkey (b) – São Paulo – 2016

(a) (b)


Quadro 4 - Fatores para conversão de números de colônias na placa TSA e MacConkey

para CBT/mL ou CCT/mL de colostro

Diluição 10-1 Multiplicar o no de colônias que cresceram na placa por 100

Diluição 10-2 Multiplicar o no de colônias que cresceram na placa por 1.000



Diluição 10-5 Multiplicar o no de colônias que cresceram na placa por 1.000.000


4.4.2 Isolamento das bactérias das fezes

A colonização bacteriana do trato gastrintestinal das bezerras foi analisada

através da cultura das fezes em meio agar sangue de carneiro 5% (Anexo C), agar

MacConkey e Salmonella-Shigella (SS) (Anexo D).

55

4.4.2.1 Amostra de fezes

As amostras de fezes foram obtidas usando luvas estéreis, diretamente da

ampola retal e foram armazenadas em tubos coletores universais estéreis (Figura 9).

Em seguida, uma alça flexível foi utilizada para coletar amostra de dentro do tubo

coletor que foi transferida para tubos de vidro contendo meio de transporte

Tetrationato (10mL) (Anexo E) e Iodo-Iodeto (200µL) (Anexo F). Ambas as amostras

foram mantidas refrigeradas a 4°C e processadas no prazo máximo de seis horas.

Figura 9 - Demonstração da coleta de fezes com luva estéril direto da ampola retal – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). 4.4.2.2 Processamento das amostras de fezes

Ao chegarem no laboratório, as amostras no frasco com tetrationato foram

incubadas em estufa bacteriológica durante 24 horas a 37°C. Após 24 horas de

incubação o frasco foi homogeneizado e a amostra foi semeada na placa contendo

agar Salmonella-Shigella (SS) nas condições descritas por Edwards; Ewing (1972).

56

As amostras mantidas no tubo coletor universal foram semeadas em placas

contendo agar sangue, agar MacConkey e SS. As placas foram incubadas a 37°C,

durante 24 horas. Após 24 horas de incubação, as placas que apresentaram

crescimento foram retiradas e protegidas em papel filme para melhor

armazenamento na geladeira até o momento da realização da série bioquímica. As

outras que não apresentaram crescimento nas primeiras 24 horas foram mantidas

na estufa até completarem 48 horas (Figuras 10 a 12).

Os microrganismos foram identificados segundo suas características de cultivo

morfo-tintoriais e séries bioquímicas com os açúcares: fenilalanina, citrato, indol,

vermelho de metil, avaliação da motilidade, produção de gás, lisina e ornitina

(KRIEG; HOLT, 1984) (Figura 11).

Figura 10 - Fezes foram semeadas no fluxo, na presença do fogo em placas agar sangue, agar MacConkey e SS – São Paulo – 2016


57

Figura 11 - Esquema do procedimento realizado no laboratório para identificação das bactérias aeróbias das fezes – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Figura 12 - Exemplos dos crescimentos obtidos após 24 a 48 horas de incubação das placas em

estufa a 37°C – São Paulo – 2016


58

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa estatístico SPSS

19.0 (IBM Corp. Released 2011. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0.

Armonk, NY: IBM Corp.). As análises foram consideradas significativas quando

P≤0,05 e tendência quando P>0,05 (*) e <0,1 (†).

Os dados da CBT e CCT inicialmente foram submetidos a uma transformação

logarítmica de base 10 para que fosse possível a realização de análise paramétrica.

Sendo assim, o teste T de Student para amostras independentes foi adotado para

comparação dos valores obtidos no colostro com (COL+) e sem células (COL-), e a

análise de variância (ANOVA) realizada para comparação entre os tempos (D0 a

D28) dentro do mesmo grupo. No caso onde ocorreram as transformações

logarítmicas, o p apresentado nas tabelas diz respeito aos testes relacionados com

os valores em log10, enquanto os valores descritos são reais.

As espécies e gêneros bacterianos obtidos a partir das fezes estão

apresentas em frequências. As espécies que obtiveram frequência superior a 5%

foram submetidas ao teste Qui-quadrado e Exato de Fisher para verificar se houve

associação com o tipo de colostro oferecido (COL+/COL-) e com a presença de

diarreia.

Nem todas as bezerras apresentaram sinais clínicos de doenças, entretanto,

as frequências positivas e negativas de escore para cada parâmetro foram avaliadas

pelo teste Qui-quadrado.

A correlação das IgG com as bactérias do colostro nos dois grupos COL+ e

COL- foram realizadas a partir da correlação de Pearson.

59

5 RESULTADOS

Este trabalho avaliou a influência das células do colostro na colonização do

trato gastrointestinal de bezerras Holandesas no período neonatal.

5.1 QUALIDADE DO COLOSTRO

A avaliação indireta da concentração de Igs e sólidos totais do colostro

administrado para as bezerras COL+ e COL- foi avaliada por meio de colostrômetro

e índice Brix, respectivamente. Foi possível determinar amplitudes de variação entre

80 e 120g/L de Igs no colostro das vacas COL+; e 70 a 120g/L para as vacas COL-

(Tabela 1).

Tabela 1 - Valores médios, mínimos e máximos de imunoglobulinas avaliados pelo colostrômetro e Brix para (COL+) e (COL-) – São Paulo – 2016


5.2 STATUS SANITÁRIO

A diarreia foi a doença mais frequente no período neonatal, seguida por

inflamações umbilicais e Doença Respiratória Bovina.

A incidência de diarreias foi avaliada a partir da tabulação de dados do

Parâmetros Colostrômetro (mg/dL)

p COL+ COL- Média 9700±1,17 10200±1,20 0,575 Mínimo 8000 7000 Máximo 12000 12000 Brix (%)

COL+ COL-

Média 27,6±3,69 28,5±3,78 0,596 Mínimo 23,0 23,0

Máximo 32,0 32,0

60

escore de fezes estabelecida segundo McGuirk (2008). A diarreia teve início no D2 e

a frequência aumentou do D7 (COL+ = 56%; COL- = 70%) ao D14 (COL+ = 78%;

COL- = 60%). Após estes momentos as bezerras apresentaram uma ligeira

diminuição na frequência de diarreias no D21 COL+ = 56%; COL- = 50%) e D28

(COL+ = 44%; COL- = 50%) (Figura 13).

A região umbilical externa foi avaliada através da inspeção e palpação

periódica para a detecção de sinais inflamatórios. Desta forma, foi possível detectar

que três bezerras do grupo COL- apresentaram inflamação umbilical no D14 (n=2) e

D28 (n=1). Além disso, também foram detectadas duas bezerras com

broncopneumonia em ambos os grupos: COL+ no D14 (n=1) e COL- no D21 (n=1).

Apesar da maior frequência de doenças encontradas no grupo COL-, não foi

possível comprovar diferenças estatísticas entre a frequência de diarreias ou

doenças totais usando o teste Qui-Quadrado.

61

Figura 13 - Frequências (%) do escore fecal em bezerras Holandesas amamentadas com colostro fresco (COL+) e colostro sem células viáveis (COL- ) durante o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016


0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D0

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D2

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D7

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D14

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D21

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D28

COL+

COL-

62

5.2.1 CBT e CCT no colostro

Os valores obtidos para CBT e CCT no colostro fornecido às bezerras COL+

e COL- estão expressos na tabela 2 e figura 14.

Foram obtidos valores médios de 0,94 x 106 ufc/mL e 3,93 x 106 ufc/mL para a

CBT do colostro fresco e congelado, respectivamente.

Para a CCT observou-se valores de 0,78 x 105 ufc/mL e 3,01 x 105 ufc/mL no

colostro fresco e congelado, respectivamente.

Não foi possível identificar diferenças entre as contagens bacterianas em

relação aos grupos COL+ e COL-.

Tabela 2 - Mediana, mínimo, máximo, média e desvio padrão da CBT/mL (x106 e log10) e CCT/mL (x105 e log10) nas amostras de colostro com (COL+) e sem células (COL-) – São Paulo – 2016


CBT/mL Log10 CCT/mL Log10

TOTAL DE BEZERRAS

(n = 20)

Mediana 1,0x106 6,02 0,83x105 4,92

Mínimo 0,046 x106 4,66 0,02x105 3,30

Máximo 15,0x106 7,19 22,1x105 6,34

COL +

Mediana 0,5 x 106 5,76 0,63x105 4,80

Mínimo 0,076 x106 4,88 0,06x105 3,79

Máximo 3,1x106 6,49 1,81x105 5,26

Média e DP 0,94x106 ± 0,92x106 5,98 0,78x105± 0,58 x105 4,90

COL -

Mediana 1,4 x106 6,17 0,99x105 5,00

Mínimo 0,046x106 4,66 0,02x105 3,30

Máximo 15,6x106 7,19 22,1x105 6,34

Média e DP 3,93x106 ± 5,14 x106 6,60 3,01x105± 6,7x105 5,48 Significância p 0,215 0,730

63

Figura 14 - Contagem bacteriana total (CBT/mL) e contagem de coliformes totais (CCT/mL) nas amostras de colostro com (COL+) e sem células (COL-) – São Paulo – 2016


As amostras de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) foram

distribuídas de acordo com a CBT/mL e CCT/mL (Tabela 3).

Em relação à CBT/mL, foram obtidas frequências de 40 e 30; 20 e 10; 20 e

10; 20 e 50% para os intervalos de 0 a 500.000; 500.001 a 1.000.000; 1.000.001 a

1.500.000; e > 1.500.001 nas amostras com (COL+) e sem células viáveis (COL-),

respectivamente.

Em relação à CCT/mL, foram obtidas frequências de 50 e 30; 10 e 20; 30 e

30; 10 e 0 e 0 e 20% para os intervalos de 0 a 500.000; 500.001 a 1.000.000;

1.000.001 a 1.500.000; e > 1.500.001 nas amostras com (COL+) e sem células

viáveis (COL-), respectivamente.

0

1

2

3

4

5

6

7

CBT/mL CCT/mL

Lo

g 10

COL+

COL-

64

Tabela 3 - Distribuição das amostras de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) de acordo com a CBT e CCT/mL – São Paulo – 2016

CBT/mL COL+ COL - Total

% Nº % Nº % Nº 0 a 500.000 40 4 30 3 35 7

500.001 a 1.000.000 20 2 10 1 15 3

1.000.001 a 1.500.000 20 2 10 1 15 3

> 1.500.000 20 2 50 5 35 7

Total 100 10 100 10 100 20

CCT/mL COL+ COL - Total

% Nº % Nº % Nº 0 a 50.000 50 5 30 3 40 8

50.001 a 100.000 10 1 20 2 15 3

100.001 a 150.000 30 3 30 3 30 6

150.001 a 200.000 10 1 0 0 5 1

> 200.000 0 0 20 2 10 2

Total 100 10 100 10 100 20


5.2.2 Relação entre a CBT / CCT com a concentração de Igs no colostro

Os dados obtidos a partir do colostrômetro e refratômetro Brix para a

concentração de IgG foram correlacionados com a contagem bacteriana no colostro

com (COL+) e sem células viáveis (COL-) (Figuras 15 e 16).

Não foi possível observar correlação entre a CBT/mL ou CCT/mL e a

qualidade do colostro avaliada pelo colostrômetro (IgG) ou Brix (sólidos totais). Os

valores de P obtidos a partir da correlação podem ser encontrados na tabela 4.

Tabela 4 - Valores de P para a correlação de Pearson em relação às concentrações de IgG e sólidos totais correlacionados com CBT e CCT obtidas a partir das amostras de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016

Parâmetros CBT CCT

COL+ COL- TOTAL COL+ COL- TOTAL

IgG Colostrômetro (mg/dL) 0,959 0,419 0,651 0,524 0,329 0,369

IgG Brix (%) 0,399 0,319 0,948 0,880 0,159 0,361


65

Figura 15 - Correlações entre IgG, contagem bacteriana total (CBT), contagem de coliformes totais (CCT) em amostras de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) - São Paulo – 2016


y = -0,0224x + 4,125R² = 0,0394

3,80

3,85

3,90

3,95

4,00

4,05

4,10

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

IgG

(m

g/d

L)

CBT Log10

Geraly = -0,0278x + 4,1248

R² = 0,0606

3,80

3,85

3,90

3,95

4,00

4,05

4,10

-1,00 1,00 3,00 5,00 7,00

IgG

(m

g/d

L)

CCT Log10

Geral

y = -0,0079x + 4,0271R² = 0,0032

3,85

3,90

3,95

4,00

4,05

4,10

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

IgG

(m

g/d

L)

CBT Log10

COL+y = -0,0281x + 4,1146

R² = 0,0354

3,85

3,90

3,95

4,00

4,05

4,10

0,00 2,00 4,00 6,00

IgG

(m

g/d

L)

CCT Log10

COL+

y = -0,0378x + 4,2334R² = 0,1248

3,80

3,85

3,90

3,95

4,00

4,05

4,10

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

IgG

(m

g/d

L)

CBT Log10

COL-y = -0,0296x + 4,1449

R² = 0,0897

3,80

3,85

3,90

3,95

4,00

4,05

4,10

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

IgG

(m

g/d

L)

CCT Log10

COL-

66

Figura 16 - Correlação entre sólidos totais, contagem bacteriana total (CBT), contagem de coliformes totais (CCT) em amostras de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016


5.2.3 Isolamento enteropatógenos aeróbios

O cultivo bacteriano das amostras fecais possibilitou a observação de uma

vasta variedade de espécies que colonizam o trato gastrintestinal das bezerras

Holandesas desde o nascimento até completarem o primeiro mês de vida.

y = -1,1064x + 34,632R² = 0,0413

0

5

10

15

20

25

30

35

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

Índ

ice

Bri

x (%

)

CBT Log10

Geraly = -1,5452x + 35,441

R² = 0,0802

0

5

10

15

20

25

30

35

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

IgG

Bri

x (%

)

CCT Log10

Geral

y = 0,6664x + 23,763R² = 0,0082

0

5

10

15

20

25

30

35

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

Índ

ice

Bri

x (%

)

CBT Log10

COL+y = -0,8788x + 31,756

R² = 0,0122

0

5

10

15

20

25

30

35

0,00 2,00 4,00 6,00

Índ

ice

Bri

x (%

)

CCT Log10

COL+

y = -2,263x + 42,391R² = 0,2241

0

5

10

15

20

25

30

35

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

Índ

ice

Bri

x (%

)

CBT Log10

COL-y = -1,8295x + 37,35

R² = 0,1711

0

5

10

15

20

25

30

35

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

Índ

ice

Bri

x (%

)

CCT Log10

COL-

67

A frequência e o número de gêneros bacterianos isolados a partir das

amostras de fezes das bezerras que receberam colostro fresco (COL+) e congelado

(COL-), do nascimento aos 28 dias de vida, estão expressos na tabela 5.

Observou-se similaridade entre o número de isolados nas fezes das bezerras

COL+ e COL-. O menor número de cepas foi obtido no D0 (COL+=8; COL-=8), e o

pico máximo de isolamentos foi observado no D2 para ambos os grupos (COL+=26;

COL-=27). Ao final do experimento, o número de isolados diminuiu (COL+=12; COL-

=16).

Em ambos os grupos, o momento com menor número de isolamentos foi o D0

com 8 isolamentos. Os gêneros presentes no grupo COL+ foram: Bactéria não

fermentativa (25%), Enterobacter spp (25%), Klebsiella spp (25%), Citrobacter spp

(12,50%) e Staphylococcus spp (12,50%). Os gêneros presentes no mecônio do

grupo COL- foram: Enterobacter spp (25%), Klebsiella spp (25%), Citrobacter spp

(12,50%), Bactéria não fermentativa (12,50%), Morganella spp (12,50%) e Proteus

spp (12,50%).

No grupo COL+ a bactéria mais isolada foi Escherichia coli com 9 isolamentos

que correspondem a 45,00% dos isolamentos no D14 e 9 isolamentos de Proteus

spp que também correspondem a 45,00% no D7.

No grupo COL- a bactéria mais isolada também foi Escherichia coli, observou-

se 9 isolamentos (52,94%) no D21. Isolou-se 9 cepas de Proteus spp (33,33%) no

D2 e 9 cepas (47,37%) no D7.

68

Tabela 5 - Frequências (%) e número de isolamentos por gêneros bacterianos nas amostras de fezes das bezerras que ingeriram colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) do nascimento aos 28 dias de vida – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016)

As espécies de bactérias aeróbias mais frequentes isoladas das amostras de

fezes das 20 bezerras do nascimento aos 28 dias de vida foram: Proteus mirabilis

(28,84%), Escherichia coli (28,37%), e Klebsiella pneumoniae (6,05%) (Tabela 6).

Foi possível observar que as espécies que estiveram em maior frequência

nas fezes durante o estudo para o grupo COL+ foram: Proteus mirabilis (29,91%),

Escherichia coli (28,04%), Citrobacter freundii (5,61%) e Staphylococcus spp

(5,61%) (Tabela 6).

Gêneros

COL+

D0 D2 D7 D14 D21 D28 TOTAL

% No % No % No % No % No % No % No

Bactéria não fermentativa 25,00 2 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 7,69 1 2,83 3

Citrobacter spp 12,50 1 19,23 5 5,00 1 5,00 1 5,26 1 0,00 0 8,49 9

Enterobacter spp 25,00 2 11,54 3 0,00 0 5,00 1 0,00 0 7,69 1 6,60 7

Escherichia spp 0,00 0 19,23 5 25,00 5 45,00 9 36,84 7 30,77 4 28,30 30

Klebsiella spp 25,00 2 15,38 4 0,00 0 10,00 2 15,79 3 7,69 1 11,32 12

Morganella spp 0,00 0 3,85 1 10,00 2 0,00 0 0,00 0 0,00 0 2,83 3

Proteus spp 0,00 0 26,92 7 45,00 9 35,00 7 31,58 6 30,77 4 31,13 33 Pseudomonas spp 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 Salmonella spp 0,00 0 3,85 1 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,94 1 Staphylococcus spp 12,50 1 0,00 0 15,00 3 0,00 0 5,26 1 7,69 1 5,66 6 Streptococcus spp 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 5,26 1 0,00 0 0,94 1 Total cepas 100 8 100 26 100 20 100 20 100 19 100 12 100 105

Gêneros

COL -

D0 D2 D7 D14 D21 D28 TOTAL

% No % No % No % No % No % No % No

Bactéria não fermentativa 12,50 1 0,00 0 0,00 0 5,26 1 5,88 1 18,75 3 5,66 6

Citrobacter spp 12,50 1 11,11 3 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 3,77 4

Enterobacter spp 25,00 2 14,82 4 5,26 1 5,26 1 5,88 1 0,00 0 8,49 9

Escherichia spp 0,00 0 18,52 5 26,32 5 31,59 6 52,94 9 37,50 6 29,25 31

Klebsiella spp 25,00 2 11,11 3 15,79 3 5,26 1 5,88 1 12,50 2 11,32 12

Morganella spp 12,50 1 7,41 2 5,26 1 5,26 1 0,00 0 6,25 1 5,66 6

Proteus spp 12,50 1 33,33 9 47,37 9 42,11 8 17,66 3 18,75 3 31,13 33 Pseudomonas spp 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 5,88 1 6,25 1 1,89 2 Salmonella spp 0,00 0 3,70 1 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,94 1 Staphylococcus spp 0,00 0 0,00 0 0,00 0 5,26 1 5,88 1 0,00 0 1,89 2 Streptococcus spp 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 Total cepas 100 8 100 27 100 19 100 19 100 17 100 16 100 106

69

As espécies que estiveram em maior frequência nas fezes durante o estudo

para o grupo COL- foram: Escherichia coli (28,70%), Proteus mirabilis (27,78%),

Klebsiella pneumoniae (11,32%) e Morganella morganii (5,66%) (tabela 6).

As diferentes espécies bacterianas isoladas nas fezes das bezerras podem

ser observadas na figura 17. Foi possível observar comportamento semelhante entre

as espécies para ambos os grupos.

Inicialmente, no D0, foram observadas poucas bactérias quando comparado

aos outros momentos (COL+ = 7 e COL- = 8 espécies diferentes). O pico de

isolamento ocorreu no D2 (COL+ = 12 e COL- = 10 espécies diferentes). Neste

momento foram observadas diversas espécies bacterianas como: Citrobacter

farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Enterobacter agglomerans,

Enterobacter gergoviae, Escherichia coli, Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella

ozaenae, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Salmonella

enteritidis no COL+ e Citrobacter koseri, Enterobacter agglomerans, Enterobacter

cloacae, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella

morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris e Salmonella enteridis paratyphia A no

COL-. Nos momentos seguintes houve um decréscimo gradual no número de

isolamentos para o grupo COL+ que atingiu o D28 com uma variedade de 6

espécies diferentes isoladas (Bactéria não fermentativa, Enterobacter agglomerans,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis e Staphylococcus sp). O

COL- apresentou um decréscimo porém menos acentuado no número de

isolamentos, finalizando o período também com com 6 espécies diferentes (Bactéria

não fermentativa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii,

Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa).

70

Tabela 6 - Número de espécies bacterianas e frequência dos isolamentos das amostras de fezes das bezerras que ingeriram colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) do nascimento aos 28 dias de vida – São Paulo – 2016

Espécies bacterianas

Total isolados COL+ COL- No % No % No %

Bactéria não fermentativa 9 4,19 3 2,80 6 5,56 Citrobacter farmeri 1 0,47 1 0,93 0 0,00 Citrobacter freundii 6 2,79 6 5,61 0 0,00 Citrobacter koseri 6 2,79 2 1,87 4 3,70 Enterobacter aerogenes 1 0,47 0 0,00 1 0,93 Enterobacter agglomerans 6 2,79 4 3,74 2 1,85 Enterobacter cloacae 6 2,79 2 1,87 4 3,70 Enterobacter gergoviae 1 0,47 1 0,93 0 0,00 Enterobacter sakazakii 2 0,93 0 0,00 2 1,85 Escherichia coli 61 28,37 30 28,04 31 28,70 Klebsiella ornithinolytica 2 0,93 1 0,93 1 0,93 Klebsiella oxytoca 2 0,93 1 0,93 1 0,93 Klebsiella ozaenae 6 2,79 5 4,67 1 0,93 Klebsiella pneumoniae 13 6,05 4 3,74 9 8,33 Klebsiella rhinoscleromatis 1 0,47 1 0,93 0 0,00 Morganella morganii 1 4,19 3 2,80 6 5,56 Proteus mirabilis 9 28,84 32 29,91 30 27,78 Proteus vulgaris 62 3,26 2 1,87 5 4,63 Pseudomonas aeruginosa 7 0,93 0 0,00 2 1,85 Salmonella enteritidis 2 0,47 1 0,93 0 0,00 Salmonella enteridis paratyphia A 1 0,47 0 0,00 1 0,93 Staphylococcus sp 8 3,72 6 5,61 2 1,85 Streptococcus sp 1 0,47 1 0,93 0 0,00 TOTAL 214 100 106 100 108 100


71

Figura 17 - Comparação entre as diferentes espécies bacterianas isoladas a partir das fezes das

bezerras Holandesas (COL+) e (COL-) durante o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016


0

5

10

15

20

25

30

D0 D2 D7 D14 D21 D28 D0 D2 D7 D14 D21 D28

Col+ Col-

Bactéria não fermentativa Citrobacter farmeri

Citrobacter freundii Citrobacter koseri

Enterobacter aerogenes Enterobacter agglomerans

Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae

Enterobacter sakazakii Escherichia coli

Klebsiella ornithinolytica Klebsiella oxytoca

Klebsiella ozaenae klebsiella pneumoniae

Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii

Proteus mirabilis Proteus vulgaris

Pseudomonas aeruginosa Salmonella enteritidis

Salmonella enteridis paratyphia A Staphylococcus sp

Streptococcus sp

72

O comportamento dos principais gêneros bacterianos encontrados para os

dois grupos pode ser observado na figura 18.

Klebsiella spp esteve presente em todos os momentos analisados com

exceção do D7 para o grupo COL+. Por outro lado, o momento com maior

isolamento no COL+ se deu na semana anterior, no D2, com 4 isolamentos. O

número máximo de cepas isoladas no grupo COL- ocorreu nos momentos D2 e D7,

com 3 isolamentos em cada tempo.

O momento onde mais observa-se Citrobacter spp dentre o período analisado

foi o D2, pico de COL+ com 5 isolamentos, e pico de COL- com 3 isolamentos. O

COL- apenas apresentou isolamento de Citrobacter spp nos momentos iniciais D0 e

D2, após isso, só foi possível observar para o grupo COL+.

As bactérias não fermentativas estiveram presentes, em maior escala, nos

extremos dos momentos analisados. No D0 o grupo COL+ apresentou 2

isolamentos, enquanto o COL- apresentou apenas 1. No D28, o COL+ apresentou 3

isolamentos e o COL- apenas 1 isolado. No D2 e D7 não foi possível isolar esse

gênero em ambos os grupos.

Enterobacter spp apresentou-se crescente do D0 ao D2, onde se deu o pico

(COL+ = 3 e COL- = 2), em seguida observou-se decréscimo no número de cepas.

No D7 e D21 não foram observados isolamentos para o grupo COL+.

O pico de isolamentos da Morganella spp no grupo COL+ ocorreu no D7,

enquanto o grupo COL- ocorreu no D2, com 2 isolamentos em ambos os grupos. No

D21 não foi possível observar nenhum isolamento em ambos os grupos.

O pico de Staphylococcus spp ocorreu no D7 para o grupo COL+ com 3

isolamentos. O grupo COL- apresentou apenas dois isolamentos sendo 1 no D14 e

outro no D21.

Os isolamentos de Proteus spp em ambos os grupos foram crescentes, tendo

o pico no dia 7 para COL+ e COL-, obtendo-se 9 isolamentos, seguido de um

decréscimo nos momentos subsequentes até alcançar 4 e 3 isolamentos no D28

para os grupos COL+ e COL-, respectivamente (Figura 18).

O perfil de isolamentos para a Escherichia coli foi diferente entre os grupos.

Observou-se pico de isolamentos para o COL+ no D14, entretanto, o pico no COL-

ocorreu no D21.

73

Figura 18 - Número de isolamentos dos principais gêneros bacterianos isolados nas amostras de fezes das bezerras Holandesas que ingeriram colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016


0

2

4

6

8

10

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Escherichia coli

0

2

4

6

8

10

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Proteus spp

0

1

2

3

4

5

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Klebsiella spp

0

1

2

3

4

5

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Enterobacter spp

0123456

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

sCitrobacter spp

0

1

2

3

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Morganella spp

0

1

2

3

4

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Staphylococcus spp

0

1

2

3

4

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

CO

L+

CO

L-

D0 D2 D7 D14 D21 D28

No

iso

lam

ento

s

Bactéria não fermentativa

74

Além disso, outros gêneros foram isolados, porém com menor frequência

durante o experimento, sendo eles: Pseudomonas spp, Salmonella spp e

Streptococcus spp.

As Pseudomonas spp não estiveram presentes durante o período estudado

para o grupo COL+ e foram isoladas apenas nos momentos D21 e D28 do grupo

COL-, obtendo-se 1 isolamento em cada tempo.

A Salmonella spp foi isolada duas vezes durante o experimento, uma em

cada grupo. Ambos os grupos apresentaram um isolamento de Salmonella spp no

D2.

O Streptococcus spp foi isolado apenas uma vez no grupo COL+, no D21. O

grupo COL- não apresentou esse isolamento durante o período estudado.

Para avaliarmos a possível influência das bactérias mais frequentemente

isoladas (Escherichia coli, Proteus mirabilis e Klebsiella pneumoniae) em relação ao

tipo de colostro fornecido e frequência de diarreias, foram realizados os testes Qui-

Quadrado e Exato de Fischer, porém, não foi possível estabelecer nenhum tipo de

relação (P>0,05).

A primeira associação realizada foi entre bactéria x grupo (COL+/ COL-) onde

tentou-se estabelecer associação para verificar se a frequência bacteriana havia

sido influenciada pelo tipo de colostro fornecido (P>0,05).

A segunda associação estabelecida foi entre a diarreia e a bactéria para

avaliar se a diarreia (ausente/presente) influenciou na frequência das bactérias mais

frequentemente encontradas (P>0,05).

75

6 DISCUSSÃO

O colostro bovino possui múltiplas funções, além daquelas relacionadas à

transferência de fatores imunes aos recém-nascidos. Esta pesquisa comprovou que

o colostro tem potencial para carrear inúmeras bactérias aos recém-nascidos, que

podem ter interferido diretamente na colonização do trato gastrintestinal, bem como

influenciado no status de saúde das bezerras que desenvolveram episódios

importantes de diarreia, os quais serão discutidos a seguir. Entretanto, a presença

de células no colostro não influenciou na colonização do intestino por bactérias

aeróbias isoladas a partir das fezes.


A celularidade do colostro fornecido às bezerras deste experimento foi

avaliada apenas no grupo COL+ para leucócitos totais, pois o congelamento do

colostro fornecido ao grupo COL- promoveu a lise das células. Esta análise foi

realizada para verificar a quantidade de células recebidas pelas bezerras.

A CCS (1.895.844 células/mL) do colostro obtida neste estudo foi superior ao

valor de 878.000 células/mL encontrado por Gomes et al. (2011). Considerando-se a

concentração celular obtida, pode-se estimar que as bezerras receberam um total de

células de 7,58x109 em quatro litros de colostro. Silva (2014) relatou que o colostro

de primeira ordenha apresenta 32% de células viáveis. Desta forma, pode-se

estimar a ingestão de aproximadamente 2,42x109 células viáveis no volume mínimo

equivalente a quatro litros de colostro administrado às bezerras recém-nascidas.

A concentração de Igs do colostro dos dois grupos experimentais

apresentaram valores adequados, segundo o limiar (50g/L) estabelecido por

Chigerwe et al. (2008); Godden (2008); Morril et al. (2012) e Quigley et al. (2013).

Assim, foi possível afirmar que todas as bezerras deste estudo receberam colostro

de qualidade, com teores de Igs acima do ponto de corte recomendado pela

literatura.

76

A ausência de diferenças estatísticas entre os valores obtidos para a

concentração de imunoglobulinas do colostro para o COL+ e COL- permitiu a

confirmação da padronização da qualidade do colostro fornecido para os dois grupos

experimentais.


A frequência da diarreia observada neste estudo foi maior no COL+ (44-78%)

e COL- (50-70%) do que a prevalência (19,1%) e índice de risco (21,2%) reportados

por outros pesquisadores (BARTELS et al., 2010; WINDEYER et al., 2014). Na

fazenda onde este experimento foi desenvolvido, as mães foram vacinadas no

período pré parto para Escherichia coli, Rotavirus e Coronavirus. Assim, a diarreia

encontrada neste experimento deveria ser menor do que a real incidência da

propriedade. Megank et al. (2015) provaram que a vacinação das mães reduziu a

frequência de diarreia de 39,9% para 14,3% em bezerros recém-nascidos.

A frequência das diarreias foi similar entre os grupos, entretanto apenas o

grupo COL- apresentou inflamações umbilicais (n=3). Foram detectadas duas

bezerras com broncopneumonia, uma pertencente a cada grupo. Langel et al. (2015)

avaliaram a saúde das bezerras que receberam colostro fresco e congelado usando

escores de fezes e escores respiratórios. Estes autores também não encontraram

diferenças estatísticas para a frequência de diarreia entre os grupos, entretanto o

escore respiratório foi maior no grupo COL- no D38. Nossos achados de

broncopneumonia não eram esperados pela faixa etária em que as bezerras se

encontravam, pois, inicialmente a bezerra está protegida pelos anticorpos maternos

adquiridos pelo colostro (RIDIPATH; BOLIN, 1995); entretanto, a metabolização

destes componentes e a diminuição da sua concentração no plasma são fatores

predisponentes para a instauração de quadros clínicos, como os respiratórios, a

partir do primeiro mês de vida (BABIUK et al., 2004).

77

6.2.1 CBT e CCT no colostro

Foram obtidos valores médios de 0,94 x 106 ufc/mL (Log10: 5,98) e 3,93 x 106

ufc/mL (Log10: 6,60) para a CBT do colostro fresco e congelado, respectivamente.

Para a CCT observou-se valores de 0,78 x 105 ufc/mL (Log10: 4,90) e 3,01 x 105

ufc/mL (Log10: 5,48) no colostro fresco e congelado, respectivamente. Considerando

a CBT e CCT do colostro congelado pode-se afirmar que a maioria das bactérias

eram coliformes fecais; sendo assim, pressupõe-se que a maior contagem

bacteriana total destes grupos pode estar associada à contaminação entre a colheita

e o fornecimento do colostro às bezerras.

Godden et al. (2012), obtiveram valores inferiores de CBT (3,5 log10 CBT/mL)

e valor superior para a CCT (5,6 log10 CCT/mL) em amostras de colostro fresco,

quando comparadas aos valores obtidos neste experimento. As diferenças nos

valores, apesar de não terem sido muito discrepantes, podem ter se dado por

importantes fatores de risco para a contaminação do colostro, desde a ordenha até a

coleta das amostras frescas, levando-se em consideração os seguintes itens:

identificação e separação de vacas infectadas; impedimento da bezerra de mamar

diretamente da mãe; preparação da higiene da glândula mamária antes e após a

ordenha; higienização do equipamento de ordenha; armazenamento e limpeza dos

equipamentos de alimentação, além da influência do local, pois um experimento foi

realizado no Brasil, com suas condições climáticas e o trabalho em questão foi

realizado em Minnesota, EUA, o que pode ter influenciado na diferente carga

bacteriana das amostras do colostro.

Apesar de não terem sido detectadas diferenças estatísticas entre os grupos

de bezerras que ingeriram colostro fresco (COL+) e congelado (COL-), tanto a

mediana quanto a média da CBT e CCT foram superiores no grupo que ingeriu

colostro congelado. Este resultado não seria inicialmente esperado, caso

considerássemos que a amostra de colostro fornecida às bezerras COL- tivesse sido

congelada imediatamente após ter sido ordenhada e envazada. Infelizmente isto não

ocorreu conforme o planejado, pois este estudo foi realizado em fazenda comercial e

não havia a possibilidade de interferir diretamente no manejo e protocolo de

colostragem da propriedade.

78

O colostro é mantido em geladeira 24 horas antes do seu congelamento,

aguardando caso alguma bezerra necessite tomá-lo. Caso não seja necessário o

fornecimento deste colostro, a mesma garrafa é retirada da geladeira e armazenada

no freezer, onde fica congelado até o momento em que precisar descongelar para

fornecer a alguma bezerra ou, no caso do experimento, para fornecer ao grupo

COL-. É interessante ressaltar que este manejo, que tem ótima intenção por parte da

fazenda, que tenta prezar pela viabilidade dos leucócitos colostrais ao mantê-los

refrigerados e não congelados, não é o ideal, pois estudos prévios da nossa equipe

comprovaram que a viabilidade celular dos colostros armazenados em geladeira se

mantém estável até 6 horas após ordenha; depois disso a viabilidade diminui

consideravelmente (NOVO et al., 2014).

O tempo de permanência do colostro na geladeira por 24 horas,

provavelmente viabilizou este aumento na proliferação das bactérias psicrotróficas

das amostras, aquelas que apresentam ótima taxa de crescimento em temperaturas

abaixo de 7ºC (FRANK et al., 1992).

As maiores frequências obtidas para a CBT no colostro fresco foram de 40%

para o menor intervalo (0 e 500.000 ufc/mL) e 50% para o maior intervalo (>

1.500.000) no colostro congelado.

Apenas duas amostras estiveram dentro dos valores recomendados como

meta por McGuirk e Collins (2004) para a contagem bacteriana total (<100.000

ufc/mL). Isso quer dizer que 10% de todo o colostro fornecido estava dentro do limiar

de bactérias totais preconizado pelos autores e aceito por grande parte de outros

pesquisadores da literatura.

Para a CCT também observou-se maior frequência das amostras no menor

intervalo (0 a 50.000 ufc/mL) para o colostro fresco (50%). As maiores frequências

para o colostro congelado foram encontradas nos intervalos de 0 a 50.000 (30%) e

100.001 a 150.000 ufc/mL (30%).

Apenas três amostras estiveram dentro dos valores recomendados para CCT

por McGuirk e Collins (2004) (<10.000 ufc/mL). Destas, duas amostras eram

pertencentes ao COL- e uma ao COL+. O fato de 17/20 amostras estarem acima dos

índices mundialmente aceitos por outros pesquisadores da área, nos faz pensar em

duas questões: a primeira delas é a qualidade higiênica do colostro que se é

fornecido às bezerras e no manejo que se é realizado com o colostro desde a

ordenha até o fornecimento ao animal, uma vez que neste intervalo ocorre a

79

proliferação de bactérias; a outra questão a ser considerada é se estes valores

preconizados por McGuirk e Collins (2004) e aceitos por outros pesquisadores, não

seriam um tanto quanto baixos e utópicos ao considerar a realidade ambiental e da

rotina da fazenda.

Outro ponto importante a ser considerado é a possibilidade de alguns grupos

bacterianos presentes no colostro serem em parte positivos para o desenvolvimento

do hospedeiro ao invés de patogênicos, como por exemplo os Lactobacillus e

Bifidobacteria, que são grupos bacterianos isolados do colostro e leite materno

humano e comumente utilizados como probióticos. Estas bactérias são importantes

para o crescimento saudável do hospedeiro, pois em estudos humanos,

comprovaram que elas atuam inibindo o crescimento e atividades de bactérias

patogênicas no lúmen do intestino e em bovinos neonatos são responsáveis por

maior ganho de peso e menor índice de diarreia (ABE; ISHIBASHI; SHIMAMURA,

1995; ISOLAURI; SALMINEN; OUWEHAND, 2004).

Os valores de imunoglobulinas obtidos a partir do colostrômetro e

refratômetro Brix para a concentração de IgG foram correlacionados com as

bactérias do colostro (CBT e CCT), porém não foram encontradas correlações.

Todas as bezerras deste experimento foram colostradas com colostro de alta

qualidade e a transferência de imunidade passiva destes animais foi confirmada

através da mensuração da proteína total do soro das bezerras por Blima (2015).

Pesquisadores têm avaliado a contagem bacteriana em comparação não só

ao colostro fresco e congelado, mas também ao colostro pasteurizado, como

importante minimizador da carga bacteriana (GODDEN et al., 2012). Dentro do

contexto apresentado e da alta presença de bactérias no colostro congelado, apesar

de não podermos afirmar se elas eram patogênicas ou benéficas para a microbiota,

pode-se recomendar o uso de pasteurizador de colostro para melhorar o manejo

desta fazenda e minimizar a CCT, pois, mesmo considerando todo o cuidado e

higiene no atual protocolo de manejo, ainda assim não é suficiente para manter os

níveis de bactérias na amostra próximos aos valores recomendados. Ao pasteurizar

o colostro a 60ºC por 60 minutos, Godden et al. (2012) notaram que não houve

alteração na concentração de IgG do colostro e diminuiu riscos de doenças até o

desmame, minimizando índices de morbidade e mortalidade, porém, mencionaram

um ponto negativo que seria a diminuição da viabilidade de leucócitos colostrais.

80

Além disso, ressalta-se a perda das bactérias benéficas Bifidobacterium e

Lactobacillus.

Outros autores também demonstraram que a pasteurização foi bastante

eficaz ao atingir o objetivo de redução de CBT e CCT do colostro (JOHNSON et al.,

2007; ELIZONODO-SALAZAR; HEINRICHS, 2009).

O ideal seria o fornecimento de colostro fresco, pelo menos na primeira

mamada, com baixas CBT e CCT para garantir a viabilidade das células do colostro

e bactérias benéficas. A pasteurização seria uma boa alternativa considerando

rebanhos com altas taxas de mastite no pós-parto imediato, que resulta na falta de

volume adequado de colostro para amamentar as bezerras no primeiro dia de vida.

Recomenda-se que o colostro pasteurizado seja fornecido apenas na segunda

mamada de colostro. Outra questão a ser considerada é o custo do pasteurizador,

por volta de U$33.000 com capacidade para 100 litros.

6.2.2 Isolamentos bacterianos das fezes

O cultivo bacteriano das amostras fecais nos possibilitou acompanhar a

dinâmica bacteriana das bezerras durante o primeiro mês de vida.

A maioria das bezerras ao nascimento apresentaram pouco crescimento

bacteriano no mecônio. Há quem acredite que o útero é um ambiente

completamente estéril (BARRINGTON; PARISH, 2001), mas sabe-se que nem

sempre é assim que ocorre (NOAKES; WALLACE; SMITH, 1991). Hoje em dia

existem técnicas de biologia molecular capazes de determinar a microbiota residente

dos tecidos, como do útero por exemplo. Desta forma, a observação de algumas

bactérias no mecônio foi um resultado esperado.

Após a colostragem, exame clínico e cura de umbigo, os animais foram

transferidos da baia de dentro da maternidade para as baias de madeira no chão, no

ambiente externo da maternidade, no bezerreiro. O pico de isolamento observado

nesta pesquisa ocorreu no D2 (COL+= 12 e COL-= 10 espécies diferentes); próxima

coleta após os animais terem sido transferidos de lugar. Neste momento foram

observadas diversas espécies bacterianas dos gêneros: Citrobacter spp,

Enterobacter spp, Klebsiella spp, Morganella spp, Proteus spp Salmonella spp e

81

Escherichia coli, no COL+. No COL- os gêneros bacterianos isolados foram:

Citrobacter spp, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Morganella spp, Proteus spp e

Salmonella spp e Escherichia coli no COL-.

Ao analisarmos as bactérias isoladas neste momento, pode-se observar uma

grande quantidade de bactérias próprias da microbiota, aquelas chamadas de

residentes, como as pertencentes aos gêneros Enterobacter spp e Klebsiella spp.

Estas bactérias são consideradas próprias da microbiota pois são encontradas em

fezes de animais com e sem diarreia (RIBEIRO et al., 2000).

A Salmonella spp e Escherichia coli encontradas em ambos os grupos são

conhecidas por serem grandes responsáveis pela diarreia neonatal bovina. O

mecanismo de virulência principal da Salmonella spp consiste na capacidade de

invadir a mucosa intestinal, se multiplicar em tecidos linfoides e evadir do sistema de

defesa do organismo. A diarreia por Salmonella spp pode se apresentar de forma

aquosa, mucoide e com presença de estrias de sangue. A Escherichia coli

enterotoxigênica (ETEC) é a principal bacteria relacionada à diarreia neonatal

bovina, que produz K99, antígeno de adesão. A ETEC afeta o epitélio intestinal e se

multiplica nos enterócitos das vilosidades do intestino. A região de predileção da

ETEC é a porção distal do intestino delgado devido ao baixo pH da região (ACRES

et al., 1985; FRANCIS et al., 1989; NATARO; KAPER, 1998; CHO; YOON, 2014;

SEEDY et al., 2016).

Este alto número de isolamentos está relacionado a diversos fatores

epidemiológicos como: alteração de ambiente; mudanças climáticas; aumento da

densidade populacional; maior contato com funcionários da fazenda; manejo ao qual

os animais foram submetidos, que se tornam desafios para o animal jovem

(FERREIRA et al., 2009). As bezerras do experimento foram alocadas nesta baia de

madeira no chão (D2), onde há pouca ventilação, pouca entrada de luz, e

principalmente é de difícil higienização, sendo que o ideal seria a realização de

vassoura de fogo com frequência; porém, a fazenda acabava higienizando com cal

virgem e água. Este fato pode ter influenciado no aumento da presença da diarreia

encontrado neste experimento.

No grupo COL+ (D14 = 45%) e COL- (D21= 52,9%) a bactéria mais isolada foi

Escherichia coli. Os momentos deste experimento em que foram isoladas E. coli em

alta quantidade diferem do achado de Rada et al. (2006) que relataram maior

frequência da população bacteriana em questão no terceiro dia, observando-se

82

diminuição acentuada até o sétimo dia. Os valores obtidos a partir de então

oscilaram pouco, apresentando leve aumento do D7 ao D21.

Rada et al. (2006) relacionaram o isolamento de Escherichia coli com os

isolamentos de bifidobacteria. No dia 3, quando a população de E. coli esteve em

alta, a de bifidobacteria estava baixa. Logo em seguida, a população de

bifidobacteria aumentou, enquanto a de E. coli diminuiu, apresentando inversão nos

valores. Essa inversão acentuada de população bacteriana foi justificada pelos

autores por possível alteração na alimentação, uma vez que a bifidobacteria é

considerada um excelente probiótico que possivelmente competiu por espaço com a

Escherichia coli, utilizando-se de mecanismos antibacterianos como, por exemplo, a

diminuição do pH gastrintestinal pela produção de compostos ácidos que inibem o

crescimento de patógenos e inibe a aderência de Escherichia coli aos receptores por

mecanismo de competição, mecanismos estes que minimizam o potencial

inflamatório dos enteropatógenos (BRANDT; CARNEIRO SAMPAIO; MIUKI, 2006;

MARTIN et al., 2012; FERNÁNDEZ et al., 2013).

O gênero Proteus spp que foi o segundo gênero mais isolado neste

experimento, após a Escherichia coli, não esteve associado à diarreia pelo teste de

Qui-Quadrado. Oliveira Filho (2006) também isolou Proteus spp nas amostras de

fezes de bezerros sadios e diarreicos, concluindo que ela não tem relação direta

com a diarreia e faz parte da microbiota residente.

Citrobacter spp foi outro gênero comumente encontrado durante todo o

experimento para o grupo COL+ com exceção do D28. O momento em que essa

bactéria foi mais isolada foi no D2, com 19,23% dos isolamentos. Por outro lado,

esse gênero no grupo COL- foi encontrado apenas no início do experimento no D0 e

D2 (12,50 e 11,11%). O gênero Citrobacter spp não está diretamente associado com

a diarreia pois autores relacionam o gênero com a flora normal do trato

gastrintestinal, porém, em grande quantidade pode ter um possível papel patogênico

(RIBEIRO et al., 2000).

Os principais patógenos causadores de diarreias em bezerros neonatos são

Escherichia coli, Cryptosporidium spp e viroses representadas por Rotavírus e

Coronavírus, respectivamente, encontrados antes e após a primeira semana de vida

(FEITOSA et al., 2008; GULLIKSEN et al., 2009; BARTELS et al., 2010). A natureza

multifatorial da diarreia em bezerros (bactérias, vírus e protozoários) torna esta

83

doença difícil de controlar com eficácia. Além disso, em muitos casos, as diarreias

vêm acompanhadas de outras doenças concomitantes (CHO; YOON, 2014).

Apesar de considerarmos as bactérias como possíveis principais agentes

causadores da diarreia, o que observamos foi que provavelmente outros agentes

que não apenas os bacterianos, estiveram à ela relacionados. Estes dados fazem

com que se possa concluir que a diarreia apresentada pelas bezerras deste

experimento não tenha sido causada necessariamente pelas bactérias que foram

isoladas. Estas bactérias podem, em sua maioria, ser apenas microrganismos

pertencentes à microbiota residente.

As bactérias tradicionalmente identificadas e classificadas utilizando técnicas

de cultura e provas bioquímicas como as desenvolvidas neste trabalho, requerem

um processo bastante demorado e trabalhoso. Muitas bactérias não são fáceis de

cultivar e isolar, principalmente as anaeróbias. O período de cultura pode variar,

dependendo da bactéria e do material utilizado para o isolamento, fazendo com que

o tempo de leitura e resultado sejam variados (ELKJAER et al., 2013).

Embora as técnicas de cultura bacteriana tenham auxiliado na identificação

dos microrganismos, estudos utilizando essas técnicas podem subestimar a

quantidade dos microrganismos presentes no trato gastrintestinal de bovinos

(SANTOS et al., 2011; PENGE et al., 2013). Desta forma, em 1996 foi desenvolvido

o pirosequenciamento por Ronaghi e colaboradores que permitiu o sequenciamento

genético via extração de DNA bacteriano e rDNA ribosomal auxiliando na

compreensão e caracterização mais completa do microbioma (WANG et al., 2012;

AZIZ et al., 2013; KNUDSEN et al., 2014; VAZIRI et al., 2015).

Como consequência do desenvolvimento e difusão das técnicas de

sequenciamento e estudos em metagenômica, aumentou consideravelmenete o

número de trabalhos relacionados ao microbioma humano e animal. Entre os vários

ambientes animais explorados através da metagenômica, o trato gastrointestinal

bovino e o reprodutivo são os mais estudados, no entanto as pesquisas ainda estão

apenas começando (KNUDSEN et al., 2014).

Estes métodos apresentam vantagens em comparação à técnica de cultura

bacteriana tradicional, uma vez que são capazes de detectar o DNA bacteriano e

indicar todas as bactérias presentes na amostra. Esta técnica não depende do

potencial de crescimento bacteriano e detecta todas as bactérias, não apenas as

que podem ser cultivadas. No entanto, apesar de todas essas vantagens, os custos

84

por amostra ainda são muito elevados, limitando o uso desse método (ELKJAER et

al., 2013). As amostras deste experimento estão armazenadas em freezer -80ºC

para futuro sequenciamento metagenômico pois, após o início deste experimento, foi

aprovada a verba para fazermos a análise do DNA bacteriano. Em breve, estes

resultados trarão mais respostas aos nossos questionamentos.

85

7 CONCLUSÃO

Com base nos dados obtidos, pode-se concluir:

(a) Os colostros celular e acelular apresentavam a mesma concentração de

imunoglobulinas, contagem bacteriana total e contagem de coliformes;

(b) A administração de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) não

influenciou na proporção de bactérias aeróbias presentes nas fezes das

bezerras durante o período neonatal;

(c) A administração de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) não

influenciou na ocorrência de diarreias em bezerras durante o período neonatal.

86

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91

CAPÍTULO 2 - INFLUÊNCIA DOS LEUCÓCITOS DO COLOSTRO NA RESPOSTA

IMUNE INATA DE BEZERRAS HOLANDESAS RECÉM-

NASCIDAS

92

8 INTRODUÇÃO

Os bezerros recém-nascidos nascem imaturos e agamaglobulinêmicos,

devido à impermeabilidade da placenta sineptéliocorial dos bovinos, cuja principal

função é a proteção do ambiente fetal contra microrganismos patogênicos. Desta

forma, os animais emergem do útero e iniciam a sua vida mediante à exposição aos

inúmeros microrganismos do meio ambiente ao qual está inserido (CHASE;

HURLEY; REBER, 2008).

A imunossupressão é outro evento associado ao estresse materno-fetal que

possui impacto no status imune dos recém-nascidos, devido ao aumento no cortisol

principalmente quando o parto é distócico (VANNUCCHI et al., 2015). O efeito do

cortisol sob o perfil leucocitário é classicamente relatado nos primeiros três dias de

vida, caracterizado por leucocitose, neutrofilia, monocitose, linfopenia e eosinopenia.

Assim, pode-se afirmar que bezerros recém-nascidos apresentam predomínio de

neutrófilos e baixos valores de linfócitos ao nascimento, observando-se inversão

deste perfil a partir do terceiro dia de vida (BENESI et al., 2012; NOVO et al., 2015).

O cortisol estimula a liberação de neutrófilos segmentados e bastonetes pela medula

óssea do compartimento estoque para a circulação (TORNQUIST; RIGAS, 2010).

O status imune do recém-nascido ao nascimento o torna dependente do

colostro materno. Falhas no gerenciamento do manejo do colostro na criação de

bezerras estão associadas à elevada prevalência (19,1%) e incidência (21,2%) de

diarreia neonatal causada por Escherichia coli, Rotavírus, Coronavirus e

Cryptosporidium parvum (WINDEYER et al., 2013; MEGANCK; HOFLACK;

OPSOMER, 2014). Além disso, animais que receberam colostro com baixos teores

de imunoglobulinas apresentaram altos índices de escore de diarreia que

perduraram por mais tempo, alta mortalidade e menor ganho de peso, quando

comparados à animais que receberam colostro com alto teor de imunoglobulinas

(NOCEK; BRAUND; WARNER,1984).

O colostro contém altas concentrações de nutrientes e hormônios que dão

suporte ao crescimento e maturação no desenvolvimento fisiológico do bezerro. O

colostro também contém fatores imunológicos importantes como citocinas,

anticorpos e uma grande quantidade de leucócitos maternos para a proteção do

neonato. O papel dos anticorpos colostrais na proteção do neonato tem sido bem

93

estabelecido, entretanto, o papel dos leucócitos maternos e citocinas do colostro

ainda não foi completamente estabelecido.

O colostro bovino contém entre 1x106 e 2,5x106 células somáticas/mL, dentre

as quais cerca de 32% são viáveis (MCDONALD; ANDERSON, 1981; LIEBLER-

TENORIO; RIEDEL-CASPARI; POHLENZ, 2002; GOMES et al., 2011; SILVA, 2014).

A população de leucócitos no colostro de primeira ordenha consiste em 13,3% de

neutrófilos, 16,4% de linfócitos, 69,5% de monócitos e células epiteliais e 0,27% de

eosinófilos (GOMES et al., 2011). Meganck et al. (2014) avaliaram a proporção dos

leucócitos colostrais e obtiveram 25,4% de linfócitos T, 2,9% de linfócitos B, e 32,7%

de macrófagos.

As células do colostro bovino são absorvidas pelo epitélio intestinal dos

recém-nascidos e migram para a placa de Peyer e linfonodos mesentéricos

(LIEBLER-TENORIO; RIDEL-CASPARI; POHLENZ, 2002). As células maternas

também foram encontradas na circulação sanguínea dos recém-nascidos,

detectando-se pico máximo de observação 24 horas após a ingestão do colostro.

Em seguida, as células maternas desapareceram da circulação sanguínea com 36

horas devido à da migração das mesmas para outros tecidos e órgãos linfoides

secundários com intuito de promover proteção ao recém-nascido (REBER et al.,

2006).

O perfil imune dos bezerros após a ingestão de colostro celular e acelular

parece ser diferenciado, de acordo com os resultados obtidos nas poucas pesquisas

realizadas nesta área. Além disso, a maioria dos dados refere-se à avaliação do

perfil imune específico e pouco se sabe sobre o padrão da resposta imune inata em

bezerros que ingeriram colostro fresco ou congelado.

Riedel-Caspari (1993) infectou 20 bezerras com 109 colônias de Escherichia

coli enteropatogênica, através de inoculação oral, três horas após o nascimento e

antes do fornecimento de colostro. Após a inoculação, as bezerras foram

alimentadas com colostro com e sem células. A autora observou que as células do

colostro podem desempenhar papel importante na manutenção de saúde do

bezerro, uma vez que as bezerras que receberam colostro com células

apresentaram maior vitalidade durante o período estudado. Os animais que

receberam colostro sem células apresentaram maior temperatura retal,

principalmente entre os dias 9 e 16, do que o COL+. Nitidamente estes animais

apresentaram maior carga de E. coli. Além disso, alguns animais do COL- se

94

recusaram a ingerir o substituto de leite que foi oferecido igualmente para ambos os

grupos, enquanto todos os animais do COL+ o ingeriram normalmente. O grupo

COL+ excretou menos E. coli durante a primeira semana de infecção e apresentou

pico de excreção depois do COL-. O COL+ atingiu o limite inferior de detecção de

bactérias mais cedo em relação ao COL-, que por sua vez apresentou outro pico de

detecção após o COL+ já ter cessado a liberação nas fezes. Os animais do COL-

atingiram o limite mínimo de detecção quatro dias após o COL+. Em relação às

concentrações específicas de anticorpos (IgA e IgM), os autores observaram que a

concentração foi maior no soro das bezerras COL+ durante todo o período

analisado. A autora conclui que leucócitos colostrais aumentaram a resistência dos

animais contra a infecção artificial desde o início, sinalizando para uma menor

resposta inflamatória do grupo, e que essas células contribuem para a imunidade

passiva e a resistência do recém-nascido, ressaltando que a qualidade e quantidade

de leucócitos são cruciais para a sua eficiência. Por outro lado, Langel et al. (2015)

não encontraram diferenças para os escores de diarreia em bezerras que receberam

colostro fresco e congelado.

Bezerros que mamaram colostro acelular apresentaram maior expressão dos

receptores CD11a, CD11c, CD43 e CD62L nas células mononucleares, em

comparação aos bezerros que receberam colostro celular, indicando maior

ocorrência de processos inflamatórios. O CD11a e CD43 são importantes receptores

ligados à migração celular da corrente sanguínea para o epitélio intestinal e o CD62L

está relacionado à sinalização dos leucócitos para que eles diminuam a velocidade

de circulação e fiquem aderidos à parede dos vasos sanguíneos facilitando a adesão

e migração (REBER et al., 2006). Em contrapartida, Stieler et al. (2012) não

observaram diferenças na proporção ou índice de fagocitose de neutrófilos e

macrófagos entre os bezerros que receberam colostro fresco e congelado.

A hipótese desta pesquisa é de que as células do colostro bovino influenciam

na resposta imune inata e consequentemente no perfil sanitário de bezerras

Holandesas durante o primeiro mês de vida. Assim, o objetivo desta pesquisa foi

avaliar se o fornecimento de colostro com (fresco) e sem células viáveis (congelado)

influencia na proporção e função dos neutrófilos sanguíneos e ocorrência de doença

durante o período neonatal.

95

9 MATERIAL E MÉTODOS

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, protocolo nº2934/2013.

9.1 BEZERRAS

As bezerras desta pesquisa eram oriundas de fazenda comercial de alta

produção, localizada no município de Araras – São Paulo. Este experimento foi

conduzido de julho a outubro de 2014.

Os partos foram assistidos pelos funcionários e veterinários da propriedade

para auxílio obstétrico, separação das recém-nascidas e controle do manejo de

colostro (Figura 19).

A equipe de pesquisa era acionada assim que os funcionários detectavam o

início do trabalho de parto para o deslocamento de pessoal e preparo do material

para a colheita das amostras.

Figura 19 - Nascimento em baias de parição (a); colostragem em baias de transição

(b), localizadas na maternidade – São Paulo – 2016

(a) (b) Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016).

Bezerras hígidas advindas de partos eutócicos foram selecionadas por meio

do exame clínico geral, segundo os procedimentos descritos por Dirksen et al.

96

(2008). Foram aferidas as frequências cardíaca (FC), respiratória (FR) e temperatura

corpórea (Quadro 5). Outros critérios foram usados para determinar a vitalidade das

bezerras, tais como: tônus muscular, irritabilidade reflexa e coloração das mucosas

oculares (RODRIGUES, 2008).

Quadro 5 - Intervalos de referência para as funções vitais em bezerras no primeiro mês de vida

Parâmetros Intervalos de Referência

1hora após nascimento 1ª semana 2ª semana 3ª semana 4ª semana

FC (bpm) 100,0-150,0 124,0±2,0 105,0±3,0 101,0±3,0 86,0±2,0

FR (mpm) 50,0-75,0 59,0±8,8 46,0±7,0 40,0±8,4 33,0±9,0

TEMP (°C) 39,0-39,5 38,6±0,3 39,0±1,0 39,0±0,4 39,0±0,3,0 Fonte: (SILVA et al., 2016, no prelo)4

Vinte bezerras hígidas foram triadas e distribuídas em dois grupos

denominados COL+ (n=10) e COL- (n=10). As bezerras do grupo COL+ receberam

colostro fresco com células proveniente de suas respectivas mães, enquanto os

animais COL- receberam colostro congelado sem células viáveis oriundo de vacas

doadoras.

Vacas e doadoras foram ordenhadas imediatamente após a parição em

tronco de contenção localizado no interior da maternidade. Inicialmente foi realizada

a lavagem com solução clorada e secagem dos tetos com papel toalha individual.

O colostro das doadoras foi armazenado pelos funcionários da fazenda em

garrafas plásticas de 2L, mantidas sob refrigeração (4 - 8°C), por 24 horas. Por fim,

as garrafas foram estocadas a -20°C durante o período mínimo de 24 horas e

máximo de 3 meses.

Inicialmente, para justificar a ausência de leucócitos viáveis nas amostras

congeladas, foi realizado um projeto piloto pela equipe onde alíquotas de colostro

fresco, refrigerado e congelado foram avaliadas quanto à sua viabilidade celular, de

hora em hora, durante as primeiras seis horas e, após, entre 18-24 horas. Com esse

estudo foi possível comprovar que as amostras de colostro que foram congeladas

4 SILVA, B. T.; HENKLEN, A.; MARQUES, R. S.; OLIVEIRA, P. ;L.; LEITE, S. B. P.; NOVO, S. M. F.; BACCILI, C. C.; REIS, J. F.; GOMES, V. Vital parameters of Holstein calves from birth to weaning. Revista Brasileira de Medicina Veterinária. [200-]. (no prelo).

97

não apresentaram viabilidade celular após o congelamento (0%) desde os

momentos iniciais (NOVO et al., 2014).

A avaliação indireta da concentração de Igs do colostro administrado para as

bezerras COL+ e COL- foi avaliada por meio de colostrômetro e refratômetro Brix

(23-32%). Foi possível determinar amplitudes de variação entre 80 e 120g/L de Igs

no colostro das vacas COL+; e 70 a 120g/L para as vacas COL-.

A quantidade de células somáticas (1,9 milhões/mL; log10: 6,28) encontrada

no colostro foi estimada a partir das amostras de colostro fresco utilizando-se como

metodologia a contagem microscópica direta adaptada por Gomes et al. (2011)

(Figura 20).

Figura 20 - Esfregaço da secreção mamária do colostro fresco fornecido para as bezerras do grupo com células viáveis (COL+) – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: (a) macrófagos presentes em predominância no colostro; (b) neutrófilo; (c) glóbulos de gordura.

A primeira garrafa de colostro foi descongelada lentamente a 37°C para

alimentar as bezerras COL- dentro das primeiras seis horas de vida. A segunda

alimentação foi realizada no intervalo máximo de doze horas de vida, utilizando-se

outra garrafa de colostro descongelado.

Bezerras COL+ foram alimentadas com dois litros de colostro fresco nas

primeiras seis horas de vida. O colostro para a segunda mamada foi mantido sob

refrigeração a 4°C, levemente aquecido a 37°C pouco antes da sua administração

entre seis a 12 horas pós-nascimento.

A cura do umbigo foi realizada pela imersão completa do cordão umbilical em

recipiente contendo tintura de iodo a 10% por pelo menos 1 minuto e meio,

(a)

(b)

(c)

98

repetindo-se o processo após 12 horas. A partir do segundo dia, foi utilizada tintura

de iodo a 5% duas vezes ao dia até mumificação do cordão umbilical.

As bezerras COL+ e COL- foram mantidas inicialmente nas baias dentro da

maternidade, local onde foram realizados os exames clínicos iniciais, colostragem e

cura do umbigo, sendo posteriormente transferidas para o bezerreiro às 6 horas de

vida, onde permaneceram em baias de madeira não suspensas até os primeiros três

primeiros dias pós-nascimento. Por fim, os animais foram transferidos e

permaneceram em gaiolas de metal individuais suspensas, medindo 1,2m x 1m, em

local com capacidade para 100 gaiolas, até o final desta pesquisa (Figura 21).

Figura 21 - Alojamento das bezerras durante o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016


Legenda: (a) alojamento das bezerras recém-nascidas durante as primeiras horas de vida para exame clínico geral, colostragem e cura do umbigo; (b) baia de transição não suspensa onde ficaram até o terceiro dia de vida; (c) bezerreiro para onde as bezerras foram transferidas e permaneceram até o fim do experimento.

a (b) (a)

(c)

99

A partir deste momento, os animais foram alimentados em baldes, duas vezes

ao dia, sendo fornecido um total de seis litros de leite sem antibiótico proveniente do

rebanho, além do fornecimento de ração comercial5 e água ad libitum.

9.2 MOMENTOS DE AVALIAÇÃO

As bezerras foram avaliadas periodicamente logo após o nascimento (D0),

entre 24 a 48 horas de vida (D2) e nos dias 7, 14, 21 e 28 pós-nascimento (D7-D28).

9.3 AVALIAÇÃO CLÍNICA PERIÓDICA

Os animais foram avaliados clinicamente utilizando-se os escores de diarreia

e broncopneumonia realizado de acordo com o Calf Heath Scoring Criteria

previamente publicado na University of Wiscosin - Madison (McGUIRK, 2008).

O escore fecal foi categorizado em escores sendo 0- consistência normal, 1-

consistência pastosa e semi-formada, 2- consistência aquosa com maior quantidade

de água, com conteúdo fecal aderido no períneo e cauda, 3- líquida, conteúdo fecal

aderido no períneo e cauda. A diarreia foi considerada presente quando o escore

obtido foi 2 ou 3 (Quadro 6 e Figura 22).

Broncopneumonia foi estabelecida considerando-se os seguintes parâmetros:

temperatura retal, tosse, secreção nasal e ocular e posição das orelhas. Para cada

item foi atribuído o escore de zero a 3 de acordo com a severidade dos sintomas. A

soma dos sintomas acima de 5 foi utilizada para a detecção da Doença Respiratória

Bovina (Quadro 7).

A região umbilical foi avaliada por inspeção e palpação periódica da região

umbilical para a detecção de sinais inflamatórios.

As anemias foram avaliadas a partir do eritrograma das bezerras. O

hematócrito, hemoglobina ou hemácias abaixo dos valores de referência

5 Rumileite 20®, Guabi

100

estabelecidos por Brun-Hansen, Kampen e Lund (2006) foram utilizados para a

interpretação dos eritrogramas e determinação das anemias. A classificação das

anemias foi baseada nos índices hematimétricos (BRUN-HANSEN; KAMPEN; LUND,

2006).

Quadro 6 - Escores de fezes adotado para detecção da diarreia em bezerras no primeiro mês de vida

Parâmetros Escores

Consistência normal: firme, coloração amarronzada, períneo e cauda limpos e secos 0

Pastosa, semi-formada 1

Pastosa com maior quantidade de água: permanece sobre a “cama”; conteúdo fecal aderido no períneo e cauda

2

Líquida: aquosa, conteúdo fecal aderido no períneo e cauda 3 Fonte: (MCGUIRK, 2008).

Figura 22 - Escores de fezes adotado para detecção da diarreia em bezerras no primeiro mês de vida – São Paulo – 2016


101

Quadro 7 - Escores de broncopneumonia adotado para detecção da doença em bezerras no primeiro mês de vida

Escores Temperatura retal ( OC) Tosse Secreção nasal Secreção

ocular Posicionamento das

orelhas 0 37,7 - 38,2 Ausente Serosa Serosa Normal

1 38,3 - 38,8 Presente e única,

quando estimulada

Pouca quantidade,

unilateral

Pouca quantidade

Balançar das orelhas ou cabeça

2 38,9 - 39,3

Presente e repetida quando estimulada, ou

ocasional quando espontânea

Excessiva, mucosa e bilateral

Moderada quantidade

bilateral

Ligeiramente pendente, unilateral

3 ≥ 39,4 Presente, repetida

e espontânea

Abundante, mucopurulenta,

bilateral

Intensa quantidade,

bilateral

Pendentes intensamente, bilateral ou torção da cabeça

Fonte: (POULSEN; MCGUIRK, 2009).

9.4 AMOSTRAS

Foram obtidas amostras de sangue por meio de punção da veia jugular,

utilizando sistema a vácuo, em tubos siliconados sem e com os anticoagulantes

EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) (Anexo G) e heparina de sódio.

9.5 ANÁLISES

A partir das amostras sanguíneas foram realizadas dosagens para avaliar o

perfil inflamatório das bezerras.

9.5.1 Hemograma

Os componentes hematológicos (hemácias, Red Blood Cells-RBC;

hemoglobina, hematócrito, Volume Corpuscular Médio - VCM, Hemoglobina

Corpuscular Média - HCM, Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média - HCM

e leucócitos totais) foram obtidos por sistema automático6. A contagem diferencial de

6 BC 2800Vet®

102

leucócitos foi realizada observando-se as características morfológicas das células

por microscopia óptica, aumento de 1.000x.

9.5.2 Cortisol

As determinações hormonais de cortisol foram realizadas por ensaio

quimiluminescente, utilizando-se kit comercial 7 em analisador de imunoensaios

Immulite 1000® (Siemens). Para a medição quantitativa do cortisol foi utilizado um

imunoensaio competitivo de fase sólida, de enzima químico - luminosas, com ciclo

de incubação de 1x30 minutos. O procedimento de ensaio segue o princípio básico

de enzima imunoensaio onde existe uma competição entre um antígeno não

marcado e um antígeno marcado com enzima, por um número determinado de sítios

de ligação no anticorpo. A quantidade de antígeno marcado com enzima é

inversamente proporcional à concentração do analítico presente não marcado. O

material não ligado é removido por decantação e lavagem das cavidades. Com os

níveis de refração da luz, o equipamento mensura a quantidade de cortisol presente

na amostra.

9.5.3 Haptoglobina

A concentração de haptoglobina sérica foi avaliada com base na sua

habilidade de ligação com a hemoglobina. Uma solução-padrão purificado de

haptoglobina de 100 a 1,5 mg/dL, foi utilizado para a preparação da curva padrão.

As amostras de soro controle (10µL) foram diluídas em solução salina (90µL) e foi

adicionado 50µL de solução de meta-hemoglobina bovina (30mg/dL). A reação foi

incubada durante dez minutos à temperatura ambiente, no escuro e em seguida

foram adicionados 150µL de substrato de guaiacol e 50 µL de peróxido de

hidrogênio. A placa ficou incubada por mais dez minutos no escuro e a leitura da

7 Cortisol Siemens® Ref: LKCO1, Lot: 0403

103

absorbância através da densidade óptica foi realizada no leitor de microplacas com

comprimento de onda de 450-500 nm.

9.5.4 Ferro

Alíquotas de soro foram descongeladas em geladeira (overnight),

homogeneizadas em homogeneizador automático para posterior realização dos

testes bioquímicos em analisador bioquímico automático5. Para a dosagem da

concentração de ferro foi utilizado kit comercial6 (Ferro UIBC, Randox®),

empregando-se a metodologia descrita pelo fabricante.

9.5.5 Imunofenotipagem dos Neutrófilos

As subpopulações e ativação dos leucócitos sanguíneos foram avaliadas

utilizando-se a técnica de citometria de fluxo. Inicialmente, alíquotas do sangue total

obtidas em tubos com EDTA (100µL) foram distribuídas em tubos de citometria de

fluxo. Os eritrócitos foram lisados pela adição de 900µL de solução comercial8

(Facslysing), e os tubos foram mantidos em temperatura ambiente por 15 minutos.

Inicialmente, dois anticorpos monoclonais primários: mouse anti-bovine (Washington

State University) foram adicionados para a marcação celular na mesma diluição

baseados nas titulações. Desta forma, tanto CH138 (IgM - CH138A), quanto CD62-L

(IgG1 - CC32) foram diluídos em 1:400.

As amostras foram incubadas por 40 minutos a 4°C para que houvesse

marcação celular e em seguida, foram submetidas a três lavagens com solução de

Phosphate Buffered Saline (PBS) (Anexo H). Posteriormente, foram adicionados

anticorpos monoclonais secundários para emissão das fluorescências identificadas

pelo citômetro de fluxo 9 . O fluorocromo APC (Allophycocyanin) (INVITROGEN,

U.S.A.) foi utilizado como anticorpo secundário para o CH138 (APC – M31505) e o

fluorocromo PE (Phycoerythrin) (BENCTON DICKINSON, U.S.A.) foi utilizado como

8 BD nº catálogo: 349202 9 FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry System®, San Diego, CA)

104

anticorpo secundário para o CD62-L (PE – P-21129). Os anticorpos secundários

foram previamente diluídos em 1:200, adicionados às células, incubados por 30

minutos refrigeradas e mantidos em ambiente escuro.

As amostras foram então submetidas a três lavagens com PBS e

ressuspendidas em 300µL e reservadas para avaliação das fluorescências emitidas

nos comprimentos de onda 650-660nm (APC) e 480nm (PE) em citômetro de fluxo.

Os eventos foram adquiridos no citômetro utilizando o software CellQuest,

selecionando os granulócitos a partir do seu tamanho - forward scatter (FSC) e

granulosidade - side scatter (SSC). Para isso, foram adquiridas dez mil células para

os neutrófilos no gate correspondente aos granulócitos.

As células foram avaliadas quanto à fluorescência emitida pelos anticorpos

secundários utilizando-se o software FlowJo® (Tree Star, EUA), versão 7.2.5. Os

resultados foram expressos em porcentagem do gate de células positivas para cada

marcador e os histogramas foram estabelecidos para avaliar a proporção de células

em cada fluorescência. Os dot plot (gráficos emitidos a partir do citômetro) foram

interpretados a partir das cores para estabelecer as populações celulares (Figuras

23 a 26).

Figura 23 - Avaliação da proporção de granulócitos no sangue de bezerras Holandesas no primeiro mês de vida – São Paulo – 2016

(a) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) Distribuição dos leucócitos sanguíneos; (b) seleção da população de granulócitos em relação ao total de eventos adquiridos

105

Figura 24 - Ensaio de avaliação da L-selectina – São Paulo – 2016

(a) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) histograma demonstrando a população CD62L+ (FL2+); (b) plotagem das células expressando os marcador CD62L+ no Q3 (FL2+).

Figura 25 - Ensaio de avaliação do CH138+ – São Paulo – 2016

(a) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) histograma demonstrando a população CH138+ (FL4+); (b) plotagem das células expressando o marcador CH138+ no Q3 (FL4+).

106

Figura 26 - Ensaio de avaliação do duplo positivo para CD62L+ e CH138+ – São Paulo – 2016

(a) (b) (c)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) histograma demonstrando a população CD62L+ (FL2+); (b) histograma demonstrando a população CH138+ (FL4+); (c) plotagem das células expressando os marcadores CD62L+CH138+ no quadrante duplo positivo (circulado).

9.5.6 Fagocitose e Produção Peróxido de Hidrogênio

Para realização desta prova, foram utilizadas Staphylococcus aureus e

Escherichia coli isoladas do leite de vaca com mastite, gentilmente cedidas pelo

Prof. Dr. Nilson Roberti Benites. As bactérias foram marcadas com Iodeto de

Propídeo segundo procedimento descrito por Silva (2014).

Para a realização dos ensaios (Quadro 8), foram adicionados 100µL de

sangue heparinizado contendo aproximadamente 2x105 células em tubos de

citometria de fluxo. Em seguida, foram adicionados 200µL da solução de uso do

DCFH-DA10 (Anexo I), 50µL da bactéria marcada, ajustando-se o volume final da

mistura para 1100µL, utilizando PBS suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) a

10%. A mistura foi incubada em estufa a 37°C por 30 minutos, mantida em

suspensão com o uso de homogeneizador. Em seguida, foram adicionados 2mL de

EDTA 3mM (Anexo I) gelado, nos ensaios onde as bactérias foram acrescidas. Logo

após, foi realizada a lise das hemácias para lavagem das células e retirada do

excesso de Iodeto de Propídeo.

10 Sigma® Aldrich, St. Louis, EUA, nº cat. D6883.

107

Para a lise das hemácias foi adicionado 1mL de água destilada ao pellet,

homogeneizado no agitador de tubos por 15 segundos, e imediatamente foi

acrescido 1mL de PBS 2x concentrado (Anexo J). Imediatamente em seguida, foi

adicionado 3mL de PBS gelado. Os tubos foram centrifugados por 5 minutos,

783xG, 4ºC. O sobrenadante foi desprezado e o pellet e ressuspendido em 1mL de

PBS. O ensaio foi centrifugado novamente nas mesmas condições (5 minutos,

783xG, 4ºC) e o pellet foi ressuspendido em 300µl de PBS para realização da leitura

no citômetro de fluxo 11 , onde foram adquiridos 20.000 eventos utilizando-se o

software CellQuest®.

A análise das fluorescências emitidas foi realizada utilizando-se software

FlowJo®. Inicialmente, a população de granulócitos foi selecionada no ensaio

contendo células sem anticorpos (branco) e copiada para os demais ensaios. Em

seguida, a produção de H2O2 basal e determinação do limite para a fluorescência

FL1 foi avaliada nos tubos onde foram adicionados células e o substrato DCFH. Os

próximos tubos da análise eram os que continham apenas as células e bactérias

Staphylococcus aureus e Escherichia coli para a determinação do limite da

fluorescência FL2. Por fim, após terem sido estabelecidos os cortes a partir dos

controles, contendo células não marcadas e marcações simples, realizou-se às

análises dos ensaios que continham DCFH-DA e bactérias. Neste tubo, foram

analisados tanto a fluorescência FL1 e FL2 para a determinação da fagocitose e

produção de peróxido de hidrogênio na presença dos estímulos bacterianos (Figuras

27 a 31).

Quadro 8 - Ensaio de fagocitose e produção de H2O2 do sangue de bezerras Holandesas

Tubo Fluorescência Sangue DCFH BACT PBS SFB 10% Evento

A Branco S - - S Branco

B FL1 S S - S Burst Basal

C FL2 S - Sapi S Fagocitose

D FL2 S - E.coli S Fagocitose

E Ensaio 1 S S Sapi S Fagocitose/Burst

F Ensaio 2 S S E.coli S Fagocitose/Burst

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: Bact – Bactéria; S – Acrescido no tubo.

11

FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System®), San Diego, CA

108

Figura 27 - Avaliação da proporção de PMN no sangue de bezerras Holandesas – São Paulo – 2016

(a)

(a) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) Distribuição dos leucócitos sanguíneos; (b) Seleção dos PMN em relação ao total de eventos adquiridos.

Figura 28 - Avaliação da produção de H2O2 basal, sem estímulos bacterianos, pelas células PMN com DCFH-DA. Seleção do eixo FL1+ para avaliação da produção de H2O2 pelos PMN sem estímulo bacteriano – São Paulo – 2016

(a) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) histograma demonstrando a produção de H2O2 basal (FL1+); (b) plotagem das células produzindo H2O2 basal (FL1+).

109

Figura 29 - Avaliação da fagocitose das células PMN do sangue de bezerras Holandesas que fagocitaram Staphylococcus aureus e Escherichia coli – São Paulo – 2016

(a) (b)

(c) (d)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) Histograma demonstrando a fagocitose dos PMN estimulados com Staphylococcus aureus (FL2+); (b) plotagem das células fagocitando Staphylococcus aureus (FL2+); (c) Histograma demonstrando a fagocitose dos PMN estimulados com Escherichia coli (FL2+); (d) plotagem das células fagocitando Escherichia coli (FL2+).

110

Figura 30 - Avaliação da produção de H2O2 e fagocitose pelas células PMN do sangue de bezerras Holandesas com DCFH-DA e Staphylococcus aureus – São Paulo – 2016

(a) (b)

(c) (d)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: (a) Histograma para avaliação da produção de H2O2 pelas células PMN (FL1+); (b) plotagem das células para avaliação da produção de H2O2 pelas células PMN (FL1+); (c) histograma para avaliação da fagocitose pelas células PMN estimuladas com S. aureus (FL2+); (d) plotagem para avaliação da fagocitose pelas células PMN estimuladas com S. aureus (FL2+).

111

Figura 31 - Avaliação da produção de H2O2 e fagocitose pelas células PMN do sangue de bezerras Holandesas com DCFH-DA e Escherichia coli – São Paulo – 2016

(a) (b)

(c) (d)


Legenda: (a) Histograma para avaliação da produção de H2O2 pelas células PMN (FL1+); (b) plotagem das células para avaliação da produção de H2O2 pelas células PMN (FL1+); (c) histograma para avaliação da fagocitose pelas células PMN estimuladas com E. coli (FL2+); (d) plotagem para avaliação da fagocitose pelas células PMN estimuladas com E. coli (FL2+).

112

9.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram armazenados em planilhas (Microsoft Excel® 2010), e

posteriormente analisados com o software estatístico SPSS 19.0 (IBM Corp.

Released 2011. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0. Armonk, NY: IBM

Corp.).

Para que fosse possível uma análise paramétrica, a transformação

logarítmica foi utilizada. Sendo assim, o Teste t de Student para amostras

independentes foi realizado para comparação entre os grupos (COL+ e COL-) e a

análise de variância (ANOVA) realizada para comparação entre os tempos (D0 a

D28) dentro do mesmo grupo. No caso onde ocorreram as transformações

logarítmicas, o p apresentado nas tabelas diz respeito aos testes relacionados com

os valores em log10, enquanto os valores descritos são reais.

Todas as análises foram consideradas estatisticamente significativas quando

p<0,05 e tendência quando p>0,05 e p<0,1. Análises descritivas foram apresentadas

pela média e desvio padrão.

113

10 RESULTADOS

Este trabalho avaliou a influência das células do colostro na resposta imune

inata e saúde de bezerras Holandesas durante o primeiro mês de vida.


A diarreia teve início no D2 e a frequência aumentou do D7 (COL+ = 56%;

COL-= 70%) ao D14 (COL+ = 78%; COL-= 60%). Após estes momentos, as

bezerras apresentaram uma ligeira diminuição da frequência no D21 COL+ = 56%;

COL-= 50%) e D28 (COL+ = 44%; COL-= 50%) (Figura 32).

A região umbilical externa foi avaliada através da inspeção e palpação

periódica para a detecção de sinais inflamatórios. Desta forma, foi possível detectar

que três bezerras do grupo COL- apresentaram inflamação umbilical no D14 (n=2) e

D28 (n=1). Além disso, também foram detectadas duas bezerras com

broncopneumonia em ambos os grupos: COL+ no D14 (n=1) e COL- no D21 (n=1).

Apesar da maior frequência de doenças encontradas no grupo COL-, não foi

possível comprovar diferenças estatísticas entre a frequência de diarreia ou doenças

totais usando o teste Qui-Quadrado.

A interpretação individual do eritrograma de cada bezerra mostrou anemia do

D2 até o D28 de acordo com os valores de referência estabelecidos por Brun-

Hansen; Kampen; Lund (2006) (Figura 33).

As frequências de anemias observadas foram de 20 e 30% no D2, 10 e 10%

no D7, 20 e 50% no D14, 0 e 40% no D21 e 0 e 50% no D28 para bezerras do COL+

e COL-, respectivamente. As bezerras do COL- apresentaram maior frequência de

anemia no D21 (COL+= 0%; COL-= 40%; P=0,03) e D28 (COL+= 0%; COL-= 50%;

P=0,02).

Durante todo o experimento foram observados 23 episódios de anemia. A

anemia predominantemente de acordo com a morfologia dos eritrócitos foi a

normocítica hipocrômica. As frequências de anemias microcítica, macrocítica e

normocítica foram 21,7% (5/23), 56,52% (13/23) e (21,7%) 5/23, respectivamente.

114

Anemia normocítica foi observada em 11/23 bezerras (47,8%) e 12/23 (52,17%),

respectivamente. Anemia normocítica foi observada em 11/23 (47,8%) e 12/23

(52,17%) dos casos.

Figura 32 - Frequência do escore fecal e incidência de diarreia em bezerras Holandesas (COL+) e (COL-) durante o primeiro mês de vida – São Paulo – 2016


0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D0

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D14

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D2

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D21

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D7

COL+

COL-

0

20

40

60

0 1 2 3

Fre

quên

cia

(%)

Escore Fecal

D28

COL+

COL-

115

Figura 33 - Frequência de anemias em bezerras Holandesas (COL+) e (COL-) durante o primeiro mês de vida - São Paulo - 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: S.A.: sem alteração; An No Hipo: anemia normocítica hipocrômica; An Mac Hipo: anemia macrocítica hipocrômica; An No No: anemia normocítica normocrômica; An Mi No: anemia microcítica normocrômica; An Mi Hipo: anemia microcítica hipocrômica.

10.2 CORTISOL

O estresse ao qual as bezerras foram submetidas nos primeiros dias de vida

foi mensurado através da dosagem do cortisol, observando-se perfil semelhante os

0

20

40

60

80

100

S. A. An NoHipo

AnMacHipo

An NoNo

An MiNo

An MiHipo

Fre

qu

ênci

a (%

)

D0

COL+

COL-

0

20

40

60

80

100

S. A. An NoHipo

AnMacHipo

An NoNo

An MiNo

An MiHipo

Fre

qu

ênci

a (%

)

D14

COL+

COL-

0

20

40

60

80

100

S. A. An NoHipo

AnMacHipo

An NoNo

An MiNo

An MiHipo

Fre

qu

ênci

a (%

)

D2

COL+

COL-

0

20

40

60

80

100

S. A. An NoHipo

AnMacHipo

An NoNo

An MiNo

An MiHipo

Fre

qu

ênci

a (%

)

D21

COL+

COL-

0

20

40

60

80

100

S. A. An NoHipo

AnMacHipo

An NoNo

An MiNo

An MiHipo

Fre

qu

ênci

a (%

)

D7

COL+

COL-

0

20

40

60

80

100

S. A. An NoHipo

AnMacHipo

An NoNo

An MiNo

An MiHipo

Fre

qu

ênci

a (%

)

D28

COL+

COL-

116

grupos COL + e COL-. O pico máximo de cortisol foi observado no D0 (COL+: 12,27

µg/dL; COL-: 11,53 µg/dL), em seguida, os valores apresentaram um decréscimo

gradual até o D28 (COL+: 0,81µg/dL; COL-: 0,35 µg/dL). Apesar de não terem sido

detectadas diferenças estatísticas entre os grupos, foi possível observar diferença

entre os momentos D0 e D21 no grupo COL+, onde p = 0,048 (Tabela 7 e Figura

34).

Tabela 7 - Concentração de cortisol sérico (µg/dL) em bezerras Holandesas que receberam

colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-), durante o primeiro mês de vida - São Paulo - 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: letras minúsculas na mesma coluna demonstram diferença entre os tempos, sendo (a) valores diferentes do D0; (b) valores diferentes do D2; (c) valores diferentes do D7; (d) valores diferentes do D14; (e) valores diferentes do D21; (f) valores diferentes do D28, quando p<0,05; tendência quando P≤0,10

Figura 34 - Concentração de cortisol sérico (µg/dL) em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-), durante o primeiro mês de vida - São Paulo - 2016


Momentos (dias) D0 D2 D7 D14 D21 D28

Cortisol (µg/dL)

COL+ 12,27

±2,23 e 6,05 ±3,43

3,16 ±1,68

1,70 ±1,49

0,95 ±0,73 a

0,81 ±0,80

COL- 11,53 ±2,38

4,81 ±2,59

3,45 ±1,12

1,09 ±0,95

0,71 ±1,01

0,35 ±0,75

p 0,479 0,150 0,886 0,163 0,483 0,359

0

2

4

6

8

10

12

14

0 7 14 21 28

Co

rtis

ol(

µg/

dL

)

Dias

Col+

Col-

117

10.3 HAPTOGLOBINA

As concentrações e densidades ópticas obtidas para a haptoglobina sérica

durante o primeiro mês de vida estão dispostas na tabela 8 e figura 35. Os valores

obtidos para a concentração de haptoglobina foram crescentes do D0 (COL+: 1,24;

COL-: 1,34 mg/dL), atingindo pico máximo no D7 (COL+: 5,38; COL-: 5,27 mg/dL) e

D14 (COL-: 5,70 mg/dL), observando-se decréscimo dos valores nos momentos

subsequentes (COL+: 1,67-2,24; COL-: 1,31-1,71 mg/dL). Apesar destas variações

observadas, não foram detectadas diferenças estatísticas entre os grupos e

momentos para a concentração e densidade óptica da haptoglobina.

Tabela 8 - Valores da concentração (mg/dL) e densidade óptica (DO) para a haptoglobina sérica em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-), durante o primeiro mês de vida - São Paulo - 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1).


Hp (mg/dL)

COL+ 1,24 ±0,41

1,28 ±0,50

5,38 ±9,17

1,67 ±0,99

2,24 ±3,24

1,80 ±1,93

COL- 1,34 ±0,59

1,56 ±0,49

5,27 ±6,18

5,70 ±12,28

1,31 ±0,45

1,71 ±0,91

P 0,802 0,873 0,682 0,454 0,686 0,365

Hp (DO)

COL+ 0,37 ±0,03

0,37 ±0,03

0,48 ±0,22

0,41 ±0,08

0,39 ±0,13

0,38 ±0,09

COL- 0,35 ±0,02

0,35 ±0,01

0,44 ±0,18

0,45 ±0,18

0,38 ±0,05

0,34 ±0,03

P 0,178 0,083 † 0,620 0,589 0,828 0,170

118

Figura 35 - Haptoglobina sérica em bezerras Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016

(a) (b)

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: (a) concentração da haptoglobina em mg/dL; (b) valores da densidade óptica da haptoglobina; † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1).

10.4 FERRO

A concentração de ferro sérico obtido para bezerras recém-nascidas estão

dispostos na tabela 9 e figura 36.

O pico máximo de ferro observado para ambos os grupos foi no D0 (COL+ =

21,76µM/L e COL- =15,41µM/L). A partir do D7, o grupo COL- (5,61 µM/L)

apresentou menor concentração de ferro sérico quando comparado ao COL+

(10,74 µM/L). Este perfil permaneceu até o D28. Foi possível observar diferença

estatística entre os grupos no D7 (p = 0,031) e diferença entre os momentos D0 e

D7 no grupo COL-.

Tabela 9 - Valores da concentração de ferro sérico (µM/L) em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células (COL-), durante o primeiro mês de vida - São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: letras minúsculas na mesma coluna demonstram diferença entre os tempos, sendo (a) valores diferentes do D0; (b) valores diferentes do D2; (c) valores diferentes do D7; (d) valores diferentes do D14; (e) valores diferentes do D21; (f) valores diferentes do D28, quando p<0,05; tendência quando P≤0,10.


Ferro (µM/L)

COL+ 21,67 ±9,14

8,98 ±2,68

10,74 ±6,21

13,26 ±10,68

9,73 ±6,32

11,15 ±10,48

COL- 15,41 ±9,81c

10,08 ±4,20

5,61 ±2,75 a

9,60 ±6,94

7,30 ±3,15

10,67 ±6,55

P 0,144 0,698 0,031 * 0,404 0,525 0,689

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0 7 14 21 28

Hap

togl

ob

ina

(Den

sid

ade

Óp

tica

)

Dias

COL+

COL-

†

0

1

2

3

4

5

6

7

0 7 14 21 28

Hap

togl

ob

ina

(mg/

dL

)

Dias

Col+

Col-

119

Figura 36 - Valores de concentração sérica de ferro (µM/L) em bezerras Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células (COL-) - São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: * indica diferença entre os grupos naquele momento (p>0,05).

10.5 LEUCÓCITOS TOTAIS E NEUTRÓFILOS SANGUÍNEOS

Os valores médios e desvio padrão absolutos e relativos para leucócitos

totais (White Blood Cells-WBC) e neutrófilos (NEUTR) estão apresentados na

tabela 10 e figura 37.

As bezerras de ambos os grupos apresentaram pico máximo do WBC no D7

(COL+= 12,37x103/µL e COL- = 11,75 x103/µL), observando-se diminuição dos

valores nos momentos subsequentes até D21 (COL+= 7,55x103/µL e COL- =

9,61x103/µL). No D28 detectou-se o menor valor médio de WBC para o COL-

(6,91x103/µL), em contrapartida, bezerras COL+ apresentaram aumento no número

dessas células (9,42x103/µL).

Os valores de neutrófilos decresceram do pico que ocorreu no D7

(8,47x103/µL) até o D21 (3,07x103/µL) no grupo COL+. O grupo COL- apresentou

perfil diferente, observando decréscimo gradual dos valores desde o D0

(7,81x103/µL) até o D28 (2,54 x103/µL).

A comparação entre os grupos COL+ e COL- para WBC e NEUTR não

possibilitou a detecção de diferenças entre os grupos, porém foi possível observar

tendência na proporção de neutrófilos no momento D7 (P= 0,073).

0

5

10

15

20

25

0 7 14 21 28

Fer

ro (

uM

/L)

Dia

Col+

Col-

*

120

As diferenças obtidas para as comparações múltiplas entre os momentos

pode ser visualizada na tabela 10.

Tabela 10 - Médias e desvios-padrão para os leucócitos totais (WBC) e neutrófilos (NEUTR) do sangue de bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) - São Paulo - 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: letras minúsculas na mesma coluna demonstram diferença entre os tempos, sendo (a) valores diferentes do D0; (b) valores diferentes do D2; (c) valores diferentes do D7; (d) valores diferentes do D14; (e) valores diferentes do D21; (f) valores diferentes do D28, quando p<0,05; tendência quando P≤0,10.


WBC (103/µL)

COL+ 10,89 ±2,72

10,19 ±5,88

12,37 ±5,23

8,03 ±2,75

7,55 ±3,39

9,42 ±3,92

COL- 11,41 ±4,23 f

9,61 ±4,23

11,75 ±5,81

9,52 ±4,20 9,61±3,18

6,91 ±1,65 a

P 0,772 0,827 0,802 0,336 0,275 0,134

NEUTR (103/µL)

COL+ 7,96

±2,34 def 7,60 ±5,73

8,47 ±5,06

3,38 ±1,92 a

3,07 ±2,87 a

3,93 ±2,30 a

COL- 7,81

±3,65 f 6,61 ±3,63

6,28 ±4,13

5,03 ±3,30

4,61 ±2,72

2,54 ±1,10 a

P 0,930 0,690 0,349 0,196 0,325 0,167

NEUTR (%)

COL+ 72,70

±9,83 def 66,30

±21,07 e 63,50

±14,28 def 39,90

±13,11 ac 36,00

±15,29 abc 39,60

±11,54 ac

COL- 67,20 ±9,31 ef

64,00 ±13,94 ef

49,60 ±12,64

49,30 ±11,92

44,30 ±14,92 ab

35,30 ±12,18 ab

P 0,239 0,783 0,073 † 0,143 0,296 0,455

121

Figura 37 - Leucócitos totais (WBC) e neutrófilos (NEUTR) do sangue de bezerras Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células (COL-) - São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1)

10.6 EXPRESSÃO DE MARCADORES NOS GRANULÓCITOS

As proporções de células e marcadores dos granulócitos estão dispostos na

tabela 11 e figura 38.

A proporção de PMN no COL+ aumentou levemente do D0 (40,25%) ao D7

(45,83%), em seguida, os valores diminuíram (27,46-34,44%). O COL- apresentou

média mínima no D0 (34,06%), pico máximo no D2 (53,25%), leve redução entre

D7 ao D21 (41,79-45,14%) seguida por redução marcante no D28 (36,76%). Foi

possível detectar diferença estatística entre os grupos no D21 (p=0,036) e

tendência no D14 (p=0,056). Não foi possível observar diferença estatística entre os

0

2

4

6

8

10

12

14

0 7 14 21 28

WB

C (

10

3/µ

L)

Dias

Col+

Col-

0

2

4

6

8

10

0 7 14 21 28

NE

UT

R (

10

3/µ

L)

Dias

Col+

Col-

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28

NE

UT

R (

%)

Dias

Col+

Col-

†

122

momentos.

O perfil apresentado pelos grupos experimentais em relação à proporção de

granulócitos CH138+ expressando ou não o receptor CD62L+ foi diferente apesar da

ausência de diferenças estatísticas (P=0,095).

Foi observada elevada proporção de granulócitos CH138+ expressando L-

selectina em ambos os grupos no D0 (COL+: 87,73%; COL-: 88,51%). A partir

deste momento, os animais apresentaram perfil diferenciado, observando-se

aumento gradual das proporções destas células no COL- (45,14%) e queda no

COL+ (80,65%) até D14. Após, o COL- apresentou queda brusca (78,70%) e

aumento subsequente no D28 (98,88%), enquanto o COL+ apresentou aumento

(89,96%) no D21 e ligeira diminuição no D28 (85,78%).

Tabela 11 - Médias e desvios-padrão para as proporções de granulócitos CH138+ expressando o

receptor CD62-L em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-), no primeiro mês de vida - São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: * indica diferença entre os grupos naquele momento (p>0,05); † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1)


PMN

(%)

COL+ 40,25 ± 20,57

41,39 ±17,02

45,83 ±19,47

34,44 ±13,27

27,46 ±11,28

33,92 ±12,94

COL- 34,06 ±16,4

53,25 ±21,55

42,79 ±16,23

45,14 ±10,04

41,79 ±13,64

36,76 ±15,27

P 0,530 0,308 0,819 0,056 † 0,036 * 0,851

CH138+CD62L+

(%)

COL+ 87,73

± 30,70 87,71 ±16,67

85,94 ±24,65

80,65 ±29,67

89,96 ±14,78

85,78 ±32,31

COL- 88,51 ±30,58

91,34 ±11,21

95,19 ±5,41

97,03 ±1,91

78,70 ±43,99

98,88 ±1,72

P 0,839 0,539 0,290 0,303 0,401 0,332

CH138+CD62L-

(%)

COL+ 0,68 ±0,84

2,61 ±5,94

2,03 ±6,28

2,40 ±5,00

0,00 ±0,01

0,02 ±0,06

COL- 9,93 ±9,51

3,03 ±6,99

0,44 ±0,61

0,09 ±0,16

0,47 ±0,97

0,02 ±0,06

P 0,295 0,819 0,859 0,095 † 0,512 0,854

123

Figura 38 - Proporção de granulócitos CH138+ expressando o receptor CD62L em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-), no primeiro mês de vida - São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: * indica diferença entre os grupos e † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1)

10.7 FUNÇÃO DOS NEUTRÓFILOS

A proporção e intensidade (Média Geométrica) da fagocitose e produção de

peróxido de hidrogênio (H2O2) pelos granulócitos, estimulados ou não, estão

dispostos na tabela 12 e figuras 39 e 40.

A proporção de granulócitos que fagocitaram S. aureus foi semelhante entre

as bezerras que ingeriram colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-). A

proporção mínima de células fagocitando foi observada no D0 para ambos os

grupos (COL+ = 45,78%; COL- = 33,76%), em seguida, observou-se rápido

aumento no índice de fagocitose no D2 (COL+ = 89,29%; COL- = 89,04%). Os

valores decresceram gradualmente até o D21 (COL+ = 62,82%; COL- = 65,01%),

25

30

35

40

45

50

55

0 7 14 21 28

PM

N (

%)

Dias

Col+

Col-

† *

0

2

4

6

8

10

12

0 7 14 21 28

CH

13

8+

CD

62

L-(%

)

Dias

Col+

Col-

†

70

75

80

85

90

95

100

0 7 14 21 28

CH

13

8+

CD

62

L+

(%)

Dias

Col+

Col-

124

observando-se decréscimo para o COL- (61,8%) e acréscimo para o COL+

(76,35%) no D28. Não foi possível detectar diferenças estatísticas entre os grupos

durante o primeiro mês de vida (P≥0,110).

A intensidade da fagocitose da bactéria Staphylococcus aureus pelos

granulócitos foi mínima no D0 para ambos os grupos (COL+: 15,15; COL-: 5,1),

observando-se rápido aumento em D2 (COL+: 204,54; COL-: 158,07). A partir do

D2, o perfil apresentado entre os grupos foi diferenciado, detectando-se queda

gradativa no COL + até D28 (52,27) e aumento gradativo no COL- até D14 (272,08)

com queda nos momentos subsequentes (29,45-36,27). Apesar destas variações,

foi possível detectar tendência estatística apenas no 28 (P=0,081).

A proporção de granulócitos que fagocitaram Escherichia coli também foi

semelhante entre as bezerras que ingeriram colostro com (COL+) e sem células

viáveis (COL-) (P≥0,102). Ambos os grupos apresentaram valores mínimos no D0

(COL+ = 35,68%; COL- = 32,36%), observando-se aumento acentuado no D2 para

o COL+ (87,44%) e COL- (77,92%). Após, os valores de ambos os grupos

decresceram no D21 (COL+ = 55,04%; COL- = 55,71%) e aumentaram no

momento subsequente (COL+ = 73,67%; COL- = 65,47%).

A intensidade da fagocitose da bactéria Escherichia coli pelos granulócitos

foi mínima no D0 para ambos os grupos (COL+: 4,38; COL-: 4,59), observando-se

rápido aumento em D2 (COL+: 179,17; COL-: 118,28). A partir do D2, o perfil

apresentado entre os grupos foi diferenciado, detectando-se queda gradativa até

D21 (23,70) e aumento no D28 (79,97) no COL +, em contrapartida, o COL- teve

aumento gradativo até D14 (252,98) com queda nos momentos subsequentes

(18,31-43,50). Foi possível detectar diferenças estatísticas entre os grupos no D7

(P=0,034).

As diferenças obtidas para a fagocitose das bactérias S.aureus e E.coli,

considerando-se as comparações múltiplas entre os momentos, pode ser

visualizada na tabela 12.

A produção espontânea de peróxido de hidrogênio (H2O2) pelos granulócitos

(%) apresentou perfil diferenciado entre os grupos COL+ e COL-. O grupo COL+

apresentou leves variações (89,64-83,51%) durante o estudo considerando-se a

proporção de células produzindo H2O2, enquanto o COL- apresentou aumento do

D0 (COL- = 89,38%) ao D14-D28 (91,25-94,41%). Foi possível detectar tendência

estatística entre os grupos no D14 (P=0,061), momento em que o COL- (94,41%)

125

apresentava maior proporção de células produzindo H2O2 que o COL+ (90,43%).

Apesar das variações relatadas entre os momentos, não foi possível detectar

diferenças estatísticas.

A intensidade da produção espontânea de peróxido de hidrogênio (H2O2)

pelos granulócitos foi mínima no D0 (COL+: 234,55; COL-: 280,14), em seguida o

perfil foi diferenciado entre os grupos. O grupo COL+ apresentou aumento gradual

na intensidade da fluorescência até D21 (727,50) e redução em D28 (395,20), em

contrapartida, o COL- apresentou leves oscilações no período com pico máximo no

D7 (406,80). Foi possível observar tendência estatística entre os grupos no D21,

observando-se maior intensidade de fluorescência no COL+ (727,50) em relação ao

COL- (243,40) (P=0,094). Apesar das variações relatadas entre os momentos, não

foi possível detectar diferenças estatísticas.

O perfil apresentado para a proporção e intensidade da produção de H2O2

pelos granulócitos foram semelhantes para as duas bactérias usadas como

estímulo, entretanto ficou nítida a diferença entre os grupos que receberam colostro

com (COL+) e sem células viáveis (COL-).


(%), quando estimulados pelo S.aureus, sofreram poucas variações. O COL+

(95,73%) maiores valores que o COL- (92,37%) em D7, observando-se diferença

estatística (P=0,008). Foi observada tendência estatística no D0 entre os grupos

(P=0,092). Não foi possível detectar diferenças entre os momentos.


pelos granulócitos quando estimulados com S.aureus foi crescente no COL + do D0

(584) ao D21-D28 (929,5-1011,8), em contrapartida, o COL- apresentou aumento

do D0 (359,2) ao D2 (739,1) e valores constantes nos momentos subsequentes

(739,1-864,9). Foi observada tendência estatística no D0 entre os grupos

(P=0,089). Não foi possível detectar diferenças entre os momentos.


(%), quando estimulados pelo E.coli sofreram poucas variações. O COL+

apresentou variações nos valores, detectando-se quedas do D0 (94,94%) ao D2

(89,66%), D14-D21 (86,51-85,81%) e aumento em D28 (93,57%). O COL-

apresentou valores constantes do D0 (91,21%) ao D14 (90,43%), detectando-se

leve aumento no D21 (92,14%) e queda em D28 (85,98%). Foi possível detectar

tendências no D1 (0,084) e diferenças estatísticas entre os grupos no D28

126

(P=0,040). Não foi possível detectar diferenças entre os momentos, apesara das

variações relatadas.


pelos granulócitos quando estimulados com E.coli foi constante no COL- do D0 ao

D28 (406,6-528,10), enquanto o COL+ apresentou aumento crescente no decorrer

do estudo (505,9-746,80). Apesar destas variações não foi possível detectar

diferenças entre os momentos e grupos experimentais.

127

Tabela 12 - Proporção (%) e intensidade da fagocitose (Média Geométrica – Geo Mean) e produção

de peróxido de hidrogênio pelos granulócitos em bezerras Holandesas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo – 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016) Legenda: letras minúsculas na mesma coluna demonstram diferença entre os tempos, sendo (a) valores diferentes do D0; (b) valores diferentes do D2; (c) valores diferentes do D7; (d) valores diferentes do D14; (e) valores diferentes do D21; (f) valores diferentes do D28, quando p<0,05 e tendência quando P≤0,10. * indica diferença entre os grupos e † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1); * indica diferença entre os grupos e † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1).


S.aureus

Índice Fagocitose

(%)

COL+ 45,78 ±27,6

89,29 ±11,15

79,98 ±26,26

71,13 ±22,79

62,82 ±22,02

76,35 ±14,27

COL- 33,76 ±18,72bce

89,04 ±10,77 a

84,71 ±15,43 a

77,82 ±27,04

65,1 ±18,26 a

61,8 ±26,67

S.aureus

Fagocitose (Geo Mean)

COL+ 15,15 ±28,63bcf

204,54 ±187,45 ae

117,99 ±101,49 a

103,98 ±152,02

25,72 ±20,43 b

52,27 ±41,14 a

COL- 5,1 ±3,38 bcdef

158,07 ±142,41 a

211,6 ±155,27 a

272,08 ±198,71 a

29,45 ±28,15 a

36,27 ±55,49 a

E.coli

Índice Fagocitose

(%)

COL+ 35,68 ±22,47

87,44 ±11,68

72,49 ±23,96

65,19 ±28,37

55,04 ±16,80

73,67 ±16,54

COL- 32,36 ±20,41c

77,92 ±17,06 e

81,63 ±13,06 a

82,52 ±21,66

55,71 ±18,75 b

65,47 ±13,08

E.coli

Fagocitose (Geo Mean)

COL+ 4,38 ±1,32bcef

179,17 ±164,14 a

89,47 ±82,91 a

63,65 ±103,77

23,70 ±32,70 a

79,97 ±95,05 a

COL- 4,59 ±1,50bcdf

118,28 ±128,14 a

167,08 ±110,44 a

252,98 ±244,98 a

18,32 ±18,64f

43,50 ±54,98 ae

Produção espontânea

H2O2 (%)

COL+ 91,44 ±6,19

89,64 ±7,09

91,82 ±7,59

90,43 ±5,77

91,03 ±8,74

93,51 ±3,93

COL- 84,20 ±14,31

91,03 ±5,45

89,21 ±7,74

94,41 ±1,85

93,20 ±5,51

91,25 ±11,72

Produção espontânea

H2O2 (Geo Mean)

COL+ 234,55 ±236,24

281,47 ±292,64

300,86 ±290,58

437,30 ±248,76

727,50 ±857,22

395,20 ±212,87

COL- 280,14 ±261,76

299,77 ±181,45

406,80 ±373,55

343,40 ±110,91

243,40 ±85,67

372,30 ±149,54

S.aureus Produção H2O2

(%)

COL+ 93,88 ±4,58

87,65 ±12,31

95,73 ±1,77

88,88 ±6,77

87,51 ±12,33

88,1 ±16,07

COL- 89,38 ±6,38

91,45 ±9,02

92,37 ±3,01

91,35 ±3,8

92,45 ±4,9

90,9 ±6,09

S.aureus Produção H2O2

(Geo Mean)

COL+ 584 ±392,64

603,1 ±526,54

722,7 ±609,84

954,7 ±762,59

1011,8 ±1023,82

929,5 ±511,97

COL- 359,2 ±220,75 d f

739,1 ±505,25

801 ±767,01

864,9 ±306,87 a

692,8 ±253,67

812,4 ±219,56 a

E.coli Produção H2O2

(%)

COL+ 94,94 ±2,51

89,66 ±6,59

94,08 ±4,05

86,51 ±8,30

85,81 ±12,01

93,57 ±4,31

COL- 91,21 ±5,79

91,14 ±5,86

91,47 ±4,13

90,43 ±5,42

92,14 ±5,71

85,98 ±10,98

E.coli Produção H2O2

(Geo Mean)

COL+ 505,90 ±234,58

427,44 ±367,05

557,50 ±669,89

661,60 ±584,71

771,70 ±692,03

746,80 ±310,67

COL- 406,60 ±252,43

457,56 ±236,20

508,10 ±410,26

534,30 ±207,22

490,80 ±219,55

528,10 ±187,24

128

Figura 39 - Proporção (%) e intensidade da fagocitose (Média Geométrica– Geo Mean) da fagocitose pelos granulócitos mediante liberação espontânea ou estimulados, em bezerras Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) – São Paulo - 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: * indica diferença entre os grupos e † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1)

30

40

50

60

70

80

90

100

0 7 14 21 28

Fag

oci

tose

(%

)

Dias

E. coli

Col+

Col-

0

50

100

150

200

250

300

0 7 14 21 28

Fag

oci

tose

(G

M)

Dias

S. aureus

Col+

Col-

†

0

50

100

150

200

250

300

0 7 14 21 28

Fag

oci

tose

(G

M)

Dias

E. coli

Col+

Col-

30

40

50

60

70

80

90

100

0 7 14 21 28

Fag

oci

tose

(%

)

Dias

S. aureus

Col+

Col-

129

Figura 40 - Produção de peróxido de hidrogênio (% e intensidade – Média Geométrica – Geo Mean)

pelos granulócitos, mediante liberação espontânea ou estimulados, em bezerras Holandesas recém-nascidas que receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) - São Paulo - 2016

Fonte: (COSTA, J. F. R., 2016). Legenda: * indica diferença entre os grupos e † indica tendência entre os grupos naquele momento (p>0,05 e < 0,1)

8486

8890

9294

9698

0 7 14 21 28

Bu

rst

(%)

Dias

E. coli

Col+

Col-

†

8486889092949698

0 7 14 21 28

Bu

rst

(%)

Dias

S. aureus

Col+

Col-

† *

350450550650750850950

1050

0 7 14 21 28

Bu

rst

(GM

)

Dias

S. aureus

Col+

Col-

350450550650750850950

1050

0 7 14 21 28

Bu

rst

(GM

)

Dias

E. coli

Col+

Col-

82

84

86

88

90

92

94

96

0 7 14 21 28

Bu

rst

bas

al (

%)

Dia

Liberação espontânea

Col+

Col-

†

200

300

400

500

600

700

800

0 7 14 21 28

Bu

rst

bas

al (

GM

)

Dia

Liberação espontânea

Col+

Col-

†

130

11 DISCUSSÃO

Esta pesquisa avaliou a influência das células do colostro na resposta imune

inata e ocorrência de diarreias em bezerras recém-nascidas.


A CCS (1.895.844 células/mL) do colostro obtida neste estudo foi superior ao

valor de 878.000 células/mL encontrado por Gomes et al. (2011). Considerando-se a

concentração celular obtida, pode-se estimar que as bezerras receberam um total de

células de 7,58x109 em quatro litros de colostro. Silva (2014) relatou que o colostro

de primeira ordenha apresenta 32% de viabilidade celular, assim pode-se estimar a

ingestão de aproximadamente 2,42x109 células viáveis no volume mínimo

equivalente a quatro litros de colostro administrado às recém-nascidas.

Novo et al. (2014) demonstraram que não há células viáveis após

congelamento das amostras em freezer -20ºC. No estudo da equipe foram feitos

testes a partir de uma hora de congelamento, com intervalos de hora em hora até 6

horas no freezer e após 24 horas. Em todas as análises foi possível observar que o

congelamento lisou as células, tornando-as inviáveis. Langel et al. (2015) utilizaram

os mesmos grupos experimentais (COL+ e COL-) para desenvolver seu trabalho,

porém com a diferença que o colostro congelado que as bezerras mamaram foi

congelado em nitrogênio líquido para que o processo de lise das células ocorresse

de forma rápida e, assim, fosse possível que a bezerra recebesse o colostro

congelado de sua própria mãe. Desta forma, não precisaram mamar colostro de

doadoras, como ocorreu neste experimento.

A concentração de Igs do colostro e sólidos totais dos dois grupos

experimentais apresentaram valores adequados, segundo o limiar inicial e bem

consolidado de 50g/L estabelecidos por Chigerwe et al. (2008); Godden (2008);

Morril et al. (2012) e Quigley et al. (2013). Se considerarmos o ponto de corte

determinado mais recentemente para o teor de IgG (IgG ≥ 80g/L) e sólidos totais

(≥23%), respectivamente, determinados pelo colostrômetro e refratômetro Brix, os

131

valores continuam acima deste limiar, garantindo assim que foi fornecido colostro de

alta qualidade para as bezerras deste experimento, acima do recomendado pela

literatura atual (BARTIER; WINDEYER; DOEPEL, 2015).

A ausência de diferenças estatísticas entre os valores obtidos para a

concentração de imunoglobulinas e sólidos totais do colostro para o COL+ e COL-

permitiu a confirmação da padronização da qualidade do colostro fornecido para os

dois grupos experimentais.

11.2 STATUS SANITÁRIO DAS BEZERRAS

A principal doença que acometeu as bezerras deste experimento no período

neonatal foi a diarreia. Através da avaliação dos escores pode-se observar que a

doença teve início no D2 e perdurou pelas próximas três semanas. A maior

ocorrência de diarreia foi observada em ambos os grupos no D7 e D14.

Nesta pesquisa não foi observada diferença para as frequências de diarreias

entre os grupos e momentos avaliados, porém o grupo COL- apresentou maior

número de bezerras apresentando diarreia severa, com escore de fezes igual a 3.

Riedel-Caspari (1993) após infectar as bezerras com E. coli observou a

manifestação de diarreias em ambos os grupos de bezerras que haviam recebido

colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-). As bezerras que mamaram

colostro acelular apresentaram quadro clínico de maior intensidade, considerando o

aumento de temperatura retal durante todo o período, além da maior eliminação por

tempo prolongado de E. coli nas fezes. Estes dados coincidem com os achados da

presente pesquisa, considerando-se maior frequência de escore de fezes 3 nas

bezerras COL-. A autora ressalta que os leucócitos colostrais, bem como outras

substâncias do colostro, melhoraram a resistência do animal contra a infecção

artificial à qual elas foram submetidas desde o estágio inicial e após a infecção. A

autora levantou duas hipóteses sobre os mecanismos de defesa envolvendo as

células do colostro: a primeira é de que os leucócitos do colostro podem ter atuado

através de efeito antimicrobiano ou então, as células podem ter estimulado a

resistência endógena da bezerra à infecção.

132

Langel et al. (2015) analisaram o escore de fezes de bezerras Holandesas e

Jersey recém-nascidas, durante o primeiro mês, que receberam colostro fresco ou

congelado. Estes autores também não encontraram diferenças para o escore de

fezes em relação aos grupos experimentais. A maior taxa de diarreia observada

pelos retro-referidos autores foi aos 14 dias de vida, período coincidente com os

achados deste experimento.

A elevada ocorrência de diarreia observada nas bezerras COL+ (50-70%) e

COL- (44-78%) no primeiro mês de vida foi superior à prevalência (19,1%) e

incidência (21,2%) reportados por outros pesquisadores (BARTELS et al., 2010;

WINDEYER et al., 2014).

A elevada frequência de diarreia a partir do D2 nas bezerras que ingeriram

colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) pode estar relacionada a diversos

fatores de risco.

O alojamento e manejo ao qual as bezerras foram submetidas durante o

período experimental pode ter influenciado na elevada ocorrência de diarreia. As

bezerras eram transferidas das baias individuais e suspensas localizadas na

maternidade para o bezerreiro aproximadamente seis horas após o parto. A

estrutura do bezerreiro contempla uma área coberta de aproximadamente 1040 m2,

com a possibilidade de fechamento lateral com cortinas de tecido sintético,

composto por 100% de polipropileno. No bezerreiro, as bezerras inicialmente foram

alojadas em baias de madeira não suspensas onde era fornecido o leite de

transição. Após três dias de vida, as bezerras foram novamente movidas para

gaiolas suspensas de metal (1,2 m2), onde foram mantidas até 70 dias de vida. No

período de aleitamento, as bezerras recebiam seis litros de leite sem antibióticos, em

baldes, proveniente do rebanho.

As baias da maternidade eram higienizadas a cada cinco dias, sendo que

uma vez por semana as paredes eram pintadas com uma mistura de cal com água.

As baias de transição não suspensas e localizadas no bezerreiro também eram

lavadas e desinfetadas com água e cal. O chão desta baia era um tapete de

borracha, onde os funcionários colocavam cal e capim por cima. O chão e o teto do

barracão eram higienizados antes da entrada das bezerras com água pressurizada

e, em seguida, com cal. O cloro era usado como desinfetante para a limpeza dos

baldes e mamadeiras. Nos tanques onde o leite era armazenado eram usados

produtos de limpeza de ordenha: alcalino clorado e ácido.

133

O maior risco para a ocorrência da diarreia no manejo supra-descrito está

relacionado à higienização das baias individuais, onde, apesar dos responsáveis

pela fazenda terem consciência que o ideal seria a troca da cama e higienização a

cada nova bezerra, o fato de não trocarem o material constantemente permite que

haja contaminação entre os animais que são inseridos em ambiente já utilizado por

outras bezerras.

Outros fatores de risco citados por McGuirk (2008) também podem ser

mencionados considerando-se a realidade da fazenda onde este experimento foi

realizado, tais como: contaminação oro-fecal pelo colostro ou ambiente; presença de

outros animais no recinto como gatos; possível higienização não adequada de

utensílios como mamadeiras, sondas esofágicas, bem como da limpeza do uniforme

dos funcionários, como botas, macacões além da higiene das mãos dos cuidadores

das bezerras.

Os principais patógenos causadores de diarreia em bezerros neonatos são

Escherichia coli, Rotavírus, Coronavírus e Cryptosporidium parvum, identificados

antes e após a primeira semana de vida (GULLIKSEN et al., 2009; BARTELS et al.,

2010; CHO; YOON, 2013; MEGANCK et al., 2015). A identificação do patógeno

causador da diarreia não foi contemplada no objetivo deste estudo, porém a maior

ocorrência de diarreia entre 7 e 14 dias de vida aponta para maior possibilidade para

agentes como Rotavirus, Coronavirus, Cryptosporidium (MCGUIRK, 2008; CHO;

YOON, 2013).

As vacas desta fazenda são vacinadas no período pré-parto para Escherichia

coli, Rotavírus e Coronavírus, assim, a ocorrência de diarreia deveria ter sido menor

do que os valores obtidos neste experimento. Meganck et al. (2015) mostraram que

a vacinação materna reduz a frequência da diarreia neonatal de 39,9% para 14,3%.

Broncopneumonia foi observada em apenas uma bezerra do COL+ aos 14

dias de vida e COL- aos 28 dias de vida. Langel et al. (2015) também avaliaram o

escore de broncopneumonia em bezerras que receberam colostro fresco e

congelado. Estes autores detectaram maior ocorrência de escore respiratório aos 12

dias de vida no COL-, porém sem diferença estatística. O período onde foi detectada

diferença estatística foi aos 38 dias, fase que não avaliamos neste experimento.

Durante todo o experimento foram observados 23 episódios de anemia. A

anemia, predominantemente de acordo com a morfologia dos eritrócitos, foi a

normocítica hipocrômica e o grupo mais anêmico foi o COL-. No caso da anemia da

134

inflamação, a absorção e distribuição das reservas de ferro não são suficientes para

satisfazer a síntese de hemoglobina na medula óssea, mesmo tendo adequada

ingestão de ferro na alimentação (GANZ, 2005). Acredita-se que a anemia

encontrada no grupo COL- foi decorrente da resposta inflamatória causada a partir

dos agentes responsáveis pela diarreia. Ganz (2005) afirmaram que este tipo de

anemia pode ser um efeito colateral da resposta de defesa do hospedeiro para o

controle da multiplicação bacteriana, considerando-se que o ferro é fundamental ao

seu metabolismo.

O diferente status sanitário apresentado pelos grupos experimentais pode

estar relacionado à ingestão e absorção de células maternas do colostro.

11.3 CORTISOL

O perfil da concentração do cortisol foi semelhante entre os grupos que

receberam colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-). Ambos os grupos

apresentaram pico de cortisol no D0, o que coincide com o momento pós-

nascimento. O momento do parto é um período crítico e estressante, tanto para a

vaca quanto para o bezerro, mesmo no parto eutócico, onde são observadas

alterações endócrinas com a liberação de cortisol, noradrenalina e adrenalina. O

momento do parto é bastante delicado, fazendo-se necessário um acompanhamento

rigoroso durante as primeiras horas de vida (VANNUCCHI et al., 2015).

Uma das principais funções do cortisol é manter o equilíbrio da glicose do

sangue. O aumento do cortisol serve, inicialmente, para prevenir a hipoglicemia

durante estresse agudo ou prolongado como, por exemplo, do parto (BENFIELD et

al., 2014).

Os altos níveis de cortisol que os bezerros produzem durante o parto

permanecem elevados durante a primeira semana de vida, dependendo do

oferecimento de condições ambientais e de manejo favoráveis à adaptação orgânica

do recém-nascido. Ao nascer, bezerras necessitam passar por um processo de

adaptação orgânica ao ambiente extrauterino. Algumas destas adaptações foram

135

avaliadas do nascimento ao desmame por Silva et al. (2016, no prelo) 12 ,

observando-se que a primeira semana pós-natal foi marcada por importantes

alterações fisiológicas inerentes à adaptação das funções cardiorrespiratórias, com

algumas oscilações nos momentos seguintes, que foram atribuídas a oscilações

climáticas do ambiente onde foram criadas. Os autores relataram impactos diretos

do período de adaptação extrauterina nos parâmetros fisiológicos dos neonatos. A

inadequada adaptação pode prolongar o estresse e os elevados níveis de cortisol.

Nesta pesquisa observou-se rápida diminuição dos níveis de cortisol já na

primeira semana de vida. Esta adaptação em relação aos níveis de cortisol pode

estar relacionada às baias de transição, pois provavelmente elas devem ter

fornecido condições que otimizassem esta estabilidade orgânica pós-nascimento.

O acúmulo desses hormônios tem um efeito supressivo nas respostas imunes

dos bezerros, afetando diretamente a resposta imune inata, causando diminuição na

fagocitose e na atividade bactericida dos neutrófilos e macrófagos (BARRINGTON;

PARISH, 2001; MOREIN et al., 2002; CHASE; HURLEY; REBER, 2008).

11.4 HAPTOGLOBINA

As proteínas de fase aguda são um excelente marcador inflamatório utilizado

para mensurar a inflamação. Dentre as proteínas de fase aguda, a haptoglobina é a

proteína de fase aguda (PFA) mais indicada para a mensuração de inflamação em

bovinos (MURRATA et al., 2004; PETERSEN et al., 2004).

As PFA são produzidas em resposta ao estímulo bacteriano e podem ser

usadas como um indicador quantitativo da infecção, inflamação, lesão tecidual e

estresse. A hp reduz o estresse pró-oxidativo e pró-inflamatório através da formação

de complexos pela ligação da hp com a hemoglobina e retirando-a da circulação

(MURRATA et al., 2004; PETERSEN et al., 2004).

Bezerros nascem com baixa concentração de hp, que podem estar ligadas ao

sistema imunológico. Kruger et al. (2015) acreditam que o aumento da hp deve ser

12

SILVA, B. T.; HENKLEN, A.; MARQUES, R. S.; OLIVEIRA, P. ;L.; LEITE, S. B. P.; NOVO, S. M. F.; BACCILI, C. C.; REIS, J. F.; GOMES, V. Vital parameters of Holstein calves from birth to weaning. Revista Brasileira de Medicina Veterinária. [200-]. (no prelo).

136

visto como um evento positivo que indica inflamação nos primeiros dias de vida e

consideram este fenômeno como algo normal e necessário para que haja a

adaptação do animal ao ambiente extrauterino. Por outro lado, o que foi observado

nesta pesquisa é que a hp aumentou apenas nos momentos em que as bezerras

apresentaram diarreia, desta forma, contradizendo o autor supracitado e reafirmando

a possibilidade de ela ser considerada um marcador inflamatório.

A haptoglobina das bezerras deste experimento apresentou perfil diferente

entre os dois grupos, apesar da ausência de diferenças estatísticas. Foi possível

observar que ambos começaram com baixos valores, tanto no nascimento quanto no

D2. Já no D7 houve um acentuado aumento, atingindo o pico para o COL+ que logo

em seguida decresceu de forma acentuada, observando-se valores próximos ao

basal no D14. Já o COL- apresentou valores elevados em D7 e D14. Analisando os

resultados, pode-se observar que os bezerros que ingeriram colostro sem células

viáveis (COL-) apresentaram uma resposta inflamatória mais prolongada,

principalmente nos momento em que houve diarreia. Pourjafar et al. (2011) também

avaliaram a hp de bezerras durante o primeiro mês de vida e encontraram picos de

hp coincidentes com o período em que elas apresentaram diarreia e provaram que a

hp é um indicador confiável da severidade da diarreia em bezerras recém-nascidas.

Possivelmente as citocinas pró-inflamatórias, especialmente a interleucina 6,

estimularam o fígado para a produção de proteínas de fase aguda, dentre elas a

haptoglobina (HEINRICH; CASTELL; ANDUS, 1990). A haptoglobina é induzida pela

citocina IL-6 e é caracterizada por ter um aumento na concentração sérica mais

tardio, permanecendo elevado até a segunda semana (PETERSEN et al., 2004).

Os valores apresentados neste trabalho confirmam que foi possível mensurar

a inflamação através da formação dos complexos da haptoglobina, pois o pico de

concentração de hp coincide com os momentos em que as bezerras apresentaram

diarreia.

11.5 FERRO

Os animais do grupo COL- apresentaram menores valores de hemácias,

hematócrito e hemoglobina, especialmente no D2. Este momento coincide com

137

acentuada diminuição nos valores de ferro sérico das bezerras que ingeriram

colostro sem células viáveis.

Citocinas pró-inflamatórias, especialmente IL-1 e IL-6 são responsáveis pela

indução da produção de proteínas de fase aguda, como por exemplo a hepcidina.

Essa substância se liga com a porção férrica dos enterócitos, hepatócitos e

macrófagos para bloquear a liberação de ferro armazenado nestas células. O efeito

desta interação resulta na inibição da absorção de ferro da dieta e limita a

exportação do mineral a partir do macrófago e hepatócito. O ferro é fundamental

para as funções vitais das bactérias, tais como síntese de DNA e transporte de

elétrons (NEMETH; GANZ, 2006).

11.6 PROPORÇÃO E FUNÇÃO DOS NEUTRÓFILOS

O leucograma apresentou perfil ligeiramente diferenciado entre os grupos

COL- e COL+. A oscilação observada no gráfico dos leucócitos totais e dos

neutrófilos foi muito semelhante para o grupo COL+ e COL-, porém a queda do

número de neutrófilos a partir do D7 foi mais intensa no COL+. Este fato pode ser

associado com a maior eficiência dos neutrófilos das bezerras COL+ em migrar a

partir dos episódios de diarreia (ZWAHLEN; ROTH, 1990).

Novo (2015) utilizou as mesmas bezerras deste experimento para o seu

estudo. O alto número de células T gamma-delta ativadas presentes no grupo COL+

pode ser explicado pela resposta inflamatória mais rápida em comparação ao tempo

que COL- levou para responder à inflamação. Acredita-se que os neutrófilos das

bezerras que mamaram o colostro fresco tiveram maior agilidade em perceber o

estímulo e se mover no sentido do tecido para combater a inflamação. As células T

gamma-delta representam a principal fonte de IL-17, que é responsável pelo

recrutamento para o tecido inflamado, e essa migração dos neutrófilos observada no

D7 coincidiu com os episódios detectados de diarreia. (ROARK et al., 2008)

Foi possível observar diferença entre os momentos para os leucócitos totais

do grupo COL- onde o D0 foi diferente do D28. Em relação ao número de neutrófilos

no grupo COL+, o D0 foi diferente em relação ao D14, D21, D28.

138

Nagahata et al. (2000) sugeriram que o aumento do cortisol sérico poderia

resultar em uma diminuição da expressão da L-selectina na superfície dos

neutrófilos. Este fato justificaria a diminuição da ligação dessas células com as

endoteliais, aumentando o número dos neutrófilos na circulação com redução no

compartimento marginal; portanto, o aumento, dos neutrófilos ocorre pela somatória

entre os neutrófilos circulantes e aqueles liberados do estoque da medula óssea. O

que observamos neste experimento foi que no momento em que o cortisol esteve

alto (D0), a expressão de L-selectina na superfície dos neutrófilos estava ao redor de

85-90%. Talvez o efeito do cortisol sobre a expressão da L-selectina tenha sido

mínimo considerando as condições de manejo oferecidas pelas bezerras.

A avaliação da influência das células do colostro sobre a proporção das

subpopulações de leucócitos mononucleares do sangue das bezerras tem sido

avaliada pela técnica de imunofenotipagem (REBER et al., 2006; REBER et al.,

2008a,b; LANGEL et al., 2015; NOVO, 2015), porém, pouco ainda se tem na

literatura a respeito da proporção e função das células polimorfonucleares CH138+

expressando ou não da L-selectina.

O grupo COL+ apresentou queda brusca na proporção de PMN do D7 ao D21

que coincidiu com a redução na proporção de células expressando CD62L,

provavelmente porque já haviam migrado para o tecido inflamado. Em contrapartida,

o COL- apresentou queda lenta e gradual do PMN que coincidiu com maior

expressão CD62L na circulação sanguínea devido ao lento processo de migração

destas células aos tecidos.

A população CH138+CD62L+ é representada por granulócitos ativados. A

ativação acentuada dos neutrófilos através da L-selectina ocorreu para que

houvesse o mecanismo de adesão dos neutrófilos às células endoteliais dos vasos

para a migração das células para o tecido através da diapedese. Este processo

parece ter sido mais rápido nos bezerros que ingeriram colostro materno com células

(COL+) observado no D14 em relação ao COL- (D21). Esta hipótese é reforçada

pelo perfil dos valores absolutos de neutrófilos determinados pelo leucograma, no

qual o COL+ apresentou queda brusca do D7 ao D14, enquanto o COL- apresentou

queda lenta e gradual no decorrer do estudo.

A população CH138+CD62L- circulante apresentou tendência para diferentes

perfis, observando-se maiores proporções no COL+ em relação ao COL-. Este fato

pode indicar diferenças na intensidade da diarreia apresentada pelos dois grupos,

139

considerando que o COL- apresentou maior frequência de escore 3. Os granulócitos

CH138+ das bezerras COL- estavam sendo recrutados em quase totalidade para a

defesa contra a infecção. O COL+ apresentou um pouco mais de neutrófilos

circulantes sem que estivessem sendo recrutados ao tecido, mais um sinal que

comprova que estes animais estiveram mais sadios e menos debilitados,

necessitando um pouco menos da atividade.

Reber et al. (2006) também não encontraram diferenças entre os grupos

COL+ e COL- para a expressão de L-selectina das células mononucleares

sanguíneas. Os autores acreditam que a L-selectina desempenha um papel menos

importante na migração de células através da parede do intestino devido ao menor

fluxo dos vasos na região intestinal.

Langel et al. (2015) observaram que a expressão de L-selectina foi maior nos

linfócitos no grupo acelular. Os autores acreditam que possa ter havido expressão

do CD62-L na superfície celular em resposta a antígenos ou estímulo de citocinas.

Gomes et al. (2014) avaliaram a influência do colostro no desenvolvimento da

resposta imune inata de bezerros recém-nascidos pela imunofenotipagem do

CH138+ das células sanguíneas. Os autores observaram que as proporções de

neutrófilos CH138+ estiveram maiores no nascimento, e permaneceram altas até o

15º dia de vida. Este perfil se assemelhou ao encontrado nesta pesquisa para

CH138+CD62L+ os quais também permaneceram altos praticamente nos mesmos

períodos, tendo baixa nos valores no 14º dia. Estas alterações na população de

CH138+ podem estar relacionadas ao estresse do nascimento e neste caso não

foram relacionadas a processos inflamatórios, pois os autores detectaram baixos ou

indetectáveis níveis de citocinas pró-inflamatórias.

A partir dos dados apresentados para o perfil de COL+ e COL- foi possível

notar uma maior e mais rápida resposta nas bezerras COL+, observando maior

dificuldade do COL- em reagir aos desafios. A hipótese que levantamos para

justificar esse achado é de que as bezerras COL+ apresentaram uma maior resposta

Th17 através do estímulo das células gamma-delta. Possivelmente, o que possa ter

ocorrido é que ao ingerir o colostro com células viáveis, as mesmas foram

absorvidas pelo epitélio intestinal. Ao nascimento, ambos os grupos foram

desafiados pelos microrganismos do meio ambiente. Desta forma, os patógenos que

adentraram o organismo e estiveram presentes na parede do intestino foram

fagocitados por células dendríticas e macrófagos, seguiram aos linfonodos

140

mesentéricos e placas de Peyer onde estimularam a expansão clonal de linfócitos T.

Esta expansão clonal estimulou a produção de células T gamma-delta que, por sua

vez, ao liberarem a citocina IL-17, atraíram mais neutrófilos para combater a

infecção no foco da inflamação observados no COL-.

Esta hipótese pode ser sustentada pelos achados de NOVO (2015) que, ao

utilizar as mesmas bezerras para o experimento e mensurar a IL-17, obteve que as

células T gamma-delta das bezerras COL+ apresentaram produção precoce da

citocina, recrutando neutrófilos de forma mais ágil. Shibata et al. (2007) analisaram a

produção de IL-17 por células T gamma-delta em ratos infectados com E. coli e

demonstraram que estas células são importantes para a resposta a estímulos

bacterianos.

Para avaliar a função dos neutrófilos cabe explicar o motivo pelo qual não foi

utilizado o marcador CH138+ para definir o local exato onde os neutrófilos estavam

dentro do gate de polimorfonucleares. Em experimento anterior da equipe, SILVA

(2014) avaliou a fagocitose e produção de burst oxidativo das células

polimorfonucleares do sangue de vacas no periparto pela mesma técnica de

fagocitose de S. aureus e E. coli desenvolvida neste experimento. Neste trabalho,

SILVA (2014) observou que a maioria das células dentro do gate PMN eram células

CH138+ (96%).

A metodologia empregada para a mensuração da fagocitose e produção de

radicais livres foi testada e comprovada por Kampen et al. (2004) que, dentre cinco

metodologias testadas, concluiu que a citometria de fluxo é ideal por ser considerada

relativamente fácil, por usar uma pequena quantidade de sangue, e por permitir

isolamento da população celular de interesse.

Os PMN apresentaram perfis diferentes em ambos os grupos, o que permitiu

a detecção de algumas diferenças ou tendências estatísticas. Os neutrófilos do

COL- foram mais reativos durante praticamente todo o período estudado,

detectando-se tendência no D14 e diferença no D21 entre grupos.

O índice de fagocitose realizada pelas células polimorfonucleares,

estimulados com S. aureus e Escherichia coli, foram semelhantes entre os grupos

de bezerras que ingeriram colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-),

observando-se pico máximo no D2. Em contrapartida, a intensidade da fagocitose

foi maior no COL- que apresentou valores crescentes do D7 ao D14 e queda brusca

em D21. Diferença estatística foi comprovada no D7 para a E.coli, onde o COL-

141

apresentou maior intensidade de fluorescência. Este fato aponta que os PMN do

grupo COL- apresentavam maior quantidade de bactérias em seu interior e maior

atividade celular.

O perfil apresentado para a produção de peróxido de hidrogênio foi diferente

entre os grupos, apesar das poucas diferenças estatísticas obtidas. A proporção de

células produzindo o H2O2 basal foi maior no COL- no D14, entretanto as bezerras

que ingeriram colostro com células (COL+) apresentaram maior intensidade de

fluorescência no D21. Estes achados indicam que as células PMN das bezerras

COL+ possuem maior capacidade para produzir peróxido de hidrogênio.

A proporção de células PMN produzindo H2O2 após a estimulação com o

S.aureus e E.coli foi constante no COL- e sofreram variações no COL+ observando-

se pico máximo em D7 e redução entre D14 e D28. Este fato pode apontar para um

constante desafio no COL- ao longo do estudo e redução da função dos PMN no

COL+ devido ao melhor status sanitário dessas bezerras.

A intensidade da fluorescência obtida para a produção de H2O2 quando

estimuladas com S.aureus e E.coli também foi mais intensa no COL+ em relação ao

COL- apesar da ausência de diferenças estatísticas entre os grupos ao longo do

estudo.

Batista et al. (2015) avaliaram o sistema imune inato das bezerras através da

fagocitose e produção de radicais livres por fagócitos CH138+ e CD14+ estimulados

com S. aureus e E. coli durante os primeiros 90 dias de vida. Os autores

encontraram maior intensidade de fagocitose de S. aureus na primeira semana. Na

presente pesquisa, a maior intensidade foi observada na primeira semana de vida

para o COL+ e na segunda semana para o COL-. Possivelmente o perfil se

assemelhou ao encontrado no COL+ devido ao melhor status sanitário desse grupo.

O índice de fagocitose (%) dos granulócitos apresentou semelhança entre os

grupos, entretanto a intensidade da fluorescência foi mais expressiva no COL-. Em

contrapartida, o COL+ demonstrou maior habilidade em produzir H2O2. Desta forma,

a grande quantidade de bactérias no interior dos granulócitos das bezerras que

ingeriram colostro sem células viáveis pode ser explicada pela menor eficiência na

produção de peróxido de hidrogênio.

142

12 CONCLUSÕES

Com base nos dados obtidos, pode-se concluir:

(a) As células do colostro influenciaram no perfil sanitário apresentado pelas

bezerras, observando-se maior intensidade de diarreias, menores teores de ferro

sérico e anemias no grupo que recebeu colostro congelado;

(b) A migração dos granulócitos sanguíneos foi mais rápida e intensa no COL+ em

relação às bezerras que receberam colostro congelado (COL-), após exposição

natural aos patógenos causadores de diarreia;

(c) O índice de fagocitose (%) dos granulócitos apresentou semelhança entre os

grupos, entretanto a intensidade da fluorescência foi mais intensa no COL-. Em

contrapartida, o COL+ demonstrou maior habilidade em produzir H2O2.

143

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148

13 CONCLUSÃO GERAL

A administração de colostro com (COL+) e sem células viáveis (COL-) não

influenciou na colonização da microbiota do intestino, porém a maior habilidade de

migração e produção de peróxido de hidrogênio pelos granulócitos sanguíneos das

bezerras COL+ pode justificar o melhor status sanitário desses animais,

considerando-se que as bezerras que ingeriram colostro congelado apresentaram

maior intensidade da diarreia e anemia do processos inflamatório.

149

REFERÊNCIAS

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ANEXOS

ANEXO A –TSA (Tryptic Soy Agar)

Meio de agar TSA .................................................................................................. 16 g

Água destilada q.s.p.......................................................................................... 400 mL

Colocar em um Erlenmeyer o pó e água destilada no fogo e homogeneizar até

dissolver completamente. Autoclavar por 15 minutos a 121°C, esperar esfriar e

distribuir nas placas.

ANEXO B – Agar MacConkey

Meio de agar MacConkey ..................................................................................... 48 g





ANEXO C – Agar Sangue de carneiro 5%

Meio de agar sangue ............................................................................................. 32 g



dissolver completamente. Autoclavar por 15 minutos a 121°C, esperar esfriar até

aproximadamente 50ºC e adicionar o sangue ovino 5%-8% desfibrinado e estéril. Em

seguida, distribuir nas placas.

154

ANEXO D – Salmonella-Shigella (SS)

Meio Salmonella-Shigella......................................................................................... 6 g





ANEXO E – Tetrationato

Meio Tetrationato …............................................................................................ 4,60 g



dissolver completamente. Aquecer até ferver e esperar esfriar até aproximadamente

60°C. Em seguida, distribuir 10mL da solução em tubos estéreis de vidro compridos

com tampa de rosca.

ANEXO F – Iodo-Iodeto

Cristais de Iodo ….................................................................................................... 6 g

Iodeto de Potássio .................................................................................................. 5 g

Água destilada q.s.p............................................................................................ 20 mL

Misturar e armazenar em frasco de vidro âmbar.

155

ANEXO G – Preparo da solução 100mM EDTA

EDTA sal dissódico (C10H14N2O8Na2.2H2O 372,24mM)................................. 3,722g

Água destilada.....................................................................................................100mL

Homogeneizar até dissolver completamente o sal e colocar autoclave

ANEXO H – PBS 10x (Concentrado)

Na2HPO47H2O.....................................................................................................26,79g

NaH2PO4H2O.........................................................................................................4,14g

NaCl.........................................................................................................................82g

Água destilada...................................................................................................1000mL

PBS uso: 1 PBS 10x: 9 de água destilada

ANEXO I – Soluções utilizadas no protocolo de Fagoc itose e Produção de H 2O2

DCFH – Solução de estoque – 25 mM Pó comercial 24,35 mg Etanol 2 mL Proteger da luz – Manter em freezer -20ºC DCFH – Solução de uso Solução de estoque 100 µL PBS 8,2 mL Adaptar a quantidade da solução a ser preparada, para a quantidade necessária apenas para o uso imediato, respeitando as mesmas proporções. EDTA 3 mM EDTA (C10H14N2O8Na22H2O-PM 372,24 g/mol) 1,12g PBS (1x) 1000 mL Manter refrigerado.

156

ANEXO J – PBS 2x (Concentrado)

PBS 10x Concentrado (Anexo H) ...................................................................... 200mL

Água Milli Q.........................................................................................................800mL

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