Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Programa de Pós-Graduação em Neurociências – Instituto do Cérebro

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE REGISTRO DE CÉLULAS DE LUGAR

UTILIZANDO MICRODRIVES DE TETRODOS MÓVEIS EM RATOS

IMPLEMENTATION OF PLACE CELL RECORDINGS USING

MOVABLE TETRODES IN RATS

Estudante: Rafael Hugo de Andrade Pedrosa

Orientador: Prof. Dr. Adriano Bretanha Lopes Tort

Co-orientador: Prof. Dr. Hindiael Aeraf Belchior

Natal / RN

2018

IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE REGISTRO DE CÉLULAS DE LUGAR

UTILIZANDO MICRODRIVES DE TETRODOS MÓVEIS EM RATOS

por

Rafael Hugo de Andrade Pedrosa

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Neurociências.

Orientador: Prof. Dr. Adriano Bretanha Lopes Tort Co-orientador: Prof. Dr. Hindiael Aeraf Belchior

Natal / RN

2018

2

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial

Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro - ICE

Pedrosa, Rafael Hugo de Andrade.

Implantação da técnica de registro de células de lugar utilizando

microdrives de tetrodos móveis em ratos / Rafael Hugo de Andrade

Pedrosa. - Natal, 2018.

102f.: il.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Instituto do

Cérebro. Programa de Pós-Graduação em Neurociências.

Orientador: Adriano Bretanha Lopes Tort.

Coorientador: Hindiael Aeraf Belchior.

1. Célula de lugar. 2. Microdrive. 3. Tetrodo. 4. Oscilações. 5.

Hipocampo. 6. Labirinto linear. I. Tort, Adriano Bretanha Lopes. II.

Belchior, Hindiael Aeraf. III. Título.

RN/UF/Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento, Instituto do

Cérebro. CDU 612.82

Elaborado por ISMAEL SOARES PEREIRA - CRB-15/741

3

Agradecimentos

Agradeço antes de tudo a minha mãe e meu pai por todo o apoio e

paciência ao longo desses 2 anos. Foram meus financiadores e budas em todo o

processo. Também agradeço a meu irmão pelo apoio quase filosófico que me fez

ser um humano menos ignorante.

Agradeço imensamente ao professor Adriano Tort por ter me aceitado e

confiado no meu trabalho. Antes mesmo de trabalharmos em conjunto, você já era

uma inspiração para mim. Hoje, mais que tudo, é um exemplo do cientista que

almejo ser. É uma referência que com certeza vou levar pro resto da minha vida.

Enfim, no mais, eu espero que tenha correspondido minimamente suas

expectativas.

Ao meu pai científico, Hindiael Belchior. Seu respeito, paciência e confiança

só me fizeram querer crescer. Além disso, nunca se inibiu de me ensinar qualquer

coisa de seu conhecimento, é uma virtude que poucos conseguem ter. Foi muito

gratificante trabalhar esse tempo desde a iniciação científica com você, levo seu

nome no meu currículo com muito orgulho.

A Richardson pela ajuda material para que eu tivesse condições de fazer os

experimentos, e Katarina por todas as dicas e conselhos ao longo do meu tempo

no ICe. Além disso, ambos, juntamente com Diego Laplagne se disponibilizaram

em me acompanhar durante o mestrado.

Ao meu Robin científico, Alan Michel, que sem sua proatividade e

cooperação esse trabalho não poderia ter sido feito.

Aos meus colegas e ex de laboratório Lockmann, Bryan, Robinho

maravilha, Vitor, Zé, Rodrigo, Arthur, Pavão, César e Izabela por me ajudar sempre

que precisei.

Aos iceanos Annie, João Patriota, Renzo, Ana Raquel, Daniel Filho, Bruna,

Ingrid, Daiane, Davi, Jéssica, Lyvia, Martin, Janine, Andressa, Carolina e que me

ajudaram de alguma forma ou foram efetivos na manutenção da minha saúde

mental. Também agradeço ao corpo de funcionários do Instituto do Cérebro.

A algumas companhias que facilitaram o trabalho: Sci-hub, Monster, Open

Ephys e Google.

4

“Hamlet” - William Shakespeare

5

Resumo

A formação de mapas espaciais depende do hipocampo e de estruturas

associadas. A atividade eletrofisiológica na região CA1 do hipocampo codifica

representações espaciais através de aumentos da taxa de disparos de neurônios

piramidais, conhecidos por células de lugar. O presente trabalho visou a

implementação da técnica de registro eletrofisiológico hipocampal através da

utilização de microdrives de múltiplos tetrodos móveis. Para isso, desenvolvemos

um protótipo de microdrive e fizemos cirurgias estereotáxicas em ratos para o

implante crônico bilateral. O novo protótipo de microdrive conteve 16 tetrodos

móveis e permitiu o posicionamento progressivo individual dos tetrodos na

camada piramidal da região CA1 do hipocampo dorsal. Após a recuperação

cirúrgica dos animais, realizamos o registro da atividade eletrofisiológica

extracelular da região CA1 enquanto ratos buscavam por recompensa de água

nas extremidades de um labirinto linear. As formas de onda dos potenciais de

ação registrados foram então classificadas como unidades neuronais individuais

por algoritmos de classificação semi-automáticos. Cada disparo de um dado

neurônio foi então associado à posição instantânea do rato no labirinto linear, e

assim detectamos campos receptivos das células de lugar. Dessa forma,

pudemos validar o protótipo de microdrive desenvolvido e, com isso, fornecer uma

base metodológica importante para futuros estudos almejando entender a

codificação espacial do ambiente e a formação de memórias espaciais.

Palavras chave: Células de lugar, Microdrive, Tetrodos, Hipocampo, Labirinto

linear.

6

Abstract

The formation of spatial maps depends on the hippocampus and associated

structures. Electrophysiological activity in the CA1 region of the hippocampus

encodes spatial representations through increases in the firing rate of pyramidal

neurons, known as place cells. The present work aimed the implementation of

hippocampal electrophysiological recording technique through the use of

microdrives of multiple movable tetrodes. For this, we developed a microdrive

prototype and performed stereotaxic surgeries in rats for bilateral chronic implant.

The new prototype microdrive contained 16 movable tetrodes and allowed the

individual progressive positioning of the tetrodes in the pyramidal layer of CA1

region of the dorsal hippocampus. After the surgical recovery of the animals, we

recorded the extracellular electrophysiological activity of the CA1 region while rats

searched for water reward at the ends of a linear track. The waveforms of recorded

action potentials were then classified as individual neural units by semi-automatic

classification algorithms. Each firing of a given neuron was then associated with

the instantaneous position of the rat on the linear track, and thus we detected

place fields of the place cells. Thus, we validated the microdrive prototype

developed and, thereby, provide an important methodological basis for future

studies aiming to understand the spatial encoding of the environment and the

formation of spatial memories.

Keywords: Place cell, Microdrive, Tetrodes, Hippocampus, Linear track.

7

Lista de abreviaturas

MRO - Movimento rápido dos olhos (Rapid eye movement).

SOL - Sono de ondas lentas (Slow wave sleep).

CA1 - Cornu Ammonis area 1.

CA2 - Cornu Ammonis area 2.

CA3 - Cornu Ammonis area 3.

CE - Córtex entorrinal.

GD - Giro denteado.

PRE - Sessão de sono anterior à tarefa espacial.

POS - Sessão de sono posterior à tarefa espacial.

PCL - Potencial de campo local.

V1 - Velocidade 1.

V2 - Velocidade 2.

V3 - Velocidade 3.

A1 - Aceleração 1.

A2 - Aceleração 2.

A3 - Aceleração 3.

IM - Índice de modulação.

CNC - Comando numérico computadorizado.

PSD - Power spectral density (densidade de potência espectral).

8

Lista de figuras

Figura 1 | Esquema das subdivisões hipocampais e suas projeções.

Figura 2 | Esquemático das principais projeções hipocampais.

Figura 3 | Ritmos oscilatórios do cérebro de roedores.

Figura 4 | Ilustração de 4 células de lugar que apresentam potenciais de ação

associados às posições em que o rato se encontra no espaço.

Figura 5 | Esquema ilustrativo da classificação de unidades neuronais a partir do

registro eletrofisiológico feito com tetrodo.

Figura 6 | Ilustração de um microdrive implantado em um rato.

Figura 7 | Comparação entre os diferentes tipos de microdrives que existem

atualmente.

Figura 8 | Processo de manufatura do tetrodo e microdrive.

Figura 9 | Microdrive de 8 tetrodos móveis.

Figura 10 | Microdrive de 16 tetrodos móveis.

Figura 11 | Testes de deslocamento e tensão na base de proteção.

Figura 12 | Reposicionamento dos tetrodos ao longo dos dias.

Figura 13 | Ilustração do protocolo de labirinto linear utilizado na tarefa

comportamental.

Figura 14 | Exemplo de classificação autônoma utilizando o Klustakwik.

Figura 15 | Exemplo de classificação autônoma utilizando o modelo de misturas

de gaussianas desenvolvido em nosso laboratório.

Figura 16 | Posições do animal no labirinto linear em diferentes sessões.

Figura 17 | Atividade neuronal registrada por um tetrodo.

Figura 18 | Seleção de candidatos a células de lugar.

Figura 19 | Seletividade espacial de neurônio de CA1 dorsal.

Figura 20 | Células de lugar ao longo da trajetória percorrida no labirinto linear.

Figura 21 | Neurônio de CA1 dorsal seletivo e acoplado em teta.

Figura 22 | Potencial de campo local de CA1 durante uma travessia no labirinto

linear.

Figura 23 | Potenciais de campo local de CA1 em alguns estados.

9

Figura 24 | Comodulograma de estados do animal.

Figura 25 | Lesão eletrolítica e histologia.

Figura 26 | Ilustração do protocolo de velocidades e acelerações da tarefa.

Figura 27 | Ilustração da tarefa de locomoção na esteira.

Figura 28 | Exemplo de oscilações delta (1-4 Hz) durante a exploração do animal

no labirinto linear.

Figura 29 | Análise espectral durante três protocolos de velocidades constantes

(20, 30 e 40 cm/s).

Figura 30 | Análise espectral durante a aceleração (2,5 cm/s²) no protocolo da

esteira.

Figura 31 | Análise espectral do PCL hipocampal em três protocolos de

aceleração (2, 2,5 e 3 cm/s²).

Figura 32 | Pico da frequência e amplitude normalizado em delta e teta através

dos 20 segundos binados.

Figura 33 | Frequência respiratória durante a corrida de velocidade constante na

esteira.

Figura 33 | Comodulograma da fase-amplitude e a energia por fase dos três

protocolos de velocidade constante.

10

Sumário

Resumo 5

Abstract 6

Lista de abreviaturas 7

Lista de figuras 8

Apresentação 11

I - Introdução geral 12 A formação hipocampal 13 Eletrofisiologia hipocampal 16 Microdrive de tetrodos móveis 23

II - Capítulo 1: Desenvolvimento dos microdrives de tetrodos móveis 27 1. Objetivos 28 2. Métodos 28 3. Resultados 31

III - Capítulo 2: Implantação da técnica de registro de células de lugar utilizando microdrives de tetrodos móveis em ratos 35

1. Objetivos 37 2. Métodos 38 3. Resultados 45 4. Conclusão 58

IV - Capítulo 3: Velocidade de corrida modula a oscilação delta no hipocampo de ratos 60

1. Objetivos 61 2. Métodos 62 3. Resultados 64 4. Conclusão 76

V. Discussão geral 77

VI. Animais implantados 81

VII. Referências 82

VIII. Anexos 96

11

Apresentação

O presente trabalho constitui uma síntese das atividades de pesquisa

desenvolvidas durante o curso de mestrado. A dissertação tem como tema central

a atividade eletrofisiológica do hipocampo de roedores durante a realização de

comportamentos exploratórios, protocolos de exercícios físicos, e ciclos de

sono/vigília. Para integrar os assuntos, o texto foi dividido em uma introdução

geral seguida de três capítulos que abordam principalmente (1) a implementação

de técnicas de registro neurofisiológico intracerebral utilizando microdrives de

tetrodos móveis; (2) a realização de registros da atividade de disparo de células de

lugar e do potencial de campo hipocampal durante a exploração de um labirinto

linear; e (3) a realização de registros eletrofisiológicos do hipocampo de roedores

durante corridas de velocidades crescentes e constantes em uma esteira elétrica

controlada por computador. Além disso, os capítulos apresentam as respectivas

análises dos sinais neurais, comportamentais, e interpretações dos resultados

obtidos de modo a trazer contribuições originais a cada um desses campos

individualmente.

12

I - Introdução geral _________________________________________________________________________________

13

A formação hipocampal

O hipocampo é uma estrutura cerebral localizada no lobo temporal medial

que exerce papel fundamental na codificação de memórias declarativas ou

explícitas (Scoville e Milner, 1954; Buzsáki e Moser, 2013), além de codificar

representações espaciais durante a navegação juntamente com o córtex entorrinal

(CE) (Hafting et al, 2005; Buzsáki e Moser, 2013). A anatomia hipocampal começou

a ser conhecida no final do século XIX a partir dos trabalhos iniciais de Camilo

Golgi e Santiago Ramón y Cajal. Eles desenvolveram uma técnica de coloração

por nitrato de prata capaz de marcar o meio intracelular dos neurônios, sendo

assim possível visualizar as unidades neuronais através do microscópio óptico

(Bentivoglio e Swanson, 2001). A partir dessa técnica, foi possível observar que o

hipocampo possui subdivisões com diferentes características e projeções

(Bentivoglio e Swanson, 2001; Insausti, 1997; Freund e Buzsáki, 1996).

A anatomia hipocampal hoje é separada em três subáreas chamadas de

Cornu Ammonis: CA1, CA2 e CA3 (Figura 1-A). Uma das principais projeções

neuronais para o hipocampo se dá pelo CE a partir de duas vias (Insausti, 1997).

(1) A via perfurante, que tem início na camada II do CE e que cruza o subiculum

até chegar no giro denteado (GD) e em CA3. O GD se projeta para o CA3 a partir

das fibras musgosas (mossy fibers), e CA3 se conecta com CA1 pelas colaterais

de Schaffer . (2) A via temporoamônica, que se origina na camada III do CE e 1

projeta diretamente para CA1 (Figura 1-B). Tanto a via perfurante (CE II - DG)

quanto a temporoamônica (CE III - CA1) enviam projeções unidirecionais para o

hipocampo, as camadas IV e V do CE por sua vez recebem projeções

hipocampais originadas em CA1 (Insausti, 1997; van Groen, 2003). No geral, a

atividade excitatória e inibitória do CE é composta de neurônios piramidais

glutamatérgicos e interneurônios GABAérgicos, respectivamente. Nas duas vias

de projeção para o hipocampo (perfurante e temporoamônica), os neurônios de

projeção do CE são excitatórios.

1 Essa conexão que envolve o CE até CA1 a partir do GD e CA3 é conhecida como via trisináptica (Amaral e Witter, 1989; Insausti, 1993). É a maior comunicação entre o hipocampo e o córtex.

14

Figura 1: Esquema das subdivisões hipocampais e suas projeções. (A) A imagem mostra uma

visão do hipocampo a partir de um corte coronal com coloração Nissl à esquerda e à direita um

esquemático com as subdivisões de CA1, CA2, CA3 e giro denteado. Em (B) uma ilustração das

projeções hipocampais. Modificado de Andersen et al, 2007.

A citoarquitetura do hipocampo é formada por uma complexa rede de

neurônios piramidais e diferentes classes de interneurônios. Em CA1, CA2, CA3 e

GD é possível observar uma alta densidade neuronal, composta de um

agrupamento de neurônios piramidais. Modulando a atividade dos neurônios

piramidais, interneurônios GABAérgicos projetam seus axônios em diferentes

níveis do corpo celular piramidal (Freund e Buzsáki, 1996; Klausberger e Somogyi,

2008). Os interneurônios são classificados de acordo com suas características de

15

projeção sobre o neurônio piramidal, sendo eles: axo-axônicas (chandelier cells) , 2

basket cells , oriens lacunosum-moleculare (OLM) cells e bistratified cells . 3 4 5

A organização morfológica dos interneurônios e das células piramidais

separa as regiões de CA1, CA2, CA3 e GD em 5 diferentes lâminas ou estratos:

stratum oriens, stratum pyramidale (onde se localiza o corpo celular dos neurônios

piramidais), stratum lucidum, stratum radiatum e stratum lacunosum-moleculare

(Figura 2). Exclusivamente em CA3 o perfil laminar se dá pelas 5 camadas, sendo

os stratum lucidum, pyramidale e oriens alvos de projeções do DG. CA2 por sua

vez é composto de apenas 4 camadas, todas com exceção do stratum lucidum

(Amaral e Witter, 1989). Sua principal via de entrada se dá pelo stratum

lacunosum-moleculare com inputs do CE II, e oriens que recebe projeções das

colaterais associativas. Similar à CA2, CA1 apresenta as mesmas 4 camadas,

onde sua principal vía de entrada é o stratum lacunosum-moleculare que recebe

projeção do CE III. CA1 tem como principal camada de saída o stratum oriens que

tem projeções de feedback para as camadas V e VI do EC. Além disso, CA1

recebe inputs de CA3 no stratum radiatum pelas colaterais de Schaffer (Amaral et

al, 2006).

2 As chandelier cells são interneurônios que possuem seu corpo celular junto ao do neurônio piramidal no stratum pyramidale e têm conexão axo-axonal (Freund e Buzsáki, 1996). 3 Interneurônio de alta taxa de disparo que inibem a região peri-somática dos neurônios piramidais (Freund e Buzsáki, 1996). 4 As células OLM regulam a atividade dos neurônios piramidais e possuem corpo no stratum oriens com projeções axonais no stratum lacunosum-moleculare. 5 Essas células apresentam seus somas no stratum pyramidale e atividade inibitória nos dendritos das células piramidais no stratum oriens (Klausberger e Somogyi, 2008; Wheeler et al, 2015).

16

Figura 2: Esquemático das principais projeções hipocampais. Na figura pode-se ver as principais

projeções de entrada e saída do hipocampo nas diferentes camadas celulares. O CE e GD

fornecem projeções de entrada (em verde musgo e rosa). CA1 gera projeções de saída (verde).

Eletrofisiologia hipocampal

As trocas iônicas entre os meios intracelular e extracelular para que ocorra

o potencial de ação neuronal desencadeiam uma diferença de potencial capaz de

ser identificada por meio de eletrodos, como foi descrito por Luigi Galvani no

século XVIII (Verkhratsky et al, 2006). O conjunto dessas ativações neuronais gera

um sinal elétrico extracelular chamado de potencial de campo local (PCL) (da

Silva, 2009). O PCL representa uma propagação espacial em torno do eletrodo de

aproximadamente 400 µm na horizontal e 1 mm na vertical . Quando medido no 6

hipocampo, o PCL apresenta diferentes bandas de frequências que se relacionam

6 Essa dispersão é discutida atualmente por influência da condição de volume local x global. Trabalhos atualmente descrevem sua influência como sendo de uma área entorno de 6 mm (Kajikawa e Schroeder, 2011).

17

com diferentes estados comportamentais (Buzsaki, 2006; O'Keefe e Reece, 1993;

Csicsvari et al, 2003; Senior et al, 2008; Sirota e Buzsaki, 2008). As principais

bandas podem ser resumidamente separadas em: delta (1-4 Hz), teta (5-10 Hz),

beta (10-30 Hz ), low gamma (LG) (30-50 Hz) e high gamma (HG) (50-80 Hz) (Figura

3). Em estudos mais recentes, foi possível observar que esses ritmos oscilatórios

podem coexistir e estar acoplados. É possível encontrar uma relação de

fase-amplitude-frequência entre dois diferentes ritmos, em geral esse

acoplamento se dá entre uma oscilação de alta frequência e uma de baixa

frequência (Scheffer-Teixeira e Tort, 2016; Scheffer-Teixeira e Tort, 2017; Colgin et

al, 2009).

Figura 3: Ritmos oscilatórios do cérebro de roedores. (A) Espectro de potência de diferentes

ritmos hipocampais durante o sono. (B) Diferentes classes de ritmos oscilatórios do cérebro por

bandas de frequências. Modificado de Buzsáki e Draguhn, 2004.

18

No geral, o estado global do cérebro é definido como “alerta” e “quieto” a

partir das oscilações predominantes no hipocampo (Battaglia et al, 2011; Kirov et

al, 2009): oscilações delta (1-4 Hz) caracterizam o estado quieto, e as oscilações

teta (5-10 Hz) o estado alerta. Teta ocorre fortemente associado a oscilações

gama (30-80 Hz), que estão relacionadas a processos cognitivos (Sheffzuk et al,

2011; Tort et al , 2009; Kirov et al, 2009). Delta, teta e gama são atualmente os

ritmos hipocampais mais estudados, e podem estar envolvidos no processo de

transmissão de informações entre as áreas cerebrais. Por isso, introduziremos

abaixo seus principais aspectos individuais:

Delta. A oscilação delta é descrita como uma oscilação lenta entre 1 e 4

Hz, predominante no hipocampo de roedores durante estados de anestesia geral,

imobilidade na vigília e em períodos de sono descrito como sono de ondas lentas

(do inglês, slow wave sleep ou “SOL”). O ritmo delta reflete períodos tônicos de

despolarização e hiperpolarização cortical referidos como estados “up” e “down”

(Steriade et al, 1993). O estado up é descrito como o aumento do balanço entre a

atividade excitatória e a inibitória dos potenciais pós-sinápticos na comunicação

do hipocampo com o córtex, que gera um aumento do potencial de membrana

nessas áreas (Haider et al, 2006; Headley e Paré, 2017). Além disso, durante as

oscilações delta, um evento de alta frequência chamado de complexo sharp wave

ripple (SWR) (150-250 Hz) ocorre periodicamente durante o início do estado up

(Isomura et al, 2006; Battaglia et al, 2004). O SWR é caracterizado pela

sincronização de neurônios piramidais de CA1 com interneurônios de CA3, e

exerce um papel fundamental no processo de consolidação de memória (Ylinen et

al, 1995; Girardeau e Zugaro, 2011).

Teta. A oscilação teta no hipocampo dorsal de roedores pode variar entre 5

e 10 hz, e é presente tanto em atividades voluntárias, como andar, correr, pular, e

nadar dentre outras, quanto atividades involuntárias como durante o alerta e o

sono de movimento rápido dos olhos (MRO) (Vanderwolf, 1969; Buzsáki, 2002).

Além disso, foi mostrado que a oscilação teta apresenta funções cognitivas,

como tomada de decisão, aprendizagem, memória espacial e associação

contextual (Belchior et al, 2014; O’Keefe e Recce, 1993; Tort et al, 2009;

Benchenane et al, 2010). Sua atividade é dependente da banda medial/diagonal

19

do septo, que possui projeções GABAérgicas, colinérgicas e glutamatérgicas para

o hipocampo (Buzsáki, 2002; Lee et al, 1994). Trabalhos anteriores mostraram que

lesões no septo e via septohipocampal abolem a atividade do ritmo teta tanto em

GD quanto em CA1 (Sainbury e Bland, 1981; Andersen et al, 1979). Além disso,

Quilichini et al, 2010 mostraram que lesões no CE também influenciam a atividade

do ritmo teta em todo o hipocampo, o que indica uma função do CE como um

modulador externo do teta hipocampal.

A atividade de teta ao longo do tempo foi extremamente explorada por ser

o principal ritmo durante o estado alerta do cérebro de roedores. Dentre esses

estudos, McFarland et al em 1975 observaram a correlação desse ritmo com a

atividade locomotora de roedores. Ao mostrar que há um aumento da amplitude e

da frequência de teta durante a locomoção, seu trabalho se tornou precursor de

uma série de estudos seguintes que relaciona esse ritmo à dedicação física do

indivíduo. Em 1998, Slawińska e Kasicki mostraram que o aumento da frequência

teta durante a locomoção tem um fator motivacional inserido que modifica sua

dinâmica a partir de influências emocionais. Mais recentemente, Kuo e

colaboradores (2011) descobriram que essa dinâmica de atividade de teta é

variável com o tempo. Eles mostraram que no início da corrida há um aumento de

amplitude e de frequência dessa banda, mas que com o passar do tempo a

frequência retorna a um nível basal. Em outro trabalho publicado em 2014, Kuo e

Li também mostraram que há diferença na ritmicidade de teta entre corridas

voluntárias e involuntárias (Li et al, 2014). Os resultados mostram que nas 7

corridas involuntárias os animais apresentaram uma maior potência na frequência

de teta quando comparado com as corridas voluntárias. Nas corridas involuntárias

também foram encontrados aumentos nos batimentos cardíacos. Os autores

sugerem que interações emocionais e sensoriais durante a corrida podem estar

relacionadas com essas diferenças de atividade cerebral e cardíaca.

Em suma, a oscilação teta é fundamental para a aprendizagem e

consolidação de memória, além de estar envolvida nas principais ações do

indivíduo durante seu estado de vigília. Sua atividade modula diversos processos

7 Experimentos executados em uma roda de correr e em uma esteira controlada por computador.

20

cognitivos, dentre eles a formação de mapas espaciais (Buzsáki e Moser, 2013),

que será discutido mais à frente.

Gama. As oscilações gama possuem frequência entre 30 e 80 Hz. Sua

atividade ocorre ao longo do córtex, hipocampo e estriado tanto durante o sono

MRO quanto na vigília. A geração do ritmo gama é bastante estudada, sendo

atualmente dividida em dois modelos: (1) Modelo baseado na comunicação

inibitória de interneurônios, que se dá através de drives excitatórios que agem em

uma rede de interneurônios inibitórios. Quando esses drives atingem um

determinado nível de atividade, os interneurônios acabam silenciando

temporariamente sua própria rede, causando uma sincronia de disparos quando

saem da inibição. Essa atividade se torna cíclica e contínua (Wang e Buzsáki,

1996). (2) Em outro modelo, os neurônios piramidais ativam os interneurônios que

causam um feedback de inibição. Com o diminuir dessa inibição, as células

piramidais voltam a disparar, excitando novamente as pequenas redes de

interneurônios, que por sua vez voltam a prover feedback de inibição (Borges e

Kopell, 2003). Essa atividade também se torna cíclica e gera uma oscilação na

banda gama.

Atualmente, o ritmo gama observado em CA1 é dividido em dois

componentes que apresentam frequência, origem e funções diferentes. O low

gamma (LG) (30-50 Hz) é oriundo de CA3 e apresenta relação com a codificação

de memórias hipocampo-dependentes (Colgin e Moser, 2010). Enquanto o high

gamma (HG) (50-80 Hz) possui origem no CE e participa de processos de

associações espaciais (Colgin e Moser, 2010; Quilichini et al, 2010). Trabalhos

mostram que há um maior acoplamento entre teta e gama em tarefas que exigem

demandas associativa e cognitiva (Igarashi et al, 2014; Tort et al, 2009; Bott et al,

2016).

Dessa forma, durante a navegação espacial no ambiente, o hipocampo

possui atividade oscilatória de teta (5-10 Hz) e gama (30-80 Hz). Essas oscilações

modulam a atividade de disparos de potenciais de ação de diversas classes de

neurônios, dentre elas os neurônios piramidais (células principais). Foi descoberto

que alguns desses neurônios piramidais modulados por teta e gama apresentam

21

preferência de disparo em um lugar específico no ambiente (O’Keefe e Dostrovsky,

1971) e participam portanto da codificação espacial, tópico da próxima seção.

Células de Lugar

Em 1971, O’Keefe e Dostrovsky observaram que neurônios piramidais no

hipocampo de ratos disparam potenciais de ação em locais específicos do

ambiente (O’Keefe e Dostrovsky, 1971); estes neurônios são hoje em dia

chamados de “células de lugar” (do inglês, place cells). Essa descoberta deu

suporte à teoria do Mapas Cognitivos, a qual postula que no hipocampo são

integradas informações sensoriais recebidas de áreas corticais primárias, criando

assim uma representação espacial do ambiente (O’Keefe e Nadel, 1978). Por outro

lado, desde a descrição do caso do paciente H.M., já havia sido proposto que o

hipocampo e estruturas parahipocampais desempenham uma função primordial

na formação de novas memórias declarativas (Scoville e Milner, 1954). Atualmente,

de acordo com essa teoria, as células de lugar forneceriam o substrato neural

fundamental para a construção de representações dos contextos envolvidos na

memória episódica (Eichenbaum, 2000b; Wood et al., 2000). Contudo, a

interligação entre essas duas teorias ainda permanece por ser esclarecida.

Mais recentemente, em um labirinto linear com recompensas de água nas

extremidades, foi possível observar o disparo sequencial de populações de células

de lugar em função da posição e da direção do animal no espaço (Figura 4)

(Wilson e McNaughton, 1994; Jensen e Lisman, 2005; Dragoi e Buzsaki, 2006;

Foster and Wilson, 2006). Foi visto também que a sequência de células de lugar

ativas ao longo do percurso era frequentemente reativada durante os momentos

de vigília quieta e durante os episódios de sono pós-experimento (Louie e Wilson,

2001; Foster e Wilson, 2006). Essas reativações acontecem acompanhadas de

sharp-wave/ripples (150-250 Hz) (Buzsáki, 1998; Battaglia et al., 2011; Carr et al.,

2011). Uma série de estudos demonstrou que a interrupção das sharp-wave ripple

afeta o processo de aprendizagem e a consolidação de novas memórias

(Girardeau et al., 2009; Ego-Stengel e Wilson, 2010; Girardeau e Zugaro, 2011).

22

Figura 4: Ilustração de 4 células de lugar que apresentam potenciais de ação associados às

posições em que o rato se encontra no espaço (o exemplo mostra a plataforma de um labirinto

linear). À direita tem-se a representação espacial do campo de lugar em escala de cor. Retirado de

Nakazawa e colaboradores (2004).

Os desenvolvimentos técnicos e a evolução das ferramentas

computacionais para análise de dados permitiram avanços na compreensão da

atividade eletrofisiológica do hipocampo. Por exemplo, (1) foi observado que a

ativação das células de lugar está acoplada a determinadas frequências do

potencial de campo local (PCL), como as oscilações teta (5-10 Hz) e gama (30-80

Hz) (O'Keefe e Reece, 1993; Csicsvari et al., 2003; Senior et al., 2008).

Observou-se ainda que (2) as oscilações teta e gama acontecem no hipocampo de

roedores não somente durante os estados de alerta e de exploração ativa da

vigília, mas também surgem durante o sono MRO (Buzsaki, 2002;

Scheffer-Teixeira et al., 2012). Além disso, as análises da relação entre a fase das

oscilações e os disparos de potenciais de ação mostraram que (3) os disparos das

células de lugar ao longo do seu campo receptivo espacial variam em função da

fase do ciclo da oscilação teta subjacente (O'Keefe e Reece, 1993). Essa variação

de fases acontece de maneira ordenada, dando origem a uma precessão das

fases da onda onde os disparos acontecem à medida que o animal atravessa o

campo espacial dessa célula (Jensen e Lisman, 2000; O'Keefe e Reece, 1993).

Além da relação com as oscilações teta, acredita-se que (4) a coordenação

23

temporal exercida pelo PCL sobre os disparos de grandes populações de

neurônios permita a formação de assembleias neuronais (Harris et al., 2003),

descrita por Donald Hebb em 1949 como agrupamentos de neurônios que se

ativariam juntos para codificar uma representação mental (Hebb, 1949).

Mais recentemente, Hafting e colaboradores (2005) registraram no córtex

entorrinal medial, uma região que envia projeções ao hipocampo, e descobriram

neurônios que disparam potenciais de ação periodicamente no espaço, com

campos espaciais em formato de grades, chamando-lhes assim de células de

grade (do inglês, grid cells). Esse achado, acompanhado da descoberta das

células de lugar ocorrida no anos 70, fez com que John O’Keefe, Edvard Moser e

May-Brit Moser fossem agraciados com o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia

em 2014 (Moser, Moser e O’Keefe, 2014).

Microdrive de tetrodos móveis

Uma dificuldade técnica para a obtenção de registros extracelulares da

atividade de disparos de unidades neuronais individuais no hipocampo de

roedores decorre do fato de as camadas celulares CA1, CA2 e CA3 apresentarem

os corpos celulares altamente compactadas em densas camadas. Para sobrepor

essa dificuldade, foram desenvolvidas duas técnicas para discriminar potenciais

de ação provenientes de diferentes neurônios a partir de registros extracelulares.

Inicialmente, foram usados estereotrodos (McNaughton et al., 1983), que se

caracterizam por dois eletrodos de mesmo material e espessura, agrupados

paralelamente e girados sobre o próprio eixo (O'Keefe e Reece, 1993; Wilson e

McNaughton, 1993). Posteriormente, foram usados tetrodos, caracterizados como

quatro eletrodos agrupados da mesma forma (Figura 5-A). Esses eletrodos

registram os mesmos disparos provenientes de uma pequena população neuronal,

e análises computacionais posteriores permitem então a caracterização de

unidades neurais individuais de acordo com os parâmetros do formato de onda

dos potenciais de ação registrados simultaneamente nos diferentes canais do

tetrodo (Figura 5-B). Esses desenvolvimentos metodológicos tornaram o registro

24

utilizando tetrodos a principal técnica eletrofisiológica para o estudo de

populações de neurônios individuais no hipocampo de roedores, e assim

permitiram a caracterização detalhada da atividade de disparos das células de

lugar.

Figura 5: Esquema ilustrativo da classificação de unidades neuronais a partir do registro

eletrofisiológico feito com tetrodo. A figura à esquerda (A) representa um esquemático de um

tetrodo localizado nas proximidades de 3 neurônios representados pelas cores vermelho, verde e

azul. A figura à direita (B) mostra um exemplo do processo de registro e classificação neuronal. O

sinal eletrofisiológico bruto é filtrado em baixas (1-1000 Hz) e altas (500-6000 Hz) frequências para

se obter o potencial de campo local e os disparos neuronais, respectivamente. A classificação dos

disparos é feita a partir da discrepância do formato de onda do disparo de cada neurônio,

mostrado na figura pelas cores seguindo os neurônios da figura (A). Figura ilustrada por Rodrigo

Pavão e modificada por Rafael Pedrosa.

Junto das técnicas de estereotrodo e tetrodo, foi desenvolvido também um

sistema para a movimentação progressiva dos eletrodos após a cirurgia de

implante, o microdrive. Esse aparelho permite a execução de ajustes finos no

posicionamento de modo que a ponta dos eletrodos esteja o mais próximo

possível dos neurônios registrados. Dependendo da necessidade, os eletrodos

podem se mover juntos ou individualmente, múltiplas vezes, e até mesmo com os

animais acordados. O uso dos microdrives também permite que o

experimentalista atinja o alvo no cérebro em diferentes camadas a partir de um

sistema móvel de parafuso que controla a altura do eletrodo no cérebro após a

cirurgia. Um exemplo de microdrive é mostrado na Figura 6.

25

Figura 6: Ilustração de um microdrive implantado em um rato. Em (A) e (B) temos um exemplo de

um animal implantado com um microdrive revestido de um papel laminado. (C) mostra o microdrive

pós implantado. Figura retirada de J. Yamamoto e Matthew Wilson (2008).

Os primeiros microdrives eram construídos usando componentes de metal

e plástico líquido, mas hoje em dia sua principal base é feita de componentes

plásticos produzidos por impressoras 3D. A principal vantagem desses

componentes plásticos é o baixo peso, alta precisão, baixo custo e a velocidade

da produção, consumindo muito menos tempo que o modelo anterior. Além disso,

as versões mais recentes se aprimoraram também em utilizar um maior número de

canais para registro, juntamente com técnicas de manufatura mais rápida.

Atualmente, o foco de melhorias nessa técnica ainda está voltado para o

aumento de número de tetrodos para controle individual juntamente com redução

do peso. Dos microdrives disponíveis no mercado atualmente, o flexDrive® é o

que apresenta uma melhor versão da relação peso/tetrodos, sendo o mais

26

utilizado nos laboratórios que trabalham com registro de unidades neuronais em

larga escala (Figura 7).

Figura 7: Comparação entre os diferentes tipos de microdrives que existem atualmente. O eixo X é

o número individual de agrupamento de eletrodos que se podem mover individualmente. Em Y o

peso de cada microdrive. A linha cinza é o peso limite que um camundongo pode sustentar.

Retirado de Voigts et al (2013).

O assunto abordado nesse tópico da introdução será necessário para o

entendimento do capítulo 1 desta dissertação. A saber, o trabalho desenvolvido

visou a implementação da técnica de registro eletrofisiológico através da utilização

de microdrives de múltiplos tetrodos móveis, uma tecnologia ainda incipiente no

Instituto do Cérebro da UFRN e no Brasil. Conforme visto nos outros tópicos

abordados nesta introdução, o desenvolvimento de tal tecnologia permitirá a

realização de pesquisas sobre importantes temas atuais da eletrofisiologia

hipocampal, como o estudo da atividade das células de lugar e de suas relações

com as oscilações neuronais.

27

II - Capítulo 1: Desenvolvimento de microdrives de

tetrodos móveis

_________________________________________________________________________________

28

A técnica de microdrive de tetrodos móveis, além de ser a mais eficaz

quanto ao quesito de número de neurônios registrados, vem sendo extremamente

utilizada em diversos laboratórios ao redor do mundo. Apesar de haver avanços

em sua eficiência, esse sistema ainda é dependente de peças e ferramentas

específicas produzidas por empresas ou grupos que monopolizam o mercado, e,

com isso, o valor individual de compra de cada microdrive ainda é inviável para

muitos laboratórios de países em desenvolvimento. Pensando nisso, e com

interesse em implementar a técnica no Brasil, desenvolvemos dois diferentes

protótipos de microdrives utilizando uma impressora 3D e uma máquina de

comando numérico computadorizado (CNC).

1. Objetivos

1.1 Objetivo geral

Desenvolver um novo protótipo de microdrives de tetrodos móveis e

implantar sua técnica no Laboratório de Neurofisiologia Computacional do

Instituto do Cérebro da UFRN.

1.2 Objetivos Específicos

1 – Desenvolver um protótipo de microdrive móvel para implantes em ratos.

2 – Utilizar o método de montagem em blocos para facilitar sua manufatura.

2. Métodos

2.1 Microdrive de tetrodos móveis

Desenvolvemos um protótipo próprio de microdrive inspirado em modelos

já existentes na literatura. Foram testadas tanto estratégias de confecção dos

protótipos via CNC quanto através de impressão 3D, e utilizados polylactic acid

(PLA) e acrylonitrile butadiene styrene (ABS). Foram empregados conectores

29

Omnetics® para a conexão do microdrive ao sistema de registro. Além disso,

parafusos e cânulas mais baratos foram adaptados aos microdrives

desenvolvidos.

2.2 Tetrodos

Os tetrodos foram formados por quatro microeletrodos de nicromo ou

tungstênio de 12,5 µm de diâmetro, revestidos de Teflón® (Politetrafluoretileno), e

emaranhados a partir de giros em relação ao seu eixo principal. Antes da cirurgia

de implante, os microeletrodos tiveram sua impedância corrigida para

aproximadamente 70 KΩ a 100 KΩ a partir da eletrólise em solução de ouro

contendo nano tubos de carbono, e de acordo com Redish e colaboradores

(2009).

2.3 Manufatura do microdrive de tetrodos móveis

Para a manufatura do microdrive é necessário imprimir e construir as partes

(usando a impressora 3D): 1) Support board - placa central em que o microdrive

será montado; 2) Protection base – estrutura tipo um cone que prevê sua

proteção; 3) Guide platforms – componentes para guiar o tetrodo, controlados por

parafusos; 4) Guiding base – peça encaixada embaixo da protection base e usada

para a distribuição espacial dos tetrodos no eixo XY; 5) Microdrive cover - tampa

para a proteção do microdrive quando não estiver em uso. A Figura 11 mostra um

passo a passo do processo de manufatura. As peças podem ser encontradas para

impressão no link: https://github.com/tortlab/Open-Source-Microdrive.

30

31

Figura 8: Processo de manufatura do tetrodo e microdrive. (A) Para a manufatura do tetrodo, cortamos dois pedaços de fio revestido de 20 cm de comprimento (níquel-cromo ou tungstênio, 12,5 µm diâmetro), dobramo-os juntos em forma de U e prendemos o laço na presilha pelas 4 pontas. B) & C) Abaixamos o suporte para suavemente prender a presilha no imã magnético para começar o protocolo de giro. D) depois do giro, usamos a heatgun para grudar os fios. Em seguida, cortamos o tetrodo perto da presilha e removemos cuidadosamente. E) Materiais usado para a confecção dos tetrodos/microdrive com o sistema de aquisição. Soldamos o conector Omnetics na printed circuit board (PCB) usando solda em pasta. Parafusos e porcas foram usados para prender a PCB na Support board. O terra (fio de prata ou aço inoxidável) também foi soldado na PCB e preso aos parafusos na ponta. F) Partes 3D do Microdrive: Microdrive cover, Support board, Guide platforms, Protection base e Guiding base. Cada uma das 16 guiding units é composta de barras de 19Ga, parafuso, porcas e uma cânula de 22Ga. Para cada guiding unit, tem-se 3 furos radialmente alinhados com a Support board para a barra, parafuso e cânula de 22Ga. Um pequeno tubo de sílica (que vai carregar o tetrodo) foi inserido dentro da cânula de 22Ga, e colado nele junto da Guide platform. A Guide platform desce pelo apoio da barra de 19Ga a partir do giro do parafuso, onde carrega a cânula de 22Ga e o pequeno tubo de sílica para a Support board. Dentro da Support board, o pequeno tubo de sílica desliza dentro de um tubo de sílica maior de 27G. A Support board encaixa na Protection base e essa por sua vez na Guiding base. G) Um passo adicional no conjunto do microdrive é o ancoramento das guiding units e das sílicas maiores de 27Ga (azul) dentro da Support board. Note que o pequeno tubo de sílica (verde) vai dentro do tubo da sílica de 27Ga (azul). Em outra etapa, as guiding units são baixadas a partir do giro dos parafusos, sendo ambas as sílicas cortadas na parte superior da Guiding base. Depois, eles são movidos de volta para cima e os tetrodos são carregados e colados nos pequenos tubos de sílica. H) Vista superior do microdrive sem as guiding units. A Support board possui 3 filas circulares de furos, através das quais são inseridas a cânula de 22Ga (fileira interna), o parafuso (fileira do meio, porca marcando em verde) e a barra de 19Ga (fileira externa). I) Vista frontal/lateral da Protection base, Guiding base (fixada dentro por resina acrílica) e o tubo de sílica de 27Ga ainda não cortada. Figura retirada de capítulo submetido.

3. Resultados

3.1 Microdrives

3.1.1 Microdrive de 8 tetrodos móveis

O primeiro protótipo de microdrive desenvolvido promove o movimento

simultâneo de 8 tetrodos que convergem na mesma região. O microdrive (5,0 cm

de altura; 1,4 cm de raio) apresenta uma parte móvel associada a 8 tetrodos

guiados por um parafuso de bronze com um passo de 0,28 mm a cada volta

(Figura 9). Uma placa de circuito impresso de fenolite foi desenvolvida para

conexão dos tetrodos e fio terra com o conector Omnetics®. As placas base

foram feitas com cortes precisos em uma CNC de modelo 3020. Os tetrodos se

encontram presos à sílica guia que se movimenta proporcionalmente ao passo

dado pelo parafuso guia. Em paralelo, as sílicas base estão fixadas à cânula presa

à placa base para estabilizar e direcionar a sílica guia com os tetrodos.

32

Figura 9: Microdrive de 8 tetrodos móveis. Na figura vemos o esquemático do microdrive, sendo a

primeira figura à esquerda, a representação de perspectiva do protótipo, seguido da vista lateral e

por último da vista superior. São indicadas por letras as peças: a - tetrodos; b - parafuso guia; c -

Base de proteção; d - Conector Omnetics®; e - Sílica guia; f - Sílica base; g - Placas base.

Ao todo 5 ratos foram implantados com esse modelo de microdrive, dos

quais foram obtidos registros de apenas 3. Os tetrodos foram progressivamente

aprofundados até a região do hipocampo. Os registros foram iniciados um dia

após observadas características eletrofisiológicas típicas do hipocampo, como a

ocorrência de SWR, oscilações teta de alta amplitude, rajadas (“bursts”) de

disparos de neurônios (típicos de neurônios piramidais). Ao fim de cada sessão de

registro, os tetrodos foram levemente aprofundados para o registro de novos

neurônios na sessão seguinte com intervalo mínimo de 20 horas entre sessões.

3.1.2 Microdrive de 16 tetrodos móveis

Com o objetivo de ampliar o número de tetrodos por implante, de se obter

movimentação individualizada, posicionamento preciso dos tetrodos de registro, e

de aumentar a quantidade de neurônios registrados, um segundo protótipo de

microdrive foi desenvolvido para o implante e registro bilateral da atividade

eletrofisiológica dos hipocampi de ratos. O microdrive (3,6 cm de altura; 2,3 cm de

raio e 14 gramas de peso) possui um sistema móvel de 16 tetrodos guiados

individualmente por 16 parafusos de bronze com um passo de 0,32 mm a cada

volta (Figura 10). Uma placa de circuito impresso de fenolite (modelo disponível

online pelo projeto Open ephys) foi utilizada para conexão dos 64 canais trilhados

33

com conectores Omnetics® (2 conectores com 32 canais cada). As peças

plásticas para a montagem do corpo do microdrive foram impressas em PLA por

uma impressora 3D com bico extrusor de 0,4 mm de precisão aquecido a 220 °C,

a partir de um modelo desenvolvido 3D por nós.

No total, 5 ratos foram implantados com o microdrive de 16 tetrodos

móveis, dos quais foram obtidos registros de apenas 3 animais. Por enquanto,

nem todos os registros colhidos foram analisados (ver na seção “VI - Animais

implantados”).

Figura 10: Microdrive de 16 tetrodos móveis. Na figura vemos um protótipo 3D do microdrive,

sendo apresentado na sequência as vistas de perspectiva, frontal e superior. As peças são

indicadas por letras: a - Tetrodos; b - Base de proteção; c - Plataforma guia; d - Conector

Omnetics®; e - Base guia.

3.1.2.1 Testes de resistência da Base de proteção

Testes de deslocamento e tensão (von Mises Stress) foram feitos para o

desenvolvimento de uma melhor estrutura de proteção do Microdrive (Figura 11).

Em simulação, foram definidos parâmetros como: material Abs, base fixada na

região inferior da Base de proteção e uma força de 2 N na região superior/lateral

para uma simulação de uma eventual batida forte do animal após implantado.

A simulação mostra que a peça apresenta maior deslocamento na região

superior, onde não há contato direto com nenhuma outra parte do microdrive

(Figura 11-A), podendo assim se movimentar sem que haja qualquer dano na

34

estrutura. A parte inferior, que é fixada na cabeça do animal com acrílico, não

apresentou qualquer movimentação no teste, proporcionando assim uma baixa

força de cisalhamento entre o implante e o acrílico.

Figura 11: Testes de deslocamento e tensão na base de proteção. Em (A) vemos um mapa de

calor do deslocamento da estrutura quando aplicada uma força de 2 N (representada pela seta

branca). Note que a região inferior da Base de proteção, a qual será fixada no animal, segue intacta

a qualquer movimento. (B) mostra o von Mises Stress, um tipo de medida de tensão da peça.

Perceba que existe pouco estresse no geral e que o vazamento ajuda na dissipação da tensão.

O von Mises Stress é uma medida de tensão baseada na relação da energia

de cisalhamento com o limite máximo de tensão do objeto. Foi observado que

houve pouco estresse na estrutura no geral (Figura 11-B). Os vazamentos da peça

ajudam na dissipação da tensão sofrida na base e na diminuição do peso,

influenciando assim na durabilidade do implante.

3.2 Posicionamento dos tetrodos

Como já dito anteriormente, uma das principais vantagens do uso de

microdrives é o reposicionamento dos tetrodos para registro de diferentes

neurônios ao longo do tempo. Como forma de validar o funcionamento do passo

dos parafusos, fizemos implantes crônicos dos microdrives em ratos com alvo em

CA1 e registramos sua atividade ao longo de diferentes camadas do tecido

cerebral (mais informações no capítulo 2). Sabendo que cada volta completa no

parafuso representa 0,32 mm, descemos os tetrodos progressivamente no

decorrer dos dias. Inicialmente o dado de cada tetrodo colhido foi filtrado entre

35

500-6000 Hz para detecção dos disparos e seus formatos de onda foram

armazenados. Em seguida analisamos a diferença de pico/pico de dois canais em

diferentes tetrodos ao longo de seu deslocamento no tecido cerebral (Figura 12).

Com propósito de registrar a camada piramidal de CA1 dorsal (2,3 mm de

profundidade a partir do início do córtex), espera-se que aproximadamente 7,2

voltas no parafuso seja suficiente para atingir o alvo. Nos registros da figura 12, a

camada piramidal foi atingida com 7,5 e 7,2 voltas no parafuso.

Nossos resultados mostram também que no decorrer da descida dos

tetrodos, particularidades da camada piramidal puderam ser observadas, como

maiores agrupamentos de disparos (Figura 12- A e B). Vimos também que, quando

no alvo, um leve torque no parafuso é suficiente para avistar novos agrupamentos

de disparos (Figura 12-C). Esse resultado se assemelha com o do Flexdrive® já

mostrado por Voigts e colaboradores, 2013.

Figura 12: Reposicionamento do tetrodo ao longo dos dias. Em (A) e (B) vemos dois tetrodos em

diferentes alturas no tecido cerebral, onde comparamos o pico/pico de 2 canais. Em cinza temos

36

um provável alvo da camada piramidal. (C) Representa um tetrodo possivelmente na camada

piramidal que apresenta diferença de agrupamentos no decorrer de pequenas descidas.

III - Capítulo 2: Implantação da técnica de registro de células

de lugar utilizando microdrives de tetrodos móveis em ratos

________________________________________________________________________

37

Embora o estudo dos correlatos neurais da codificação espacial constitua

uma área extremamente ativa de pesquisa atual, até o presente momento nenhum

laboratório no Brasil publicou estudos envolvendo registro de células de lugar, o

que portanto caracteriza um atraso científico de mais de 40 anos em relação aos

laboratórios de países desenvolvidos. O Laboratório de Neurofisiologia

Computacional do Instituto do Cérebro da UFRN, coordenado pelo orientador do

aluno de mestrado da presente dissertação, possui grande interesse nesta área de

pesquisa, e, de fato, já vem contribuindo para tal através da análise computacional

de registros de células de lugar colhidos por terceiros e que estão disponíveis na

internet em sites de compartilhamento de dados científicos (por exemplo, ver

www.crcns.org). Contudo, por já estarem colhidos, as perguntas que podem ser

respondidas por estes dados são restritas. Neste sentido, a fim de ganhar mais

autonomia científica, torna-se necessário que o laboratório, além de sua expertise

na análise computacional dos registros, também desenvolva expertise

experimental na coleta de seus próprios dados de atividade de células de lugar.

Para tanto, uma primeira etapa crucial é a implementação da tecnologia de

registros eletrofisiológicos do hipocampo através do uso de microdrives de

tetrodos móveis. Portanto, almejamos aqui uma validação da técnica, que servirá

de importante base para estudos futuros visando compreender a formação de

novas memórias espaciais dependentes do hipocampo.

38

Assim, o presente estudo visou implementar um sistema de registro

eletrofisiológico utilizando o novo protótipo de microdrive contendo 16 tetrodos

móveis desenvolvido no presente projeto (ver capítulo 1). Para validar este

protótipo, registramos a atividade de populações de células de lugar na região

CA1 do hipocampo dorsal de ratos durante uma tarefa de exploração de um

labirinto linear associado a recompensas de água nas extremidades.

1. Objetivos

1.1 Objetivo geral

Implementar no Laboratório de Neurofisiologia Computacional do Instituto

do Cérebro da UFRN a técnica de registro de potenciais de ação de células de

lugar no hipocampo de ratos utilizando um novo protótipo de um microdrive de

tetrodos móveis.

1.2 Objetivos Específicos

1 – Utilizar o novo protótipo de microdrive para o implante crônico de 16 tetrodos

móveis que possam ser precisamente posicionados após a cirurgia de implante.

2 – Utilizar tetrodos para registro eletrofisiológico do potencial de campo local e

da atividade de neurônios hipocampais individuais.

3 – Realizar o registro eletrofisiológico de potenciais de ação e de potenciais de

campo local na subárea CA1 do hipocampo dorsal de ratos enquanto os animais

39

buscam recompensa de água nas extremidades de um labirinto linear e durante o

sono pré e pós tarefa para futuras análises.

4 – Aplicar ferramentas de classificação de disparos (“spike sorting”) para

identificação de unidades neuronais individuais a partir das propriedades das

formas de onda do potencial de ação.

5– Fazer a análise do registro eletrofisiológico para quantificação da taxa de

disparos neuronal em relação à posição do animal ao longo do labirinto linear, a

fim de detectar células de lugar.

Métodos

2.1 Sujeitos experimentais

Utilizamos 10 ratos wistar machos adultos (Rattus Norvegicus) entre 2 e 4

meses de vida. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas sob ciclo

claro-escuro de 12 horas com água e ração ad libitum. Os experimentos foram

realizados em sua maioria na fase clara do ciclo. Todos os experimentos seguiram

as normas éticas estabelecidas pelo comitê de ética animal (CEUA 058/2016).

2.2 Protocolo de aprendizado espacial

Os animais foram submetidos a uma tarefa de aprendizado espacial para

obtenção de recompensa de água em labirinto linear. Alguns animais também

foram submetidos a sessões de sono de uma hora de duração antes e após a

execução da tarefa (Figura 13). Os animais foram privados de água durante as 18

horas que antecederam os experimentos. Ao final das sessões diárias de

experimento, os animais receberam água ad libitum durante 6 horas. A cada dia

40

do protocolo da tarefa, o animal foi submetido a uma sessão de exploração do

labirinto linear (180 cm de comprimento por 21 cm de largura) com duração de 30

minutos. A tarefa consistiu do deslocamento espacial do animal a partir de uma

extremidade do labirinto até a outra para a obtenção de uma recompensa de

água. A presença dos animais foi detectada por sensores de infravermelho

instalados nas paredes do labirinto e localizados a 25 cm do local de recompensa.

Ao passar pelos sensores, a presença do animal ativa um sistema automatizado

que aciona a liberação de 60 µL de água. A próxima recompensa liberada por esse

sensor só pode ser acionada após o animal visitar a outra extremidade do

labirinto. Foram registrados automaticamente os instantes de tempo em que o

animal atravessa os sensores. O comportamento dos animais foi registrado por

meio de uma câmera de vídeo digital (Logitech® c920) localizada

aproximadamente 200 cm acima do labirinto linear. Os arquivos foram adquiridos

à taxa de 30 imagens por segundo e armazenados em disco rígido para análise

posterior.

Figura 13: Ilustração do protocolo de labirinto linear utilizado na tarefa comportamental. O labirinto

é feito de madeira em suas extremidades e revestido de acrílico em suas paredes, sendo ele

conectado a sensores de infravermelho próximos à extremidade para detectar a presença do

animal e liberar a recompensa de água. Um LED vermelho é acoplado com o sensor infravermelho

para a sincronização do registro eletrofisiológico por vídeo.

2.3 Neurocirurgia para implante de microdrive

Cada animal foi submetido a uma cirurgia estereotáxica para o implante

permanente de um microdrive contendo oito ou dezesseis tetrodos móveis. Os

animais foram anestesiados através da administração intramuscular de sulfato de

41

atropina (0,04 mg/kg), seguido de cloridrato de cetamina (100 mg/kg) e cloridrato

de xilazina (8 mg/kg). Durante a cirurgia, o nível da anestesia era periodicamente

verificado através de alterações das frequências cardíaca e respiratória, e de

outros sinais fisiológicos como o reflexo da cauda. Doses suplementares de

cetamina (metade da dose inicial) eram administradas quando necessário. Todos

os esforços foram empregados para minimizar o sofrimento animal durante os

procedimentos experimentais. Após tricotomia, o animal foi posicionado em um

aparelho estereotáxico (Kopf). Lidocaína foi injetada no tecido subcutâneo

craniano onde foi realizada uma incisão longitudinal, expondo o crânio. O centro e

os quatro pontos marginais da craniotomia foram marcados segundo as

dimensões do microdrive de tetrodos e segundo as coordenadas estereotáxicas

da subárea CA1 do hipocampo dorsal (AP: -4,16 mm; ML: +2,4 mm; DV: 2,40 mm).

Brocas dentais de diâmetro apropriado foram utilizadas para a realização da

craniotomia de uma janela quadrada, e de seis pequenas perfurações para

inserção de parafusos de sustentação e de dois parafusos de

sustentação/aterramento. Os dois parafusos de sustentação/aterramento foram

implantados na região occipital, e entraram em contato com o líquido

cefalorraquidiano cerebelar, servindo como aterramento elétrico dos eletrodos de

registro. Os parafusos de sustentação/aterramento foram soldados a fios de aço e

conectados ao canal de referência da placa de circuito acoplada ao microdrive.

Após craniotomia da janela, as meninges cerebrais foram cuidadosamente

retiradas, expondo assim o córtex cerebral e permitindo a penetração dos

tetrodos. Durante a cirurgia de implante, os tetrodos foram inseridos apenas

superficialmente no tecido cerebral, aproximadamente 1 mm (equivalente a 3

voltas no parafuso-guia). O posicionamento final dos tetrodos na camada

piramidal de CA1 foi realizado conjuntamente à visualização dos sinais captados,

após a recuperação pós-cirúrgica dos animais. Acrílico dental polimerizável foi

usado para confeccionar um capacete sobre o crânio, dando sustentação e

estabilizando a posição final do microdrive. Após a cirurgia, os animais receberam

antibiótico Fluotril (i.m.) na dose de 2,5 mg/kg. Os animais tiveram acesso livre

diário a 200 ml de água contendo 20 gotas do analgésico paracetamol (200

42

mg/kg, sendo que 15 gotas contém 1 ml, que contém 200 mg de paracetamol), e

permaneceram em repouso por uma semana para recuperação do peso corporal.

2.4 Aquisição de dados eletrofisiológicos e comportamentais

Os sinais eletrofisiológicos foram adquiridos a uma taxa de 30 KHz, filtrados

entre 0,1 Hz e 7,5 KHz, amplificados em 20X e digitalizados através do uso de

headstages Intan® e do sistema de registro Open Ephys. Os movimentos da

cabeça do animal nos três eixos de deslocamento foram detectados por

acelerômetros localizados nos headstages Intan®. O comportamento foi filmado e

gravado em vídeo através de uma câmera Logitech c920 na frequência de 30

imagens por segundo.

2.5 Eutanásia por perfusão transcardíaca

Depois de injetarmos uma sobredose de Tiopental (100 mg/kg), o rato foi

posicionado sobre uma plataforma plana e seus membros foram presos por fitas à

mesa. Foi feita, então, uma marcação tecidual do posicionamento de cada

eletrodo por passagem de corrente elétrica contínua de 0,2 µA por 30 segundos.

Em seguida, foi feita uma incisão no abdome e estendida até o tórax de maneira a

expor o coração. Uma ponteira foi introduzida no ventrículo esquerdo do coração

e guiada até a aorta. Em seguida, foi feita uma incisão no ventrículo direito para a

circulação do sangue. Um sistema de bombeamento acoplado à ponteira injetou

500 ml de salina (preparada a 38°C) e 500 ml de paraformaldeído (preparado a

20°C). Após esse processo, o cérebro foi cuidadosamente retirado, mantido em

solução de paraformaldeído por 24 horas, seguido de solução de sacarose por 48

horas, e foi posteriormente congelado em gel para inclusão (Tissue Tek®) e

conservado em refrigerador à temperatura de -80°C para processamento

histológico posterior.

2.6 Análise histológica

O tecido cerebral foi seccionado em fatias coronais de 50 micrômetros de

espessura em um criostato (Micron®), em seguida montado em lâminas

gelatinizadas e corado com solução cresil violeta para registro fotográfico e

43

inspeção visual do posicionamento final dos eletrodos de registro através de

microscopia luminosa com lente amplificada em 5x.

2.7 Sincronização de registros eletrofisiológicos e de vídeo

Os vídeos e os registros eletrofisiológicos foram sincronizados para que a

posição instantânea do animal fosse alinhada ao tempo de disparo dos neurônios.

A sincronização se deu a partir da normalização dos mesmos pelo tempo de

registro do primeiro ao último evento identificados pelo infravermelho.

Inicialmente, foram detectados os frames em que o LED vermelho acoplado

ao infravermelho acende, para identificação do primeiro e último frame em que o

animal cruzou o labirinto, chamando-os assim de firstledon e lastledon (primeiro e

último frame em que o LED acende). Sabendo que a taxa de aquisição da câmera

é de 30 frames/s, cada frame será associado a um período de amostragem de

1/30 segundos, gerando assim um vetor de tempo de cada posição do animal na

tarefa (Frametime). Durante o registro, o infravermelho quando acionado envia

TTL’s para a Open Ephys, salvando assim o momento exato do registro

eletrofisiológico em que o animal cruza o labirinto naquela posição. O primeiro e

último eventos marcados (ftimeevent e ltimeevent) foram utilizados para identificar

o início e fim da tarefa nos registros eletrofisiológicos.

2.8 Análise de dados neurais

Todos os registros eletrofisiológicos e de vídeo foram analisados usando

rotinas programadas em MATLAB®. O registro eletrofisiológico foi filtrado entre

500-6000 Hz para a detecção dos disparos e armazenamento do formato de onda.

A detecção e a classificação dos potenciais de ação foram feitas a partir de

características das formas de onda. A classificação foi feita tanto pelo algoritmo

MClust, desenvolvido por David Redish, como por um algoritmo desenvolvido em

nosso laboratório (Souza et al, 2018) que utiliza modelos de misturas de

gaussianas (GMMs, do inglês, Gaussian mixture models) para a caracterização de

atributos da onda. A classificação neuronal foi feita utilizando tanto os sistemas

autônomos Klustakwik (Figura 14) e GMMs (Figura 15), juntamente de correções

44

manuais. Essas correções manuais se dão pela verificação da energia e amplitude

dos formatos de onda dos neurônios em relação à sua classificação.

Figura 14: Exemplo de classificação autônoma utilizando o Klustakwik a partir da análise dos

componentes principais. A figura apresenta as diferenças de cluster de 2 neurônios de um mesmo

eletrodo (A e B). Em (C e D) temos o formato de onda nos neurônios classificados (figura retirada

de Keopsell et al, 2009).

45

Figura 15: Exemplo de classificação autônoma utilizando o modelo de misturas de gaussianas

desenvolvido em nosso laboratório. A figura apresenta as diferenças de cluster de 5 neurônios de

um mesmo tetrodo em 4 diferentes pares de atributos do formato de onda.

Após a atribuição dos disparos a unidades neuronais individuais, iniciamos

a detecção das células de lugar. Como descrição clássica, a célula de lugar

apresenta uma maior taxa de disparo em um (ou mais) determinado lugar no

espaço. Para medir esse tipo de informação, a métrica que leva em consideração

ae taxa de disparo por taxa de ocupação definida por Skaggs e colaboradores

(1993) foi utilizada. Essa métrica calcula a informação espacial por disparos

neuronais em unidade de bits/spikes, como descrito na equação abaixo:

sendo o N o número total de bins, pi a probabilidade do animal estar no bin i, λi a

taxa de disparo no bin i e λ a taxa de disparo total da célula. No nosso caso, o

46

labirinto foi binado em bins de 4 cm², sendo que 25 cm foram excluídos em cada

extremidade.

3. Resultados

3.2 Comportamento espacial

O comportamento do animal durante a execução da tarefa espacial no

labirinto linear foi gravado em vídeo em todas as sessões de registros. Um LED

acoplado ao headstage foi utilizado para detectar a posição instantânea do animal

ao longo do labirinto linear. E então um algoritmo foi desenvolvido para rastrear a

posição do animal automaticamente.

Observamos que, durante as explorações espaciais, todos os animais

apresentaram um maior tempo de permanência nas extremidades do labirinto

linear, na maioria das vezes em uma das extremidades. Como exemplo, o rato 04

executou mais de 18 travessias em 4 das 8 sessões registradas (critério mínimo de

18 e máximo de 36 travessias), sendo as mesmas selecionadas para análises

adicionais. A trajetória do animal foi plotada e o tempo de permanência em cada

um dos 210 quadrantes do labirinto linear foi calculado. A Figura 16 mostra que o

animal explorou toda a área do labirinto e apresentou maior tempo de

permanência nas extremidades do labirinto (região próxima à área de recompensa

e que apresenta paredes escuras).

47

Figura 16: Posições do animal no labirinto linear em diferentes sessões. A área da plataforma foi

dividida em 42x5 bins de aproximadamente 4 cm². O tempo em cada bin foi somado para calcular

a matriz de ocupância (Occupation Matrix). Como mostram as matrizes de ocupância das 4

sessões, o rato tem maior tempo de permanência nas extremidades do labirinto, perto da área de

recompensa.

3.3 Potencias de Ação e Células de lugar

Nesse subtópico, 4 sessões de registros de 3 ratos diferentes foram

analisadas. Algumas outras sessões foram pré-analisadas e descartadas devido à

má qualidade do dado.

3.3.1 Classificação de unidades neuronais individuais

Inicialmente, os potenciais de ação registrados em cada tetrodo foram

atribuídos a unidades neuronais individuais através da técnica de spike sorting

usando o programa MClust®, desenvolvido por David Redish (Universidade de

Minnesota), ou pelo classificador desenvolvido em nosso laboratório por Bryan

Souza (Souza et al, 2018). Em ambos os programas, a classificação é feita por

algoritmos semi-automáticos seguido de ajustes manuais quando necessário.

48

Como exemplo de classificação, podemos ver na Figura 17 a distribuição dos

potenciais de ação obtidos de um único tetrodo em um registro de 5 minutos na

sleep box. Foram encontradas 5 unidades neuronais individuais a partir da

diferença de pico-vale do formato de onda e do autocorrelograma dos próprios

clusters.

49

Figura 17: Atividade neuronal registrada por um tetrodo. Em (A) pode-se ver a clusterização

neuronal de um tetrodo a partir da diferença pico-vale dos formatos de onda. (B) mostra o formato

50

de onda e o desvio padrão de 5 neurônios clusterizados em (A) (separados pelas cores) e seus

autocorrelogramas.

3.3.2 Neurônios candidatos a células de lugar

Com o objetivo de selecionar apenas os neurônios candidatos a células de lugar, analisamos a atividade de neurônios individuais de 2 registros e consideramos apenas aqueles que apresentaram uma taxa de disparo média acima de 0,2 Hz e um índice de informação (I) acima de 0,5. Com esses critérios, foram obtidas 18 células de lugar, de um total de 71 neurônios selecionados (25,3% do total) (Figura 18-A). Como exemplo ilustrativo, na Figura 18-B mostramos 3 exemplos de células: (1) um neurônio excluído de análises adicionais por apresentar baixa taxa de disparos, (2) um neurônio candidato a célula de lugar, e (3) um neurônio com alta taxa de disparo, mas pouca informação espacial e por isso excluído de análises adicionais.

Figura 18: Seleção de candidatos a células de lugar. Em (A) plotamos a taxa de disparo em função

da quantidade de informação espacial (I, bits/spike) dos neurônios analisados. As linhas tracejadas

em vermelho ilustram os critérios definidos para a detecção dos candidatos a células de lugar. Em

(B) é mostrada e taxa de disparo de 3 neurônios ao longo do labirinto linear binado. Note que

nesses exemplos, o turquesa e o azul não foram selecionados como candidatos a célula de lugar

por não atenderem aos critérios (taxa de disparo > 0,2 Hz e I > 0,5). Em vermelho um exemplo de

célula candidata a ser célula de lugar.

3.3.3 Células de lugar

Após selecionar as células de lugar, os disparos provenientes de cada

neurônio foram plotados em função das respectivas posições do animal no

51

labirinto (Figura 18-A). A somatória dos disparos em cada bin dividida pelo tempo

permanecido no mesmo foi usada para comparar a taxa de disparo do neurônio

em cada posição ocupada pelo animal ao longo do labirinto (Figura 18-B). Apenas

as sessões em que o animal executou um número de travessias acima do critério

foram analisadas.

Os resultados mostram que os neurônios selecionados como candidatos a

células de lugar apresentam um ou mais campos de lugar e taxas de disparos

aumentadas em locais específicos do labirinto linear (Figura 19).

52

Figura 19: Seletividade espacial de neurônio de CA1 dorsal. Os potenciais de ação desta célula

piramidal putativa (pontos vermelhos) foram plotados em função de 24 passagens (linha cinza)

executadas pelo rato ao longo do labirinto linear (superior). Taxas de disparos do mesmo neurônio

foram divididas e linearizadas em 42 bins ao longo do labirinto (as bordas foram descartadas)

(inferior). Note que há um aumento na taxa de disparo no lado direito do labirinto linear (limiar

acima de 7 Hz). Apenas períodos onde o animal se encontrava em movimento foram considerados

nesta análise.

Na Figura 20, os campos de lugar dessas células também podem ser

observados nos eixos X e Y da trajetória do animal. Por ser na extremidade do

labirinto o lugar onde o animal se encontra mais parado, 15 cm de cada

extremidade do aparato foram excluídos das análises. As células de lugar foram

binadas em 5 cm para que fosse possível encontrar o seu campo de lugar. A taxa

de disparo foi computada pela divisão de cada bin de contagem de disparos pela

ocupância do animal no bin.

Figura 20: Células de lugar ao longo da trajetória percorrida no labirinto linear. A figura mostra 4

células de lugar durante a corrida no labirinto linear. Em cima temos a trajetória percorrida pelo

animal em preto e em vermelho os momentos em que as células de lugar dispararam. Abaixo

vemos o percurso binado e também “suavizado”.

53

Afim de verificar a existência de células de lugar unidirecionais e

bidirecionais, plotamos a taxa de disparo dos neurônios em relação ao sentido de

travessia (Figura 21-A e C), No exemplo, podemos ver que o neurônio apresenta

um provável campo de lugar nas travessias à direita. Verificamos, também nesse

exemplo, que o autocorrelograma da célula revelou disparos rítmicos em

aproximadamente 7 Hz, o que indica que ela dispara na mesma frequência do

ritmo teta (Figura 21-E). Ao analisar as fases da oscilação teta em que os disparos

aconteceram, observamos que esse neurônio possui preferência de fase

aproximadamente em 260° (vale do ciclo) (Figura 21-D).

Figura 21: Neurônio de CA1 dorsal seletivo e acoplado em teta. Em (A) vemos o comportamento

desse neurônio no labirinto linear para a direita e esquerda e sua taxa de disparo. (B) O formato de

onda nos 4 canais do tetrodo. (C) Disparos durante travessias para direita e esquerda em cada

volta. (D) Fase preferencial de disparo na banda teta. (E) Autocorrelograma. Note que existem 7

picos em 1 segundo, o que indica que o neurônio é modulado por teta.

3.4 Potenciais de Campo Local

Os potenciais de campo local dos 64 canais foram gravados, e intervalos

de interesse foram devidamente selecionados para análises espectrais. Durante a

tarefa espacial, o PCL da região de CA1 apresentou um aumento da amplitude

das oscilações na banda teta (6-12 Hz, Figura 22) no decorrer da travessia do

animal. Já enquanto o animal se encontrava em estado de repouso, o espectro de

54

potências mostra o predomínio de frequências mais lentas, na banda delta (1-4

Hz). Nesse momento, também é possível observar a ocorrência de episódios

pontuais de oscilações de alta frequência, denominadas ripples (150-250 Hz).

Figura 22: Potencial de campo local de CA1 durante uma travessia no labirinto linear. Sinais brutos

de PCL obtido de cada canal (ch 1-4 de um tetrodo) mostram duas diferentes frequências

oscilatórias a partir da trajetória do animal (acima). Espectrograma do canal 4 (verde) mostra um

aumento da potência oscilatória em teta (5-12 Hz). A barra cinza indica quando o animal chegou ao

fim do labirinto linear (recompensa entregue).

Para uma melhor visualização do PCL, dividimos o registro em 3 estados:

os momentos de travessia no labirinto linear, episódios de SOL e de sono MRO

durante os períodos pré tarefa (Figura 23-A e B). Concatenamos momentos

provenientes de registros obtidos de 3 animais (Rato 04, Rato 05, e Rato 06) para

um vetor de cada condição.

Inicialmente foram feitas análises da potência espectral de cada animal em

SOL, MRO e durante a travessia (exemplo do Rato 04 na Figura 23-C). Os estágios

de sono foram definidos por observações manuais do PCL e vídeo devidamente

55

sincronizados. Com isso, integramos a área do PSD nos segmentos de teta (5-12

Hz), delta (1-5 Hz), LG (30-55 Hz) e HG (65-100 Hz) para análise da potência

(Figura 23-D). Podemos observar que o sinal dos animais corroboram achados

publicados na literatura, como o aumento de teta durante MRO e travessia, e o

aumento do ritmo delta durante o SOL (Buzsáki, 2002; Mole et al., 2006). O HG

também apresentou um aumento de amplitude na travessia comparado com SOL

e MRO (Sheffzuk et al., 2011).

Figura 23: Potenciais de campo local de CA1 em alguns estados. Em (A) temos exemplos de 2

segundos de um sinal bruto, filtrado em teta (5-12 Hz), LG (30-55 Hz) e HG (65-100 Hz) em SOL,

MRO e durante a travessia no labirinto linear. Em (B) vemos o espectrograma de todo o sinal

filtrado e concatenado do registro do mesmo rato (Rato 04). O colorbar foi modificado para “hot”

para facilitar a visualização da imagem, já que a escala foi ancorada para os três espectrogramas.

No painel (C), temos o PSD do sinal em (B). (D) Integral da PSD nos intervalos de teta, delta, LG e

HG para os 3 animais.

3.4.1 Comodulogramas

Fizemos análises de acoplamento fase-amplitude (Rato 04) durante os

momentos de sono pré tarefa (SOL e MOL) e de caminhada no labirinto linear

56

(Figura 24-A). Os períodos representam uma concatenação de 123 segundos de

SOL, 43 segundos de MRO e 200 segundos de caminhada (25 corridas).

Podemos observar que durante os episódios de SOL houve acoplamento

da fase de delta com LG e a amplitude de HG, e, em menor escala, entre a fase de

teta e a amplitude de HG. Durante os episódios de sono REM, podemos observar

um acoplamento claro entre a fase de teta e a amplitude de HG. Na caminhada, foi

observado um acoplamento tanto das fases de teta com a amplitude de LG, como

entre as fases de teta e a amplitude de HG, corroborando como o que já existe

relatado na literatura (Figura 24-B).

Ao que já sabemos, existe um acoplamento maior entre as fases de teta e a

amplitude de HG durante o sono MRO (Sheffzuk et al, 2011; Scheffer-Teixeira e

Tort, 2017) do que quando o animal está acordado, o que também foi observado

em nossos resultados. Vale ressaltar que os tempos analisados para cada

comodulograma podem ter sido curtos, o que pode influenciar em quão robustas

são as modulações.

57

Figura 24: Comodulograma fase-amplitude para os diferentes estados comportamentais. Em (A)

temos um exemplo de comodulograma de um registro de SOL, MRO e “Running”, este último

definido como a travessia do animal no labirinto linear. (B) mostra as distribuições fase-amplitude

dos exemplos de (A), computados para: delta (1-5 Hz) / LG (30-60 Hz), delta (1-5 Hz) / HG (65-100

Hz), teta (5-10 Hz) / LG (30-60 Hz) e teta (5-10 Hz) / HG (65-100 Hz). Os números em cima de cada

barra significa o valor de acoplamento (índice de modulação ,IM).

58

3.5 Histologia

A análise por microscopia luminosa dos cortes histológicos corados com

cresil violeta mostra a posição final dos tetrodos na região CA1 do hipocampo

dorsal. No detalhe ampliado da foto é possível observar a lesão tecidual

provocada pela passagem de corrente na ponta dos eletrodos, indicando que o

protocolo de marcação tecidual foi efetivo (Figura 25).

Figura 25: Lesão Eletrolítica e Histologia. O tecido cerebral foi seccionado com cortes coronais de

50 micrômetros em um criostato (Micron®), montado em fatias gelatinizadas tingidas de cresil

violeta para fotografia e inspeção visual do posicionamento final dos eletrodos por microscopia,

utilizando uma lente amplificadora de 5x. A esquerda na parte superior as setas indicam

marcações de CA1 e DG. A direita temos um esquemático do hipocampo dividido em CA1, CA2,

CA3 e DG. Abaixo temos marcações de CA1. Perceba que existe um deslocamento do tecido que

indica o posicionamento final do tetrodo.

59

4. Conclusão

Utilizando os 2 protótipos de microdrives desenvolvidos (ver capítulo 1),

registramos a atividade eletrofisiológica de neurônios do hipocampo de ratos.

Abaixo estão sumarizados os objetivos e suas devidas conclusões.

Objetivo 1:

- O protótipo foi desenvolvido e implantado com sucesso, e os tetrodos

foram precisamente posicionados na região de CA1.

Objetivo 2:

- Os tetrodos foram confeccionados e utilizados para registro da atividade de

disparos e das oscilações de populações de neurônios. No todo, os últimos

animais apresentaram uma grande qualidade nos registros de LFP e um

bom desempenho quanto à atividade neuronal.

Objetivo 3:

- Os animais foram devidamente treinados e executaram bem a tarefa no

labirinto linear, onde correram por recompensa de água, cruzando o

labirinto de 8 a 37 vezes. Foi percebido que no geral o animal preferia uma

das extremidades do labirinto para explorar mais.

Objetivo 4:

- Inicialmente houve um retardo nas análises de sorting dos dados por um

problema de conversão. Foram utilizados no total 4 classificadores

diferentes para finalmente padronizar as análises com o Klustakwik e o

GMM. Nem todos os dados colhidos foram analisados devido à quantidade

e tempo até o momento (9 registros foram analisados).

60

Objetivo 5:

- Os dados que foram selecionados para análise apresentaram em

aproximadamente metade de seus tetrodos a atividade neuronal

característica de CA1.

Em suma, a técnica de registro neuronal com microdrive de tetrodos

móveis foi implantada no laboratório. As análises dos dados mostraram atividade

de células de lugar no labirinto linear. Nosso trabalho, além de tudo, apresentou

grande importância metodológica para o Instituto do Cérebro em geral, que ganha

maiores opções de pesquisa com a padronização de uma técnica desenvolvida

com tecnologia própria.

61

IV - Capítulo 3: Velocidade de corrida modula a oscilação

delta no hipocampo de ratos

________________________________________________________________________

62

Durante os registros ocorridos no labirinto linear, foi possível notar que,

além da presença da oscilação teta (5-10 Hz), uma oscilação delta (1-4 Hz)

apresentava picos de coatividade durante períodos de aumento de velocidade. A

fim de investigar isso mais profundamente, fizemos a análise da atividade do PCL

durante a locomoção do animal. Para controlar a velocidade de locomoção dos

animais, utilizamos uma esteira elétrica controlada por computador enquanto os

ratos (wistar) corriam em protocolos de velocidades constantes e crescentes.

Observamos o surgimento de oscilações na banda delta no hipocampo enquanto

os ratos aumentam sua velocidade de locomoção. A amplitude e a frequência das

oscilações delta foram fortemente associadas à velocidade de corrida dos

animais, e a ritmicidade da banda delta se tornava notavelmente periódica acima

das velocidades de 30 cm/s. Nossos resultados demonstram que a velocidade de

corrida modula fortemente as oscilações delta no hipocampo de ratos, e que esse

ritmo e a oscilação teta podem coexistir.

1. Objetivos

1.1 Objetivo geral

Registrar a atividade eletrofisiológica do hipocampo de ratos enquanto os

animais correm em uma esteira elétrica controlada por computador em protocolos

de velocidades constantes e crescentes.

1.2 Objetivos específicos

1 – Desenvolver um protocolo experimental para a tarefa com fim de analisar a

relação entre a velocidade do animal e as frequências lentas do PCL hipocampal.

2 – Registrar os sinais eletrofisiológicos na subárea CA1 do hipocampo dorsal de

ratos enquanto correm em uma tarefa de locomoção em esteira.

63

3 – Analisar a relação entre oscilações neurais e a velocidade de locomoção dos

animais.

2. Métodos

2.1 Sujeitos experimentais

Utilizamos 4 ratos machos adultos (Rattus Norvegicus) entre 2 e 4 meses de

vida. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais sob ciclo claro-escuro de

12 horas com água e ração ad libitum. Todos os experimentos foram realizados

durante a fase clara do ciclo. Nesses experimentos, foram utilizados os mesmos

animais implantados com o microdrive de 16 tetrodos móveis.

2.2 Protocolo da tarefa na esteira

Inicialmente os animais foram treinados em protocolos de baixas

velocidades contínuas por 15 minutos por 2 vezes ao dia para que aprendessem a

andar na esteira . Durante os treinamentos, uma barra de choque de 0,1 a 0,7 mA 8

foi ligada para que o animal evitasse descansar fora da cinta, na parte posterior da

esteira (Figura 26). Uma vez que os animais aprenderam a tarefa, era iniciado o

protocolo de velocidades constantes e velocidades crescentes (Figura 27). O início

do protocolo é sinalizado com 3 tons neutros de 100 ms intercalados por 150 ms,

seguido de um intervalo de 5 s com a esteira parada. Os protocolos de locomoção

(Aceleração1 (A1) = 0-20 cm/s, Aceleração2 (A2)= 0-30 cm/s, Aceleração3 (A3)=

0-40 cm/s, Velocidade1 (V1) = 20 cm/s, Velocidade2 (V2) = 30 cm/s, Velocidade3

(V3) = 40 cm/s) são iniciados de acordo com uma ordem previamente definida,

com duração de 20 s por protocolo e intervalo de 5 s entre protocolos. Essa

sequência de protocolos foi repetida 7 vezes, gerando um total de 42 episódios de

corrida, equivalente a 17 min e 30 s de tarefa. Nossos protocolos de corrida e de

choque foram baseados em estudos anteriores (Albeck et al, 2006; O’Callaghan et

8 A esteira possui 40 cm de comprimento e tem uma velocidade máxima de 120 cm/s. Além de possuir regulagem angular de inclinação, possui uma barra de choque na parte de trás e uma ventoinha na parte da frente adaptada.

64

al, 2007; Liu et al, 2009). Um dos animais preliminares (Rato 05) foi registrado com

velocidades de 40, 50 e 60 cm/s.

Figura 26: Ilustração da tarefa de locomoção na esteira. A esteira é revestida de acrílico e

apresenta um sistema gradeado de choque na parte posterior e uma ventoinha de refrigeração na

parte frontal. Um LED vermelho foi colocado em um quadrante da imagem capturada pelo vídeo

para a sincronização de registros eletrofisiológicos e de vídeo.

Figura 27: Ilustração da sequência de protocolos de velocidades na esteira. A tarefa inicia com 3

tons de 100 ms intercalados por 150 ms, seguido de 20 s de 6 diferentes condições de velocidade,

intercalados por 5 segundos de intervalo.

A etapa de treinos durou 1 mês, visto que os animais apresentaram

dificuldade em correr em altas velocidades. Nos últimos treinos antes do

procedimento cirúrgico e ao longo de todos os registros, o choque foi mantido

desligado. Após recuperação cirúrgica, o animal foi re-treinado por mais duas

semanas antes que houvesse o primeiro registro. Uma câmera Logitech c920 foi

utilizada para filmar o experimento com amostragem de 30 quadros/s. Um LED

vermelho foi acoplado em um dos quadrantes da imagem capturada pelo vídeo

para posterior sincronização entre vídeo e registro.

65

3. Resultados

Registramos 4 animais, sendo que um deles foi registrado com A1 = 0-40

cm/s, A2 = 0-50 cm/s, A3 = 0-60 cm/s, V1 = 40 cm/s, V2 = 50 cm/s e V3 = 60

cm/s e os demais seguindo o protocolo normal. Um trial é descrito como a corrida

individual de cada velocidade de locomoção (A1, A2, A3, V1, V2 e V3). Corridas

em que os animais apresentaram taxa de execução menor 18s dos 20s de cada

trial foram excluídas de qualquer análise (animal parar na barra de choque por 2

segundos por exemplo). A taxa de execução é dada pelo momento em que o

animal corre adequadamente durante a tarefa. Observamos que em todos os

registros e em todos os trials o animal desempenhou a tarefa em marcha de

caminhada, como esperado pela definição de Whishaw e Kolb (2005).

3.1 Picos de oscilações delta no labirinto linear

Nos experimentos descritos no capítulo 2, foi presenciada uma

proeminente oscilação teta (6-12 Hz) durante a movimentação do animal no

labirinto linear. Além disso, foram observados picos de potência na frequência

delta (1-4 Hz) durante períodos de maior velocidade (Figura 28-A). Isto é,

constatamos que além dos períodos de delta sem teta que ocorrem quando o

animal encontra-se parado, e de teta sem delta durante locomoção, também havia

períodos de teta associado a delta relacionados ao aumento de velocidade (Figura

28-B).

66

Figura 28: Exemplo de oscilações delta (1-4 Hz) durante a exploração do animal no labirinto linear.

(A) vemos o espectrograma de um canal durante uma tarefa de exploração espacial. A linha preta

representa a velocidade do rato. Note que durante momentos de maior velocidade aparece uma

maior frequência de delta independente do teta. (B) 3 momentos de 2 segundos mostrando a:

trajetória, sinal bruto, sinal filtrado em teta (6-12 Hz) e delta (1-4 Hz). No primeiro momento o

animal encontra-se parado, como pode ser observado na trajetória. O segundo é um período de

movimentação em que se tem alta amplitude das oscilações teta mas não de delta. O terceiro é um

momento de aceleração do animal em que se tem uma alta amplitude tanto de teta como de delta.

A partir dessas observações procuramos conduzir experimentos de forma

controlada em uma esteira, visando encontrar uma maior estabilidade da atividade

delta em relação à velocidade do animal.

3.2 Velocidades constantes

Inicialmente analisamos os três protocolos de velocidades constantes na

esteira. Vimos que tanto a oscilação teta (6-12 Hz) quanto delta (1-4 Hz)

coexistiam nas três velocidades (Figura 29), o que, em primeira instância, parece

67

contradizer a literatura de ritmos hipocampais que separa os estados “alerta” e

“quieto” a partir da oscilação predominante presente (Battaglia et al, 2011; Kirov et

al, 2009).

Em análises iniciais, pensamos que essa oscilação delta poderia ser

artefato de movimento da cabeça, o que rapidamente descartamos ao observar

que o movimento da cabeça do animal oscilava em torno de 6 Hz, como mostrado

na Figura 29. A fim de ver se se trata de um artefato elétrico oriundo do

funcionamento do motor da esteira, fizemos testes com o animal livre na esteira,

onde o motor estava ligado mas sem correia. Observamos que o motor não causa

interferência elétrica nos sinais registrados.

Figura 29: Análise espectral durante três protocolos de velocidades constantes (20, 30 e 40 cm/s).

Espectrograma hipocampal (esquerda) e PSD (meio) dos três protocolos de velocidades

constantes. À direita, o PSD do acelerômetro localizado na cabeça do animal.

Além de tudo, pudemos observar também que a frequência do delta é

variável de acordo com a diferença de velocidade, o que nos fez olhar mais

atenciosamente para os protocolos de velocidades crescentes, como será

mostrado abaixo.

68

3.3 Protocolo de aceleração na esteira

Após observar a atividade delta durante o protocolo de velocidades

constantes, decidimos investigar sua dinâmica durante a variação de velocidade.

Analisando o protocolo de velocidades crescentes na esteira, vimos que a

oscilação do PCL bruto varia de acordo com a velocidade de corrida (Figura 30),

onde o delta em certos momentos pode chegar a ter amplitude maior do que teta.

Figura 30: Análise espectral durante protocolo de aceleração (2.5 cm/s²) na esteira. Protocolo

“ramp up” de 0 a 50 cm/s em 20 s (acima). PCL hipocampal antes e durante a corrida (meio).

Espectrograma e PSD em blocos de 5s mostram o aumento da oscilação delta (abaixo).

Em seguida, analisamos a variação do delta nos diferentes protocolos de

velocidades crescentes (aceleração A1, A2 e A3, Figura 31). Na figura, é possível

observar que a variação da frequência de delta se relaciona com a velocidade de

locomoção instantânea, não pela aceleração. Além disso, é possível notar que o

aumento da potência do delta é mais robusto em acelerações maiores.

69

Figura 31: Análise espectral do PCL hipocampal em três protocolos de aceleração (2, 2.5 e 3

cm/s²). A amplitude e frequência da oscilação delta aumenta de acordo com a velocidade de

locomoção.

Por último, fizemos uma correlação entre o pico do PSD das frequências e

potências normalizadas de delta e teta com a velocidade de locomoção do animal

(Figura 32). Utilizando trials como entrada e analisando em bins de 1 segundo,

nossos resultados mostram que há uma correlação linear positiva (r = 0,29) com a

potência de delta e negativa com teta (r = -0,39), o que sugere inicialmente que

essas bandas se correlacionam de forma inversamente proporcional à velocidade.

Quanto à frequências, observamos que um aumento da velocidade se

correlaciona com a frequência apenas de delta, sugerindo assim que a banda

delta tenha uma relação agregada com a velocidade de locomoção.

70

Figura 32: Pico da frequência e amplitude normalizado em delta (acima) e teta (abaixo) através dos

20 segundos binados. A frequência e amplitude da oscilação delta aumenta com a velocidade,

enquanto a frequência de teta aumenta e a amplitude diminui.

3.4 Frequência respiratória na esteira

Atualmente, é sabido na literatura que aspectos fisiológicos estão

correlacionados com ritmos oscilatórios do cérebro (Fuhrmann et al, 2015;

Ledberg e Robbe, 2011; Lockmann et al, 2016). Dentre esses aspectos, o ritmo

respiratório está associado ao ritmo oscilatório no hipocampo de roedores

(Lockmann et al, 2016; Vivan Chi et al, 2016). Essa particularidade levanta a

hipótese de que o delta visto no hipocampo durante os protocolos de velocidades

constantes e crescentes esteja associado ao ritmo respiratório. Para testar isso,

fizemos um piloto, onde implantamos um thermocouple na cavidade nasal de um

rato Long Evans macho adulto enquanto corria em uma esteira nas velocidades

constantes de 20, 30 e 40 cm/s (Figura 33). O sinal foi registrado a uma taxa de

amostragem de 2030 e filtrado entre 0-15 Hz. Nosso resultado mostra que a

banda de frequência de respiração durante a tarefa nas 3 velocidades constantes

71

é entre 4-6 Hz (Figura 33-B), o que diverge da banda delta observada no

hipocampo durante a corrida em esteira (1-4 Hz). Ainda que esse achado não

tenha sido obtido dos mesmos animais, ele sugere que a oscilação delta no

hipocampo de roedores observada durante corrida em diferentes velocidades não

está associada à atividade do ritmo respiratório.

Figura 33: Frequência respiratória durante a corrida de velocidade constante na esteira. Em (A e B)

temos um exemplo da frequência respiratória do animal durante a corrida nas velocidades

constantes de 20, 30 e 40 cm/s. Em (C) o PSD mostra uma oscilação nas três velocidades,

variando entre 4 e 6 Hz.

3.5 Fase de delta modula a oscilação Low gamma

Em análises iniciais de acoplamento fase-amplitude, também encontramos

um alto índice de modulação entre as fases de delta (1-4 Hz) e a amplitude de LG

(20-55 Hz) em velocidades constantes, o que sugere a priori que o delta tenha

relação com a atividade de CA3. Vimos também que quanto maior é a velocidade,

maior a modulação de delta e LG (Figura 34), o que nos fez olhar para a energia

72

por fase de delta. Encontramos que a amplitude máxima de LG em velocidades

mais baixas ocorre no vale da fase, enquanto que em velocidades mais altas, no

pico (Figura 34).

Essas análises foram feitas em apenas um animal (Rato 06), onde todos os

trials foram concatenados, e comodulogramas foram feitos para as três condições.

Dessa forma, uma análise mais completa deve ser feita para o grupo de

sessões/animais registrados, permitindo assim afirmações mais robustas acerca

dessa modulação de delta e LG durante a atividade de corrida em velocidades

constantes.

Figura 34: Comodulograma da fase-amplitude e a energia por fase dos três protocolos de

velocidade constante. Acima, vemos que delta modula a atividade de LG (20-55 Hz). Abaixo, a

energia por fase de delta. Note que em velocidades mais baixas LG tem amplitude maior no vale

de delta, enquanto que em velocidades mais altas LG ocorre no pico.

73

4. Conclusão

A oscilação delta (proeminente em estados offlines do cérebro) pode

coexistir com a oscilação teta (proeminente em estados onlines) no hipocampo de

ratos em função da velocidade de locomoção. A oscilação delta apresenta

amplitude e frequência relacionadas à velocidade. Também existe modulação da

amplitude de LG pela fase de delta, o que indica que delta tenha relação com a

atividade de CA3. No mais, a origem e função da oscilação delta na locomoção

necessita de mais estudos para um melhor entendimento.

74

V. Discussão _________________________________________________________________________________

Apesar de distintos, os três capítulos dessa dissertação possuem uma

relação dependente que os une de forma sequencial. Observando passo a passo,

essa relação tem início com a intenção do Laboratório de Neurofisiologia

Computacional em implantar a técnica de registro de tetrodos utilizando

microdrives. Visando esse objetivo, nós desenvolvemos um novo modelo de

microdrive barato e eficiente que vem sendo não apenas utilizado por nosso

grupo, mas por outros laboratórios do Instituto do Cérebro da UFRN.

No capítulo 1 apresentamos dois diferentes modelos de microdrives de

tetrodos móveis. Pensando em facilidade e praticidade para futuras produções em

larga escala, seu desenvolvimento se deu a partir da utilização apenas de

ferramentas e máquinas disponíveis no Instituto do Cérebro, tais quais CNC e

impressora 3D, além de parafusos hexagonais e porcas específicas, diferente de

outros modelos da literatura que utilizam materiais exclusivos e comerciais (Voigts

et al, 2013; Battaglia et al, 2009). Além disso, os microdrives disponíveis

atualmente não possuem uma proteção apropriada, no geral improvisados com

algum plástico e papel alumínio. No microdrive elaborado, a arquitetura de

montagem por blocos conta com uma proteção leve e resistente que dá corpo ao

dispositivo. Essa montagem por blocos também ajuda em uma fácil adaptação

para o uso de fibras ópticas e eletrodos de estimulação em conjunto dos tetrodos,

caso seja necessário. Apesar de tudo, nosso modelo ainda se limita à utilização do

conector Omnetics, que é a componente mais cara do sistema hoje em dia. Com

isso, futuras adaptações podem ser feitas para baratear ainda mais sua produção.

Como forma de validar o funcionamento adequado do microdrive,

registramos células de lugar no hipocampo de ratos. Isso faz desse trabalho, o

primeiro projeto voltado para o registro de células de lugar no Brasil . Em 9

adicional, esse dado será utilizado para futuras análises em nosso laboratório para

9 As células de lugar foram descobertas por O’Keefe e Dostrovsky em 1971. Até o momento não há nenhum trabalho publicado que indique registros dessas células no Brasil.

75

um melhor entendimento da formação de mapas espaciais no hipocampo de

ratos.

Apesar de apenas parcialmente analisado, nossos registros reforçam a

existência de células de lugar no hipocampo dorsal de ratos. Alguns trabalhos têm

apontado uma média de 1/3 das células que são registradas no hipocampo como

sendo células de lugar (O’Keefe, 1976; Souza, 2015; Thompson e Best, 1989).

Nosso trabalho, nesse sentido, apresentou uma porcentagem de 25,3% de células

de lugar, o que corrobora com o esperado . Na literatura, a atividade das células 10

de lugar durante a corrida no labirinto linear é separada como sendo unidirecional

ou bidirecional, isso significa que podem apresentar formação do campo de lugar

apenas durante a travessia em um determinado sentido ou em ambos (Battaglia et

al, 2009; Foster e Wilson, 2006; Dragoi e Buzsáki, 2006). Em nossas análises,

também encontramos seletividade de direção, reforçando assim que as células de

lugar apresentam padrões complexos em relação à sua preferência espacial.

Apesar de não ter apresentado um resultado do grupo de animais, vimos também

que as células de lugar em sua maioria apresentam disparos acoplados às fases

do ritmo teta. Esse acoplamento já era esperado, e segundo alguns trabalhos,

pode ter relação com a precessão de fase durante a travessia no campo de lugar,

como mostra Jensen e Lisman (2000), O'Keefe e Reece (1993) e Skaggs e

McNaughton (1996).

Durante os registros, também observamos uma maior ocupância do rato

nas extremidades do labirinto linear. Esse comportamento também foi visto em

outros trabalhos, que acrescentam que durante esse período há reativação das

células de lugar (Foster e Wilson, 2006; Dragoi e Tonegawa, 2011).

Como análises adicionais e também como forma de validação dos registros

pelo modelo de microdrive desenvolvido nesta dissertação, analisamos o PCL de

ratos em diferentes estados comportamentais. Nossos resultados são

semelhantes ao que está descrito na literatura, como: (1) encontramos um

aumento de teta durante o MRO e durante travessia no labirinto linear, além de um

aumento do ritmo delta durante o SOL (Buzsáki, 2002; Mole et al, 2006); (2) houve

10 Vale ainda salientar que, durante a classificação pela métrica de Skaggs, não separamos as corridas por unidirecionalidade, o que implica que essa porcentagem poderia aumentar.

76

um aumento do HG durante a travessia, diferentemente de SOL e MRO (Sheffzuk

et al., 2011); (3) vimos também uma comodulação maior entre teta e HG durante o

sono MRO comparado com os momentos de travessia (Sheffzuk et al, 2011;

Scheffer-Teixeira e Tort, 2017). Durante as análises do PCL nos períodos de

travessia no labirinto linear, vimos que além da esperada oscilação teta no

hipocampo, houveram picos de atividade de delta que se correlacionaram com o

aumento de velocidade do rato. Com isso, dedicamos o capítulo 3 para uma

análise controlada desse ritmo.

Mesmo que sob análises iniciais, os resultados do capítulo 3 apresentam

achados interessantes quanto ao funcionamento oscilatório do hipocampo. Alguns

trabalhos têm definido (Hirase et al, 2001; Scheffer-Teixeira e Tort, 2016) a

atividade eletrofisiológica hipocampal em estados “alerta” e “quieto”, onde, por

natureza, esses estados são supressivos e excludentes entre si. Os estados são

definidos pelas oscilações presentes no hipocampo, sendo o alerta caracterizado

pela atividade de teta e gama, e o quieto pela atividade de delta acompanhada de

eventos de alta frequência chamados de sharp-wave ripple. Nosso achado neste

trabalho indica que essa separação é incongruente quando os animais estão em

uma atividade de locomoção, visto que mostramos que tanto as oscilações teta

quanto delta podem coexistir no hipocampo. Além disso, nossos resultados

indicam que as duas bandas de frequência são afetadas pela velocidade de

locomoção do animal, tanto na amplitude como frequência.

Até hoje, não existe nenhum estudo que mostra correlação entre a

amplitude e frequência de delta em relação à velocidade de locomoção. Ao invés

disso, vários estudos correlacionam locomoção apenas a banda teta e gama

(Fuhrmann et al, 2015; Andersen et al, 2007; McFarland et al, 1975), o que também

é reforçado pelo nosso trabalho, adicionando que encontramos correlações

inversas da potência de teta em relação a velocidade.

Como é sabido, aspectos fisiológicos estão associados a ritmos

oscilatórios no cérebro de roedores, como movimentos da cabeça, frequência

respiratória e outros (Fuhrmann et al, 2015; Ledberg e Robbe, 2011; Lockmann et

al, 2016), dessa maneira, a oscilação delta não apresenta ação específica em

atividade motora. Pesquisas recentes têm reportado uma atividade oscilatória

77

entre 2-4 Hz no giro denteado de animais anestesiados (Yanovsky et al, 2014; Ito

et al, 2014; Lockman et al, 2016). Outros estudos ainda apontam que a frequência

respiratória de um roedor pode variar de 2-10 Hz (Kabir et al, 2010; Nalivaiko et al,

2010). Das possíveis razões da origem do delta encontrado no nosso trabalho,

ainda não podemos afirmar com convicção se ele é oriundo ou não do ritmo

respiratório; para isso, experimentos adicionais devem ser feitos com registros do

PCL de CA1 e da atividade respiratória durante uma tarefa de corrida. Por outro

lado, Alves et al (2016) mostram que a taxa respiratória média das velocidades que

estamos registrando é de 8 Hz, e, juntamente com nosso resultado piloto

mostrando respiração acima de 4 Hz na esteira, supomos que o delta encontrado

na esteira em nossos protocolos de velocidades não seja uma influência

fisiológica direta do ritmo respiratório.

Um outro ponto a se observar é de que achados recentes apontam para um

acoplamento entre o córtex prefrontal e o hipocampo de 2-5 Hz em ratos

anestesiados (Roy et al, 2017). Nesse trabalho, os autores reportam que essa

banda de frequência é oriunda do córtex prefrontal e expressa no hipocampo via o

tálamo. Ao que se conhece na literatura (Giustino et al, 2015; Likhtik et al, 2014), o

córtex prefrontal possui papel crucial codificação de memória de medo. Essa

codificação é reportada por uma oscilação que gira em torno de 4 Hz, sendo

também encontrada na amígdala (Fujisawa, 2017; Karalis et al, 2016 ). O protocolo

de condicionamento aversivo na nossa tarefa com as barras de choque faz pensar

que a oscilação delta encontrada no hipocampo durante a locomoção possa ser

proveniente da oscilação lenta que o prefrontal projeta indiretamente ao

hipocampo. Para comprovar essa hipótese, outros experimentos devem ser feitos

a partir de registros do hipocampo e do córtex prefrontal.

Apesar de já termos feito algumas análises, o presente trabalho ainda

apresenta limitações, como o número de animais analisados até aqui e a falta de

uma análise de grupo. Contudo, os resultados prévios corroboram com uma ideia

nova de definição da atividade de delta e teta no hipocampo de ratos durante a

locomoção.

Em suma, durante o presente trabalho de mestrado foi desenvolvido e

implementado no Instituto do Cérebro da UFRN uma tecnologia ainda incipiente

78

no país de registro de atividade eletrofisiológica através de microdrives de

tetrodos móveis. A efetividade de tal tecnologia foi validada através do registro e

análise da atividade neuronal e de PCL do hipocampo de ratos se movimentando

em um labirinto linear e numa esteira motorizada. Além da caracterização das

células de lugar, já bem estabelecidas na literatura, como co-produto deste

trabalho mostramos também resultados preliminares inéditos acerca da atividade

delta durante locomoção em esteira.

79

VI. Animais implantados _________________________________________________________________________________

Ao todo 10 animais foram implantados para registros de tarefas no labirinto

linear e em uma esteira. Todos passaram previamente por um período de no

mínimo 1 mês de treinos 2x por semana para cada uma das tarefas. A tabela

abaixo mostra um sumário:

Animal Implante Tarefas/Treino Registros

Rato 01 (Chorão) Microdrive de 8 tetrodos Labirinto linear X

Rato 02 Microdrive de 8 tetrodos Labirinto linear X

Rato 03 Microdrive de 8 tetrodos Labirinto linear 6

Rato 04 Microdrive de 8 tetrodos Labirinto linear 8

Rato 05 Microdrive de 16 tetrodos móveis Labirinto linear/esteira 4/2

Rato 06 Microdrive de 16 tetrodos móveis Labirinto linear/esteira 4/2

Rato 07 Microdrive de 16 tetrodos móveis Labirinto linear/esteira 1/X

Rato 08 Microdrive de 16 tetrodos móveis Labirinto linear/esteira 3/2

Rato 09 (Pirata) Microdrive de 8 tetrodos Labirinto linear/esteira 3/2

Rato 10 Microdrive de 16 tetrodos móveis Labirinto linear/esteira 0

X = Animais que perderam o implante ou que morreram antes de serem registrados

80

VII. Referências _________________________________________________________________________________

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93

VIII. Anexos: _________________________________________________________________________________

1. Anexo 1:

94

2. Anexo 2: Poster apresentado no House Symposium do Instituto do cérebro

em dezembro de 2016

95

3. Anexo 3: Colaboração em um capítulo de livro da editora Elsevier

96

4. Anexo 4: Desenvolvimento de um tutorial para a manufatura de microdrives

97

5. Anexo 5: Desenvolvimento de um sistema de realidade virtual (VR) para

roedores.

Aparte de tudo, comecei a desenvolver um projeto de realidade virtual (VR)

para experimento com roedores. Inicialmente a ideia era desenvolver um aparato

experimental de registro head fixed com roedores em uma superfície esférica,

onde um projetor preso na superfície reproduz a imagem para uma plataforma

côncava de pano. Um sistema de recompensa foi pensado para ficar preso

próximo da boca do animal. O ambiente virtual pensado foi um labirinto linear

rodeado de dicas espaciais para facilitar a localização do animal.

O labirinto linear foi desenvolvido em Unity/C#, que é uma linguagem muito

utilizada no desenvolvimento de jogos, o que proporciona uma boa realidade e

uma programação fácil de Inputs e outputs em hardwares (Figura abaixo).

98

6. Anexo 6: Poster apresentado no House Symposium do Instituto do Cérebro

em dezembro de 2017.

99

7. Anexo 7: Aparelho de privação de sono.

Em colaboração com Daniel Filho, aluno de doutorado do Laboratório de

Memória e Sono, ajudei a desenvolver um aparelho de privação de sono

programado manualmente pelo hardware. O sistema possui um algoritmo de

escolha de protocolo que permite selecionar tanto uma rotina já preexistente de

privação de horas de sono como uma escolha manual de horas de privação

(Figura abaixo). O sistema também possui um input para o MATLAB® que permite

a escolha do tipo de sono (ex: SOL, MRO e fase de transição) a ser privado.

O aparelho é composto por duas partes, a primeira é uma caixa revestida

por acrílico com dois motores na superfície. A segunda parte é onde se pode

programar o aparelho manualmente para algum protocolo e é composta por um

Arduino due, fonte 24 V, 2 relés, LCD, keyboard, 1 transistor, 2 conversores de

voltagem e um RTC (Real Time Clock) (Figura abaixo). A privação de sono do

animal ocorre a partir do acionamento dos motores que movimentam a caixa em 2

cm no intervalo de 100 ms. Os intervalos desses acionamentos ocorre a partir de

um dos protocolos escolhidos manualmente ou por meio do MATLAB®.

100

Algoritmo de programação: O algoritmo foi programado em um Arduino para que o pesquisador

escolha o protocolo de privação.

101

Aparelho de privação de sono: O aparelho é composto pela caixa de onde o animal vai dormir e

pelo hardware de programação.

102