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Santander S.P., Urueña C., Castañeda D., Cifuentes C., Aristizábal F., Cordero C., Fiorentino S., Influencia del ...

1 Estudiante de Doctorado en Ciencias Biológicas, Grupo de Inmunobiología y Biología Celular, PontificiaUniversidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

2 Profesora asistente, Departamento de Nutrición y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Pontificia Univer-sidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

3 Departamento de Farmacia, Grupo de Farmacogenética del Cáncer, Universidad Nacional de Colombia,Bogotá, D.C., Colombia.

4 Directora, Grupo de Inmunobiología y Biología Celular, Departamento de Microbiología, PontificiaUniversidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

Recibido: 26-01-2009 Revisado: 17-04-2009 Aceptado: 18-06-2009

Resumen

El estudio del perfil de expresión génica en las células eucariotas se constituye como unaherramienta importante en el entendimiento de las huellas moleculares generadas en res-puesta a un estímulo farmacológico. A partir de Petiveria alliacea, una de las plantascolombianas con actividad antitumoral, se ha obtenido la fracción FAST 8 7:3, en la cual sehan encontrado diferentes compuestos, como el trisulfuro de dibencilo, uno de los compo-nentes antitumorales más potentes reportados para la planta. Esta fracción también poseeactividad citotóxica sobre la línea de células tumorales K562 e induce cambios en el perfilde expresión de genes, que podrían estar relacionados de alguna forma con la actividadantitumoral tradicional reportada para esta planta. Esta actividad puede ser ejercida, enparte, por la presencia del trisulfuro de dibencilo y por la actividad de los otros componen-tes de la fracción. En este contexto, proponemos el uso del ADNc-AFLP como herramien-ta útil en la tamización del perfil de genes transcritos en las células tumorales y, también,como herramienta útil para el descubrimiento de nuevos fármacos antitumorales.

Palabras clave: AFLP, Petiveria alliacea, expresión diferencial de genes, fármacosantitumorales, productos naturales.

Influencia del tratamiento de Petiveriaalliacea en la expresión diferencial de

genes en células tumorales

SANDRA PAOLA SANTANDER1

CLAUDIA URUEÑA1

DIANA CASTAÑEDA1

CLAUDIA CIFUENTES1,2

FABIO ARISTIZÁBAL3

CLAUDIA CORDERO3

SUSANA FIORENTINO4

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Title

Differential gene expression in tumor cells inducedby Petiveria alliacea treatment

Abstract

Gene expression profile in eukaryotic cells is avery useful tool to understand the molecularfootprint responsible for the pharmacologicalresponse to a stimulus. In the present study afraction named FAST 8 (7:3), obtained fromPetiveria alliacea, was used as stimulus to trackout the gene expression profile on K562 cell line.P. alliacea is a plant that grows in Colombia, andin traditional medicine is used for its anti-tumoralactivity. Of the different compounds present in thefraction, dibenzyl trisulfide (DTS), is a compounddescribed by previous reports to have anti-tumoralproperties. The fraction exhibits cytotoxic activityover tumor cell line K562 inducing changes in geneexpression profile. DTS might be in partresponsible for the fraction activity, but the othercompounds may also contribute to the biologicalresponse. Herein, we propose the use of cDNA-AFLP as a useful tool for gene expression profilescreening of tumoral cells and in the discovery ofnew anti-tumoral drugs.

Key words: AFLP, Petiveria alliacea, genedifferential expression, antitumor drugs, naturalproducts.

Introducción

Las plantas han sido utilizadas porsiglos como fuente de medicina popu-lar para el tratamiento de diferentesenfermedades, pero sólo hasta ahora eseconocimiento tradicional comienza aser utilizado y estudiado en la medici-na moderna, redescubriendo medica-mentos para el tratamiento del cáncer.Un ejemplo de ello es el taxol, aisladode la planta Taxus brevifolia y caracte-

rizado de manera experimental comofármaco antitumoral, ya que tiene lacapacidad de unirse y desestabilizar losmicrotúbulos de diferentes líneas celu-lares tumorales[2]. Debido a esta acti-vidad, actualmente es usado en eltratamiento de cáncer de mama y deovario[3].

En Colombia, existen diferentesplantas que también tienen un inmen-so potencial farmacológico y que co-mienzan a ser estudiadas con el fin deencontrar nuevos productos que pue-dan utilizarse en la terapia antitumoral;una de ellas es Petiveria alliacea, co-nocida comúnmente como anamú. Estaplanta es cultivada en diferentes áreastropicales con propósitos medicina-les[4], como diurético, antiespasmó-dico, analgésico y antiinflamatorio[5,6]. Hasta el momento, se han venidorealizando diferentes estudios farma-cológicos con el fin de descifrar suspropiedades medicinales, las cualeshan confirmado su actividad inmuno-moduladora[7, 8], antimicótica[9],analgésica, antiinflamatoria[10, 11] yantitumoral[12].

La actividad antitumoral fue inicial-mente reportada en las fraccionesetanólicas, las cuales inducen citotoxi-cidad en diferentes líneas de célulastumorales[13]. Diversos componenteshan sido implicados como responsa-bles de la actividad antitumoral, comoel trisulfuro de dibencilo, que ejercediferentes efectos (antiproliferativos y

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citotóxicos) en células del neuroblas-toma[12].

Recientemente, nuestro grupo en-contró que una fracción no polar deP. alliacea induce apoptosis por la víamitocondrial y disminución de laHSP70, la cual puede ser protectoracontra la muerte celular (artículo enpreparación). Además, el análisis delproteoma de las células tumorales tra-tadas con fracciones obtenidas a par-tir de la purificación con acetato deetilo, ha demostrado un cambiometabólico importante que podría ex-plicar la muerte celular, unido a unaactividad sobre el citoesqueleto queinduce una detención de las células enla fase G2 del ciclo celular[13].

En la actualidad, el estudio del per-fil de la expresión genética en célulaseucariotas se constituye como una he-rramienta importante en el entendimien-to de las huellas moleculares de unavariedad de enfermedades huma-nas[14] y, también, se utiliza en la iden-tificación de genes expresados portejidos y células tratadas con diversosagentes farmacológicos[15]. Aunquelos mecanismos por los cuales P.alliacea ejerce una función antitumo-ral empiezan a ser estudiados, no sabe-mos si la expresión diferencial deproteínas[13] corresponde también auna expresión diferencial de genes osi, por el contrario, es el reflejo de unmanejo diferencial de las proteínas co-dificadas naturalmente por la célula.

El estudio de estos mecanismospermitiría diferenciar los blancos mo-leculares de la planta entre los facto-res reguladores del procesamientoposterior a la traducción de la degra-dación intracelular o los reguladoresde la expresión génica.

En este contexto, proponemos eluso del ADNc-AFLP basado en el po-limorfismo para la longitud de frag-mentos amplificados (amplifiedfragment length polymorphism, AFLP)como método de estudio rápido paraobservar el perfil de transcritos entrepoblaciones de ARNm de célulastumorales. Este método involucra latranscripción inversa de ARNm aADNc de doble cadena, seguida porla digestión con una enzima de res-tricción de amplio rango de corte(EcoRI) y un segundo corte con unaenzima dirigida contra secuenciasmenos frecuentes (MseI). Después dela digestión enzimática, se realiza laligación de adaptadores específicossobre el ADNc y el fraccionamientode esta mezcla se utiliza para la am-plificación selectiva por reacción encadena de la polimerasa (PCR); estosfragmentos se separan después engeles de alta resolución y se tiñen connitrato de plata[16, 17].

En el presente estudio encontramosque una fracción de P. alliacea, a laque denominamos FAST 8 7:3, pre-senta un compuesto muy citotóxico,previamente identificado en la plan-

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ta[18], que induce muerte en la líneatumoral K562, además de generar uncambio en el perfil de expresión degenes determinado por AFLP. Estoshallazgos podrían sugerir que el cam-bio en el proteoma de las células[13]correspondería a un cambio en la ex-presión de genes, lo que podría ser elorigen de su actividad antitumoral.

Materiales y métodos

Obtención de las fracciones dePetiveria alliacea

El material vegetal fue recolectadoen Viotá, Cundinamarca, e identifica-do por el biólogo Antonio Luis Mejíacomo P. alliacea. La planta se com-paró con la muestra del Herbario Na-cional Colombiano, con número deregistro 333406 del 12 de agosto de1991.

Las hojas secas y los tallos (300 g)fueron extraídos por reflujo (60°C) con1,5 litros de etanol al 96% por 3 ho-ras. El extracto etanólico fue filtradoy evaporado hasta la mitad de su vo-lumen, a presión reducida de 175mbares. Se añadió un volumen igualde agua destilada y se calentó a 65°Cpor 20 minutos con agitación constantepara permitir la floculación. El preci-pitado fue eliminado por filtración (pa-pel Wattman) y la fracción soluble seextrajo con acetato de etilo (EtOAc)exhaustivamente (7 veces), utilizandoun embudo de separación.

Análisis de la fracción FAST 8 porHPLC-MS/MS

Para la separación de la fracción, seutilizó una bomba HPLC Alliance2795 (Waters®, UK) con detectorultravioleta de diodos PDA 996(Waters®, UK), a las siguientes condi-ciones: Columna Symmetry (Waters)C18 � 2,1x150 mm � 5 µm +precolumna a 40°C; solventes: solven-te A (H2O + 0,1% HCOOH) y solventeB (CH

3OH + 0,1% HCOOH);

gradiente: 0 a 45 minutos de corridosolvente A al 60% y solvente B al 40%;de los 45 a 50 minutos de corrido sol-vente A al 0% y solvente B al 100%, yde 52 a 65 minutos de corrido solventeA al 60% y solvente B al 40%. Para elanálisis de la relación masa/carga (m/z)de los compuestos, se utilizó unespectómetro de masas con tiempo devuelo (LCT de MIcromasss®, UK) yelectrospray. Los análisis se realizaronen el Instituto de Productos Naturalesde Gif sur Yvette, Francia.

Mantenimiento y tratamiento de lascélulas tumorales

Para el estudio se utilizó la líneacelular K562 (eritroleucemia humana),obtenida de la American Type CellCulture (ATCC) Las células se man-tuvieron en medio RPMI 1640 consuplemento de suero fetal bovino(SFB) al 10%, 0,01 M de Hepes, 100µg de penicilina, 100 UI de estrepto-micina y 2 mM de glutamina (Eurobio,

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Francia), en atmósfera húmeda con5% de CO2.

La viabilidad de las célu-las se analizó con azul de tripano.

Determinación del efecto citotóxicode la fracción FAST 8 sobre célulasK562 (IC50)

Para los análisis de citotoxicidad, secultivaron 5x103 células K562 y se tra-taron con diferentes concentraciones dela fracción FAST 8 (125 a 0,9 µg/ml).Como control negativo, se utilizó etanolal 0,2% y como control positivo seagregaron diferentes concentracionesde vincristina (0,1 a 0,0008 µg/ml), por48 horas a 37ºC. Después del tratamien-to, las células se centrifugaron y seresuspendieron en medio RPMI 1640con suplemento sin rojo de fenol y setrataron por 4 horas a 37ºC con MTT, auna concentración final de 0,25 µg/ml[bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio] (MolecularProbes, Eugene, Oregon, USA). Des-pués de la incubación, los cristales deformazán se disolvieron con dimetil-sulfóxido (DMSO) y la absorbancia sedeterminó a 540 nm en un MultiskanMCC/340 (LabSystems). Finalmente, laconcentración inhibitoria 50 se calculóusando un análisis Probit (MINITAB®

Release 14.1. Minitab Inc. 2003Statistical Software).

Obtención del ARNm y síntesis delADNc

Para los ensayos de AFLP, se trata-ron 20x106 células K562 con 25 ìg/ml

de la fracción FAST 8. Después del tra-tamiento, las células se observaron almicroscopio para identificar posiblescambios morfológicos. El ARN total delas células K562 se obtuvo con trizol,siguiendo las recomendaciones delfabricante (GIBCO). Las muestras deARN se cuantificaron por espectrofo-tometría y se observaron en geles deagarosa al 1% teñidos con bromuro deetidio. El ARNm se aisló a partir delARN total, utilizando el kit de aislamien-to de ARNm PolyATract (Promega).

Para la construcción del ADNc, 1 µgdel ARNm se puso en contacto con 50ng/ml de cebadores aleatorios, 0,5 mMde dNTP, 0,005 M de DDT y 200 U dela enzima SuperScript III, en un volumenfinal de 20 µl (Invitrogen). La reacciónse llevó a cabo utilizando las siguientestemperaturas: 10 minutos a 25ºC, segui-da de 50 minutos a 50ºC y una reacciónterminal de 70ºC por 5 minutos. Para lasíntesis de la segunda cadena, se utiliza-ron 5 U de E. coli ligasa, 20 U de E. colipolimerasa I (New England Biolabs),200 µM de dNTPs y 1 U de RNasa H(Invitrogen), en un volumen final de28 µl. La reacción se llevó a cabo por 2horas a 16ºC. La purificación del ADNcde doble cadena se llevó a cabo utilizan-do fenol:cloroformo:isoamílico en una re-lación de 25:24:1 (Clontech).

Análisis de ADNc-AFPL

Para los análisis de AFPL, el ADNcde doble cadena se incubó con 0,5 U

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de EcoRI y MseI, según las condicio-nes del fabricante (Invitrogen). Se in-cubaron 10 µl de los productos dedigestión con 5 pmol de los adaptadorespara EcoRI y MseI, con el fin de gene-rar secuencias para la amplificación delADNc. Para las preamplificaciones, seutilizaron cebadores con una base deselección en el extremo 3�. La mezclautilizada contenía 50 ng de ADNc, 20µl de la mezcla de iniciadores de pream-plificación, PCR solución tampónAFLP 1X y taq polimerasa a 0,04 U/µl, en un volumen final de 25 µl. Conesta mezcla se realizó la PCR, con elsiguiente perfil de amplificación: 94°Cpor 30 segundos (s), 56°C por 60 s y72°C por 60 s, por 20 ciclos. Los pro-ductos de amplificación se visualiza-ron en geles de agarosa al 1% teñidoscon bromuro de etidio.

Para las amplificaciones selectivas,se utilizaron cebadores, que poseenla misma secuencia de los utilizadosen la preamplificación, más tres ba-ses de selección en los extremos 3�(Invitrogen-AFLP analysis system II)(tabla 3).

Análisis del gel

Para observar los cambios en elperfil de expresión de genes, la mues-tra obtenida de la PCR selectiva se di-luyó con 20 µl de una solución deformamida al 98%, EDTA 10 mM,azul de bromofenol y cianol de xileno,la cual fue calentada por 5 minutos a

95ºC y colocada en hielo inmediata-mente. La muestra se corrió en gelesde secuenciación de poliacrilamida al6% (acrilamida:bisacrilamida 20:1,urea 6 M y solución tampón TBE 1X)y teñidos con nitrato de plata (Invitro-gen-AFLPs analysis system II).

Resultados

Obtención y análisis de lacomposición química del FAST 8

Durante el proceso de purificacióndel extracto de P. alliacea, se obtu-vieron tres fracciones denominadas(1:1), (7:3) y (9:1), a las que se lesdeterminó su actividad citotóxica so-bre la línea de células tumorales K562.Los resultados obtenidos muestran quela fracción 7:3, llamada FAST 8, in-duce mayor cambio morfológico yposee mayor actividad citotóxica so-bre las células tumorales que las otrasfracciones obtenidas para la P. alliacea(no se presentan los datos). Por lo tan-to, esta fracción fue la seleccionadapara continuar con los ensayos bioló-gicos.

Mediante el análisis de la actividadcitotóxica, se estableció la concentra-ción a la cual el 50% de las célulastumorales se encontraban vivas y elotro 50%, muertas (IC50); se calculópara la fracción y se encontró una con-centración correspondiente a 81,58 µg/ml (tabla 1).

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Teniendo en cuenta este resultado,se establecieron concentraciones pordebajo de la IC50 que nos permitie-ron observar el efecto de la fracción.Para el trisulfuro de dibencilo, uno delos compuestos reportados y presen-tes en la fracción, en el 2007, Williamsreferencia los valores de IC50 en di-ferentes líneas tumorales como: neu-roblastoma SH-SY5Y (0,12 µg/ml),carcinoma mamario MCF7 (0,62 µg/ml) y (1,8 µg/ml), melanoma IPC (0,81µg/ml), carcinoma primario de mama(5,27 µg/ml), leucemia de célulasJurkat (0,09 µg/ml), fibrosarcomaHT1080 (0,53 µg/ml), cáncer de pul-món de células grandes H460 (1,4 µg/ml), mama M231 (0,672 µg/ml) yadenocarcinoma HeLa (0,7 µg/ml).

Al comparar estos valores con losobtenidos para nuestra fracción en lalínea K562, encontramos menor acti-vidad citotóxica en la fracción y, aun-que el trisulfuro de dibencilo es unode los compuestos mayoritarios en lamisma, ésta posee componentes adi-

cionales que podrían disminuir su toxi-cidad, pero que también actuarían so-bre otros blancos en la célula tumoral.

En el análisis del espectro de masasobtenido para la fracción, se observóla presencia de 14 relaciones masa/carga (m/z). En ellas se encontrarontres compuestos con relaciones demasas 278, 298, y 314, que correspon-dían a compuestos previamente identi-ficados y reportados para P. alliacea,como el trisulfuro de dibencilo[18],7-demetil leridal y leridal o petiveral,respectivamente[19, 20] (tabla 2).

Tabla 1IC50 de la fracción de P. alliacea FAST 87:3 en la línea celular K562. Las células

K562 fueron tratadas con diferentesconcentraciones de FAST8 7:3 y el IC50

del extracto fue calculado usando unanálisis Probit (MINITAB® Release14.1. Minitab Inc. 2003 Statistical

Software)

IC50 (mg/ml)

Vincristina FAST8 7:3

K562 1,07 81,58

Tabla 2Caracterización de la fracción FAST 8 por HPLC-MS/MS. La fracción FAST8 fuesometida a un análisis por HPLC-MS/MS para identificar los posibles compuestos

presentes en ésta. Para el análisis de la relación masa/carga (m/z) de los compuestos,se utilizó un espectrómetro de masas con tiempo de vuelo

(LCT de MIcromasss®, UK) y electrospray

Tiempo de retención m/z Compuestos identificados(minutos) por derreplicación

30,65 314 Leridal/petiveral

33,41 298 Leridal 7 demeti

48,36 278 Trisulfuro de dibencilo

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Las relaciones masa/carga (m/z) co-rrespondientes a 238, 281, 294, 308,316, 330, 344, 514, 530, 676 y 692,no se pudieron correlacionar con nin-gún compuesto reportado previamen-te para la planta. El trisulfuro dedibencilo encontrado en el FAST 8 esuno de los compuestos con mayor ac-tividad biológica reportada inmuno-moduladora como la actividadcitotóxica y la antiproliferativa en lí-neas de células tumorales �por dismi-nución de la fosforilación de cinasas�y la actividad inmunomoduladora[12,21, 22]. Para compuestos como el 7-demetil leridal, leridal y petiveral, nose ha reportado ninguna actividad bio-lógica específica.

La fracción FAST 8 inducecambios en el perfil de expresióngénica de las células K562

El cultivo de células tumorales enlas condiciones empleadas nos permi-tió conseguir una concentración sufi-ciente de ARN total con la calidadóptima para obtener hasta 1 µg deARNm. Las condiciones utilizadaspara la síntesis de la primera y segun-da cadenas de ADNc han sidooptimizadas para realizar las respecti-

vas digestiones y ligaciones con losadaptadores blancos de la preamplifi-cación y, por consiguiente, poder rea-lizar las amplificaciones selectivasnecesarias para implementar la técni-ca de ADNc-AFLP.

El análisis de estas amplificacionescon las diferentes combinaciones decebadores nos ha llevado a encontrarmezclas que permiten obtener un per-fil de expresión de diferentes genes enlas células K562, que puede ser anali-zado utilizando la técnica de ADNc-AFLP (tabla 4).

La visualización de estas amplifi-caciones en los geles de poliacrila-mida nos permitió encontrar lascombinaciones con las que se puedeobtener un perfil de expresión dife-rencial de genes (figura 1). Por ejem-plo, la combinación del iniciadorE-AAC y el M-CAC fue la óptimapara comparar la expresión de los di-ferentes genes en las células K562.Como se muestra en la figura 1 (ca-rril 16), se encontraron 21 genes ex-presados diferencialmente en lascélulas tratadas con la fracción FAST8, al comparar las células tratadas conel control negativo.

Tabla 3Cebadores seleccionados para la amplificación selectiva del ADNc de

la línea tumoral K562

M-CAA M-CAC M-CAG M-CAT M-CTA M-CTC

E-AAC Ö Ö Ö Ö Ö Ö

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Tabla 4Combinación de cebadores que amplifican el ADNc y permiten la observación de unperfil de expresión diferencial de genes en las células K562 tratadas con el extracto

FAST 8

M-CAA M-CACM-CAGM-CAT M-CTA M-CTC

E-AAC Ö Ö Ö x Ö Ö Ö

Bandas observadas Nuevas 10 21 5 9 14 21Aumentadas 3 0 5 1 5 2Disminuidas 4 4 0 0 2 1No expresadas 7 3 0 7 15 6

x: no recomendado

Figura 1. Análisis de la expresión diferencial de genes por ADNc-AFLP en las célulastumorales K562 tratadas con el extracto FAST 8 de Petiveria alliacea. Las células

tumorales K562 fueron tratadas por 24 horas con 25 mg/ml del extracto FAST 8 obtenidode Petiveria alliacea. Las amplificaciones selectivas se realizaron utilizando la siguientecombinación de cebadores: M-CAA, K562 tratadas con el solvente (KS) (línea 4) y K562tratadas con FAST 8 (KFAST8) (línea 5); M-CAC, KS (línea 6) y KFAST8 (línea 7); M-CAG, KS (línea 8) y KFAST8 (línea 9); M-CAT, KS (línea 11) y KFAST8 (línea 12); M-

CTA, KS (línea 13) y KFAST8 (línea 14); M-CTC (línea 15) y KFAST8 (línea 16). Controlpositivo: ADN tomate digerido con EcoR I con el cebador M-CAA (línea 1), M-CAC

(línea 2); marcador de peso molecular (línea 3, 10 y 17).

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La identificación de los genes ex-presados diferencialmente está siendoevaluada por nosotros actualmente; sinembargo, ésta es la primera demostra-ción de que un extracto de P. alliacea,utilizada tradicionalmente para el tra-tamiento de algunas enfermedadescomo el cáncer, actúa sobre la célulatumoral induciendo cambios genéticosque pueden atribuirse a la presenciade uno de los compuestos encontra-dos en esta fracción, como lo es eltrisulfuro de dibencilo, consideradoprincipal componente activo lipofílicode la P. alliacea[18].

Conclusiones

Petiveria alliacea, comúnmenteutilizada en la medicina tradicional enAmérica, el Caribe, Estados Unidos yÁfrica, es una de las plantas con ma-yor potencial farmacológico en nues-tro país y a nivel mundial, ya que hasido seleccionada entre 14.000 extrac-tos de plantas como una de las 34candidatas con potencial antitumoralpor la Universidad de Illinois[23].

Los resultados obtenidos en esteestudio demuestran que el extractocompleto de la P. alliacea obtenido ennuestro laboratorio, presenta actividadcitotóxica en la células K562 y con-tiene tres compuestos, con masas de278, 298, y 314, que corresponden acompuestos previamente identificadosy reportados para P. alliacea, comotrisulfuro de dibencilo[18], 7-demetil

leridal y el leridal o petiveral, respec-tivamente[19, 20].

El trisulfuro de dibencilo se consi-dera el principal compuesto activocontra el cáncer, presente en la plan-ta, ya que su mecanismo de acción hasido estudiado en diferentes célulastumorales, entre ellas las de neuroblas-toma, en las que se ha observado dis-minución en la defosforilación de lasMAPcinasas y, también, desestabiliza-ción de la forma normal en la que seencuentran los microtúbulos del ci-toesqueleto, sin afectar la dinámica dela áctina, pero inhibiendo la prolifera-ción de las células[12]. El trisulfuro dedibencilo también posee actividadcitotóxica sobre líneas tumorales comolas del sarcoma TE671, el carcinomamamario MCF-7, el melanoma IPC, elcarcinoma primario de vejiga 5637 yel cáncer de pulmón[22].

En cuanto la expresión de genes,también se ha encontrado que el tri-sulfuro de dibencilo puede regularpositivamente la expresión de E-caderina en células de neuroblastomaSH-SY5YTRK-A tratadas previamentecon factor de crecimiento nervioso(NgF)[25]. La molécula de adhesióncelular E-caderina es un componenteprimordial en la interacción célula-cé-lula y se encuentra notablemente au-sente o disfuncional en muchos de loscarcinomas epiteliales o de mama másagresivos, indiferenciados y avanza-dos; la pérdida de esta molécula se ha

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visto relacionada de manera impor-tante en la transición de tumoresepiteliales benignos a estados invasi-vos[26]. Por lo tanto, como se repor-ta, el trisulfuro de dibencilo tienediferentes blancos citotóxicos en lascélulas tumorales, no sólo por su ac-ción directa a nivel de microtúbulos,sino también, a nivel molecular al in-ducir la expresión de genes importan-tes relacionados con el estado invasivode la célula tumoral.

La demostración de la existencia deuna expresión diferencial de genes porlas células tumorales tratadas con lafracción FAST 8, sugiere la actividadespecífica del extracto de la planta so-bre la línea celular K562. La identifi-cación de los genes que se encuentranregulados positiva o negativamente, nospermitirá dilucidar los blancos molecu-lares específicos por los que P. alliaceainduce su actividad antitumoral.

La validación de la actividad bioló-gica de la planta sentará las bases cien-tíficas del conocimiento tradicional y,asimismo, conducirá al desarrollo denuevos medicamentos derivados deproductos naturales que podrán ser uti-lizados en la terapia antitumoral o comoadyuvantes de la terapia convencional.

Agradecimientos

Agradecemos la valiosa colabora-ción de la doctora Pilar Márquez yGina Paola Solano de la unidad de

Biotecnología Vegetal. Pontificia Uni-versidad Javeriana.

Fuente de financiación

Este trabajo fue parcialmente finan-ciado por la Vicerrectoría Académicade la Pontificia Universidad Javerianay la Fundación Terry Fox. SandraPaola Santander y Claudia Urueña sonbecarias del programa de doctorado deColciencias.

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