HEME SPIN RENDAH SITOKROM OKSIDASE C SEBAGAI

PENDORONG PROSES POMPA PROTON

Oleh:

Anne Carolina (20504011)

Eka Wulandari (20504012)

PROGRAM MAGISTER KIMIA

BIDANG KHUSUS BIOKIMIA

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2005

ABSTRAK

Sitokrom c oksidase mitokondria berperan pentingdalam respirasi seluler aerob, mereduksi oksigenmenghasilkan air, dalam proses kopling dengan pompahidrogen melewati membran mitokondria dalam. Residuaspartat, Asp-51, yang 0berlokasi dekat permukaanenzim, mengalami perubahan struktur dalam Sinar-X. Halini mengindikasikan bahwa residu ini berperan dalamproses pemompaan proton. Meskipun bukti keterlibatanmekanistik dan fungsional dari residu ini dalam prosespemompaan proton belum jelas diperoleh, mutasi Asp-52 Asn dari enzim hati memperlihatkan fungsi pompaproton tanpa mempengaruhi aktivitas reduksi dioksigen.Struktur Sinar-X (pada resolusi 1.8/1.9 Å dalam bentukteroksidasi dan reduksi penuh) menunjukkan bahwa muatanpositif total yang dibentuk selama oksidasi mendorongtransport proton aktif dari ruang mitokondria ke Asp-51melewati enzim lewat saluran air dan jaringan ikatanhidrogen, yang berlokasi di tandem. Selain itu reduksienzim menginduksi pengeluaran proton dari aspartat kemitokondria bagian luar. Ikatan peptida dalam jaringanikatan hidrogen menginhibisi transfer balik proton

melalui jaringan. Perubahan redoks dalam kapasitassaluran air, diinduksi oleh gugus hidroksi farnesiletil dari heme spin-rendah. Hal ini mengindikasikanbahwa fungsi saluran air sama efektifnya dengan daerahpengumpul proton. Hasil infrared mengindikasikan bahwakonformasi Asp-51 dikontrol hanya oleh bentuk oksidasiheme spin rendah. Hasil ini mengindikasikan bahwa hemespin rendah mendorong proses pompa proton.

BAB I

PENDAHULUAN

Sitokrom c oksidase yang berlokasi di bagian dalam

membran mitokondria merupakan enzim kunci pada rantai

respirasi organisme aerob. Enzim ini berfungsi dalam

katalisis transfer elektron dari sitokrom c ke oksigen

molekular, sehingga terjadi reduksi menjadi air. Reaksi

ini terjadi melalui proses transport, yaitu melalui

pemompaan empat proton melewati membran. Sitokrom c

oksidase memiliki empat kofaktor reaksi redoks yang

aktif, yaitu dua atom Cu pembentuk, dinamakan CuA,

suatu heme a spin rendah, serta pusat binuklir heme a3

dan Cu B. Cu A menerima elektron dari sitokrom c dan

elektron ditransfer melalui heme a ke pusat binuklir

tempat terjadinya reduksi oksigen.

Kesetimbangan elektron dicapai dari sitokrom c di

luar membran dalam mitokondria (ruang inter membran)

melalui sisi Cu A dan heme spin rendah (heme a) ke sisi

reduksi O2. Proton yang digunakan untuk pembentukan air

dari O2, ditransfer dari membran dalam mitokondria

(ruang matriks) melalui dua jaringan ikatan hidrogen

yang disebut jalur K dan D. Selain dalam proses pompa

proton, transfer proton dan elektron ke sisi reduksi

O2 menghasilkan perpindahan muatan positif ke ruang

intermembran, yang menghasilkan gaya proton motive yang

diperlukan untuk menggerakkan ATP sintase.

Mutasi residu asam amino di dalam jalur D dapat

menyebabkan penurunan dalam efesiensi pompa proton dan

penurunan aktivitas reduksi O2. Pengamatan menunjukkan

bahwa proses yang menyertai pompa proton terjadi

melalui jalur proton untuk membentuk air. Struktur

Sinar-X memperlihatkan bahwa sitokrom c oksidase dari

hati sapi dalam bentuk teroksidasi dan tereduksi penuh

pada resolusi 2.3 dan 2.35 Å, menunjukkan adanya

pergerakan Asp-51 dari subunit I (subunit paling besar

yang mengandung heme a dan sisi reduksi O2) dari

interior protein menuju permukaan inter membran melalui

reduksi enzim. Dalam bentuk teroksidasi, Asp-51

berkontak dengan ruang matriks melalui jaringan ikatan

hidrogen sehingga molekul air dapat melewati ruang

dalam matriks (jalur H). Struktur ini memberikan

gambaran bahwa proses pompa proton terjadi pada Asp-51.

Akan tetapi usulan mengenai hal ini belum banyak

diterima, karena enzim bakteri dan tumbuhan tidak

mempunyai residu analog Asp-51 (penomoran dalam sapi)

dan juga karena mutasi jalur D menyebabkan penurunan

efisiensi pompa proton dan aktivitas reduksi O2. selain

itu tidak ada mekanisme untuk penggerak pompa proton

pada Asp-51 yang menjelaskan. Mutasi Asp-51 memberikan

satu alternatif untuk menjelaskan fungsi Asp-51. Dalam

penelitian ini akan dijelaskan peranan jalur H melalui

sisi mutagenesis terarah, struktur Sinar-X dan

spektroskopi infra merah.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Semua tahap-tahap enzimatis pada degradasi

oksidatif karbohidrat, lemak dan asam amino didalam sel

aerobik menyatu menjadi tahap akhir respirasi sel.

Disini terjadi pengaliran electron dari senyawa organik

menuju oksigen, menghasilkan energi untuk membuat ATP

dari ADP dan fosfat. Rantai respirasi terdiri dari

serangkaian protein dengan gugus prostetik yang terikat

kuat dan mampu menerima dan memberikan elektron.

Pada sel eukariot, hampir semua dehidrogenase

spesifik yang diperlukan pada oksidasi piruvat dan

bahan bakar lain melalui siklus asam sitrat terletak

pada bagian sebelah dalam mitokondria yaitu matriks.

Molekul pemindah electron dari rantai respirasi dan

molekul enzim yang melakukan sintesa ATP dari ADP dan

fosfat terbenam dalam membran sebelah dalam. Bahan

bakar siklus asam sitrat seperti piruvat, harus

dipindahkan dari sitosol (tempat dilakukannya sintesis

molekul-molekul tersebut) melalui membran mitokondria

ke dalam bagian matriks disebelah dalam, sebagai tempat

aktivitas dehidrogenase.

Demikian pula, ADP yang dibentuk dari ATP selama

aktivitas yang memerlukan energi dari sitosol harus

dipindahkan ke dalam matriks mitokondria, untuk

mengikat fosfat kembali, menjadi ATP. ATP baru yang

dibentuk harus dikembalikan ke sitosol.

Jadi membran mitokondria sebelah dalam, merupakan

struktur komplek yang mengandung molekul pembawa

electron, sejumlah enzim dan beberapa system transport

membran.

Gambar Proses Fosforilasi Oksidatif dalam

Mitokondria

Beberapa jenis gugus pembawa elektron, semuanya

berikatan dengan protein. Golongannya antara lain

Nikotinamida adenin dinukleotida (NAD) yang aktif

dengan dehidrogenase; flavin mononukleotida (FMN) pada

NADH dehidrogenase;ubiquinon atau koenzim Q, suatu

senyawa kuinon isoprenoid yang larut dalam lemak, yang

berfungsi dalam bentuk ikatannya dengan satu atau lebih

protein; dua jenis protein yang mengandung pusat besi-

sulfur (Fe-S) sitokrom; dan tembaga pada sitokrom aa3.

Senyawa sitokrom adalah protein mengandung besi

pemindah elektron dan berwarna merah atau coklat, yang

bekerja secara berurutan untuk mengangkut elektron dari

ubikuinon ke molekul oksigen. Golongan ini merupakan

protein heme, dengan besi yang berada pada kompleks

porfirin-besi, atau heme, yang serupa dengan pada

hemoglobin.Terdapat tiga kelas sitokrom, a, b, dan c

yang berbeda dalam spektra absorbsi sinarnya. Setiap

jenis sitokrom dalam keadaaan tereduksinya atau ferro

memiliki tiga pita absorbsi yang jelas pada kisaran

sinar tampak.

Sitokrom pada rantai respirasi disusun dalam urutan b

c1 aa3. Sitokrom b berada dalam dua bentuk,

menerima elektron dari ubikuinon dan memindahkannya ke

sitokrom c1 yang selanjutnya memberikan elektron yang

diterima ke sitokrom c. Setiap sitokrom berada dalam

bentuk feri [Fe(III)] menerima satu elektron menjadi

bentuk fero [Fe(II)]. Pembawa elektron terakhir adalah

sitokrom aa3 atau oksidase sitokrom yang dapat

memberikan elektron langsung ke oksigen untuk

menyempurnakan proses transport elektron.

Sitokrom aa3 berbeda dengan sitokrom lain. Protein ini

mengandung dua molekul heme A yang terikat kuat, yang

berbeda dari protoheme oada hemoglobin, dalam cincin

porfirinnya, yang memiliki rantai sisi hidrokarbon yang

panjang. Lebih jauh lagi sitokrom aa3 juga mengandung

dua atom tembaga yang esensial. Setelah komponen

sitokrom a menerima elektron dari sitokrom c dab

tereduksi menjadi bentuk Fe(II), molekul ini memberikan

elektronnya ke sitokrom a3. Sitokrom a3 tereduksi lalu

memberikan elektron kepada molekul oksigen. Unsur yang

berpartisipasi dengan kedua gugus heme didalam proses

ini adalah kedua atom tembaga yang terikat, yang

mengalami perubahan redoks kupro-kupri [Cu(I)-Cu(II)]

dalam fungsinya. Ini adalah suatu tahap yang kompleks

dan penting di dalam transport elektron, karena ke

empat elektron harus diberikan hampir bersamaan kepada

O2 untuk menghasilkan dua H2O, dengan mengambil empat H+

dari medium cair. Dari semua anggota rantai transport

elektron, hanya sitokrom aa3 yang dapat bereaksi

langsung dengan oksigen.

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Mutagenesis Terarah (Site-directed Mutagenesis)

Jumlah sitokrom c pada mitokodria ditentukan

menggunakan western blot. Sejumlah sampel dijalankan

pada on 4–12% Mes NuPage gels (Novex) selama 42 menit

pada 200V dan 40C. Kemudian electrotransfer basah ke

membran nitroselulosa menggunakan sistem Novex dengan

5% metanol pada buffer transfer selama 1 jam pada 30V.

Efisiensi transfer dipertegas dengan noda transfer awal

pada gel dan membran menggunakan EasyStain (Novex) and

Ponceau S.

Membran residu noda dicuci menggunakan Tris-

buffer saline dengan 0.2% Tween- 20 (TBS-T),yang diblok

semalam menggunakan 1.5% susu bubuk pada TBS-T.

Sitokrom c ditandai menggunakan imunoglobulin antibodi

sitokrom c oksidasi dari tikus dengan pengenceran 1 :

2000 dengan TBS-T dengan 1,5% selama 1 hari. Inkubasi

selanjutnya menggunakan secondary anti tikus Ig

berikatan dengan horseradish peroxidase (Amersham) pada

pengenceran 1:2000 selama 40 menit, pitanya

divisualisasikan menggunakan reagen luminol dan film

sinar-x.

3.2 Pemurnian Sitokrom c Oksidase dari Hati Sapi dan

Kristalisasi

Penyiapan pemurnian enzim dengan rekristalisasi

berulang adalah pengkondisian kristalisasi enzim yang

sangat penting. Kristal dalam bentuk reduksi penuh dan

bentuk reduksi ikatan-CO dimulai dengan merendam bentuk

teroksidasi penuh dengan medium yang mengandung

askorbat dan sejumlah katalitik sitokrom c sebagai

sistem pereduksi dan polietilen glikol (PEG 4000) untuk

menstabilkan kristal dibawah atmosfer N2 dan CO.

Difraksi sinar-X dilakukan dengan cara menempatkan

kristal pada kapiler yang sesuai dengan medium

perendaman.

Keadaan teroksidasi dan keadaan pengikatan ligan

dari enzim dipertegas dengan spektra absorpsi

darikristal ini pada kondisi medium yang sama.

Bentuk azida disiapkan dengan merendam kristal pada

keadaan teroksidasi penuh ke dalam buffer yang

mengandung azida dan jumlah PEG 4000 yang sesuai pada

keadaan aerobik. Data intensitas diambil menggunakan

radiasi synchroton pada 1.0 Å Photon Factory, Tsukuba,

Japan, dengan modified Weissenberg camera untuk

makromolekul.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Mutagenesis Asp-51 dalam Subunit I Hati Sapi

Sitokrom c Oksidase

Subunit I Asp-51 digantikan oleh Asn melalui

metode pembentukan hibrid. Vektor ekspresi dibuat

untuk memproduksi, di dalam sitosol sel HeLa, yang

mengkode subunit I dari enzim sapi dengan signal targeting

mitokondria pada terminal N- dan ekor heksahistidin

pada terminal C-, untuk penentuan kuantitatif subunit I

yang terekspresi. Struktur Sinar-X menunjukkan bahwa

terminal C subunit I mempunyai ruang yang cukup untuk

menerima tag (ekor) His tanpa mempengaruhi konformasi

enzim.

Efisiensi produksi enzim hibrid sapi/manusia

dievaluasi dengan antibodi yang spesifik. Seperti yang

ditunjukkan oleh analisis western blot dari SDS

mitokondria hati sapi dan Sel HeLa. Antibodi Subunit I

sapi menunjukkan pita yang jelas tapi tidak pada

Subunit I manusia (Fig. 1A, garis 1 dan 2). Antibodi

untuk protein manusia hanya bereaksi dengan Subunit I

manusia tapi tidak dengan Subunit I sapi (Fig 1A, garis

3 dan 4).

Gambar 1A. Pengaruh mutasi sub unit I Asp-51 3 Asn(Asp51Asn) pada fungsi sitokrom c oksidase.Mitokondria dari hati sapi (jalur 1 dan 3) dansel HeLa (jalur 2 dan 4) diperlakukan 4% SDS3,5M urea dan difraksinasi menggunakan SDSPAGE. 70 gram sampel protein dimasukkankecuali untuk jalur 1 (20gram protein).Antibodi untuk subunit I sapi digunakan untukjalur 1 dan 2, antobodi sub unit 1 untukmanusia digunakan jalur 3 dan 4.

Dodesil maltosida melarutkan sitokrom c okidase

dari membran mitokondria tanpa mendenaturasi protein

dan menghasilkan pita 210 kDa dari Sitokrom c oksidase

dalam blue native PAGE. Antibodi sapi bereaksi dengan

fraksi 210 kDa dari mitokondria yang larut dalam

dodesil maltosida. Fraksi ini diisolasi dari sel HeLa

transfektan gen sapi wild-type (Fig 1B, garis 2).

Gambar 1B. Hasil gel elektroforesis di fraksinasidengan 1,4% dodesil maltosidesolubilizedmetokondria dari tiruan-transfektan sel HeLa(jalur 1,4 dan 6) dan dari sel HeLamenempatkan wild type (jalur 2 dan 5) dan subunit I gen mutan Asp51Asn (jalur 3 dan 7)dari sitokrom c oksidase. Pada jalur 1,2, dan3,180,90 dan 90 gram protein diberikan secaraberturut-turut. Pada jalur 4-7 ditambahkan 70gram protein. Anyibodi spesifik sub unit Iuntuk sapi digunakan jalur 1-3 atau manusiapada jalur 4-7.

Fraksi yang berhubungan diambil dari suatu sel

transfektan oleh vektor yang tidak membawa gen subunit

I (mock-transfected cell line) tidak menghasilkan pita yang

analog (Fig.1B, garis 1). Disamping itu antibodi

manusia bereaksi dengan fraksi dari mock-transfected cell line

(Fig 1B, garis 4 dan 6). Kemudian hasil menunjukkan

bahwa subunit I sapi tersusun oleh subunit manusia.

Keberadaan pita yang lemah dari fraksi 210 kDa

mitondria yang larut dari garis cell transfected gen sapi

wild-type (Fig. 1B, garis 5) menunjukkan bahwa subunit

I manusia tidak sempurna digantikan oleh subunit I

manusia dalam cell transfected. Jumlah residu dari

nonhibrid enzim ditentukan secara kuantitatif dengan

membandingkan intensitas pita dari pita 210 kDa dari

mock-transfected dan gen wild-type transfected cell seperti

dijelaskan dalam metode yaitu menjadi sekitar 20% (Fig.

1B, garis 4 dan 5). Pita yang ditunjukkan dalam Fig. 1B

yaitu pita blue native PAGE, tidak sejelas pita hasil

SDS PAGE. Spektrum sinar tampak dari mitokondria yang

larut dalam dodesil maltosida dan mitokondria tereduksi

penuh dari gen wild-type sel transfektan menunjukkan

suatu - pita pada 640 nm, yang karakteristik bagi

sitokrom c oksidase natif. Tidak ada komponen

mitokondria yang mempunyai absorbansi signifikan pada

604 nm selain sitokrom c oksidase.

Selanjutnya, preparasi enzim hibrid yang larut

memperlihatkan aktivitas enzim spesifik (laju oksidasi

ferositokrom c per molekul enzim) yang sama tinggi

dengan enzim preparasi yang larut dari sel transfektan

tiruan. Spektrum dan aktivitas enzim dari enzim hibrid

memberikan bukti kuat bahwa enzim hibrid membawa

konformasi natif. Sel transfektan dengan gen subunit I

yang termutasi Asp51Asn memperlihatkan efisiensi

produksi enzim hibrid yang sama, seperti halnya sel

transfektan gen wild-type pada garis diatas (Fig. 1B,

garis 2 dan 3). Spektrum absorpsi dan aktivitas

transfer elektron dari preparasi yang bersifat larut

juga sama identik dengan enzim hibrid wild-type. Hasil

ini menunjukkan bahwa mutasi Asp51Asn tidak mengganggu

struktur 3D enzim.

Aktivitas transfer elektron dan pompa proton dari

enzim hibrid dalam mitokondria ditentukan dengan

mengukur laju oksidasi sitokrom c dan pengeluaran

elektron oleh preparasi mitoplast dengan keberadaan

beberapa reagen pemblok aktivitas komponen mitokondria

lain, termasuk valimisin dan KCl untuk eliminasi

potensial membran. Reaksi dimulai dengan penambahan

ferrositokrom c. Oksidasi ferositokrom c ini kemudian

diinhibisi oleh 1mM sianida. Sampel mitoplast yang

mengandung subunit I sapi wild-type mengalami asidifikasi

awal diikuti dengan alkalinisasi yang menyebabkan

reduksi oksigen dan proses pemompaan proton (Fig. 1C,

WT).

Gambar 1C Pengeluaran proton oleh sampel mitoplast(44.7g protein) dari sel HeLa transfektandengan gen wild-type (WT) dan gen subunit Imutan Asp51Asn (D51N) setelah penambahan 8.1nmol ferositokrom c. perubahan konsentrasiproton dengan keberadaan 10nmol karbonilsianida p-trifluorometoksifenil hidrazon

(FCCP) per mg protein mitoplast yangditunjukkan dengan +FCCP

Kurva yang sama diperoleh dari sampel sel

transfektan tiruan (tidak ditunjukkan). Karbonil

sianida p-trifluorometoksi fenilhidrazon (FCCP)

memindahkan asidifikasi awal (Gambar 1C, WT + FCCP).

Adaptasi awal alkalinisasi dengan keberadaan FCCP

menunjukkan bahwa alkalinisasi karena reduksi O2

diabaikan dalam 4 detik pertama. Kemudian kecepatan

pengeluaran proton dapat ditentukan dari fase linear

dalam 4 detik pertama setelah inisiasi reaksi.

Perkiraan kuantitatif proton dan elektron yang

ditransfer dalam 5 detik pertama adalah 0.96 nmol

proton (Gambar 1C, WT) dan 1.17 nmol ekuivalen

electron. Hal ini berarti perbandingan H+/ e- adalah

sekitar 0.82. Tiga pengukuran lain menggunakan sampel

mitoplast, termasuk subunit I wild-type sapi dari garis

sel yang sama, memberikan perbandingan 0.83, 0.58, dan

0.79. Harga ini sama dengan hasil dari sampel mitoplast

yang dibuat dari garis sel trasnfektan tiruan (0.85 dan

0.82). Selain itu harga yang sama juga ditunjukkan oleh

enzim mamalia lain. Hasil ini juga menunjukkan bahwa

konformasi natif enzim ada pada enzim hibrid. Preparasi

mitoplast termasuk juga mutan Asp51Asn dari subunit I

sapi tidak menunjukkan adanya asidifikasi awal (Gambar.

1C, D51N). Asidifikasi juga tidak terlihat dengan

keberadaan FCCP (Fig.1C, D51N + FCCP). Mutan mitoplast

memperlihatkan oksidasi ferrositokrom yang sensitif

terhadap sianida pada laju yang lebih cepat sekitar 70%

dari wild-type. Kandungan residu enzim manusia (sekitar

20%) terlalu rendah untuk mendeteksi proses pompa

proton pada kondisi percobaan ini. Hasil ini dipertegas

oleh data yang diperoleh dari garis sel transfektan

gen wild-type dan tiga garis sel transfektan gen mutan

Asp51Asn yang berbeda.

Hipotesis endosimbiosis yang diterima secara luas

yaitu bahwa asal muasal organel menyebutkan gen asal

ditransfer ke inti selama evolusi. Subunit I dan

sitokrom b yang memiliki 12 dan 8 transmembran -

heliks, dikode oleh DNA mitokondria oleh semua

organisme eukariot. Pemindahan yang terlihat berhasil

dari subunit I ke mitokondria adalah bahwa daerah

hidrofobik merupakan alat yang mencegah subunit I dab

sitokrom b mengalami transfer dari genom mitokondria

selama evolusi. Pembentukan sistem ekspresi subunit I

tidak menggunakan metode pembentukan hibrid seperti

digunakan disini karena percobaan untuk pengangkutan

apositokrom b (yang lebih kecil dari subunit I) ke

mitokondria tidaklah berhasil.

4.2 Struktur Sinar-X dari Jalur H

Struktur sinar-X dari sitokrom c oksidase bentuk

teroksidasi dan tereduksi penuh pada resolusi 1.8 dan

1.9 Å memperlihatkan bahwa perubahan konformasional

yang besar dari Subunit I Asp-51 terjadi di dekat

permukaan sisi intermembran (Gambar 2A).

Gambar 2A Perubahan konformasional redoks berpasangandalam Asp-51. penggambaran Spektroskopijaringan ikatan hidrogen dalam bentukteroksidsi dan tereduksi penuh (strukturbiru)pada resolui 1.8 dan 1.9 Å, dilihat darisisi intermembran. Dua histidin terikat ke Fea

(besi heme a), tidak ditunjukkan.

Perubahan konformosional ini meliputi penyusunan

ulang interaksi ikatan hidrogen (Gambar 2B). Harga pKa

dari gugus karbonil dipengaruhi oleh lingkungannya.

Sebagai contoh, pKa asam asetat adalah 4.8 dalam air

dan 9.5 dalam methanol. Oleh karenanya lingkungan polar

yang non aqueous dari Asp-51 dalam bentuk teroksidasi

dihasilkan oleh gugus OH dari dua Ser- dan dua gugus

NH- peptida. Hal ini menunjukkan bahwa Asp-51 hampir

seluruhnya terprotonasi dalam bentuk tereduksi. Gugus

karboksil dari residu Asp-51 pada permukaan molekular

inter membran berada dalam aqueous, menunjukkan bahwa

gugus karboksil dalam bentuk deprotonasi.

Gambar 2B.Struktur Ikatan Hidrogen Asp-51 pada keadaanTeroksidasi (kiri) dan keadaan Tereduksi(kanan). Garis tebal menunjukkan permukaanmolecular dimana molekul air berada pada ruangintermembran dapat diakses.Perubahankonformasi diinduksi oleh reduksi dari enzimyang diperlihatkan dengan struktur berwarnabiru disebelah kanan. Bola berwarna biru (A)dan hitam (B) menggambarkan molekul air. Garisputus-putus menunjukkan ikatan hidrogen. Panahdua menunjukkan kemungkinan pergerakan molekulair dari Arg-38 ke Tyr-71.

Gugus karbonil dari ikatan peptida antara Tyr-440

dan Ser-441 dihubungkan dengan Arg-38 oleh jaringan

ikatan hydrogen yang terdiri dari Tyr-371 dan molekul

penarik air kedua (Fig. 2). Molewkul air yang terikat

dengan ikaan hidrohen ke Arg- 38 berlokasi sekitar 4 Å

dari Tyr-371. Jarak ini terlalu jauh untuk membentuk

ikatan hydrogen. Molekul air ini kemudian dapat

mendekati Tyr-371 untuk membentuk ikatan hydrogen

setelah berpindah dari Arg-38, yang diindikasikan oleh

tanda panah bertitik. Air yang terikat antara tyr-371

dan gugus karbonil peptida juga terhubung dengan

hydrogen ke gugus propionat dari heme a.

Transfer proton dimungkinkan terjadi melalui

ikatan peptida. Ketika proton ditambahkan ke gugus

kmarbonil peptida, akan terbentuk asam imidat [-

C(OH)=N+H-]. Jika gugus penerima proton berlokasi dekat

bagian =N+H-, proron akan diambil untuk membentuk enol

dari peptida [-C(OH)=N-]. Stabilitas yang lebih besar

ada pada bentuk keto (-CO-NH-) dibandingkan bentuk enol

[-C(OH)=N-]. Perubahan konformasi dari bentuk

ketoenol mengindikasikan pembalikan ke bentuk keto.

Peptida tidak memberikan arah yang karakteristik

transfer protonmelalui peptida yang menghalangi

transfer proton dari sisi intermembran.

Asp-51 dalam bentuk teroksidasi dihubungkan dengan

ikatan hydrogen ke Ser-441 pada permukaanmolekul. Pada

tempat itu bentuk reduksi dari jaringan ikatan hydrogen

termasuk air yang terikat antara Asp-51 dan Ser-205

menghubungkan Asp-51 dengan jaringan ikatan hydrogen

terbentang ke Arg-38 (Fig 2B). Kemudian Asp-51 dapat

dilalui melalui ikatan hydrogen ke kedua sisi molekul

bentuk oksidasi. Transfer proton kebalikan dihalangi

oleh ikatan peptida. Disamping itu struktur sebelumnya

pada resolusi 2.3/2.35Å menunjukkan bahwa Asp-51 dalam

bentuk teroksidasi dihubungkan ke ruang matriks oleh

jaringan ikatan hydrogen dan terkubur di dalam

permukaan inter membran. Sementara itu bentuk tereduksi

enzim, terdesosiasi dari jaringan ikatan hydrogen dan

terpapar ke ruang intermembran. Model terbaru ini

menunjukan bahwa proses pompa proton didorong oleh

perubahan pKadari Asp-51 dan transfer proton tak

berarah melalui ikatan peptida berbeda halnya dengan

usulan yang dijelaskan sebelumnya.

Besi heme a yang terikat ke enam nitrogen, (dua

dari histidin dan empat dari forfirin) keduanya dalam

bentuk teroksidasi. Dalam bentuk tereduksi , dua muatan

positif Fe2+ dinetralkan oleh dua muatan negatif

forfirin. Dalam bentuk teroksidasi, Fe3+ mempunyai satu

muatan positif yang belum ternetralkan. Relokasi muatan

positif ini melalui system electron -forfirin dapat

menyebabkan deprotonasi gugus bersifat asamyang

berlokasi dekat heme a. struktur terbaru Sinar-X

menunjukkan bahwa struktur heme a gugus formil adalah

coplanar dengan cincin forfirin dan dapat berkonjugasi

dengan system electron -forfirin dalam kedua bentuk

oksidasi. Hal ini konsisten denganbuktin resonansi

Raman yaitu pengaruh bentuk oksidasi besi pada karbonil

formil ditunjukkan oleh pergeseran vibrasional tarikan

C-O dari 1610-1650 cm-1dari oksidasi heme a. Karenanya

perubahan dalam bentuk oksidasi heme a dapat diharapkan

mempunyai pengaruh elektrostatik yang signifikan

terhadap Arg-38 yang terikat dengan ikatan hydrogen ke

gugus formil, walaupun tidak teradi perubahan

kopnformasional yang disebabkan oleh system Arg-38-

formil (Fig 2A). resolusi terbaru dari struktur Sinar-X

tidak cukup untuk meneliti perubahan konformasional

yang diinduksi oleh pengaruh elektrostatik Fea. gugus

propionat heme a yang terhubung dengan ikatan hydrogen

ke air yang terperangkap (Fig 2), dapat memicu transfer

proton melewati jaringan ikatan hydrogen, juga oleh

pengaruh elektrostatik dari oksidasi Fea.

Arg-38 yang terhubung dengan ikatan hydrogen ke

gugus formil heme a, dimana molekul air dalam ruang

matriks dapat masukmelalui saluran air. Saluran di

dekat ujung formil, secara skematik diperlihatkan

dengan garis putus dalam gambar 3A. ruang yang dapat

dilalui air pada saluran, ditentukan oleh perhitungan

permukaan molekul, menunjukkan bahwa saluran memilki 4

lubang, yang masing-masing cukup besar untuk

mengandungsatu sampai tiga molekul air (fg 3B dan ruang

bertitik merah dalam Fig 3A. gugus OH dari gugus

hidrofarnesiletil dari heme a terhubung dengan ikatan

hydrogen ke Ser-382 dekat saluran airdalam bentuk

oksidasi ( Fig. 3A, struktur merah). Selama reduksi

enzim, ikatan hydrogen OH…Ser-382 diputus ,

memungkinakn gugus OH dari gugus hidroksifarnesiletil

berotasi 120 dengan pergerakan dari rantai hidrokarbon

dekat gugus OH [-CH(OH)-CH2-CH2-CH=C(CH3)-] dan

memungkinkan rotasi 110 dari gugus OH Ser-382 (Fig.3A,

struktur biru), dipasangkan dengan perubahan

konformasional dalam pergantian heliks-X yang termasuk

Ser-382, Leu-381 dan Val-380 (Fig.3A, struktur asam

amino merah dan biru dlam Heliks-X). perubahan

kondformasiional ini menyebabkan terbentuknya lubang

baru antara gugus hidroksi farnesiletil dan Heliks-X

(Fig 3A, ruang bertitik biru dengan ruang yang tidak

ertitik merah dan Fig. 3B, oval biru). Perubahan

konformasional diatur olehbentuk oksidasi heme a

karena ikatan hydrogen OH…Ser-382 yang berlokasi dekat

system electron- forfirin heme a. posisi dan ukuran

empat lubang yang teramati dalam bentuk teroksidasi

tidak dipengaruhi secara signifikan selama reduksi

(Fig.3 ruang bertitik biru dan merah). Perubahan

konformasional redoks yang dipasngkan menunjukkan

perubahan kapasitas air dalam saluran, yang sepertinya

memberikan kontribusi terhadap kumpulan proton efektif

dari ruang matriks ke Arg-38.

Gambar 3A Struktur Sinar-X dari saluran air jalur H.perubahan konformasional redoks berpasangandari saluran air. Bagian atas saluranditunjukkan. Merah dan biru menunjukkanstruktur dalam bentuk teroksidasi dantereduksi. Permukaan bertitik merah dan birumenunjukkan lubang yang dideteksi dalambentuk teroksidasi dan tereduksi. Garis putus-putus menunjukkan jalur pengubung air kelubang. Garis bertitik menunjukkan ikatanhidrogen. Bola kecil menunjukkan posisimolekul air yang terikat. His-61 terikat keFea dari sisi yang berlawanan dengan hemetidak ditunjukkan.

Gambar 3B Representasi skematik dari perubahankonformasional redoks berpasangan dalamsaluran air. Daerah yang diberi kotak disebutdaerah A. Bola hitam dan biru menunjukkanmolekul air yang terikat. Struktur yangteramati hanya pada bentuk tereduksi yaituoleh warna biru.

4.3 Analisis FTIR Dari Perubahan Konformasi ReaksiRedoks Yang Berpasangan

FTIR digunakan untuk mengidentifikasi sisi logam

redoks-aktif yang mengatur konformasi Asp-51. Berbeda

dengan spektrum FTIR dari keadaan teroksidasi, enzim

keadaan tereduksi pada H2O, Asp-51 memberikan puncak

pada 1,738 cm-1 dan 1,585 cm-1, yang memberikan bukti

adanya uluran COO model dari COOH dan COO. Perbedaan

spektra pada redoks dengan adanya sianida dan CO yang

juga memberikan pita yang identik pada 1,738 cm-1 dan

1,585 cm-1. sianida menstabilkan heme a3 pada keadaan

teroksidasi. Jadi enzim tereduksi dengan adanya sianida

yang dimiliki oleh heme a3, CuA dan CuB pada keadaan

tereduksi dan heme a3 pada keadaan sianida terikat yang

berikatan. Sehingga spektrum yang berbeda antara enzim

teroksidasi pada sianida berikatan dan enzim tereduksi

yang mengikat sianida menghasilkan penjumlahan

perbedaan spektra redoks yang diinduksi oleh heme a,

CuA dan CuB. Dengan kata lain, Co menstabilkan CuB dan

heme a3 pada keadaan tereduksi memberikan spektra

redoks yang berbeda yang diinduksi oleh heme a, CuA.

Karena itu hasil ini mengindikasikan bahwa keadaan

terprotonasi dari Asp-51 dikendalikan oleh heme a dan

CuA.

Pada titrasi reduksi enzim sapi ini terdapat

sianida, dengan penurunan intensitas dua pita adalah

proporsional pada ekuivalen elektron yang ditambahkan.

Tiga elektron ekuivalen dibutuhkan untuk memenuhi

eliminasi dari dua pita pada spektrum yang berbeda.

Hasil ini mengindikasikan bahwa spektra infra

merahberubah karena single elektron ekuivalen.

Titrasi redukrif enzim sianida terikat, dimonitor

menggunakan keadaan oksidasi dari tempat logam redoks

aktif, heme a, CuA dan CuB. Sehingga jika dua atau tiga

elekron dibutuhkan untuk perubahan spektra infra merah,

maja perubahn spektra tidak akan terlihat dibawah satu

atau dua elektron secara ekuivalen. Karena itu COOH

dari Asp-51 dipisahkan selama reduksi hanya satu tempat

logam, selain heme a atau CuA.

Elektron equivalen dari sitokrom c ditransfer dari

CuA ke heme a kemudian dari heme a ke tempat reduksi

O2.jadi heme a dapat memberikan tanda sebagai tempat

kontrol logam pada konformasi Asp-51.

4.4 Mekanisme Proton-Pumping

Mekanisme keseluruhan berdasarkan hasil kesimpulan

adalah : ketika heme a berada pada keadaan teroksidasi,

Arg-38 terprotonasi pertama walaupun dibawah muatan

positif dari heme a, karena molekul air pada ruang

matriks accessible ke Arg-38 melalui terowongan

air.Asp-51 terkubur didalam protein dan terprotonasi.

Selama heme a mengalami reduksi, dimana kehilangan

muatan positif di heme a, Asp-51 keluar ke ruang

intermembran dan kapasitas terowongan air meningkat.

Karena itu molekul air akan bergerak ke ruang matriks,

ketika proton pada Asp-51 dilepaskan ke ruang

intermembran. Selama heme a mengalami oksidasi, Asp-51

bergerak ke belakang ke interior protein dan

memperlihatkan muatan positif pada heme a menurunkan

afinitas dari formil oksigen untuk membagi proton

dengan Arg-38. penurunan aktivitas promosi proton

transfer dari Arg-38 ke Asp-51. gugus propionat ikatan

hidrogen pada air juga mempercepat proton transfer

sepanjang jaringan ikatan hidrogen.

Gambar 4. Mekanisme Proton pumping yang diusulkan. Besi,porfirin dan gugus samping formil dari heme adiperlihatkandengan Fea, Pr dan OCHO.COOH pada Pr menunjukkan satu gugus propionatdari heme a.

Tanda kurung ([ ]1_and [ ]0) menunjukkanjumlah muatan dari enam koordinat heme Warnakotak yang lebih hitam menunjukkan keadaanstruktur yang stabil dan keadaan intermediet.

Panah tebal menunjukan pengaruh elektrostatikdari jumlah muatan positif heme a dan protontransfer selama heme a mengalami oksidasi. Garis putus-putus menunjukkan ikatan hidrogenyang menghubungkan Arg-38 dengan Asp-51,termasuk ikatan peptida yang menghalangireverse transfer dari sisi intermembran.

Hasil Arg-38 yang terprotonasi mengekstrak proton dari

molekul air pada terowongan air sebelum kapasitas

terowongan air menurun menjadi pemaksaan keluar OH-.

Keikutsertaan gugus formil heme a dan molekul air

disekitar proton pumping sebelumnya telah dianalisa

menggunakan resonansi raman.

KESIMPULAN

1. Mutasi Asp-51 Asn dari enzim hati memperlihatkan

fungsi pompa proton tanpa mempengaruhi aktivitas

reduksi dioksigen

2. Struktur Sinar-X (pada resolusi 1.8/1.9 Å dalam

bentuk teroksidasi dan reduksi penuh) menunjukkan

bahwa muatan positif total yang dibentuk selama

oksidasi mendorong transport proton aktif dari ruang

mitokondria ke Asp-51 melewati enzim lewat saluran

air dan jaringan ikatan hidrogen, yang berlokasi di

tandem.

3. Hasil infrared mengindikasikan bahwa konformasi Asp-

51 dikontrol hanya oleh bentuk oksidasi heme spin

rendah. Hasil ini mengindikasikan bahwa heme spin

rendah mendorong proses pompa proton.

DAFTAR PUSTAKA

Lehninger, L. 1991.Dasar-dasar Biokimia.Alih bahasa : DrMaggy Thenawidjaja. Edisi kedua.Penerbit Erlangga.Jakarta.

Michel H. 1998. The Mechanism of proton pumping bycytochrome c oxidase.PNAS 95, 12819-12824.

Tsukihara, T., Shimokata, K., Katayama, Y., Shimada H,Muromoto K, Aoyama H, Mochizuki M, Shinzawa K,Yamashita E, Yao M, Ishimura Y, Yoshikawa S.2003.The Low Spin Heme of Cytochrome c oxidase as the drivingelement of the proton pumping process.PNAS 100.15304-15309.

Yoshikawa, S., Shinzawa-Itoh, K., Nakashima, R., Yaono,R., Yamashita, E.,

Inoue, N., Yao, M., Fei, M. J., Libeu, C. P.,Mizushima, T., et al. (1998) Science 280, 1723–1729.