Guia implantacion validacion y verificacion de metodos analiticos inecc 2013

Este documento pertenece al INECC-CCA citar como:

INECC-CCA, (2010). GUÍA PARA LA IMPLANTACIÓN, VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO

CONTINUO DE UN MÉTODO ANALÍTICO. México, p.27.

NORTH AMERICAN COMMISSION FOR ENVIRONMENTAL COOPERATION

(NACEC)

DESARROLLO DE LOS PROTOCOLOS BASE PARA EL PROGRAMA NACIONAL DE

MONITOREO Y EVALUACIÓN (PRONAME)

ANEXO 6 DEL REPORTE FINAL

GUÍA PARA LA IMPLANTACIÓN, VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO CONTINUO DE UN

MÉTODO ANALÍTICO

L A B O R A T O R I O S A B C QUÍMICA INVESTIGACIÓN Y ANÁLISIS S.A. DE C.V.

DICIEMBRE 2009




2

CONTENIDO

1.0 INTRODUCCIÓN 2.0 OBJETIVOS 3.0 PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO

3.1 LIMITE DE DETECCIÓN DEL METODO (LDM) 3.2 INTERVALO DE TRABAJO DEL MÉTODO (ITM).

3.3 LÍMITE PRÁCTICO DE CUANTIFICACIÓN (LPC)

3.4 CALIBRACIÓN INICIAL (CI)

3.5 EXACTITUD (RECUPERACIÓN) Y SESGO INICIAL DEL MÉTODO

3.6 PRECISIÓN INICIAL DEL MÉTODO

3.7 REPRODUCIBILIDAD DEL MÉTODO

3.8 INCERTIDUMBRE INICIAL

4.0 BIBLIOGRAFIA




3

1.0 INTRODUCCIÓN

Todos los laboratorios analíticos y en especial los de la Red de PRONAME se deben obligar a seguir los 6 Principios básicos de buenas prácticas de mediciones analíticas (ref. 3)

1.- Las mediciones analíticas deben ser realizadas de acuerdo a requerimientos acordados (con un propósito definido).

2.- Las mediciones analíticas deben ser realizadas usando métodos y equipos que han sido probados para asegurar que son adecuados para el propósito de la medición.

3.- El personal que realiza las mediciones analíticas debe ser calificado y competente para llevar a cabo sus tareas.

4.- Debe haber regularmente una evaluación independiente del desempeño técnico del laboratorio.

5.- Las mediciones analíticas efectuadas en un lugar deben ser consistentes con aquellas efectuadas en cualquier otro lugar.

6.- Las organizaciones que realizan mediciones analíticas deben tener perfectamente definidos procedimientos de aseguramiento y control de calidad.

La validación de un método de ensayo se ha definido como:

“La confirmación por examen y la provisión de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos particulares para un uso propuesto” [NMX EC 17025 IMNC 2006 Ref 1]

“El proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de un método de medición y la identificación de aquellas influencias que pueden modificar estas características y a que grado lo afectan” [EURACHEM “The fitness for Purpose of Analytical Methods” Ref 2]

“La validación examina las características de desempeño de un método para identificar y establecer cualquier limitación que pueda esperarse del método cuando se aplique a un tipo específico de muestras” [CENAM Métodos analíticos adecuados a su propósito. Guía de laboratorio para validación de métodos y tópicos relacionados” Ref 3]




4

Las 3 definiciones tienen en común en que la validación es el proceso para demostrar que el desempeño en un laboratorio determinado con un método analítico específico cumple con las especificaciones necesarias para las necesidades de medición especificadas. Internacionalmente la comunidad analítica ha establecido las principales especificaciones y requisitos operativos de un laboratorio de pruebas por medio de la Norma Internacional ISO/IEC 17025:2005 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”, esta Norma especifica claramente la necesidad de la validación de los métodos analíticos como un requisito indispensable antes de realizar una medición analítica, ya que el desempeño de un método analítico es diferente en cada laboratorio que lo realiza y además los métodos analíticos no se pueden utilizar para medir algún mensurando en cualquier matriz, sino que son muchas veces específicos para la matriz en la que fueron desarrollados y por ende validados originalmente:

5.4.1 “El laboratorio debe usar métodos y procedimientos apropiados para todos los ensayos dentro de su alcance. Estos incluyen muestreo, manejo, transporte, almacenamiento y preparación de los elementos que serán ensayados.....”

5.4.2 “Deben usarse preferentemente los métodos publicados en normas internacionales (ISO, AOAC, etc.), regionales o nacionales (NOMs, NMXs para México; USEPA, NIOSH, OSHA, FDA, etc. para USA; etc.) o por organizaciones técnicas reconocidas (ASTM, UL, API, ACS, etc.), o en textos o publicaciones científicas importantes, o como sea especificado por los fabricantes de equipo.....”

5.4.5.2 “El laboratorio debe validar métodos no normalizados, métodos diseñados / desarrollados por el laboratorio, métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto y ampliaciones y modificaciones de métodos normalizados para confirmar que los métodos se ajustan al uso propuesto....” (por extensión se podría entender que los métodos normalizados usados dentro de su alcance no deben validarse…)

5.4.2 “....El laboratorio debe confirmar que puede operar adecuadamente métodos normalizados antes de implantar los ensayos, si el método cambia la confirmación debe ser repetida”.

NOTA: La 17025 utiliza el concepto de “confirmación” sin definirlo, por lo que internacionalmente se ha adoptado que este término equivale a una “validación parcial” con la cuál se pueda evidenciar su adecuación al uso propuesto)

La referencia mas completa sobre validación de métodos, sobre la cuál se basa la 17025, se encuentra en la publicación de Eurachem “The Fitness for Purpose of Analytical Methods, a Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics” (La Adecuación al Uso Propuesto de los Métodos Analíticos, una Guía para el Laboratorio para la Validación de Métodos y Tópicos Relacionados Ref. 2)




5

Los parámetros de una validación completa de un método analítico (ref. 3) son los siguientes:

Recuperación

Sensibilidad

Selectividad / Especificidad

Robustez

Límite de detección

Límite de cuantificación

Intervalo lineal y de trabajo

Reproducibilidad

Repetibilidad

Sesgo (En algunos casos evaluado a partir de la Recuperación)

Incertidumbre inicial Estos parámetros se evalúan mediante una serie de indicadores como:

PARÁMETRO INDICADOR

Selectividad / Especificidad Pruebas estadísticas en diferentes matrices con diferentes interferencias

Robustez Pruebas Interlaboratorios con variaciones en las condiciones de prueba

Sensibilidad Límite de detección

Precisión Repetibilidad, Reproducibilidad e Incertidumbre

Exactitud Recuperación y sesgo

Intervalo lineal y de Trabajo Límite de Cuantificación, Intervalo lineal, curva de calibración

Cuando se utiliza un método Normalizado, es decir un método desarrollado por una Institución técnicamente reconocida (Organismos internacionales de normalización como la ISO o AOAC. Dependencias extranjeras reconocidas internacionalmente como la EPA, DIN, NIOSH, OSHA, FDA, etc. Organizaciones técnicas reconocidas como la ASTM, UL, API, ACS, etc.) y que ha sido validado con los estándares internacionales antes mencionados, solo es necesario que el laboratorio “confirme” que lo puede realizar con los mismos criterios de desempeño bajo el cual fue validado, por lo que debe realizar esta “confirmación” o validación parcial con los siguientes parámetros:

Recuperación

Sensibilidad

Límite de detección

Límite de cuantificación

Intervalo lineal y de trabajo




6

Reproducibilidad

Repetibilidad

Sesgo (En algunos casos evaluado a partir de la Recuperación)

Incertidumbre inicial Cuando un laboratorio desarrolla un método analítico, debe validarlo totalmente, este desarrollo implica los siguientes casos:

o Los métodos que un laboratorio de ensayos desarrolla internamente para una aplicación específica sin seguir detalladamente las especificaciones de un método normalizado.

o Los métodos que se basan en un método normalizado pero al que se le han realizado modificaciones para aplicarlo a otra matriz no contemplada en el método de referencia

o Métodos Normalizados con modificaciones que alteran su alcance inicial.

o Métodos mencionados en textos o publicaciones científicas o Métodos especificados por los fabricantes de equipos.

Es muy difícil validar un método analítico en un laboratorio de ensayos, ya que la determinación de la selectividad/especificidad y la robustez se basan en diseños experimentales que implican tiempo y altos costos, normalmente se realizan por medio de estudios de colaboración realizados por algunas Instituciones Gubernamentales, principalmente extranjeras (EPA, FDA, NIOSH, OSHA, etc.) u Organizaciones Técnicas reconocidas, también extranjeras (AOAC, ASTM, etc.), existen algunos pocos casos realizados por Laboratorios Primarios. No es válido el realizar un diseño experimental simple en un solo laboratorio ya que puede existir un sesgo importante, existen referencias internacionales al respecto si se quiere profundizar en el tema, la más completa está en AOAC International Method Validation Program (www.aoac.org/vmeth/oma_program.htm). Los criterios de cuando se debe realizar una Validación Parcial o Completa son los siguientes:

PROBLEMA TIPO DE VALIDACION

Desarrollo de un método para un problema en particular

Completa

Existe un método evaluado para aplicarlo en un problema en particular

Completo

Un método establecido, realizar una revisión para incorporar innovaciones

Parcial o completa

Un método establecido, extenderlo o adaptarlo a un problema nuevo

Parcial o completa

Cuando el control de calidad indica que un método establecido cambia con el tiempo

Parcial o completa




7

Establecer un método en un laboratorio diferente

Parcial

Establecer un método con diferente instrumentación

Parcial

Establecer un método con diferente operador Parcial

La validación inicial documenta que el Laboratorio es inicialmente competente para realizar el método de ensayo, para algunos este proceso se denomina “Montaje del método”, solo se realiza una vez. Al menos cada año debe reevaluarse la incertidumbre, el LDM, Intervalo lineal, el de trabajo y la reproducibilidad. La reproducibilidad se debe realizar a través del análisis de muestras de control de calidad (QC), las cuáles deben:

Estar en la matriz analizada o lo más parecida,

En concentraciones diferentes a través de todo el intervalo de trabajo,

Ser analizadas con cada lote de muestras analizadas. La Prueba Inicial de Desempeño del Analista (PIDA) documenta la competencia de los analistas respecto a la validación del método en el laboratorio específico, todos los analistas que realizan algún método de ensayo deben demostrar que son competentes para operarlo a través de la obtención de los LDM, Repetibilidad, Sesgo y Recuperación, los cuáles deben estar dentro de los criterios de aceptación y rechazo del método de referencia, lo anterior se denomina “Evaluación Inicial de Desempeño del Analista”, se debe realizar para cada analista, al menos cada año y cuando se efectúan cambios importantes en el equipo. Esta PIDA puede ser utilizada por el laboratorio para evidenciar que su método sigue validado a través del tiempo. Para determinar si se ha confirmado adecuadamente un método se deben seguir los siguientes criterios:

Intervalo de Trabajo, debe abarcar al menos de 0.25 a 2 veces el LMP o la especificación acordada con el cliente (curva de calibración) y debe estar dentro del Intervalo Lineal.

El LDM debe estar al menos 10 veces por debajo del LMP o especificación acordada.

El LPC debe estar al menos 2 veces por debajo del LMP o especificación acordada.

La Repetibilidad inicial debe estar realizada con la concentración del punto medio de la curva de calibración (LMP o especificación acordada).




8

Para la estimación de la incertidumbre se debe utilizar un estudio de precisión que cumpla con lo siguiente:

o Número de muestras de QC mayor a 20 o Todas dentro de control estadístico o Que pertenezca a una distribución normal o Que se hayan elaborado a través de todo el intervalo de trabajo del

método de ensayo (diferentes concentraciones).

Los valores obtenidos en la Validación Parcial del Método deben cumplir con los de la Validación del Método de Referencia y son la base para establecer los Criterios de Aceptación y Rechazo del Laboratorio (pueden ser mejores que los del Método de Referencia pero no peores).




9

2.0 OBJETIVOS 2.2.1 Objetivo General

Establecer los pasos a seguir para realizar la validación parcial de métodos analíticos cuantitativos estandarizados.




10

3.0 PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO En este capitulo se presentan los procedimientos específicos para realizar todos los parámetros de una validación parcial, no se presentan los procedimientos para determinar la Especificidad, Robustez por estar fuera de los alcances de un laboratorio de ensayo.

3.1 LIMITE DE DETECCIÓN DEL METODO (LDM)

Aplica a las siguientes técnicas analíticas:

Cromatografía de Gases

Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas

Cromatografía de Líquidos de Alta Presión

Espectrofotometría UV/VIS

Espectrofotometría de Absorción Atómica

Espectrometría de Emisión Óptica con Plasma Inducido Acoplado (ICP/OES)

Espectrometría de Masas con Emisión de Plasma Inducido Acoplado (ICP/MS)

NOTA IMPORTANTE: ESTE PROCEDIMIENTO NO SE DEBE APLICAR A TÉCNICAS GRAVIMETRICAS, VOLUMÉTRICAS, POTENCIOMETRICAS Y CONDUCTIMETRICAS, PARA ESTAS TECNICAS LA CANTIDAD MINIMA DETECTABLE ES EQUIVALENTE AL LIMITE PRACTICO DE CUANTIFICACION INSTRUMENTAL.

-Anote todo lo realizado en su bitácora de analista.

-Verifique para cada analito el límite de detección estimado del método fuente, tome como base este valor para determinar la concentración de la muestra control, la cual se debe encontrar entre 5 y 10 veces por arriba del límite de detección estimado del método. -Prepare una muestra control conteniendo los analitos del método a evaluar, en un volumen suficiente para dividirla en 7 porciones iguales. -Divida la muestra control en 7 alícuotas y analícelas de acuerdo al método analítico en cuestión.




11

-Calcule la media y la desviación estándar de los resultados obtenidos. -Calcule el límite de detección del método (LDM) usando la siguiente ecuación LDM = (tn-1, 0,99%)*s

donde: (tn-1, 0,99%) = 3,14 (para 7 repeticiones)

s = desviación estándar -Si el resultado del LDM obtenido es menor de 10 veces la concentración de la muestra que se utilizó, entonces prepare otra muestra que se encuentre entre 5 y 10 veces arriba del LDM obtenido y repita el procedimiento. -El Límite de Detección del Método que se obtenga, debe ser igual o menor al que se presenta en el Método Fuente. Cuando el LDM no puede ser igual o menor al del método fuente, pero es menos de 10 veces el valor del Límite Máximo Permisible (LMP) o del criterio ambiental aplicable, éste puede ser aceptado.

3.2 INTERVALO DE TRABAJO DEL MÉTODO (ITM).

Aplica a las siguientes técnicas analíticas: Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS), Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos (UV/VIS, AAE).

-Determine el ITM de acuerdo al Límite Máximo Permisible o criterio de calidad respectivo, con al menos dos puntos de la curva de calibración por debajo de dicho valor y dos puntos por encima. Los valores deben ser calculados tomando como punto de partida el LMP o criterio y los valores bajos deberán guardar una relación aproximada de 2 y 5 veces menos de ese valor; mientras que para los valores altos la relación deberá ser de 2 a 5 veces mas ese mismo valor. Ejemplo 1: LMP: 0,20 mg/L Curva de calibración: 0,04; 0,10: 0,20; 0,40; 1,0 Intervalo de trabajo: 0,04 – 1,0 mg/L Ejemplo 2 (mismo método para 2 normas de LMP diferentes): LMP: 0,20 mg/L Pb para agua potable y 1,0 mg/L para agua residual Curva de calibración: 0,04; 0,10; 0,20; 0,40; 1,0; 2,0; 5,0 mg/L




12

Intervalo de trabajo: 0,04 – 5,0 mg/L Determine el ITM utilizando como indicador el coeficiente de correlación de la recta de ajuste por mínimos cuadrados, el cual debe ser mayor a 0,997 (siempre y cuando se verifique la linealidad por métodos gráficos antes).

3.3 LÍMITE PRÁCTICO DE CUANTIFICACIÓN (LPC)


Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS), Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos (UV/VIS, AAE) -Calcule el LPC multiplicando por 5 el LDM o en caso de que el primer punto del intervalo de trabajo sea mayor a éste valor, entonces utilice el primer punto de la curva de calibración.

3.4 CALIBRACIÓN INICIAL (CI)

La calibración inicial está íntimamente relacionada con el Intervalo de Trabajo del Método, el cual puede ser mas amplio, la calibración inicial, nunca puede tener un intervalo menor al ITM.


Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS), Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos (UV/VIS, AAE) -La calibración inicial se define con la curva de calibración al momento de calcular el intervalo de trabajo. Debe estar conformada por al menos tres puntos y recomendablemente, cinco puntos. -La curva de calibración debe ser lineal (r2 > 0,997 con 5 puntos de curva y 0,98 con 3 puntos de curva). -Mientras la pendiente de una curva de calibración es mayor, mayor es su sensibilidad (a pequeños cambios de señal, mayor es el cambio en concentración). -La ordenada al origen nunca puede ser negativa (error matemático de ajuste por mínimos cuadrados). Si es positiva, significa que a una concentración “0” existe una señal, lo cual puede deberse a contaminación de reactivos.




13

-Se debe buscar la mayor sensibilidad y nunca se debe ajustar la señal del “0” de calibración con el blanco de reactivos, sino con el blanco de calibración. -En la gran mayoría de los métodos ambientales, los patrones de la curva de calibración no se procesan, se analizan solo instrumentalmente (solo en el caso de los Compuestos Orgánicos Volátiles que se analizan por Purga y Trampa). Se debe verificar la calibración inicial con un Material de referencia Certificado de otra fuente diferente a la utilizada para elaborar la curva de calibración inicial para evidenciar que no existió algún error de dilución que pudiera invalidar la calibración inicial.

3.5 EXACTITUD (RECUPERACIÓN) Y SESGO INICIAL DEL MÉTODO


Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS), Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos (UV/VIS, AAE) -Prepare una muestra control conteniendo los analitos del método a evaluar, en un volumen suficiente para dividirla en 10 porciones iguales y realice el análisis completo en las mismas condiciones de operación y por el mismo analista. La concentración de la muestra debe ser cercana al punto medio de la curva de calibración. -Analice las 10 muestras y registre los resultados. -Calcule la Exactitud inicial del Método, la cual estará expresada como un porcentaje de recuperación o recobro: %R = (Valor Encontrado / Valor Real) x 100 donde:

%R = Porcentaje de Recuperación o Recobro Valor Encontrado = Valor medido en la muestra Valor Real = Valor asignado a la muestra

-Calcule el promedio y la desviación estándar del %R, al promedio del %R obtenido reste 100 para calcular el Sesgo (respete el signo obtenido).




14

-Compare los valores obtenidos del promedio y la desviación estándar del %R y del Sesgo con los que se presentan en el método de referencia, si existen. -Si los valores no cumplen con lo especificado, determine las causas y corrija los errores, documente adecuadamente las incidencias y acciones correctivas e inclúyalas en el expediente del método. -Repita el procedimiento anterior hasta que se cumpla con las especificaciones del método fuente.

3.6 PRECISIÓN INICIAL DEL MÉTODO

-REPETIBILIDAD DEL MÉTODO


Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS), Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos (UV/VIS, AAE). -Con los resultados de las 10 muestras preparadas en la Sección anterior elabore una tabla donde se pongan los 10 valores (5 parejas de 2 valores apareados). -Calcule la DPR de cada pareja de datos apareados con la siguiente ecuación: DPR = ((X1 - X2) / (X1 + X2))*200 donde: DPR = Diferencia Porcentual Relativa X1 = Valor medido de la muestra original X2 = Valor medido de la muestra duplicada (apareada) -Calcule la media aritmética de las 5 DPR obtenidas -Compare los valores de la media con los que se presentan en el método de referencia. -Si los valores no cumplen con los especificados, determine las causas y corrija los errores, documente adecuadamente las incidencias y acciones correctivas e inclúyalas en el expediente del método. -Repita el procedimiento anterior hasta que se cumpla con las especificaciones de los criterios de aceptación del método fuente.




15

3.7 REPRODUCIBILIDAD DEL MÉTODO


Métodos Cromatográficos (GC, HRGC, HPLC y HRGC/LRMS), Métodos Espectroscópicos (ICP/OES, ICP/MS) y Espectrofotométricos (UV/VIS, AAE), -Después de haber obtenido la Repetibilidad del Método, inicie la medición de muestras reales y cuando tenga 12 datos de las muestras de Control de Calidad, calcule la Reproducibilidad Inicial del Método, elabore una tabla donde se pongan los 12 valores (6 parejas de 2 valores apareados). -Calcule la DPR de cada pareja de datos apareados con la siguiente ecuación: DPR = ((X1 - X2) / (X1 + X2))*200 Donde: DPR = Diferencia Porcentual Relativa X1 = Valor medido de la muestra original X2 = Valor medido de la muestra duplicada (apareada) -Calcule la media aritmética de las 6 DPR obtenidas -Compare los valores de la media con los que se presentan en el método de referencia, si existen. Estos valores de reproducibilidad deben ser mayores que los de Repetibilidad, en caso contrario, determine las causas y corrija los errores, documente adecuadamente las incidencias y acciones correctivas e inclúyalas en el expediente del método. Con estos valores inicie las cartas control de Reproducibilidad.

3.8 INCERTIDUMBRE INICIAL

La estimación de la incertidumbre en este tipo de mediciones puede ser muy compleja y aún no existen lineamientos oficiales de como obtenerla, existen fuertes discusiones acerca de hasta donde debemos llevar la formalidad académica o científica y que equilibrio debemos guardar entre esta formalidad y los aspectos prácticos y de tipo comercial que todos los laboratorios que realizamos la importante función de las mediciones analíticas del medio ambiente, por lo que en este inciso se




16

presenta un acercamiento de como poder obtenerla, existen otros, los cuales pueden ser igualmente válidos. Es muy importante tener en cuenta algunos conceptos básicos:

“La calidad de un resultado de una medición se juzga por el grado de representatividad de la magnitud de la propiedad que intenta cuantificar. Un resultado de medición tendrá cuanta mas calidad como permita lograr mas eficacia en las decisiones que se tomen basándose en ello.” “La medición de la calidad de un resultado de medición estará entonces relacionada con el contenido informativo que proporcione, que no es independiente del usuario y/o de la finalidad o intento de la medición.” “El concepto de incertidumbre se utiliza internacionalmente para cuantificar y representar esta calidad.” “Un resultado de una medición no está completo si no viene acompañado de la estimación de la incertidumbre señalada por quien realizó la medición y quien conoce la información relacionada con la conducción del proceso de medición.” (1)

Los conceptos anteriores son citas textuales de la Introducción de la NMX CH 140-1996 IMNC “Guía para la Evaluación de la Incertidumbre en los resultados de las mediciones” La definición de Incertidumbre (International Vocabulary of Basic and General Terms in Metrology, ISO, Geneva, 1993):

“Parámetro asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden

ser atribuidos al mesurando” El estadístico que se debe utilizar en mediciones de química analítica debe ser la Incertidumbre Expandida(2). La referencia a la incertidumbre surge debido a que la concordancia entre los laboratorios es limitada, en parte, por las incertidumbres en que incurre cada laboratorio en su cadena de trazabilidad. Por lo anterior, la trazabilidad esta íntimamente ligada a la incertidumbre, la trazabilidad provee los medios para poner todas las mediciones relacionadas en una escala consistente de medición, mientras que la incertidumbre caracteriza la “fuerza” de los eslabones de la cadena y la concordancia que es esperada entre los laboratorios que hacen mediciones similares(2). La incertidumbre de las mediciones que realiza un laboratorio ambiental de tercera parte no pueden incluir la incertidumbre del muestreo, ya que ésta es desconocida y




17

trasciende regularmente a los alcances del servicio que estos laboratorios proporcionan. Además, regularmente tampoco se pueden evaluar las incertidumbres relativas a las condiciones de almacenamiento, ya que en la mayoría de los casos, las determinaciones analíticas solo se pueden dentro de un periodo de tiempo corto (holding times). Lo anterior debe ser claramente definido en los informes de prueba.

Existe una relación directa entre los datos de QC e Incertidumbre:

QC exactitud: Mide el error del proceso, normalmente a través del %R o del

error relativo (valor “real”-valor obtenido) aplica a una sola medición.

QC precisión: Mide la variabilidad del proceso a través normalmente de la Desviación Estándar

NO es posible con estos conceptos determinar cuales son las causas del error

o de la variabilidad, ya que están basadas en el cálculo de solo un número final, normalmente por el uso de MRs o MRCs.

NO se puede tener un proceso de mejora continua de una forma lógica y

ordenada sobre el resultado al desconocer las causas precisas del resultado de QC.

El proceso para la estimación de la incertidumbre expandida determina en

1er. lugar las fuentes de variación, su importancia en el resultado final, y no solo combina los dos conceptos anteriores y los unifica en un solo número, sino que permite el proceso de mejora continua de una forma lógica y ordenada.

El procedimiento para la estimación de la incertidumbre es el siguiente:




18

PROCEDIMIENTO PARA LA ESTIMACION DE LA

INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (U)

Calcular la incertidumbre expandida U

Determinar el factor de cobertura

Calcular la incertidumbre estándar combinada uc

Estimar correlaciones

Reducir: Obtener la incertidumbre e´tándar u(xi)

Cuantificar la variabilidad de cada fuente

y asociarle el tipo de distribución

Identificar las fuentes de incertidumbre

Establecer el Modelo Matemático

Identificar las magnitudes de Entrada

Definir el Mensurando

El Mensurando es lo que se va a medir (DDT, Cadmio, Naftaleno, etc.) El Modelo Matemático se determina a partir de las ecuaciones matemáticas que relacionan las diferentes variables medidas para obtener el resultados analítico (p. ej. y=mx+b, Co=1000 x m x p / V, etc.), normalmente se utiliza para determinar las magnitudes de entrada relevantes (masa, volumen, temperatura, curva de calibración, etc.) Las principales fuentes de incertidumbre son las siguientes en mediciones químicas, bioquímicas y biológicas (2):

Toma de la muestra Condiciones de almacenamiento de la muestra Efectos instrumentales Pureza de reactivos Estequiometría asumida del analito Preparación de la muestra Condiciones de la medición Efectos de la muestra (interferencias de matriz) Efectos de las computadoras (modelos de curvas de calibración, cifras

significativas en los cálculos, etc.) Corrección por blancos de reactivos Efectos de los analistas Efectos aleatorios




19

Todas las fuentes de incertidumbre tienen variabilidad y sus propias incertidumbres, las cuales se deben expresar en términos de la desviación estándar, pero

normalmente en unidades diferentes (C, ml, mg, etc.) Existen 2 tipos de Incertidumbre estándar:

Tipo A: Incertidumbre calculada por métodos estadísticos (normalmente por estudios de repetibilidad).

Tipo B: Incertidumbre calculada por otros métodos (especificaciones del fabricante, certificados de calibración, efectos del medio ambiente, etc.)

La determinación de la Incertidumbre Estándar se realiza de la siguiente forma:

Incertidumbre Estándar = u(xi) = s / n

donde: o u(xi) = desviación estándar experimental de la media o Esta u(xi) representa un intervalo centrado en el mejor estimado del

mensurando (media aritmética) que contiene el valor verdadero con una probabilidad p del 68.27% (si los datos siguen una distribución Normal)

Las desviaciones estándar se tienen que “corregir” dependiendo del tipo de distribución estadística de los datos para obtener las incertidumbres estándar:

s/1 = Normal s/2 = Normal (k=2)

s/3 = Rectangular (especificaciones simétricas, sin límites de confianza y donde se pueden esperar valores limítrofes, +- x% como en el material de vidrio)

s/6 = Triangular (especificaciones simétricas, sin límites de confianza y donde no se esperan valores limítrofes, pero con datos de alguna distribución estadística, como en el material de vidrio anterior pero verificado en el laboratorio y donde no se aprecian valores en los extremos de la especificación)

Se debe determinar la relación entre las magnitudes de entrada, de tal forma que se conozca si existe o no correlación entre ellas, con objeto de utilizar el modelo matemático pertinente para el cálculo de la incertidumbre combinada. A continuación se debe estimar la incertidumbre estándar combinada, par realizarlo, se combinan las incertidumbres estándar, según el procedimiento científico, se debe hacer por medio de la integración de cada una de las incertidumbres estándar de cada una de las fuentes de incertidumbre, lo cual es bastante complicado, sin embargo existen aproximaciones aprobadas por la Eurachem que permiten tener esta combinación por medios matemáticamente menos complejos basados en el tipo




20

de modelo matemático que se emplea para calcular la concentración del mensurando: 1.- Para modelos donde en la formula de cálculo solo existan sumas y restas:

y = (p+q+r+...) entonces uc(y(p,q..) = u(p)2+u(q)2+... 2.- Para modelos donde en la formula de cálculo existan multiplicaciones y divisiones (el más común):

y = (p x q x r x...) ó p/(q x r x ...) entonces uc(y(p,q..) = (u(p)/p)2+(u(q)/q)2+... donde: uc = incertidumbre combinada de y respecto a p,q,r u(p) = incertidumbre estándar de p u(q) = incertidumbre estándar de q u(r) = incertidumbre estándar de r p = valor de r q = valor de r r = valor de r p,q,r = fuentes de incertidumbre La incertidumbre combinada se debe ahora multiplicar por el factor de cobertura, el cual es normalmente es 2 el cuál equivale en una distribución normal al 95.45% de confianza. Puede ser otro número dependiendo del número de datos utilizados, en poblaciones pequeñas se utiliza la t de Student de una tabla de 2 colas. Con lo anterior se obtiene la incertidumbre expandida, el cual es el estadístico acordado internacionalmente para expresar la incertidumbre (U):

Incertidumbre Expandida = U = uc k donde:

uc es la incertidumbre combinada k es el factor de cobertura, este factor es generalmente 2, el cual equivale a 2 desviaciones estándar y por lo mismo a una probabilidad del 95.45%.

Copn objeto de ejemplificar la estimación de incertidumbre con un caso real, se presenta el caso de la determinación de Cadmio en loza vidriada (NOM 009 SSA1 1993)




21

PASO 2 IDENTIFICACION Y ANALISIS DE LAS FUENTES DE INCERTIDUMBRE:

2.1- Determinar el modelo matemático (ecuación para el cálculo de la concentración)

I.- r (Masa de Cadmio lixiviado por unidad de area mg/dm2) = ((Co * Vl) / Av) * d * Facido * Ftiempo * Ftemp

Co Contenido de cadmio en la solución de extracción, mg/L

Vl Volumen del lixiviado, L

Av Area superficial del objeto de prueba, dm2

d Factor de dilución

Facido Influencia de la concentración del ácido

Ftiempo Influencia del tiempo de lixiviación

Ftemp Influencia de la temperatura

II.- Co = (Ao-Bo)/Bi

Ao Absorbancia del metal en la muestra

Bo Intercepción de la curva de calibración

Bi Pendiente de la curva de calibración

Por lo tanto:

III.- r (mg/dm2) = (Vl * (Ao-Bo) * d * Facido * Ftiempo * Ftemp) / (Av * Bi)

EJEMPLO DE LA DETERMINACION DE LA INCERTIDUMBRE DE LA NOM 009 SSA1 1993

PASO 1 ESPECIFICACION DEL METODO:

1.-Elaboración del diagrama de procesos unitarios

Preparación

Acondicionamiento

de la superficie

Llenado con Acido

Acético al 4%

Lixiviación por 24

hs.

Homogeneización

del lixiviado

Preparación de

Estándares de

Calibración

Determinación por

AAE

Calibración del

AAE

Resultado




22

Concentración de Cadmio (Co):

Curva de calibración:

Ver Hoja siguiente

U(Co) = 0,017801097 mg/L

Area (Av):Longitud 1 (altura):

La superficie se calculo en 2.37 dm2, se estima que la medición está +- 2 mm al 95% de confianza (LC)

si la altura es de 1 dm entonces la Ustd = 2 mm/2 por ser LC 95% = 1 mm

Longitud 2 (ancho):

idem anterior Ustd = 1 mm = 0.01 dm

Area:

Ya que no es exactamente geométrico se utiliza una Uc=5% al 95% LC,

Ustd= 5/2 = 2.5 dm2

Area = 2.37 dm2

Uc(Av) = (0.01^2 + 0.01^2 + ((0.05x2.37) / 1.96)^2)^0.5 0,062091166 dm2

2.2- Identificación de todas las fuentes de incertidumbre (a través de un diagrama causa-efecto)

IV.- r (mg/dm2) = ((Vl * (Ao-Bo) * d) * Ftemp * Facido * Ftiempo / (Av * Bi))

Co Vl

Curva de Calibración Llenado

Facido Temperatura

Ftiempo Calibración

Ftemperatura Lectura

r

Longitud 2

Longitud 1

Area

Av d




23

Efecto de temperatura:El efecto de la temperatura está publicado y es 5%/grado C (ver ref 1-5 Eurachem) para el rango de +- 2 que permite

el metodo, el Ftemp sería 1+-0.1

Ustd con una distribución rectangular sería 0.1/3^0.5 = 0.06 0,06 mL

Efecto de Tiempo:Un estudio (ref 1 eurachem) 1.8 mg/l en 86 mg/l = 0.3%/h por el rango de +- 0.5h en 24 h el Ft = 1+-(0.5x0.003) = 1+- 0.0015

Ustd con una distribución rectangular sería 0.0015/3^0.5 = 0.001 0,001 mL

Concentración del ácido acético:Un estudio dice que ujh cambio de 4 a 5% del ácido aumenta de 92.9 a 101.9 mg/l o sea 9.7% (0.097) por cada 1% de cambio

concentracion de acido

Por otro lado la Ustd de la estandarizacion del acido con NaOH (ver ejemplo en eurachem) es de 0.008% v/v

Ustd del Facido = 0.008 x 0.1 = 0.0008, como esta en Ustd, no se hacen mas calculos 0,008 mg/L

CALCULO DE LA INCERTIDUMBRE POR LA CURVA DE CALIBRACION

Xi Yi Xi-X (Xi-X)^2 Yi-Y (Yi-Y)^2 (Xi-X)(Yi-Y) x^2 Yi ^y [yi-^y] (yi-^y)^2 Xi Y1 Y2 Y3 Yp

1 0,1 0,029 -0,400 0,160 -0,101 0,010 0,040 0,0 0,0 0,03 0,00 0,000017 1 0,1 0,028 0,029 0,029 0,029

2 0,3 0,083 -0,200 0,040 -0,047 0,002 0,009 0,1 0,1 0,08 0,00 0,000003 2 0,3 0,084 0,083 0,081 0,083

3 0,5 0,133 0,000 0,000 0,004 0,000 0,000 0,3 0,1 0,13 0,00 0,000014 3 0,5 0,135 0,131 0,133 0,133

4 0,7 0,181 0,200 0,040 0,052 0,003 0,010 0,5 0,2 0,18 0,00 0,000015 4 0,7 0,180 0,181 0,183 0,181

5 0,9 0,220 0,400 0,160 0,091 0,008 0,036 0,8 0,2 0,23 0,01 0,000028 5 0,9 0,215 0,23 0,216 0,220

Suma 2,5 0,646 0,000 0,400 0,000 0,023 0,096 1,7 0,000078 Suma 2,5 0,642

n 5 No de datos

X 0,5 Media de X

Y 0,1292 Media de Y

r 0,9983

b 0,2410

a 0,0087

Sy/x 0,0051 Desviación estándar residual

Sb 0,0080 Desviación estándar de la intercepción

Sa 0,005 Desviación estándar de la pendiente

LC95b 0,2203

LC95a -0,0032

Sx0 0,018 Incertidumbre (Error) del resultado analítico (u(co))

m 2 No. de lecturas

p 15 No. de puntos de la curva leidos

Co 0,26 Resultado analítico

Sxx 0,4 Suma de los cuadrados de la diferencia de los valores menos la media de x




24

CALCULO DE LA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA:

U = Uc * t95 0,00694

RESUMEN:

Símbolo

Magnitud de

Entrada o Fuente de

Incertidumbre

UnidadesValor

Estimado (x)

Fuente de

Información

Incertidumbre

Original

Tipo de

DistribuciónCalculo de la Us

Incertidumbre

Estándar

Incertidumbre

Estándar

Combinada

Coeficiente de

Sensibilidad

Incertidumbre

Estándar

Relativa U(x)/x

Concentración de

Cadmio (Co):

Concentración de

Cadmio (Co):mg/L 0,26

Curvas de

calibración0,017801 0,06847

Diluciones (D) Diluciones (D) #¡DIV/0!No se hizo

dilución

Volumen (Vl): Volumen (Vl): L 0,332 0,001829 0,00551

Llenado L Practica 99.5+-0.5% Triangular 0.005*332/6^0.5 0,0007

Temperatura L Metodo 22+-2 C Rectangular(2.1e-4*332*2) /

(3)^0.50,0001

Lectura del

VolumenL Practica 1% error Triangular 0.01*332/(6)^0.5 0,0014

Calibración L Especificacion 500+-2.5 ml Triangular 2.5/(6)^0.5 0,0010

Area (Av): dm2 2,37 0,062091 0,02620

Longitud 1 altura dm Practica 2 mm al 95%P Normal 0.02/1.96 0,010

Longitud 2 ancho dm 2 mm al 95%P Normal 0.02/1.96 0,010

Area dm2 5 % error Normal (0.05*2.37)/1.96 0,060

Concentración del

ácido acético:mg/L 1

Estudio + U de la

titulación del

ácido

0.1% por %v/v

acido + 0.008% U

de la titulación con

NaOH

0.008*0.1 0,0080 0,00800

Efecto de Tiempo: mL 1 0,0015 Rectangular 0.0015/(3)^0.5 0,001 0,00100

Efecto de

temperatura:mg/L 1 0,1 Rectangular 0.1/(3)^0.5 0,06 0,06000

PASO 4 CALCULO DE LA INCERTIDUMBRE ESTANDAR COMBINADA:

Los valores intermedios son:

r (Masa de Cadmio lixiviado por unidad de area mg/dm2) = ((Co * Vl) / Av) * d * Facido * Ftiempo * Ftemp

Símbolo

Magnitud de

Entrada o Fuente de

Incertidumbre

UnidadesValor

Estimado (x)

Incertidumbre

Estándar

Incertidumbre

Estándar

Combinada

Incertidumbre

Estándar

Relativa U(x)/x

Concentración de

Cadmio (Co):

Concentración de

Cadmio (Co):mg/L 0,26 0,017801 0,06847

Volumen (Vl): Volumen (Vl): L 0,332 0,001829 0,00551

Area (Av): Area (Av): dm2 2,37 0,062091 0,02620

Efecto de

temperatura:

Efecto de

temperatura:mg/L 1 0,0600 0,06000

Efecto de Tiempo: Efecto de Tiempo: mL 1 0,0010 0,00100

Concentración del

ácido acético:

Concentración del

ácido acético:mg/L 1 0,0080 0,00800

Diluciones (D)

r = ((0.26 * 0.332 * 1 * 1 * 1 * 1) / 2.37) = 0,036422 mg/dm2

0,003469 mg/dm2

Valores Intermedios e incertidumbres

Incertidumbre Combinada Ucr = r * ((U(Co)/Co)^2+(U(Vl)/Vl)^2+(U(Av)/Av)^2+(Ufacido/Facido)^2+(Uft/ft)^2+ (Uftemp/Ftemp)^2) ^0.5 =

0.0034 mg/dm2




25

Para la estimación de la incertidumbre inicial los datos de partida son los de la validación del método.

Incertidumbres Std. Vs Incertidumbre Combinada

0,003462

0,002494

0,000201

0,000930

0,000291

0,000036

0,002185

0,0000 0,0005 0,0010 0,0015 0,0020 0,0025 0,0030 0,0035 0,0040

r

Concentración de Cadmio (Co):

Volumen (Vl):

Area (Av):

Concentración del ácido acético:

Efecto de Tiempo:

Efecto de temperatura:

Incertidumbres (mg/dm2)

Concentra

ción de

Cadmio

(Co):

Volumen

(Vl):Area (Av):

Concentración

del ácido acético:

Efecto de

Tiempo:

Efecto de

temperatura:

Valor 0,26 0,332 2,37 1 1 1

Incertidumbre Std 0,01780 0,00183 0,06209 0,00800 0,00100 0,06000

Concentración de Cadmio (Co):0,26 0,2778011 0,26 0,26 0,26 0,26 0,26

Volumen (Vl): 0,332 0,332 0,33382877 0,332 0,332 0,332 0,332

Area (Av): 2,37 2,37 2,37 2,432091166 2,37 2,37 2,37

Concentración del ácido acético:1 1 1 1 1,008 1 1

Efecto de Tiempo: 1 1 1 1 1 1,001 1

Efecto de temperatura: 1 1 1 1 1 1 1,06

r 0,036422 0,038916 0,036623 0,035492 0,036713 0,036458 0,038607

u(y,xi) 0,002494 0,000201 0,000930 0,000291 0,000036 0,002185

u(y)^2,u(y,xi)^2 1,199E-05 6,22E-06 4,03E-08 8,65E-07 8,49E-08 1,33E-09 4,78E-06

Inceridumbre

Combinada Uc(r)0,003462

HOJA DE CALCULO PARA LA ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE




26

4.0 BIBLIOGRAFIA 1.- NMX EC 17025 IMNC 2006 2.- The Fitness for purpose of Analytical methods, Eurachem, 1998 (www.eurachem.com) 3.- Métodos analíticos adecuados a su propósito. Guía de laboratorio para validación de métodos y tópicos relacionados. CNM-MRD-PT-030, CENAM, 1998. 4.- Managers guide to VAM, UK Dept. of Trade and Industry, Valid Analytical Measurements Programme. 5.- EAL P-11, “Validation of Test Methods”, European Cooperation for Accreditation of Laboratories, 1997. 6.- USEPA “Guidance for method development and methods validation for the RCRA Program”, 1992. 7.- ICH Q2B Guidance for Industry “Validation of Analytical Procedures: Methodology” (International Conference for Armonization), 1996. (1) NMX CH 140-1996 IMNC “gUÍA PARA LA EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN LOS RESULTADOS DE LAS MEDICIONES” (2) Eurachem/CITAC Working Group “Quantifying uncertainty in analytical measurement”, Eurachem/CITAC Guide, 2nd. Edition, 2000 Centro Nacional de Metrología CENAM, “Guía para estimar la incertidumbre de la medición”, El Marqués, Qro, México, Mayo 2000,. National Institute of Standards and Technology NIST, “Guidelines for evaluatingand expressing the uncertainty of NIST measurements results”, NIST Technical Note 1297, 1994 Ed. CCIA-Ma. Eugenia Moreno de E.“Apuntes del curso de cuantificación de la incertidumbre en mediciones analíticas”, México, D.F. 1998. National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Background, International and US perspectives on

http://www.eurachem.com/




27

measurement uncertainty” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/international1.html y 2, 3/09/98 National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Essentials of Expressing uncertainty” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/basic.html, 3/09/98 National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Evaluating uncertainty components: Type A” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/typea.html, 3/09/98 National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Evaluating uncertainty components: Type B” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/typeb.html, 3/09/98 National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Combinig uncertainty components” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/combination.html, 3/09/98 National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Expanded uncertainty and coverage factor” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/coverage.html, 3/09/98 National Institute of Standards and Technology NIST, “The NIST Reference on Constants, Units and Uncertainty, Examples of uncertainty statements” http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/examples.html, 3/09/98

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/international1.html

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/basic.html

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/typea.html

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/typeb.html

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/combination.html

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/coverage.html

http://physics.nist.gov/cuu/Uncertainty/examples.html

Guia implantacion validacion y verificacion de metodos analiticos inecc 2013

Documents

Transcript of Guia implantacion validacion y verificacion de metodos analiticos inecc 2013