ETIOPATOGENIA Y DIAGNOSTICO EN ENFERMEDADES TROPICALES Editado por: Sociedad Española de Medicina Tropical y Salud Internacional con motivo de la celebración de su II Reunión, celebrada en Salamanca el 2 Febrero de 2001 Coordinador: Antonio Muro Comité organizador de la II Reunión de la SEMTSI y colaboradores en la edición del libro: • Mª Do Amparo Andrade • Cristina Carranza • Patricia Casanueva • Elsa Espinoza • Julio López-Abán • Clemente Mateos • Blas Muñoz-Perea • Javier Pardo • Álvaro Plaza • Sara Ramos • Belén Vicente Junta Directiva de la SEMTSI: • Jorge Alvar • Joaquín Gascón • Fernando Carreras • Agustín Benito • Josep Mª Jansa • Santiago Mas-Coma • José Luis Pérez-Arellano Coordinador de la edición: • Antonio Muro A K. Mott, jefe de la división de schistosomiasis de la OMS, quien amó y dedicó su vida al conocimiento de la medicina tropical. Va por ti, Dr. Mott. Antonio Muro La Sociedad Española de Medicina Tropical y Salud Internacional (SEMTSI) acaba de celebrar su segunda Reunión en Salamanca. Si esta ciudad es un lugar emocionante y muy adecuado para hablar de ciencia, no menos perfecta ha sido la organización de todas las actividades realizadas, desde el equilibrio entre las conferencias al concierto de música barroca por el agradable cuarteto de cámara “Ars” formado por estudiantes, sin olvidar la interesante visita a la ciudad monumental emotivamente guiada por el Prof. Calderón de la Barca. Todo ha sido posible en un suspiro de tiempo, gracias a la perfecta organización del Prof. Antonio Muro y todo su equipo. Les agradecemos el esfuerzo y damos la enhorabuena por el éxito, a

la vez que nos felicitamos por lo viva que está la SEMTSI, con más de 180 participantes en esta reunión salmantina. La primera reunión, celebrada en Granada en 1999, versó sobre “Vacunas para Enfermedades Tropicales” y ahora, los organizadores, consolidando la idea de que las reuniones entre congresos sirvan para hacer actualizaciones monográficas, nos han sabido reunir un ramillete espléndido de especialistas para hablarnos de “Etiopatogenia y Diagnóstico de Enfermedades Tropicales”. Además de los ponentes de la SEMTSI que nos han actualizado en la Etiopatogenia de la tuberculosis (Prof. Pérez Arellano, Univ. de Las Palmas de Gran Canaria) y Etiopatogenia de la malaria (Dr. Alonso, Fundació Clinic, Barcelona), y Diagnóstico molecular de los brotes por parásitos (Dra. Gárate, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda), nos han acompañado el Prof. Antunes (Univ. de Lisboa) que nos ha traído lo más reciente de la Etiopatogenia del sida y el Prof. Hillyer (Univ. de Río Piedras, San Juan de Puerto Rico) que nos habló de sus trabajos sobre Inmunodiagnóstico de fasciolosis y bilharziosis. Así pues, un programa intenso e interesante que ahora se edita para que todos los miembros de la SEMTSI tengan disponibles las conferencias. El esfuerzo hecho por el Prof. Valladares (Univ. de Tenerife) para poner en marcha un grupo de trabajo sobre Prevalencia de parasitosis en España merece ser reconocido. En este libro se presentan las normas que estos grupos de trabajo han de reunir para que estén al alcance de todos y puedan surgir nuevas iniciativas. Muchas gracias a todos los ponentes por su esfuerzo de actualización y síntesis, y muchas gracias a todos los asistentes. Jorge Alvar Presidente de la SEMTSI

Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection Francisco Antunes Faculdade de Medicina de Lisboa, Hospital de Santa Maria and Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Lisboa, Portugal AIDS was first recognised as a new and distinct clinical entity in 1981 (1,2). The first cases were recognised because of an unusual clustering of diseases such as Pneumocystis carinii pneumonia and Kaposi’s sarcoma in young homosexual men. Most of the first cases of this newly defined clinical syndrome involved homosexual men, and soon reported in five new categories of AIDS patients: intravenous drug users, haemophiliacs, blood transfusion recipients, adults from Central Africa, and infants born to mothers who themselves had AIDS or were intravenous drug users. In 1983, three groups, Essex and colleagues (3), Gallo and colleagues (4) and Montagnier and colleagues (5) postulated that a variant T-lymphotropic retrovirus (HTLV) could be the etiologic agent of AIDS. Soon after, proof that the disease was linked to T-lymphotropic retroviruses was obtained by Gallo and colleagues (6). Further characterization of the agent, now termed human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), revealed that it was only distantly related to HTLV. HIV comprises two distinct viruses, HIV-1 and HIV-2, which differ in origin and gene sequence. Both belong to the lentivirus subfamily of retroviruses and have a similar structure and order of genes. In common with all retroviruses the gag gene encodes the structural proteins of the virus particle, and the env gene encodes the glycoproteins (gp120, gp41) that comprise the viral envelope antigens, which interact with cell surface receptors. The p24 and gp120 proteins are the ones most commonly incorporated into diagnostic tests for HIV antibodies. Based on relatedness of nucleotide sequences and the diversion seen among HIV isolates, it is possible that HIV-1 and HIV-2 originated quite recently, and it is generally agreed that both represent novel, zoonotic

introductions into the human population within the past 100 years (7). The first documented infection with HIV-1, based on antibody detection, occurred in 1959 (8). HIV-2 was identified in 1987 (9) and is endemic in West Africa, but has spread to Europe (especially Portugal) and to India. Although both HIV-1 and HIV-2 appear to have entered the human population several decades ago, HIV-1 is being more virulent than HIV-2. It is now apparent that the HIV-1 isolates from infected people in the United States and Europe are closer to each other than to typical HIV-1 isolates from people in Africa or Asia. This has led to the classification of HIV-1 into subtypes or ‘clades’ (10). In human populations, there are three major groups of HIV-1, named M, N (non-M, non-O) and O. Group M represents all the subtypes or clades A - H that have spread to cause the worldwide pandemic. The viruses isolated from group O are less related to HIV-1 subtypes from group M than the subtypes within each group. To emphasize this distance HIV-1 subtypes A through H are designated the major group, and HIV-O is designated the outgroup. HIV-1 groups O and N are largely confined to Gabon, Cameroon and neighbouring countries (11). Group M subtypes, have envelope gene sequences that vary by 20% or more between subtypes. Most of HIV-1 isolates from the United States and Western Europe is of single subtype, HIV-1 B. On the African continent in general, subtypes A, C and D have been found more frequently than others. In Asia, the introduction and spread of HIV-1 appeared about a decade later than in West. In Thailand, HIV-1 subtype E has spread very rapidly among heterosexuals. In Western India, subtype C also caused a rapidly spreading heterosexual epidemic. Like HIV-1, HIV-2 can be subdivided into a number of major groups, which appear to represent separate zoonoses from a primate host. One of the most perplexing aspects of AIDS as an infectious disease is the fact that clinical signs and symptoms rarely appear until several years after the initial infection. During this period, the host immune system presumably responds to high rates of virus replication with continuous, vigorous immunoselection cycles, which allow the survival and expansion of immunoresistant variants. However, phenotypic variants with different cell tropisms and cytopathic properties have also been well characterized. After infection, the HIV-1 viruses that can be isolated during the first few months or years, before clinical disease appears, have been designated “slow-low” because they grow poorly in cell culture. Conversely, HIV-1 viruses isolated from patients with clinical disease have been designated “rapid-high” because they grow much more efficiently. The “slow-low” HIV-1 also grow better in monocytes than in established T4-lymphoid cell lines, whereas the “rapid-high” viruses grow well in human T4 cell lines but poorly or not at all in fresh monocytes (12). During the long asymptomatic incubation period before AIDS develops, the virus is not latent, but is actively replicating, producing as many as 109 infectious viral progeny and over 107 newly infected cells each day (13). This high rate of virus replication allows numerous immune escape and drug-resistant mutants to be generated, and permits substantial genetic drift within each infected individual. The HIV shares features common to all retrovirus, including the ability to route genetic information from RNA to DNA. This is accomplished by a unique enzyme, reverse transcriptase (RT), which is encoded by a

gene within the retroviral genome. The binding of an extracellular infectious virions to a susceptible cell begins the afferent portion of the HIV retroviral life cycle. Binding occurs between the surface gp120 env protein of the virus and the cellular CD4 molecule. This reaction permits the transmembrane gp41 env molecule to fuse the viral lipid envelope with the cell membrane. Cytoplasmic penetration by the virus core results, liberating the viral genomic RNA as a nucleoprotein complex. The RNA is then rapidly converted by RT into a copy of double-stranded DNA and transported to the nucleus. Here, in association with viral integrase, the viral DNA is integrated by cleavage steps into the host chromosomal DNA. This begins the efferent portion of the life cycle. The proviral DNA can replicate synchronously with host chromosomal genes. Expression of the viral genes begins when the proviral DNA serves as a template for DNA-dependent RNA polymerase activity. Such activity results in production of viral regulatory factors that enhance and stabilize the later-stage mRNAs responsible for structural function. These structural proteins assemble around viral genomic RNA at the plasma membrane, as a final step in the HIV life cycle. The infectious virus matures after it has been released from the plasma membrane. Full replication of HIV in T-lymphocytes usually results in cell deaths, whereas macrophages may sustain lower levels of viable virus production for long periods. Acute HIV-1 infection is a transient symptomatic illness associated with high-titer HIV-1 replication and a robust and expansive immunologic response to the invading pathogen. Forty to 90 percent of new HIV-1 infections are associated with symptomatic illness. This syndrome is often undiagnosed or misdiagnosed, since HIV-1 antibodies are usually not detected during the early phase of infection. The diagnosis of acute HIV-1 infection requires a high index of clinical suspicion and correct use of specific diagnosis laboratory tests. Accurate early diagnosis is now particularly important because of the potential clinical benefit of early antiretroviral therapy. WHO and UNAIDS have estimated that by the end of 2000, the number of adults and children living with HIV/AIDS worldwide will reach 36.1 million people (14). It is also estimated that during 2000, 5.3 million people (including 600.000 children aged < 15) became infected. By the end of 2000, it is estimated that a total of 21.8 million adults and children will have died because of HIV/AIDS since the beginning of the epidemic. Mortality due to HIV continued to increase, with an estimated 3 million deaths during 2000. Sub-Saharan Africa remains the hardest-hit region, accounting for 72% of the 5.3 million people infected with HIV during 2000, 70% of the people living with HIV/AIDS and 80% of AIDS deaths in the past year. HIV pathogenesis The pathogenesis of HIV infection is extremely complex. A variety of virologic and immunologic mechanisms contribute to the progressive deterioration of immune function and to progression of HIV to AIDS. Among the multiple pathogenic mechanisms that have been proposed, four are critical for the establishment and propagation of HIV infection over time and for the progression of HIV disease: 1. lack of elimination of HIV after primary infection; 2. persistent virus replication in lymphoid organs throughout the course of HIV infection; 3. chronic stimulation of the immune system, which may cause inappropriate immune activation and progressive exhaustion of the immune response; 4. destruction of lymphoid tissue, which results in severe impairment of

the ability to maintain over time and effective HIV-specific immune response and to generate immune responses against new pathogens. Recent advances in the delineation of the virologic and immunologic events associated with primary infection and of the anatomic compartments that serve as reservoirs for HIV, and the sites at which virus replication primarily occurs represent a fundamental advance in our understanding of the pathogenesis of HIV infection. However, a series of important mechanisms, such as those allowing HIV to elude the immune response, those determining the effectiveness of the HIV-specific immune response, and those leading to the destruction of the lymphoid tissue, have not yet been fully delineated. Studies on the kinetics of virus turnover (16, 17) have supported previous findings that virus replication is continuous in all stages of HIV infection and have provided a precise determination of the number of virions produced every day. A mathematical model has been used to calculate the potential number of CD4+ T-lymphocytes that are depleted and replenished every day, and it has been proposed that there is a very high turnover of CD4+ T cells (a mean of 1.8 x 109 cells per day). From the beginning AIDS was recognized to result from selective depletion of CD4+ T cells. The function of these cells is to help citotoxic T lymphocytes (CTLs) or killer cells to destroy other cells expressing foreign antigens, and also to enhance antibody production by B-lymphocytes. Another cell type that expresses low levels of CD4 antigen is the tissue macrophage. These cells, which function as scavengers and as antigen-presenting cells, become infected by HIV, and act as an important reservoir of the virus in the body. Microglia in the brain, dendritic cells include the Langerhans cells of the mucous membranes are types of macrophages, and also targets of the virus. Whereas the CD4 antigen is important for HIV attachment to the cell surface, two chemokine receptors, known as CCR5 and CXCR4, where identified as coreceptors to CD4 that permitted virus entry (18, 19). The most common mode of HIV-1 infection is sexual transmission at the genital mucosa. In rhesus monkeys with acute intravaginal simian immunodeficiency virus infection, the first cellular targets of the virus are Langerhans cells. These cells then fuse with CD4+ T cells and spread to the deeper tissues. Shortly thereafter, systemic dissemination occurs, and the virus can be cultured from plasma 5 days after infection (20). In humans, there appears to be some variation in the time from mucosal infection to initial viremia, with estimates ranging from 4 to 11 days. Studies of persons with acute HIV-1 infection demonstrate selective infection by certain populations of HIV-1 variants. Transmitted viruses are typically macrophage-tropic and lack the ability to induce multinucleate syncytia in tissue culture (21). The coreceptor for macrophage-tropic strains (R5 viruses) is CCR5 (22). Langerhans cells, the earliest target of the virus, express CCR5 but may not express CXCR4, the coreceptors required for the entry of X4 viral isolates (23). This may explain why R5 viruses are the predominant strains transmitted during acute HIV-1 infection. After infection, there is a rapid rise in plasma viremia, with widespread dissemination of the virus associated with seeding of lymphoid organs and trapping of virus by follicular dendritic cells (24, 25). After the initial rise in plasma viremia, there is a marked reduction from the peak viremia to a steady-state level of viral replication (26). The decreased in the viral load during acute HIV-1 infection is probably due to virus-specific

immune responses that limit viral replication. There is a temporal relation between the appearance of HIV-1 specific CTLs and declining viral titers. During acute infection, a high proportion of CTLs specifically targeted against the virus was detected (27). These observations, coupled with in vitro evidence of a potent antiviral effect of CTLs, suggest that these cells are at least partly responsible for the reduction in HIV-1 viremia. In addition, soluble factors produced by CD8 T cells inhibit HIV-1 replication in the early stages of acute infection and may thus contribute to the reduction of the viral load (28). In contrast, neutralizing antibodies are not usually detectable until weeks to months after the reduction in replicating virus (26). Many of the symptoms of acute HIV-infection may reflect the immune response to the virus, and the symptoms usually resolve as the viral load in the plasma decreases (29). After the initial drop in viremia, a viral set-point is established. Persons with the highest viral loads have the most rapid rates of progression to AIDS and death (30). The factors determining this set-point may be related to genetic differences in coreceptors or qualitative differences in the immune response (31, 32, 33). A more broadly directed CTL response in the early stages of HIV-1 infection is associated with a subsequently lower viral load and slower progression of disease, suggesting that containment of viremia by this immune response in the early stages of infection may have a clinical benefit (34). Differences in the virulence of viral strains may also modulate the set-point. Less virulent strains have attenuated replication, which is associated with lower levels of viremia and slower disease progression (35). The clinical course of HIV infection has been well studied. Although progression to AIDS occurs in most HIV-infected individuals, in a small percentage, HIV disease does not progress for an extended period of time. On the basis of the duration of HIV infection and the kinetics of virologic and immunologic events observed throughout HIV disease, three dominant patterns of evolution of HIV disease have been described: 1. eighty to 90 percent of HIV-infected persons are “typical progressors” and experience a course of HIV disease with a median survival time of approximately 10 years; 2. five to 10 percent of HIV-infected persons are “rapid progressors” and experience an unusually rapid (3 to 4 years) course of HIV disease (36); 3. about 5 percent of HIV-infected persons do not experience disease progression for an extended period of time (at least 7 years) and are termed “long-term nonprogressors” (37). The typical course of HIV infection includes three phases: primary infection, clinical latency, and clinically apparent disease. On the basis of the clinical history, an acute clinical syndrome of variable severity may occur in a relatively large proportion (50 to 70 percent) of HIV-infected individuals, and although HIV-specific antibodies may not be detected, the initial period of primary infection is characterized by high levels of virus in circulation (i.e. viremia) (38). Appearance of symptoms during acute primary infection usually occurs within 3 to 6 weeks of infection, together with the high levels of viremia. In most patients, both resolutions of symptoms and down regulation of the viremia occur within 9 to 12 weeks after the onset of symptoms. Both events are associated with the appearance of HIV-specific immune response. The phase of primary infection is followed by the long, clinically latent period of HIV infection. In “typical progressor”, this phase of infection may last for years (median, 8 to 10), and in “rapid progressors”, the

progression to AIDS occurs within 2 to 3 years after seroconversion. The progression to AIDS results from the continuous replication of the virus in the lymphoid tissue, which is associated with progressive destruction of this tissue and severe impairment of immune function. This advanced phase of infection is characterized by severe and persistent constitutional signs and symptoms or by opportunistic infections or neoplasms, or both. In “rapid progressors” immune responses are usually defective, levels of antibodies against HIV proteins and neutralizing antibody are low to absent. A series of immunologic abnormalities typical of HIV-infected individuals in late-stage disease are usually observed in “rapid progressors”, including high percentages of activated CD8+ T cells expressing CD38 and HLA-DR and elevated serum levels of β2-microglobulin, neopterin, soluble CD8, and soluble interleukin-2 (IL-2) receptors. The levels of viral load are usually very high in “rapid progressors” (39, 40). The criteria that have been used for nonprogression include documented HIV infection for more than 7 years, stable CD4+ T cell counts higher than 600 cells/µL, absence of symptoms, and no antiretroviral therapy. In addition to normal and stable CD4+ T cell counts, the absolute number of CD8+ T lymphocytes is significantly and consistently higher in most “long-term nonprogressors” (31). The distribution of certain surface markers on CD8+ T cells, for example the presence of an increased percentage of CD8 + CD38 + T cells, that is associated with a severe prognosis in “typical progressors”, is significantly lower in “long-term nonprogressors”. Similarly, other immunologic parameters such as serum levels of β2-microglobulin are within the normal range, and proliferative responses to mitogens, alloantigens, and soluble antigens are preserved. HIV-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) against various HIV proteins, can readily be detected in “long-term nonprogressors”, in contrast to “typical progressors”, who experience a decline over time of HIV-specific activity (41). The contribution of persistent cytotoxic activity to the maintenance of the status of nonprogression remains to be clarified. With regard to the humoral immune response, higher titers of neutralizing antibodies in “long-term nonprogressors” compared with “typical progressors”. The contribution of neutralizing antibodies in preventing disease progression remains still to be determined. From a virologic standpoint, levels of viral load, including frequency of HIV DNA-containing cells and virus replication in both peripheral blood and lymph node mononuclear cells as well as plasma viremia, are fourfold to 20-fold lower in “long-term nonprogressors” than in “typical progressors”. Of particular interest is the fact that lymph node architecture is preserved, the degree of lymphoid tissue activation (i.e., formation of germinal centers) is significantly lower, and tissue involution is rarely observed in “long-term nonprogressors” (32). Furthermore, involvement of genetic factors (i.e., major histocompatibility complex class I and II molecules) has been proposed as an explanation for the lack of disease progression in “long-term nonprogressors” (42). However, at the present time, the relative contributions of immunologic, genetic and virologic factors in determining progression of HIV infection remain unclear. CD4+ T lymphocytes are the primary targets of HIV infection. The progressive depletion of CD4+ T lymphocytes is characteristic of every stage of HIV infection. Several mechanisms have been proposed for the

depletion of CD4+ T lymphocytes, which can be divided into two groups: 1. direct, virologic related to HIVmediated cytopathic effect; 2. indirect, nonvirologic that include predominantly immunologic phenomena triggered during the course of HIV infection (table 1). TABLE 1. Mechanisms responsible for the depletion of CD4+ lymphocytes during the course of HIV infection (43-49) VIROLOGIC • direct single-cell killing by both accumulation of unintegrated viral DNA and inhibition of cellular protein synthesis • syncytia formation of peripheral blood CD4+ T lymphocytes regulated by the LFA-1/ICAM-1/-2/-3 pathway of cell-to-cell adhesion NONVIROLOGIC • auto immune hypothesis, involving both cellular and humoral immune responses direct against gp120 and gp41 proteins of HIV-1 that may cross-react with self-HLA class I and II molecules • induction of anergy by abnormal presentation of gp120 bound to CD4+ T cells that could generate CD4+ cytotoxic cells from the pool of resting T cells • the hypothesis that HIV proteins can potentially function as supertantigens by binding to T cells that display a specific variable (V) region of the â chain of the T cell antigen receptor is still the subject of active investigation • apoptosis has been hypothesized that represents the primary mechanisms of CD4+ T cell death in HIV infection, leading to the elimination of autoreactive T cells, and it may be involved in the regulation of the termination of antigen-specific immune responses by causing death of those cells that have been stimulated repetitively with a specific antigen • humoral and cell-mediated immunity play an important role in the control of HIV replication and spread in vivo, contributing significantly to the elimination of HIV-infected cells, including CD4+ T cells, macrophages, and follicular dendritic cells (FDCs), either by HIV-specific CTLs or by antibodydependent cellular cytotoxicity The complexities of the virus-specific immune responses and of the pathogenic mechanisms of HIV disease are critical for the development of vaccine and therapeutic strategies. REFERENCES 1. Gottlieb MS, Schroff R, Schanker HM et al. Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular immunodeficiency. N Engl J Med 1981; 305: 1425 2. Masur H, Michelis MA, Creene JB et al. An out break of community-acquired Pneumocystis carinii pneumonia: initial manifestation of cellular immune dysfunction. N Engl J Med 1981; 305: 1431 3. Essex M, Melane MF, Lee TH et al. Antibodies to cell membrane antigens associated with human T-cell leukemia virus in patients with AIDS. Science 1983; 220: 859 4. Gallo RC, Sarin PS, Gelmann EP et al. Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983; 220: 865 5. Barre-Sinoussi F, Cherman J-C, Rey F et al. Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983; 220: 868 6. Popovic M, Sarngadharan MG, Read E et al. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 1984; 224: 497 7. Hahn BH, Shaw GM, De Cock KM et al. AIDS as a zoonosis : scientific and health implications. Science 2000; 287: 607 8. Nahmias AJ, Weiss J, Yao X et al. Evidence for human infection with an HTLV-III/LAV-like virus in Central Africa, 1959. Lancet 1986; 1: 1279 9. Clavel F, Mansinho K, Chamaret S et al. Human immunodeficiency virus type 2 infection associated with AIDS in West Africa. N Engl J Med 1987; 316: 1180 10. Louwagie J, McCutchan F, Mascola J et al. Genetic subtypes of HIV-1. AIDS Res Hum Retroviruses 1993; 9:

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Aspectos actuales de la patogenia de la tuberculosis José Luis Pérez Arellano*, Alfonso Angel-Moreno Maroto*, Adela Francés Urmeneta* y José Antonio Caminero Luna** * Unidad de Enfermedades Infecciosas y Medicina.Tropical. Servicio de Medicina Interna Hospital Insular de Las Palmas de Gran Canaria. Departamento de Ciencias Médicas y Quirúrgicas. Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. ** Servicio de Neumología. Hospital de Gran Canaria Dr Negrín. Las Palmas de Gran Canaria Introducción La tuberculosis es un ejemplo de enfermedad que debe ser perfectamente conocida por el médico, ya que cumple los 6 requisitos que, para la selección de contenidos, se resumen bajo el acrónimo PUIGER (prevalencia, urgencia, intervención, gravedad, ejemplaridad pedagógica y repercusión socioeconómica) La prevalencia de la enfermedad tuberculosa es elevada considerándose, a pesar de los problemas que existen para el diagnóstico, que existen en el mundo entre 10 y 30 millones de personas

con enfermedad activa y que la incidencia de nuevos casos es de aproximadamente 4-10 millones1. Otro dato de especial transcendencia es la tasa de infección tuberculosa ya aproximadamente un tercio de la humanidad está infectada. La gravedad del problema es patente si se señala la cifra de mortalidad de esta entidad que es de aproximadamente 1-3 millones de personas al año. España puede considerarse, a la luz de cifras recientes un país de endemia tuberculosa siendo la incidencia aproximada de 50/100.000 habitantes/año y un riesgo de infección anual de 0,17%2. La tuberculosis, de forma similar a otras enfermedades infecciosas, sigue una evolución temporal peculiar experimentando una tendencia al declive. Este fenómeno fue detectado al estudiar las curvas de mortalidad, morbilidad e infectividad3 en las que se observó que la tuberculosis había sobrepasado el punto critico sanitario, es decir el periodo a partir del cual era posible erradicar la infección. De hecho, empleando modelos matemáticos se postuló la desaparición de la tuberculosis en torno al año 20104. La asociación de varios factores, de los que el más importante ha sido la epidemia de infección por VIH, ha complicado esta situación, enlenteciendo el declive natural de la enfermedad tuberculosa, así como aumentando su morbilidad y mortalidad5. Por ello, el manejo de la tuberculosis es un problema que reviste urgencia, en el sentido de que se necesitan soluciones rápidas para evitar situaciones irreversibles y que además posee importantes repercusiones médicas y sociales, ya que afecta a aspectos colectivos de la población. Por otro lado, y afortunadamente, la tuberculosis es un problema médico en el que la intervención (actuación a nivel preventivo, curativo o educativo) es efectiva y produce un cambio radical en la evolución de la enfermedad . Finalmente, la tuberculosis es una entidad de alta ejemplaridad pedagógica, ya que es el paradigma de la interacción entre un agente exógeno y la respuesta inmunitaria del hospedador. En este trabajo desarrollaremos de forma detallada los aspectos más novedosos de la etiopatogenia de la tuberculosis. Además del profundo interés teórico que presenta este tema, un adecuado conocimiento de la etiopatogenia de este trastorno es imprescindible para interpretar los datos clínicos, sugerir técnicas diagnósticas, planificar una adecuada profilaxis y diseñar el tratamiento más adecuado. Inicialmente revisaremos varios aspectos en los que se basa el esquema patogénico actual de la tuberculosis para posteriormente detallar el modelo patocrónico de la misma. Elementos clave en la etiopatogenia de la tuberculosis El mayor conocimiento de la etiopatogenia de la tuberculosis que se dispone en la actualidad se basa en cuatro aspectos fundamentales. En primer lugar, la experiencia clínica y los estudios epidemiológicos obtenidos a lo largo de siglos aportan información esencial para comprender la patogenia de la entidad. Por otro lado, la caracterización fenotípica y funcional de las células inmunitarias ha permitido estudiar con mayor rigor los aspectos inmunológicos involucrados en esta entidad. En tercer lugar, el avance de las técnicas microbiológicas, métodos bioquímicos y genéticos, que ha permitido un mayor conocimiento de la estructura y propiedades de los agentes causales. Finalmente, el estudio exhaustivo de modelos experimentales de la enfermedad ha permitido estudiar algunos aspectos, imposibles de evaluar en humanos. Revisaremos a continuación los dos últimos elementos con un mayor detalle. Agentes etiológicos Los microorganismos causales de la tuberculosis se incluyen taxonómicamente en el orden Actinomycetales y en la familia Mycobacteriaceae. En la actualidad el denominado “complejo Mycobacterium tuberculosis” incluye cuatro especies: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti 6. Sin lugar a dudas, la tuberculosis producida por M. tuberculosis es la más importante desde el punto de vista sanitario y, por ello, en adelante nos referiremos de forma prácticamente exclusiva a este microorganismo. La tuberculosis por M. bovis es menos frecuente en los paises industrializados debido al control de la tuberculosis animal y a la pasteurización de la leche, aunque constituye todavía un problema importante en los paises en vías de desarrollo 7. M. africanum es responsable de un menor número de casos de tuberculosis en Africa, debido a su menor virulencia8. Finalmente, la infección por M. microti (agente causal de tuberculosis en roedores) ha sido recientemente descrita en humanos, principalmente en inmunodeprimidos9,10. Las micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis pueden ser diferenciadas fácilmente empleando un escaso número de pruebas bioquímicas 11. La prueba aislada más útil en la identificación de M. tuberculosis es la producción de una gran cantidad de niacina, ya que a diferencia del resto de micobacterias la enzima nicotinamidasa es mucho más activa mientras que las enzimas que reciclan niacina para generar NAD son menos activas que en las otras especies. (con la excepción de M. simiae)12.

M. tuberculosis posee a diferencia de otras micobacterias sólo una catalasa/peroxidasa sensible al calor (68º), codificada por el gen katG 13 . Esta catalasa, además del interés patogénico (ver más adelante) tiene una importante trascendencia clínica, ya que es esencial en la actividad antibacteriana de la isoniacida, de tal forma que sus mutaciones se asocian a resistencia a este tuberculostático13,14. Además, M. tuberculosis posee nitrato reductasa (capaz de convertir nitratos en nitritos y pirazinamidasa (codificada por el gen pcnA), lo que permite su diferenciación con M. bovis 15. En algunos casos también se encuentran aislados de M. tuberculosis con mutaciones puntuales del gen pcnA , que son resistentes a pirazinamida 16. Algunas de las características biológicas del bacilo tuberculoso poseen una especial relevancia en su patogenia. El primer aspecto de interés es que su único reservorio son los humanos, aunque puede infectar a otras especies de animales domésticos comportándose en estos la infección como abortiva. Por otro lado, M. tuberculosis es un microorganismo aerobio estricto lo que va a condicionar su mayor resistencia en zonas del organismo en las que la tensión de oxígeno es elevada (p. ej vértices pulmonares). De hecho, tanto en animales inmunocompetentes como inmunodeprimidos, el crecimiento de micobacterias tuberculosas en el pulmón es más rápido y eficaz que en otros tejidos 17,18. Desde el punto de vista tintorial es un gérmen grampositivo o frecuentemente incoloro, por lo que habitualmente no es visualizado en muestras procesadas de forma rutinaria. Desde el punto de vista estructural posee una pared muy rica en lípidos lo que es responsable de varias características biológicas: (i) la dificultad para ser destruidos por los macrófagos. (ii) la resistencia a la desecación (sin embargo es sensible al calor, a los desinfectantes habituales y a la radiación ultravioleta) y (iii) la característica tinción acido-alcohol resistente. M. tuberculosis ejerce sus efectos patógenos, y evita la actuación de los mecanismos de defensa, mediante las estructuras presentes en su superficie y los elementos segregados. La cubierta externa de M. tuberculosis (y de otras micobacterias) es muy diferente de la presente en otras bacterias 19,20 (fig 1). Así, la capa de peptidoglicano se encuentra unida de forma covalente a glúcidos (arabinosa-galactosa) unidos a su vez a ácidos micólicos. Estos ácidos micólicos, constituyentes principales de la pared celular micobacteriana (50% del peso seco), son ß-hidroxiácidos de cadena larga (C60-C90)21,22. En íntimo contacto con los ácidos micólicos se encuentran varios componentes no unidos covalentemente: “cord factor” (factor trenza o trehalosa 6,6`dimicolato), sulfolípidos, diacil y triacil trehalosas, lipooligosacáridos y micósidos22. Estos componentes constituyen la región más externa micobacteriana también conocida como “cápsula” micobacteriana, aunque esta denominación no es correcta conceptualmente al no estar unida covalentemente a capas más profundas23. Otro elemento importante de la superficie de M. tuberculosis es el lipoarabinomanano, anclado en la membrana plasmática y que atraviesa las estructuras descritas21,22. Es menos conocido el efecto de los componentes segregados por M. tuberculosis, aunque algunos estudios han demostrado la liberación específica de algunas enzimas clásicas24 o componentes antigénicos25 . Figura 1 - Esquema de la estructura de M. tuberculosis Aunque se ha postulado, y es probable que sea correcto, el papel de diversos componentes en la patogenia de la tuberculosis, principalmente los ácidos micólicos y fragmentos del complejo peptidoglicano- arabinogalactano- ácido micólico, la mayor parte de datos experimentales se han obtenido de dos tipos de moléculas puras: el “cord factor” y el lipoarabinomanano. Así, por ejemplo, se ha comprobado que el “cord factor” es capaz de (i) desencadenar la formación de granulomas en hígado y pulmón con alta expresión de IL-1, TNFa e IL-6 26,27 (ii) inducir atrofia tímica por apoptosis 27 (iii) estimular la angiogénesis a través de la liberación por las células fagocíticas de VEGF (vascularendothelial growth factor)28 y (iv) inhibir la fusión fagosoma-lisosoma en el interior de los macrófagos29. Por otro lado, el lipoarabinomanano ejerce múltiples acciones sobre las células fagocíticas 30,31. Las acciones de este componente requieren de todos los elementos estructurales de la molécula, principalmente los residuos manano y los lípidos32 . El LAM ejerce tres tipos de acciones principales: (i) adherencia a los macrófagos mediada a través de los receptores para manosa33 las colectinas del surfactante (spA y spD)34,35 y de forma más controvertida a traves de los receptores tipo Toll (toll-like receptors o TLR ) 36,37 (ii) liberación de citocinas inflamatorias y quimiotácticas ( TNFa, IL-1, MIP-2, IL-8, IP-10, MCP-1, Gro-a)38,40 para neutrófilos, células del sistema mononuclear fagocítico o linfocitos o acción quimiotáctica directa sobre linfocitos T41, (iii) inhibición de la activación de los macrófagos por interferón gamma42, mediada en parte por la liberación de TGFß 43 . En relación con esta molécula, debe señalarse que el mecanismo de acción del etambutol, conocido tuberculostático, consiste en la inhibición de su síntesis 44. Modelos experimentales

Aunque existen múltiples modelos experimentales de tuberculosis que ilustran diferentes aspectos de esta entidad, en este apartado nos referiremos exclusivamente a tres de ellos, que ilustran aspectos clave de la infección tuberculosa. El modelo experimental de Lurie y Dannemberg 45,46, empleó dos tipos de conejos singénicos: sensibles y resistentes a la infección tuberculosa. En este modelo, y mediante el recuento del número de bacilos en el pulmón tras la infección, los autores describieron tres fases de la infección tuberculosa (fig 2). La primera fase correspondía a la destrucción bacteriana y comprendía 3-7 días; a continuación aparecía una fase de “simbiosis” en la que se producía un crecimiento exponencial de los bacilos, apareciendo posteriormente un control de la infección. Las dos cepas de conejos diferían exclusivamente en la primera fase de tal forma que los conejos resistentes destruían de forma más rapida y efectiva los bacilos que los sensibles. Las experiencias de Lurie y Danneberg señalaban la importancia de la resistencia natural frente al bacilo tuberculoso Figura 2 - Fases del modelo de Lurie y Dannenberg Los experimentos de Lefford, realizados en ratas, resaltaban sin embargo el papel de la respuesta inmune adquirida 47. Estos autores infectaron a ratas con una cepa avirulenta de M. tuberculosis y, al cabo de unos días, intentaron reinfectar a las mismas ratas con una cepa virulenta del mismo gérmen Observaron que las ratas habían adquirido resistencia a la infección y que esta resistencia tenía una base celular ya que los linfocitos obtenidos por drenaje linfático protegían a ratas que no habían estado en contacto con la bacteria. Por lo tanto, estos estudios experimentales indicaban de forma clara que en la defensa antituberculosa participaban tanto mecanismos naturales como adquiridos. Sin embargo, debemos señalar que los resultados obtenidos en animales de experimentación deben ser interpretados con cautela, ya que las diferentes especies de mamíferos poseen características inmunológicas variables. Señalaremos como ejemplo los trabajos de Rook, en los que se observa una respuesta bactericida macrofágica radicalmente distinta en macrófagos de ratón y humanos a la administración de g-interferón y vitamina D48. Finalmente, tiene interés destacar la existencia de dos grupos de modelos de infección latente por M. tuberculosis 49,50. En el denominado “modelo de la Universidad de Cornell” descrito originalmente por McCune y cols51 y sujeto a modificaciones posteriores49, la administración de micobacterias tiene lugar por vía intravenosa durante un periodo variable seguido de un tratamiento antimicobacteriano (con isoniacida y piracinamida) de duración variable y un periodo de tiempo sin tratamiento antibacteriano 49,51. El otro grupo de modelos, en los que la vía de entrada es inhalatoria, reproducen de forma más fisiológica la situación real de la infección y enfermedad tuberculosa52,53. Esquema etiopatogénico de la tuberculosis Teniendo en cuenta los elementos señalados previamente detallaremos a continuación el esquema patogénico más aceptado de la infección tuberculosa. En este esquema deben diferenciarse claramente los fenómenos patogénicos de la primoinfección tuberculosa de los fenómenos posteriores. Por otro lado deben diferenciarse de forma esencial los datos patogénicos de las manifestaciones clínicas de cada periodo. Primoinfección tuberculosa Se denomina primoinfección tuberculosa al conjunto de fenómenos biológicos que tienen lugar cuando un individuo entra en contacto por primera vez con el bacilo tuberculoso. Tradicionalmente este proceso se producía, en los paises industrizados, en la infancia por lo que se asocian los términos primoinfección y tuberculosis infantil. Sin embargo, este proceso puede tener lugar en cualquier momento de la vida por lo que la denominación de primoinfección es, en términos generales, más adecuada. A continuación señalaremos los fenómenos patogenicos clave de este periodo y las manifestaciones clínicas de la primoinfección (fig. 3). Figura 3 - Fenómenos patogénicos de la primoinfección Fenómenos patogénicos Incluyen varios procesos que de forma sucesiva son: (i) la entrada del bacilo, (ii) la respuesta inicial del aparato respiratorio, (iii) la fase de equilibrio entre M. tuberculosis con los mecanismos de defensa y (iv) la respuesta inmune a la infección. Entrada del bacilo tuberculoso 20,54

Previamente se ha señalado que el único reservorio de M. tuberculosis es la especie humana. Por ello, la única forma posible de transmisión es interhumana, lo que excluye su transmisión por fómites o desde animales (domésticos o salvajes). En el 95% de los casos la tuberculosis se transmite por vía aérea siendo excepciones la transmisión por via digestiva (en el caso de la infección por M. bovis) y casos

concretos de escaso interés epidemiológico de trans misión por otras vías ( p. ej. cutánea o sexual). La transmisión por vía aérea depende de varios factores que implican (i) una mayor generación de partículas infectantes por el transmisor y (ii) una mayor capacidad infectiva de determinadas cepas micobacterianas (fig 4). Figura 4 - Factores determinantes de la transmisión de M. tuberculosis por vía aérea La capacidad de generación de partículas infectantes se relaciona con varios factores: (i) el número de bacilos, de tal forma que a mayor eliminación de bacilos tuberculosos, existe un mayor riesgo de transmisión. A su vez la mayor o menor eliminación de los bacilos depende de la localización del foco tuberculoso, por lo que el riesgo de transmisión se incrementa en la tuberculosis laríngea, en las formas pulmonares cavitarias y neumónicas, descendiendo en los casos de formas bacilíferas negativas y siendo prácticamente nulo en las formas con cultivo negativo. (ii) el tiempo de contacto con el enfermo, siendo máximo para las personas que conviven con un paciente tuberculoso disminuyendo en los contactos esporádicos. (iii) la aerosolización del bacilo producida al estornudar, hablar, cantar y, sobre todo, al toser y (iv) las condiciones de hacinamiento que aumentan el tiempo de contacto entre sujetos enfermos y sanos. En todas estas circunstancias, los pacientes tuberculosos activos generan varios tipos de partículas portadoras de bacilos. Las partículas grandes (> 10 µm) debido a su gran peso sedimentan y por lo tanto no son infecciosas. Otras grupo de partículas aerosolizadas, con un tamaño de 5-10 µ , alcanzan las vías aéreas que son resistentes a la infección tuberculosa. Sin embargo, las particulas de 1-5 µm formadas por condensación de las anteriores al perder parte de su contenido en agua y que contienen aproximadamente entre 1 y 5 bacilos/partícula, son las realmente infecciosas, accediendo y depositándose en la región alveolar. En los últimos años debe añadirse como factor importante la descripción de cepas de Mycobacterium tuberculosis con una variable capacidad de transmisión 55,56. Respuesta inicial del aparato respiratorio En condiciones infectivas, sin embargo, algunas partículas de 1-5 µm llegan a la vía aérea distal. Se considera que deben llegar un mínimo de 10 a 200 partículas para que tenga lugar la infección. La zona de llegada preferente es, lógicamente, la zona mejor ventilada del pulmón y corresponde a la región subpleural del lóbulo inferior. Los bacilos tuberculosos se encuentran en la región alveolar principalmente con los macrófagos alveolares, que constituyen más del 95% de las células presentes en dicha región 57, y con el surfactante que tapiza los alvéolos. Por ello, en humanos los macrófagos alveolares van a ser las células clave en la interacción inicial con el bacilo tuberculoso. Antes de profundizar en la interacción bacilo tuberculoso-macrófago alveolar debemos señalar algunas características de estas células: (i) Tienen su origen en médula ósea y llegan al alvéolo tras contacto con la circulación general58, pudiendo influir diversos factores (p. ej. la infección VIH 46) sobre sus características funcionales. (ii) La capacidad presentadora de antígenos de los macrófagos alveolares es baja en humanos y diferente a la de otras especies animales 59. (iii) Los macrófagos alveolares son células que viven en un medio rico en oxígeno por lo que teóricamente su capacidad de generación de radicales libres de oxígeno es elevada. Sin embargo, y probablemente para evitar la toxicidad por estas sustancias, aunque los macrófagos alveolares generan radical superóxido, no poseen mieloperoxidasa por lo que el sistema de Klebanoff no ejerce efecto 60 y (iv) Poseen una rica dotación en enzimas lisosomales 61. Unión y captación de los bacilos tuberculosos La interacción inicial bacilo tuberculoso /macrófago alveolar humano se produce por fagocitosis mediada por varios tipos de receptores (fig 5)54. Las principales moléculas implicadas son los receptores para elementos del complemento (CR1, CR3 y CR4), los receptores para manosa, los receptores para proteínas del surfactante, y los receptores tipo Toll. De forma anecdótica también se ha sugerido que la molécula CD14 podría ser un receptor implicado 62. La baja expresión de CD14 en los macrófagos maduros 63,64 cuestiona su importancia en esta fase de la infección, debiéndose explicar el aumento de CD14 soluble en el lavado broncoalveolar de pacientes con tuberculosis 65 como índice de reclutamiento monocitario. Existen claras evidencias que implican a los receptores para factores del complemento (CR1,CR3 y CR4) en la internalización de M. tuberculosis, ya que la ausencia de suero (y por lo tanto de complemento) o el empleo de anticuerpos específicos inhiben este proceso 66. La unión de M. tuberculosis a los receptores del complemento se produce de tres formas diferentes (i) activando la via alterna y quedando recubierto de C3b y C3bi66 (ii) asociándose a C2a para formar una convertasa de C367 y (iii) uniéndose directamente a regiones de los receptores sin necesidad de fijar previamente complemento68,69. Además, es muy importante desde el punto de vista patogénico que la internalización de antígenos a través de receptores para el complemento, a diferencia de los receptores para la fracción Fc de las

inmunoglobulinas, no estimula la generación de radicales libres de oxígeno70 A pesar de todos los datos mencionados, el papel real de estos receptores en la captación de M. tuberculosis, al menos en las fases iniciales de la infección tuberculosa, es controvertido, no sólo por la baja concentración de elementos del complemento 71, sino por la nula influencia de la deficiencia de C3 en la evolución de la infección tuberculosa 72. También M. tuberculosis puede entrar en los macrófagos a través de los receptores para manosa73, siendo el lipoarabinomanano la molécula implicada en esta interacción 33,74. Tanto la expresión de receptores para elementos del sistema del complemento como de los receptores tipo manosa están regulados por citocinas linfocitarias y prostaglandinas. Así, el interferón gamma deprime la expresión de estos receptores mientras que tanto la interleucina 4 como la prostaglandina E2 estimulan su expresión 75-77. El tercer tipo de moléculas implicadas en la fagocitosis de M. tuberculosis son los receptores para la proteína A del surfactante, que actuarían como un puente entre el lipoarabinomanano de la micobacteria y los macrófagos alveolares 34,78,79. Por otro lado, los bacilos tuberculosos pueden unirse y activar a los macrófagos a traves de los receptores tipo Toll, en concreto TLR2 y TLR436,37. Finalmente, además de los receptores indicados, también la expresión de CD43 (sialoglicoforina) en los macrófagos alveolares es necesaria para la unión de M. tuberculosis 80. Figura 5 - Receptores para M. tuberculosis en los macrófagos alveolares Destino intracelular de M. tuberculosis Tras la unión a los macrófagos alveolares, los bacilos tuberculosos son internalizados e incluidos en la vacuola de fagocitosis. La fagocitosis de un antígeno por los macrófagos y su inclusión en la vacuola de fagocitosis estimula la generación de mecanismos defensivos que pueden ser clarificados en tres grupos diferentes: (i) mecanismos no radicálicos, mediados por enzimas hidrolíticas que, contenidas en los lisosomas son vertidas a la vacuola de fagocitosis y ejercen su acción a pH ácido (ii) mecanismos óxigeno-dependientes en los que se producen secuencialmente radical superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo y (iii) mecanismos dependientes de la producción de óxido nítrico. En esta fase de la infección tuberculosa, los bacilos ponen en marcha un conjunto de estrategias de evasión capaces de superar los mecanismos de defensa, ya que los macrófagos alveolares no se encuentran activados por las citocinas linfocitarias20. Los principales sistemas de destrucción antigénica macrofágicos son de dos tipos: enzimáticos, mediados por la actuación de las hidrolasas lisosomales 61 a pH ácido y radicálicos, que incluyen los radicales libres de oxígeno 60 y el óxido nítrico 81 (fig 6). Con la Figura 6 - Mecanismos de destrucción antigénica en las células del sistema mononuclear fagocítico excepción de la producción de óxido nítrico (ver más adelante) se ha demostrado que todos los mecanismos bactericidas macrofágicos son anulados por productos derivados de las micobacterias (fig 7). Así, la presencia de varios glucolípidos (particularmente los sulfátidos 82,83 o el cord factor29) y la generación de amonio 84,85 inhiben la fusión entre los fagosomas y los lisosomas. Por otro lado, los fagosomas que contienen M. tuberculosis, debido a la exclusión de una bomba de protones son incapaces de acidificar el interior, impidiendo la acción de las hidrolasas 86,87. Finalmente, M. tuberculosis posee varios mecanismos para evitar la acción de los radicales libres de oxígeno: (i) inhibiendo la generación de superóxido88 (ii) inactivando los radicales ya formados por mecanismos enzimáticos (superóxido dismutasa y catalasa)89, y (iii) aportando elementos (LAM, sulfátidos) que actuan como moléculas suicidas al reaccionar con los radicales libres90,91. En la actualidad se han descrito otras moléculas, de función menos conocida, implicadas en la supervivencia de M. tuberculosis en el interior de los macráfagos (mcep, sigma factor A y erp)92,93,94. El final de esta fase, como puede entenderse es el crecimiento intracelular más o menos intenso de los bacilos y la destrucción ulterior de los macrófagos alveolares. Figura 7 - Interacción inicial entre M. tuberculosis y macrófagos Un aspecto muy importante que debe mencionarse en este punto es que la resistencia natural a la infección tuberculosa (ver más adelante) radica fundamentalmente en esta fase Fase de “equilibrio” Como consecuencia de la fase anterior, se genera en la región alveolar afectada por la infección tuberculosa un medio inflamatorio rico en sustancias quimioatractantes. Estos productos proceden tanto de las propias micobacterias o de sus fragmentos (p. ej. cord factor o lipoarabinomanano)95 como de los propios macrófagos alveolares al ser estimulados por componentes de las micobacterias. En concreto, se ha comprobado que productos micobacterianos son capaces de estimular la producción y/o liberación de las siguientes quimiocinas: IL-8 (interleucina 8), MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1), RANTES ( regulated on activation normal T-cell expressed and secreted) y MIP-1a ( macrophage inflammatory

protein-1a) 96-100. Cada una de estas quimiocinas presenta una relativa especificidad por las células reclutadas96, de tal forma que IL-8 recluta principalmente neutrófilos, MCP-1 atrae al foco inflamatorio monocitos, RANTES presenta selectividad sobre linfocitos CD4 y MIP-a es una quimiocina que predominantemente atrae linfocitos T citotóxicos. Por ello, la alveolitis que aparece en la tuberculosis se caracteriza por un aumento de macrófagos inmaduros, linfocitos y neutrófilos en proporción variable 101.En este momento se establece una relación de equilibrio en la que ni los bacilos ni los macrófagos jóvenes se destruyen uno al otro, ya que los monocitos no han sido activados y los bacilos no son tóxicos, al menos de forma aguda. Los tres fenómenos patogénicos básicos de esta fase son (i) el crecimiento exponencial del número de bacilos que aumenta la carga infecciosa (ii) la aparición de una alveolitis, es decir, una inflamación de la región alveolar, con las características descritas y (iii) el escape de micobacterias, por vía linfática, hacia los ganglios regionales (fig 8). Aunque los datos concretos son escasos, es muy probable que en este fenómeno intervengan de forma sustancial las células dendríticas102. En esta región tiene lugar la respuesta inmunológica inicial del organismo a la infección tuberculosa. En ocasiones esta respuesta inmunológica es suficiente para frenar la progresión de la infección, pero en un elevado número de casos los bacilos escapan hasta el conducto linfático y entran en la circulación pulmonar accediendo al intersticio pulmonar y, atravesando el filtro pulmonar, a todos los órganos de la economía. Los principales focos metastáticos son los órganos muy irrigados, es decir, el sistema nervioso central, el hueso esponjoso, hígado, riñón y región genital. En cada uno de estos órganos los bacilos son fagocitados por las células locales del sistema mononuclear fagocítico. Figura 8 - Diseminación hematógena del bacilo tuberculoso Control inmunológico de la infección La respuesta inmune a las micobacterias tuberculosas es compleja e incluye tanto la síntesis de anticuerpos como la participación de diferentes tipos celulares Los datos de la literatura en lo que respecta a la respuesta humoral son controvertidos 103, pudiendo desempeñar un discreto papel protector 104,105 o modulador106 de la formación de granulomas en algunos modelos murinos. Sin embargo, en la tuberculosis humana, parece que la respuesta humoral no reviste importancia en el control de la infección. De hecho, en pacientes con tuberculosis activa, la respuesta a antígenos solubles de M. tuberculosis es mucho más intensa (y la respuesta celular menor) que en los convivientes sanos 107. La mayor parte de los estudios inmunológicos en tuberculosis han demostrado el papel de la respuesta mediada por células en el control de la infección tuberculosa. Sin embargo, los mecanismos concretos por los que se ejerce este control son dificiles de explicar, aplicandose con razon en este momento la expresión de “puzle”. Existen varias razones que contribuyen a esta situación de confusión: 1) aspectos de “nomenclatura” de tal forma que no es lo mismo el concepto de hipersensibilidad retardada en los modelos experimentales que la denominación de hipersensibilidad retardada a la reacción tuberculinica. Por ello, en esta revisión únicamente utilizaremos términos descriptivos. En segundo lugar, no pueden ser manejados los datos inmunologicos obtenidos durante la enfermedad tuberculosa como explicación de los mecanismos de control en el individuo que no desarrolla la enfermedad . En tercer lugar, los modelos experimentales no reproducen exactamente los fenómenos que suceden en humanos. Finalmente, existen importantes limitaciones éticas para estudiar en humanos los fenómenos locales que dan lugar al control inicial de la infección tuberculosa Con estas limitaciones, se revisarán los principales datos disponibles. De forma sintética podemos indicar que el control de la infección tuberculosa se debe a la interacción de linfocitos T y células del sistema mononuclear fagocítico (fig 9 y 10). En las dos últimas décadas, gracias a los avances en biología molecular y en las técnicas de estudio de proteínas se han podido diferenciar diversas subpoblaciones linfocitarias con características estructurales y funcionales muy diferentes57. Así, atendiendo a la estructura del receptor para el antígeno (TCR) de los linfocitos T (CD3) se distinguen los linfocitos a/b, mayoritarios desde un punto de vista cuantitativo y los linfocitos T g/d con un repertorio antigénico y propiedades funcionales diferentes. Dentro de los linfocitos T a/b se distinguen dos grupos funcionales diferentes: colaboradores (helper) y citotóxicos, asociados habitualmente a la expresión de las moléculas CD4 y CD8 respectivamente. Además, dentro de la subpoblación CD4 pueden distinguirse diferentes tipos atendiendo a dos criterios no relacionados, el patrón de secreción de citocinas y la presencia del contacto con el antígeno. Así, atendiendo a la producción de citocinas se distinguen dos tipos funcionales de linfocitos colaboradores: Th1 ( productores de interferón gamma e IL-2) y Th2 (productores de IL-4, IL-5 e IL-10). Ambas subpoblaciones derivan de precursores comunes (Tho) por influencia del antígeno desencadenante (p. ej. los microorganismos

intracelulares desencadenan principalmente respuestas Th1) y a la presencia de citocinas producidas por las células presentadoras de antígenos ( p. ej. IL-12 e IL-18 en las respuestas Th1). Finalmente, atendiendo al contacto con el antígeno los linfocitos CD4 se diferencian en vírgenes (naive) cuando no han estado en contacto con el antígeno o memoria; ambas subpoblaciones pueden diferenciarse por la expresión de isoformas de la proteína CD45 ( CD45 RA en los vírgenes, CD45 RO en los memoria) y de moléculas de adhesión que facilitan la entrada en el foco inflamatorio. Figura 9 - Respuesta inmune al bacilo tuberculoso-1 Figura 10 - Respuesta inmune al bacilo tuberculoso-2 En la respuesta inmune al M. tuberculosis, y en orden jerárquico, el papel principal correspondería a los linfocitos Ta/b CD4 activados con fenotipo Th1, en segundo lugar a los linfocitos citotóxicos y en tercer lugar a los linfocitos T g/d, siendo menos importante el papel de las células natural killer. En los apartados posteriores se detallarán estos datos. Linfocitos Ta/b a/CD4 El importante papel atribuido a esta subpoblación linfocitaria deriva de varios hechos: (i) datos clínicos (ii) datos biológicos obtenidos en pacientes con enfermedad tuberculosa y (iii) estudios experimentales. Así, en la infección por el VIH, enfermedad cuya característica fundamental es la depleción progresiva de linfocitos CD4, no sólo es más frecuente la reactivación de la infección tuberculosa latente sino también la progresión de la primoinfección a enfermedad108. Los datos biológicos obtenidos de pacientes con enfermedad tuberculosa también sugieren un papel importante de esta estirpe celular. Así, el estudio de la inmunidad local mediante lavado broncoalveolar (LBA) ha permitido constatar de forma repetida el aumento de linfocitos en pacientes con tuberculosis 109, encontrándose un aumento tanto de subpoblaciones CD4 (+) como CD8 (+) 110 , presentando la mayor parte de los linfocitos CD4 caracteristicas funcionales de Th1111 y características fenotípicas de activación 110, 112 . Tiene interés mencionar en este punto las diferencias de los patrones encontrados en diferentes formas de tuberculosis. Así, cuando se comparan los datos del lavado broncoalveolar de los pacientes tuberculosos con resolución lenta o rápida se observa que aquellos presentan un menor aumento de linfocitos CD4 (y proporcionalmente una mayor cantidad de CD8) y un menor grado de activación linfocitaria112. Por otro lado, cuando se compara el perfil citológico presente en el LBA entre formas poco avanzadas (sin cavitación y baciloscopia negativa) con formas cavitarias, se encuentra en las primeras un predominio linfocitario que contrasta con el aumento de neutrófilos en las formas cavitarias 113. Finalmente, la respuesta inflamatoria local varía atendiendo a otros datos, principalmente la coinfección por el VIH 114. Por otro lado, el estudio del granuloma tuberculoso en humanos, diferente del encontrado en modelos experimentales 115, permite comprobar que en torno a la zona de destrucción celular central, se encuentran macrófagos modificados constituyendo células epitelioides, fuertemente unidas a través de ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) entre las que aparecen múltiples células dendríticas 116,117. Rodeando a esta estructura se encuentra una corona linfocitaria, en la que predominan claramente los linfocitos CD4 , aunque también aparecen linfocitos CD8 118 . Los datos experimentales son de dos tipos diferentes: estudios funcionales realizados en pacientes tuberculosos y modelos experimentales animales. Los estudios funcionales pueden clasificarse en dos grupos: aquellos realizados en sangre periférica y los realizados sobre células inflamatorias locales. En lo que respecta a los datos obtenidos en sangre periférica , prácticamente todos los estudios realizados demuestran que la estimulación de los linfocitos con antígenos micobacterianos produce menos citocinas Th1 y más citocinas Th2 que los controles 107,119-124. Este hecho contrasta con la importante elevación en sangre periférica de citocinas Th1 (IFN-g e IL-18)125,126 y con la mayor producción de estas citocinas por los linfocitos obtenidos de las lesiones tuberculosas (pulmón, pleura)127,128. La explicación de estos aparentemente contradictorios datos ha sido propuesta por Peter Barnes en un reciente editorial129, indicando que en las zonas de enfermedad tuberculosa se produciría una acumulación de células Th1 y por tanto se produciría una depleción de estas células en sangre periférica. Las citocinas liberadas en exceso en el foco inflamatorio sería el factor responsable del aumento en la sangre periférica. Por otro lado, múltiples modelos experimentales en los que se produce la depleción de linfocitos CD4 (animales transgénicos o empleo de anticuerpos específicos) han demostrado la necesidad absoluta de esta estirpe celular para el control de la enfermedad tuberculosa 130-133. Existe menos información acerca de los subtipos de linfocitos CD4 responsables del control de la enfermedad tuberculosa atendiendo al contacto con el antígeno. En el modelo murino, y como parece

razonable, la respuesta inicial es a expensas de linfocitos vírgenes134 mientras que el control posterior es ejercido por linfocitos memoria 135. Sin embargo, en humanos, no se observa este patrón 136. Una vez establecido el importante papel de los linfocitos CD4 en el control de la infección tuberculosa, es preciso conocer por qué acuden estas células al lugar de la infección, por qué se produce la diferenciación hacia un fenotipo Th1 y cómo actúan en el control de la infección. En lo que respecta al primer aspecto, se ha comprobado que tanto factores micobacterianos como macrofágicos son responsables de la atracción de linfocitos CD4 hacia el foco inflamatorio. Así, se ha comprobado que el lipoarabinomanano posee actividad quimioatrayente para linfocitos T 41 y, por otro lado los macrófagos alveolares estimulados por M. tuberculosis liberan mayor cantidad de RANTES que recluta selectivamente linfocitos CD4 hacia el foco inflamatorio 96,97. Una vez en el foco inflamatorio, se produce la diferenciación de los linfocitos CD4 hacia un fenotipo Th1 gracias a la producción de IL-12 por los macrófagos alveolares estimulados por M. tuberculosis 137,138. Los linfocitos CD4 actúan en el control de la infección tuberculosa principalmente a través de la producción de interferón gamma, aunque la producción de esta citocina no es el único mecanismo 132,139. La importancia del interferón gamma en el control de la infección tuberculosa también ha planteado problemas de interpretación, ya que los resultados obtenidos “in vitro” e “in vivo” son claramente diferentes. Los resultados “in vivo” apoyan claramente el papel del interferón gamma en el control de la infección tuberculosa. Así, en modelos experimentales, la ausencia de interferón gamma o de su receptor incrementan de forma extraordinaria la susceptibilidad a la infección por bacterias tuberculosas 140-142. Por otro lado, también en humanos, defectos en la expresión del receptor para interferón gamma se asocian a una mayor susceptibilidad de la infección tuberculosa 143,144. Finalmente, algunos autores han empleado con éxito el tratamiento con interferón gamma en las infecciones por micobacterias refractarias a otras medidas terapéuticas 145,146. Sin embargo los estudios “in vivo” que han intentado evaluar el efecto directo del interferón gamma sobre la actividad micobactericida de los macrófagos han comprobado, con alguna excepción147 que el efecto es escaso, siendo precisa la acción de otras sustancias (p. ej. vitamina D 148 o GM-CSF149) para que se produzca la destrucción de las micobacterias. Tradicionalmente se ha considerado, basándose en estudios en ratones, que la acción del interferón gamma se ejerce sobre los macrófagos, (i) activando la síntesis de citocinas (particularmente el factor de necrosis tumoral alfa o TNFa )(ver más adelante), (ii) estimulando la producción de radicales libres de oxígeno y (iii) activando la producción de óxido nítrico. El papel de los radicales libres de oxígeno en la defensa frente al M. tuberculosis fue postulado al inicio de los años ochenta por Walker y Lowrie 150, pero un amplio cuerpo de datos experimentales posteriores empleando scavengers 151 o modelos de animales 152 permiten afirmar la escasa participación de este mecanismo de defensa. Probablemente este hecho se deba a los importantes mecanismos de evasión frente a este sistema que posee el bacilo tuberculoso (ver antes). Sin embargo, la producción de óxido nítrico se ha considerado un mecanismo esencial en el control de la infección tuberculosa por varias razones 153: (i) el óxido nítrico es capaz de destruir directamente bacilos tuberculosos (ii) existe un aumento de la expresión de óxido nítrico sintasa en los lugares de la infección tuberculosa (iii) en aquellas situaciones experimentales en las que se desarrolla enfermedad tuberculosa progresiva existe una disminución de la producción de óxido nítrico (iv) el empleo de inhibidores de la ONSi tanto “in vitro como “in vivo” da lugar a aumento de la replicación micobacteriana y (v) los animales geneticamente deficientes en ONSi son más susceptibles a la infección tuberculosa. Sin embargo, el papel que desempeña la generación de óxido nítrico en humanos es más controvertido. Así, aunque existe expresión inmunohistoquímica de ONSi en macrófagos alveolares humanos, la producción de nitritos en cultivo es indetectable (observación personal) o mínima154. Por ello, sin descartar la participación de este sistema de defensa en humanos, se puede afirmar que su papel en el control de la enfermedad tuberculosa es diferente al observado en los modelos murinos155. Además de su acción sobre los macrófagos, el interferón gamma puede participar en el control de la infección tuberculosa por otros mecanismos entre los que se han descrito: (i) formación de células multinucleadas con mayor capacidad microbicida156,157, (ii) aumentando la citotoxicidad macrofágica157 o (iii) eliminando células CD4 activadas por apoptosis158 . Linfocitos T citotóxicos El concepto de linfocito T citotóxico es funcional, correspondiendo a aquellas células capaces de reconocer y destruir a otras células que expresan moléculas extrañas. Desde el punto de vista fenotípico, es posible encontrar linfocitos T citotóxicos que no expresen ni CD4 ni CD8 159, que expresen CD4 160 o lo que es más característico que expresen la molécula CD8 161. Además, dentro de los linfocitos T

citotóxicos CD8 (+) pueden distinguirse fenotípica y funcionalmente subvariedades vírgenes y memoria 162 Los linfocitos citotóxicos deben inicialmente reconocer las células que expresan moléculas extrañas para posteriormente destruirlas. Para que un antígeno sea reconocido por un linfocito T citotóxico CD8 es preciso que sea adecuadamente presentado, bien mediante antígenos de histocompatibilidad de clase I, con procesamiento previo (fig 11) (y por lo tanto requiriendo TAP)163 o bien a través de una vía no clásica que emplea las moléculas CD1 164,165. Ambos sistemas, y probablemente otros no bien conocidos en la actualidad166 requieren como molécula esencial la presencia de ß2 microglobulina(fig 12). Una vez reconocido el antígeno extraño, los linfocitos CD8 citotóxicos son capaces de destruir la célula que los contiene por dos mecanismos fundamentales: (i) la liberación de enzimas líticas contenidas en los gránulos (perforina, granulisina) y (ii) la inducción de apoptosis a través del sistema Fas-FasL167,168 (fig 13). Figura 11 - Presentación antigénica mediada por HLA-I Figura 12 - Reconocimiento del antígeno por Linfocitos T citotóxicos Figura 13 - Mecanismos efectores de los linfocitos T citotóxicos De forma similar a lo descrito en el apartado anterior, varios tipos de pruebas sustentan la participación de los linfocitos CD8 en el control de la infección tuberculosa. Destacaremos como datos de interés la aparición de enfermedad tuberculosa en personas que reciben BCG y que presentan una respuesta CD4 , demostrada por la reacción tuberculínica , el aumento de linfocitos CD8 en el líquido de lavado broncoalveolar de enfermos tuberculosos (ver antes) o los modelos experimentales en animales con defecto genético de ß2microglobulina, TAP o perforina169. Los linfocitos CD8 participan en el control de la infección tuberculosa por dos mecanismos complementarios. Por un lado, son capaces de sintetizar y liberar citocinas Th1 (interferón gamma e IL- 12)170,171 y por otro desencadenan una respuesta citolítica172. En lo que respecta a la respuesta citotóxica, se ha comprobado que a la presentación antigénica, parece que tanto los mecanismos clásicos como formas no clásicas intervienen en este fenómeno 169,173. Por otro lado, parece claramente establecido que el mecanismo más eficaz en el control de la infección tuberculosa es el relacionado con la liberación del componente granular y no la inducción de la apoptosis159. Más controvertido es el papel de los componentes de los gránulos responsable del efecto citotóxico, específicamente de la perforina, ya que dependiendo del modelo de estudio, algunos autores le atribuyen un papel esencial174, mientras que otros cuestionan su participación 175,176. En este sentido, es posible que existan mecanismos de compensación, particularmente la producción de granulisina177, que actúen en ratones deficientes en perforina. Linfocitos T g/d Aunque los linfocitos T g/d constituyen una pequeña proporción de los linfocitos circulantes, sus características funcionales sugieren un papel importante en el control de la respuesta a la infección tuberculosa. Así, en particular la subpoblación Vg9/d2 que constituye el 70% de todas las células g/d en el adulto178, es capaz de reconocer antígenos no peptídicos producidos por las bacterias tuberculosas y unirse a ellos sin necesidad de procesamiento antigénico139. Los estudios realizados en animales experimentales sugieren que esta estirpe celular participa en el control de la infección tuberculosa. Así, la administración intranasal de PPD da lugar a un importante incremento en el número de linfocitos T g/d en el pulmón179 o la deficiencia de estas células se asocia a un fallo en el control de la infección tuberculosa180. Sin embargo, los datos obtenidos en humanos son menos claros, de tal forma que algunos autores observan un aumento de linfocitos T g/d circulantes en contactos sanos de pacientes tuberculosos 181,182, mientras que otros grupos no encuentran diferencias 183,184. El mecanismo de actuación de los linfocitos T g/d en el control de la infección tuberculosa es doble: (i) contribuyendo a la actividad citotóxica a través de la liberación de componentes de los gránulos (perforina) 185 y (ii) a través de la liberación de citocinas, particularmente interferón gamma 186 y factor de necrosis tumoral alfa 187. Células “natural killer” El papel de las células NK ha sido poco estudiado en el control de la infección tuberculosa, observando algunos autores la disminución de este tipo celular durante la enfermedad activa 188, particularmente en las formas de tuberculosis multirresistente189. En los pocos estudios experimentales realizados, parece que el mecanismo de actuación sería indirecto, a través de la producción de citocinas190. Macrófagos En varios apartados de esta revisión, se ha indicado cómo los macrófagos activados desempeñan

un papel clave en el control de la infección tuberculosa20, reclutando hacia el foco inflamatorio varios tipos celulares, presentando antígenos a los linfocitos CD4, fusionándose en respuesta a gammainterferón y activando sus sistemas micobactericidas en respuesta a diversas citocinas. También las células del sistema mononuclear fagocítico desempeñan un papel importante en la destrucción tisular que tiene lugar en el centro del granuloma al liberar colagenasa y gelatinasa en respuesta a lipoarabinomanano 191. Además, las células del sistema mononuclear fagocítico son las principales responsables de la producción de otra citocina clave en el control de la infección tuberculosa: el factor de necrosis tumoral alfa. El papel esencial de los macrófagos en la producción de TNFa se pone de manifiesto en estudios histológicos (observando la expresión de mRNA de esta citocina en células que expresan marcadores fenotípicos)192 y en estudios en los que el transplante de precursores de médula ósea corrige el defecto inmunológico de ratones con deficiencia de TNFa 193.Por otro lado, la importancia de esta citocina se pone de manifiesto en la falta de control de la infección tuberculosa en animales experimentales con deficiencia en la producción de TNFa 193,194, de actuación de esta citocina (por exceso de receptores solubles) 195 o por defectos de sus receptores196. La actividad del TNFa en el control de la infección tuberculosa es sinérgica con la del interferón gamma, como se comprueba en estudios de animales con deficiencia aislada o combinada de la producción de ambas moléculas, aunque el estudio comparativo parece asignar mayor importancia al TNFa 195. La mayor parte de grupos coincide en el papel esencial del TNFa en la organización del granuloma tuberculoso 196,197,198, probablemente por el incremento de la expresión de ICAM-1 y de HLA de clase II 193 aunque algunos estudios clínicos observan mayores niveles locales de esta citocina en las formas cavitadas de enfermedad tuberculosa199 . De cualquier forma las relaciones entre M. tuberculosis, macrófagos y TNFa son complejas y dificiles de integrar en la actualidad. Así, se ha comprobado que M. tuberculosis estimula la producción de TNFa por los macrófagos200 mientras que esta citocina induce apoptosis macrofágica y, en determinadas condiciones estimula el crecimiento de M. tuberculosis 202. Integración de la respuesta inmune Los datos inmunológicos y los estudios experimentales permiten sugerir que el control de la infección tuberculosa cursa en dos fases: (i) una primera fase en la que se produce una respuesta global citotóxica y apoptótica (fig 14) y (ii) una segunda fase en la que la activación macrofágica por citocinas linfocitarias lleva a un control de la infección (fig 15). Figura 14 - Fase destructiva de la respuesta inmune en tuberculosis Figura 15 - Fase de control inmune en la tuberculosis La primera fase, destructiva, es independiente de la generación de linfocitos CD4, ya que tiene lugar tanto en animales resistentes o susceptibles. Expresado de otra manera,tanto los sujetos susceptibles, que tienen una débil respuesta celular como los resistentes que no han desarrollado todavía la respuesta inmune efectiva son capaces de frenar inicialmente el crecimiento bacteriano. La destrucción de los macrófagos que contienen micobacterias presenta un papel protector en la infección tuberculosa ya que la acidosis local, la hipoxia y la presencia de ácidos grasos inhibitorios dificulta el crecimiento bacteriano. En la destrucción celular intervienen principalmente los mecanismos citotóxicos y la inducción de la apoptosis (por el propio bacilo)203 o por citocinas linfocitarias. Sin embargo, la hipersensibilidad retardada debe ser “reforzada” por una segunda fase en la que los macrófagos activados por citocinas controlan finalmente el crecimiento de los bacilos tuberculosos. Los sujetos inmunocompetentes (y su equivalente experimental, los animales resistentes) evitan la salida de los bacilos del foco tuberculoso gracias al desarrollo de una potente respuesta inmune celular a expensas de linfocitos T helper que activan a los macrófagos. Desde el punto de vista clínico, los sujetos inmunocompetentes desarrollan un equilibrio entre el bacilo y el organismo que actúa hasta que una circunstancia predisponente sea capaz de reactivar la infección. Sin embargo, los individuos inmunodeficientes, no son capaces de controlar la infección desarrollando la enfermedad y , logicamente no se hacen positivos para la reacción tuberculínica. Manifestaciones clínicas y biológicas de la primoinfección Durante la primoinfección aproximadamente el 95% de los pacientes permanecen asintomáticos (o con síntomas mínimos que recuerdan un episodio gripal) y sólo un 5% desarrollan enfermedad aparente. En los pacientes que han sufrido una primoinfección es posible, si se realiza una radiografía de tórax ,objetivar la presencia de alveolitis. La calcificación de la zona alveolítica se denomina nódulo de Ghon, asociándose en ocasiones a la calcificación del ganglio de drenaje, denominándose esta situación: complejo de Ranke. Lo habitual en estos sujetos es que se produzca una conversión tuberculínica que

traducirá el desarrollo de linfocitos CD4 que reconocen al bacilo tuberculoso. Sin embargo, aproximadamente un 5% de los sujetos que sufren una primoinfección tuberculosa presentan manifestaciones clínicas de la misma que pueden ser locales: (p. ej. neumonía tuberculosa, por extensión de la alveolitis al resto del lóbulo pulmonar, o pleuritis tuberculosa, por rotura de un foco próximo a la cavidad pleural) o generales (tuberculosis miliar). En estos casos, la regla es que no se produzca la conversión tuberculínica, ya que la infección no ha sido adecuadamente controlada por el sistema inmune. Fenómenos postprimarios Latencia y reactivación tuberculosa En el apartado anterior se ha señalado que la evolución más frecuente de la primoinfección tuberculosa es el control inmunológico de la misma de tal forma que el individuo se encuentra clínicamente sano y los bacilos acantonados en diferentes regiones, particularmente en los vértices pulmonares. A esta situación se le denomina tuberculosis latente y depende de factores dependientes tanto de la micobacteria tuberculosa como del sistema inmune. Las modificaciones de los factores inmunologicos puede llevar a la reactivación de la infección tuberculosa ocasionando, lógicamente en este caso siempre enfermedad (local o sistémica). Fenómenos patogénicos (fig 16) Figura 16 - Latencia y reactivación tuberculosa Existen dos modelos principales para el estudio de la latencia: el modelo “in vivo” de la Universidad de Cornell51 y modelos “in vitro”, en los que M. tuberculosis es mantenida en condiciones microaerófilicas (fase NRP1) o anaerobias (fase NRP2)204. Los modelos “in vivo” son útiles en el estudio de los mecanismos inmunológicos mientras que los modelos “in vitro” son eficaces para conocer los mecanismos de supervivencia del bacilo. Empleando esta última metodología se ha demostrado la expresión de varias proteínas en los bacilos tuberculosos en condiciones de latencia, perticularmente el factor sigF 205, la proteína del shock térmico acr (a-cristalina)206 y la la isocitrato liasa 207, enzima del ciclo del glioxilato. Esta última molécula es de interés especial, ya que aunque su expresión es escasa en las micobacterias presentes en macrófagos aislados, mientras que se incrementa en los macrófagos activados. La inactivación experimental de la expresión de esta enzima evita la persistencia de los bacilos tuberculosos207. Por otro lado, existen datos experimentales que sugieren la importancia del óxido nítrico y de los linfocitos CD4 en el control de la latencia tuberculosa 52,132. La reactivación de las lesiones tuberculosas se produce cuando se altera el control de los bacilos tuberculosos en fase de latencia. Este hecho puede producirse por una alteración de los factores locales de control o cuando por diferentes razones se altera la respuesta inmune sistémica. Esta última situación tiene lugar tras la administración de sustancias inmunosupresoras (p. ej. corticoides), durante la infección VIH no tratada, en la malnutrición o por la coinfección por otros microorganismos, particularmente helmintos. Desde un punto de vista patogénico, la malnutrición se asocia al aumento de la producción de TGFß, mientras que las infecciones por helmintos, al estimular respuestas Th2 inhiben a través de la interleucina 10 la actividad de los linfocitos Th1 210,211(fig 17). Figura 17 - Helmintos y control de tuberculosis De cualquier forma uno de los fenómenos patogénicos importantes de la reactivación es la licuefacción del caseum, cuya consecuencia inmediata es la formación de un medio de crecimiento excelente para los bacilos, que comienzan a replicarse y liberan productos similares a la tuberculina con una gran capacidad tóxica. Estos productos liberados rompen, en el caso del pulmón, la pared de los bronquios adyacentes formando una cavidad y extendiendo por vía broncógena los bacilos. Como hemos mencionado previamente los vértices pulmonares son un lugar predilecto para el acantonamiento de los bacilos y por lo tanto es frecuente que la cavitación se localice en esta zona. Manifestaciones clínicas y biológicas de la reactivación Por definición todas las tuberculosis de reactivación dan manifestaciones clínicas. Las manifestaciones pueden ser focales o sistémicas, por nueva diseminación del M. tuberculosis. La reacción tuberculínica en la reactivación de la tuberculosis puede ser positiva (asumiendo en estos casos una alteración local de la inmunidad) o negativa (señalando un profundo déficit de la inmunidad celular sistémica). Reinfección tuberculosa Hasta hace pocos años, la reinfección, es decir la enfermedad producida por la entrada de nuevos bacilos tuberculosos era considerada una causa muy poco frecuente de tuberculosis (fig 18). Sin embargo, en los últimos años, gracias a técnicas de biología molecular aplicadas a la epidemiología de la

tuberculosis212, se ha podido comprobar que particularmente en los pacientes inmunodeprimidos, la reinfección es respondable de un número apreciable de casos de enfermedad tuberculosa. Lógicamente, en estos casos, la enfermedad se produce al disminuir, por la inmunodepresión, los mecanismos de control inmune. Figura 18 - Formas de enfermedad tuberculosa Resistencia natural a la tuberculosis Algunas características epidemiológicas de la tuberculosis humana sugieren una resistencia natural a la tuberculosis. Así, en lo que respecta al sexo, existe un claro predominio de varones, que se ha relacionado con una mayor presencia de los factores de riesgo para la enfermedad. Sin embargo, en estudios epidemiológicos realizados en zonas industrializadas en las que la incorporación laboral y hábitos se han equiparado en ambos sexos, sigue manteniéndose el predominio masculino213. Recientemente se ha identificado la presencia de marcadores genéticos de susceptibilidad a la tuberculosis en el brazo largo del cromosoma X, lo que podría explicar el exceso de varones observado214. Por otro lado, también influye la raza en la susceptibilidad a la infección tuberculosa. Así, se ha señalado una mayor resistencia a la tuberculosis en caucasianos y mongoles y una mayor susceptibilidad en negros, esquimales e indios. Entre las explicaciones a este hecho se ha señalado que los individuos de raza negra tienen mayores requerimientos de exposición solar para la síntesis de vitamina D activa, molécula implicada en la defensa antituberculosa215. De esta forma, en circunstancias especiales ( por ejemplo estancia prolongada en prisión), la deficiencia de vitamina D puede condicionar una mayor facilidad para el desarrollo de tuberculosis 216. Por otro lado, la presencia de determinados polimorfismos en genes importantes en el desarrollo de enfermedad tuberculosa puede desempeñar un papel en la resistencia natural a este patógeno216. Finalmente, un hecho que debe destacarse es que tras la exposición continua cerrada a bacilos tuberculosos (p. ej. en el submarino Bird) sólo se afectan un 45%-50% de los contactos, lo que implica que la otra mitad no se infectan 217. Evidentemente todos los datos previos son sugerentes pero no demuestran fehacientemente la resistencia natural. Los estudios experimentales han aportado claves más rigurosas, principalmente los genes Nramp 1 y 2 (Natural resistence associated protein macrophage protein)218,219 y el recientemente descrito sst1 (susceptibility to tuberculosis-1)220. La mayor parte de los datos de los que se dispone en la actualidad derivan del estudio del gen Nramp1. Este gen, que controlaba de forma aislada la resistencia a la tuberculosis se describió inicialmente en ratones y se denominó bcg 221. Posteriormente, se comprobó que no sólo controlaba la resistencia a M. tuberculosis sino a otros microorganismos intracelulares como Salmonella sp. o Leismania sp. de lo que deriva su denominación actual. Este gen se localiza en el cromosoma 1 del ratón y en el cromosoma 2 humano y restringiéndose la expresión de la proteína codificada a las células del sistema mononuclear fagocítico218. Funcionalmente es una proteína que se localiza en la vacuola de fagocitosis y transporta hierro y nitritos a su interior. En el seno de la vacuola de fagocitosis, los nitritos pueden ser dismutados a óxido nítrico, que ejerce un efecto microbicida222. La importancia de este mecanismo se ha puesto de manifiesto al encontrar en humanos polimorfismos de este gen que se asocian a una mayor susceptibilidad a la tuberculosis 223 y al observar mecanismos de evasión en la bacteria tuberculosa muy similares (Mramp; Mycobacterium analogue of Nramp) que competirían en la captación de cationes 224. Conclusiones En la actualidad, disponemos de una abundante información acerca de los mecanismos por los que M. tuberculosis da lugar a infección y eventualmente enfermedad. Sin embargo, permanecen sin aclarar múltiples aspectos, como los mecanismos por los que los macrófagos destruyen a los bacilos, el papel real del óxido nítrico, la cronología exacta de los fenómenos patogénicos, los mecanismos de latencia así como los mecanismos por los que se pone en marcha la reactivación local o el papel de los diferentes genes que controlan la resistencia natural a la tuberculosis. Del conocimiento de estos y otros aspectos derivará un mejor manejo de la infección y enfermedad tuberculosa, evitando por tanto sus consecuencias sobre el ser humano. Bibliografía 1. American Thoracic Society. Committee on priorities for tuberculous research. Future research in tuberculosis. Am Rev Respir Dis 1988; 138: 1327-1329 2. Caylá JA, Jansá JM, Artazcoz L. Estructura organizativa del tratamiento de la tuberculosis en un país endémico. En: Vidal Plá R y De March Ayuela P (ed) Tratamiento de la infección y enfermedad tuberculosa. Ed Doyma 1992; 69-76 3. Grigg ERN. The arcane of tuberculosis with a brief epidemiological history of disease in USA. Am

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Inmunidad contra P. falciparum y el papel de la multiplicidad de infección Alfredo G. Mayor y Pedro L. Alonso Unidad de Epidemiologia Centro de Salud Internacional Hospital Clinic / IDIBAPS* Barcelona * Institut d’Investigacions Biomediques August Pi i Sunyer La aparición y propagación de parásitos resistentes a los fármacos antimaláricos y de los vectores anofelinos resistentes a los insecticidas, indican la necesidad del desarrollo de vacunas para el control de la malaria. Para este tipo de medidas de control es necesario el conocimiento de cómo se desarrolla la inmunidad contra la malaria. La protección contra P. falciparum se ha descrito en áreas hiperendémicas de África y Papúa-Nueva Guinea1, 2. En estas regiones, los adultos desarrollan un estado de potente inmunidad en la que los individuos están infectados crónicamente con parasitemias de muy baja densidad y sólo ocasionalmente sufren episodios de malaria clínica. Esta inmunidad parcial se caracteriza por ser incompleta, independiente de cepa, de corta duración, de desarrollo extremadamente lento y no esterilizante 3. La evidencia sistemática más temprana de la capacidad del hombre de adquirir una inmunidad efectiva contra la malaria surgió de estudios epidemiológicos que mostraron que las manifestaciones clínicas y parasitológicas de la enfermedad declinaban con la edad en residentes de áreas endémicas4. Según la opinión de Ronald Ross (1910), los trabajos de Robert Koch en Java fueron los que sugirieron por primera vez que “en la mayoría de los sitios con mucha malaria los niños sufren la forma aguda de la enfermedad. La sangre de aquéllos que sobreviven produce de forma gradual algo que tras un

determinado número de años tiene el poder de reducir y quizás extinguir la invasión de los parásitos”. Sin embargo, aún está poco claro si el desarrollo de la inmunidad resulta de una respuesta inmune específica de haplotipo o de una respuesta secundaria de una especificidad más amplia trascendente de haplotipo, o si simplemente refleja que la eliminación eficiente de los parásitos es dependiente del desarrollo intrínseco del sistema inmune de los individuos. La hipótesis de exposición acumulativa propone que la relativa susceptibilidad de los niños a los estadios sanguíneos del parásito se debe a un repertorio inadecuado de células de memoria y efectoras contra el espectro antigénico del parásito en la naturaleza. Los parásitos evadirían una respuesta inmune efectiva hasta que el huésped experimentase exposición a suficientes infecciones como para montar una defensa eficaz. Basándose en estas observaciones, se ha considerado que para la protección en áreas hiper u holoendémicas es suficiente con un periodo de 10-15 años de exposición ininterrumpida. Esta hipótesis la sugirió por primera vez Robert Koch4 al observar diferentes patrones de parasitemia específicos de la edad en la población de Java expuestos a malaria hipo versus hiperendémica. La ausencia de un patrón relacionado con la edad en los sujetos relativamente menos expuestos sugirió la necesidad de una exposición fuerte e ininterrumpida para la protección. El requisito de una exposición repetida a parásitos de malaria para mantener la inmunidad protectiva se observa en individuos inmunes que se desplazan a áreas no endémicas y tienden a sufrir la enfermedad clínica cuando son infectados por nuevos parásitos5. Varios trabajos han mostrado que, en áreas endémicas, el suero de individuos expuestos a P. falciparum o P. vivax muestra un incremento en el grado de reconocimiento de antígenos parasitarios al aumentar las exposiciones a P. falciparum 6. Se ha propuesto que el lento establecimiento de la inmunidad se debe al reto heterólogo (polimorfismo antigénico)7. La inmunidad se alcanzaría durante la infancia y vida adulta, supuestamente por la lenta acumulación de inmunidades específicas de haplotipo al incrementar el número de tipos parasitarios reconocidos. El hallazgo de que episodios clínicos sucesivos sufridos por niños senegaleses que viven en una área holoendémica estaban asociados con el crecimiento rápido y aparentemente descontrolado de parásitos recientemente inoculados, las características genéticas de los cuales diferían en cada episodio8, apoya la hipótesis de que la diversidad del parásito es uno de los factores que contribuye a la ocurrencia de ataques clínicos y de que existe un componente específico de haplotipo en la inmunidad protectiva. La adquisición más general de una inmunidad protectiva requeriría, por tanto, una exposición repetida a una gran variedad de parásitos. La demostración de variación antigénica en P. knowlesi9 y P. falciparum10 supuso un argumento más para esta hipótesis. En definitiva, según esta teoría la lenta adquisición de inmunidad natural se justifica como el producto acumulativo de una fuerte exposición contra los parásitos. La adquisición de un repertorio de células de memoria regularía de forma efectiva la supresión de la densidad de parasitemia. La inmunidad natural sería, por tanto, la suma de inmunidades específicas de haplotipo conseguidas a lo largo de 10 años de exposición al parásito. La hipótesis trascendente de haplotipo propone la existencia de un fuerte componente de inmunidad específica no variante. Existen varias observaciones que apoyan esta hipótesis. En un estudio se retó a voluntarios humanos inmunizados mediante picaduras de mosquitos irradiados infectados con P. falciparum11. Los individuos inmunizados que resistieron el reto desarrollaron una inmunidad efectiva no específica de aislado. En otro trabajo se observó un decremento en las densidades de parasitemia por P. falciparum tras la transfusión de IgGs de adultos inmunes de África del oeste en niños que vivían en África del este12. Varios miles de kilómetros entre el donante y el receptor tenían aparentemente poco efecto en la eficacia protectora de las IgGs de adultos inmunes. Esto también era así cuando IgGs de adultos africanos se inyectaban en monos Aotus infectados con aislados asiáticos de P. falciparum 13. La transferencia de IgG de adultos africanos inmunes en pacientes tailandeses con la enfermedad aguda tuvo también efectos similares14. Otra observación que apoya esta hipótesis surgió del análisis retrospectivo de los datos parasitológicos y de fiebre de 318 pacientes que, entre 1940 y 1963, fueron infectados con las líneas El Limon, Santee Cooper, o McLendon de P. falciparum como tratamiento de la neurosífilis. Cincuenta y nueve de estos pacientes fueron reinfectados con P. falciparum para su tratamiento15. Tras la inducción de malaria se desarrollaba una inmunidad efectiva. La protección era mayor cuando se retaba con un haplotipo homólogo del parásito, aunque normalmente también era evidente cierta protección contra haplotipos heterólogos. Por último, en otro estudio reciente se ha puesto de manifiesto que la inmunidad a malaria severa no cerebral se consigue tras 1 o 2 infecciones16, indicando que existe un fuerte componente de inmunidad específica no variante (trascendente de haplotipo) implicada en la protección contra la enfermedad severa. Otra hipótesis para explicar el lento establecimiento de inmunidad natural postula que ésta

depende de la edad del individuo infectado17. Los cambios intrínsecos en las funciones inmunes que afectan el curso de la infección por P. falciparum podrían estar ligados al desarrollo y maduración normal del huésped. Estos cambios influirían en la inmunidad contra P. falciparum independientemente de los efectos acumulativos de una exposición ininterrumpida. Así, la inmunidad se podría desarrollar tras relativamente pocas infecciones hasta un nivel determinado por factores inmunes que cambiarían con la edad. Durante 1987 y 1988, en un estudio longitudinal de malaria entre emigrantes de Java (baja intensidad de malaria), que se desplazaban a Irian Jaya (alta intensidad de malaria) se observó una rápida adquisición de inmunidad natural por los adultos pero no por los niños18. Se estudió la susceptibilidad de los migrantes javaneses respecto a los nativos irianeses. Mientras que los javaneses tenían prevalencias específicas ligeramente mayores, la distribución de las prevalencias entre los grupos de edad de los javaneses era paralelo al de los nativos de Irian Jaya. Este patrón se observaba también para el tiempo medio de la primera parasitemia, densidad, tasa esplénica y síntomas de malaria. Aunque los inmigrantes tenían menos de 2 años de exposición, su susceptibilidad específica de edad era paralela a la de los residentes. Posteriormente se midió una incidencia de 3 infecciones de P. falciparum por persona y año en las áreas de inmigración de Irian Jaya19. Durante 1-2 años, por tanto, cada persona recibía de 3 a 6 infecciones. Esta exposición era aparentemente suficiente para inducir un patrón de protección dependiente de la edad. La exposición acumulativa no parecía gobernar, por tanto, la eficacia de la inmunidad adquirida naturalmente en esta población. Desde hace tiempo se sabe que los aislados de malaria están compuestos de una mezcla de diferentes poblaciones de parásitos. Las infecciones por P. falciparum son genéticamente muy diversas en la gran mayoría de situaciones (excepto circunstancias inusuales como epidemias, islas o poblaciones aisladas), y la gran mayoría de individuos infectados en zonas de transmisión endémica son portadores de más de un alelotipo del parásito. Las infecciones concurrentes se han encontrado casi tan frecuentemente en regiones de baja endemicidad (Sudán20, 21, 22) como en áreas de mayor transmisión (Gambia23, Senegal24 y Tanzania25). En general, los estudios sobre multiplicidad de infección han establecido que la concurrencia de infecciones dentro del huésped parece depender no sólo de la exposición sino también de la edad; puede alcanzar altos niveles (hasta 9 genotipos diferentes en un solo huésped); y puede estar asociada con el riesgo de malaria clínica. La cuantificación del número de genotipos parasitarios coinfectantes ha permitido abordar la cuestión del desarrollo de la inmunidad desde una perspectiva epidemiológica molecular. En este sentido, el concepto de multiplicidad de infección ha supuesto una nueva herramienta para responder a preguntas sobre la ecología del parásito y su interacción con la población de los hospedadores. Se han propuesto varias teorías que tratan de explicar el papel de la multiplicidad de infección en el curso de las infecciones. En un estudio prospectivo realizado en una área altamente endémica de Papúa-Nueva Guinea26

se observó que los niños con múltiples infecciones mostraban una menor incidencia de ataques clínicos que los niños con una sola infección. Estos datos sugirieron que las infecciones concurrentes o muy recientes protegen contra los parásitos superinfectantes. Estudios realizados en Idete (Tanzania)27 han mostrado que en esta zona hiperendémica la multiplicidad de infección es dependiente de edad, al igual que la relación entre multiplicidad de infección y el riesgo de tener malaria clínica. El rango de edad en el que se incrementa la multiplicidad de la infección y la prevalencia por microscopía corresponde al tiempo en que los niños adquieren inmunidad clínica. A partir de estos datos se reintrodujo el término de premunición28, según el cual las infecciones crónicas existentes protegen contra las superinfecciones, ya sea evitando que los nuevos alelotipos invasores se establezcan, ya sea vía tolerancia de nuevas infecciones. Según esta teoría, cada haplotipo parasitario infectante constituye una especificidad inmunológica con cierto grado de protección cruzada. Cuanto mayor sea el número de parásitos coinfectantes, más ocupado queda el espacio inmune que comprende el repertorio total de las posibles respuestas inmunes del huésped. De esta forma, los nichos inmunológicos que pueden ocupar los nuevos parásitos infectantes quedarían más restringidos cuanto mayor fuese la concurrencia de infecciones. Una hipótesis diferente surgió a partir de estudios desarrollados en 2 pueblos muy cercanos de Senegal. La multiplicidad de infección era mayor en la zona de mayor intensidad de transmisión29

(Dielmo, 200 picaduras infectivas por persona por año) que en la de menor transmisión30 (Ndiop, 20 picaduras infectivas por persona y año). La complejidad de las infecciones en Dielmo decae a la edad en que se monta una inmunidad eficiente, pero no varía con la edad en Ndiop. El número de tipos parasitarios por aislado y la influencia de edad en la complejidad y la distribución de alelos parece

depender, por tanto, de la intensidad de transmisión, en la medida en que una alta endemicidad (Dielmo) podría permitir el desarrollo más rápido de una inmunidad antiparasitaria que en zonas de baja endemicidad (Ndiop). A medida que los niños crecen, la adquisición de inmunidad contra la malaria reduciría la densidad parasitaria, la complejidad de las infecciones y el riesgo de nuevas infecciones patentes tras un tratamiento supresor, pero no reduciría la prevalencia de infección que normalmente es crónica y asintomática. Trabajos desarrollados en Daraweesh (Sudán)31 mostraron una tendencia significativa a que las infecciones contuviesen un mayor número de alelotipos en los episodios que durante el periodo asintomático. También se observó una diferencia considerable en la densidad parasitaria entre estos 2 estados infecciosos, lo cual llevó a sugerir que el muestreo de un mayor número de parásitos incrementaba la probabilidad de detectar infecciones complejas, ya sea por competencia entre los moldes de DNA durante las fases iniciales de amplificación por PCR o por problemas de muestreo de los diferentes tipos parasitarios. Por otro lado, trabajos desarrollados en Manhiça (Mozambique) han mostrado que las técnicas de tipificación de parásitos de P. falciparum basadas en la PCR tienden a subestimar el número de genotipos concurrentes en aquellas infecciones dobles de baja densidad en las que las proporciones alélicas se alejan de la igualdad. Además, un estudio prospectivo desarrollado en niños mozambicanos menores de 10 años indicó que la multiplicidad de infección constituía un factor de riesgo positivo de malaria clínica, sugiriendo que la concurrencia de infecciones podría ser un marcador de exposición. La dinámica de las infecciones múltiples y su papel en el desarrollo de la inmunidad contra malaria sigue siendo muy controvertida. Es fácil tener la impresión de que la malaria es una condición homogénea. Sin embargo, esto probablemente no es así, ya que se dan variaciones ecológicas que afectan tanto al vector como a la población humana, originando un amplio rango de condiciones, desde malarias epidémicas inestables e intermitentes hasta holendemicidades. Las discrepancias entre los estudios realizados en áreas geográficas con diferentes intensidades de transmisión se deben probablemente a que la cinética de la multiplicidad de infección es, en realidad, un proceso muy complejo determinado, entre otros factores, por el estado inmune del huésped y las limitaciones inherentes de la técnica de tipificación. Bibliografía 1 Cattani JA, Tulloch JL, Vrbova H, Jolley D, Gibson FD, Moir JS, Heywood PF, Alpers MP, Stevenson A, Clancy R. The epidemiology of malaria in a population surrounding Madang, Papua New Guinea. Am J Trop Med Hyg 1986;35(1):3-15. 2 Trape JF, Rogier C, Konate L, Diagne N, Bouganali H, Canque B, Legros F, Badji A, Ndiaye G, Ndiaye P, et al. The Dielmo project: a longitudinal study of natural malaria infection and the mechanisms of protective immunity in a community living in a holoendemic area of Senegal. Am J Trop Med Hyg 1994;51(2):123-37. 3 Druilhe P, Perignon JL. Mechanisms of defense against P. falciparum asexual blood stages in humans. Immunol Lett 1994;41(2-3):115-20. 4 Koch, R. Zweiter bericht über die thatigkeit der malaria-expedition. Deutsche Medizinische Wochenschrift.1900; 26, 88-90. 5 Gill C. A. Epidemic or fulminant malaria together with a preliminary study of the part played by immunity to malaria. Indian Journal of Medical Research 1914; 2: 268-315. 6 Marsh K, Howard RJ. Antigens induced on erythrocytes by P. falciparum: expression of diverse and conserved determinants. Science 1986 10;231(4734):150-3. 7 Mendis KN, David PH, Carter R. Antigenic polymorphism in malaria: is it an important mechanism for immune evasion? Immunol Today 1991;12(3):A34-7. 8 Contamin H, Fandeur T, Rogier C, Bonnefoy S, Konate L, Trape JF, Mercereau-Puijalon O. Different genetic characteristics of Plasmodium falciparum isolates collected during successive clinical malaria episodes in Senegalese children. Am J Trop Med Hyg 1996;54(6):632-43. 9 Brown KN, Brown IN. Immunity to malaria: antigenic variation in chronic infections of Plasmodium knowlesi. Nature 1965;208(17):1286-8. 10 Hommel M, David PH, Oligino LD. Surface alterations of erythrocytes in Plasmodium falciparum malaria. Antigenic variation, antigenic diversity, and the role of the spleen. J Exp Med 1983;157(4):1137-48. 11 Clyde DF, McCarthy VC, Miller RM, Hornick RB. Specificity of protection of man immunized against sporozoite-induced falciparum malaria. Am J Med Sci 1973;266(6):398-403. 12 McGregor, I, Carrington SP, Cohen S. Treatment of East African P. falciparum malaria with West

African human gammaglobulin. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1963;57: 170-175. 13 Diggs CL, Hines F, Wellde BT. Plasmodium falciparum: passive immunization of Aotus lemurinus griseimembra with immune serum. Exp Parasitol 1995;80(2):291-6. 14 Druilhe P, Bouharoun-Tayoun H. Natural immunites. Res Immunol. 1991; 142(8):637-43. 15 Collins WE, Jeffery GM A. retrospective examination of secondary sporozoite- and trophozoiteinduced infections with Plasmodium falciparum: development of parasitologic and clinical immunity following secondary infection. Am J Trop Med Hyg 1999;61(1 Suppl):20-35. 16 Gupta S, Snow RW, Donnelly CA, Marsh K, Newbold C. Immunity to non-cerebral severe malaria is acquired after one or two infections. Nat Med 1999;5(3):340-3. 17 Baird JK, Fryauff DJ, Basri H, Bangs MJ, Subianto B, Wiady I, Purnomo, Leksana B, Masbar S, Richie TL, et al. Primaquine for prophylaxis against malaria among nonimmune transmigrants in Irian Jaya, Indonesia. Am J Trop Med Hyg 1995;52(6):479-84. 18 Baird JK, Jones TR, Danudirgo EW, Annis BA, Bangs MJ, Basri H, Purnomo, Masbar S. Agedependent acquired protection against Plasmodium falciparum in people having two years exposure to hyperendemic malaria. Am J Trop Med Hyg 1991;45(1):65-76. 19 Jones TR, Baird JK, Bangs MJ, Annis BA, Purnomo, Basri H, Gunawan S, Harjosuwarno S, McElroy PD, Hoffman SL. Malaria vaccine study site in Irian Jaya, Indonesia: Plasmodium falciparum incidence measurements and epidemiologic considerations in sample size estimation. Am J Trop Med Hyg 1994;50(2):210-8. 20 Babiker HA, Creasey AM, Fenton B, Bayoumi RA, Arnot DE, Walliker D. Genetic diversity of Plasmodium falciparum in a village in eastern Sudan. 1. Diversity of enzymes, 2D-PAGE proteins and antigens. Trans R Soc Trop Med Hyg 1991;85(5):572-7. 21 Babiker HA, Creasey AM, Bayoumi RA, Walliker D, Arnot DE. Genetic diversity of Plasmodium falciparum in a village in eastern Sudan. 2. Drug resistance, molecular karyotypes and the mdr1 genotype of recent isolates. Trans R Soc Trop Med Hyg 1991;85(5):578-83. 22 Bayoumi RA, Creasey AM, Babiker HA, Carlton JM, Sultan AA, Satti G, Sohal AK, Walliker D, Jensen JB, Arnot DE. Drug response and genetic characterization of Plasmodium falciparum clones recently isolated from a Sudanese village. Trans R Soc Trop Med Hyg 1993;87(4):454-8. 23 Conway DJ, Greenwood BM, McBride JS. The epidemiology of multiple-clone Plasmodium falciparum infections in Gambian patients. Parasitology 1991;103 Pt 1:1-6. 24 Konate L, Zwetyenga J, Rogier C, Bischoff E, Fontenille D, Tall A, Spiegel A, Trape JF, Mercereau- Puijalon O. Variation of Plasmodium falciparum msa1 block 2 and msp2 allele prevalence and of infection complexity in two neighbouring Senegalese villages with different transmission conditions. Trans R Soc Trop Med Hyg 1999;93 Suppl 1:21-8. 25 Babiker HA, Lines J, Hill WG, Walliker D. Population structure of Plasmodium falciparum in villages with different malaria endemicity in east Africa. Am J Trop Med Hyg 1997;56(2):141-7. 26 al-Yaman F, Genton B, Reeder JC, Anders RF, Smith T, Alpers MP. Reduced risk of clinical malaria in children infected with multiple clones of Plasmodium falciparum in a highly endemic area: a prospective community study. Trans R Soc Trop Med Hyg 1997;91(5):602-5. 27 Smith T, Beck HP, Kitua A, Mwankusye S, Felger I, Fraser-Hurt N, Irion A, Alonso P, Teuscher T, Tanner M. Age dependence of the multiplicity of Plasmodium falciparum infections and of other malariological indices in an area of high endemicity. Trans R Soc Trop Med Hyg 1999;93 Suppl 1:15-20. 28 Sergent E and Parrot L. L’immunité, la prémunition et la résistance inné. Arch Inst Pasteur Alger 1935;3:279-319. 29 Ntoumi F, Contamin H, Rogier C, Bonnefoy S, Trape JF, Mercereau-Puijalon O. Age-dependent carriage of multiple Plasmodium falciparum merozoite surface antigen-2 alleles in asymptomatic malaria infections. Am J Trop Med Hyg 1995;52(1):81-8. 30 Zwetyenga J, Rogier C, Tall A, Fontenille D, Snounou G, Trape JF, Mercereau-Puijalon O. No influence of age on infection complexity and allelic distribution in Plasmodium falciparum infections in Ndiop, a Senegalese village with seasonal, mesoendemic malaria. Am J Trop Med Hyg 1998;59(5):726-35. 31 Roper C, Richardson W, Elhassan IM, Giha H, Hviid L, Satti GM, Theander TG, Arnot DE. Seasonal changes in the Plasmodium falciparum population in individuals and their relationship to clinical malaria: a longitudinal study in a Sudanese village. Parasitology 1998;116 ( Pt 6):501-10.

Prevalencia de las parasitosis humanas en España. José Enrique Piñero y Basilio Valladares Unidad de Parasitología Facultad de Farmacia Universidad de La Laguna En enero del año 2000, se celebró en la ciudad de Sitges el II Congreso de la Sociedad Española de Medicina Tropical y Salud Internacional (SEMTSI). En la reunión que tuvo la Junta Directiva se acordó proponer la creación de grupos de trabajo, que dinamizaran la actividad de la Sociedad. Como consecuencia de ello se propuso a la Junta General, la creación de un grupo de trabajo denominado “Prevalencia de las parasitosis humanas en España”. Su trabajo consistiría en la realización de un catálogo sobre las distintas parasitosis que afectan a la población, tanto en lo que hace referencia a las autóctonas como las importadas. De esta forma se pretendía realizar un estudio que permitiera conocer de forma global la situación de los parásitos en España, pudiendo de esta manera, proponer directrices que puedan llevar al control de los mismos. Es obvio que un proyecto tan ambicioso como el que se pretendía con este grupo de trabajo requiere de la implicación de todas aquellas instituciones que están de alguna manera en contacto con este tipo de enfermedades. Para llevar a cabo un estudio serio y cuyos resultados puedan ser tomados en consideración para la elaboración de pautas de control es necesario la toma del mayor número posible de datos en todo el territorio español. La Junta General aceptó la propuesta de la Junta Directiva y encargó al grupo de Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de La Laguna que coordinase los primeros pasos necesarios para poner en funcionamiento este proyecto. Lo primero que había que solucionar era la confección de un formulario donde pudiesen quedar recogidos el mayor número de datos posibles sobre las parasitosis detectadas y la colocación del mismo en una página Web de fácil acceso que permitiese a los grupos que colaboraban realizar la denuncia de los casos detectados . Esta página, dependería de la SEMTSI y sus resultados quedarían conectados a una base de datos para su posterior tratamiento estadístico. El formulario elaborado se dividió en cinco apartados: el primero de ellos hacía referencia a los datos del informante y en el se pretendía conocer la fecha del informe, nombre y apellidos de la persona que hace la denuncia, centro de trabajo, teléfono, correo electrónico, titulación y categoría profesional. Con todos estos datos se pretendía asignar a cada caso la autoría del diagnóstico y que los grupos que colaborasen mantuvieran una cierta potestad sobre las comunicaciones realizadas. El segundo apartado hacía referencia a los datos del paciente y en el se comunicaría el sexo del mismo, la edad, nacionalidad, lugar de residencia habitual, el municipio, si residía en área rural o urbana, la profesión, lugar de trabajo, si mantenía contacto habitual con animales y de ser así con que tipo de animal. Todos estos datos nos permitirían la ubicación exacta de la persona afectada y conocer en que tipo de ambientes pudiera haber adquirido la parasitosis declarada. Un tercer apartado de la encuesta hacía referencia a los datos clínicos del paciente y de esta manera se preguntaba sobre la fecha de inicio de los primeros síntomas, la sintomatología observada, complicaciones, si tuvo lugar el ingreso en el hospital y de ser así en que fecha, el centro de ingreso, el tratamiento realizado, la evolución del paciente y, por último, si el paciente presentaba inmunosupresión y en caso afirmativo, de que tipo. Todos estos datos permitirían observar la evolución en la clínica de la parasitosis detectada y la constatación del perfil que esta mantenía y poderlo comparar con el clásico asociado a la enfermedad diagnosticada. El cuarto de los apartados propuestos hace referencia a los datos de laboratorio y se preguntaba sobre la fecha del diagnóstico, el tipo de muestra analizada, la técnica de diagnóstico empleada, el parásito diagnosticado y el grupo al que pertenecía el mismo. Todos estos datos eran tremendamente importantes para la homogeneización de los resultados. Se sabe que la habilidad del microscopista en el caso del diagnóstico microscópico, es fundamental. Lo mismo ocurre con la sensibilidad y especificidad con la técnica empleada para el diagnóstico, caso de diagnóstico inmunológico o molecular. La tremenda dificultad a la hora de comparar los métodos era una de las principales dificultades de la encuesta. Todos estos datos permitirían, entre otras cosas, asociar las técnicas de diagnóstico más efectivas al tipo de muestra analizada y al tipo de parásito diagnosticado. El último apartado al que hace referencia la encuesta, pretendía conocer algunos aspectos sobre

los datos epidemiológicos de los casos detectados. Así se preguntaba sobre si el caso era autóctono o importado, continente, país y ciudad de contagio, fecha de salida y regreso en caso de viaje, lugar de entrada en España, motivo de estancia en el país de contagio, datos sobre si se llevo a cabo quimioprofilaxis o no y con que fármaco y un apartado final de observaciones. Resuelto el encargo hecho por la Junta en Sitges, fue presentado en la Junta General, con el fin de saber si se seguía adelante con la propuesta o si por el contrario, debería emplearse otra estrategia o no realizarla. Después de un amplio debate, en el que se discutieron entre otras cosas, las grandes dificultades existentes para la colaboración de personas e instituciones ajenas a la SEMTSI, así como la problemática de las técnicas de diagnóstico, se llegó al acuerdo de que sería más conveniente iniciar el trabajo por provincias o autonomías que pudieran ser mejor controladas y a la vista de la experiencia, desarrollar la encuesta en el resto del territorio nacional.

Diagnóstico molecular de brotes por parásitos T. Gárate, A. Benito, C. Chicharro, I. De Fuentes, M.A. Morales, E. Rodríguez, J.M. Rubio, J. Alvar. Instituto de Salud Carlos III, Centro Nacional de Microbiología, Servicio de Parasitología, Carretera Majadahonda-Pozuelo, Km 2.2, 28220-Majadahonda, Madrid, España. Introducción Un brote epidémico por parásitos se puede considerar como una situación epidémica caracterizada por la existencia de un número de personas afectadas por una determinada parasitosis, con una frecuencia claramente superior a la esperada en condiciones normales, en un ámbito geográfico y período de tiempo determinados. Cuando el personal sanitario detecta la existencia de un brote, resulta imprescindible su estudio inmediato para: (i) Identificar las causas que están determinando su aparición y adoptar las medidas de control adecuadas a corto, medio y largo plazo. (ii) Conocer el comportamiento de la enfermedad y los factores de riesgo que actúan en la comunidad y conducen a su aparición. Toda la información obtenida permitirá tomar las medidas oportunas para prevenir la difusión del brote, con el riesgo de epidemias más graves, así como la adopción de medidas a largo plazo que eviten brotes futuros similares 1. En el Servicio de Parasitología hemos participado en la identificación de los parásitos en el seguimiento de los brotes mediante la caracterización de marcadores moleculares específicos de estos patógenos y el diseño de técnicas de detección adecuadas. Nuestros esfuerzos se han centrado en el análisis de dos tipos de moléculas, proteínas (isoenzimas, antígenos) y ácidos nucleícos (ácido desoxiribonucleico, ADN), seleccionando en ambos casos aquellos dominios o fragmentos que mejor se adapten a los objetivos planteados sobre diagnóstico específico y sensible. Una vez investigadas la naturaleza y propiedades de las dianas moleculares seleccionadas, se procedió a la puesta a punto de técnica de laboratorio sencillas, de rápida ejecución y reproducibles. Se han empleado principalmente ELISA y "Western-blot" para la evaluación de los antígenos de interés, asi como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y sus variantes, para los estudios de las secuencias de ADN seleccionadas. A continuación se revisan algunos de los brotes estudiados, asi como el trabajo de vigilancia llevado a cabo en las parasitosis de gran interés sanitario. En concreto se examinan situaciones de emergencia en leishmaniasis, malaria, cryptosporidiosis y triquinelosis. Leishmaniasis Las leishmaniasis están producidas por diferentes especies del género Leishmania, y son transmitidas por flebotominos. Las diferentes manifestaciones clínicas de la enfermedad dependen tanto de la especie de Leishmania responsable de la misma como del estado inmunológico del paciente. Esta parasitosis está presente en 88 países de regiones tropicales y subtropicales, alcanzando zonas templadas como centro y sur de América, la cuenca Mediterránea, Próximo y Medio Oriente y el sur de China. Se estima una prevalencia de 15 millones de enfermos, con 2 millones de nuevos casos al año y más de 350 millones de habitantes en áreas de riesgo 2. En los países mediterráneos, Leishmania infantum es responsable tanto de la leishmaniasis visceral como de la cutánea y , además, se le considera un importante patógeno oportunista asociado a la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 3,4. En la coinfección Leishmania-VIH, mediante estudios isoenzimáticos, se aprecia una gran

variabilidad parasitaria no descrita en las cepas aisladas de individuos inmunocompetentes, siendo común la visceralización de zimodemas dermotrópicos así como la descripción de nuevos perfiles isoenzimáticos no descritos anteriormente 3. A pesar de que la caracterización isoenzimática es la técnica más empleada en el estudio de la variabilidad de Leishmania, un mismo zimodema puede presentar diferentes genotipos 5, por lo que es difícil diferenciar entre reinfecciones y recidivas y reduce el valor de este método en el seguimiento molecular del parásito. Por este motivo, se han desarrollado otras técnicas de estudio basadas en la PCR como el RAPD o "Rapid Amplification of Polymorphic DNA" 6 o la amplificación de las regiones intergénicas ribosomales y posterior estudio de su polimorfismo mediante digestión con enzimas de restricción (RFLP) 7. El análisis del ADN del kinetoplasto (kADN) también ha sido empleado en el análisis de la variabilidad. Nuestro laboratorio ha desarrollado una nueva técnica combinando éstas últimas: amplificación mediante PCR de los minicírculos del kinetoplasto, usando “primers” diseñados a partir de la región conservada, y posterior estudio con una serie de seis enzimas del fragmento de kADN amplificado (PCR-RFLP) 5. El patrón de restricción obtenido se mantiene constante para una misma cepa incluso después de 3-4 años, lo que permite un seguimiento individualizado de cada aislado. En los últimos años, en el Servicio se ha identificado un brote de leishmaniasis visceral entre individuos VIH positivos y adictos a drogas por vía parenteral (ADPV) 8. Los tres pacientes implicados en el brote (A, B, C) vivían en la misma zona geográfica (Badalona), y las muestras de L. infantum se aislaron en un periodo inferior a cuatro meses. El estudio isoenzimático de los diferentes aislados (aspirado de médula y/o sangre periférica) obtenidos de cada paciente mostró el mismo perfil para todas las muestras estudiadas: MON 253. Este zimodema no se había encontrado anteriormente en España y sólo se había descrito una vez en un paciente sueco que había realizado frecuentes viajes por países mediterráneos 9. Aunque debido a la confidencialidad de los datos médicos, era imposible establecer una relación entre los tres pacientes, el hecho de que todos ellos presentaran simultáneamente un nuevo zimodema, vivieran en la misma ciudad y tuvieran hábitos comunes nos hizo sospechar de que una sóla cepa de Leishmania era responsable de los tres casos. Posteriormente se estudió el kADN (PCR-RFLP) 5 de cada uno de los aislados. El patrón de restricción obtenido, usando hasta seis endonucleasas diferentes, era idéntico en todos los casos para cada una de las enzimas (Figura 1). Para ratificar la homología de los fragmentos amplificados, éstos se subclonaron en pGEM-T y posteriormente fueron secuenciados usando un secuenciador automático. Las secuencias obtenidas para los diferentes clones de los diferentes aislados presentaban un alto grado de homología (superior al 95 %), lo que confirmó que estos tres casos de leishmaniasis estaban producidos por una sola cepa del parásito. Este dato refuerza la teoría, anteriormente descrita por nuestro laboratorio 10, de la existencia de un ciclo de transmisión artificial y antroponótico mantenido entre adictos a drogas por vía parenteral (ADPV), en el que los flebotominos han sido sustituidos por jeringas. Figura 1.- Patrones de PCR-RFLP. Los patrones fueron obtenidos tras la digestión con Hpa II del producto de amplificación de 6 aislados procedentes de Badalona. Calle M Marcador molecular, calles 1 y 2.- Aislados de pacientes de Badalona, no relacionados con el brote y usados como control, calles 3 y 4.- Muestras de médula ósea y sangre periférica del paciente A, calle 5.- Muestra de médula ósea del paciente B, calle 6.- Muestra de médula ósea del paciente C. Paludismo El paludismo es uno de los problemas de salud más graves que existen en el mundo, afectando a cien países o territorios, todos ellos situados en una enorme franja de terreno a ambos lados del ecuador. Causa entre 300 y 500 millones de nuevos casos clínicos al año y se estima que de un 40% a un 60% de la población mundial vive en zonas de riesgo 11. Desde el último caso descrito en España en 1962, todas las malarias que se han registrado en nuestro país son importadas. En el Laboratorio de Referencia de Malaria del Servicio de Parasitología se realiza una intensa labor en la vigilancia de esta parasitosis, apreciándose un incremento del 40% en el número de casos importados confirmados desde 1992, fecha en la que se inició dicha vigilancia. Asi, durante el año 2000 hemos estudiado en nuestro Laboratorio 1222 muestras con sospecha diagnóstica de paludismo, confirmándose que 164 (13,5%) eran positivas por microscopía y 281 (23%) positivas mediante Seminestedmultiplex PCR (SnM-PCR) 12. Esta observación pone de manifiesto un aumento en la sensibilidad del diagnóstico realizado, con la detección de casi el doble de infecciones no apreciadas por microscopía. La diferencia en la sensibilidad de la SnM-PCR y el diagnóstico microscópico se explica por el gran número de muestras de inmigrantes semi-inmunes analizadas. Estos pacientes exhiben parasitemias de menos de 40 parásitos por microlitro de sangre, cifra que se encuentra por debajo del umbral de detección de la

microscopía óptica. M 1 2 3 4 5 6 La SnM-PCR ha sido desarrollada en nuestro laboratorio y en la actualidad es el método más sensible de detección de las cuatro especies de Plasmodium que afectan al hombre, permitiendo además diagnosticar infecciones mixtas que pasarían desapercibidas por otros métodos. La SnM-PCR está basada en la amplificación en cadena de la subunidad pequeña del ADN ribosómico (ADNr). La secuencia de bases de este ADNr, del que existen miles de copias en los genomas de los organismos eucariotas, es muy similar en todos ellos si bien hay regiones cuya secuencia de nucleótidos es específica de cada plasmodio. Esta dualidad “secuencias específicas/secuencias comunes” permite el diseño de oligonucleótidos (primers) con diversos niveles de especificidad (primers universales, primers con especificidad de género, primers con especificidad de especie, etc.) y usarlos en el sistema denominado “Multiplex PCR”, o detección de las cuatro especies de plasmodio en un único proceso de amplificación. Este método consiste en una primera reacción de amplificación específica para detectar el género de los parásitos en estudio (Plasmodium) y una “Multiplex PCR” a partir de la primera reacción, que nos va a permitir diferenciar las cuatro especies que infectan al hombre por el tamaño de los fragmentos de amplificación obtenidos. Además de la SnM-PCR, en nuestro laboratorio también se utiliza otra PCR que se basa en la amplificación del ADN correspondiente a los genes que codifican antígenos de superficie del merozoito (MSP-1, y MSP-2; "merozoite surface proteins" 1 y 2). Los MSPs presentan amplio polimorfismo, propiedad que nos va a permitir definir si en una misma muestra existe multiplicidad de infecciones, o lo que es lo mismo, cuántas cepas diferentes de parásitos se presentan en una misma muestra de sangre. Combinando la SnM-PCR de diagnóstico especie-específico y la MSP-PCR de polimorfismos de antígenos de superficie, se han podido estudiar las siguientes situaciones de interés: A) La detección de varios aislados de Plasmodium vivax, resistentes o que toleran en mayor o menor medida la primaquina como tratamiento de recidivas 12; B) El diagnóstico de un paludismo inducido por la aplicación en transfusión de sangre procedente de un donante de riesgo 12; C) El aumento de sensibilidad del diagnóstico en pacientes tanto europeos no inmunes como inmigrantes semi-inmunes con esplenomegalia malárica hiperreactiva 13, y; D) La determinación de dos casos de malaria congénita, uno en un niño ecuato-guineano y en su madre, y otro en dos gemelos también de una madre ecuato-guineana 14. Cryptosporidiosis La cryptosporidiosis es una infección intestinal causada por Cryptosporidium, un protozoo coccidio parásito monoxeno. Fue identificado por primera vez como patógeno humano en 1976, considerándose posteriormente un parásito de importancia emergente como agente de enfermedad gastrointestinal tanto en pacientes inmunocomprometidos como inmunocompetentes 15. Es de distribución cosmopolita, asociándose a enfermedades diarreicas en la mayoría de países del mundo y es causa frecuente de enfermedad en el viajero. Las tasas de prevalencia de infección por Cryptosporidium no están bien determinadas, siendo infravaloradas dado el gran número de casos que pasan desapercibidos o no son declarados, considerándose entre 2-3% en Europa y norte América, y es mayor en países en vías de desarrollo, con rangos entre el 5% en Asia y el 10% en Africa 16. La cryptosporidiosis ha sido reconocida en pacientes con SIDA e inmunocomprometidos como causa de diarrea severa no remitente, reportándose asimismo casos de cryptosporidiosis respiratoria, y causa común de gastroenteritis esporádicas y epidémicas en personas inmunocompetentes, principalmente en grupos infantiles, en los que origina una diarrea aguda moderada o severa, autolimitante, pudiendo manifestar dolor abdominal, fiebre y vómitos. La historia natural de la cryptosporidiosis es compleja e incluye reservorios y formas de transmisión zoonóticas y urbanas. Se han señalado más de 40 especies de animales, entre los que destacan los mamiferos domésticos, como reservorios, demostrándose la transmisión cruzada natural y experimentalmente 17. La infección se adquiere por la ingestión e inhalación de ooquistes del parásito eliminados junto con las heces del hospedador. Estos ooquistes son redondeados, miden entre 4-6 µm contienen en su interior 4 esporozoitos envueltos por una pared gruesa doble que los hace muy resistentes a condiciones medioambientales adversas y a la acción de desinfectantes, originando la contaminación del medio 18. Las fuentes más comunes de infección humana son a través del agua y alimentos contaminados, por inhalación, contacto con los animales y el contagio directo persona a persona fecal-oral o por transmisión sexual entre homosexuales masculinos.

Hay que destacar la importancia de los brotes originados por Cryptosporidium, tanto comunitarios como en diferentes grupos de población (guarderías, colegios, hospitales, etc.), en muchos casos asociadas a la contaminación de origen hídrico 19-21. Se han descrito brotes de gran magnitud entre los que se encuentra el de Milwaukee, en 1993, con la afectación de 403.000 personas por contaminación del agua de la red pública filtrada y clorada 22. En los brotes originados por Cryptosporidium es importante tanto el diagnóstico del enfermo como la detección de la posible fuente de contaminación para poder instaurar las medias de control adecuadas. Las técnicas comúnmente utilizadas para el diagnóstico del paciente y del reservorio animal, dada la falta de disponibilidad de pruebas serológicas, se basan en la observación microscópica de ooquistes presentes en las heces tras la utilización de métodos de concentración (técnica de Ritchie, gradiente de sacarosa, etc) y posteriores tinciones específicas tales como la auramina o el más aceptado método de Kinyoun (tinción de Ziehl-Neelsen modificada) basado en la tinción ácida y la propiedad acido-alcohol resistente del ooquiste. No obstante, estas técnicas presentan limitaciones de sensibilidad y especificidad. La solución para mejorar el diagnóstico es la utilización de técnicas moleculares, tanto para la detección del ADN del parásito por PCR como de coproantígenos y ooquistes mediante anticuerpos monoclonales. En nuestro laboratorio se están desarrollando e investigando técnicas moleculares para el diagnóstico y caracterización de Cryptosporidium, basados en la PCR y PCR-RFLP, para apoyo de los estudios epidemiológicos y de rutas de transmisión, ya que se han identificado dos genotipos principales de Cryptosporidium parvum (especie asociada a la cryptosporidiosis humana), genotipos 1 y 2, implicados en dos ciclos diferentes de transmisión, el genotipo 1 exclusivamente humano y en un solo primate no humano y el genotipo 2 tanto animal como humano 23. Sin embargo, el valor epidemiológico de estas técnicas está por evaluar por lo que en el estudio de los casos y brotes, junto a los métodos microscópicos, se está utilizando la detección con anticuerpos monoclonales. La técnica de ELISA de detección de antígenos en muestra de heces por inmunocaptura con anticuerpos monoclonales, permite la detección del parásito; ha demostrado una buena sensibilidad y especificidad, 93% y 99% respectivamente, 24. La técnica de inmunofluorescencia directa (IF), utilizando anticuerpos monoclonales específicos frente a determinados antígenos de la pared del ooquiste, permite la detección del parásito en diversas muestras del enfermo y reservorios (heces, biopsias, etc.) y en muestras de agua y medioambientales, tomadas en el estudio de brotes, mostrando una sensibilidad y especificidad similar a la anterior. Tabla 1. Brotes de cryptosporidiosis analizados en el Servicio de Parasitología años 1996-2000 Año Localidad Colectivo afectado Estudiados Cryptosporidium positivos 1996 Santibáñez del Toral (León) Comunidad terapéutica de rehabilitación 55 personas 7 muestras de aguas 38 1 1997 Palma de Mallorca Hotel 42 personas 16 equinos 1 óvido 11 muestras de agua 24 5 - 5 1997 Guadix (Granada) Colegio disminuídos psíquicos 68 personas 8 muestras de agua 58 -

2000 Zaragoza (prov.) Comunitario (posible origen hídrico) 6 personas (desconocido nº total de afectados) 6 2000 Almohacid de Cuba (Zaragoza) Comunitario (posible origen hídrico) 9 personas (afectación 100 personas de 210 habitantes) 9 En la tabla 1 se resumen los brotes estudiados en nuestro laboratorio en los últimos años, unos de carácter comunitario y otros en grupos específicos de población. Hay que destacar que en la mayoría de estos brotes no existía sospecha de etiología por Cryptosporidium, como sucede en muchos brotes que permanecen con etiología no determinada; el parásito fue detectado en los estudios complementarios tras descartar posible contaminación bacteriana o vírica. En aquellos casos que pudo comprobarse el estudio completo, como en el efectuado en 1997 en Palma de Mallorca, también se analizaron los reservorios y las posibles contaminaciones hídricas, observándose la parasitación de équidos y la contaminación hídrica. Para el análisis de las muestras de agua realizábamos, en principio, la técnica de floculación y posterior detección de los ooquistes por IF, pero en la actualidad desarrollamos la técnica recomendada por la Agencia del Medio Ambiente de USA (EPA), que conlleva un proceso inicial de filtración seguido del método de inmunocaptura y separación magnética de ooquistes y posterior detección por IF 25. La asociación de las distintas técnicas disponibes permite el estudio de forma complementaria y global de los diversos factores que intervienen en la aparición de un brote y su resolución de forma satisfactoria. Triquinelosis La triquinelosis es producida por Trichinella spp y transmitida a través de la ingestión de carne infectada cruda o poco cocida. La distribución de la enfermedad es cosmopolita, afectando al hombre y otros mamíferos. Se estima que en la actualidad hay más de 11 millones de enfermos, concentrados principalmente en Los Balcanes, Rusia, Repúblicas Bálticas, China y Argentina 26. En España, la triquinelosis se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, causada por dos especies, Trichinella spiralis y Trichinella britovi 27, que se caracterizan por presentar distintas propiedades biológicas, epidemiológicas y moleculares. En el humano, se detectan cada año nuevos brotes de la enfermedad 28, con el consumo de carne de jabalí como primera causa de transmisión. Hasta muy recientemente se pensaba que T. spiralis era la única especie implicada en el desencadenamiento de los brotes humanos, pero la introducción de técnicas moleculares basadas en la amplificación del ADN de los parásitos, más concretamente la técnica RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) han permitido confirmar que tanto T. spiralis como T. britovi alcanzan por igual al hombre. Además, para aquellos casos en los que se aislan parásitos muertos de las piezas cárnicas implicadas en el brote, en los que no se puede desarrollar los protocolos RAPD diseñados, se dispone de una batería de anticuerpos monoclonales (US5, US9) 29, preparados en el Laboratorio del Profesor Ubeira del Departamento de Parasitología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela, que posibilitan el diagnóstico especifico de las poblaciones mencionadas a través del reconocimiento de la gp53, antígeno de secreción 30. Los ensayos RAPD desarrollados en el Servicio emplean las condiciones de trabajo previamente descritas 31 y permiten la utilización de ADN purificado o crudo como molde de reacción. El último protocolo, ADN crudo, tiene la ventaja de obtener los resultados en 24 horas, y evitar los 31 días de espera que se requieren para el aislamiento de suficiente material parasitario para llevar a cabo los largos protocolos de preparación de ADN purificado. De los distintos brotes de la enfermedad seguidos en nuestro Servicio, comentaremos dos, Huerta de Marquesado (Cuenca) y Albarracín (Teruel). El de Huerta del Marquesado ocurrió en febrero de 1993 y afectó a 19 personas y el de Albarracín ocurrió en febrero de 1994 con 38 afectados. Las fuentes de infestación fueron embutidos crudos preparados con carne de cerdo en el brote de Cuenca y jabalí en el de Teruel. En las muestras remitidas a nuestro laboratorio, carne y embutidos, se aislaron las cepas llamadas Cañete y Albarracín, respectivamente. A continuación se sometieron a los dos protocolos de extracción

de ADN citados, purificado y crudo 31. Tras las amplificaciones y fraccionamiento de los productos de reacción en geles de agarosa se pudo confirmar que ambos aislamientos presentaban idéntico patrón, corresponsiente al del control de T. britovi T3 introducido en el experimento (Figura 2). Figura 2.- A: Patrones de amplificación obtenidos por RAPD a partir de ADN purificado utilizando los cebadores M-are y M -1. Líneas 1 y 5 : Aislamiento referencia T.spiralis Vasallo (ISS116/T1), líneas 2 y 6: aislamiento Cañete, líneas 3 y 7: aislamiento Albarracín y líneas 4 y 8: aislamiento referencia T.britovi Monegrillo (ISS89/T3). Líneas 1-4: cebador M-are. Líneas 5-8 : cebador M-1. Los productos fueron fraccionados en en gel de agarosa al 0,8% y teñidos con Bromuro de Etidio (EtBr). A la izquierda del gel se muestra el marcador de tamaño molecular lDNA-HindIII. B: Patrones de amplificación obtenidos por RAPD a partir de ADN crudo de 5 larvas L1* utilizando el cebador lgt11F.Línea 1: Aislamiento referencia T.spiralis Vasallo (ISS116/T1), línea 2: aislamiento Cañete, línea 3 :aislamiento Albarracin y ílínea 4: aislamiento referencia T.britovi Monegrillo (ISS89/T3). Los productos fueron fraccionados en en gel de agarosa al 0,8% y teñidos con EtBr. A la derecha del gel se muestra el marcador de tamaño molecular lDNA-BstEII. Además, se examinó el suero de los 57 pacientes involucrados, para determinar el título de anticuerpos específicos mediante inmunofluorescencia (IF) y ELISA, apreciándose que 11 eran positivos. Todos los enfermos presentaron alguno de los siguientes síntomas: mialgia, diarrea, edema, alergia cutánea y fiebre. La mayoría de los pacientes (60%) tuvo eosinofilia, y el 90% mostró niveles elevados del enzima creatinin-fosfoquinasa, no observándose diferencias clínicas significativas con los cuadros de triquinelosis clásicos descritos. 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 A B Como conclusión del trabajo realizado, hay que indicar que la identificación de las especies de Trichinella mediante RAPD ha puesto de manifiesto la importancia potencial de T. britovi en la salud pública de nuestro país, ya que dicha especie puede alcanzar al hombre tanto a través de animales implicados en el ciclo doméstico del parásito como en el selvático. Además, hay que mencionar que con los estudios descritos se diagnosticó por primera vez a T. britovi como agente causal de la enfermedad en el hombre en nuestro país, pues previamente se había detectado en otros de la Cuenca Mediterránea 32. Para terminar, se debe enfatizar en las propiedades de especificidad, sensibilidad, simplicidad y rapidez de la técnica RAPD desarrollada, principalmente con ADN crudo. Bibliografía 1. Reingold A.L. (1998). Outbreak investigations: A perspective. Emerging 4: 2. Desjeux, J. P. & UNAIDS. (1998). Leishmania and HIV in Gridlock. WHO/CTD/LEISH/98.9 Add. I, UNAIDS/98.23. World Health Organization, Geneva, Switzerland. 3. Alvar, J., Cañavate, C., Gutiérrez-Solar, B., Jiménez, M. I., Laguna, F., López-Vélez, R., Molina, R., & Moreno, J. (1997). Leishmania and Human Immunodeficiency Virus coinfection: first 10 years. Clin. Microb. Rev., 10: 298-319. 4. Dedet, J. P. & Pratlog, F. (2000). Leishmania, Trypanosoma and monoxenous trypanosomatids as emerging agents. J. Eukaryot. Microbiol., 47: 37-39. 5. Morales, M. A., Chicharro, C., Cañavate, C., Ares, M., Barker, D. C., & Alvar, J. (2001). Molecular tracking of infections by Leishmania infantum. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 95: 104-107. 6. Andersen, K., Ibrahim, M. E., Theander, T. G. & Kharazmi, A. (1996). Random amplified polymorphic DNA for the differentiation of Leishmania donovani isolated from Sudan. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 90: 204-205. 7. Cupolillo, E., Grimaldi, G., Momen, H. & Beverly, S. M. (1995). Intergenic region typing (IRT): a rapid molecular approach to the charazterization and evolution of Leishmania. Mol. Biochem. Parasitol., 73: 145-155. 8. Chicharro, C., Sirera, G., Ares, M., Sans, A., Videla, S. & Alvar, J. (1999). Is Leishmania infantum zymodeme MON-253 involved in an outbreak among intravenous drug users?. Trans. R. Soc. Med. Trop. Hyg., 90: 434-435 9. Montelius, S.,Maasho, K., Pratlong, F., Lebbad, M., Gregory, L. & Akuffo, H. et al. (1998). Skin rash for 15 years. Lancet, 352: 1438. 10. Alvar, J., Gutiérrez-Solar, B., Pachón, I., Calbacho, E., Ramírez, M., Vallés, R., Guillén, J. L., Cañavate, C. & Amela, C. (1996). AIDS and Leishmania infantum. New approachees for a new epidemiological problem. Clin. Dermatol., 14: 541-546. 11. World Health Organization. (1996) Week. Epidemiol. Rec., 71: 41-48.

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Recent advances in the immunodiagnosis of schistosomiasis and fascioliasis George V. Hillyer, Ph.D. Professor of Pathology & Laboratory Medicine, Adjuncto Professor of Biochemistry,

University of Puerto Rico School of Medicine, San Juan, P. R. 00936-5067; and Chancellor UPR Rio Piedras Campus 00931. ghillyer@rcm.upr.edu General Comments Diagnosis of trematode infections including schistosomes and Fasciola by stool or (in the case of S. haematobium) urine are specific; however, their sensitivity is poor, labor intensive, and, moreover, useless during prepatent periods at which time the patients may present clinical symptoms. Thus sensitive and specific immunodiagnostic tests are an attractive adjunct to define infection status. This review will summarize the experience of the author in the application of immunodiagnostic assays for detection of infection and as a seroepidemiologic tool for research on the status of infection with S. mansoni or F. hepatica. Immune diagnosis of other schistosome species or F. gigantica are reviewed by others authors 1,2,3. Schistosomiasis Traditional diagnosis of human schistosomiasis has been based on the detection of parasite eggs in stool or urine. However, the sensitivity of coprological examination is highly limited by the sporadic fecundity of the adult worms and the low rate of recovery of parasitic ova from patient samples. Therefore, patient management based solely on the presence of ova is overly conservative and may result in patients with low egg counts being undiagnosed and able to continue to transmit infection. Antibody assays, of which there are many, with the proper antigens, are highly specific and sensitive 2. At the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) in Atlanta, Georgia the algorithm for schistosomiasis immunodiagnosis is to screen by FAST-ELISA and, those positive, confirm by Western Blot (EITB). The FAST-ELISA and confirmatory EITB both derive their sensitivity and specificity from microsomal antigens of adult worms. The microsomal antigens from the adult worms of all three main human Schistosoma spp. contain large amounts of specific components and minimal quantities of nonspecific or irrelevant materials. Thus, the specific activity of these reagents is high. In the case of S. mansoni microsomal antigens, they are specific in that they do not cross-react with a wide variety of protozoan, cestode, and trematode infections, including fascioliasis. It should be noted that highresolution confirmatory assays, especially immunoblot-based assays are generally difficult and expensive 1,2. This is why screening with an inexpensive, high throughput, rapid, simple assay such as FAST-ELISA followed by confirmation of all positives by the identification of diagnostic bands by EITB is efficacious. This approach was originally proposed by Tsang in 1983 4 for immunodiagnosis of parasitic diseases but ignored by parasitologists. The virologists immediately found its power and implemented it. This approach has for years been used in HIV-1 antibody testing. The FAST-ELISA is a quantitative immunoassay that measures antibody concentration in units ranging from 0 to 2,000. Samples that yield 10 or more units in this assay are considered positive. This assay for the detection of S. mansoni-specific antibodies has been shown to have a sensitivity of 98 % and a specificity of 99 %. All FAST-ELISA-positive samples are then subjected to confirmation by a Western immunoblot test in which the presence of a species-specific glycoprotein 30 kDa antigen band is considered diagnostic. This assay has a combined sensitivity and specificity of 99 % 1,2,3. In Puerto Rico, physicians have historically requested a circumoval precipitin (COP) test. This test is done by incubating serum with schistosome eggs and examining the eggs several days later for the development of precipitations emanating from pores in the eggs. The COP test was exhaustively evaluated as a seroepidemiologic tool and found to have a sensitivity of 95 % and specificity of 96 %. It is so sensitive that it detects 80 % + of patient samples excreting less than one egg per gram feces 5. The COP test is an inexpensive, low tech, and excellent method for use in areas of high endemicity where technicians will repeatedly find positive sample slides. But in areas of low or fleeting endemicity it is time consuming, exhausting, and with the many negative results some positives may be missed entirely since it is a subjective reading. Thus the choice of diagnostic tests and sample acquisition methods for human schistosomiasis in areas of low prevalence and infrequent transmission represents a special challenge. It appears that Puerto Rico has become such a place. In areas such as Puerto Rico where only a few persons harbor low numbers of parasites and have low transmission rates, the lack of sensitivity in coprological tests that are dependent on egg detection will be detrimental to estimates of infection status. For example in the last 7 years of the XXth century, of around 5,000-6,000 yearly stool examinations at the Puerto Rico Medical Center, only single digit (in fact 3 or less) positive cases for S. mansoni 6. On the other hand, in the first

systematic, island-wide survey for schistosomiasis in Puerto Rico conducted in 40 years using 2,955 Red Cross blood donors revealed 10.56 % positive by EITB confirmatory assay. Seventeen of 76 municipalities accounted for 48 % of seropositive samples. The results suggested that in Puerto Rico schistosomiasis was being transmitted in focal fashion for the previous 20 years 7. A second study focusing on the under 25 year old group comprising 766 individuals two-thirds of which were from the 10 municipalities with the highest and one-third from the 10 municipalities with the lowest seroprevalence rates in the previous study. In this study overall confirmation by EITB was only 1.8 %, as compared with 10.56 % in the previous study. Importantly, when seropositivity was measured in 5 year increments, a clear age-specific decrease in seropositivity was observed; viz. 4.7 % (21-25 years old), 2.6 % (16-20), 1.2 % (11-15), 0.7 % 6-10), and 0 % (1-5). Regarding high prevalence municipalities, only 4 of 10 had confirmatory EITB positive samples for 1 %; in the low prevalence municipalities only single positive cases were seen in 3 of them. These results support the probability that there has been little transmission of S. mansoni in Puerto Rico during the first half of the 1990s and confirm the anecdotal comments of physicians who state that they have not seen new infections during the last half of the XXth century 8. A third study of ours shows a continuous decline of human samples for serodiagnostic testing indicating a lack of need. Moreover, we found that patients with positive serum samples as reported by us were subsequently treated with praziquantel, thereby diminishing the infection pool from the island 6. It was serodiagnostic testing that made it possible to evaluate the status of schistosomiasis in Puerto Rico. Our approach can also serve as a model for others in countries with similar low intensity, low prevalence rates. It should be stated that there are numerous antigen/test systems for the immune diagnosis of schistosomiasis. But they vary and are, in general, lower in sensitivity and specificity than those reported for the microsomal antigens delineated above. Currently, there are no molecular cloning-derived recombinant antigens with high sensitivity or specificity for the immune diagnosis of schistosomiasis. Fascioliasis Fascioliasis, a disease of ruminants found world-wide, is now being recognized as an important human disease. In the mountains of Bolivia, Peru, and Ecuador it is of high endemicity in the human population; in Egypt it is supplanting schistosomiasis as the new human disease problem. In humans, clinical manifestations appear early in infection, and long before parasitologic diagnosis is possible. For example, symptoms in humans that include fever, abdominal pain, and eosinophilia are variable in their time of appearance, usually within 3-6 weeks of infection. On the other hand, the parasite prepatent period from the time of ingestion of the metacercariae to the time of appearance of eggs in feces may take 4 months or longer. Moreover, eggs are often absent or in low numbers in feces once the infections have become patent. In addition, acute fascioliasis can be confounded with other diseases, and chronic fascioliasis can be missed entirely due to lack of specific symptoms. Thus serologic procedures are important to help define infection as an adjunct to clinical findings. Serology is especially important in areas of the world where human fascioliasis is rare. Serodiagnosis is also useful in epidemiological studies to map the presence of human and animal infections 3,9. Over the past 20 years the overwhelmingly favorite antibody detection immunodiagnostic assay for fascioliasis has been an ELISA, usually using an excretion-secretion (FhES) antigen As in the case for schistosomiasis, above, for the immune diagnosis of individual patient samples, we screen by FASTELISA and confirm by Western Blot 3,10. Antibody detection assays are overwhelmingly the preferred method for immune diagnosis of fascioliasis because of their relative simplicity and early seroconversion (usually by 1-2 weeks of infection) during primary infections as compared to a much later patency of months duration. Antibody levels in infected mice, rabbits, sheep, and cattle can be detected by 1-2 weeks of infection, rising rapidly and reaching a plateau by 3-6 weeks of infection 11. Usually, patient samples requested for ELISA serology tend to have high antibody levels and titrate slowly by dilution with our positive control. Antibody levels decrease slowly after successful chemotherapy 12. Western immunoblot is technically more challenging and costly. It can also be confusing with different laboratories reporting different molecular weights based on their own standards. Regarding Western blot, and since our original 1988 article, many have reported similar banding patterns as those reported by us; they also have reported a myriad of additional potential diagnostic bands. For example, in our first study the 17kDa band appeared to disappear rather rapidly after successful chemotherapy. A 63

kDa band appeared in all positive patient samples. Many investigators report immuodiagnostic bands in the 25-30 kDa regions. That they may exist there is quite probable; but there are also other proteins in this region that cross-react with other trematodes (i.e. schistosomes) which include the glutathione Stransferases and many proteases. Moreover, in some laboratories, normal serum can reveal non-specific banding patterns in this region. Thus in the case of the use of Western blot for fascioliasis, contrary to schistosome infections where diagnostic bands are clearly seen, recombinant proteins may bode well for the future of fascioliasis immunodiagnosis. Recently, several recombinant antigens with potentially high sensitivity and specificity have been evaluated. One is a recombinant cathepsin L1 cysteine protease that showed excellent sensitivity and specificity and was similar in activity to purified cathepsin L1 when used to detect human fascioliasis in individuals from a village in the northern Altiplano of Bolivia 13. Cornelissen, et al. (1999)14 took it one step further and synthesiezed predicted B-cell epitopes of cathepsin L1 finding the peptide ELISA to have a sensitivity of 98.9 % and specificity of 99.8 %, in this study higher than the purified protein itself. Lastly, we have found a recombinant polypeptide with high homology to F. hepatica T1 bodies which detected Fasciola infections in mice by 2 weeks of infection and did not cross-react with serum from mice with S. mansoni (Toledo, Rodriguez, and Hillyer, 2000, unpublished). Lastly, antigen detection systems for the identification of circulating antigen in serum or feces have also been shown to have high sensitivity and specificity, although costs are higher than antibody detection systems. Moreover, in the case of herds, stool samples may be done on a portion of a herd and husbandry practices will be decided based upon egg detection methods. However, regarding antigen detection methods two interesting monoclonal antibodies used for antigen detection in feces have been reported from Cuba by Espino, Finlay, Doumenigo and others 15,16, and from Louisiana by El Bahi and Malone, this last one being patented [No. 5,338,660, Aug. 16, 1994]. There is approximately 10-fold more antigen in feces than that observed in serum making fecal antigen detection more sensitive. For protocols on ELISA for antigen detection in serum, see Hillyer (1997) 10 and Espino, et al., (2000) 15. Although antigen detection systems convert at approximately the same time intervals as antibody based systems, they have the advantage of reverting to negative more rapidly after successful chemotherapy. References 1. Tsang, V.C.W., and Wilkins, P.P. 1991. Immunodignosis of schistosomiasis. Screen with FASTELISA and confirm with immunoblot. Clin. Lab. Med., 11: 1029-1039. 2. Tsang, V.C.W., and Wilkins, P.P. 1997. Immunodiagnosis of schistosomiasis. Immunol. Invest., 26: 175-188. 3. Hillyer, G.V. 1999. Immunodiagnosis of human and animal fasciolosis. In: Dalton, J.P., Ed. Fasciolosis. 13: 435-447. CABI Publ. 4. Tsang, V.C.W., Peralta, J.M., Simons, A.R. 1983. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques (EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Methods Enzymol, 92: 377-391. 5. Hillyer, G.V., Ruiz Tiben, E., Knight, W.B., Gomez de Rios, I., Pelley, R.P. 1979. Immunodiagnosis of infection with Schistosoma mansoni. Comparison of ELISA, radioimmunoassay, and precipitation tests performed with antigens from eggs. Am. J. Trop. Med. Hyg., 28: 661-669. 6. Hillyer, G.V., Soler de Galanes, M. 1999. Seroepidemiology of schistosomiasis in Puerto Rico: Evidence for vanishing endemicity. Am. J. Trop. Med. Hyg., 60: 827-830. 7. Tsang, V.C.W., Hillyer, G.V., Noh, J., Vivas-Gonzalez, B., Ahn, L.H., Pilcher, J.B., Hightower, A.W., Deseda, C., Felciano de melecio, C. 1997. Geographic clustering and seroprevalence of schistosomiasis in Puerto Rico (1995). Am. J. Trop. Med. Hyg., 56: 107-112. 8. Hillyer, G.V., Tsang, V.C.W., Vivas-Gonzalez, B.E., Noh, J., Ahn, L., Vorndam, V. 1999. Agespecific decrease in seroprevalence of schistosomiasis in Puerto Rico. Am. J. Trop. Med. Hyg., 60: 313-318. 9. Hillyer, G.V. 1998. Improved diagnosis in human fascioliasis. In: Angelico, M., Rocchi, G., Eds. Infectious Diseases and Public Health. A Research and Clinical Update. Pp. 314-324. Balaban Publ., Phila. 10. Hillyer, G.V. 1997. Immune diagnosis of fasciolosis. In: Boray, J.C., Ed. Immunology, Pathobiology and Control of Fasciolosis. Pp. 11-20. MSD AGVET. 11. Hillyer, G.V., Soler de Galanes, M. 1991. Initial feasibility studies of the FAST-ELISA for the

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