Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells

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Nanotechnology, Biology, and Medicinenanomedicine

K.T. Thurn, H. Arora, T. Paunesku, A. Wu, E.M.B. Brown, C. Doty, J. Kremer,

G. Woloschak, page 123.

April 2011

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Nanotechnology, Biology, and Medicine

Volume 7, Issue 2 • April 2011

nanomedicine

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Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cellsKenneth T. Thurn, Hans Arora, Tatjana Paunesku, Aiguo Wu, Eric M.B. Brown,

Caroline Doty, Jeff Kremer, Gayle WoloschakNanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, April 2011, Volume 7, Number 2, Pages 123–130.

DOI:10.1016/j.nano.2010.09.004

ABOUT THE COVERUptake of TiO2-alizarin red S nanoparticles by prostate cancer cells expressing green fluorescent protein is mediated throughevery major endocytic mechanism.

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Min Wu, MD, PhDGrand Forks, ND

Yuliang Zhao, PhDBeijing, China

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nanomedicine

4A

FEATURE ARTICLE

Oncology, Cell Biology, Interaction of NPs With Cells, Mechanisms of Uptake, TiO2

Endocytosis of Titanium Dioxide Nanoparticles in Prostate Cancer PC-3M Cells 123K.T. Thurn, H. Arora, T. Paunesku, et al.

SHORT COMMUNICATION

Cell Biology, Regenerative Medicine, Hydrogels, Electrospun Nanofibers, Layer-by-Layer Assembly

Portable Nanofiber Meshes Dictate Cell Orientation Throughout Three-Dimensional Hydrogels 131Y. Yang, I. Wimpenny, M. Ahearne

RESEARCH ARTICLES

General Medicine, Theory and Modeling, Photothermal Therapy, Cell Ablation, Laser-Nanoparticle Interaction Modes

Modeling Nanophotothermal Therapy: Kinetics of Thermal Ablation of Healthy and Cancerous Cell Organelles and Gold Nanoparticles 137R.R. Letfullin, C.B. Iversen, T.F. George

Cell Biology, Protein Folding, AFM Force Spectroscopy

Nanoprobing of α-Synuclein Misfolding and Aggregation With Atomic Force Microscopy 146J. Yu, J. Warnke, Y.L. Lyubchenko

Pharmacology, Drug Delivery Systems, Lymphatic Systems, Macrophages, Multicompartment Niosomes

Multicompartment Vectors as Novel Drug Delivery Systems: Selective Activation of Tγδ Lymphocytes After Zoledronic Acid Delivery 153C. Agrati, C. Marianecci, S. Sennato, et al.

Pharmacology, Formulation, Cell Biology, Interaction of NPs With Cells

Curcumin Nanodisks: Formulation and Characterization 162M. Ghosh, A.T.K. Singh, W. Xu, et al.

Pharmacology, Drug Delivery Systems, Streptococcus, Intranasal Vaccine, Dendritic Polymers

Self-Adjuvanting Polyacrylic Nanoparticulate Delivery System for Group A Streptococcus (GAS) Vaccine 168M. Zaman, M. Skwarczynski, J.M. Malcolm, et al.

Pharmacology, Targeted Drug Delivery, Gene Transfection, Soluble Chitosan

Succinated Chitosan as a Gene Carrier for Improved Chitosan Solubility and Gene Transfection 174E.K.-W. Toh, H.-Y. Chen, Y.-L. Lo, et al.

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nanomedicine

5A

Oncology, Toxicology, Antimicrobial Agents, ROS Generation, Apoptosis, Zinc Oxide

Selective Toxicity of ZnO Nanoparticles Toward Gram-Positive Bacteria and Cancer Cells by Apoptosis Through Lipid Peroxidation 184M. Premanathan, K. Karthikeyan, K. Jeyasubramanian, et al.

Oncology, Targeted Therapy, Recombinant Gene Therapy

HSV-TK/GCV Cancer Suicide Gene Therapy by a Designed Recombinant Multifunctional Vector 193Yuhua. Wang, B.F. Canine, A. Hatefi

Oncology, Pharmacology, Targeted Drug Delivery, Dendritic Block Copolymer, Paclitaxel

Highly Stable, Ligand-Clustered “patchy” Micelle Nanocarriers for Systemic Tumor Targeting 201Z. Poon, J.A. Lee, S. Huang, et al.

Therapeutics, Gene Transfection, DNA and siRNA Complex Formation, Correlation With PEI Properties

Comparative Structural and Functional Studies of Nanoparticle Formulations for DNA and siRNA Delivery 210A. Kwok and S.L. Hart

Musculoskeletal System, Reconstructive Orthopedics, Bone Formation, Laser, Nano-Scale Topography

Bone Response to Laser-Induced Micro- and Nano-Size Titanium Surface Features 220R. Brånemark, L. Emanuelsson, A. Palmquist, et al.

Diagnostic Imaging, Photoacoustic Contrast Agents, PLGA NPs, Near-IR, Nd:YAG Laser

Preparation and Biological Evaluation of Multifunctional PLGA-Nanoparticles Designed for Photoacoustic Imaging 228Y. Kohl, C. Kaiser, W. Bost, et al.

Dermatology, Sebaceous Glands, Acne, Oxidative Stress, Fullerene

Improvement of Acne Vulgaris by Topical Fullerene Application: Unique Impact on Skin Care 238S. Inui, H. Aoshima, A. Nishiyama, et al.

Ophthalmology, Drug Delivery, Antifungal Drugs, Amphotericin B/Eudragit NPs

Nanosuspension: A New Vehicle for the Improvement of the Delivery of Drugs to the Ocular Surface. Application to Amphotericin B 242S. Das, P.K. Suresh

POTENTIAL CLINICAL RELEVANCE

Feature A

Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 7 (2011) 123–130

Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostatecancer PC-3M cells

Kenneth T. Thurn, PhDa, Hans Arora, BSa, Tatjana Paunesku, PhDa, Aiguo Wu, PhDb,Eric M.B. Brown, PhDc, Caroline Doty, BSa, Jeff Kremer, BSa, Gayle Woloschak, PhDd,⁎

aDepartment of Radiation Oncology, Northwestern University, Feinberg School of Medicine, Chicago, Illinois, USAbDivision of Functional Materials and Nanodevices, Ningbo Institute of Material Technology and Engineering,

Chinese Academy of Sciences, Ningbo City, Zheijang Province, ChinacDepartment of Biological Sciences, University of Wisconsin–Whitewater, Whitewater, Wisconsin, USA

dDepartments of Radiation Oncology, Radiology, and Cell and Molecular Biology, Northwestern University,Feinberg School of Medicine, Chicago, Illinois, USA

Received 28 January 2010; accepted 10 September 2010

rticlewww.nanomedjournal.com

Abstract

Nanotechnology has introduced many exciting new tools for the treatment of human diseases. One of the obstacles in its application tothat end is the lack of a fundamental understanding of the interaction that occurs between nanoparticles and living cells. This report describesthe quantitative analysis of the kinetics and endocytic pathways involved in the uptake of anatase titanium dioxide (TiO2) nanoparticles intoprostate cancer PC-3M cells. The experiments were performed with TiO2 nanoconjugates: 6-nm nanoparticles with surface-conjugatedfluorescent Alizarin Red S. Results obtained by flow cytometry, fluorescence microscopy, and inductively coupled plasma–massspectrometry confirmed a complex nanoparticle-cell interaction involving a variety of endocytic mechanisms. The results demonstrated that atemperature, concentration, and time-dependent internalization of the TiO2 nanoparticles and nanoconjugates occurred via clathrin-mediatedendocytosis, caveolin-mediated endocytosis, and macropinocytosis.

From the Clinical Editor: The interaction and uptake of TiO2 nanoparticles (6-nm) with prostate PC-3M cells was investigated and found toundergo temperature, time, and concentration dependent intracellular transport that was mediated through clathrin pits, caveolae, andmacropinocytosis. These results suggest that nanoparticles may widely permeate through tissues and enter almost any active cell through avariety of biological mechanisms, posing both interesting opportunity and possible challenges for systemic use.© 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.

Key words: Anatase; TiO2; Nanoconjugate; Endocytosis; Alizarin Red S

The photocatalytic properties of titanium dioxide (TiO2) haveled to extensive research into its potential uses as a disinfectant,antibiotic, biological sensor, tumor cell–killing agent, and gene-targeting device.1-9 Bulk forms of TiO2 are generally biologicallyand chemically inert3,10-14; however, the surface of TiO2

nanoparticles smaller than 20 nm is reactive because of surfacedefects and readily binds enediol bidentate ligands includingdopamine, ascorbic acid, alizarin, and Alizarin Red S (ARS).15-17

Here we take advantage of earlier work by our group demons-

This work was supported by National Institutes of Health grantsCA107467, EB002100, P50 CA89018, and U54CA119341 (G.W.).

No conflict of interest was reported by the authors of this article.⁎Corresponding author: Departments of Radiation Oncology, Radiology,

and Cell and Molecular Biology, Northwestern University, Feinberg Schoolof Medicine, 303 E Chicago Ave, Chicago, Illinois 60611, USA.

E-mail address: [email protected] (G. Woloschak).

1549-9634/$ – see front matter © 2011 Elsevier Inc. All rights reserved.doi:10.1016/j.nano.2010.09.004

Please cite this article as: K.T., Thurn, et al, Endocytosis of titanium diox2011;7:123-130, doi:10.1016/j.nano.2010.09.004

trating a stable covalent bond between TiO2 nanoparticles smallerthan 20 nm and fluorescent ARSmolecules.15 In this work, TiO2-ARS nanoconjugates have been shown to be resistant tointracellular milieu for more than 12 hours, well beyond thetime points used in experiments described here.15 Therefore,conjugation of ARS permits us to “dissect” nanoconjugate uptakein living cells using confocal microscopy and flow cytometry.

There are three main types of endocytosis in nonphagocyticcells: clathrin-mediated endocytosis (CME), caveolin-mediatedendocytosis (Cav-Me), and macropinocytosis. There also existminor forms of endocytosis (e.g., dynamin-dependent clathrin-independent, and dynamin- and clathrin-independent endocyto-sis) that have not yet been fully elucidated.18-20 Endocyticpathways can be inhibited with various pharmacological agents,dominant negative proteins, and cellular treatments. Clathrin-coated vesicles can be reduced nearly 80% by potassiumdepletion.21 CME and Cav-Me can be inhibited by dominant-

ide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells. Nanomedicine: NBM

http://dx.doi.org/10.1016/j.nano.2010.09.004




mailto:[email protected]



Figure 1. Concentration- and competitor-dependent uptake of TiO2-ARSnanoconjugates. (A) Serum-starved PC-3M cells were treated with a rangeof concentrations of fluorescently labeled nanoconjugates (0–200 nM).After 1 hour, the cells were washed to minimize surface-boundnanoparticles and analyzed by flow cytometry. There was a statisticallysignificant increase in signal for cells treated with 50 nM nanoparticles(4 ng/mL) compared to lower nanoparticle concentrations (⁎P b 0.001)(n = 3). There was also a significant difference in uptake between cellstreated with 50 and 200 nM (‡P b 0.05). (B) GFP-expressing cells weretreated with 50 nM of TiO2-ARS nanoconjugates alone (left) or incombination with a 135-fold excess of unlabeled nanoparticles (6.7 μM)(right). Because of the significance of surface-bound nanoparticles for thisexperiment, neither cell sample was washed in glycine. Cells were fixed in4% paraformaldehyde and imaged by laser-scanning confocal microscopy.Cytoplasm and nucleus were both filled with GFP (green), while TiO2-ARS nanoparticles (maroon) could be seen only in the absence of TiO2

nanoparticle competition.

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negative mutant forms of dynamin-1 (K44A), because thisprotein is involved in the budding off of vesicles in both types ofendocytosis.22 Cav-Me can also be inhibited by treatment withmicromolar concentrations of the tyrosine kinase inhibitor,genistein.23 Macropinocytosis is an actin-dependent mechanism,and treatment with the actin polymerization inhibitor cytocha-lasin D is often used to repress this process. Because actin isinvolved in most major endocytic processes,24,25 treatment withthe amiloride derivative, 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride(EIPA) is considered to provide more specific inhibition ofmacropinocytosis. Amiloride and EIPA are Na+/H+ exchangeinhibitors that reduce macropinocytosis at millimolar ormicromolar concentrations, respectively.26

The endocytosis of nanoparticles depends on the size, shape,and charge of the nanoparticles, and also on the cell typetreated22,27-30 (reviewed in Thurn et al31). Although TiO2 has beenstudied for nearly three decades, the endocytic pathways involvedin its uptake have yet to be fully discerned, possibly because thereexist different crystal forms of this oxide and so many TiO2nanoparticle shapes and sizes. For example, qultrafineq TiO2 wasfound in clathrin-coated vesicles of lung epithelial cells by electronmicroscopy.32 Our group focuses on work with nanoparticlessmaller than 20 nm, especially those that are directly labeled withfluorescent ARS.15 Previous work had established that (i) TiO2-ARS nanoconjugates emit detectable fluorescence that can beanalyzed by both confocal fluorescent microscopy and flowcytometry; (ii) a sample preparation procedure that removessurface-adsorbed nanoconjugates allows both single-cell and cellpopulation analyses; (iii) nanoconjugates were stable in culturedanimal cells, including the PC-3M cells; and (iv) the minimalnumber of nanoconjugates to obtain a confocal fluorescent signalis about 104. 15 Here we expand upon those results to utilizefluorescence microscopy and flow cytometry to characterize theuptake of TiO2-ARS nanoconjugates in PC-3M cells. This uptakeis temperature-, time-, and concentration-dependent, whereascompetition experiments with excess unlabeled nanoparticlesrevealed dependence on available membrane-binding sites. Allthree of the major endocytic pathways were involved in thenanoconjugate uptake: CME, Cav-Me, and macropinocytosis.These experiments were repeated with the unlabeled nanoparticlesand quantified by inductively coupled plasma–mass spectroscopy(ICP-MS) to verify that the results were not dependent upon theARS conjugation.

Methods

Nanoparticle synthesis and nanoconjugate preparation

Nanoconjugates were prepared from the same batch ofnanoparticles that were synthesized, characterized, and used inour earlier work,15,33 employing the same approach that wasdescribed there. In short, TiO2 nanoparticles with an averagediameter of 6 nm (nanoparticle dispersity 21%) were synthe-sized by low-temperature alkaline hydrolysis route as describedpreviously,1 and were dialyzed and stored at 4°C in 10 mMNa2HPO4 buffer pH = 6.5. The molarity of nanoparticles was 10μM, hence their surface was calculated at 6.9 mM potentialbinding sites. ARS was conjugated to the nanoparticle surface

before each experiment as described previously,15 by incubatingbare nanoparticles with ARS in appropriate molar ratio to cover44% of the nanoparticles’ surface-binding sites with ARS. As anexample, 1 mL of 10 μM nanoparticles was mixed with 0.864mL of 8 mM ARS; the resultant solution was 0.563 μM withrespect to nanoparticles. Subsequently, the nanoparticle solutionwas further diluted to concentrations indicated in each specificcase. Ultraviolet-visible light spectroscopy (using NanodropND-1000 Spectrophotometer; NanoDrop Technologies Inc.,Wilmington, Delaware) for absorbances between 200 and 750nm showed a characteristic red shift in absorption peakidentified previously as unique to the nanoconjugates.15

Cell culture conditions

All cell culture reagents were purchased from Mediatech Inc.(Manassas, Virginia) unless otherwise specified. PC-3M meta-static prostate cancer cells with stable green fluorescent protein

125K.T. Thurn et al / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 7 (2011) 123–130

(GFP) expression were a gift from Dr. Raymond Bergan,Northwestern University34; these cells were used in our priorwork establishing intracellular stability of nanoconjugates.15 PC-3M cells were maintained at 37°C with 5% CO2 in RPMI 1640medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2mM L-glutamine, 10 mMHEPES, 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, and 0.15 mg/mL G418 sulfate. Beforenanoparticle treatments the cells were washed with phosphatebuffered saline solution (PBS) and placed in serum-free RPMI1640 medium for 1–2 hours. Next, the cells were treated withTiO2-ARS nanoparticles (0–200 nM), TiO2 nanoparticles (0–540 nM), or ARS alone (0–60 μM). After treatment cells werewashed with PBS, then in 200 mM glycine pH 4 (Sigma-Aldrich,St. Louis, Missouri), and two more times in PBS. The onlyexception to this washing protocol was the experiment describedin Figure 1, B, where only PBS washes were done.

Inhibition of endocytosis

For the temperature-dependent effects on uptake, cells werepre-incubated for 1 hour at either 4°C or 37°C before treatmentwith nanoparticles at the same temperatures. For potassiumdepletion, cells werewashed in an isotonic potassium-freemedium(140mMNaCl, 1 mMCaCl2, 1 mMMgCl, 5.5 mMD-Glucose, 20mM HEPES), then placed in a hypotonic solution (1:1 mixture ofwater and isotonic potassium free-medium) for 10 minutes. Next,the cells were washed and incubated for 30 minutes in the isotonicpotassium-free medium. Finally, cells were treated with nanocon-jugates or a positive control marker, 50 μg/mL of Transferrin-Alexa Fluor 633 (Invitrogen, Carlsbad, California). As a control,cells were treated with the same solutions supplemented with 20μM KCl. Endocytosis inhibitors EIPA and genistein wereincubated with cells for 1 hour before treatment with markers ornanoparticles. For macropinocytosis inhibition, cells were treatedwith 60 μM of EIPA before nanoconjugate or dextran treatment.To inhibit Cav-Me, cells were treated with 100 μM of genisteinbefore nanoconjugate or BODIPY-FL C5-lactosylceramide(LacCer) treatment. BODIPY-LacCer, a fluorescent sphingolipidanalogue, was added to cells at 4°C and incubated for 30 minutes.Then the cells were placed at 37°C to allow endocytosis. After 1hour, cells were washed four times for 10 minutes in RPMI 1640medium supplemented with 5% defatted bovine serum albumin(Sigma-Aldrich); 2 μMBODIPY-LacCer (Invitrogen) served as apositive control for Cav-Me. In experiments with EIPA, themarker for macropinocytosis was 250 μg/mL of Dextran-AlexaFluor 647 (10,000 MW; Invitrogen).

Flow cytometry and cell sorting

PC-3M cells for flow cytometry were grown until approxi-mately 30–40% confluent. After treatment and washing, cellswere trypsinized, collected in FBS-supplemented medium, andbrought to a single-cell suspension. Samples were analyzed orsorted at the Northwestern University Flow Cytometry CoreFacility of the Robert H. Lurie Cancer Center on the BeckmanCoulter MoFlo Flow Cytometer (Brea, California). TiO2-ARSnanoconjugates were excited by a 543-nm laser. Positive controlsfor CME, macropinocytosis, and Cav-Me: Transferrin-AlexaFluor 633; Dextran-Alexa Fluor 647, and BODIPY-LacCer were

excited by a 630-nm laser. In all cases fluorescence wasquantified by the number of cells that emitted above the levelof autofluorescence in control cells. Analysis was performedusing the FCS Express V3 program (De Novo Software, LosAngeles, California). Cell debris was excluded based on theforward-and side-scatter characteristics of the cell populations.

Confocal microscopy

For confocal microscopy cells were cultured on glass cover-slips. After treatment and washes the cells were fixed in 4%paraformaldehyde, stained with Hoechst 33343 (Invitrogen), andmounted onto slides in mounting medium (9 mM p-phenylene-diamine, 10 mM Tris pH 8, 70% glycerol). Samples werevisualized using the LSM 510 UV Meta Microscope (Carl Zeiss,Inc., Maple Grove, Minnesota) at the Northwestern UniversityCell ImagingFacility. Lasers of 405nm, 488nm, and 543nmwereused with band-pass filters of 420–480 nm, 505–530 nm, and560–615 nm, respectively.

Inductively coupled plasma–mass spectroscopy

Cells were treated as described above, with uncoated TiO2

nanoparticles. After washing, cells were collected by scraping,centrifuged at 5000 g for 5 minutes, and washed in 3% nitric acid(HNO3). The samples were then incubated at 65°C in HNO3

overnight. Several dilutions were done to bring the titaniumatoms to within a range of 0–50 parts per billion (ppb), for whichwe prepared a titanium standard curve. All samples and standardsincluded internal standards of 3 ppb of indium. Samples were runwith the SC-2 Autosampler (Elemental Scientific Inc., Omaha,Nebraska) and analyzed by the X-Series II ICP-MS (ThermoScientific, Waltham, Massachusetts) at the Northwestern Uni-versity Quantitative Bioelemental Imaging Center.

Statistical analysis

Data were analyzed using the GraphPad InStat 3 software(GraphPad Software Inc., La Jolla, California). Unpaired two-tailed P value t-tests were performed to compare the percentagesof fluorescent cells, or the mean fluorescence intensities(arbitrary units) of the cell populations (n ≥ 3). P values lessthan 0.05 were considered significant.

Results

PC-3M prostate cancer cells were treated with 0–200 nM (0–16 ng/mL) of 6 nm TiO2-ARS nanoconjugates for 1 hour, aloneor in the presence of “competitor” nonlabeled TiO2 nanoparti-cles. About 44% of the nanoparticle surface titanium atoms wereconjugated to ARS molecules, using the procedure describedpreviously.15 Coating of the nanoparticles with ARS permittedfluorescent detection of nanoconjugates, while treatment withARS alone did not result in appreciable intracellular fluorescenceas shown before.15 To decrease false-positive results fromnanoconjugates passively adhering to the cellular plasmamembrane, here and wherever it is not emphasized otherwise,the cells were washed with 200 mM acidic glycine (pH = 4) at theconclusion of each treatment.

Figure 2. Time-dependent uptake of TiO2-ARS nanoconjugates. (A) PC-3M cells were treated with 50 nM TiO2-ARS for 0–120 minutes before analysis by flowcytometry. A statistically significant uptake was obtained by 15 minutes (*P b 0.05), and the difference in uptake between cells treated for 15 and 120 minuteswas statistically significant as well (‡P b 0.01), but not the difference between cells treated for 60 and 120 minutes (P N 0.05) (n = 3). (B) Confocal microscopyimages of cells treated with 50 nM TiO2-ARS nanoconjugates (red) for the time points indicated. Blue (Hoechst dye) indicates position of the nucleus.


Results in Figure 1, A, demonstrate a concentration-dependent increase in fluorescence in cells treated with anincreased concentration of nanoconjugates. Approximately13% of the cell population treated with 10 nM of TiO2-ARSnanoconjugates emitted detectable fluorescence after 1 hour oftreatment, compared with over 50% of the cells treated with 50nM nanoconjugates (equal to 4 ng/mL of TiO2 in the medium).The nanoconjugate uptake reached saturation level at about100 nM under the conditions used (1 hour treatment). Insubsequent experiments a concentration of 50 nM TiO2-ARSwas used.

To produce the images in Figure 1, B, cells were treatedwith 50 nM TiO2-ARS nanoconjugates either alone or in thepresence of a 135-fold excess of unlabeled TiO2 nanoparticles.This concentration of unlabeled nanoparticles was selected asnontoxic, experimentally feasible, and likely to completelyoutcompete fluorescent nanoconjugates when monitored byconfocal microscopy. Moreover, we anticipated that evenpassive adherence of nanoconjugates to the cell surface wouldbe prevented in this case, and for that reason in this experimentalone we did not perform the glycine wash of the cells beforemicroscopy so as to preserve passive competitor nanoparticleinteractions. PC-3M cells stably expressing GFP (green) treatedwith TiO2-ARS nanoconjugates alone exhibited a strong ARSsignal (maroon) both within the cell in large cytoplasmicvesicles and on the cell surface. When these cells were treatedsimultaneously with the nanoconjugates and nonfluorescentnanoparticles, they showed no detectable fluorescence on thecell surface or within the cytoplasm. The morphology of the

cell was also altered at this treatment concentration (540 ng/mLof TiO2), with large vacuoles devoid of GFP within the cell,possibly filled with nanoparticles.

The effect of incubation time (0–120 minutes) on uptake wasalso investigated (Figure 2). TiO2-ARS fluorescence wasanalyzed by flow cytometry to quantify uptake as a percentageof the cell population that had internalized the nanoconjugates.Figure 2, A shows that after 5 minutes of treatment,approximately 8% of cells exhibited fluorescence, after 15minutes 25%, and at 1 hour nearly 50% of the cells. These resultswere verified with confocal microscopy (Figure 2, B). TiO2-ARSnanoconjugate aggregates were visible both on the cell surfaceand within the cells at 5 minutes of treatment, whereas at 60minutes large aggregates were found in perinuclear regions andthroughout the cytoplasm.

To investigate the effect of cellular metabolism on the uptakeof TiO2-ARS nanoconjugates, cells were incubated at 4°C beforeand during the treatment with nanoconjugates (Figure 3). PC-3Mcells were treated with 50 nM TiO2-ARS for 1 hour at either 4°Cor 37°C, and the fluorescence from TiO2-ARS was quantified byflow cytometry. Uptake at 37°C was robust and similar toprevious experiments (58%), but it was severely diminished incells treated at 4°C (10%) (Figure 3). When comparing untreatedcontrol cells (false-positive fluorescence at 1%) with cells treatedat 4°C (10%), there was a statistically significant increase incellular ARS (nanoconjugate)-associated fluorescence. Thissuggested that both metabolically dependent uptake andmetabolically independent adhesion of nanoconjugates to thecell surface occurred at the same time.

Figure 3. Effect of temperature on TiO2-ARS nanoconjugate internalization.PC-3M cells were treated with 50 nM fluorescent nanoconjugates (TiO2-ARS) at 37°C or 4°C. Subsequent analysis by flow cytometry showed asignificant decrease in fluorescence for cells treated at 4°C compared with37°C (*P b 0.0001). There was also a statistically significant difference influorescence between untreated cells and cells treated at the lower temperature(‡P b 0.05) (n = 6).

Figure 4. Effect of endocytosis inhibitors on TiO2-ARS nanoconjugateuptake. (A) Potassium depletion modulates clathrin-mediated endocytosis(CME). Control cells were supplemented with 20 μM potassium at all steps(+KCl). Fluorescent transferrin was used as a marker for CME. There was astatistically significant decrease in both TiO2-ARS (⁎P b 0.05) andtransferrin (‡P b 0.05)-associated fluorescence in cells depleted of potassium(n = 3). (B) The role of macropinocytosis in TiO2-ARS endocytosis wasevaluated by using cells pretreated with 60 μM EIPA. A statisticallysignificant decrease in the uptake of TiO2-ARS nanoconjugates and thefluorescently labeled macropinocytosis marker dextran-Alexa 647. Nano-conjugate uptake was diminished compared with control cells (⁎P b 0.05) aswell as dextran endocytosis (‡P b 0.05) (n = 3). (C) Caveolin-mediatedendocytosis (Cav-Me) was downregulated with 100 μM genistein.Fluorescence of TiO2-ARS-treated cells decreased (⁎0.1 b P b 0.05), aswell as uptake of BODIPY-LacCer, a marker of Cav-Me uptake (‡P b 0.05).


To evaluate the contribution of each of the three mainenergy-dependent pathways of nonphagocytic endocytosis onthe internalization of TiO2-ARS nanoconjugates, each mecha-nism was inhibited in turn (Figure 4). Before nanoconjugatetreatment, CME was abolished by depletion of cellularpotassium.35,36 Depleting cellular levels of potassium preventedinteraction between clathrin and adapter proteins at the cellmembrane that stabilize clathrin-coated pits.37 Fluorescentlylabeled transferrin (Alexa Fluor 633; Invitrogen) was used as apositive control for CME.18 After treatment, extracellulartransferrin was removed from the cell surface by treatmentwith pronase. Figure 4, A shows that cells devoid of potassium(–KCl) exhibited a statistically significant decrease in thenumber of cells that internalized transferrin and a significantreduction in cells displaying TiO2-ARS-associated fluorescence(54% and 53%, respectively).

In Figure 4, B, EIPA was used to inhibit macropinocytosis.Cells were pretreated with 60 μM EIPA before incubation withfluorescently labeled Dextran-Alexa 647 (Invitrogen), used as amarker of macropinocytosis. The uptake of dextran was inhibitedby EIPA by 40% (P b 0.05), whereas the reduction in thenanoconjugate uptake reached 54%.

Cav-Me (Figure 4, C) was inhibited by treatment of cells with100 μM genistein; BODIPY-LacCer, a fluorescent sphingolipidanalogue, was used as a positive control.38 Because of the partialoverlap between fluorescent emission spectra of BODIPY-LacCer and GFP, cells were analyzed not as a percentage ofcells that had internalized the sphingolipid, but instead based onthe cell population's mean fluorescence intensity. Untreated cellsand cells treated with BODIPY-LacCer at 4°C were used asnegative controls to determine the baseline fluorescence intensity.Cells pretreated with genistein showed a statistically significant34% decrease in BODIPY-associated fluorescence. Genisteintreatment also caused a decrease in TiO2-ARS fluorescence,though only marginally statistically significant (0.1 N P N 0.05).

All of the flow cytometry experiments were performed withTiO2-ARS nanoconjugates, therefore, to verify that this surface

Figure 5. Quantification of cell-associated titanium by ICP-MS. Cells weretreated with TiO2 nanoparticles after inhibition of specific endocyticpathways. (A) Cell treatment in KCl-free medium. Control cells weresupplemented with KCl at 37°C (TiO2 + KCl) or treated at 4°C (TiO2 4°C)(*P b 0.05) (n = 3). (B) Treatment with TiO2 nanoparticles in serum-freeRPMI 1640 medium alone, with EIPA, genistein, or at low temperature. NTcells were nanoparticle-free controls (*P b 0.05) (n = 3).


modification did not affect the cellular uptake pathways; totaltitanium content was directly quantified in cells treated withuncoated nanoparticles. ICP-MS was used for these experiments.Cells were treated with the same concentration of nanoparticles(50 nM), with or without inhibition of endocytic pathways.Inhibition was performed in the potassium-free mediumsupplemented or not with KCl to regulate CME (Figure 5, A),or in the presence of serum-free RPMI 1640 medium with orwithout the pharmacological agents targeting macropinocytosisor Cav-Me (Figure 5, B). After treatment, cells were extensivelywashed, collected, and resuspended in 3% HNO3 and incubatedovernight at 65°C. Finally, samples were analyzed by ICP-MS todetermine the level of titanium isotopes 47–49. Titanium-48 isthe most prevalent form of titanium and was used for analysis.

Cells treated at 4°C displayed a statistically significantdecrease in cell-associated titanium-48 as compared with cellstreated at physiological temperatures in either potassium-freemedium supplemented with KCl (52% reduction, Figure 5, A,P b 0.05) or RPMI 1640 medium (60% reduction, Figure 5, B;P b 0.05). This confirmed the dependence of TiO2 nanoparticleendocytosis on active metabolism.

The concentration of titanium was also reduced in each of thethree conditions that inhibit endocytic pathways. In cellsdepleted of KCl, titanium was reduced by 28% compared withKCl-supplemented cells (Figure 5, A). In samples in whichmacropinocytosis was inhibited by preincubation with EIPA(Figure 5, B), titanium-48 was decreased by 32% compared withcontrol cells. In the presence of genistein, cellular-associatedtitanium-48 was decreased by 28% compared with control cells.These trends determined by ICP-MS in cells treated withuncoated nanoparticles were similar to those observed by flowcytometry, where the extent of ARS fluorescence representednanoconjugate uptake (Figures 3 and 4).

Discussion

Despite the great variety of different nanoparticle forms ofTiO2 and the widespread actual and potential use of TiO2,relatively few studies have focused on the cellular uptake of TiO2

nanoparticles and nanoconjugates, as reviewed recently by Suhet al.39 It is very likely that this omission is a result of inherentdifficulties with identification of TiO2 by light microscopy.Unlike gold nanoparticles or carbon nanotubes that can beuniquely monitored by plasmon resonance or Raman spectros-copy, TiO2 is not associated with any unique detectiontechnique, is nonfluorescent, and has a low density, whichmakes it inconvenient for any other detection method than x-rayfluorescence. However, its surface defects allow for a stablecovalent surface modification with bidentate ligands—one ofthem is the fluorescent dye ARS.15 Here we used TiO2-ARSnanoconjugates to investigate endocytosis of TiO2 nanoparticles.

The form of endocytosis involved in nanoparticle uptake canbe expected to affect the nanoparticle's intracellular localizationand trafficking. Understanding endocytic mechanisms is vital forthe development of nanomaterials for clinical therapies. Thefrequent alterations in the endocytic pathways of variousmalignant cells make these studies especially significant,because targeting of specific pathways becomes feasible withrationally modified nanoparticles.20,40 In three closely relatedprostate cancer cell lines, for example, the difference inphenotypes led to dramatically different subcellular distributionand trafficking of 27-nm anionic quantum dots.41

The experiments described herein characterize the uptake of6-nm TiO2 nanoparticles and TiO2-ARS nanoconjugates in PC-3M cells. A quantitative flow cytometry approach, confocalmicroscopy, and ICP-MS were used to determine the cellularmechanisms and kinetics involved in TiO2 nanoparticleinternalization. In a competition experiment depicted in Figure1, B, the morphology of the cells treated with competitorparticles in addition to TiO2-ARS was altered, with largevacuoles possibly filled with nanoparticles. However, thecompetitor TiO2 nanoparticle concentration was 540 ng/mL ofTiO2, and in the absence of photoactivation, anatase TiO2

nanoparticles are considered to become toxic only at 10-foldhigher concentrations than the one used.39 In Figure 4, C, thedata obtained for inhibition of Cav-Me by genistein showed onlymarginal significance. This result is most likely the outcome ofthe fact that Cav-Me is not a prominent endocytosis mechanismin cells of PC-3 lineage41,42; hence the uptake that occurs in


parallel and independently of Cav-Me overpowers the results ofCav-Me inhibition. In Figure 5, B, inhibition of the uptakefollowing any of the three modes of inhibition shows a decreasebut low significance values due to large variation betweenexperiments. We expect that the cause may be that (at the timepoint investigated) no more than 50% of the cells take up thenanoparticles and the presence of many “empty” cells compli-cates interpretation of the data; most importantly, whenever onemechanism of uptake is inhibited, two active uptake mechanismsremain. When all three endocytic mechanisms were inhibited bylow-temperature exposure (Figure 5, A), inhibition resultsobtained by ICP-MS showed high statistical significance.

In summary, these studies revealed that nearly all of thenanoparticle (nanoconjugate)-cell uptake was metabolicallydependent, and each one of the major endocytic mechanismsin PC-3M cells can be utilized for uptake of nanoconjugates.This can be explained in part by the nanoconjugates’ size,which is smaller than any one of the vesicles formed duringendocytosis. Clathrin-coated vesicles have a general diameterof nearly 120 nm; caveosomes range between 50 and 80 nm,and macropinosomes are the largest and most “leaky” withdiameters from 500 to 2000 nm.18 Thus, it is possible fornanoconjugates to enter cells by any one of the possibleendocytic mechanisms. Although nanoparticle uptake wasmetabolically dependent, it was nonspecific in terms of aparticular endocytic mechanism. In such a case, the mostimportant mechanism of nanoparticle uptake would be the onemost prominent in the given cell type. In PC-3M cellsthe two primary endocytic mechanisms are CME andmacropinocytosis.41,42 This matches well with the two mostsignificant processes of nanoparticle and nanoconjugate uptakedetected through our work. Therefore, nontargeted uptake ofnanoparticles by cells is highly feasible, and allows that theretention and intracellular trafficking of nanoconjugatesbecome the mechanisms that ultimately dictate nanoconjugatequantity in cells.

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Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells

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