Effet inhibiteur des huiles essentielles de trois plantes ...

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITIE ABOU BEKR BELKAID TLEMCEN

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Laboratoire de Microbiologie Appliquée à l’Agroalimentaire, au Biomédical

et à l’Environnement « LAMAABE »

THESE

Présentée par

Mme ZENATI Fatima

Ep Lakehal

En vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en biologie

Option : Microbiologie

Soutenue le …/…/2016

Devant le jury

Président Abdelouahid D.E. Professeur U. de Tlemcen

Examinateur Timinouni M. Professeur Institut Pasteur Maroc

Examinatrice Hassaine H. Professeur U. de Tlemcen

Examinateur Abbouni B. Professeur U. de Sidi Bel abbes

Directeur de thèse Bendahou M. Professeur U. de Tlemcen

Année Universitaire : 2015-2016

Effet inhibiteur des huiles essentielles de trois plantes aromatiques

sur Escherichia coli (BLSE) responsables d’infections urinaires

d’origine hospitalière

Dédicaces

Je dédie humblement ce travail :

A mes très chers parents

A mes sœurs Amina et Meriem et sa fille Nouran.

A mon époux. Kamel.

A mes très chère amies : Raniya, Naima, Rema, Zahra, Wassila, Nadia, Fatima, Nadjet,

Chaficka, Sara, Nassima, Khawla, Khadidja, Karima, Wafae, Zahira Et Samya. En

souvenir des moments inoubliables que nous avons passés ensemble. Je vous souhaite, à

travers ce travail et en témoignage de ma profonde affection, tout le bonheur et la réussite

que vous méritez.

A tous les membres de ma famille petits et grands. Veuillez trouver dans ce modeste travail

l’expression de mon affection la plus sincère.

F. Zenati

Remerciements

Avant toutes choses, je remercie Dieu, le tout puissant, pour m’avoir donné la force

et la patience pour réaliser ce travail.

Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de microbiologie appliquée à

l’agroalimentaire, au biomédicale et a l’environnement (LAMAABE), université Aboubekr

Belkaïd (ABB) de Tlemcen. La caractérisation moléculaire des souches bactériennes a été

faite à l’Institut Pasteur de Casablanca au Maroc.

J’adresse mes vifs remerciements à mon Directeur de Thèse, monsieur Bendahou

Mourad, professeur à l’université ABB, pour sa grande disponibilité, son écoute, ses conseils

judicieux et son suivi tout au long de ce travail. Je le remercie également de m’avoir fait

confiance pour la réalisation de ce travail.

Je remercie le professeur Moussa-Boudjemaa Boumediène directeur du laboratoire

LAMAABE de m’avoir permis de réaliser ce travail au sein du laboratoire.

J’adresse mes remerciements et mes respects à monsieur Abdelouahid Djamel Eddine,

professeur à l’université ABB de Tlemcen, pour ces conseils précieux et pour avoir accepté de

présider le jury de cette thèse.

Je suis très reconnaissante à Monsieur Timinouni Mohammed, professeur et chef du

département de microbiologie responsable du laboratoire de Bactériologie Moléculaire à

l’Institut Pasteur à Casablanca (Maroc), de m’avoir accueilli au sein du Laboratoire. Je lui

témoigne toute ma reconnaissance pour sa bonne humeur, son sourire, son agréable assistance

durant mon stage et d’avoir accepté d’examiner ce travail.

Je remercie profondément Mme Hassaine Hafida, professeur à l’université ABB de

Tlemcen et responsable de la formation doctorale «Maitrise du développement microbien»

pour avoir accepté d’examiner ce travail. Ses encouragements, ces conseils précieux et sa

confiance m’ont permis d’avancer dans ce travail.

Un grand merci à Mr Abbouni Bouziane professeur à l’université de Sidi Belabess

pour avoir accepté d’examiner cette thèse.

Je remercie l’équipe de chimie des substances naturelles dirigée par le professeur Jean

Costa de l’université de Corse (France) pour l’analyse des huiles essentielles.

Tous mes remerciements vont aussi à l’équipe du laboratoire de bactériologie

moléculaire de l’Institut Pasteur de Casa (Maroc), particulièrement à Monsieur Barguigua

Abouddihaj et madame Kawter pour leur collaboration durant mon séjour scientifique au

laboratoire.

Je remercie tous les enseignants et les doctorants du laboratoire LAMAABE, en

particulier Mme Bendimred Nahida, qui m’ont soutenu et encourager tout au long de ma

thèse.

Merci aux membres de l’équipe des substances naturelles antimicrobiennes (SNA) de

LAMAABE, Dr Khadir Abdelmounaim, Dr Barka Mohamed Salih, Dr Borsali Mohamed

Nabil, Mr Messaoudi Omar, Dr Benbelaid Fethi et Mme Bellahcène Chafika, qui m’ont

aidé et soutenu dans mes travaux au laboratoire.

Enfin, merci à tous ceux qui, de loin ou de près ont contribué à la réalisation de ce

travail.

يسخشفى الانسؤونت ع االنخهاباث انبىنت و انعسونت ي E. coli BLSE عهى زىث عطرتثالديفعىل : العنوان

الملخص

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انفعانت ضذ انبكخرا, زىث عطرت,انقاويت , ,PCR , E. coli BLSE االنخهاباث انبىنت:انكهاث انفخاحت

Titre : Effet inhibiteur des huiles essentielles de trois plantes aromatiques sur Escherichia coli

(BLSE) responsables d’infections urinaires d’origine hospitalière.

Résumé

La résistance des bactéries aux antibiotiques pose un vrai problème de santé publique.

Dans le but de trouver des alternatifs de lutte contre cette résistance, l’étude proposé est

d’évaluer l’effet inhibiteur de trois huiles essentielles (Cinnamomum cassia, Coriandrum

sativum et Ziziphora hispanica) sur des souches E. coli BLSE responsables d’infections

urinaires isolées au CHU de Tlemcen. Les résultats ont montré que l’infection urinaire

nosocomiale est importante chez les femmes et elle est due principalement à E. coli (63℅).

L’incidence d’Escherichia coli BLSE a été de 32,5%. L’analyse par PCR de E. coli BLSE ces

dernières, a révélé la présence des gènes Bla CTX-M et TEM1 avec un pourcentage élevé

(100℅ et 96℅). Les souches E. coli BLSE soumises à l’effet des trois huiles essentielles, ont

montré une grande sensibilité à l’huile essentielle de Cinnamomum cassia à l’état

planctonique et biofilm. Elle a donné en moyenne respectivement, une zone d’inhibition

> 33,25mm, une CMI=1,97mg/ml, CMB=2,5mg/ml et une CMIB=4,37 mg/ml,

CMEB=4,53mg/ml. Par contre Coriandrum sativum et Ziziphora hispanica sont moins actif.

En combinant les huiles à l’antibiotique céfotaxime contre E.coli BLSE 09, les huiles

essentielles de Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum ont présenté un effet d’addition.

La cinétique de destruction des cellules bactériennes par l’huile essentielle de Cinnamomum

cassia a été obtenue au bout de 30 min, par contre il a fallu 240 min pour les détruire par

l’huile de Coriandrum sativum.

Mots clés : Infection urinaire ; E. coli BLSE ; PCR ; Résistance ; Huiles essentielles ; Activité

antibactérienne.

Title: Inhibitory effect of essential oils of three aromatic plants on Escherichia coli (ESBL)

responsible for urinary tract infections Hospital

Abstract

Bacterial resistance to antibiotics is a real public health problem. In order to find

alternative fight against this resistance, the proposed study is to evaluate the inhibitory effect

of three essential oils (Cinnamomum cassia, Coriandrum sativum and Ziziphora hispanica)

on ESBL E. coli strains responsible for urinary tract infections isolated at the University

Hospital of Tlemcen. The results showed that nosocomial urinary tract infection is high

among women and it is mainly due to E. coli (63℅). The effect of E. coli ESBL was 32,5%.

PCR analysis of ESBL E. coli, revealed the presence of genes Bla CTX-M and TEM1 with

high percentage (100℅ and 96℅). ESBL E. coli strains subject to the effect of three essential

oils, have shown great sensitivity to essential oil of Cinnamomum cassia at state planctonic

and biofilm. She gave an inhibition zone > 33,25mm, MIC=1,97mg/ml, MBC = 2,5mg/ml and

a MBIC=4,37mg/mL, MBEC=4,53mg/ml. While, Coriandrum sativum and Ziziphora

hispanica oils are less active. Essential oils combined with the antibiotic cefotaxime against

ESBL E. coli 09, showed an additive effect of Cinnamomum cassia and Coriandrum sativum

essential oils. The kinetics of destruction of bacterial cells with essential oil of Cinnamomum

cassia was obtained after 30 min, while Coriandrum sativum oil destroys bacterial cells after

240 min.

Keywords : Urinary tract infection ; ESBL E. coli ; PCR ; Résistance ; Essential oils

Antibactérial activity.

Sommaire

Introduction………………………………………………………………………………………1

Partie I : Synthèse bibliographique…………………………...4

Chapitre I : les infections urinaires………………………………………………………..........4

I.1. Généralités sur les infections urinaires………………………………………………..........4

I.1.1. Infection urinaire et colonisation………………………………………………………........4

I.1.2. Infection urinaire simple et compliquée………………………………………………..........5

I.1.3. Infection urinaire récidivante………………………………………………………..............6

I.1.4. Infection urinaire communautaire et nosocomiale………………………………………….6

I.1.5. Epidémiologie et facteurs de risque……………………………………………………..7

I.2. Mode de pénétration des bactéries dans les voies urinaires………………………….........7

I.2. La voie ascendante…………………………………………………………………………….7

I.2.2. La voie hématogène…………………………………………………………………............8

I.2.3. Extension directe à partir d’un organe de voisinage (voie lymphatique)……………………8

I.3. Les infections à E. coli……………………………………………………………………….8

I.3.1. Généralités…………………………………………………………………………………..8

I.3.2. Caractères morphologiques et culturaux…………………………………………………….9

I.3.3. Caractères biochimiques……………………………………………………………….........9

I.3.4. Caractères antigéniques……………………………………………………………….........10

I.3.5. Pouvoir pathogène………………………………………………………………………….10

I.3.6. Les substances élaborées...………………………………………………………………….11

I.3.7. Physiopathologie de l’infection urinaire à Escherichia coli…………………………..........11

I.4. Antibiotiques et facteurs de risque de résistance aux antibiotiques……………………..14

I.4.1. Antibiotiques des infections urinaires ………………………………………………..........20

I.4.2. Schéma de traitement des infections urinaires ……………………………………….........22

I.4.3. Resistance d’E.coli aux antibiotiques chez l'adulte …………………………………..........23

I.4.4. Les mécanismes de résistances bactériennes aux antibiotiques …………………………...29

I.4.5. Facteurs de risque connus d’infections à EP-blse …………………………………………30

I.4.6. Les moyens de lutte contre E. coli BLSE ………………………………………….........31

I.4.7. Préventions…………………………………………………………………………………30

Chapitre II : Produits naturels et infections urinaires ………………………………….........31

II.1. Les plantes aromatiques et médicinales……………………………………………..............31

II.2. Généralités sur les huiles essentielles ...……………………………………………….........32

II.2.1. Définition des huiles essentielles ...………………………………………………….........32

II.2.2. Répartition…………………………………………………………………………………32

II.3. Composition des huiles essentielles…………………………………………………………32

II.4. Méthodes utilisées d’extractions des huiles essentielles……………………………………33

II.5. Activité antimicrobienne……………………………………………………………….........33

II.5.1. Mécanismes d’action des huiles essentielles………………………………………………34

II.5.2. Place des plantes médicinales dans la lutte contre les résistances aux

antibiotiques…................................................................................................................................35

II.5.3. Méthodes d’évaluation de l’activité antimicrobienne………………………………...........36

II.5.4. Méthodes de détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice.……………...........37

II.6. Domaines d’utilisation des huiles essentielles………………………………………….........38

II.7. Les principales voies d’utilisation des huiles essentielles…………………………………....39

II.8. Monographie des plantes sélectionnées………………………………………………...........40

Partie II : Matériel et méthodes………………………………44

II.1. Matériel microbien………………………………………………………………................44

II.1.1. Souches de références ……………………………………………………………..............44

II.1.2. Souches d’origine clinique ………………………………………………………………..44

II.2. Méthode……………………………………………………………………………………..44

II.2.1.Prélèvement………………………………………………………………………………...44

II.2.2. Bandelette urinaire ………………………………………………………………………...44

II.2.3. Examen bactériologique des urines ……………………………………………….............44

II.2.4. Antibiogramme ……………………………………………………………………………45

II.2.5. Détection des E .coli BLSE (Test de synergie) …………………………………………...45

II.2.6. Détermination de la CMI sur microplaque………………………………………………...46

II.2.7. Typage moléculaire d’E. coli BLSE……………………………………………….............47

II.2.7.1. Extraction d’ADN bactérien …………………………………………………………….47

II.2.7.2. PCR standard ……………………………………………………………………………47

II.2.7.3. Electrophorèse sur gel d’agarose………………………………………………………...55

II.3. Matériel végétal……………………………………………………………………….........56

II.3.1. Extraction des huiles essentielles…………………………………………………..............57

III.3.2. Analyse chimique des huiles essentielles………………………………………………....57

II.3.3. Evaluation de l’activité antibactérienne …………………………………………………...58

II.3.4. Étude de la combinaison des huiles essentielles avec les antibiotiques ……………….......61

II.3.5. La cinétique de destruction d’E. coli exposé aux huiles essentielles ………………….......62

Partie III : Résultats et discussions …………………………..63

III.1. Examens macroscopiques des urines ……………………………………………………….63

III.2. Résultats de la bandelette urinaire …………………………………………………………63

III.3. Résultats bactériologiques ………………………………………………………………....64

III.4. Fréquences des urines infectées en fonction du sexe……………………………………….65

III.5. Fréquences des urines infectées et non infectées en fonction de l’âge ……………………..66

III.6. Répartition des urines infectées et non infectées en fonction du lieu de prélèvement..........66

III.7. Étude de la résistance des entérobactéries isolées aux ntibiotiques………………………...67

III.8. Étude de la résistance d’E. coli isolée aux antibiotiques …………………………………..69

III.9. Phénotypes de résistance d’E. coli aux β-lactamines ………………………………………70

III.10. Biotypage des souches d’E. coli BLSE selon les profils numériques en API 20E

………..72

III.11.Répartition des profils numérique………………………………………………………….72

III.12. Répartition des souches d’E.coli BLSE en fonction des services………………………...73

III.13. Répartition des souches d’E.coli BLSE en fonction sexe ………………………………...73

III.14. Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction d’âge ……………………………..74

III.15. Répartition des patients infectés par E.coli BLSE en fonction des antécédents

médicaux…………………………………………………………………………………….........75

III.16. Fréquence d’E.coli BLSE durant les trois années d’étude ……………………………….75

III.17. Concentrations minimales inhibitrices de céfotaxime contre E. coli BLSE ……………...76

III.18. Profil moléculaire de la résistance d’E.coli BLSE aux β-lactamines...……………...........77

III.19. Recherche moléculaire de la résistance croisée……………………………………………79

III.20. Effet des HEs des plantes aromatiques retenues sur les souches d’E. coli BLSE ………...90

III.21. Étude de la combinaison des huiles essentielles avec la céfotaxime………………...........101

III.22. Cinétique de destruction d’E. coli avec les huiles essentielles……………………………102

Conclusion générale……………………………………………………………………………..105

Référence Bibliographique……………………………………………………………………..107

Annexes

Communications et Publication

Liste des tableaux

Tableau 1: Caractères biochimiques d’Escherichia coli ………………………………………………9

Tableau2 : Le traitement de la cystite aigüe...........................................................................………..20

Tableau 3: Le traitement des pyélonéphrites, prostatites et de la cystite compliquée de l’homme

………………………………………………………………………………………………………….21

Tableau 4: Le traitement de la pyélonéphrite simple …………………………………………............22

Tableau 5: Répartition des résistances d’E. coli aux ATB les plus fréquemment utilisés

dans le traitement des cystites simples ………………………………………………………………....23

Tableau6 : Phénotypes de résistance des entérobactéries aux aux β-lactamines ……………………...29

Tableau 7: Nomenclature des terpènes ………………………………………………………………..33

Tableau 8 : Composition chimique de l’huile essentielle de Coriandrum sativum ……………...........41

Tableau 9 : Composition chimique de l’HE essentielle de Ziziphora hispanica ……………….............42

Tableau 10 : Constituants chimiques de l’HE de C. cassia …………………………………………...43

Tableau 11: Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de résistance aux β-lactamines

………………………………………………………………………………………………………….48

Tableau 12 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour des bêta-lactamases…………...49

Tableau 13 : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes plasmidiques de type AmpC………..49

Tableau 14 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour AmpC…………………............50

Tableau15 : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de résistance aux quinolones ……......50

Tableau 16 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour les quinolones………………....51

Tableau17 : Amorces utilisées pour l’amplification de gènes de résistance aac(6’)-Ib ………………51

Tableau 18 : Les conditions d’amplification de gènes de résistance aac(6’)-Ib ………………………51

Tableau19 : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de résistance aux aminosides………...52

Tableau 20: Les conditions d’amplification des gènes codants pour les aminosides………………….52

Tableau 21: Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de virulence…………………………..53

Tableau 22 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour les gènes de virulence53

Tableau 23 : Les amorces d’ERIC-PCR utilisées…………………………………………………......54

Tableau 24 : Les amorces utilisées pour groupement phylogénétique……………………………......54

Tableau25 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour le groupement

phylogénétique………………………………………………………………………………………….55

Tableau 26 : Données sur les espèces végétales retenues et leurs utilisations………………………..56

Tableau 27: Répartition selon l’aspect macroscopique des urines d’origine hospitalière…………….63

Tableau 28: Résultat de la chimie des urines analysées d’origine hospitalière……………………….63

Tableau 29: Fréquences des urines infectées d’origine hospitalière………………………………….64

Tableau 30: Fréquences des urines infectées et non infectées en fonction du sexe…………………...65

Tableau 31 : Fréquences des urines infectées en fonction des tranches d’âge………………………..66

Tableau 32: Répartition des urines infectées et non infectées en fonction

du lieu de prélèvement………………………………………………………………………………….67

Tableau 33 : Comparaison des résistances bactériennes d’E. coli…………………………………….70

Tableau 34 : Biotypage des souches d’E. coli BLSE selon les profils numériques en API

20E………………………………………………………………………………………………..........72

Tableau 35 : Concentrations minimales inhibitrices (µg/mL) de céfotaxime contre E.coli

BLSE…………………………………………………………………………………………………..76

Tableau 36 : Profil moléculaire des 27 souches E. coli BLSE………………………………………78

Tableau 37: Les gènes qui codent pour les enzymes modificatrices des aminosides…………...........79

Tableau 38 : Les 16S ARNr methyltransphérases…………………………………………………….80

Tableau 39: Profil moléculaire de la résistance associée des souches d’E.coli BLSE aux

quinolones……………………………………………………………………………………………..81

Tableau 40 : Phénotype des facteurs de virulence……………………………………………............87

Tableau 41: Relation épidémiologique entre les 27 souches d’E.coli BLSE étudiées par ERIC/

PCR et groupement phylogénétique ………………………………………………………………….89

Tableau 42: Rendements en HE et caractéristiques organoleptiques…………………………...........90

Tableau 43 : Rendements en HE rapportés dans la littérature………………………………………..91

Tableau 44: Composition chimique (%) des huiles essentielles des plantes retenues…………….....92

Tableau 45 : Composés majoritaires des trois HEs rapportés dans la littérature………………….....93

Tableau 46 : Diamètres d’inhibitions (en mm) des huiles essentielles et de céfotaxime……………94

Tableau 47 : Concentrations minimales inhibitrices des huiles essentielles (mg/ml) et

de céfotaxime (μg/ml)………………………………………………………………………………...96

Tableau 48 : Evaluation de la formation du biofilm in vitro ……………………………………......98

Tableau 49. Effet des HEs étudiées vis–à–vis des souches d'E. coli en état du biofilm,

exprimées par les concentrations minimales inhibitrices (CMIB) et éradicatrices (CMEB)

du biofilm en mg/ml………………………………………………………………………………..99

Tableau 50 : CFI des huiles essentielles de Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum…......102

Liste des figures

Figure 1 : Microphotographie d’E. Coli obtenue par microscopie électronique à balayage………..8

Figure 2 : Les différentes étapes d'infection urinaire à Escherichia coli..………………………... 12

Figure 3 : Physiopathologie de l’infection urinaire………………………………………………...13

Figure 4 : Structure de l'unité isoprénique………………………………………………………….32

Figure 5 : Cellules d’E. coli avant et après le traitement avec huile essentielle d’Origan,

sous microscope électronique a balayage ……………………………………………………….…35

Figure 6 : Photo de Coriandrum sativum ……………………………………………………….....41

Figure 7 : Photo de Ziziphora hispanica…………………………………………………………...42

Figure 8 : Photo de Cinnamomum cassia ………………………………………………………….43

Figure 9: Réalisation d’un test de synergie………………………………………………………...46

Figure 10 : Photo de l’appareil utilisé pour l’extraction des huiles essentielles par

hydrodistillation……………………………………………………………………………………..57

Figure 11 : Principe de la méthode de diffusion par disque …………………………………….....59

Figure 12 : Répartition des bactéries responsables d'infections urinaires d’origine hospitalière en

fonction de l'espèce………………………………………………………………………………….64

Figure 13: Pourcentage de résistance aux antibiotiques des entérobactéries isolées d’urines au

CHU de Tlemcen……………………………………………………………………………………68

Figure 14 : Pourcentage de résistance d’E. coli aux antibiotiques……………………………......69

Figure 15 : Fréquences des phénotypes de résistance aux β-lactamines des souches d’E .coli

isolées d’urines infectées au CHU de Tlemcen…………………………………………………….70

Figure 16 : Répartition des profils numériques d’E. coli BLSE par service (CHU

Tlemcen)……………………………………………………………………………………............72

Figure17 : Répartition des souches d’E.coli BLSE en fonction des services au CHU de

Tlemcen……………………………………………………………………………………………..73

Figure 18 : Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction de sexe…………………….......74

Figure 19 : Répartition des souches d’E.coli BLSE en fonction d’âge……………………...........74

Figure 20 : Répartition des patients infectés par E.coli BLSE en fonction des antécédents

médicaux……………………………………………………………………………………...........75

Figure 21: Fréquence d’E.coli BLSE responsables d’IU durant les trois années d’étude (CHU de

Tlemcen)………………………………………………………………………………………........76

Figure 22a : détection des gènes bla CTXM15 ……………………………………………...........77

Figure 22b : détection des gènes bla TEM1………………………………………………………..77

Figure 23 : Les enzymes modificatrices des aminosides…………………………………………..79

Figure 24 : Effet de l’huile essentielle de Cinnamomum cassia sur Pseudomonas aueruginosa

………………………………………………………………………………………………………………...95

Figure 25 : Cinétique de destruction de la souche Ecoli BLSE 09 exposée à l’huile essentielle de

Cinnamomum cassia pendant 15, 30, 45 et 75 mn à la concentration de CMB= 5 mg/ml………..102


Coriandrum sativum pendant 15, 30, 45, 75,90,120,150,180 et 240 mn aux concentrations CMB=

10, 20 et 40 mg/ml…………………………………………………………………………………103

Liste des abréviations

A.F.S.S.A.P.S : Agence Française de Sécurité Sanitaire et des Produits de Santé

ACC : Ambler class C

ADN : acide désoxyribonucléique.

AMC : Amoxiciline+ acide Clavulamique

AME: Aminoglycosides modifying enzymes

AmpC : céphalosporinase

API 20E: Analytical profile index 20E (E= Entérobactéries)

Arm: Aminoglycoside resistance methylase

ATB : Antibiotique

ATM : Aztreonam

ATP: Adénosine Triphosphate

BES : Brazilian extended-spectrum

BHIB : Bouillon Cœur cervelle

BLSE : béta-lactamases à spectre étendu.

C3G : céphalosporine de 1ere, 2eme, 3eme et 4eme génération

CASE: céphalosporinase

CC : complexe clonal

CFI : Concentration fractionnelle inhibitrice

CG/SM : chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse

CHU : Centre hospitalier universitaire

CIP : Ciprofloxacine

CIT :Gène codant pour une céphalosporinase

CLIN: Comité de lute contre les infections nosocomiales

CLSI : Clinical and Laboratory Standard Institute

CMB: Concentration(s) Minimale(s) Bactericide

CMEB : Concentration minimale éradicatrice du biofilm

CMI : Concentration minimale inhibitrice.

CMIB : Concentration minimale inhibitrice du biofilm

CMY : Cephamycinase (gène codant pour une céphalosporinase plasmidique

CNF1: cytotoxic necrotizing factor 1

CTIN : Comité Technique national des Infections Nosocomiales

CTX-M : cefotaximase-Munich

DHA : Dharhan hospital

DMSO : Diméthyl sulfoxyde

dNTP : désoxyribonucléotide triphosphate

DO : Densité optique

E. coli : Escherichia coli

EARS-Net : European Antimicrobial Resistance Surveillance Network

EBLSE: Entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu.

ECBU : examen cytobactériologique urinaire

ECDC :European Center for Disease prevention and Control

EDTA : acide éthylène diamine tétraacétique

ERIC-PCR : Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus- Polymerase chain reaction

FOS : Fosfomicine

FOX : Gène codant pour une céphalosporinase

FQ : Fluoroquinolones.

H.E : Huiles essentielles

hly :hémolysine

IU : Infection urinaire

IUN : Infection urinaire nosocomiale

LCR: Liquide céphalorachidien

LPS: Lipopolysaccharide

M P: Marqueur de poid

Mgcl2 :magnesium chloride

MH: Muller Hinton

MOX : Gène codant pour une céphalosporinase

ORL : Oto-rhino-laryngologie.

OXA : oxacillinase

PASE: pénicillinase

PB : Paires de bases

PCR : Polymérase Chain réaction.

PER : Pseudomonas extended resistance

PLP: Protéines de liaison aux pénicillines

PNA : La pyélonéphrite aiguë

qepA : quinoloneef-ffux pump

qnr : Quinolone resistance gene

QRDR : Quinolone Resistance Determining Region

Rmt: ARNr 16S méthyltransférase

rpm : rotation par minute

sfa:S-family adhesions

SFO : Serratia fonticola

SHV : sulfydryl variable

SPILF : Société de Pathologie Infectieuse de Langue Française

SXT : Triméthoprime + Sulfaméthoxazole.

TBE : TRIS Acide borique EDTA

TEM : TEMoneira- nom du patient

Ufc : unité formant colonie

VEB : Vietnam extended-spectrum

VIM : Verona integron–encoded metallo-β-lactamase

Introduction

Introduction

1

Introduction

Les infections en générale posent un véritable problème de santé publique du fait de leur

fréquence, leur gravité et leur coût socioéconomique. Leurs traitements par les antibiotiques

restent le moyen de choix, mais l’émergence de bactéries résistantes pose un problème

d’inefficacité de ces molécules anti-infectieuses. Dans les établissements de soins, les

infections dites nosocomiales sont préoccupantes du fait de la libre circulation des bactéries.

Les infections urinaires représentent un exemple élucidant des infections

nosocomiales contractées à l’hôpital. Elles sont plus fréquentes dans les services de moyen

séjour tels que le service d’urologie, où ces infections, sont souvent la résultante d’un certain

nombre de facteurs tels que les pratiques de soins, la flore liée au patient ou encore

l’environnement.

Les micro-organismes les plus incriminés dans les infections urinaires sont les bacilles

à gram négatif, hôtes naturels de l’intestin et de l’environnement, dont Escherichia coli

est la plus incriminée. Le moyen de lutte le plus fréquemment utilisé est l’antibiothérapie,

mais la prescription massive et probabiliste de ces molécules a été rapidement suivie par

l’émergence de bactéries résistantes. Même l’utilisation de nouvelles molécules de quinolones

s’est avérée inefficaces suite aux mécanismes de résistances développées par les bactéries

(Lazrak, 2014).

Les mécanismes sont (i) soit de natures enzymatiques telles que les β-lactamases qui

inactivent les β-lactamines par modification chimique ou (ii) soit non enzymatiques causés

par des mutations ou par des gènes d’origine inconnue qui s’intègre au niveau du génome

bactérien (Gutmann, 1987).

A ce jour, plus de 600 variantes de BLSE ont été décrites à travers le monde. On

distingue 11 familles différentes : TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES, TLA, BES, SFO,

FEC et OXA. Les BLSE les plus anciennes dérivent de TEM- 1,2 et de SHV-1 (Geser et al.,

2012).

Les souches d’E. coli productrices de beta-lactamases à spectre élargi (BLSE) sont

apparues dans les années 1980 (Knothe et al., 1983 ; Bradford, 2001). Elles sont dominées

actuellement par la production de BLSE de type CTX-M. Le problème d’échec thérapeutique

découle aussi des résistances associées, puisque 80% d’E. Coli CTX-M sont résistantes aux

fluoroquinolones de nature plasmidique attribuer aux gènes qnr ou encore à l’enzyme AAC6’-

1b-cr (López-pujol et al., 2011).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Lazrak%20MA%5Bauth%5D

Introduction

2

Les infections causées par E. coli (BLSE) sont associées à une morbidité et une

mortalité élevées, à une prolongation de la durée de l’hospitalisation et à une augmentation

des coûts d’hospitalisation (Patterson, 2001 ; Masterton et al., 2003).

La fréquence élevée des bactéries résistantes aux antibiotiques complique la conduite

thérapeutique de cette pathologie, et justifie d’une part (i) d’une évaluation de l’efficacité de

ces médicaments et (ii) d’autre part la recherche de nouvelles molécules antimicrobiennes.

Parmi les sources prometteuses de molécules bioactives, les plantes aromatiques et

médicinales.

Jadis, les plantes étaient le seul moyen pour traiter les infections mêmes avant de

découvrir les microbes. Aujourd’hui, 80% des populations à travers le monde utilisent les

plantes médicinales pour se soigner, par manque d’accès aux médicaments prescrits par la

médecine moderne mais aussi parce que ces plantes ont souvent une réelle efficacité (Dibong

et al., 2011). Ils restent aux scientifiques de préciser les propriétés et de valider les usages des

plantes aromatiques et médicinales qui constituent un réservoir naturel de molécules

bioactives (Pelt, 2001).

Des travaux antérieurs ont montré l’effet antimicrobien des extraits des plantes sur les

microorganismes. L’exemple de la canneberge (Vaccinum macrocarpon) est aujourd’hui

reconnu dans le traitement des IU. D’ailleurs l’Agence française de sécurité sanitaire des

produits de santé (A.F.S.S.A.P.S) lui reconnaît depuis 2004 les propriétés suivantes :

« Contribue à diminuer la fixation de certaines bactéries Escherichia coli sur les parois des

voies urinaires ». L’importance de cette plante est liée aux pro-anthocyanidines et à la

présence des substances anti-oxydantes (Peyramaure, 2008). Cependant, peu de travaux ont

été réalisés sur un exemple clinique bien déterminé tel qu’E. coli (BLSE).

Dans le même axe de recherche de molécules bioactives issues des plantes aromatiques

et médicinales de la région de Tlemcen, nous nous sommes intéressé à l’étude de l’effet

inhibiteur de trois huiles essentielles Coriandrum sativum (kasbour) ; Ziziphora hispanica

(Fliou) et Cinnamomum cassia (qirfa) sur E. coli (BLSE) responsables d’infections urinaires

d’origine hospitalière. Les objectifs de ce travail sont la mise en évidence de la prévalence de

résistance d’E. coli aux antibiotiques, le typage moléculaire des souches isolées et surtout

l’évaluation de l’effet inhibiteur des huiles essentielles retenues sur E. coli (BLSE).

Le travail est structuré de la façon suivante :

La première partie est une synthèse bibliographique sur les infections urinaires et les

huiles essentielles.

Introduction

3

La deuxième partie consiste à la présentation du matériel et les méthodes utilisés dans

ce travail.

Et enfin, la troisième partie, sera consacrée à la présentation des résultats et à leurs

discussions.

Synthèse

bibliographique

Synthèse bibliographique

4

Partie I : Synthèse bibliographique

Chapitre I : Les infections urinaires

I.1. Généralités sur les infections urinaires

I.1.1. Infection urinaire et colonisation

A l’état normal, l’urine est stérile. Les infections urinaires (IU) se traduisent par la présence de

germes pathogènes dans l’urine à l’intérieur des voies excrétrices. Elles se définissent à l’aide de

critères biologiques: une bactériurie supérieure à 105/ml, une leucocyturie supérieure à 10/mm

3 ou

104/ml avec la présence d’au moins 10

5 colonies par ml, qu’il y ait ou non des signes cliniques

d’accompagnement (Gonthier et Heritier, 1988).

D'après la définition établie lors de la conférence de consensus organisée par la société de

pathologie infectieuse de langue française et l’association française d'urologie (SPILF et l’AFU,

2002 ; Clere, 2012), on parle d'infection urinaire si l'on est en présence d'au moins un des signes

cliniques suivants :

fièvre (> 38°C),

impériosité mictionnelle (envie pressante),

pollakiurie (envie fréquente) : la fréquence des mictions est plus élevée (> 8 mictions par 24

heures et/ou > 2 mictions nocturnes) mais le volume d'urine journalier n'est pas augmenté,

brulures mictionnelles ou douleurs sous-pubiennes (pesanteur pelvienne),

douleurs lombaires.

de dysurie (difficulté a la miction : évacuation lente et difficile, voire douloureuse des

urines, avec diminution du débit urinaire et sensation que la vessie ne se vide pas),

d'hématurie (sang dans les urines) en fin de miction dans 30% des cas,

d'urines troubles (pyurie ou leucocyturie) et malodorantes.

Selon Lobel et Soussy, (2007), l'infection urinaire (IU) correspond a l'agression d'un tissu par

un (ou plusieurs) microorganisme (s), générant une réponse inflammatoire et des symptômes de

nature et d'intensité variable selon le terrain. L’IU regroupe les infections des différents constituants

de l'appareil urinaire ou de certaines annexes comme :

l'urétrite : inflammation de l'urètre, considérée comme une maladie sexuellement

transmissible,

la cystite : inflammation de la vessie,

la pyélonéphrite : inflammation des reins,

la prostatite : inflammation de la prostate,

l'orchi-épididymite : inflammation de l’épididyme et des testicules.


5

En général, la fièvre et les douleurs lombaires (souvent unilatérales) sont le signe d'une

atteinte parenchymateuse, c'est à dire d'une pyélonéphrite ou d'une prostatite (Leroy et Tattevin,

2012 ). A ces signes peuvent être associés des frissons, des sueurs et une altération de l'état général

( Rostoker et al., 1991).

La colonisation est à différencier de l'IU, elle correspond à la présence d’un (ou de plusieurs)

micro-organisme dans l’arbre urinaire sans qu’il ne génère par lui-même de manifestations

cliniques. Le concept de bactériurie asymptomatique est indissociable de celui de colonisation et

correspond à la même entité sans le rattacher à une notion de seuil (ufc/ml). Le terme de

colonisation est préférable à celui de bactériurie asymptomatique (Vildé et al., 2002).

1.1.2. Infection urinaire simple et compliquée

Depuis la parution des dernières recommandations de l’Agence française de sécurité sanitaire

des produits de santé en la matière (2008), les termes d’infections urinaires hautes ou basses, ont été

abandonnées. On emploie plus volontiers aujourd’hui les notions d’infections urinaires simples ou

compliquées. Ces recommandations font apparaitre de nouvelles stratégies thérapeutiques qui

tiennent compte de l’évolution des résistances des microorganismes les plus fréquemment retrouvés

dans les infections urinaires.

a. Les infections urinaires simples

Ce sont des infections urinaires survenant chez des patients ne présentant pas de facteur de

risque de complication ou de morbidité. L’âge (au-delà de 65 ans) n’est plus considéré comme un

facteur de risque de complication en l’absence de terrain problématique. Les IU dites simples

comprennent la cystite aigue simple et la pyélonéphrite simple (AFSSAPS, 2010).

b. Les infections urinaires compliquées

Elles surviennent chez des patients présentant au moins un facteur de risque de complication,

parmi les suivants :

Anomalie organique ou fonctionnelle de l’arbre urinaire (lithiase, tumeur, reflux…)

Certaines pathologies comme le diabète, l’insuffisance rénale, l’immunodépression

Un terrain particulier (grossesse, sexe masculin).

Les IU dites compliquées comprennent la cystite compliquée et la pyélonéphrite compliquée

(AFSSAPS, 2010).

Toute infection urinaire survenant chez l’homme est automatiquement considérée comme

compliquée et gérée comme une prostatite aigue (inflammation de la glande prostatique d’origine

bactérienne). Les infections urinaires survenant chez la femme enceinte sont également considérées

comme des IU compliquées (cystite aigue gravidique et pyélonéphrite aigue gravidique)

(AFSSAPS, 2010).


6

I.1.3. Infection urinaire récidivante

Les IU sont dites récidivantes lorsqu'il y a au moins 4 épisodes par an ou un épisode datant de

moins de 3 mois (AFSSAPS, 2008). Elles concernent en général les femmes jeunes, en bonne santé,

sans anomalies fonctionnelles ou anatomiques du tractus urinaire. Les IU récidivantes sont malgré

tout à considérer comme des IU compliquées (Barrier Letertre, 2013).

Parmi ces IU, on distingue les rechutes (IU symptomatique causée par la même bactérie après

un traitement adéquat, ayant lieu moins d'un mois après la première IU), des réinfections (IU

symptomatiques causées par une autre bactérie, ou par la même bactérie après un traitement adapté

et un ECBU de contrôle négatif, survenant plus d'un mois après la première IU) ( Kodner et

Gupton, 2010). Ce dernier cas, réinfection par la même bactérie, est le plus fréquent. Le caractère

récurent d'une IU dépend surtout de la bactérie et moins des facteurs de risques (Foxman, 1990).

I.1.4. Infection urinaire communautaire et nosocomiale

Les IU communautaires surviennent en dehors d'une structure de soins (Marrhich, 2008).

Par contre les IU nosocomiales sont acquises dans une structure de soins, ou bien reliée à la prise en

charge du patient, et causée par des microorganismes dont l'origine est hospitalière (SPLIF et AFU,

2002 ; Eilenberg, 2005). L’IU nosocomiale peut concerner les personnes séjournant, visitant ou

travaillant à l'hôpital (Eilenberg, 2005). La fréquence est variable selon les résidents avec sonde et

sans sonde. De manière générale, les IU nosocomiales touchent tous les services hospitaliers. Les

principaux services touchés dans les hôpitaux sont : le service de chirurgie urologique, réanimation

médicale, pédiatrie, rééducations fonctionnelle de l’adulte et de la personne âgée, maternité et le

service de gynécologie (Vildé et al., 2002).

Les germes les plus fréquemment rencontrés à l’hôpital sont les bacilles Gram négatif avec

Escherichia coli en tête, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Serratia et Pseudomonas. Les germes

sont souvent multi-résistants du fait de nombreux traitements antibiotiques antérieurs.

La contamination se fait par la flore rectale ou lors de manipulations exogènes (Faucher et

Cudennec, 2002 ; SPILF et AFU, 2002).

Il existe peu d’études sur la morbidité des infections urinaires car elle est difficile à évaluer

lors d’un séjour hospitalier en raison des poly pathologies et autres infections qui peuvent entraîner

le décès. Le rôle de la bactériurie asymptomatique dans la morbidité génito-urinaire chez les sujets

âgés en institution est faible en comparaison de sa prévalence élevée. Il n’y a pas d’argument pour

un lien causal entre bactériurie asymptomatique et mortalité dans la population âgée dans les

dernières études. Les IU sont davantage un marqueur de maladie qu’une cause d’augmentation de la

mortalité. La mortalité de la pyélonéphrite est faible si la prise en charge adaptée est précoce. C’est

cependant la cause la plus fréquente de septicémie et de choc infectieux chez le sujet âgé. Les décès


7

par septicémie à point de départ urinaire correspondent à moins de 10 % des décès totaux (Faucher

et Cudennec, 2002).

I.1.5. Epidémiologie et facteurs de risque

L’infection de l’appareil urinaire est fréquente chez la femme. 6 à 10 % des fillettes et femmes

jeunes ont une bactériurie. Ce taux augmente avec l’âge pour atteindre 20 % chez la femme adulte

et 25 à 50 % chez la femme de plus de quatre-vingts ans. Ainsi une femme sur trois aura une

infection urinaire avant l’âge de vingt-quatre ans, 40 à 50 % auront une infection au cours de leur

vie et 20 à 30 % d’entre elles ayant eu un premier épisode, récidiveront dans les trois à quatre mois

chez le sujet âgé. D’autres facteurs de risque sont responsables de l’IU comme la grossesse, le

diabète et l’existence d’anomalies urologiques (Sourander, 1966 ; Raz, 2001 ; Foxman, 2002).

I.2. Mode de pénétration des bactéries dans les voies urinaires

L’urine vésicale normale est stérile. Cependant on rencontre des bactéries de façon

permanente surtout chez la femme. La bactériurie dépend de 3 phénomènes :

- la vitesse de pénétration des bactéries dans la vessie,

- la vitesse de croissance de ces bactéries,

- la vitesse d’élimination ou de la destruction des bactéries (kodio, 1979 ; Fauchere, 1997 ; Epok,

1999).

I.2.1. La voie ascendante (Chartier, 2001)

La voie ascendante est la plus fréquente. A partir du méat (physiologiquement porteur de

Staphylocoques et de Streptocoques, mais pas de bacilles Gram -, les germes peuvent remonter vers

la vessie. Chez la femme, la brièveté de l’urètre, la proximité de l’anus et la tendance des bactéries

du rectum (bacilles Gram -) à coloniser le périnée, prédisposent à cette migration. L’anatomie du

bas appareil urinaire de la femme avec un urètre court et la proximité de la cavité vaginale explique

la possibilité de transmission des germes des régions rectales et vaginales à la vessie. La miction

ayant un rôle de « chasse » des germes remontants vers la vessie, toute perturbation de celle-ci

favorisera aussi cette ascension. Chez l’homme, l’urètre situé à distance de l’anus et les sécrétions

prostatiques antibactériennes (riches en zinc) rendent cette migration peu fréquente.

Au cours des infections urinaires basses, une fois la vessie contaminée, la persistance des

microorganismes est liée à leur capacité d’adhésion à l’épithélium vésical. Les bactéries présentes

dans la vessie engendrent une réponse inflammatoire qui se manifeste par la présence de

polynucléaires dans la vessie. Chez la femme comme chez l’homme, les infections urinaires sont

favorisées par :

les sondes à demeure,

tout obstacle à l’écoulement de l’urine (lithiase),


8

l’état grabataire (pour les malades qui ne quittent pas le lit).

I.2.2. La voie hématogène :

Moins fréquente, elle survient lors d’une septicémie ou lors d’une bactériémie, surtout chez

l’immunodéprimé et le diabétique. La porte d’entrée infectieuse, inconstamment retrouvée peut être

variable : cutanée, O.R.L., dentaire (Chartier, 2001).

I.2.3. Extension directe à partir d’un organe de voisinage (voie lymphatique) :

Exemple de la maladie inflammatoire de l’intestin, suppuration pelvienne aiguë chez la

femme, abcès para vésical (Chartier, 2001).

I.3. Les infections à E. coli

I.3.1. Généralités

L’espèce E. coli, également appelé colibacille, est un bacille Gram-négatif (figure 1) de la

famille des Enterobacteriacae. Découvert en 1885 par Théodore Escherich dans les selles des

nourrissons, c’est un commensal commun de la flore intestinale de l’homme et des animaux à sang

chaud. Son établissement dans le tractus digestif s’effectue durant les premières heures suivant la

naissance (Kaper et al., 2004).

Figure 1: Microphotographie d’E. coli obtenue par microscopie électronique à balayage

(Clément, 2012).

Certaines souches peuvent devenir pathogènes par acquisition de gènes de virulence et elles

sont capables de causer des infections intestinales et extra intestinales à l’aide des facteurs de

virulence qui perturbent les processus cellulaires normaux (Kaper et al., 2004). Les facteurs de

virulence qui distinguent les différents pathotypes d’E.coli sont codés par des plasmides,

transposons, phages et les génomes des autres bactéries par transfert horizontal ou vertical des

gènes. L’îlot de pathogénicité peut-être identifié dans les souches pathogènes car il possède une

composition différente du reste du génome bactérien ce qui indique leur provenance d’autres

espèces (Whittan, 1996). E. coli est l’organisme le plus étudié dans les laboratoires de biologie


9

moléculaire et constitue un modèle pour les études biochimiques et génétiques grâce à sa

découverte précoce et sa culture aisée (Donnenberg et Whittam, 2001).

I.3.2. Caractères morphologiques et culturaux

E.coli est une bactérie asporulée mesurant 2 à 4 μm de long sur 0,4 à 0,6 μm de large. C’est

une bactérie fine et allongée à extrémités arrondies, mobile grâce à une ciliature péritriche. Ce

germe non exigeant, sur gélose ordinaire donne des colonies lisses, brillantes et homogènes (Lobril,

1998).

I.3.3. Caractères biochimiques

E. coli possède une catalase mais est dépourvu d’oxydase. L’étude de l’activité enzymatique

et de la fermentation des sucres est réalisée à l’aide de micro-méthodes validées disponibles dans le

commerce sous forme de galeries (Gueye, 2007 ; Sibery et al., 2001). E. coli fermente le glucose et

le lactose avec une production de gaz, il est dépourvu d’une uréase, produit de l’indole, n’utilise pas

le citrate de Simmons comme source de carbone et ne produit pas d’hydrogène sulfuré. Ces

différents tests sont regroupés dans le tableau 1 (Gueye, 2007).

Tableau 1: Caractères biochimiques d’Escherichia coli (Gueye, 2007)

tests ADH B

Gal

CC CS Gel IND MAL PDA LDC ODC TDA URE NIT GLU LAC VP ESC H2S

résultats +∕- + + - - + - +∕- + + + +∕- - + + - - -

Légende : (+) Caractère positif ; (-): Caractère négatif ; (+/-): caractère inconstant.

ADH : Arginine dihydrolase ; β Gal: Bêta galacto-D pyranoside ; CC : Citrate de Christensen, CS :

citrate de Simmons ; Gel : Gélatinase ; H2S : Hydrogène sulfuré ; IND : Indole ; MAL : Maltose ;

PDA : Phényle alanine désaminase ; LDC : Lysine décarboxylase ; ODC : Ornithine

décarboxylase ; URE : Uréase ; NIT : Nitrate réductase ; VP : Réaction de Voges Proskauer ; TDA

: Tryptophane désaminase, GLU : Glucose, LAC : Lactose

Souches atypiques

Se sont des souches mutantes qui ont perdu ou acquis un caractère biochimique non habituel

chez l’espèce E. coli. Exemples :

Des variant indole - : pour ces souches, l’indole est le seule caractère qui a muté. (Le minor,

1993). A la différence des souches appartenant à l’espèce Escherichia fergusonii qui sont : indole -,

LDC -, ODC - (Pelmont, 1995).

Des variant H2S+, Uréase+, ces caractères sont codés par un plasmide qui peut déterminer une

résistance à un antibiotique tel que la tétracycline (Le minor, 1993 ; Pelmont, 1995).


10

Alkalescens-dispar (A.D) : Auparavant les variants immobiles et agazogènes d’E. coli

portaient le nom de Alkalescens-dispar et étaient classés avec les Shigella. Aujourd’hui, on leurs

reconnaît le même pouvoir, la même écologie que ceux des autres E. coli, d’où leur intégration dans

ce genre. (Le minor, 1989 ; 1993). Les souches E.coli sont isolées des selles d’individus en bonne

santé. Ils sont immobiles, agazogènes, fermentent tardivement le lactose, ou lactose négative ;

ONPG négative.

I.3.4. Caractères antigéniques

Au sein de chaque genre, on individualise les espèces par l’étude des caractères

biochimiques et antigéniques. Les entérobactéries possèdent toutes, des antigènes de paroi

(somatiques) ou antigènes O. Les espèces mobiles quand à elles renferment en plus des antigènes O,

des antigènes H ou flagellaires : C’est le cas d’E. coli (Lobril, 1998 ; Edler, 2001 ; Flaudrois,

2004).

I.3.5. Pouvoir pathogène

Les entérobactéries sont des taxons isolées dans de nombreux aliments (céréales), et dans

divers produits pathologiques (urine, LCR, selles……). E. coli est souvent responsable de gastro-

entérites graves pouvant être mortelles dans certains cas à l’absence de traitement. Il est classé dans

le groupe des entérobactéries pathogènes spécifiques avec les Shigelles et les Salmonelles qui sont

responsables de dysenteries et fièvres typhoïdes graves (Collignon, 2002).

Il existe divers d’E coli à mécanismes d’actions différentes :

- ETEC : Enterotoxinogen E. coli, responsable de la « diarrhée des voyageurs » ou « turista » et des

syndromes épidémiques dans les pays du Tiers-monde ;

- EIEC : Enteroinvasive E. coli, encore appelé E. coli Shigella-like, responsable de syndromes

dysentériques avec invasion de la muqueuse intestinale ;

- EHEC : Enterohaemorragic E. coli, responsable de diarrhées sanglantes liées à la production de

toxines ;

- EPEC : Enteropathogen E. coli, responsable de gastro-entérites infantiles. (Perrière, 1992 ;

Collignon, 2002).

Infections urinaires

E. coli représente à lui seul l'agent responsable de la très grande majorité de cas d'infection

urinaire spontanée ou après instrumentation. L'infection urinaire basse à E .coli est vulgairement

appelée colibacillose. En fait, l'origine de l'infection est intestinale (infection par voie ascendante),

favorisée chez la femme par l'anatomie du bas appareil urinaire (urètre court) et par la fréquence des

rapports sexuels. E. coli est aussi dominant dans le rectum et la sphère génito-urinaire (Flandrois,

1997).


11

Septicémies et méningites

Les E. coli sont isolés dans 20 % des septicémies et représentent 45% des septicémies dues

aux bacilles à Gram négatif. Les méningites sont rares, elles surviennent surtout chez le nourrisson

mais sont souvent graves. 80 % des E. coli isolés de méningites possèdent l'antigène K1,

polysaccharide acide dont la composition chimique et la spécificité immunologique sont identiques

à celle de l'antigène B de Neissseria meningitidis (Flandrois, 1997).

Suppuration diverses

Les E. coli de la flore fécale peuvent être en cause dans des péritonites, des cholécystites, des

salpingites et des suppurations postopératoires jouant le rôle de bactéries pyogènes (Flandrois,

1997).

I.3.6. Les substances élaborées :

E. coli peut produire des entérotoxines, des hémolysines, des enzymes capables de détruire

certains antibiotiques et des bactériocines, substances à action antibiotique qui détruisent

spécifiquement d'autres bactéries qui sont aussi dénommées colicines (Ferron, 1994)

1.3.7. Physiopathologie de l’infection urinaire à Escherichia coli:

Escherichia coli uropathogène s’attache à l’uroépithélium par des pili de type 1, qui se lient

aux récepteurs Uroplakin Ia et IIIa (figure 2). Cette liaison stimule des voies de signalisation

inconnues qui interviennent dans l'invasion et de l'apoptose. La liaison du pili de type 1 à l’α3β1

intégrines est également le médiateur de l’internalisation des bactéries dans les cellules

superficielles pour former des communautés bactériennes intracellulaires. Des concentrations

sublytiques de la toxine porogène hémolysine A (HlyA) peuvent inhiber l'activation de protéines

Akt et conduire à l'apoptose de l'hôte cellulaire et l’exfoliation. L’exfoliation de l’uroépithélium

expose les cellules de transition sous-jacentes pour une autre invasion d’E. coli uropathogène, et les

bactéries peuvent résider dans ces cellules en tant que des réservoirs intracellulaires qui peuvent être

impliqués dans des infections récurrentes (Matthew et al., 2010).


12

Figure 2 : Les différentes étapes d'infection urinaire à Escherichia coli (Matthew et al., 2010).

L’infection urinaire débute par la colonisation du tube digestif par une souche uropathogène

qui, grâce à la présence de facteurs de virulence, colonise l’aire périurétrale et migre le long de

l’urètre vers la vessie, puis le long de l’uretère vers le rein (figure 3). La migration d’E. coli en

dépit du flux urinaire requiert son attachement à la surface des cellules épithéliales par

l’intermédiaire des différentes adhésines. Les flagelles ne semblent pas jouer un rôle déterminant

dans la remontée des voies urinaires par E. coli. Parmi les nombreuses adhésines, deux jouent un

rôle majeur : les pili de type 1 pour la colonisation de la vessie et les pili de type P pour l’invasion

du parenchyme rénal. L’interaction de l’adhésine FimH des pili de type 1 avec les récepteurs mono-

mannose à la surface des cellules vésicales facilite l’internalisation de la bactérie et conduit à la

formation de communautés bactériennes intracellulaires dans une matrice de biofilm. Elles sont

ensuite reléguées dans la lumière vésicale ou restent quiescentes faisant le lit de la récidive de

l’infection urinaire. Cette internalisation et cette persistance d’E. coli dans les voies urinaires basses

seraient renforcées en présence de la toxine CNF (facteur cytotoxique nécrosant1). Face à

l’infection de la vessie, seule l’immunité innée peut entrer en action. Durant les deux premières

heures, elle est essentiellement liée à l’action des défensines. Par la suite, l’adhésion via les pili de

type 1 et les pili de type P va être à l’origine de la réponse inflammatoire. En l’absence de CD14

libre dans les urines, cette adhésion sert de cofacteur lors de la reconnaissance du complexe LPS

(lipoplysaccharide binding protein) par les TLR4 (Toll-like receptor 4) des cellules vésicales.

L’activation des TLR4 induit la sécrétion de cytokines chimiotactiques aboutissant à un afflux de

polynucléaires neutrophiles. Les bactériuries asymptomatiques sont reliées soit à une déficience de

l’hôte en TLR4, soit à un phénomène de dépiliation des E. coli intra vésicaux. L’expression


13

continue de fimbriae de type 1 confine l’infection à la vessie. Les souches d’E. coli responsables de

pyélonéphrites aiguës bloquent leur synthèse de fimbriae de type 1 en invalidant le promoteur en

position « off », et peuvent ainsi migrer le long des uretères en dépit du flux urinaire. La migration

est favorisée par l’expression des fimbriae de type P. Le passage de la bactérie dans la circulation

sanguine serait facilité par la déstabilisation de l’épithélium rénal par des cytotoxines comme

l’hémolysine α ou la toxine Sat. Une fois dans la circulation sanguine, la bactérie se protège du

système immunitaire par les différentes structures (capsule, LPS) et par les protéines de surfaces

permettant notamment d’échapper à l’activité bactéricide du complément et à la phagocytose. Tout

au long de sa progression, aussi bien dans les urines que dans le sang, E. coli va devoir trouver les

éléments nécessaires à sa croissance et notamment le fer en utilisant les nombreux systèmes de

capture. (Bonacorsi et al., 2014 ; Bidet et al., 2012)

Figure 3 : Physiopathologie de l’infection urinaire (Bidet et al., 2012)

I.4. Antibiotiques et facteurs de risque de résistance aux antibiotiques

Généralement, le traitement des infections urinaires par les ATB vise trois objectifs :

(i) l’infection selon une antibiothérapie adaptée (généralement par les fluoroquinolones, les

céphalosporines de 3ème génération et les aminosides).

(ii) la douleur en utilisant les antalgiques, antispasmodiques et anti-inflammatoires non

stéroïdiens.

(iii) la récidive en respectant les mesures hygiéniques et diététiques.


14

I.4.1. Antibiotiques des infections urinaires

I.4.1.1. Les β-Lactamines

a. Définition

Les -lactamines constituent la famille d'antibiotiques la plus importante, aussi bien par le

nombre et la diversité des molécules utilisables que par leurs indications en thérapeutique et en

prophylaxie des infections bactériennes. Cette famille qui regroupe les pénicillines, les

céphalosporines, les carbapénèmes et les monobactames, est caractérisée par la présence constante

du cycle β-lactame associé à des cycles et des chaînes latérales variables qui expliquent les

propriétés pharmacocinétiques et le spectre d'activité des différents produits. La grande variété de

leurs modes d'administration, leur large spectre d'activité antibactérien associé à une action

bactéricide, une bonne diffusion tissulaire, une bonne tolérance et un faible nombre d'interactions

médicamenteuses expliquent leur popularité et l'importance de leurs utilisations seules ou en

associations (Cavallo et al., 2004).

b. Classification des β-Lactamines

Les β--lactamines sont classées dans quatre familles : pénicillines, céphalosporines,

monobactames et carbapénèmes (Bryskier, 1999).

Les pénicillines :

- La benzylpénicilline a été la première pénicilline utilisée. Cette β-lactamine et ses dérivés

(pénicilline du groupe G) possèdent un spectre antibactérien qui couvre les cocci à Gram positif et

négatif et les bacilles à Gram positif. L’apparition de souches de Staphylococcus aureus

productrices de pénicillinases a nécessité la synthèse de molécules stables à l’hydrolyse par cette

enzyme.

- Les isoxazolyl-pénicillines (pénicilline du groupe M) possèdent des modifications structurales qui

permettent une augmentation de la stabilité à l’hydrolyse par les pénicillinases mais qui entraînent

souvent une diminution de l’activité antibactérienne.

- Les amino-pénicillines (pénicilline du groupe A) possèdent une activité sur les bacilles à Gram

négatif. L’ampicilline et l’amoxicilline appartiennent à ce groupe. L’amoxicilline ne diffère de

l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une meilleure biodisponibilité par

voie orale que l’ampicilline. La pivampicilline fait partie d’un groupe d’ester de l’ampicilline qui

libère l’ampicilline suite à l’action des estérases digestives extra- et intracellulaires. Ces prodrogues

ont été développées pour améliorer la biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale

(Ferres, 1983).


15

- Les uréido-pénicillines et les carboxy-pénicillines possèdent un spectre élargi à certains bacilles

à Gram-négatif. Elles sont actives sur Pseudomonas aeruginosa et sur certaines souches

productrices de céphalosporinases. Elles sont réservées à la médecine humaine (Bibbal, 2008).

Les céphalosporines :

Les céphalosporines diffèrent chimiquement des pénicillines par le remplacement du cycle

thiazolidine par un cycle dihydrothiazine. Elles possèdent en effet pour structure commune l'acide

7-amino céphalosporanique. Par rapport à l'acide 6-aminopénicillanique, ce noyau possède un

carbone supplémentaire mais la distance séparant la fonction carboxylique de l'amide cyclique reste

conserver. Un élément important est la possibilité de substitution en C3 par des groupements

électrocapteurs. Ceux-ci permettront une meilleure délocalisation des électrons au niveau du cycle

bêta-lactame, rendant en principe les céphalosporines plus actives vis-à-vis des trans-peptidases en

comparaison des pénicillines. Ceci ne se traduit cependant pas toujours par un avantage clinique.

Grand nombre de céphèmes orales sont administrées sous forme de prodrogues afin d’augmenter

leur résorption. Les céphalosporines sont habituellement classées en fonction de leur spectre

d'activité, leur résistance aux β-lactamases, ainsi que de leur date de commercialisation. Et on

distingue les céphalosporines de première, deuxième, troisième et quatrième génération :

- Les céphalosporines de première génération : Elles présentent un spectre antibactérien commun

avec celui des pénicillines M et A et sont surtout utilisées contre les cocci Gram positif, à

l’exception des entérocoques et de certains staphylocoques résistants. Citons notamment le céfaclor,

la céfadroxil, la céfazoline, ou la céfatrizine qui constituent un premier choix dans la prophylaxie

chirurgicale.

- Les céphalosporines de deuxième génération : comprenant la céfuroxime, le céfamandole et la

céfoxitine qui sont caractérisées par une meilleure résistance aux -lactamases et un spectre d'action

plus large (Haemophilus influenzae et certaines entérobactéries), une activité à faible concentration

ainsi qu’une bonne diffusion tissulaire. Elles sont utilisées dans un grand nombre d'infections,

notamment respiratoires, urinaires et ostéo-articulaires.

- Les céphalosporines de troisième génération : telles que le céfotaxime, la ceftriaxone, la

ceftazidime. Elles sont moins efficaces que celles de première génération sur les germes Gram

positif mais beaucoup plus que celles de deuxième génération sur les entérobactéries. Certaines de

ces molécules sont particulièrement actives contre le bacille pyocyanique (Pseudomonas

aeruginosa). Leur prescription est généralement réservée aux infections sévères dues à des bacilles

Gram négatif. De même, elles sont utilisées avec un certain succès dans le cas des infections

nosocomiales. Elles sont actives à plus faible concentration et résistent mieux aux β-lactamases.


16

- Les céphalosporines de quatrième génération : avec la cefpirome et la céfépime qui pourraient

remplacer les céphalosporines de 3e génération pour le traitement des infections à germes résistants.

Elles possèdent un spectre large, leur activité est améliorée sur les germes Gram positifs et sont plus

stables face aux -lactamases. De nombreuses céphalosporines ne sont pas résorbées par voie orale

et doivent donc être administrées par voie parentérale. Comme pour les pénicillines, les

céphalosporines présentent une courte demi-vie (à l'exception de la ceftriaxone) et doivent être

administrées de façon régulière (Wise, 1990). Ceci est d'autant plus important que le principal

paramètre d'efficacité soit le temps au delà duquel la concentration sérique est maintenue supérieure

à la concentration minimale inhibitrice.

Les monobactames :

À la fin des années 1970, toutes les nouvelles bêta-lactamines identifiées étaient produites par

les Actinomycètes. Sykes et al., (1981) entreprennent alors la recherche de nouveaux antibiotiques

produits par d’autres organismes dont les monobactames. Ces derniers sont des bêta-lactamines

monocycliques inactives sur les bactéries à Gram positif et les anaérobies. Ces antibiotiques sont en

revanche très actifs sur les entérobactéries et P. aeruginosa. L’activité anti Gram-négatif de

l’aztréonam, chef de file de cette classe est globalement comparable à celle des céphalosporines de

3ème génération comme la ceftazidime. L’aztréonam présente une bonne stabilité vis-à-vis des

bêta-lactamases de spectre restreint. De plus, les monobactames constituent les seules beta-

lactamines non hydrolysées par les métallo--lactamases sécrétrices (Figueiredo, 2012).

Les carbapénèmes :

Les carbapénémases sont des β-lactamases ayants une activité hydrolytique vis à vis des

carbapénèmes. Ces enzymes appartiennent à trois classes selon la classification d’Ambler

(Nordmann et Carrer, 2010) :

- la classe A correspond principalement aux enzymes de type KPC, IMI et GES. Elles ont la

particularité de voir leur activité in vitro totalement ou partiellement inhibée par l’acide boronique

et l’acide clavulanique. Elles hydrolysent toutes les β-lactamines.

- la classe B correspond aux métallo-β-lactamases de type VIM, IMP et NDM. Ces enzymes

hydrolysent très fortement toutes les β-lactamines à l’exception de l’aztréonam. Leur activité in

vitro n’est pas affectée par les inhibiteurs suicides de β-lactamases (acide clavulanique et

tazobactam). Ce sont des métallo-enzymes qui contiennent un ion zinc dans leur site actif

expliquant l’inhibition de leur activité par l’EDTA (chélateur des cations divalents) ou l’acide

dipicolinique.


17

- la classe C correspond essentiellement aux enzymes de type oxacillinases (OXA-48, OXA-163,

OXA-181). Ces enzymes hydrolysent fortement les carbapénèmes mais pas ou peu les

céphalosporines de 3ème génération. Elles sont résistantes aux inhibiteurs suicides de β-lactamases

(acide clavulanique et tazobactam). Toutefois, leur présence est souvent couplée à la présence d’une

β-lactamase à spectre étendu (BLSE), ce qui conduit à une multirésistance des souches (Boutet-

dubois et al., 2012)

c. Inhibiteurs des -lactamases :

Les inhibiteurs des β-lactamases possèdent une faible activité antibactérienne intrinsèque. En

se liant à la β-lactamase, ils permettent l’activité de la β-lactamine à laquelle ils sont associés. Il en

résulte une action synergique et une augmentation de l’activité de la β-lactamine. Actuellement,

sont disponibles l’association :

- Amoxicilline-acide clavulanique (Augmentin) (Andre et al., 1998).

- Pipéracilline-tazobactam (Tazocillin)

- Sulbactam : En plus de son effet inhibiteur irréversible sur les β-lactamases, le sulbactam a une

activité antibiotique intrinsèque sur quelques germes, mais il est toujours utilisé en association avec

les antibiotiques détruisent par les β-lactamases.

- Sulbactam+ampicilline estérifiée : Unacim (Allain, 2008).

d. Mécanisme d’action des β-lactamines

Les bêta-lactamines agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne par le biais d’une

liaison à des cibles moléculaires spécifiques appelées les protéines liants les pénicillines (PLP). Le

peptidoglycane est un polymère réticulé, fait de chaines polysaccharidiques reliées par des peptides.

Ses précurseurs sont synthétisés dans le cytoplasme et assemblés à l’extérieur de la membrane

cytoplasmique. Lorsque les bactéries sont en phase de croissance, il existe simultanément des

phénomènes de synthèse et de destruction du peptidoglycane. L’équilibre entre ces deux

phénomènes est rompu par les antibiotiques inhibant la synthèse du peptidoglycane (Nauciel,

2001).

Le blocage de la phase finale de polymérisation représente le mode d’action des β-lactamines.

Chez les bactéries à Gram négatif, les β-lactamines doivent traverser la membrane externe pour

atteindre leurs cibles. Cette membrane agit comme une barrière hydrophobe et les β-lactamines, qui

sont le plus souvent des molécules hydrophiles, vont traverser cette barrière essentiellement par la

voie des porines (Cavallo et al., 2004) Après avoir traversées la membrane externe des bactéries à

Gram négatif, les β-lactamines diffusent facilement à travers le peptidoglycane, se trouvant ensuite

dans l’espace périplasmique.


18

Le β-lactamines présente une analogie structurale entre leur noyau β-lactame et le dipeptide

terminal D-alanine-D-alanine du pentapeptide constitutif du peptidoglycane. Leur reconnaissance

par les trans-peptidases et les carboxypeptidases (PLP) aboutit à la fixation du cycle β-lactame sur

le site actif de ces enzymes. Cette fixation entraîne la formation d’un complexe pénicilloyl-enzyme

covalent provoquant l’inactivation de l’enzyme, l’inhibition de la synthèse du peptidoglycane et

enfin l’arrêt de la croissance bactérienne (Livermore, 1995).

I.4.1.2. Les quinolones

a. Définition

Les quinolones sont des molécules obtenues par synthèse chimique, qui dérivent d’acides

carboxyliques hétérocycliques diversement substitués. Toutes les quinolones actuelles présentent

une structure bicyclique, avec un azote en position 1, un carboxylate en position 3 et un carbonyle

en position 4. Les fluoroquinolones, ainsi appelées car contenants un atome de fluor en position 6,

dérivent de la quinoléine (Thomas, 2001).

b. Classification des quinolones

- Quinolones de première génération (A. nalidixique)

- Quinolones de deuxième génération (ofloxacine, ciprofloxacine, lévofloxacine, …)

- Quinolones de troisième génération (trovafloxacine, gémifloxacine, moxifloxacine)

- Quinolones de quatrième génération : des fluoroquinolones (garénoxacine) (Lafaurie, 2008).

c. Mécanisme d’action des quinolones

Les quinolones sont des antibiotiques bactéricides qui bloquent la réplication de l’ADN.

Avant d’atteindre leur cible, elles traversent les diverses structures membranaires de manière

passive. Elles se concentrent dans le cytoplasme où elles se lient à une topo-isomérase. Les

topoisomérases sont des enzymes qui modifient la topologie de l’ADN bactérien. Au cours du cycle

de réplication de l’ADN, le chromosome bactérien est soit surenroulé, soit relâché. Les

topoisomérases sont les enzymes qui permettent le passage d’un état à l’autre, en coupant l’ADN et

en le recollant. Les quinolones vont se fixer sur le complexe ADN-topo-isomérase en inhibant son

fonctionnement. La bactéricide s’expliquerait par la stabilisation des coupures d’ADN qui

déclencherait des phénomènes d’autolyse. Les deux enzymes cibles principales sont l’ADN-gyrase

et la topo-isomérase IV (Jehl et al., 2003 ; Gaudy et Buxeraud, 2005 ).

I.4.1.3. Les aminosides

a. Définition :

Le premier aminoside a été découvert en 1944 par Waksman (le premier à avoir défini les

antibiotiques), a été nommé streptomycine et a été utilisé contre la tuberculose. Cette molécule est

isolée de souches de Streptomyces griseus. Les aminosides sont principalement produits par


19

Streptomyces (molécule se terminant par -myxine) ou Micromonospora (molécule se terminant par

-micine) qui sont tous les deux des actinomycètes (bactéries). Il faut préciser que quelques

aminosides, découverts dans les années 70, sont hémi-synthétiques (amikacine et netilmicine). Ils

possèdent un spectre d’activité antibactérien large justifiant que certaines spécialités soient

réservées à l’hôpital pour combattre les infections bactériennes sévères. Les principaux

inconvénients de cette classe d’antibiotiques sont leur ototoxicité et leur néphrotoxicité (Dorosz

et al., 2011).

b. Classification des aminosides:

Ils sont divisés en trois classes :

1 - Les déoxystreptamines bisusbstituées 4-5 qui comprennent: Néomycine B ou C, Paromomycine,

Lividomycine A ou B, Ribostamycine, Framycétine.

2 - Les déoxystreptamines bisubstituées 4-6 qui comprennent: Kanamycines A, B, C et dérivés,

Amikacine, Tobramycine, Dibékacine, Gentamicine, Sisomycine, Nétilmicine.

3 - Les autres : Streptomycine, Streptidine, Spectinomycine (Ezaitouni et al., 1999).

c. Mécanisme d’action des aminosides

L’activité anti-bactérienne des aminosides se décompose en plusieurs phases : une

accumulation intracellulaire (en trois phases) précède la fixation sur la cible (Casin et Collatz,

1997).

La première étape de la pénétration intracellulaire se fait par diffusion passive à travers du

peptidoglycane. Elle est rapide et non spécifique.

Les deux étapes suivantes (Phase énergie dépendante « EDP I et II» sont des transports actifs à

travers la membrane cytoplasmique. Ils nécessitent un apport d’énergie, et donc la présence d’ATP

et d’une chaîne respiratoire. EDP I permet une lente accumulation dans le cytoplasme. La fixation

progressive de la molécule sur sa cible entraîne une accélération du transfert de l’antibiotique au

travers de la membrane cytoplasmique, EDP II est donc une phase d’accumulation rapide. Ces deux

phases de transports actifs reposent sur l’existence d’un gradient électrique transmembranaire, qui

est modifié par certains paramètres biochimiques de l’environnement bactérien, tel le pH, la

présence d’O2…

La phase d’accumulation rapide permet la saturation des récepteurs ribosomaux de ces

molécules. Elles se fixent sur l’ARN 16S de la sous-unité 30S du ribosome bactérien, interférant

dans la synthèse protéique au niveau du site A (site accepteur de l’ARNt). Il y a donc inhibition de

la synthèse au stade d’initiation et d’élongation, avec synthèse de protéines non fonctionnelles,

voire létales.


20

I.4.1.4. Les phénicoles (Coumbes, 1995 ; Drame, 1999).

a. Définition :

Ce sont des antibiotiques bactériostatiques à large spectre qui couvrent une grande variété de

germes à Gram positif et à Gram négatif.

b. Classification :

Nous distinguons dans ce groupe le chloramphénicol et le thiamphénicol.

c. Mécanisme d’action des phénicoles

Les phénicoles agissent en inhibant la synthèse protéique en se fixant au niveau de la sous

unité 50 S des ribosomes et empêchant la transpeptidation de l’ARN de transfert.

I.4.1.5. Les antibactériens de synthèse

Parmi les molécules synthétisées, nous citerons principalement les oxyquinoleines et la

notroxoline. L’association sulfamétoxazole-trimétoprime possède un large spectre permettant

d’exercer un effet bactéricide. Ainsi, le cotrimoxazole inhibe la synthèse des acides nucléiques en

agissant sur les deux enzymes principales de la voie de synthèse des bases puriques, le

sulfaméthoxazole inhibe le dihydrofolate synthétase (DHS) et le triméthoprime inhibe la

dihydrofolate réductase (DHR).

I.4.2. Schéma de traitement des infections urinaires

Les différents traitements des infections urinaires sont présentés dans les tableaux 2 et 3.

Tableau2 : Le traitement de la cystite aigüe (Vorkaufer, 2011)

1er

intention 2eme

intention

Cystie aigüe simple/

Cystite récidivante

Fosfomycine–

Trometamol

Dose Unique

Nitrofurantoine : 100mg (3/j pendant 5j)

Fluoroquinolones dose unique ou 3/j

Cystite compliquée Nitrofurantoine

100mg (3/j Pendant 7j)

Cefixime ou fluoroquinolones pendant 5j


21

Tableau 3 : Le traitement des pyélonéphrites, prostatites et de la cystite compliquée de l’homme

(Vorkaufer, 2011).

Probabiliste Relais oral

(après antibiogramme)

Pyélonéphrite aigüe

Simple ou compliquée

Ceftriaxone

ou cefotaxime,

par voie injectable,

ou Fluoroquinolone

per os ou IV

(ciprofloxacine ou

levofloxacine ou

ofloxacine)

amoxicilline,

ou amoxicilline- acide

clavulanique,

ou cefixime,

ou fluoroquinolone

(ciprofloxacine, Levofloxacine,

ofloxacine),

ou sulfamethoxazole –

trimethoprime

Prostatite et Cystite

compliquée de l’homme

fluoroquinolone (ciprofloxacine

ou levofloxacine ou ofloxacine),

ou sulfamethoxazole trimethoprime.

I.4.2.1. Infection urinaire de la femme enceinte.

a. Bactériurie asymptomatique

Le traitement est à prescrire en fonction des résultats de l’antibiogramme.

b. Cystite aigüe gravidique

Traitement probabiliste : Céfixime, ou Nitrofurantoine, à réadapté aux résultats de

l’antibiogramme. Durée du traitement 5j (7j pour la nitrofurantoine).

c. Pyélonéphrite aigüe gravidique

Traitement probabiliste : céftriaxone ou céfotaxime, par voie injectable. Relais par voie orale

avec les résultats de l’antibiogramme. Durée totale de traitement : au moins 14 jours. (Vorkaufer,

2011)

I.4.2.2. Traitement d'une infection urinaire à EBLSE :

Les différents traitements sont présentés dans le tableau 4.


22

Tableau 4: Le traitement de la pyélonéphrite simple (SPILF, 2014)

1er

choix 2ème

choix

3ème

choix(en l’absence

d’alternative)

Pyélonéphrite

simple

Fluoroquinolones-S

Fluoroquinolone

(ciprofloxacine,

lévofloxacine, ofloxacine)

Fluoroquinolones-S et TMP-

SMX-S TMP-SMX

Fluoroquinolones-R et

TMP-SMX-R

Amoxicilline+acide

clavulanique Si CMI < 8 mg/l

Pipéracilline+tazobactam Si

CMI < 8 mg/l

Céfotaxime Si CMI < 1 mg/l

Ceftriaxone Si CMI < 1 mg/l

Ceftazidime Si CMI < 1 mg/l

Céfépime Si CMI < 1 mg/l

Céfoxitine si

souche sensible, et

IU à

E. coli

Aminoside

(amikacine,

gentamicine,

tobramycine)

Carbapénème

1er

traitement :

Imipénème,

méropénème

Traitement de relais :

Ertapénème

I.4.3. Résistance d’E. coli aux antibiotiques chez l'adulte

E. coli est naturellement sensible à l'ensemble des pénicillines (exceptées les pénicillines G et

M), des céphalosporines, des carbapénèmes, des quinolones, des aminosides, à la fosfomycine, à la

nitrofurantoïne et au TMP-SMX (SPILF, 2014).

Il existe différents facteurs de risque de résistance aux antibiotiques dont le principal est

l'exposition antérieure aux antibiotiques. Les taux de résistance observés sont étroitement liés a la

quantité d’antibiotiques utilisée (Austin, 1999 ; Sotto, 2001 ; Hillier, 2007). L'exposition à une

famille d’antibiotiques peut sélectionner des bactéries résistantes à d'autres familles d’antibiotiques

par le biais de mécanismes croisés. Les résistances bactériennes se développent tout

particulièrement dans la flore digestive compte tenu de son abondance (109 bactéries /g de selles).

Comme les IU sont d'origine ascendante (espèces bactériennes de la flore périnéale, elle-même


23

reflet de la flore digestive), cette pression de sélection a un retentissement clinique certain (Comes,

2011).

Ceci a été montré dans différents travaux rapportant une prévalence de résistance plus élevée

pour les souches isolées de patients préalablement exposés à des antibiotiques. Ainsi, De Mouy et

al., (1999) ont montré qu’une exposition aux -lactamines ou aux quinolones dans les 6 mois

précédant, une IU augmente le risque de sélection d’une souche résistante à ces antibiotiques. Pour

l'antibiothérapie probabiliste des cystites simples, pathologie bénigne dont le risque d'évolution vers

une PNA est très faible, les antibiotiques utilisables sont ceux dont le taux de résistance est inférieur

à 20% dans la population cible. Pour l'antibiothérapie probabiliste des autres IU (cystite à risque de

complication, cystite gravidique, PNA, IU masculine), un taux de résistance supérieur à 10% n'est

pas acceptable (SPILF, 2014). La fréquence des résistances acquises aux antibiotiques d’E. coli est

présentée dans le tableau 5.

Tableau 5: Répartition des résistances d’E. coli aux ATB les plus fréquemment utilisés dans

le traitement des cystites simples (Afssaps, 2009 ; Soussy et al ., 2000).

Antibiotiques Resistance (%)

Amoxicilline

Amoxicilline - acide clavulanique

Céphalosporines de 3eme

génération

Pivmecillinam

Sulfamethoxazole-trimethoprime

Quinolones de 1ere

generation

Fluoroquinolones

Fosfomycine trometamol

Nitrofurantoine

40 à 50

25 à 30

4

25

20

14

10

< 3

< 5

I.4.4. Les mécanismes de résistances bactériennes aux antibiotiques

Outre les résistances naturelles des bactéries, il existe un nombre important de mécanismes de

résistance développé par les bactéries en réponse à la pression de sélection des ATB. Ces

résistances relèvent d’un mécanisme biochimique dont le support est génétique et elles peuvent être

transmissibles à d’autres bactéries (Andremont et Pression, 2002). Les modes de résistance

connus actuellement résultants de la pression de sélection exercée par les ATB sont au nombre de

quatre :

L’inactivation enzymatique par la sécrétion d’une enzyme

L’efflux actif


24

La modification de la cible

La diminution de la perméabilité (porines) à l’antibiotique

Une même bactérie peut présenter plusieurs de ces mécanismes de résistance (Bevilacqua, 2011).

I.4.4.1. Mécanismes de résistance d’E. coli

a. La résistance aux ß-lactamines

Dans le cas d’E. coli, la résistance aux β-lactamines est due à une inactivation de

l’antibiotique par l’acquisition d’enzymes. Nous avons identifié 6 phénotypes qui sont :

phénotype sensibles (P.S.) : Les souches de ce phénotype sont sensibles aux -lactamines. Il

s’agit des entérobactéries du groupe 1.

phénotype pénicillinase de bas niveau (P.B.N.) : Les souches sont résistantes à

l’amoxicilline et sensibles à l’association amoxicilline + acide clavulanique, à la céfalotine et à la

ceftriaxone.

phénotype pénicillinase haut niveau (P.H.N.) : Les souches sont résistantes à l’amoxicilline,

à l’association amoxicilline + acide clavulanique, à la céfalotine mais sont sensibles à la

ceftriaxone.

phénotype pénicillinase résistante aux inhibiteurs des bêta-lactamases pour TEM résistantes

aux inhibiteurs: Les souches sont résistantes à l’amoxicilline, l’association amoxicilline + acide

clavulanique mais sont sensibles à la céfalotine et à la ceftriaxone.

phénotype céphalosporinase inductible (C.Ind.) : Les souches de ce phénotype sont

résistantes à l’amoxicilline, à l’association amoxicilline + acide clavulanique, à la céfalotine mais

sont sensibles à la ceftriaxone et à la ticarcilline.

phénotype céphalosporinase déréprimée (C.D.) : Les souches sont résistantes à

l’amoxicilline, à l’association amoxicilline + acide clavulanique, à la ticarcilline, à la céfalotine et à

la ceftriaxone mais elles sont sensibles au mécillinam (Keita, 1999).

phénotype -lactamase à spectre élargi (B.L.S.E.) : Les β-lactamases à spectre élargi (BLSE)

constituent un vaste groupe de β-lactamases véhiculées habituellement par des plasmides. Ce type

de β-lactamases confère une résistance à l’ensemble des β-lactamines, à l’exception des

céphamycines (céfoxitine, céfotétan, latamoxef) et des carbapénèmes (imipénème, doripénème,

ertapénème, méropénème). Elles ont la propriété d’être inhibées par les inhibiteurs de bêta-

lactamases dont l’acide clavulanique, à la base même du principe de détection des BLSE. Plus de

200 BLSE ont été décrites, classées en 11 familles en fonction de leur séquence protéique. Les 4

familles majeures sont TEM, SHV, OXA et CTX-M, et sont le plus souvent d’origine plasmidique

(Géraldine, 2010).


25

Caractéristiques moléculaires des BLSE:

Leur apparition s'explique par la mutation des gènes des plasmides de TEM et SHV (Bush et

al., 1995). En effet, une seule mutation sur le plasmide de TEM ou SHV peut provoquer une

modification du site actif de l'enzyme et donc une modulation de l'activité pouvant s'exprimer de

façon variable vis-à-vis des C3G (Paterson et Bonomo, 2005). Cette substitution en acide aminé

ne concerne qu'un nombre restreint de position mais certaines sont particulièrement importantes. Il

a été montré que, pour TEM, les acides aminés les plus mutés sont en position 104, 164, 238 et 240

(Perilli et al., 1997). Les acides substitués sont la lysine, la sérine, la leucine et l'histidine

(Philippon et Arlet, 2005). Cela a une importance car la mutation du gène entraînant une variation

de la structure protéique de l'enzyme synthétisé, l'affinité de l'enzyme pour la -lactamine peut en

être modifiée. Les mutations ne concernent jamais la sérine 70 du site actif (Paterson et Bonomo,

2005). Parfois, la mutation de l'acide aminé sur TEM peut entraîner une baisse de l'affinité de la

- lactamase pour l'ensemble des -lactamines et en particulier pour les inhibiteurs. Ces enzymes de

classe A ont une faible activité en entraînant une faible augmentation des CMI (Philippon et Arlet,

2005).

Par rapport aux -lactamases de type TEM, il existe relativement moins de mutants SHV avec

un nombre de mutations ponctuelles également réduit (Jacoby et Sutton, 1991). La position la plus

substituée est la 238 avec par exemple la SHV-2 sur laquelle la glycine est substituée par une serine.

Ainsi, en fonction de l'acide aminé substitué, la –lactamase développera une meilleure affinité

pour l'une des C3G (Huletsky et al., 1993).

Nouvelles BLSE:

Les BLSE ont une capacité de diffusion et d'évolution importante. Elles sont à l'origine de

nouvelles enzymes plasmidiques et sont en pleine expansion ces dernières années. Ces enzymes

sont appelés non-TEM non SHV avec un phénotype BLSE (Vahaboglu et al., 1996 ). Tout d'abord,

les CTX-M ou « céfotaximases » qui possèdent une capacité importante d'hydrolyser le céfotaxime

et l'aztréonam (Sabaté et al., 2000 ; Tzouvelekis et al., 2000). Par contre, la sensibilité à la

ceftazidime est conservée. Elles sont inhibées de façon plus importante par le tazobactam que par

l'acide clavulanique et elles ont une distribution mondiale (Bradford et al., 1999; Gniadkowski et

al., 1998). Depuis 1989, plus de 20 enzymes ont été mis en évidence chez des entérobactéries

comme Salmonella typhimurium, Escherichia coli et Kiebsiella pneumoniae (Gazouli et al., 1998 ;

Bonnet et al., 2000 ; Sabaté et al., 2000). Il a été montré une homologie à 98% entre les CTX-M

du groupe 1 (notamment CTX-M-2) et la -lactamase chromosomique de Kluyvera ascorbata (gène


26

klu), bactérie de l'environnement, alors qu'il n'existe que 40% d'homologie avec les TEM et SHV

(Bonnet et al., 2000).

De point de vu classification, les premières CTX-M sont classées, selon leur séquence en

acides aminés, en quatre groupes (Philippon et Arlet, 2005):

- Groupe I : CTX-M-2, 4, 5, 6, 7, 20

- Groupe 2: CTX-M- 1, 3, 10, 11, 12, 15

- Groupe 3: CTX-M-9, 13, 14, 16, 17, 19, 21

- Groupe 4: CTX-M-8

Ces -lactamases possèdent une capacité de diffusion et d'évolution importante. En effet,

certaines continuent même de s'élargir pour devenirs actifs sur la ceftazidime, comme les CTX-M-

15 et 16 (Bonnet et al., 2000). D'autre part, les enzymes ayant un haut niveau de résistance à la

ceftazidime et parfois à l'aztréonam sont décrits chez Pseudomonas aeruginosa.. Il est possible de

les retrouver aussi chez Acinetobacter baumannii (Barrial et Scotet, 2006).

b. La résistance aux fluoroquinolones

Comme pour beaucoup d’antibiotiques, la résistance passe par deux mécanismes principaux :

réduction de la concentration intrabactérienne de l’antibiotique et altération de ses enzymes cibles.

Pour ce dernier mécanisme, il s’agit en fait de mutations dans les gènes codants pour l’ADN gyrase

et la topoisomérase IV. Ce type de mutation est stable et diffusé facilement dans le milieu bactérien.

La résistance clinique apparaît selon un mécanisme en marche d’escalier par accumulation de

plusieurs mutations génétiques. Cela peut induire une résistance de classes à l’ensemble des

quinolones, ou à seulement certaines molécules de la famille. Là encore la présence d’un groupe

méthoxy en position 8 comme pour la moxifloxacine et la gatifloxacine, est importante puisqu’elle

réduit la probabilité de sélection de résistants mutants (Dong et al., 1998 ; Zhao et al., 1997 ;

Dalhoff, 2001 ;Van bambeke, 2005 ). Quand à la réduction de la concentration d’antibiotiques

dans la bactérie, elle peut impliquer plusieurs mécanismes, dont des changements dans la membrane

bactérienne externe, comme la modification de structures protéiques appelées porines, qui assurent

une partie des échanges entre l’extérieur et l’intérieur de la bactérie. Ces systèmes d’échange

n’étant pas spécifiques des molécules transportées car l’acquisition de ce type de résistance peut

aussi entraîner une réduction de la sensibilité à d’autres classes d’antibiotiques, notamment les

carbapénèmes (Van bambeke, 2005). La réduction de la concentration de quinolones dans la

bactérie peut également être la conséquence de l’augmentation de sa sortie, par un système dit

d’efflux. Ce mécanisme peut soit rendre en lui-même la bactérie résistante à l’antibiotique s’il est

très puissant, soit permettre à la bactérie de survivre dans une concentration suboptimale

d’antibiotiques ; ce qui à terme favorise l’apparition de mutations génétiques du fait d’une pression


27

majeure de sélection antibiotique jouant alors à son maximum d’efficacité. Il s’agit donc dans tous

les cas d’un mécanisme favorisant la résistance aux quinolones et sa faible spécificité tend à

permettre l’émergence de multirésistance. Enfin, les résistances aux quinolones peuvent aussi être

transmises par des plasmides. Toutefois ce phénomène bien décrit chez Klebsiella sp et E. coli

semble rare pour les autres familles bactériennes, excepté dans certaines régions géographiques

comme l’Asie orientale (Hopper, 2003).

La résistance d’E. coli aux fluoroquinolones a nettement augmenté au cours des 10 dernières

années mais elle est très variable selon le terrain: 3% à 25% aujourd'hui en France, selon la

présentation clinique et le terrain. Chez la femme entre 15 et 65 ans ; la résistance reste proche de

5%.Un traitement par quinolones dans les 6 mois précédents expose au risque de sélection de

souches moins sensibles. Il faut donc éviter les prescriptions répétées de fluoroquinolones chez un

même patient et ne pas les utiliser en traitement probabiliste chez un patient déjà traité par

quinolones dans les 6 mois précédents (quelle qu'en ait été l'indication). L'impact écologique

important des fluoroquinolones sur le microbiote intestinal rend obligatoire une stratégie d'épargne

et limite leur usage à des indications spécifiques (SPLIF, 2014).

c. Résistance aux aminosides

Résistance non enzymatique

Les mécanismes non enzymatiques peuvent être regroupés en trois grands types de

mécanisme : diminution de la perméabilité, efflux et modification de la cible des antibiotiques

(Euzéby, 2008). Les microorganismes producteurs d'aminosides ont développé un mécanisme

supplémentaire de résistance aux aminosides, leurs évitant le suicide: la méthylation post-

transcriptionnelle de l'ARNr (Galimand et al., 2003). La diminution de la perméabilité résulte

souvent d'une mutation affectant la structure des porines ou diminuant la synthèse des porines. Dans

le cas des aminosides, l'imperméabilité résulte d'un mécanisme différent. Elle est due à des

mutations modifiant le système de transport actif de ces molécules et provoquant une diminution

d'activité de tous les aminosides. C'est alors une modification de la membrane cytoplasmique

(Galimand et al., 2003).

Le système d'efflux actif est efficace grâce aux protéines transmembranaires ancrées dans la

membrane plasmique mais également dans la membrane externe des bactéries (Walsh, 2003). Ces

protéines sont spécifiques d'une classe d'antibiotique ou au contraire responsables de la multi-

résistance (Cattoir, 2004). Chez E. coli, le transporteur (Acri) appartenant à la famille "résistance-

nodulation-division"(RND) impliquée dans le transport des aminoglycosides fonctionne seule

(Rosenberg et al., 2000).


28

Les modifications de la cible ribosomale relèvent de trois mécanismes : mutation de l'ARN

16S, mutation des protéines de la sous-unité 30S et méthylation de l'ARN 16S sur certaines bases

impliquées dans la fixation des aminosides au niveau du site A (Jean et Lambert, 2012). Ces

mutations de I'ARN 16S peuvent être responsables de la résistance à la streptomycine ou à la

spectinomycine, tandis que la mutation A1408G rapportée chez les mycobactéries confère la

résistance de type AGNT (Prammananan et al., 1998).

Les bactéries peuvent acquérir une résistance aux aminosides par l’altération de la cible

ribosomale. L‘existence chez la plupart des bactéries de plusieurs copies de l'opéron ARN

ribosomal constitue donc un facteur limitant à l'apparition de la résistance qui nécessite plusieurs

mutations (Jean et Lambert, 2012). Les mutations de certaines protéines de la sous-unité 30S du

ribosome S12 et S16 ont été observées comme responsables respectivement de la résistance à la

streptomycine et à la spectinomycine (Funatsu et Wittmann, 1972), mais cette résistance est

relativement rare (Carter et al., 2000).

La méthylation de l'ARN 16S est un mécanisme émergent qui confère une résistance de haut

niveau à tous les aminosides disponibles utilisés pour la thérapie systémique, à l'exception de

streptomycine. ArmA est la première méthylase responsable de ce type de résistance, porté par un

transposon situé sur un plasmide conjugatif (Galimand et al., 2003) et coder pour une enzyme qui

méthyle la position N7 de la guanine 1405 de l'ARN 16S au niveau du site A (Liou et aI., 2006).

Résistance enzymatique

L'inactivation enzymatique des aminosides est le mécanisme de résistance le plus souvent

observé. Il permet d'expliquer la résistance de plus de 95 % des souches d'entérobactéries résistantes

aux aminosides. Le déterminisme génétique est souvent plasmidique (Perichon et al., 2007). Il

existe trois classes d'enzymes différentes classées en fonction du radical qu'elles ajoutent à la

molécule d'aminoside : les N-acétyltransférases (AAC) qui neutralisent les fonctions N112, les O-

nucléotidyltransférases (ANT), et les O- phosphotransférases (APH) qui neutralisent les fonctions

OH (Doublet et al., 2004).

Ces enzymes sont codées sur des éléments génétiques mobiles, les plasmides, ce qui permet

leur échange entre les bactéries ( Schiessinger, 1988). La famille des phosphotransférases est une

large famille d'isozymes qui est responsable de l'O-phosphorylation. Il y a sept classes d'isozymes

qui catalysent la phosphorylation d'aminoglycosides: l'APH (3'), APH (2"), APH (3"), APH (4),

APH (7"), APH (6) et l'APH (9) (Poole, 2005). L'enzyme la plus étudiée et la mieux comprise de

cette famille est I'APH (3'). Cette enzyme à elle seule confère à la bactérie qui la produit une

résistance à la kanamycine, la néomycine, la paromomycine et l'amikacine (Wright et Thompson,


29

1999). La famille des aminoglycosides acétyltransférases est constituée de 4 isozymes : soit les

AAC (1), AAC (3), AAC (2') et AAC (6) (Vakulenko et Mobashery, 2003).

Ces enzymes catalysent la N-acétylation. Les informations génétiques de ces enzymes sont

codées sur des transposons ou des intégrons. Elle peut aussi acétyler les aminoglycosides

possédants un hydroxyle en 6' (Ishino et al., 2004).La dernière famille d'enzymes ; les

aminoglycosides adényltransférases (ANT) catalyse le transfert catalytique d'un motif adényle entre

le complexe Mg-ATP et l'aminoglycoside .Il y a quatre isozymes ANT (6), ANT (4'), ANT (3"), et

ANT (2 "). Le gène codant pour l'ANT (2") est retrouvé dans la majorité des bactéries à Gram

négatif. Les informations génétiques pour ces enzymes sont localisées sur des transposons et des

intégrons (Vakulenko et Mobashery, 2003).

Phénotypes de résistance des entérobactéries aux -lactamines

Les phénotypes de résistance des entérobactéries aux -lactamines sont colligés dans le tableau 6.

Tableau6 : Phénotypes de résistance des entérobactéries aux β-lactamines (Jehl et al., 2003 ; Hedi,

2007)

a

phénotype conféré par une carbapénémase chez une souche de pseudomonas aeruginosa

I.4.5. Facteurs de risque connus d’infections à entérobactéries productrices BLSE

Devant l’augmentation de l’incidence des infections aux entérobactéries productrices BLSE

nosocomiales et dans la population générale, il est primordial de pouvoir identifier les patients à

risque afin de mieux cibler ceux qui nécessitent un traitement empirique de première intention par

carbapénèmes.


30

1.4.5.1. Facteurs de risque d’infections nosocomiales

De nombreuses études ont été menées depuis ces 15 dernières années afin d’identifier les

facteurs de risque d’infections nosocomiales aux entérobactéries productrices BLSE.

Les plus fréquemment identifiés sont les suivants :

les traitements antibiotiques par céphalosporines et fluoroquinolones ;

les procédures invasives et la présence de matériel étranger, en particulier le sondage vésical

ou la ventilation mécanique et la présence de cathéters centraux ;

les antécédents d’hospitalisation, notamment en unités de soins intensifs ainsi que la durée

de séjour prolongé.

les facteurs liés au statut et comorbidités du patient avec l’âge avancé, la présence des

maladies chroniques (diabète, insuffisance rénale chronique, cirrhose hépatique, pathologie

pulmonaire chronique obstructive). (Rodríguez-Baño et al., 2006 ; Pena et al., 2006 ;

Lavigne et al., 2007 ; Trecarichi et al., 2012).

I.4.6. Les moyens de lutte contre E. coli BLSE

Les moyens de lutte contre E. coli BLSE recommandés par le haut conseil de santé publique

sont (Mondain, 2010) :

Surveillance épidémiologique : étudier la fréquence du portage de E. coli BLSE dans

différents types de population, évaluer l’évolution du nombre des infections, dépister les

entérobactéries BLSE en établissement de soins en cas de situation épidémique ou en cas de

facteurs de risque connus de BLSE : patients d’ Établissements d’hébergement pour personnes

âgées dépendantes, maisons de retraite ou l’unité de soins longue durée, patients ayants reçu une

antibiothérapie, antécédents de traitement par -lactamines ou fluoroquinolones, antécédents

d’hospitalisation, âge élevé, sexe féminin, existence de comorbidités, diabète, infections urinaires

récidivantes, sondage urinaire et chirurgie gynécologique.

Réduction de l’usage des antibiotiques : réduire les volumes utilisés, promouvoir le

recours à des antibiotiques autres que les C3G et les fluoroquinolones, révision des

recommandations concernant les traitements de 1ère intention.

Hygiène : à domicile et dans les collectivités autres que les établissements de santé et les

EHPAD, l’accent sera mis sur l’hygiène des mains, l’hygiène générale autour de la toilette et de

l’alimentation.

Formation :

• Sensibiliser les microbiologistes, recherche systématique de BLSE face à une entérobactérie

résistante, notification dans le compte-rendu du laboratoire.


31

• Faire prendre conscience à la population de l’émergence d’un péril sanitaire.

• A l’hôpital : outre les mesures précitées, mettre en place des mesures de nature à prévenir la

transmission croisée et diminuer la dissémination d’E. coli BLSE dans l’environnement en

contrôlant les effluents.

I.4.7. Préventions

Des mesures simples de prévention peuvent être réalisées au quotidien afin de diminuer le

risque d'IU. Un traitement préventif est par ailleurs envisagé en cas d'IU récidivantes.

a. Mesures préventives non médicamenteuses

Certaines mesures non médicamenteuses sont recommandées, d'autres n'ont pas fait leurs

preuves mais sont classiquement admises :

- boire suffisamment d’eau (> 1,5 l /j),

- éviter de retenir un besoin d'uriner : avoir des mictions régulières et complètes,

- avoir une miction post-coïtale (efficacité non confirmée mais recommandée (AFSSAPS, 2008),

- réguler le transit intestinal : lutter contre la diarrhée ou la constipation,

- avoir une bonne hygiène intime quotidienne avec un savon adapté,

- éviter les douches vaginales,

- éviter les produits parfumes d'hygiène intime,

- s'essuyer de l'avant vers l’arrière,

- préférer des sous-vêtements en coton, pas trop serrés,

- éviter les spermicides et l'utilisation d'un diaphragme en cas d'IU récidivante (Bruyere et al.,

2008)

Chapitre II : Produits naturels et infections urinaires

Les infections urinaires représentent la seconde cause de consultation et de prescription

d’antibiotiques, juste derrière les infections respiratoires. L’apparition depuis quelques années de

résistances aux antibiotiques, augmentant la fréquence des rechutes et diminuant leur efficacité, a

rendu plus urgente la nécessité de trouver des alternatives naturelles. Le D-mannose, la bromélaïne,

les extraits de canneberge, d’hibiscus, de pissenlit et d’orthosiphon agissent de façon synergique

contre les micro-organismes responsables des infections urinaires (Ofek et al., 1982).

II.1. Les plantes aromatiques-médicinales

Les plantes aromatiques-médicinales (PAM) sont des drogues végétales dont au moins une

partie possède des propriétés médicamenteuses (Farnsworth et al., 1986). Environ 35 000 espèces

de plantes sont employées par le monde à des fins médicinales, ce qui constitue le plus large

éventail de biodiversité utilisé par les êtres humains. Les plantes médicinales continuent de


32

répondre à un besoin important malgré l'influence croissante du système sanitaire moderne (Elqaj

et al., 2007)

II.2. Généralités sur les huiles essentielles

II.2.1. Définition des huiles essentielles

Les huiles essentielles (HE) sont des mélanges complexes de substances organiques

aromatiques liquides qu'on trouve naturellement dans diverses parties des végétaux. Elles sont très

concentrées, volatiles, non huileuses et sensibles à la décomposition sous l'effet de la chaleur.

Actuellement, leur utilisation en parfumerie et en alimentation est considérable ; c'est pour quoi

certains organismes de normalisation AFNOR NF et ISO ont donné une définition beaucoup plus

précise des huiles essentielles : l'huile essentielle est un produit obtenu par hydrodistillation et

séparée de la phase aqueuse par des procédés physiques. Cette définition est restrictive : elle exclut

d'une part les produits odorants d'origine animale, et d'autre part les essences obtenues selon d'autre

procédés d'extraction (Hammoudi, 2008).

II.2.2. Répartition

Les huiles essentielles peuvent être stockées dans divers organes, fleurs (origan), feuilles

(citronnelle), écorces (cannelier), bois (bios de rose), rhizomes (acore), fruits (badiane), ou grains

(carvi) (Degryse et al., 2008).

II.3. Composition chimique des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont constituées principalement de deux groupes de composés odorants

distincts selon la voie métabolique empruntée. Il s’agit des terpènes, prépondérants dans la plupart

des essences et des dérivés du phénylpropane, retrouvées en tant que composé majoritaire dans

quelques unes, telles que les essences d’anis, de cannelle, de girofle, etc.… Divers autres

constituants minoritaires leurs sont associés. Les composés terpéniques sont issus d’une voie

métabolique secondaire de l’acide mévalonique. Suivant le nombre entier d'unités pentacarbonés

(C5) ramifiées, dérivées du 2-méthylbutadiène (isoprène) (Ganou, 1993) (figure4).

Figure 4 : Structure de l'unité isoprénique (Crete, 1965 ; Robles et al., 1995)


33

On distingue plusieurs familles (tableau 7)

Tableau 7: Nomenclature des terpènes (Marriott et al., 2001)

Nombre d’atomes Unité d'isoprène Nomenclature

10 2 Monoterpènes (C10)

15 3 Sesquiterpènes (C15)

20 4 Diterpènes (C20)

25 5 Sesterpènes (C25)

30 6 Triterpènes (C30)

40 8 Tétraterpènes (C40)

II.4. Méthodes utilisées pour l’extraction des huiles essentielles

Le procédé le plus ancien consiste à briser les cellules productrices des huiles avec des pierres

ou instruments en bois à la température ambiante pour libérer leurs contenus (Baster et

Buchbauer, 2009). Les méthodes utilisées actuellement sont l’hydrodistillation, la distillation par

entraînement à la vapeur, l’extraction par les solvants volatils, l’extraction au CO2 supercritique et

l’'extraction par micro-onde.

II.4.1. Hydrodistillation

L’hydrodistillation est la technique de référence dans l’extraction des composés volatiles

d’une plante dans le domaine de la recherche. Cependant une verrerie adaptée a été mise en place

permettant à la fois la circulation en circuit quasi-fermé de l’eau sous forme aqueuse et gazeuse et la

cohobation de l’huile essentielle. Ces phénomènes ont étés rendus possibles à l’échelle du

laboratoire grâce à l’utilisation d’un appareillage de type Clevenger (Reverchon et De marco,

2006).

II.5. Activité antimicrobienne

Les huiles essentielles possèdent de nombreuses activités biologiques. En phytothérapie, elles

sont utilisées pour leurs propriétés antiseptiques contre les maladies infectieuses d'origine

bactérienne, par exemple contre les bactéries endocanalaires (Benblaid, 2015), la microflore

vaginale et les dermatophytes (Hammoudi, 2008).

L’utilisation des antibiotiques conduit dans la très grande majorité des cas à la sélection de

populations microbiennes résistantes. Cette résistance est due à des mutations chromosomiques ou à

l’acquisition de gènes de résistance portés par des éléments génétiques mobiles (plasmides, phages,

transposons, intégrons). Ces résistances ont conduit à chercher de nouveaux agents antimicrobiens

possédants une efficacité plus importante que les drogues synthétiques d’une part et bien accepté


34

par l’organisme d’autre part (sans exercer des effets délétères sur la santé humaine) (Kempf et

Zeitouni, 2009).

Beaucoup de groupes de recherches ont étudié l’activité antimicrobienne des extraits de

plantes médicinales telles que fennel (Foeniculum vulgare), peppermint (Mentha piperita), thyme

(Thymus vulgaris). Ils ont trouvé que ces extraits sont actifs non seulement contre les bactéries mais

aussi contre les champignons, les levures et les virus (Jürgen et al., 2009). D’autres groupes de

chercheurs ont franchi une étape plus loin, ils ont isolé et identifié les métabolites responsables de

l’activité antimicrobienne des extraits de plantes, cette étape constitue une plateforme pour

plusieurs implications incluant l’industrie pharmaceutique, la médecine alternative et la thérapie

naturelle (Huang et al., 2008).

II.5.1. Mécanismes de l’action antimicrobienne des huiles essentielles

Les mécanismes par lesquels les huiles essentielles exercent leur activité antibactérienne sont

incomplètement compris, mais il y a un certain nombre de mécanismes proposés (Holley et Patel,

2005). L’action des huiles essentielles sur le développement des micro-organismes peut être

expliquée par l’altération de la perméabilité membranaire des germes en perturbant les systèmes de

transport ionique, le transport des électrons et la production d’énergie (Sikkema et al., 1995).

Smith-Palmer et al., (2001) ont montré que les bactéries à Gram positif sont plus sensibles à l’effet

des huiles essentielles que les bactéries à Gram négatif qui se caractérisent par une membrane

externe imperméable. Selon Cristiani, cette imperméabilité est due à la richesse de cette membrane

en lipo-polysaccharides la rendant plus hydrophile, ce qui empêche les terpènes hydrophobes d’y

adhérer (Cristiani et al., 2007).

D’autres études ont été effectuées sur la relation entre la présence de citral (mélange des

isomères néral et géraniale) dans le zeste des fruits des agrumes et l’inhibition de Penicillium

digitatum, Penicillium italicum et Geotrichum candidum qui sont les principales moisissures

responsables de la contamination des Citrus (Wuryatmo et al., 2003). Cette inhibition est due à la

présence d’un groupement carbonyle adjacent aux carbones α et β dans les aldéhydes insaturés α et

β ; néral et géraniale ; ceci polarise positivement le carbone β et l’aldéhyde peut agir en tant

qu’agent d’alkylation direct capable de lier les groupes nucléophiles cellulaires (Cosentino et al.,

1999).

Le mode d’action de certaines molécules antibactériennes a été décrit dans la littérature. Par

exemple : l’action antibactérienne de l’huile essentielle d’Origan est due à une augmentation de la

perméabilité de la membrane plasmique d’E. coli suivie d’une rupture de celle-ci, entraînant une

fuite du contenu cytoplasmique, (apparition de fuite d’ions potassium K+ des cellules

microbiennes), et donc la mort de la bactérie (figure 5).


35

Figure 5. Cellules d’E. coli avant et après le traitement avec huile essentielle

d’Origan, sous microscope électronique a balayage (Rasooli et al ., 2006)

Le carvacrol et le thymol semblent capables d’augmenter la perméabilité membranaire

(Lambert et al., 2001). En détruisant la membrane externe des bactéries Gram négatives, ils

augmenteraient la perméabilité de la membrane plasmique aux métabolites cellulaires (Helander et

al ., 1998).

II.5.2. Place des plantes médicinales dans la lutte contre les résistances aux antibiotiques

La résistance des microorganismes aux antibiotiques est un sérieux problème de santé

publique d’où l’intérêt de chercher de nouveaux composés antimicrobiens en inhibant un ou

plusieurs mécanismes de résistance. Les nouveaux composés actifs peuvent être recherchés dans les

PAM, car celles-ci constituent une source potentielle de composés antimicrobiens et inhibiteurs des

mécanismes de résistances aux antibiotiques. En effet, de nombreux composés d’origine végétale

ont déjà démontré des propriétés antimicrobiennes (anti-IU) comme la canneberge. Ils agissent

selon plusieurs mécanismes à savoir, la formation de complexes avec des macromolécules telles que

les protéines et les polysaccharides inhibant ainsi leurs fonctions (polyphénols), la rupture de

membranes microbiennes (flavonoïdes lipophiles, terpénoïdes, défensines) et l’inhibition de

l’adhésion de protéines microbiennes aux récepteurs polysaccharidiques de l’hôte (polypeptides).

Les PAM fournissent également des composés qui n’ont pas nécessairement un effet direct sur les

microorganismes, mais qui augmentent ou restaurent l’activité des antibiotiques en inhibant les

mécanismes de résistance. Ces composés appartiennent à diverses classes phytochimiques et

agissent comme inhibiteurs des pompes à efflux (flavonoïdes, terpénoïdes, alcaloïdes), inhibiteurs

des PBP 2a (penicillin binding protein 2a) (quinones, terpénoïdes), provoquant la perméabilité des

membranes bactériennes (terpénoïdes) et inhibiteurs des -lactamases (alkyls gallates). Il y a lieu


36

d’ajouter quelques résultats importants publiés récemment comme la formation de biofilm par les

agents infectieux devenus inaccessibles aux antibiotiques, leur conférant ainsi une résistance. Les

métabolites secondaires de PAM peuvent inhibés les biofilms. Ainsi, les huiles essentielles de

Cymbopogon citratus et Syzygium aromaticum inhibent la formation des biofilms chez Candida

albicans (Khan et Ahmad, 2012). L’extrait aqueux d’un mélange de cinq drogues, présente une

double action, d’une part il inhibe la formation des biofilms chez Pseudomonas aeruginosa et

d’autre part il tue les microorganismes se trouvant dans la matrice (Wang et al., 2011). Une

macrolactone contenant le D-xylose, le L-rhamnose, la pescapréine, a montré un effet inhibiteur sur

les pompes à efflux des MRSA, augmentant ainsi l’action de la norfloxacine (Escobedo Martinez

et al., 2010). La liaison de deux triterpènes, l’acide oléanolique et l’acide ursolique, augmente

l’activité de -lactames vis-à-vis des souches de Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis

et Listeria monocytogenes (Kurek et al., 2012).

II.5.3. Méthodes d’évaluation de l’activité antimicrobienne

Les méthodes d’évaluation de l’activité antimicrobienne des HE les plus couramment utilisées

sont la méthode de diffusion dans l’agar et la méthode de dilution d’agar et de bouillon (Malecky,

2007). Ces méthodes sont relativement rapides, peu coûteuses et n'exigent pas l'équipement de

laboratoire sophistiqué. Cependant, elles ne sont pas sans inconvénients (Wilkinson, 2006) du fait

de la faible solubilité des huiles essentielles dans l’eau, d’où la nécessité d’ajouter des solvants

(dimethylsulfoxide et l’éthanol) ou des détergents (tween 20) au milieu de culture ( Hammer et al.,

1999), et de la volatilité des huiles essentielles pendant l’incubation.

a. Méthode de diffusion dans l’agar ou aromatogramme

L’aromatogramme est basée sur une technique utilisée en bactériologie médicale, appelée

antibiogramme ou méthode par diffusion en milieu gélosé ou encore méthode des disques (Jacob et

al., 1979 ; Abdesselam, 2006 ; Razakarivony et al., 2009). Cette méthode a l’avantage d’être

d’une grande souplesse dans le choix des antibiotiques testés, de s’appliquer à un très grand nombre

d’espèces bactériennes et d’avoir été largement évaluée durant 50 ans d’utilisation mondiale

(Fauchère et Avril, 2002). Elle permet également de déterminer la sensibilité des différentes

espèces bactériennes vis-à-vis des huiles essentielles et autres agents antimicrobiens (Wilkinson,

2006). La technique consiste à utiliser des disques de papier imprégnés des différentes substances à

tester, puis déposés à la surface d’une gélose uniformément ensemencée avec une suspension de la

bactérie à étudier. Après incubation, les colonies se développent à la surface de la gélose laissant

des zones claires autour des disques appelées zones d’inhibition. Plus le diamètre de la zone

d’inhibition est grand, plus la souche est sensible à la substance testée (Conner et Beuchat, 1984).


37

b. Méthode de diffusion en puits

Méthode proposée par Cooper et Woodman en 1946 et reprise par Shroeder et Messing en

1949. Elle assure une diffusion radiale de l’huile essentielle a partir d’un puits en donnant une zone

d’inhibition claire facilement mesurable. La méthode consiste à découper un trou circulaire dans la

gélose et y verser une solution de l’huile essentielle de concentration connue. L’huile essentielle

diffuse radialement en donnant une zone d’inhibition circulaire a la surface de la gélose

préalablement ensemencée avec la suspension bactérienne (Eymard, 2003)

c. Méthode de dilution

Les huiles essentielles à tester peuvent également être directement mélangées en concentration

connue au milieu de culture, qu’il soit solide ou liquide (exige la dispersion homogène par un

émulsifiant). Le milieu est ensuite inoculé à un taux déterminé de microorganismes, après

incubation, on note la présence ou l’absence de culture. La lecture peut-être visuelle ou a l’aide d’un

spectrophotomètre, le degré d’inhibition est en rapport avec la turbidité du milieu (Robert-Demuet,

1995).

d. Méthode de micro-atmosphère

Cette technique consiste à cultiver les microorganismes à tester dans les boites de Pétri sur

milieu de culture approprié. La différence réside principalement dans la position du disque

imprégné d’huile essentielle qui est déposé au centre du couvercle de la boite de Pétri, renversée

après fixation de l’huile essentielle sur le disque. Celui-ci n’est donc pas en contact avec le milieu

gélosé. L’huile s’évapore dans l’atmosphère de la boite, elle peut exercer son effet inhibiteur sur les

microorganismes testés (Pibiri, 2005).

II.5. 4. Méthodes de détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice

Le but des méthodes de dilution en bouillon et en gélose est de déterminer la concentration la

plus faible de l’antimicrobien testé qui inhibe la croissance de la bactérie testée (la CMI,

habituellement exprimée en mg/ml ou mg/L). Cependant, la CMI ne représente pas toujours une

valeur absolue. La « véritable » CMI est un point entre la plus basse concentration qui empêche la

croissance de la bactérie et la concentration inférieure immédiate. Concernant les huiles essentielles,

les techniques de détermination de la concentration minimale inhibitrice CMI sont décrites par

plusieurs études (Bendahou et al., 2008 ; Chaker, 2010 ).

a. La dilution en bouillon

La dilution en bouillon est une technique dans laquelle une suspension bactérienne (à une

concentration optimale ou appropriée prédéterminée) est testée contre des concentrations variables

d’un agent antimicrobien dans un milieu liquide. La méthode de dilution en bouillon peut être

effectuée dans des tubes contenants un volume minimum de 2 ml (macrodilution) ou dans de plus


38

petits volumes à l’aide de plaques de microtitration (microdilution). L’utilisation de ces plaques

avec un protocole documenté, y compris les précisions sur les micro-organismes de référence

appropriée peut faciliter la comparaison des résultats entre analyses.

b. La dilution en gélose

La dilution en gélose implique l’incorporation d’un agent antimicrobien dans un milieu gélosé

à des concentrations variables, en général une dilution en série de 2 en 2, suivie de

l’ensemencement d’un inoculum bactérien défini à la surface de la gélose de la boîte.

II.6. Domaines d’utilisation des HE

II.6.1. Industrie alimentaire

Les HE sont utilisés dans la conservation des denrées alimentaires, elles y sont rajoutées pour

rehausser le goût et pour empêcher le développement des contaminants alimentaires (Lachowicz et

al., 1998; Cosentino et al., 1999 ; Nielson et Rios, 2000 ; Skandamis et Nychas, 2001). Plusieurs

travaux ont montré que les HE de thym, de cannelle, d’origan et d’autres plantes aromatiques ont un

effet inhibiteur sur la croissance et la toxinogenèse de plusieurs bactéries et champignons

responsables d’infections alimentaires (Montes-belmont et Carvajal, 1998 ; Nielsen et Rios,

2000)

II.6.2. Parfumerie et cosmétologie

Un grand nombre d’HE (400 à 500) est utilisé dans l’élaboration de la majorité des parfums et

produits de toilette. Ces essences servent à préserver ces cosmétiques grâce à leur activité

antiseptique tout en leur assurant une odeur agréable (Roulier, 1992). De même, certains

constituants chimiques isolés à partir d’HE peuvent faire l’objet de transformations chimiques

donnant naissance à de nouvelles odeurs; ainsi, à partir de l’eugénol tiré de l’essence de girofle, on

aboutira à l’isogénol qui a une odeur d’œillet (Vigne, 1987).

II.6.3. Désinfection des locaux

Des essences naturelles (de citron et de lilas) à activité bactéricide, acaricide et fongistatique

entrent dans la composition d’un produit, le «paragerm», solution volatile qui s’est révélé sans

toxicité pour l’homme aux doses utilisées (Mallea et al., 1979).

Les HE étant volatiles, on peut envisager leur utilisation en tant qu’agents de préservation

pour le contrôle de l’hygiène de l’air des systèmes de climatisation, notamment dans le milieu

hospitalier, entraînant un effet bénéfique au niveau de la qualité de l’air (De billerbeck et al.,

2002). Les composés majoritaires de certaines HE (thymol et carvacrol) sont utilisés dans certains

pays comme additifs aux déchets animaux afin d’empêcher leur dégradation, qui pourrait générer de

mauvaises odeurs, réduire les agents pathogènes et conserver les nutriments des déchets jusqu’à leur

recyclage comme agents fertilisants (Varel, 2002).


39

II.6.4. Aromathérapie

L’aromathérapie est une branche de la phytothérapie qui utilise les HE pour traiter un certain

nombre de maladies. Beaucoup d’ouvrages décrivent des préparations à base d’HE diverses

prescrites pour le traitement de plusieurs maladies. Cependant, ces prescriptions ne possèdent pas

de bases scientifiques rigoureuses car elles sont souvent tirées de pratiques empiriques (Valnet,

1990). Actuellement, plusieurs publications scientifiques fondées utilisent les HE ou leur composés

majoritaires pour tester leurs effets in vitro (Lima et al., 1993; Viollon et al., 1993; Viollon et

Chaumont, 1994). Ces effets sont également testés in vivo sur des modèles animaux afin de traiter

certaines infections expérimentales d’origine bactérienne provoquées par Helicobacter pylori chez

la souris par exemple (Bergonzelli et al., 2003; Ohno et al., 2003), ou de champignons

opportunistes (Surech et al., 1997; Manohar et al., 2001).

II.6. 5. Médecine dentaire

En médecine dentaire, l’exemple le plus couramment utilisé est la Listerine: solution

constituée d’HE de thymol et d’eucalyptol utilisée pour le lavage de la cavité orale et des dents et

qui possède une activité bactéricide sur les microorganismes de la salive et de la plaque dentaire

(Kato et al., 1990). Plusieurs HE ont donné des résultats cliniques très satisfaisants dans la

désinfection de la pulpe dentaire et dans le traitement et la prévention des caries (Pellecuer et al.,

1980; Sourai, 1989; Schwartz et al., 1992). Plusieurs auteurs ont rapporté les propriétés

antimicrobiennes d’un certain nombre d’HE et de leurs composés majoritaires sur les bactéries de la

cavité orale (Shapiro et al., 1994; Didry et al., 1994 ; Hammer et al., 2003). Une autre équipe de

chercheurs a décrit les propriétés antifongiques de l’HE de l’arbre à thé (Melaleuca alternifolia) sur

les infections oropharyngées chez les patients ayants présentés une résistance aux antifongiques

classiques (Vasquez et al., 2000).

II.7 Les principales voies d’utilisation des huiles essentielles (Baudoux et al., 2006 ;Willem,

2002)

II.7.1. La diffusion atmosphérique

Lors de la diffusion dans l’atmosphère, il faut prendre soin de choisir des huiles essentielles

labélisées biologiques, pures, et adaptées afin d’éviter les allergies et les contre-indications.

Certaines huiles essentielles peuvent être irritantes pour les muqueuses respiratoires. Il faut éviter de

diffuser en continu dans une pièce close et toute la nuit en présence d’une personne qui dort, mais

plutôt une quinzaine de minutes, une à trois fois par jour. Le diffuseur doit être placé de façon à ne

pas projeter directement vers le visage ou les yeux. Il faut utiliser un diffuseur qui ne chauffe pas les

huiles essentielles afin qu’elles ne s’oxydent pas. Cette voie d’administration est préférée dans


40

certaines indications comme pour les huiles essentielles utilisées pour une indication respiratoire

comme l’Eucalyptus globulus, le Pin.

II.7.2. La voie interne

La voie interne peut être utilisée avec beaucoup de précaution.

La voie orale :

L’ingestion ne doit jamais se faire pure : il faut toujours les diluer avec de l’huile végétale ou

par exemple dans du miel car celles-ci ne sont pas solubles dans l’eau et laisser fondre sous la

langue. Il existe des capsules à avaler déjà prêtes avec une base d’huile végétale. Il est préférable de

ne jamais ingérer plus de trois gouttes d’une même huile essentielle plus de trois fois par jour.

La voie rectale :

La voie rectale, avec l’emploi de suppositoires est le mode d’utilisation préconisé dans les

infections broncho-pulmonaires. Cette voie permet une absorption rapide et efficace des principes

actifs des huiles essentielles en évitant le circuit digestif.

La voie gynécologique :

Elle permet une action rapide localement avec l’emploi d’ovules vaginaux fabriqués sur le

même modèle que les suppositoires en aromathérapie.

II.7.3. La voie externe

La voie cutanée :

La voie cutanée peut être utilisée dès trois ans en effleurage. Elle est beaucoup utilisée en

aromathérapie. L’huile essentielle est appliquée pure ou en mélange avec une huile végétale

préférentiellement au niveau des poignets ou du plexus solaire.

Le bain :

On peut également mettre quelques gouttes d’huile essentielle dans un bain. Là encore, la

dilution avec une huile végétale hydrosoluble est recommandée pour éviter tout risque de réaction

cutanée du fait de leur insolubilité et ainsi de leur contact avec la peau en trop grande concentration.

Les huiles essentielles sont toujours insolubles dans l’eau, pour cette raison, il faut utiliser un

dispersant en quantité quatre fois supérieure à celle de l’huile essentielle pour disperser le tout dans

le bain

II.8. Monographie des plantes sélectionnées

II.8.1. Coriandrum sativum

Coriandrum sativum est une plante odorante appartenant à la famille des Apiaceae.

Noms vernaculaires: En Français (coriandre) et en Arabe: kasbour

Nom scientifique: Coriandrum sativum L. (figure 6).


41

Figure 6: Photo de Coriandrum sativum

Composition chimique: la composition chimique de l’HE de C. sativum est donnée dans

le tableau 8.

Tableau 8 : Composition chimique de l’huile essentielle de Coriandrum sativum (Craker et al.,

2004)

Constituants %

Heptanal

α-pinene

Camphene

Sabinene

β-pinene

Myrcene

ρ-cymene

Limonene

γ-terpinene

Linalool

Camphor

Borneol

Terpine-4-ol

Decanal

Geraniol

2-decenal

Geranyl-acetate

Tetradecane

2.06

3.97

0.33

0.26

0.38

0.77

2.16

1.28

4.64

77.48

2.60

0.18

0.17

0.46

0.46

0.16

1.06

0.05

Utilisations traditionnelles : Les grains de coriandre sont traditionnellement utilisés dans

le traitement symptomatique des troubles digestifs tels que : ballonnement épigastrique, lenteur de

la digestion, éructations et flatulences, la toux, le dysfonctionnement vésiculaire, la fièvre,

(Bruneton, 2009) et contre les infections urinaires (Verbeke, 2006 ; Ghourri et al., 2014).


42

Usage et propriétés pharmacologie

Utilisations principales : eupeptique, spasmolytique, antimicrobien, carminatif. Le coriandre aurait

aussi des propriétés hypolipémiantes et hypoglycémiantes.

Utilisations secondaires : En usage externe ; elle entre dans la composition de pommades contre

les rhumatismes et douleurs articulaires.

2.8.1. Ziziphora hispanica:

Ziziphora hispanica est une plante odorante appartenant à la famille des lamiacées.

Noms vernaculaires: en Français: Menthe pouliot (Boullard, 2001) et en Arabe: Fliou

Nom scientifique: Ziziphora hispanica L. (Quezel et Santa, 1963) (figure 7).

Figure 7: Photo de Ziziphora hispanica

Composition chimique: La composition chimique est donnée dans le tableau 9.

Tableau 9: Composition chimique de l’HE essentielle de Ziziphora hispanica (Bekhchi et al.,

2007)

Constituants % Constituants %

α-pinene 0.52 (3Z,5E)-1,3,5-undecatriene 0.41

Cyclohexanone-3-methyl 0.24 1-Dodecene 0.36

Sabinene 0.11 α-terpineol 0.71

β-pinene 0.5 Pulegone 78.6

β-myrcene 0.3 Piperitenone 2.9

Isolimonene-trans 0.1 8-hydroxy-p-menthan-3-one 2.24

Limonene 1.4 1,3-Dimethyl pyrogallate 0.98

Iso menthone 0.11 α-copaene 0.2

1,8-Cineole 0.1 β-bourbonene 0.1

(-)-L-Isopulegol 0.1 β-caryophyllene 0.4

Camphor 0.06 γ-cadinene 0.1

Trans-isopulegone 1.09 Mint furanone-2 0.59

Menthofuran DB5-785 1.26 Caryophyllene oxide 0.11

neo-Menthol

0.05 2-Pentenoic acid, methyl ester,

(E)

0.18


43

Utilisations traditionnelles

Le décocté, le macérât et la poudre végétale de la partie aérienne de cette plante, sont

préconisés pour les douleurs d'estomac. Cependant le décocté est utilisé pour la céphalée, les

douleurs abdominales, la toux, l'ictère et l’infection urinaire. Aussi, la poudre végétale de la partie

aérienne est utilisée sous forme de cataplasme pour soulager les douleurs de la céphalée (Ozturk et

Ercisli, 2007; Zargari, 1995)

Cinnamomum cassia

Cinnamomum cassia est une plante odorante appartenant à la famille des Lauraceae.

Noms vernaculaires: en Français: cannelle de Ceylan, cannellier de Ceylan et en Arabe: quirfa,

Nom scientifique: Cinnamomum cassia (Wichtl et Anton, 2003) (figure8).

Figure 8 : Photo de Cinnamomum cassia

Constituants chimiques : La composition chimique est cosignée dans le tableau 10.

Tableau 10 : Constituants chimiques de l’HE de C. cassia (Geng et al., 2011)

Les composés principaux %

L'aldéhyde trans-cinnamique

L'acétate de cinnamyle

L'eugénol

La coumarine

Le trans-2méthoxycinnamaldéhyde

70 - 90

1 - 6

≤ 0.5

1.5 - 4.0

3.0 - 15

Utilisations traditionnelles

La drogue est surtout utilisée comme aromatisant, correcteur de gout et comme épice. L’huile

essentielle est utilisée dans les dysménorrhées et comme hemostyptique (Bruneton, 2009) et contre

les infections urinaires (Verbeke, 2006 ; Ghourri et al., 2014), La drogue est également utilisée

dans les bronchites chroniques , comme stimulants de l’appétit (Bruneton, 2009 ), troubles

digestifs tels que ballonnements épigastriques (Bruneton, 2009).

Matériels et

méthodes

Matériels et méthodes

44

Partie II : Matériels et méthodes

II.1. Matériel microbien

II.1.1. Souches de références

Dans ce travail nous avons utilisé des souches de référence ATCC (American Type Culture

Collection) conservées à LAMAABE : Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Escherichia coli

ATCC25922, Proteus mirabilis ATCC 35659 et Klebsiella pneumoniae ATCC 70603.

II.1.2. Souches d’origine clinique

Des prélèvements cliniques (urines) ont été réalisés de mai 2011 à juin 2013 sur des patients

hospitalisés plus de 48h dans trois services à risque du Centre Hospitalo- Universitaire (CHU) de

Tlemcen à savoir les services d’urologie, de médecine interne et de maternité.

II.2. Méthodes

II.2.1. Prélèvements

Les prélèvements et l’acheminement des échantillons ont été effectués selon les

recommandations du CTIN et du CLIN (1998). Après une désinfection soigneuse du méat urétral au

savon, les urines sont recueillies dans des pots stériles après élimination du premier jet. Les

échantillons sont transportés dans une glacière et traités dans les plus brefs délais au laboratoire.

Chaque prélèvement est accompagné d’une fiche de renseignement comportant le sexe, l’âge, le

service d’hospitalisation et la durée du séjour (voir annexe 1 : Enquête sur les infections urinaires).

II.2.2. Bandelette urinaire

L’intérêt essentiel du diagnostic par les bandelettes urinaires (leucocytes et nitrites) réside dans

sa facilité de réalisation et dans sa valeur prédictive négative. Elle permet de confirmer une

infection urinaire par une activité de leucocytes et de nitrites. Pour cela, des bandelettes (Aragen)

sont trempées dans des urines fraîchement émises et dans des conditions aseptiques. La lecture doit

se faire 1 ou 2 minutes après le trempage par comparaison avec une gamme étalon de couleur

accompagnant la boite contenant les bandelettes (Champetier et al., 1998).

II.2.3. Examen bactériologique des urines

Le but de l’examen bactériologique des urines et de rechercher les entérobactéries à Gram

négatif.

a. Examens direct et macroscopique : Cet examen permet d’apprécier la leucocyturie,

l’aspect de l’urine (couleur, odeur, consistance……) et les éléments figurés de l’urine (hématies,

sédiments………) (Darbas et al., 2007).

b. Examen bactériologique : La culture quantitative des urines contribue à définir l’infection

urinaire. Dans des tubes, on a fait des dilutions de l’urine avec de l’eau physiologique stérile à 9%


45

pour obtenir des dilutions de 10-1

à 10-4

. Puis 1 ml de chaque dilution est ensemencé sur gélose

nutritive. La boite de Pétrie est laissée sécher pendant 30min à la température ambiante puis

incuber pendant 24h à 37 °C. Après incubation, les boites considérées sont celles contenants entre

30 et 300 colonies. Le nombre ainsi déterminé est multiplié par la dilution donnant le nombre de

bactéries par millilitre d’urine (Veron et Kazmierczak, 1971).. Urine est infecté si le nombre de

bactéries significatif d’une infection urinaire est >10 5 UFC/ml (Corroyer-simovicet Faure, 2011).

c. Isolement, purification et identification : L’isolement des entérobactéries Gram négatif a

été réalisé par repiquage successif sur bouillon nutritif et sur le milieu Mac conkey (Fluka) puis

incuber 18 à 24 h à 37°C. Les souches purifiées par repiquage successif sur GN sont ensemencées

sur de la GN inclinée puis conservée à 4°C. L’identification des souches est contrôlée après

vérification de leur pureté par :

l’étude des caractères macroscopiques ;

l’étude des caractères microscopiques (forme des colonies, mobilité, coloration de Gram)

l’étude des caractères biochimiques (API 20E Biomerieux®, France).

II.2.4. Antibiogramme

Un antibiogramme a été réalisé pour chaque souche isolée par la méthode de diffusion à partir

de disques chargés sur gélose de Muller Hinton selon les recommandations du Clinical Laboratory

Standards Institute (CLSI, 2008). Les géloses ont été ensemencées à l'aide d'un écouvillon à partir

d'une suspension bactérienne à 0.5 Mac Farland (une densité optique égale à 620 nm). Des disques

d'antibiotiques ont été déposés à la surface des géloses.

Les antibiotiques utilisés (oxoid) sont :Amoxicilline (25 µg), l'amoxicilline / acide clavulanique (30

µg), ticarcilline (75 µg), acide ticarcilline / acide clavulanique (85 µg), pipéracilline (75µg),

pipéracilline/tazobactam(85µg), céphalotine (30µg),céfotaxime (30 µg), la ceftazidime (30 µg),

céfépime (30 µg), l'imipénème (10 µg), l'aztréonam (30 µg), la céfoxitine (30 µg), la gentamicine

(15 µg), l'amikacine (30 µg) l'acide nalidixique (30µg), la ciprofloxacine (5 µg).

II.2.5. Détection des E.coli BLSE (Test de synergie)

Le test consiste à rechercher une image de synergie entre un disque d’antibiotique contenant un

inhibiteur de ß-lactamases et un disque de céphalosporine de 3ème

génération (CTX, CAZ). Cette

image est dite « bouchon de champagne » (Philippon et Arlet, 2005).

La recherche de ß-lactamases à spectre étendu se fait dans les conditions standards de

l’antibiogramme, en disposant 2 disques : amoxicilline + acide clavulanique (AMC) et une

céphalosporine de 3ème

génération (CTX) à une distance de 20 a 30mm sur gélose Mulleur Hinton.

L’incubation se fait à 37°C pendant 18h (figure 9).


46

Figure 9: Réalisation d’un test de synergie (El Brahmi, 2013)

La production de BLSE se traduit par l’apparition d’une image de synergie ou bouchon de

champagne entre le disque AMC et C3G.

II.2.6. Détermination de la CMI sur microplaque (CLSI, 2008)

Des microplaques à fond en U (plaque à microtitration) ont été utilisées pour la détermination

des CMI. Une plaque à 96 puits permet la détermination des CMI des souches E.coli BLSE vis-à-

vis de la céfotaxime.

II.2.6.1. Technique :

Dissoudre 2,048 mg de poudre titrée d’antibiotique dans le volume adéquat du solvant

correspondant (Léau distillé), pour obtenir une solution mère à 2048 μg/ml.

Introduire 25 μl de solution de céfotaxime de façon à avoir des concentrations intermédiaires

allant de 512 μg/ml a 0,063 μg/ml

Ajouter la suspension bactérienne standardisée : A partir d’une culture pure de bactéries en

phase exponentielle, une colonie est introduite dans 5 à 10 ml d’eau physiologique stérile

(ou de bouillon MH), de telle sorte que l’inoculum sera ajusté à une turbidité standard de 0,5

McFarland correspond à une densité optique de 0,08‒0,1 à une longueur d’onde de 625 nm.

Ceci correspond approximativement à 108

CFU/ml. Diluer la suspension d’opacité 0,5 MF

au 1/10ème. Inoculer les cupules de la microplaque avec 5 µl de suspension bactérienne

afin d’obtenir une concentration finale de 5.105 CFU/ml. Pour chaque série, réaliser un

témoin sans antibiotique.

Ajouter dans chaque cupule 5 μl de la suspension bactérienne ajustée à 108 bactérie/ml

(Larif et al., 2013)

Répartir dans les cupules 70μl de bouillon MH, la concentration d’antibiotique obtenue va

ainsi de 512 μg/ml à 0.063 μg/ml.


47

Recouvrir la plaque d’un couvercle et incuber à 37º C pendant 24h

Après incubation, voir l’opacité ou le dépôt au fond de la cupule.

la CMI de chaque antibiotique correspond à la 1ère cupule ‘claire’ (pas de culture par

rapport au témoin sans antibiotique).

II.2.7. Typage moléculaire d’E. coli BLSE

La caractérisation moléculaire des souches d’E. Coli BLSE responsables d’IU a été réalisé au

laboratoire de Bactériologie Moléculaire de l’Institut Pasteur à Casablanca (Maroc). Les gènes de

résistance aux β-lactamines (bla CTX-M1, bla CTX-M2, bla CTX-M9 , bla CTX-M14 , bla CTX-M15 , bla CTX 28,

blaTEM-1 et bla SHV-12), aux aminosides (armA,rmtB,rmtA et rmtC ), aux quinolones (aac6’-Ib-cr,

qnrA, qnrB, qnrS), les AmpC (MOX ,FOX ,CMY,EBC,DHA et CIT), les gènes de virulence (pap,

hly,sfa et Cnf) et le groupement phylogénétique ont été identifiés par réaction d’amplification

génique de type PCR simplex ou multiplex (Guessennd et al., 2008 ; Perichon et al., 2007 ;. Doi

et al., 2004 ; Nordmann et al., 2010, Versalovic et al., 1991 ; Farshad et Emamghorashi ,

2009) cette dernière nécessite tout d’abord une étape d’extraction d’ADN qui sera suivi d’une

caractérisation et quantification des différents types des gènes.

II.2.7.1. Extraction d’ADN bactérien :

L’extraction de l’ADN bactérien a été effectuée par la technique de choc thermique. A partir

d’une culture jeune de 18 à 24 heures à 37°C sur gélose ordinaire, quelques colonies sont mises en

suspension dans 500 µL d’eau ultra-pure (eau de biologie moléculaire, dépourvue d’ADNase et

ARNase) et portées à ébullition pendant 10 min puis transférées directement dans la glace (0°C)

pendant 5 min. Après une centrifugation de 14500 trs/min pendant 10 min, 300µL du surnageant

riche en ADN sont récupérés et conservé à -20 °C .

II.2.7.2. PCR standard :

Les réactions d'amplification des gènes codants pour les β-lactamases ont été réalisées avec des

couples d'amorces spécifiques. A chaque réaction de PCR standard nous avons utilisé un ADN

d’une souche produisant le gène à tester comme témoin positif.

La réaction PCR permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné

afin d'obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. Pour se faire une série de réactions

permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de

la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle

suivant. L’amplification est donc exponentielle.

Pour avoir une réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes. (i) Il faut

dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simples brin ; (ii) borner et amorcer la réplication de la


48

séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques ; (iii) réaliser la réaction de

polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme

d'ADN double brin.

Les gènes de résistance aux β-lactamines : Les β-lactamases de classe A d’Ambler ; bla

TEM 1, bla SHV12, bla CTX-M1, bla CTX-M2, bla CTX-M9 , bla CTX-M14 , bla CTX-M15 , bla CTX 28 ont été

identifiés par La PCR standard en utilisant le protocole décrit par Guessennd et al., (2008). Les

gènes bla TEM, bla SHV, et bla CTX-M ont été amplifiées en utilisant des amorces spécifiques (Tableau

11) à partir de l’ADN total.

Tableau 11: Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de résistance aux β-lactamines

Gènes séquences séquences (5’--3’) Taille des fragments

(pb)

blaCTX-M 1

blaCTX-M 2

blaCTX-M 9

blaCTX-M15

blaCTX-M14

blaCTX-M28

blaTEM

blaSHV

CTX-M1(+)

CTX-M1(-)

CTX-M2(+)

CTX-M2(-)

CTX-M9(+)

CTX-M9(-)

CTX-M15(+)

CTX-M15(-)

CTX-M14(+)

CTX-M14(-)

CTX-M28(+)

CTX-M28(-)

a-216

a-217

Os-5

Os-6

GGTTAAAAAATCACTGCGTC

TTGGTGACGATTTTAGCCGC

ATGATGACTCAGAGCATTCG

TGGGTTACGATTTTCGCCGC

ATGGTGACAAAGAGAGTGCA

CCCTTCGGCGATGATTCTC

GAC GAT GTC ACT GGC TGA GC

AGC CG C CGA CGC TAA TAC A

GCT GGA GAA AAG CAG CGG AG

GTA AGC TGA CGC AAC GTC TG

GAC GAT GTC ACT GGC TGA GC

AGC CG C CGA CGC TAA TAC A

ATAAAATTCTTGAAGACGAAA

GACAGTTACCAATGCTTAATCA

CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC


863

865

869

499

477

499

1079

795

(+) : amorce sens, (-) : amorce antisens

Le milieu réactionnel, commun pour toute les PCR effectuées, comprenait dans un volume final de

25 μl: 0.25 μl de dNTP (dATP,dGTP,dCTP,dGTP)(10 mM ); 2,5μl tampon de réaction10 X, 0,10 μl

de Taq polymérase (1U), 0,5 μl de chaque amorce (20 pmol/ μl), 2μl d'ADN génomique , 1,25 μl

de Mgcl2 (50Mm pour blaCTX et blaTEM et 25 Mm pour blaSHV); et 17,9 μl de H2O stérile ; suivant

le programme figurant dans le Tableau 12.


49

Tableau 12 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour des bêta-lactamases

Gènes Etape

initiale

Dénaturation/hybridation/élongation Nombre

de cycles

Etape finale

CTX-M 94 ºC 5min 94 ºC 1min/60 ºC1min/72 ºC 1min 30 72 ºC 7 min

SHV 94 ºC 5min 94 ºC 1min/60 ºC1min/72 ºC 1min 30 72 ºC 7 min

TEM 94 ºC 5min 94 ºC 1min/50C1min/72 ºC 1min 30 72 ºC 7 min

Les souches de référence utilisées sont : E. coli U2A1790 (CTX-M-1), E. coli U2A1799

(CTX-M-9), Salmonella sp. U2A2145 (CTX-M-2), Salmonella sp. U2A1446 (TEM-1 and SHV-12)

sont utilisées comme contrôles positifs (Guessennd et al., 2008).

Dépistage des gènes codants pour de céphalosporinase plasmidique de type Amp C :

Les gènes Ampc plasmidiques dérivent de gène chromosomique présent chez certaines

entérobactéries. La recherche des gènes AmpC (MOX, CIT, FOX, DHA, CMY et DHA) a été

effectuée par PCR multiplex en utilisant le protocole décrit par Perichon et al., (2007) Pour

amplifier ces gènes, nous avons utilisé les amorces décrites par Nordmann et al., (2010 ) qui

permettent d’amplifier les différents variant de chaque famille de gènes blaAmpC plasmidiques

(tableau 13).

Tableau 13 : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes plasmidiques de type AmpC.

Gènes séquences séquences (5’--3’) Taille des

fragments (pb)

CIT

DHA

EBC

FOX

MOX

CMY

CIT(+)

CIT(-)

DHA(+)

DHA(-)

EBC(+)

EBC(-)

FOX(+)

FOX(-)

MOX(+)

MOX(-)

CMY(+)

CMY(-)



TGGCCAGAACTGACAGGCAAA

TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC

AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T

CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC

TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG

CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT

AACATGGGGTATCAGGGAGATG

CAAAGCGCGTAACCGGATTGG

GACAGCCTCTTTCTCCACA

TGGAACGAAGGCTACGTA

795

462

405

302

190

1000



50

Le milieu réactionnel pour le PCR effectuée

comprenait dans un volume final de 25 μl: 0.25 μl de dNTP (dATP,dGTP,dCTP,dGTP)(10 mM ),

2,5μl tampon de réaction 10 X, 0,10 μl de Taq polymérase (5U/ μl), 0,25 μl de chaque amorce (20

pmol/ μl), 2μl d'ADN génomique 1,25 μl de Mgcl2 (25Mm); et 15,9 μl H2O stérile; suivant le

programmes figurant dans le Tableau 14.

Tableau 14 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour AmpC

Gène Etape

initiale


de cycles

Etape

finale

AmpC 94ºC3 min 94ºC 30s, 64ºC 30s, 72ºC 1min 25 72ºC 7 min

La souche Klebsiella pneumoniae U2A 2240 (gène dha ) ,utilisé comme contrôle positif.

Les gènes de résistance aux quinolones qnrA, qnrB et qnrS : Le dépistage du gène qnr

est réalisé par la technique de PCR Multiplex sur Ecoli BLSE détectées, en utilisant les amorces

spécifiques pour les gènes qnrA, qnrB et qnrS (Tableau 15) selon les protocoles décrit par

Guessennd et al., (2008).

Tableau15 : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de résistance aux quinolones

Gènes Séquences Séquences (5’--3’) Taille des fragments

(pb)

qnrA

qnrB

qnrS

qnrA(+)

qnrA(-)

qnrB(+)

qnrB(-)

qnrS (+)

qnrS (-)

TGGCGAAAAAAATT(GA)ACAGAA

GAGCAACGA(TC)GCCTGGTAG

GACGTGCTAACTTGCGTGAT

AACACCTCGACTTAAGTCTGA

ATGACTGAGCATGACCTTG

AACCATGTACACGGCTGG

594

388

476

(+) : amorce sens, (-) :amorce antisens

Les souches d’Escherichia coli, E. coli U2A2118 (qnrA), E. coli U2A2119 (qnrB), E. coli

U2A2120 (qnrS), sont utilisées comme contrôles positifs. Le milieu réactionnel pour le PCR

effectuée comprenait dans un volume final de 25 μl ; 0.5 μl de dNTP (dATP,dGTP,dCTP,dGTP)(5

mM ); 2,5μl tampon de réaction 10 X, 0.1μl de Taq polymérase (5U/ μl), 0,5 μl de chaque amorce

(20 pmol/ μl), 2μl d'ADN génomique,1,25 μl de Mgcl2 (25Mm) et 15.65 μl H2O stérile. Pour

l’amplification des échantillons, 25 μl de ce mélange sont mis dans chaque puits de la plaque. La


51

plaque contenant le mélange réactionnel est introduite dans le thermocycleur. L’ADN a été amplifié

selon le programme suivant (Tableau 16).

Tableau 16 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour les quinolones

Gènes Etape

initiale


de

cycles

Etape finale

qnr(A,B et S) 94 ºC 5min 94°C 1min,60°C 45s, 72°C 1 min 30 72ºC 10 min

Recherche de gène aac (6’)-Ib : Le dépistage du gène aac (6’)-Ib est réalisé par la

technique de PCR simplex sur Ecoli BLSE détectées, selon le protocole décrit par Perichon et al.,

(2007 en utilisant les amorces spécifiques pour le gènes aac (6’)-Ib (Tableau 17).

Tableau17: Amorces utilisées pour l’amplification de gène aac(6’)-Ib


(pb)

aac(6’)-Ib

aac(6’)-Ib(+)

aac(6’)-Ib(-)

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGC

GATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC

variable


La souche d’E. coli U2A1528 (aac (6’)-Ib), est utilisée comme contrôles positifs. Le milieu

réactionnel pour le PCR effectuée comprenait dans un volume final de 25 μl ; 0.25 μl de dNTP

(dATP,dGTP,dCTP,dGTP) (5 mM ); 2.5μl tampon de réaction 10 X, 0,1μl de Taq polymérase

(5U/ μl), 0,5 μl de chaque amorce (20 pmol/ μl), 2 μl d'ADN génomique , 1,25 μl de Mgcl2 (25mM)

et 17.9 μl H2O stérile. L’ADN a été amplifié selon le programme suivant (Tableau 18).

Tableau 18 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour le gène aac(6`)-Ib

Type de

-lactamase

Etape

initiale


de

cycles

Etape finale

aac(6`)-Ib 94 ºC 5min 94°C 1min, 55°C 1min, 72°C 1 min 30 72 ºC 7 min

Les gènes de résistance aux aminosides : La recherche des gènes de résistance aux

aminosides (armA, rmtB, rmtA, rmtC), a été effectuée par PCR multiplex selon le protocole décrit

par Doi et al., (2004) en utilisant les amorces spécifiques pour les aminosides (tableau 19).


52

Tableau19 : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de résistance aux aminosides


(pb)

armA

rmtA

rmtB

rmtC

armA(+)

armA(-)

rmtA(+)

rmtA(-)

rmtB(+)

rmtB(-)

rmtC(+)

rmtC(-)

TATGGGGGTCTTACTATTCTGCCTAT

TCTTCCATTCCCTTCTCCTTT

CTAGCGTCCATCCTTTCCTC

TTTGCTTCCATGCCCTTGCC

TCAACGATGCCCTCACCTC

GCAGGGCAAAGGTAAAATCC

GCCAAAGTACTCACAAGTGG

CTCAGATCTGACCCAACAAG

774

315

556

846


Le milieu réactionnel pour le PCR effectuée comprenait dans un volume final de 25 μl: 0.23

μl de dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dGTP)(2.5mM) ; 2.3μl tampon de réaction l0 X, 1.16 μl de

Mgcl2(25Mm); ,0.09 μl Taq polymérase (2U/ μl), 0,93 μl de chaque amorce(20 pmol/ μl),, 2 μl

d'ADN génomique et 11,78 μl de H2O stérile . L’ADN a été amplifié selon le programme suivant

(Tableau 20).

Tableau 20: Les conditions d’amplification des gènes codants pour les aminosides

Gènes Etape

initiale


de cycles

Etape finale

rmt A 94 ºC 5min 94°C 30 S, 55°C 1min, 72°C 1 min 30 72 ºC 7 min

rmt B 94 ºC 5min 94°C 30 S, 55°C 1min, 72°C 1 min 30 72 ºC 7 min

rmt C 94 ºC 5min 94°C 30 S, 55°C 1min, 72°C 1 min 30 72 ºC 7 min

armA 94 ºC 5min 94°C 1min,55°C 45s, 72°C 1 min 30 72 ºC 7 min

Les gènes de virulence : La recherche des gènes pili (pap), S-family adhesions (sfa),

hémolysine (hly), et cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1) ont été effectuées par PCR multiplex en

utilisant le protocole décrit par Farshad et Emamghorashi , (2009) (Tableau 21).


53

Tableau 21: Amorces utilisées pour l’amplification des gènes de virulence


fragments (pb)

Cnf

pap

hly

sfa

cnf (+)

cnf(-)

pap (+)

pap (-)

hly(+)

hly (-)

sfa (+)

sfa(-)

TTATATAGTCGTCAAGATCACTAA

GCTTTACAATATTGAC

GGCGTTTGCTTCCATGCCCTTGCC

ATA TCC TTT CTG CAG GGA TGC AATA

AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT

ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA

CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA

GAGAACTGCCCGGGTGCATACTCT

634

328

1177

410


Le milieu réactionnel pour le PCR effectuée comprenait dans un volume final de 50 μl: 1.25

μl de dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dGTP) ; 5 μl tampon de réaction l0 X, 225 μl de Mgcl2 , 0.3 μl

Taq polymérase, 1 μl de chaque amorce, 4μl d'ADN génomique et 26.95 μl H2O.. L’ADN a été

amplifié selon le programme figurant dans le Tableau 22.

Tableau 22 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour les gènes de virulence

Type de - -

lactamase

Etape

initiale


de

cycles

Etape

finale

Hly 94 ºC 5min 94°C 1min, 63°C 30 s, 72°C 3 min 30 72 ºC 7 min

Sfa 94 ºC 5min 94°C 1min, 63°C 30 s, 72°C 3 min 30 72 ºC 7 min

Cnf 94 ºC 5min 94°C 1min, 63°C 30 s, 72°C 3 min 30 72 ºC 7 min

Pap 94 ºC 5min 94°C 1min, 63°C 30 s, 72°C 3 min 30 72 ºC 7 min

ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus)

ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) est une technique génotypique de

typage épidémiologique pour établir le degré de parenté entre les souches cliniques, si les bandes

sont identiques ou différentes. Elle utilise des séquences ERIC (tableau 23) pour l’amplification par

PCR ( Versalovic et al., 1991).


54

Tableau 23 : Les amorces d’ERIC-PCR utilisées


fragments (pb)

ERIC-PCR ERIC-2

ERIC-1

AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC Variable


L’ADN total de chaque souche a été testé par ERIC-PCR. Pour cette réaction, l’ADN a été

amplifié à l’aide de l’amorce ERIC avec le programme suivant: 7 min à 94C° et 1 min à 94C° ;

puis 36 cycles de 1min à 52C°, 6 min à 65C°, 8 min à 35C° et à la fin 10 min à 72C°. Les

conditions de préparation de mixte pour ERIC-PCR ont été réalisées comme suivantes: eau distillée

stérile: 11, 17μl, 1 μl dNTP (50 μM )(Eurogentec) ,1.5μl de MgCl2(2.5 mM) , 2.5μl de Tampon

1X , 0.5 μl de chaque amorce ERIC (20 pmol/ μl) , 0.4 μl de Taq ADN polymérase (Promega) (1.5

U), 0.43 μl de BSA (1,7 mg /ml) 2.5 μl de DMSO (10%) et 5 μl d’extrait d’ADN brut. L’ADN a

été amplifié dans un volume final de 25 μl, dans un thermocycleur puis les produits de la PCR ont

été migrés sur un gel d’agarose à 1.5% dans une cuve pour électrophorèse pendant 1 heure. Après la

migration, le gel a été soumis sous U.V pour la révélation.

Phylogénie d’E. coli : La détermination des groupements phylogénétiques d’E. coli (A1,

A2, B1, B2, et D), a été réalisée par réaction d’amplification génique de type PCR multiplex en

utilisant la combinaison de trois ADN marqueurs chuA, yjaA et le fragment ADN d’E. coli

(TspE4.C2) (Clermont et al., 2009) (tableau24).

Tableau 24 : Les amorces utilisées pour groupement phylogénétique


fragments (pb)

chuA

yjaA

TspE4.C2

ChuA 1

chuA 2

yjaA 1

yjaA2

TspE4.C2.1

TspE4.C2.2

GACGAACCAACGGTCAGGAT

TGCCGCCAGTACCAAAGACA

TGAAGTGTCAGGAGACGCTG

ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC

GAGTAATGTCGGGGCATTCA

CGCGCCAACAAAGTATTACG

288

211

152

Le milieu réactionnel pour le PCR effectuée comprenait dans un volume final de 25 μl ; 0.5

μl de dNTP (dATP,dGTP,dCTP,dGTP)(5 mM ); 2,5μl tampon de réaction 10 X, 0,075μl de Taq

polymerase (5U/ μl), 0,5 μl de chaque amorce (20 pmol/ μl), 0.5μl d'ADN génomique et 15,65 μl


55

H2O stérile,1,25 μl de Mgcl2 (25Mm); suivant les programmes figurants sur le. Pour l’amplification

des échantillons, 25 μl de ce mélange sont mis dans chaque puits de la plaque. La plaque contenant

le mélange réactionnel est introduite dans le thermocycleur (Tableau 25). L’ADN a été amplifié

selon le programme suivant.

Tableau 25 : Les conditions d’amplification des gènes codants pour le groupement phylogénétique

Type de -

lactamase

Etape

initiale


de cycles

Etape finale

chuA 94 ºC 5min 94°C 30S, 59°C 30S, 72°C 30S 30 72 ºC 7 min

yjaA 94 ºC 5min 94°C 30 S, 59°C 30S, 72°C 30S 30 72 ºC 7 min

TspE4.C2 94 ºC 5min 94°C 30 S, 59°C 30S, 72°C 30S 30 72 ºC 7 min

II.2.7.3. Electrophorèse sur gel d’agarose (Sambrook et Russell, 2001)

Principe : En milieu basique, les fragments d’ADN sont chargés négativement. Placés

dans un champ électrique, ils vont donc se déplacer vers l’anode, mais leurs charges respectives

étant à peu près équivalentes, c’est leur masse moléculaire qui va régler leur vitesse de déplacement

à travers les mailles du gel dans lequel ils ont été placés. Plus les fragments sont petits, plus ils vont

migrer rapidement et donc loin de leur point de départ.

Préparation du gel d’agarose :

Réaliser le gel d’agarose par dissolution à chaud de 1 g de poudre d’agarose dans 150 ml

tampon TBE 0.5X et refroidir jusqu’à une température voisine de 50°C.

Couler le gel dans un moule dont les 2 extrémités ont été préalablement fermées par du

ruban adhésif

Disposer le peigne nécessaire à la réalisation des puits dans le gel

Laisser solidifier

Enlever délicatement le peigne et le ruban adhésif

Placer le moule avec le gel dans la cuve d’électrophorèse : les puits sont placés du côté de la

cathode et la cuve est remplie de tampon TBE jusqu’au niveau supérieur du gel.

Ensemencement :

Répartir dans les tubes Eppendorfs 8 μl de chaque solution d’ADN

Ajouter 2 μl de tampon de charge

Mélanger à l’aide d’une micropipette puis transférer les 10 μl des mélanges dans les puits

du gel.


56

Migration : Brancher le générateur après avoir raccordé la cuve. Appliquer un voltage de

90 volts pendant 4 heures.

Révélation : Colorer le gel en l’immergeant dans une solution de TBE 0.5 X contenant du

BET à une concentration de 0,5 μg/ml pendant 30 à 45 minutes à la température ambiante.

II.3. Matériel végétal

Suite à une enquête préliminaire chez les herboristes de la ville de Tlemcen et de quelques

vendeurs ambulants (voir questionnaire sur l’utilisation des plantes anti-Infections Urinaires en

annexe 1) sur les plantes utilisées contre les infections urinaires, nous avons sélectionnés trois

espèces qui sont : Cinnamomum cassia (Kirfa), Coriandrum sativum (Kasbour) et Ziziphora

hispanica (Fliou). Ces trois espèces ont été choisies pour les raisons suivantes :

Les trois plantes sont utilisées par la population de Tlemcen pour traiter les infections

urinaires et comme complément alimentaire (alicaments)

La disponibilité du matériel végétal au marché

Les HEs sont reconnues comme substances antimicrobiennes (Furletti et al., 2011 ;

Bekhchi, 2007 ; El hadri et al., 2014).

Les trois plantes ont été achetées à l’herboristerie du marché de la ville de Tlemcen. Les

données sur les trois plantes sont résumées dans le tableau 26.

Tableau 26 : Données sur les espèces végétales retenues et leurs utilisations

Plantes Appellation

locale

Famille Utilisations Origine Parties

utilisées

Cinnamomum

cassia

qirfa Lauraceae stimulants de l’appétit,

trouble digestifs et

infection urinaire

Marché

de

Tlemcen

Ecorce

Coriandrum

sativum

kasbour Apiaceae troubles digestifs, toux,

dysfonctionnement

vésiculaire, fièvre et

infection urinaire

Grains

Ziziphora

hispanica

Fliou Lamiacées douleurs d'estomac,

céphalée, douleurs

abdominales, toux, ictère

et infection urinaire

Plante

entière


57

II.3.1. Extraction des huiles essentielles

L’extraction a été effectuée par hydrodistillation a l’aide d’un appareil de type Clevenger selon

la technique recommandée par la pharmacopée européenne (European-Pharmacopoeia, 2005). La

matière végétale fraiche (200‒400 g) est ajoutée a l’eau dans un ballon de 2 litre placé au dessus

d’une source de chaleur (figure 10). Le ballon est lié à une colonne qui communique avec un

réfrigérant, permettant la condensation des vapeurs d’eau chargée de gouttelettes d’HE. Après

l’extraction du maximum de l’huile essentielle, la partie huileuse flottante est récupérée puis

déshydratée sur du sulfate de magnésium (MgSO4) et conservée à 4 °C.

Figure 10 : Photo de l’appareil utilisé pour l’extraction des huiles essentielles par hydrodistillation

II.3.2. Analyse chimique des huiles essentielles

Les analyses GC et GC/SM ont été effectuées au laboratoire des Produits Naturels de Corse

(France) en utilisant un appareil Perkin Elmer GC Autosystem équipé d'un injecteur unique et de

deux détecteurs à ionisation de flamme (FID). L'appareil est doté de deux colonnes de silice fondue

capillaires (60 m x 0,22 mm de diamètre, épaisseur de film 0,25 um) avec différentes phases

stationnaires : Rtx-1 (polydiméthylsiloxane) et Rtx- Wax (polyéthylène glycol). Programme de

température : 60-230 °C à 2 °C / min puis maintenus isotherme à 230 °C (30 min). Gaz vecteur :


58

hélium (1 ml/min). Températures d'injecteur et du détecteur ont eu lieu à 280 °C. Injection a été

réalisée avec un rapport de division de 1:80. Volume injecté : 0,1 μl.

Les analyses CG/SM ont été effectuées à l'aide d'un détecteur Perkin Elmer TurboMass,

directement couplé à un XL Perkin Elmer Autosystem équipé de colonnes de silice fondue

capillaires (60 m×0,22 mm de diamètre, épaisseur du film 0,25 um), Rtx-1 (polydiméthylsiloxane)

et Rtx-Wax (polyéthylène glycol). Autres conditions CG étaient les mêmes que décrit ci-dessus.

CG/SM (IE) les conditions : température de la source d'ions : 150 °C ; énergie d'ionisation : 70 eV ;

spectres électroniques de masse à ionisation ont été acquises sur la gamme de masse de 35 à 350

Da. Temps de numérisation : 1 s. L’injection a été réalisée avec un rapport de division de 1:80.

L’identification des composants est fondée : (i) la comparaison de leurs indices de rétention

(RI GC) sur des colonnes apolaires et polaires, déterminée par rapport au temps de rétention d'une

série de n-alcanes avec une interpolation linéaire, avec les composées authentiques ou des données

de la littérature, et (ii) sur l'ordinateur correspondant à des bibliothèques spectrales de masses

commerciales (Adams, 1995; Köning et al., 2001; Mc lafferty et Stauffer, 1994; NIST, 1999) et

avec la comparaison des spectres avec ceux de notre bibliothèque personnelle. La quantité relative

de chaque composant a été réalisée sur la base de leurs surfaces de pics sur les deux colonnes GC

capillaires Rtx-1 et Rtx-Wax, sans correction du facteur de réponse du FID.

II.3.3. Evaluation de l’activité antibactérienne

II.3.3.1. Technique en milieu solide: La méthode de Vincent (Aromatogramme)

La méthode de diffusion par disques sur gélose (méthode de Kirby-Bauer) a été utilisée pour

Évaluer l’activité antibactérienne des huiles essentielles par la formation de zones d’inhibition

(Carson et Riley, 1995).Des disques en papier filtre à 6 mm de diamètre sont imprègnes de 5 μl

d’huile essentielle et déposés sur la surface gélosée pré-ensemencée par écouvillonnage avec de la

suspension microbienne standardisée. Les souches bactériennes sont ensemencées sur gélosé Muller

Hinton (Fluka, Inde) et incubées à 37 °C pendant 24 h (figure11).Les résultats sont lus par la

mesure des diamètres des zones d’inhibition en millimètres (mm) selon la fourchette proposée par

Ponce et al., (2003) comme suit :

6 mm ≤ Ø ≤ 8 mm : non sensible 9mm ≤ Ø ≤ 14 mm : sensible

15 mm ≤ Ø ≤ 19 mm : très sensible Ø ≥20 mm : extrêmement sensible


59

Figure 11 : Principe de la méthode de diffusion par disque (Ganou, 1993)

II.3.3.2. Détermination des CMI de la croissance

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) ont été déterminées à l’aide des plaques de

microtitration à 96 puits (Wiegand et al., 2008). Les inocula standardisés à 108 ufc/ml sont dilués

au 1/1000 par le même milieu de culture (bouillon Cœur-Cervelle) pour avoir la concentration de

105

UFC/ml. Les puits de la première rangée verticale sont remplis par 200 μl de la suspension

microbienne standardisée a 105 ufc/ml comme premier témoin positif. Les puits de la deuxième

rangée sont remplis par 200 μl d’un mélange contenant du Tween 80 dilué à 0,1 % (v/v) dans la

suspension microbienne standardisée à 105 ufc/ml afin de vérifier l’effet du Tween 80 sur les

souches testées.

Le reste des dix rangées est rempli par les différentes concentrations de chaque huile essentielle.

Pour cela, une série de dilutions au 1/2 a été préparée à partir d’une solution mère contenant 400

mg/ml d’huile essentielle et 1 % de Tween 80 dilués ensemble dans le bouillon Cœur- Cervelle

(BHIB). Les autres solutions filles contenaient déjà un mélange de Tween 80 dilue à 1 % dans le

BHIB (dans la même concentration que la solution mère), dans un volume total égale à la moitié du

volume total de la solution mère, pour garder la concentration de Tween 80 constante à 1 %. Les dix

puits dans chaque rangée sont remplis par 180 μl de suspension puis 20 μl de la concentration

correspondante allant de la plus grande à la plus faible concentration dans une gamme finale de 4 %

jusqu’à 0,0039 %. La concentration finale du Tween 80 dans les puits était 0,1 %.


60

II.3.3.3. Concentration minimale bactéricide (CMB)

La Concentration Minimale Bactéricide (CMB) correspond à la plus faible concentration en

huile essentielle capable de tuer plus de 99,9 % de l’inoculum bactérien initial (soit moins de 0,01

% de survivants). Elle définit l’effet bactéricide d’une huile essentielle.

La gélose nutritive coulée dans des boîtes de Pétri est ensemencée en stries par 100 μl des

contenus des puits ayant la concentration minimale inhibitrice et des puis ayant une concentration

supérieure à la CMI. La CMB est déterminée après une incubation de 24 heures à 37°C ( Ganiere et

al ., 2004 ; Andrews, 2001)

II.3.3.4. Evaluation de la formation de biofilm in vitro

Test d’adhésion sur des microplaques de titration à 96 puits : Le test d‘adhésion pour

les souches était réalisé selon Extremina et al., (2010) avec quelques modifications. Pour cela, les

microplaques de titration à 96 puits ont été utilisées.

Ensemencement des souches à partir de GN inclinée dans 5mL de bouillon Cœur-Cervelle

(BHIB). L‘incubation est effectuée à 37°C pendant 24heures

Remplir les 12 puits de la microplaque avec 100μL de BHIB stérile qui vont servir de

témoin

Puis remplir les autres puits avec 100μL d'inoculum à 108

UFC/ml.

Incuber les microplaques à 37°C pendant 24 et 48 heures

Rincer les plaques trois fois avec de l‘eau physiologique stérile (pH 7,2) Laisser sécher

pendant 15 minutes

Colorer les puits au cristal violet à 0,2% pendant 15 minutes à température ambiante puis

verser le surplus du cristal violet et rincer trois fois à (EPS)

Laisser sécher pour une nuit à l‘air libre

Solubiliser le cristal violet en ajoutant 150μL d‘acide acétique à 33% dans chaque puits et

laisser pendant 15 minutes avant de lire les Densité Optique à 630nm en utilisant un lecteur

de microplaques (Awareness Technologies Stat Fax 3200).

Lecture des résultats :

La classification des résultats obtenus présente sur la base du DO témoin. Les souches ont été

classées comme suit : DO ≤ DOt(Témoin) : non formatrice du biofilm, DOt × 2 ≤ DO ≤ DOt × 4

: Modérée, DOt × 4 ≤ DO : Fortement formatrice du biofilm (Christensen et al., 1985).


61

Détermination des concentrations minimales inhibitrices de biofilm (CMIB) :

Obtention de biofilm : Les concentrations inhibitrices de biofilm (CMIB) des

HEs ont été déterminées comme décrit par Nostro et al., (2007). Premièrement, la microplaque à

96 puits a été remplie en distribuant 100 µL d'inoculum à 108

UFC/ml dans chaque puits. Après

24 h d'incubation à 37°C, l’inoculum flottant a été doucement enlevé et tous les puits ont été lavés

trois fois avec de l’eau physiologique stérile. Dix concentrations de chaque extrait déjà solubilisé

dans le TW80 ont été préparées par la série de dilution 1/2 dans le bouillon Mueller-Hinton stérile.

Ensuite tous les puits ont été remplis par 70 µL de bouillon Mueller-Hinton stérile et 30 µL de

chaque concentration d’huile essentielle pour obtenir des concentrations finales de 0,23 mg/ml à

120 mg /ml pour l’huile essentielle.

Lecture des résultats : La concentration inhibitrice de biofilm (CMIB) a été

déterminée après 24 h d’incubation à 37°C comme la concentration la plus basse sans culture dans

le puit visuellement déterminée.

Détermination des concentrations minimales éradicatrices de biofilm (CMEB) : Les

concentrations bactéricides de biofilm des huiles essentielles ont été déterminées comme décrit par

Nostro et al., (2007). Premièrement, la microplaque à 96 puits a été remplie par 70 µL de

bouillon Mueller-Hinton stérile et 30 µL de chaque concentration dans chaque puits. Après 24 h

d'incubation à 37°C, l’inoculum a été doucement enlevé et tous les puits ont été lavés trois fois

avec de l’eau physiologique stérile. Ensuite tous les puits ont été remplis par 100 µL de bouillon

Mueller-Hinton stérile.

Lecture des résultats : La concentration bactéricide de biofilm a été

déterminée après 24 h d’incubation à 37°C comme la concentration la plus basse sans culture dans

le puits visuellement déterminée

II.3.4. Étude de la combinaison des huiles essentielles avec les antibiotiques

Le test de combinaison a été effectué sur une souche de référence (E. coli ATCC 25922) en

combinant les huiles essentielles avec un antibiotique qui est la céfotaxime selon la méthode de

Vitale et al., (2005) et Mahboubi et Bidgoli, (2010) ; Sur microplaques de 96 puits, on introduit

verticalement 10 μl des concentrations de l’antibiotique a des concentrations décroissantes qui

débutent de 256 μg/ml et horizontalement 10 μl des concentrations de l’huile essentielle avec des

concentrations décroissantes qui débutent de 400 μg/ml. En fin on ajoute 180 μl de l’inoculum à


62

105 UFC/ml dans tous les puits. L’interprétation des résultats se fait en calculant la concentration

fractionnelle inhibitrice (CFI).

CFI = CFI l’huile + CFI de la céfotaxime

CFI de l’huile =CMI de l’huile combiné avec la cefotaxime

CMI de l’huile seul

CFI de la cefotaxime = CMI de la cefotaxime combiné avec l′huile

CMI de la cefotaxime seul

La CFI est interprété comme montrant l'effet synergique si elle est ≤ 0.5, l’effet indifférent quand

elle est > 0,5-2 et comme antagonistes quand elle est >2 (Mahboubi et Ghazian Bidgoli, 2010).

II.3.5. La cinétique de destruction d’E. coli exposé aux huiles essentielles

Pour l’étude de la cinétique de destruction d’E. coli BLSE par les huiles essentielles, nous

avons choisi la souche E. coli 09 BLSE parce qu’elle possède les gènes de résistance de quinolones,

des aminosides et les gènes de virulence. Pour cela, nous avons suivi le protocole expérimental de

Tangjitjaroenkun et al., (2012) . La préparation de l’inoculum a été faite en cultivant la souche a

testé dans 5 ml de cœur cervelle pendants 18 h d’incubation, on remplit les tube par la suspension

microbienne standardisée a 105 puis on ajoute l’huile essentielle pour avoir les concentrations

suivantes : CMB, 2 CMB et 4 CMB et de Tween 80 (1 %). Après une incubation sous agitation en

continu de 15, 30, 45, 60,90, 120,150 et 180 min à température 37C °, ensuite la culture est

centrifugé pendant 10 min a 250 rpm a 25 C°. Après, le culot est récupéré ensuite il est suspendu

dans 9 ml d’eau physiologique stérile pour avoir une série de dilution 10-1

a 10-4

, 100 μL de chaque

dilution ont été étalés sur le milieu gélose nutritif pour énumérer les colonies.

N.B. Chaque essai est réalisé en triple

Résultats et

discussion

Résultats et discussion

63

Partie III : Résultats et discussion

III.1. Examens macroscopiques des urines

Les résultats de l’examen macroscopique des urines prélevées au CHU de Tlemcen sont

présentés dans le tableau 27.

Tableau 27: Répartition selon l’aspect macroscopique des urines prélevées à partir des patients

hospitalisés

Nous remarquons que sur les 441 échantillons d’urines prélevées à partir des patients hospitalisés

; 121 échantillons étaient d’aspects troubles et 320 échantillons étaient d’aspects limpides.

Nous anticipons ici les résultats bactériologiques (voir ci-dessous), les urines troubles étaient toutes

infectées alors que 11/320 urines limpides étaient aussi infectées. Au mali, Ya bi (2006) a trouvé

sur un total de 131 urines infectés d’origine hospitalière, 70,23 % étaient d’aspects limpides et

29,77 % étaient d’aspects troubles. Ce qui nous amène à dire que l’aspect macroscopique des urines

ne présume pas de l’infection.

III.2. Résultats de la bandelette urinaire

Les résultats chimiques des urines sont enregistrés dans le tableau 28.

Tableau 28: Résultat de la chimie des urines analysées d’origine hospitalière

Aspects Présence Absence Total

Leucocytes > 104/ml 132 320 441

Nitrites 132 320 441

D’après le tableau 28 ; on constate la présence de leucocytes et de nitrites dans 132 urines

analysées dont 121 troubles et 11 limpides. Legras en 1993, a trouvé que tous les urines contenants

des leucocytes ≥104/ml et des nitrites étaient infectées. Ces résultats permettent de suspecter la

présence des microorganismes responsables d’une infection urinaire. C’est pourquoi la leucocyturie

garde une place de choix dans le diagnostic de l’infection urinaire.

Aspect Effectif Pourcentage (%)

Trouble 121 27.43

Limpide 320 72.56

Total 441 100


64

III.3. Résultats bactériologiques

III.3.1. Dénombrement bactérien

Les résultats de dénombrement des bactéries sont présentés dans le tableau 29.

Tableau 29: Fréquences des urines infectées d’origine hospitalière

Numération bactérienne Présence Fréquence (%)

Significative (≥105germe/ml) 132 30

Non significative (≤105germe/ml) 309 70

Total 441 100

Le tableau ci-dessus montre une uroculture significative observée chez 132 patients soit 30%.

Ce taux est supérieur à celui trouver par Epok, (1999) à l’hôpital national du Point G à Bamako au

Mali soit 15,75 % et par Hassaine, (2002), dans deux hôpitaux de l'ouest algérien : Ain-

Temouchent et Maghnia soit respectivement 26,4% et 20,7% d’IUN.

III.3.2. Germes isolés

L'identification des souches d’E. coli a été basée sur les méthodes microbiologiques standards

à savoir l’aspect macroscopique, microscopique, la croissance sur milieu gélosé de mac Conkey, la

coloration de Gram et par la galerie API20E. Cette dernière technique nous a permis de caractériser

83 souches d’ E.coli, avec 7 profils numériques différents: 7144772 , 5144572 ( ADH -), 7044552

( SAC - ,ODC -), 5044572 ( ADH -, ODC -), 5144552 (ADH -, SAC-),5044552 (ODC-, ADH -

SAC-), 5044512 (SAC-, ADH- , MEL- , ODC-).

Les bactéries isolées d'infections urinaires d’origine hospitalière sont présentées par la figure 12.


65

Figure 12 : Répartition des bactéries responsables d'infections urinaires d’origine hospitalière en

fonction de l'espèce

D’après la figure 12, on remarque qu’E. coli est l'espèce la plus fréquemment isolée (63℅),

suivie de Klebsiella pneumoniae (13℅) et de Proteus mirabilis (6℅). Les autres espèces sont

présentées en faible proportion comme Pseudomonas aueroginosa (3℅), Acinetobacter baumani

(3℅), Enterobacter sakazakic (3℅), Enterobacter cloacae (2℅), Klebsiella oxytoca (2℅),

Aeromonas hydrophila (1℅), Serratia marecesens (1℅), Citrobacter freundii (1℅), Providencia

stuartii (1℅), Pseudomona putida (1℅).

La fréquence d’isolement de l’espèce E.coli à l’hôpital de Tlemcen est presque équivalente à

celle de Zahlane et al., (2009) qui ont trouvé 65℅ d’E coli à l’hôpital de Marrakech (Maroc). Par

contre, la fréquence d’isolement est inferieure à celle de Valeri et ces collaborateurs qui ont trouvé

à l’hôpital de Paris 80 % d’E.coli (1998). Thabet et al., (2008) ont isolé 71℅ d’E.coli en Tunisie.

Par contre Barka et al., (2014) ont trouvé 19.16℅ d’E.coli à l’hôpital de Mahnia.

L’isolement fréquent d’E.coli à partir des prélèvements urinaires peut être expliqué par la

physiopathologie de ce type d’infection qui est en général ascendante. Il existe une forte

colonisation du périnée par les entérobactéries d'origine digestive et en particulier E.coli (Larabi et

al., 2003).

III.4. Fréquences des urines infectées en fonction du sexe :

Les résultats des urines infectées et non infectées en fonction du sexe sont données dans le

tableau 30.

Tableau 30: Fréquences des urines infectées et non infectées en fonction du sexe.

Sexe Infectées Non infectées Fréquence (%)

Femmes (F) 90 176 33.83

Hommes (H) 42 133 24


66

D’après les résultats ci-dessus, on remarque que les urines infectées provenant du sexe

féminin (33,83℅) sont supérieurs aux urines infectées provenant du sexe masculin (24℅). Le

rapport Ratio F/H est égal à 1,4. La fréquence élevée des infections urinaires chez la femme par

rapport à celle de l’homme est en concordance avec celle rapportée par la littérature (Alexander,

1998 ; Saint et Lipsky, 1999 ; Masrar et al., 2000 ; Wagenlehner et Naber, 2001). Plus de la

moitié des femmes ont au moins un épisode de cystite bactérienne au cours de leur vie (Brumfitt et

al., 1991). L’infection urinaire chez la femme peut être interprétée par plusieurs facteurs ; liés à la

nature anatomique et physiologique de son appareil urinaire. A titre d’exemple ; la longueur de

l’urètre très réduite (4cm), les changements hormonaux et physiologiques qui parviennent au cours

des périodes de grossesse, d’accouchement et de ménopause favorisants ainsi ces incidences

d’infections (Brumfitt et al., 1991).L'homme est relativement plus protégé vue la structure

anatomique de son appareil urinaire et la distance qui sépare l'anus de son méat urinaire permet de

réduire les contaminations fécales (Lepelletier, 1997).

III.5. Fréquences des urines infectées et non infectées en fonction de l’âge

Les résultats des urines infectées et non infectées en fonction d’âge sont montrés dans le

tableau 31

Tableau 31 : Fréquences des urines infectées en fonction des tranches d’âge.

âges 0-19 20-39 40-59 ≥ 60

Infectées 2 60 20 50

Non infectées 8 117 74 110

Fréquence (%) 20 33.89 21.27 31.25

Le tableau ci-dessus montre que les patients qui ont un âge compris entre 20 et 39 ans

montrent une incidence d'infection urinaire importante (33.89%). Cette tranche d’âge coïncide avec

la phase sexuellement la plus active chez l’homme, ce qui est en concordance avec les résultats de

la littérature (Larabi et al., 2003). Aussi, l’infection est présente chez les sujets âgées plus de ≥ 60

ans (31,25℅). L’infection urinaire chez les patients âgés est aggravée par la fréquence des formes

sévères et compliquées, du fait de l’état d’immunodépression due à l’âge. Cette prévalence élevée

peut être expliquée par de nombreux facteurs plus ou moins intriqués, anatomiques, fonctionnels ou

immunologiques (Lobel et Soussy, 2007). Chez le sujet âgé la diminution du débit urinaire du fait

d’une baisse des apports hydriques, la réduction du tonus musculaire des parois des voies urinaires,

notamment celles de la vessie, entraînent après chaque miction une stase vésicale responsable de la

prolifération des germes par réduction de l’effet chasse due chez la femme à un prolapsus

(descente) de la vessie et du vagin, et chez l'homme à une affection de la prostate (adénome). Chez


67

la femme ménopausée, la carence hormonale modifie la flore vaginale et provoque la disparition

des lactobacilles et une alcanisation du pH favorisant ainsi la colonisation des urines par les souches

uropathogènes (Boscia et al., 1986).

III.6. Répartition des urines infectées et non infectées en fonction du lieu de prélèvement

Les résultats des urines infectées et non infectées en fonction du lieu de prélèvement sont

donnés dans le tableau 32.

Tableau 32: Répartition des urines infectées et non infectées en fonction du lieu de prélèvement.

Service

Urine

infectée

Urine non

infectée

Pourcentage

(%)

Médecine interne 47 93 33.57

Maternité 44 111 28.38

Urologie 41 105 28.08

D’après ce tableau, on constate que les urines les plus infectées provenaient du service de la

médecine interne (33℅) suivi des services de maternité et d’urologie (28℅ par service). Ce résultat,

peut être expliqué par une nette dominance des patients diabétiques admis au service.

En effet, l'infection urinaire est une pathologie fréquente chez les sujets diabétiques pouvant

avoir des séquelles sur des organes vitaux comme les reins (Haraj et al., 2012).

Cette fréquence globale est variable d'une étude à l'autre en fonction des cadres d'étude et de

la population étudiée. Ainsi, Alebiosu et al., (2003) ont trouvé une fréquence de 26,6%, chez les

diabétiques de type 2 au CHU Olabisi Onabanjo, à Ibadan ; Kayima et al., (1996) ont rapporté un

taux de 11,1 % de bactériurie asymptomatique chez les diabétiques au CHU de Nairobi au Kenya

alors que Traoré et al., (1994) ont estimé cette prévalence à 19,5% à l'hôpital point "G", à Bamako.

Certains facteurs sont à l'origine de ces fréquences élevées de l'lU chez le diabétique. Ce sont

notamment la glycosurie, l'altération des fonctions des polynucléaires neutrophiles, l'anomalie

immunitaire, l'augmentation de l'adhésion de certaines souches d'E.coli aux cellules de l'urothélium

et une anomalie fonctionnelle et (ou) anatomique des voies urinaires liées à la neuropathie

autonome.

III.7. Étude de la résistance des entérobactéries isolées aux antibiotiques

Les résultats d’étude de la résistance des entérobactéries aux antibiotiques sont présentés par

la figure 13 (voir annexe 2, annexe3 et annexe 7).


68

Figure 13: Pourcentage de résistance aux antibiotiques des entérobactéries isolées d’urines au

CHU de Tlemcen

D’après la figure 13, on note que la résistance des souches aux aminopénicillines, était élevée

(90,20%), alors qu’en présence d'acide clavulanique, cette résistance baissait pour atteindre le taux

de 62,08%. Kayima et al., (1996) avaient obtenu des résultats inferieurs avec une résistance de

66,7% pour l’amoxicilline.

Les taux de résistance des souches d’entérobactéries aux β-lactamines sont élevés. Nos

résultats montrent que l’imipenème est la seule β-lactamine active pouvant être utilisée comme un

traitement alternatif pour ces souches résistantes. Selon les anciennes études, l’imipenème est

considéré, pour longtemps, comme un antibiotique de choix pour les cliniciens (Mansour et al.,

2008). Plusieurs études ont rapporté l’efficacité de cette molécule sur les souches d’entérobactéries

productrices de BLSE. Une sensibilité de 100 % a été rapportée par Goossens et Grabein, (2005).

Dans notre étude, le taux de résistance des entérobactéries aux C3G observé était de 45,41%.

Ce taux est inferieur par apport à celui rapporté par Ben romdhane et al., (2007) soit 71% et par

Thabet et al., (2008) avec 70,8% en Tunisie. Le même constat est observé en Algérie à l’hôpital de

Dr Dorban (Annaba) 42,85% (Ramoul, 2013) et 43,56% à l’hôpital de Sidi Bel Abbes (Souna,

2010).

Pour les autres résistances associées au β-lactamines, on retrouve la ciprofloxacine qui a

montré une activité importante sur les entérobactéries (28,54%). Touati et al., (2006), ont rapporté

un taux de 0% de résistance à la ciprofloxacine. Par contre d’autres auteurs ont rapporté des taux de

résistance variables à cette molécule, soit respectivement 55% et 80% de souches BLSE sont

résistantes à la ciprofloxacine (Eisner et al., 2006 ; Goossens et Grabein, 2005).

CTX:Céfotaxine ; FOX:Cefotaxime ; CF:Céfalotine ; FEP:Péfloxacine ; PRL:Pipéraciline,

TZP:Pipéraciline+Tazobactam ; CAZ:Ceftazidine ; ATM:Aztreonam ;

TIC:Ticarciline ;TIM:Ticaciline+Acide Clavulanique ; AMX:Amoxicilline ;

AMC:Amoxicilline+Acide Clavulanique ; IMP:Imipinème ; GN;Gentamicine ;

AK:Amikacine ; CIP:Ciprofloxacine NA : Acide Nalidixique.


69

La résistance des souches aux aminosides observée dans notre étude est faible 16,52% pour la

gentamycine et 14,14% pour l’amikacine. Des taux de 76% de résistance aux aminosides sont

rapportés par Touati et al., (2006). L’amikacine reste la molécule la plus efficace avec 85,86% de

souches sensibles comme cela a été rapporté dans la bibliographie (Gangoue-Pieboji, 2007;

Wu et al., 2007).

III.8. Étude de la résistance d’ E. coli isolée aux antibiotiques

Les résultats d’étude de la résistance d’E.coli aux antibiotiques sont présentés par la figure

14 (voir annexe 2, annexe3 et annexe 4).

Figure 14 : Pourcentage de résistance d’E. coli aux antibiotiques

D’après la figure 14, on constate que les taux de résistance les plus élevés sont observés avec

les pénicillines (amoxicilline 83,13℅, ticarciline 75,9℅, pipéraciline 61,44℅). L’association des

pénicillines avec les inhibiteurs de -lactamase a permis de récupérer l’activité de ces molécules.

En effet, on note des taux de 62,65℅ pour l’amoxiciline +acide clavulanique, 24,09℅ pour

pipéraciline+tazobactam et 39,75℅ pour ticarciline +acide clavulanique. Nous avons cependant

noté l'activité supérieure de l'association pipéracilline + tazobatam que l'association amoxiciline +

acide clavulanique. Ceci pouvant s'expliquer par le fait que l'association pipéracilline + tazobactam

est peu utilisée que l'association amoxiciline + acide clavulanique à l'Hôpital de Tlemcen. Pour les

céphalosporines de troisième génération (céfotaxime et ceftazidime) on note une résistance

importante 56,62℅.


TZP:Pipéraciline+Tazobactam ; CAZ:Ceftazidine ; ATM:Aztreonam ;

TIC:Ticarciline ;TIM:Ticaciline+Acide Clavulanique ; AMX:Amoxicilline ;

AMC:Amoxicilline+Acide Clavulanique ; IMP:Imipinème ; GN;Gentamicine ;

AK:Amikacine ; CIP:Ciprofloxacine NA : Acide Nalidixique.


70

Les niveaux des résistances bactériennes varient d’un pays à l’autre et d’une année à l’autre.

Aussi, la connaissance de la situation locale et de son évolution sont nécessaires pour le choix de

l’antibiothérapie de première intention (El bakkouri et al., 2009). Pour les autres classes

d’antibiotiques, les aminosides et les quinolones ont montré une bonne activité sur E. coli

(18℅ à 39℅).

En Tunisie, Thabet et al., (2008), ont constaté une résistance de cette espèce aux pénicillines

et aux fluoroquinolones. A El Jadida (Maroc) les résistances les plus élevées ont été observées pour

l’amoxicilline (61,2%), l’association triméthoprime sulfaméthoxazole (33,7%), l’acide nalidixique

(26,52%) et la ciprofloxacine (42%) (Tassouiket, 2014). Le tableau 33 donne une comparaison de

résistance d’E. coli aux antibiotiques testés.

Tableau 33 : Comparaison des résistances bactériennes d’E. coli

AMX AMC C3G AK GN FQ ATB (%)

Références

79,0

97,4

85,3

-

83,13

67,0

-

39,2

50,0

62,65

6,0-6,5

37,2-36,5

-

11,0

56,62

9,0

-

37,0

6,0

18,07

10,5

50,7

-

21,0

19,27

34,5-37

31,9

72,0

25,0

30,11

Tassouiket, 2014

Kashef, 2010

Kothari, 2008

Moukrad, 2012

Nos résultats

D’après le tableau 33, on remarque que la résistance aux céphalosporines de 3eme

génération des souches isolées dans notre étude est beaucoup plus élevée et que la résistance à

l’amoxiciline et aux fluroquinolones est identique par rapport aux résultats des travaux antérieurs.

III.9. Phénotypes de résistance d’E. coli aux β-lactamines

Les résultats de phénotypes de résistance aux β-lactamines sont illustrés par la figure 15

(voir annexe 4).

Figure15: Fréquences des phénotypes de résistance aux β-lactamines des souches

d’E .coli isolées d’urines infectées au CHU de Tlemcen.

Case: Céphalosporinases

Pase : Pénicillinases

S : Sensible


71

L'analyse des phénotypes de résistance aux -lactamines d’E. coli isolée au CHU de Tlemcen

a montré une nette dominance des souches productrices de -lactamases à spectre étendu BLSE

(32.5%). Cette fréquence est très importante par rapport à celle observée à l’hôpital Mostafa Pacha

à Alger soit 7,9% (Ramdani-Bouguessa et al., 2006). En Tunisie, Thabet et al., (2008) ont isolé

1,8% d’E.coli BLSE. Selon le réseau de surveillance de la résistance des antibiotiques en Europe

2009 (EARSNet), l'incidence des E. coli productrices de BLSE varie entre 85 à 100% dans plus de

la moitié des pays déclarants y compris l'Allemagne, la France, la Belgique, le Danemark, la

Norvège, la Finlande, l'Irlande, l'Espagne, le Royaume-Uni, l'Italie, le Portugal, la Grèce et

l'Autriche. Cependant les plus faibles proportions ont été signalées par l'Islande (1,8%), en Estonie

(2,2%) et la Norvège (2,3%) (Gagliotti et al., 2011).

Cette différence de fréquence peut être expliquée par la variation géographique, la variabilité

des facteurs épidémiologiques, des politiques d’utilisation des antibiotiques et des mesures

d’hygiène hospitalière entre les différentes institutions (Mkouar et al., 2008).

Cette émergence de bactéries BLSE est liée à l'utilisation accrue des antibiotiques de type

céphalosporines de 3ème génération quelques années avant l'apparition des premières BLSE. De

nombreuses études ont été effectuées ces dernières années sur le sujet et ont souvent montré le rôle

prépondérant des antibiotiques lors de l'émergence des BLSE (Dutour et al., 2002). En effet, les

antibiotiques agissent à plusieurs niveaux : ils peuvent par exemple : transformer la flore habituelle

des patients, favoriser la colonisation par des bactéries résistantes ou encore sélectionner des

souches résistantes et faciliter leurs disséminations. En d'autres termes, les antibiotiques exercent

une pression de sélection non-négligeable (Ferron, 1989 ; Flandrois, 1997 ; Eveillard et al.,

2000 ; Gonullu et al., 2008). Cette pression de sélection est d'autant plus marquée que le nombre de

patients traités est important et que la durée de l'antibiothérapie est longue (Issa maigardie, 2006).

De plus, on peut constater que la restriction de l'utilisation des antibiotiques a permis la diminution

du nombre de BLSE (Kounta, 1999 ; Karim et al., 2001).

En générale l’acquisition des bactéries productrices de BLSE concerne des patients

immunodéprimés, suite à une hospitalisation prolongée et après exposition à des manœuvres

invasives tels que les prélèvements protégés distaux. D’autres facteurs de risque sont la

malnutrition, l’admission en réanimation, l’antécédent de prise d’antibiotique tel que l’exposition

préalable aux C3G (aussi aux fluoroquinolones et aminosides), le nombre d’antibiotiques

administrés et la durée du traitement (Ruppé, 2010). Ainsi le milieu hospitalier joue un rôle de

réservoir des souches multi-résistantes dont la dissémination est aggravée par la difficulté d’y

appliquer des mesures d’hygiène (port de gants et lavage des mains). Depuis plus de 20 ans, la

résistance des entérobactéries aux céphalosporines de 3eme génération (C3G) ne cesse de se


72

renforcer notamment par l’acquisition de -lactamases à spectre élargi (BLSE) (Belmonte et al.,

2010).

III.10. Biotypage des souches d’E. coli BLSE selon les profils numériques en API 20E

Les résultats de biotypage des souches d’E coli BLSE selon les profils numériques en API

20E sont présentés dans le tableau 34.

Tableau 34 : Biotypage des souches d’E. coli BLSE selon les profils numériques en API 20E

Profil 5044572 5144572 5144552 5044552 7044572 7144572 5044512

Fréquence(%) 25.92 37.03 7.4 11.11 7.4 7.4 3.7

D’après les résultats de tableau 27, on note que sur les 27 souches d’E .coli BLSE isolées des

différents services hospitaliers de CHU de Tlemcen, 7 profils numériques différents ont été

enregistrés. Le profil 5144572 est dominant avec une fréquence de (37.03%), suivi du profil

numérique 5044572 (25.92%), puis du profil numérique 5044552 (11.11%). Davies et al., (1977)

ont trouvé chez les patients infectés par E coli les mêmes profils des biotypes 5144552, 7144572 et

7044572

III.11. Répartition des profils numériques d’E. coli par service d’hospitalisation

Les résultats de répartition des profils numériques par service d’hospitalisation sont présentés

dans la figure 16.

Figure 16 : Répartition des profils numériques d’E. coli BLSE par service (CHU Tlemcen)

La relation profil numérique et origine de la souche nous informe encore une fois que le

phénotype 5144572 est dominant dans les trois services et que sa fréquence varie entre 11% et

14%. Ainsi le service de médecine enregistre le taux le plus élevé 14%, suivis du service de

maternité et d’urologie avec 11% pour chacun.


73

III.12. Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction des services

Les résultats de la répartition des 27 souches d’E. coli BLSE en fonction des services sont

illustrés par la figure 17 (voir annexe5).

Figure17 : Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction des services au CHU de Tlemcen

Les résultats ci-dessus montrent que la fréquence d’E. coli BLSE varie en fonction des

services. Le service d’urologie reste de loin le pourvoyeur essentiel de ces souches (37,1%), suivi

du service de maternité avec une fréquence de 33,3%. Le service de médecine interne marque la

plus basse fréquence 29,6%.

Le taux élevé d’E. coli BLSE enregistré en urologie peut être expliqué par le fait que les

patients admis dans le service d’urologie sont particulièrement vulnérables aux infections à des

bactéries résistantes à cause de leurs défenses immunitaires amoindries et leur exposition fréquente

aux antibiotiques (Ebertin, 1997).

D’après bertrand et al., (2003), la prévalence des phénotypes de résistance observés constitue

le plus souvent un reflet fidèle des habitudes de prescription.

Donc on peut dire que le principal facteur de risque incriminé dans cette augmentation de

résistance à l’hôpital de Tlemcen est la conséquence de la consommation croissante de C3G.

Il est nécessaire de préciser que les surfaces ainsi que les objets se trouvant dans

l’environnement du patient pouvaient être une source de contamination par les bactérie

productrices de BLSE (Tietz et al., 2004).

III.13. Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction sexe

Les résultats de la répartition des 27 souches d’E. coli BLSE en fonction du sexe sont notés

dans la figure 18(voir annexe5).


74

Figure 18 : Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction de sexe

D’après la figure 18, on note une dominance féminine au sein de la population des personnes

infectées. La littérature nous indique qu'une femme a plus de risque de présenter une infection

urinaire que l'homme (Johanson et al., 1972 ; Garibaldi et al., 1974) à cause de la position de son

urètre. Les mêmes auteurs ont montré que le taux de l'acquisition d'une bactériémie était en rapport

avec le sexe. (Vittori et al., 2012 ; Park et al., 2012).

III.14. Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction d’âge

Les résultats de la répartition des 27 souches d’E. coli BLSE en fonction d’âge sont présentés

dans la figure 19(voir annexe5).

Figure 19 : Répartition des souches d’E. coli BLSE en fonction d’âge

La figure ci-dessus montre que l’infection urinaire est élevée chez les patients qui ont une

tranche d’âge comprise entre 20 et 39 ans, suivie par des patients qui ont un âge ≥ 60 ans.

L'incidence des infections urinaires nosocomiales par E. coli BLSE croît avec l’âge. Khoury

et al., (1985), ont constaté une proportion importante des infections urinaires chez les sujets âgés.


75

Butreau et Botto, (1997), ont montré que le risque d'infection nosocomiale est multiplié par 5 chez

les sujets de plus de 65 ans. En effet, les patients âgés présentent le plus souvent des facteurs de

risque à l'infection urinaire notamment la présence de maladies métaboliques ou débilitantes

(Ben-Ami et al., 2009) .

III.15. Répartition des patients infectés par E. coli BLSE en fonction des antécédents

médicaux.

Les résultats de la répartition des patients infectés par les 27 souches d’E. coli BLSE en

fonction des antécédents médicaux sont illustrés dans la figure 20 (voir annexe 5).

Figure 20: Répartition des patients infectés par E. coli BLSE en fonction des antécédents médicaux

D’après la figure 20, on note que le pourcentage d’infection urinaire est élevé chez les

diabétiques et les femmes enceintes.

En effet, un diabète déséquilibré est associé à un risque plus élevé de survenue d'IU. Le

glucose présent dans les urines en cas de diabète favorise la croissance bactérienne. Il en est de

même pour un diabète compliqué avec une neuropathie vésicale, qui est à l'origine de reflux vésico-

rénaux et donc facteur de risque de pyélonéphrite (Rostoker et al., 1991). Les femmes enceintes

sont particulièrement à risque en raison de la pression exercée par le bébé sur le système urinaire et

à des changements hormonaux inhérents à la grossesse.

III.16. Fréquence d’E. coli BLSE durant les trois années d’étude

Les résultats de la fréquence des 27 souches d’E.coli BLSE durant les trois années d’étude

sont illustrés dans la figure 21.


76

Figure 21: Fréquence d’E. coli BLSE responsables d’IU durant les trois années d’étude

(CHU de Tlemcen)

D’après la figure 21, on note qu’il ya une augmentation importante de souches d’E. coli

BLSE durant l’année 2013 avec une fréquence de 55,5℅. Nous avons montré que dans un intervalle

de trois ans, la progression de la résistance des germes vis-à-vis des différentes familles

d’antibiotiques s'est multipliée.

L’acquisition par les bactéries de moyens de lutte contre l’effet létal des antibiotiques ou les

transformations génotypiques qui en résultent, progressent dans le même sens que cette résistance

rendant la bactérie de plus en plus virulente (Ecdc, 2011).

Il est actuellement prouvé que l'utilisation des antibiotiques, notamment les céphalosporines de

3éme génération dans un but thérapeutique est le facteur de risque le plus important dans le

développement de résistances bactériennes qui est devenue un problème majeur de santé public

(Rubin et Samore, 2002).

III.17. Concentrations minimales inhibitrices de céfotaxime contre E. coli BLSE

Les résultats des concentrations minimales inhibitrices de céfotaxime contre E. coli BLSE

sont illustrés dans le tableau 35.

Tableau 35 : Concentrations minimales inhibitrices (µg/mL) de céfotaxime contre E. coli BLSE

E.coli 01 02 03 04 05 06 08 09 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

CMI 128 32 4 4 64 8 4 4 8 64 16 4 6 4 64 64 4 4 64 16 4 64 4 8 4 4 4

D’après le tableau 35, on note que les valeurs absolues des CMI de céfotaxime des 27

souches d’E. coli résistantes oscillent dans un intervalle allant de 128µg/ml à 4 µg/ml. Ce sont des


77

valeurs très élevées comparées aux valeurs trouvées par Lerma et al., (2008) soit de 0,007 a 0,125

µg/ml.

III.18. Profil moléculaire de la résistance d’E. coli BLSE aux β-lactamines

III.18.1. PCR Standard

L’amplification par PCR standard en utilisant les amorces spécifiques qui codent pour les

BLSE et la révélation des gènes par l’électrophorèse sur gel d’agarose ont montré que les 27

souches d’E. coli BLSE isolées dans cette étude se sont avérées productrices de moins de deux

gènes qui codent pour le BLSE (figures 22a, 22b et tableau 36).

Figure 22a : détection des gènes bla CTXM15 Figure 22b : détection des gènes bla TEM1

T1+: bla CTXM15 - T2+: bla CTXM15

D’après le tableau 36, on remarque que les 27 souches d’E.coli BLSE (100%) possèdent le

gène bla CTX-M «CTX-M 14 (7,40℅), CTX-M15 (92,59℅), CTX-M28 (3,7℅), CTX-M1 (3,7℅)»,

1 seule souche (3,7%) possède le gène bla SHV et 26 souches (96,29%) possèdent le gène bla TEM.

100 pb 200pb 500 pb 1000 pb

100 pb 200pb 500 pb 800 pb

T1+ T2+ 17 4 3 2 1 MP

19 14 21 18

MP 19 20 17 16 15 14 13 T1+ T2+


78

Tableau 36 : Profil moléculaire des 27 souches E. coli BLSE

Référence de la

souche

Gènes codant pour les BLSE

TEM1 SHV12 CTXM-14,1, 28 CTXM-15

Ec01 TEM1 - - CTXM-15

Ec02 TEM1 - CTXM-15

Ec03 TEM1 - CTXM-14 CTXM-15

Ec04 TEM1 - CTXM-15

Ec05 TEM1 - CTXM-14 CTXM-15










Ec17 - - - CTXM-15



Ec20 TEM1 - CTXM-1 -

Ec21 TEM1 - CTXM-28 -








Ec29 TEM1 SHV12 - CTXM-15


79

III.19. Recherche moléculaire de la résistance croisée

III.19.1-Résistance aux aminosides

A- Les enzymes modificatrices des aminosides

Les résultats des gènes qui codent pour les enzymes modificatrices des aminosides sont

présentés dans le tableau 37 et a par la figure 23.

Tableau 37: Les gènes qui codent pour les enzymes modificatrices des aminosides

Référence de la souche Gènes codant pour les

BLSE

Référence de la souche Gènes codant pour les

BLSE

Ec 01 aac(6')-Ib-cr Ec16 aac(6')-Ib-cr

Ec 02 aac(6')-Ib-cr Ec17 -

Ec 03 - Ec18 -

Ec 04 aac(6')-Ib-cr Ec19 aac(6')-Ib-cr


Ec 06 - Ec22 -



Ec 10 - Ec25 -


Ec 12 - Ec27 -

Ec14 aac(6')-Ib-cr Ec 28 aac(6')-Ib-cr

Ec15 aac(6')-Ib-cr

Ec 29 aac(6')-Ib-cr

T1+: aac(6’)-Ib- T2+: aac(6’)-Ib

Figure 23 : Les enzymes modificatrices des aminosides

MP T1+ T2+ 22 17 19 21 18

1000pb 600pb 200pb


80

D’après le tableau 37 et la figure 23, on note que la PCR standard des gènes qui codent pour

les enzymes modificatrices des aminosides ont fait apparaitre la présence de 13 souches d’E. coli

BLSE (48,14%) qui portent le gène aac(6)-lb.

B- Les 16S ARNr methyltransphérases

Les résultats des gènes qui codent pour le 16s ARNr methyltransférase des souches qui

résistent aux aminosides sont présentés dans le tableau 38.

Tableau 38 : Les 16S ARNr methyltransphérases

Référence de la

souche


armA rmt B

rmt A

rmtC

Ec 03 - - - -

Ec 04 - - - -

Ec 05 - - - -

Ec 06 - - -

Ec 08 armA rmt B - -

Ec 09 armA rmt B - -

Ec 12 - - - -

Ec 14 - - - -

Ec 16 - - - -

Ec 17 armA - - -

Ec 21 - - - -

Ec 22 - - - -

D’après le tableau 38, on note que la PCR a montré que 3/12 souches d’E. coli BLSE

(25%) possèdent le(s) gène(s) armA et/ou rmt B qui code(nt) pour le 16s ARNr methyltransférase

responsable(s) de la résistance élevée à tout les aminosides. En revanche, aucune souche d’E. coli

BLSE ne possède les gènes rmt A et rmt C.

III.19.2. Résistance aux quinolones

Les résultats des gènes qui codent pour les quinolones sont présentés dans le tableau 39.


81

Tableau 39: Profil moléculaire de la résistance associée des souches d’E. coli BLSE aux

quinolones.

Référence de la

souche


qnrB qnrA qnrS

Ec 01 - - -

Ec 02 - qnrA1 -

Ec 03 - - -

Ec04 qnrB1 - -

Ec 05 - -

Ec 06 - - -

Ec 08 - - -

Ec 09 - - -

Ec 10 - - -

Ec 11 - - -

Ec 12 - - -

Ec 14 - - -

Ec 15 - - -

Ec 16 - - -

Ec 17 - - -

Ec 18 qnrB1 - -

Ec 19 - - -

Ec 20 - - -

Ec 21 - - -

Ec 22 - - -

Ec 23 - - -

Ec 24 - - -

Ec 25 - - -

Ec 26 - - -

Ec 27 qnrB1 - -

Ec 28 qnrB1 - -

Ec 29 _ - -

D’après le tableau 39 ; on note que l’amplification par PCR standard a montré que 5

souches E. coli BLSE (18.51%) isolées dans cette étude possèdent le gène qnrb ou qnra qui


82

codent pour la résistance aux fluoroquinolones. Le gène qnr a toujours coexisté avec le gène

aac(6’)-Ib-cr, ce dernier code pour la résistance simultanée aux aminosides et à la ciprofloxacine.

Le support génétique des enzymes BLSE produits par les 27 souches d’E.coli isolées dans

notre étude était varié. Le type CTX-M a été détecté chez les 27 souches (100%), le type SHV chez

une seule souche (3.7%) et 26 souches (96,44%) hébergeaient le gène TEM.

Cette étude souligne, d’une part l’augmentation de la fréquence de la production de BLSE par

les souches d’E.coli isolées en Algérie, et d’autre part confirme la propagation mondiale du gène

CTX-M-15 (Carrer et Nordmann, 2011). Dans la présente étude, la diversité génétique des gènes

BLSE peut être attribuée à des gènes déjà détectés (TEM-1, SHV-12, CTXM-14, 15, 28,1) (Baba

Ahmed-Kazi, 2013 ; Messai et al., 2008 ; Nedjai et al., 2012 ; Ramdani-Bouguessa et al, 2003 ;

Touati et al., 2006)

La souche BLSE SHV-12 a été isolée pour la première fois en 1997 en Suisse chez une

souche de K. pneumoniae isolée d’un patient venant de l’Afrique du Nord (Nüesch-Inderbinen et

al., 1997). Depuis lors, cette BLSE a une répartition mondiale : Australie (Howard et al., 2002),

Canada (Mulvey et al., 2004), Chine (Chanawong et al., 2002), Croatie (Bedenic et al., 2001),

France (Weill et al., 2004), Grèce (Neonakis et al., 2003), Inde (Dhawan et al., 2003), Italie

(Perilli et al., 2002), Japon (Yagi et al., 2000), Corée (Kim et al., 1998), Espagne (Briñas et al.,

2003), Taiwan (Yan et al, 2000), Thaillande (Chanawong et al., 2001), Etats- Unis (Wong-

Beringer et al., 2002), Afrique du Sud (Kruger et al., 2004), Tanzanie (Blomberg et al., 2005),

Cameroun (Gangoué Piéboji, 2000), RCA (Frank et al., 2006), Tunisie (Ben-Hamouda et al.,

2004), Sénégal (Cardinale et al., 2000), Mali (Weill et al., 2004 et Algérie (Iabadene et al., 2008 ;

Iabadene et al., 2009 ; Berrazeg et al., 2013).

Les souches BLSE de type SHV, TEM et CTX-M-1 ont été rapportées dans différentes études

algériennes. Touati et al., (2008a) ont révélé la présence de CTX-M-15 dans des souches

environnementales de K. pneumoniae et E. cloacae, sachant que CTX-M-15 fait partie du groupe

de CTX-M-1 (Gangoué Piéboji, 2007). Messai et al., (2008) ont également rapporté des souches

de K. pneumoniae portant les gènes bla TEM et bla CTX-M-1. Dans une autre étude, Touati et al.,

(2010) ont rapporté en plus de la présence de CTX-M-15, la détection de SHV-12 chez des souches

de l’environnement. Au Bénin, Ahoyo et al., (2007) ont également rapporté la présence du gène bla

SHV chez des souches environnementales d' E. coli. La BLSE du type CTX-M a été rapportée pour

la première fois en Europe Occidentale en 1989 et c’était la CTX-M-1. Cette enzyme a été détectée

en Allemagne, en Italie et en France chez des espèces variées d’Entérobactéries. La CTX-M-15 a

été identifiée pour la première fois en Inde et au Japon et a été par la suite mise en évidence dans

plusieurs autres pays (Canada, Russie, Bulgarie, Pologne, France, Royaume uni, Turquie et


83

Taiwan). Trois autres types de CTX-M ont été rapportés en Afrique, la CTX-M-2 (Afrique du Sud),

la CTX-M-3 (RCA) et la CTX-M-12 (Kenya) (Gangoué Piéboji, 2007).

La résistance aux β-lactamines chez les entérobactéries est dominée par la production de

BLSE de type CTX-M-3 et CTX-M-15 (Baba Ahmed-Kazi Tani et Arlet, 2014). Plusieurs études

ont rapporté ces BLSE dans différents régions en Algérie : à Annaba (Bouzidi et al., 2011; Nejai et

al., 2012), à Constantine (Naas et al., 2005; Naas et al., 2011), à Bejaia (Touati et al., 2006;

Touati et al., 2008 b, Gharout-Sait et al., 2012), à Alger (Ramdani-Bouguessa et al., 2006;

Iabadene et al., 2008; Iabadene et al., 2009; Ramdani-Bouguessa et al., 2011; Touati et al.,

2012; Kermas et al., 2012) et à Tlemcen (Baba Ahmed et al., 2012; Baba Ahmed-Kazi Tani et

al., 2013).

Il faut noter que les différents types de BLSE (CTX-M-1, TEM et SHV) trouvés dans notre

étude font partie des BLSE dites transférables, ce qui explique la facilité du transfert entre les

entérobactéries (Philippon, 2013). La présence des souches environnementales productrices de

BLSE de différents types peut agir comme un réservoir de gènes de résistance qui peuvent être

transmis horizontalement à des souches cliniques ou environnementales. En plus, elle constitue un

facteur de risque des épidémies nosocomiales (Touati et al., 2008a). Par conséquent,

l’environnement inanimé des patients (surfaces et objets), contaminé par des entérobactéries multi

résistantes peut servir comme un réservoir secondaire pour une transmission croisée. En effet,

plusieurs auteurs, ont rapporté des souches environnementales qui ont été identifiées comme

sources d’épidémies (Touati et al., 2010). Par ailleurs, la coexistence des différentes -lactamases

dans une même bactérie peut poser un problème de diagnostic et de thérapeutique (Roh et al.,

2008).

La résistance aux quinolones est codée par différents types de gènes dont les gènes qnr qui

ont été identifiés dans différentes espèces d’entérobactéries essentiellement K. pneumoniae,

Enterobacter spp., E. coli et Salmonella enterica, aussi bien en milieu hospitalier que

communautaire (Rodriguez-Martinez et al., 2011). Elle est souvent associée à la production de

bêta-lactamases à spectre élargi Guessennd et al., 2008).

Dans notre étude la répartition des gènes de résistance plasmidique aux quinolones montre

que les gènes qnr sont présents chez 5 souche (qnrB1 chez 4 souches et qnrA1 chez une

souche).qnrA1 a été identifié en 1998 sur un large plasmide conjuguait isolé à partir d’une souche

de K. pneumoniae résistante à la ciprofloxacine (Martinez-Martinez et al., 1998). Les gènes qnr B

et qnr S ont été décrits dans peu de pays (Guessennd et al., 2008).


84

En Algérie, les gènes de résistance aux fluoroquinolones sont d’identification plus récente

dont les plus répandus sont les déterminants qnr (Baba Ahmed-Kazi Tani et Arlet, 2014). Aussi,

les gènes qnr (A, B, S) ont été détectés chez des souches hospitalières d’entérobactéries produisants

des BLSE (CTX-M, SHV-12 et VEB-1) (Iabadene et al., 2008; Meradi et al., 2011 ; Touati et al.,

2008 b). Plus récemment les gènes qnr ont été isolés chez des souches d’E.coli produisantes des

BLSE de type CTX-M et responsables d’infections urinaires en milieu communautaire à Bejaia

(Gharout-Sait et al., 2012).

D’autres études basées sur des approches moléculaires ont montré la relation entre les

déterminants de la résistance aux quinolones et la production de BLSE (Rodriguez-Martinez et al.,

2011; Poirel et al., 2006; Ambrozic Avgustin et al., 2007; Fihman et al., 2008; Lavilla et al.,

2008). Le aac(6’)-Ib-cr a été découvert pour la première fois en 2006 chez une souche d’E.coli

qnrA-positive en Chine (Robicsek et al., 2006). Le gène aac (6')-lb-cr confère une résistance

simultanée à la ciprofloxacine et aux aminosides (Bouchakour et al., 2010). En Algérie, il a été

détecté pour la première fois en 2009 chez une souche d’E. cloacae (Meradi et al., 2011) et dans

des travaux antérieures (Baba Ahmed-Kazi, 2013).

L’étude des associations des gènes de résistance qnr et aac(6’)-Ib-cr entre eux d’une part, et

avec le phénotype BLSE d’autre part montre que les souches EBLSE contenant le gene aac(6’)-Ib-

cr sont les plus nombreuses (48%), suivies des E coli co-exprimant les gènes qnr et aac(6’)-Ib-cr

(Guessennd et al., 2008). Le gène aac(6’)-Ib-cr est souvent associé à d’autres gènes de résistance

aux quinolones tels les différents variant qnr, les BLSEs (CTX-M-1, CTX-M-14, CTX-M-15, CTX-

M-24), les céphalosporinases plasmidiques (DHA-1) et les carbapénémases (KPC-2) (Strahilevitz

et al., 2009). Il a été essentiellement identifié chez des souches cliniques d’E.coli et de K.

pneumoniae (Poirel et al., 2012).

En outre, le problème lié aux BLSE est surtout la présence fréquente de corésistances rendant

les souches multirésistantes (Leotard et Negrin, 2010). En effet, les BLSE sont généralement

portées par de grands plasmides qui portent aussi des -lactamines, tels que les gènes de résistance

aux classes d’antibiotiques non aminoglycosides, les quinolones et le

triméthoprime/sulfaméthoxazole. Aussi, l’utilisation de ces antibiotiques contribue à la sélection de

souches productrice de BLSE (Paterson et Bonomo, 2005).

L’incidence d’apparition des résistances aux aminosides a augmenté ces dernières années et

particulièrement chez les souches productrices de BLSE (Spanu et al., 2002).

Parmi les autres AMEs, 3 souches d’E.coli BLSE hébergent le gène armA et/ou rmtB. Toutes

les souches qui possèdent le gène armA et rmtB ont exprimé de hauts niveaux de résistance à

l’amikacine et à la gentamicine. Cependant, ce gène a été trouvé chez des souches de


85

K. pneumoniae isolées chez quatre patients d’origine Algérienne. Ce qui a été rapporté par une

enquête dans les hôpitaux Belges entre 2000 et 2005 (Bogaerts et al., 2007). En Algérie, le gène

armA a également été trouvé chez Salmonella enterica productrice de BLSE à Constantine (Naas et

al., 2009) et Salmonella non-typhi productrice de BLSE de type CTX-M-15 à Annaba en 2009

(Bouzidi et al., 2011). Récemment, le gène armA a été identifié en combinaison avec le gène

NDM-1 chez K. pneumoniae au Népal. Notre taux d’isolement du gène armA est plus élevé que

celui constaté chez les entérobactéries productrices de BLSE en Grèce (0,2%) en 2012 et en France

(1,3%) en 2007(Bercot et al., 2008). Par ailleurs, la prévalence du gène ArmA reste inférieure à

celle trouvée chez les souches de K. pneumoniae « BMR » en Chine (54,5%) en 2009 (Yang et al.,

2011). Le gène rmtB a été détecté principalement en Asie et en Europe chez les Entérobactéries

(Bogaerts et al., 2007). L’équipe japonaise de Yamane et al., (2005) ont constaté que le gène

rmtB est trouvé à la fois dans Klebsiella spp. et E. coli avec un taux de prévalence de 0,008% et

0,02% respectivement.

La méthylase ARNr 16S semble donc être plus répandue en Asie qu'en Europe et en

Amérique. La résistance transférable aux C3G et aux aminosides par production de BLSE et le 16s

ARNr methyltranspherase entraîne l’émergence de bactéries multi-résistantes BMR, limitant ainsi

les possibilités thérapeutiques. La dissémination de ces BMR peut impliquer l’association de

plusieurs mécanismes : propagation de souches épidémiques ou gènes de résistance. Les

investigations concernant cette dissémination nécessitent une compréhension des mécanismes et les

risques potentiels qui s’y rapportent.

Ainsi, un traitement efficace doit être sélectionné en fonction de l'antibiogramme afin de

limiter l'utilisation des carbapénèmes lorsque cela est possible. En effet, la classe des carbapénèmes

comme l’imipenème est le traitement de premier choix pour traiter les bactéries productrices des

enzymes BLSE parce que ces enzymes ne l’hydrolysent pas (Nordmann et Carrer, 2010).

Actuellement, les carbapénèmes sont de plus en plus utilisés dans le monde entier car c'est souvent

le médicament de dernier recours pour traiter les infections graves causées par les entérobactéries

productrices de BLSE. Néanmoins, Il a été démontré que, lors de ce traitement, une fréquence

élevée de la résistance à l'imipénème peut être sélectionnée (Belbel et al., 2014).

III.19.3. Caractérisation des céphalosporinases plasmidiques

Parmi les 6 souches isolées qui résistent a la cefoxitine, deux souches d’E.coli (Ec 19 et Ec

26) ont été détectées positives pour le gène blamox et blaCMY-2, soit une prévalence de 33%.

L’amplification a permis de préciser la dissémination des céphalosporinases plasmidiques AmpC

de type MOX, CMY-2 chez les deux souches isolées en 2013 et 2012 à partir de deux services :


86

médecine interne et urologie. En revanche, aucune souche d’E. coli BLSE ne possède les gènes bla

dha et bla FOX. Des études réalisées en Egypte, Pakistan et Tunisie ont montré les mêmes données

où il y’a la diffusion des céphalosporinases plasmidiques MOX associés avec les mécanismes de

production de β-lactamases à spectre étendue BLSE chez les souches d’E. coli (Wassef et al., 2014

; Cherif et al., 2009). Aux États-Unis Kaye et al., (2004), ont montré qu’il y’a une diffusion des

céphalosporinases plasmidiques.

Ces enzymes ont été plus récemment individualisées chez des entérobactéries comme E. coli,

K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, P. mirabilis et Salmonella spp. Ces céphalosporinases

plasmidiques sont très proches génétiquement des céphalosporinases AmpC chromosomiques et le

transfert des gènes codants les céphalosporinases sur les plasmides implique des éléments

génétiques mobiles (Bush et al., 1995 ; Philippon et al., 2002). Généralement, les gènes codants

les enzymes AmpC sont localisés sur des plasmides dont la taille varie de 7 à 180 kb (Philippon et

al., 2002).

La dissémination de la multirésistance et la diffusion des gènes de résistance sont liées à

l’existence d’éléments génétiques mobiles entre bactéries d’une même espèce ou d’espèces

différentes, ainsi qu’à l’existence de structures génétiques permettant de cumuler de nombreux

gènes de résistance au sein d’une même souche (Skurnik et et al., 2006).

III.19.4. Étude du phénotype des facteurs de virulence

Les résultats des gènes de virulence sont consignés dans le tableau 40. On note que

l’amplification par PCR standard montre que 12 souches d’E. coli sur 27 possèdent l’opéron

d’addition pap et/ou l’opéron sfa et n’expriment pas le gène hly. Par contre, une souche d’E. coli

possède le gène cnf1.

Les travaux d’Andreu et al., (1989) ont identifié le gène de virulence de type fimbriae I

(FimH) chez E. coli isolées chez des patients qui ont une pyélonéphrite, cystite, et UTI avec des

pourcentages 97%, 97% et 90%, respectivement. En outre, la fréquence de papC a été de 73%, 0%

et 20%, respectivement. Blanco en 1997 a indiqué que les taux de sfa , papC et afa d’ E. coli

isolées chez des patients UTI était de 53%, 54% et 2%, respectivement. Dans une autre étude,

Santo en 2007 a trouvé des gènes de virulence chez E. coli de sfa (19%), aérobactine (76%), papC

(11%), afa (32%) et hémolysine (96%). Alors que Tiba et al., (2008) ont trouvé des gènes différents

chez E. coli provenant de patients atteints de cystite de virulence FimH (97,5%), papC (32,7%),

afa (27,8%), IUCC (25,9%), hly (25,3%), et afa (6,2%).


87

Tableau 40 : phénotype des facteurs de virulence

E.coli 01 02 03 04 05 06 08 09 10 11 12 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

sfa - - - - Sfa - Sfa Sfa - - - Sfa - - Sfa - - - - - - - - - - sfa sfa

pap - - - Pap - - - - - Pap - - - Pap - - - - Pap - - - pap - - pap -

cnf1 - - - - -

- -

-

- -

- -

- - - - - - - - - - - - - - cnf1


88

Il semble que certains facteurs d’uropathogénicité comme les systèmes d’adhésion pap et sfa

jouer un rôle majeur dans la survenue d’infection urinaire symptomatique. En outre, l'incidence des

gènes de virulence chez E. coli isolées à partir adultes roumain avec UTI était FimH (86%), sfa / foc

(23%), papC (36%), et afa (14%) (Usein et al., 2001).

Les facteurs d’uropathogénicité des E. coli et leurs déterminants génétiques sont bien connus.

Ils sont soumis à une régulation complexe qui dépend essentiellement des conditions de

l’environnement dans lequel la bactérie doit se développer. Selon de nombreuses études

épidémiologiques, dans les IUS, les facteurs d’uropathogénicité des E. coli peuvent être corrélés

avec la symptomatologie des cystites et des pyélonéphrites (Michel, 2014).

En fait, il n’existe pas de bactérie uropathogènes type et on peut considérer que plus une

bactérie possède de facteurs d’uropathogénicité, plus elle est pathogène pour son hôte. Le nombre

de facteurs présents est variable mais certains comme les systèmes d’adhésion Pap ou les toxines

comme l’hémolysine α ou le Cnf semblent plus spécifiques de l’uropathogénicité. En outre, certains

de ces facteurs sont capables de se transmettre par transfert horizontal lorsque les opérons qui les

codent se trouvent regroupés sur des loci du chromosome dénommés par Hacker et al., (2003).

Ilots de pathogénicité. Au total, les bactéries retrouvées dans les infections urinaires possédant ces

facteurs doivent être soumises à un traitement antibiotique bien codifié selon le type d’infection.

II.19.5. Détermination de la relation épidémiologique

L’analyse génotypique par ERIC-PCR des souches d’E. coli BLSE a montré une grande

diversité de souches : 13 différents génotypes parmi les 27 souches étudiées. La détermination des

groupes phylogénétiques a montré que 9 clones appartiennent au groupe phylogénétique A0 et A1,

3 clones au groupe phylogénétique B1, 4 clones au groupe phylogénétique B2 et 1 clone au groupe

phylogénétique D1 (tableau41).


89

Tableau 41: Relation épidémiologique entre les 27 souches d’E. coli BLSE étudiées par ERIC/-

PCR et groupement phylogénétique

Code service groupement

Phylogenetique

ERIC

profile

Ec 06 Maternité A0 c

Ec 12 Urologie A0 f

Ec 22 Médecine interne A0 j

Ec 24 maternité A0 e

Ec 26 Urologie A0 p

Ec 27 Maternité A0 o

Ec 01 Maternité A1 a

Ec 02 Maternité A1 q



Ec 08 Maternité A1 e

Ec 09 Urologie A1 f

Ec 14 Urologie A1 g

Ec 18 Médecine interne A1 c

Ec 23 Urologie A1 k

Ec 03 Maternité B1 b

Ec 10 Urologie B1 f

Ec 16 Médecine interne B1 h


Ec 25 Médecine interne B1 i


Ec 11 Urologie B23 f

Ec 15 Urologie B23 h


Ec 21 Médecine interne B23 i

Ec 29 Urologie B23 n

Ec 28 Urologie D1 e

La phylogénie moléculaire a pour but de reconstruire les relations de parenté entre les

séquences de nucléotides ou d’acides aminés. On peut ainsi étudier les relations de parenté entre les

espèces qui les portent mais, aussi, l’évolution du génome.

D’après le tableau 41, on remarque que les souches isolées sont du groupe phylogénétique B1

et A1. Alors que les souches du groupement phylogénétique B2 et D1 sont moins fréquents.

Selon la littérature, les souches du groupe phylogénétique B1 et A1 sont moins virulentes et

dite commensale. Il existe une corrélation entre la résistance aux antibiotiques, les facteurs de

virulence et le groupement phylogénétique des souches. Les souches de groupe B1 et A sont

fréquemment résistantes a de nombreux antibiotique alors que les souches B2 demeurent

relativement sensible (Moran et al., 2006 ; Corvec et al., 2007 ).


90

Les souches de groupe B1, A et D sont plus fréquemment associes a une rareté des facteur de

virulence, a une résistance aux antibiotiques, a une origine nosocomiale de l’infection, a une porte

d’entré urinaire ou non et au statut immunodéprimé (Moran et al., 2006 ; Corvec et al., 2007 ).

Conclusion :

Les infections urinaires posent un problème majeur de la santé publique, du fait de leur

fréquence très élevée, leur coût culminant de traitement et les multiples échecs de l’antibiothérapie

à cause des bactéries multi résistantes incriminées dans ces infections.

Les résultats de cette étude ont montré que sur 441 échantillons urinaires provenant des

patients hospitalisés 132 répondaient aux critères d'infection urinaire. Le rapport Ratio F/H est égal

à 1,4. L’infection urinaire est plus importante chez les tranches d’âge comprises entre 20 et 39 ans.

Les agents infectieux impliqués dans ces infections étaient surtout E. coli, l'espèce la plus

fréquemment isolée (63℅). La résistance des souches d'E. coli isolées aux ATB est très importante:

83,13% sont résistantes à l’amoxiciline, 62,65% à l’amoxicilline plus l’acide clavulanique et 56,62

% aux céphalosporines de 3eme génération.

L'analyse des phénotypes de résistance aux -lactamines d’E .coli isolées au CHU de Tlemcen,

a montrée une nette dominance des souches productrices de -lactamases à spectre étendu BLSE

(32,5%) appartenant au génotype CTX-M 15.

III.20. Effet des HEs des plantes aromatiques retenues sur les souches d’E. coli BLSE

III.20.1. Résultats des extractions

Les rendements en HE des trois plantes retenues et leurs caractères organoleptiques sont

résumés dans le tableau 42.

Tableau 42 : Rendements en HE et caractéristiques organoleptiques

Plante Partie

utilisée

Propriétés organoleptiques Teneur

(%)

Durée

d’extraction

(h) Aspect Couleur Odeur Saveur

Cinnamomum

cassia

Ziziphora

hispanica

Coriandrum

sativum

Ecorces

Feuilles

et fleurs

Graines

Liquide

Liquide

Liquide

Jaune foncé

Jaune pale

Jaune clair

légèrement

sucrée

Fraîche

légèrement

sucrée et

citronnée

Aromatique

Suave

Aromatique

1.7

1.5

1.2

8

3

5


91

D’après le tableau ci–dessus, on remarque que les rendements en HEs sont variables selon les

espèces. En général, nous avons obtenu de bons rendements en HE comparés à ceux obtenus par

d’autres chercheurs (tableau 43).

Tableau 43 : Rendements en HE rapportés dans la littérature.

Espèces Teneur (%)

Cinnamomum cassia

Ziziphora hispanica

Coriandrum sativum

Nos résultats Autres travaux Références

1.7

1.5

1.2

0,5 - 2

0.5

0,7

Richard, (2008)

Bekhchi et al., (2007)

Skiredj et al., (2012)

L’espèce Cinnamomum cassia a donné un rendement en HE (1,7%) très proche de celui

obtenu par Richard, 2008 mais les rendements en HE obtenus pour Ziziphora hispanica (1,5%) et

Coriandrum sativum (1,2%) sont supérieurs à ceux obtenus par bekhchi et al., (2007) et Skiredj et

al., (2012). Cette différence de rendements en HEs dépend de plusieurs facteurs biotiques et

abiotiques comme la période de récolte, le type d’organes récoltés, le sol et la pluviométrie

(Schmidt, 2010).

III.20.2. Analyse chimique des huiles essentielles

Les résultats des analyses chimiques par CG/SM des huiles essentielles sont présentés dans le

tableau 44 et illustrés par les chromatogrammes (voir annexe 8).

Les résultats de l’analyse chimique montrent que les HEs de C. sativum et de Z. hispanica

sont riches en monoterpènes oxygénés, respectivement 95,71% et 93,66%, alors que l’HE de

C. cassia est riche en phénylpropanoides (80,12%).


92

Tableau 44: Composition chimique (%) des huiles essentielles des plantes retenues

Composés Ira Irp C. sativum Z. hispanica C. cassia

α–Pinène 931 1022 0.79 0.49 1.69 Camphène 943 1066 - - 0.67

–Pinène 970 1110 - 0.55 0.50

p–Cymène 1011 1268 1.36 - -

Limonène 1020 1199 0.68 3.36 - 1,8-Cinéole 1022 1209 - - 2.52

(Z)–beta–Ocimène 1034 1247 0.24 - - Linalol 1081 1544 85.57 - 0.22

(E) oxyde de Linalol 1044 1469 0.50 - -

(Z) oxide de Linalol 1073 1469 0.44 - - Camphre 1123 1517 4.78 - 1.37 p–menth–3–en–8–ol 1135 1595 - 2.46 - Bornéol 1148 1698 - - 0.44 (E)-Isopulégone 1149 1572 - 0.88 - Terpinène- 4-ol 1161 1600 - - 0.77

α–Terpinéol 1179 1700 0.48 - 1.17 (Z)-Cinnamaldéhyde 1182 1867 - - 0.96 Pulégone 1216 1645 - 88.33 -

Géraniol 1232 1844 2.76 - - Pipéritone 1232 1730 - 0.34 - (E)-Cinnamaldéhyde 1233 2044 - - 75.85 (E)–Pipéritone oxide 1235 1724 - 0.46 - Thymol 1266 2189 - 0.38 - Acétate de Bornyl 1269 1515 - - 0.78 Carvacrol 1278 2219 - 0.20 - Pipériténone 1315 1909 - 0.61 -

Acétate de néryl 1342 1725 1.18 - - α –Copaène 1379 1488 - - 0.11 Coumarin 1391 1488 - - 0.46 Acétate de Cinnamyl 1413 2152 - - 3.31

Total

98.78 98.06 90.82

Monoterpènes

hydrocarbonés 3.07

4.40

2.86

Monoterpènes

oxygénés 95.71

93.66

7.27

Phénylpropanoides - - 80.12

Sesquiterpènes

hydrocarbonés -

-

0.11

Sesquiterpènes

oxygénés -

-

0.46 Ira : Indice de rétention sur colonne apolaire, Irp : Indice de rétention sur colonne polaire

- : Absence ; ID : identification ; SM : spectrométrie de masse.

En effet, le linalol est le composé majoritaire de l’HE de C. sativum (85,57%) alors que la

pulégone est le composé majoritaire de l’HE de Z. hispanica (88,33%). Cependant, le

cinnamaldéhyde est le composé majoritaire de l’HE de C. cassia (75,85%).


93

En comparant nos résultats avec ceux de la littérature, on remarque que les mêmes composés

majoritaires des HEs de Ziziphora hispanica et de Coriandrum sativum sont retrouvés mais avec

une variabilité quantitative (tableau 45).

Tableau 45 : Composés majoritaires des trois HEs rapportés dans la littérature.

Espèces Nos résultats Autres travaux Références

Ziziphora hispanica

Coriandrum sativum

Cinnamomum cassia

Pulégone (88.33℅)

Linalol (85.57℅)

Cinnamaldehyde

(75.85℅)

Pulégone (79,5℅)

Linalol (57,57℅)

Cinnamaldehyde

(42,37℅)

Bekhchi et al., (2007)

Khani et Rahdari, (2012)

Chang et al., (2013)

D’après le tableau on remarque que l’espèce Ziziphora hispanica a donné un pourcentage de

Pulégone (88,33%) très proche de celui obtenu par bekhchi et al., (2007), mais les pourcentages

de linalol (85,57%) et du cinnamaldéhyde (75,85℅) sont supérieurs à ceux obtenus par Khani et

Rahdari, (2012) et Chang et al., (2013) respectivement.

III.20.3. Etude du pouvoir antibactérien des huiles essentielles

Pour rappel, l’étude a été faite sur les souches E.coli BLSE responsables d’infections

urinaires. Pour comparaison, nous avons élargi les tests sur d’autres souche responsables d’infection

urinaire (Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis et Pseudomonas aeruginosa), sur des souches

E.coli sensibles et sur des souches de référence.

III.20.3.1. Méthode des disques

Les résultats du pouvoir antimicrobien des trois HEs et de céfotaxime par la méthode des

disques sont consignés dans le tableau 46 et la figure 24.

On remarque que l’HE de C. cassia est la plus active sur les souches testées en particulier sur

les souches E. coli BLSE. Par contre, les huiles de C. sativum et Z. hispanica ont montré une

moyenne voir une faible activité.

En effet, l’HE de Cinnamum à donné des zones d’inhibitions de 27 a 39 mm pour toutes les

souches sauf pour P. aeruginosa (12 à 19 mm) malgré le faible volume utilisé d’huile (5μl).

Selon les moyennes des zones d’inhibitions on peut classer l’efficacité des HEs par ordre

décroissant comme suit : C. cassia (27.35 mm), C. sativum et Z. hispanica ( 11 mm).

Selon la sensibilité des souches, E. coli, Proteus et Klebsiella ont montré la plus grande

sensibilité à l’HE de C. cassia par rapport aux autres HEs. Les souches E. coli BLSE ont enregistré

un diamètre moyen 33 mm, alors qu’on note une résistance de P. aeruginosa vis-à-vis des huiles

de C. sativum et Z. hispanica.


94

Tableau 46 : Diamètres d’inhibitions (en mm) des huiles essentielles et de céfotaxime

HE et ATB

Souches

Z. hispanica C. cassia C. sativum Céfotaxime

Escherichia coli ATCC 25922 14±1 30±1 13±1 29

Escherichia coli 72 S 17±1 35±0 31±1 27±1



Escherichia coli 75 S 13±1 38±1 11± 1 28±1

Moyenne E.coli S 15.75 36 21.75 29

Escherichia coli 21 BLSE 08±1 32±1 9±1 21±1


Escherichia coli 05 BLSE 09±0 34 ±1 10±1 19±1










Moyenne E.coli BLSE 09.33 33.25 10.08 14

P. aueruginosa ATCC 27853 06±1 15±1 06±0 08±1

Pseudomonas aueruginosa S 06±0 19±1 06±0 10±0

Pseudomonas aueruginosa R 06±0 12±0 06±0 13±1

Proteus mirabilis ATCC 35659 09±0 34±1 12±1 19±0

Proteus mirabilis S 10±1 39±0 13±1 19±1

Proteus mirabilis R 08±1 30 ±1 09±1 20±0

K. pneumoniae ATCC 70603 12±1 21±1 14±1 19±1

Klebsiella pneumoniae S 13±1 32±1 14±1 20±1

Klebsiella pneumoniae R 07±1 27±1 10±1 21±1

Moyenne générale 9.67 27.35 11.23 18.41

S : sensible ; R : résistante

En comparant l’effet des HEs au céfotaxime, on remarque que l’effet de C. cassia est plus

élevé que l’antibiotique soit respectivement 27,35 mm et 18,4.


95

Figure 24 : Effet de l’huile essentielle de Cinnamomum cassia sur Pseudomonas aueruginosa

Nos résultats obtenus concordent avec ceux de Vilas et Kamble (2013). Ces auteurs ont

obtenu des zones d’inhibition de 12 à 15 mm vis–à–vis d’E. coli avec l’HE de C. sativum.

Par contre, Ali Khan et al., (2013) n’ont pas trouvé d’activité sur B. cereus, S. aureus,

P. aeruginosa et E. coli, alors que Shahid et Mohammad, (2013) ont obtenu des zones d’inhibition

entre 13 et 20 mm.

Pour Z. hispanica, Bekhchi et al., (2007) ont obtenu des zones d’inhibition de 10,33 mm vis–

à–vis d’E. coli. Par contre pour C. cassia, Al-saghir, (2009) ont obtenu environ 26 mm vis–à–vis

d’E.coli.

Historiquement, les souches de Pseudomonas aeruginosa ont toujours présenté une résistance

vis-à-vis de des huiles essentielles (Sivropoulou et al., 1995; Mimica-Dukié et al., 2003 ; Salehi et

al., 2005). Mais dans notre étude, P. aeruginosa s’est montré sensible à l’HE de cassia.

D’après Kalemba et Kunicka, (2003), la méthode de diffusion sur gélose n’est pas une

technique idéale pour l’évaluation du potentiel antimicrobien des HEs vis–à–vis des

microorganismes à l’état planctonique. Son utilisation reste uniquement pour des criblages rapides.

Par contre, la détermination des CMIs est une technique plus fiable, car cette méthode permet la

quantification de l’activité antimicrobienne de l’agent testé.

II.20.3.2. Résultats des concentrations minimales inhibitrices et bactéricides

Les résultats des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et bactéricides (CMB) des HEs

et de céfotaxime vis-à-vis des souches responsables d’infection urinaire et des souches de

références sont présentés dans le tableau 47.


96

Tableau 47 : Concentrations minimales inhibitrices des huiles essentielles (mg/ml) et de

céfotaxime (μg/ml).

HE

Souches

Z. hispanica C. cassia C. sativum

Céfotaxime

CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI

E. coli ATCC 25922 2.5 5.0 0.63 1.25 2.5 2.5 0.125

Escherichia coli 72 S 2.5 2.5

0.63 1.25 1.25 1.25 1.0

Escherichia coli 73 S 2.5 2.5 0.31 0.63 1.25 1.25 1.0



Moyenne E. coli S 2.5 2.5 0.55 0.78 1.87 3.12 1.0

Escherichia coli 21 BLSE 5.0 10.0 2.5 2.5 5.0 10.0 64.0

Escherichia coli 17BLSE 5.0 5.0 1.25 2.5 5.0 10.0 64.0











Moyenne E.coli BLSE 12.5 24.58 1.97 2.5 8.75 17.5 26.66

P. aueruginosa ATCC 27853 2.5 2.5 - - 16.0

Pseudomonas aueruginosa S - - 2.5 2.5 - - 8.0

Pseudomonas aueruginosa R - - 5.0 5.0 - - 64

P. mirabilis ATCC 35659 5.0 5.0 0.31 0.31 5.0 5.0 2.0

Proteus mirabilis S 5.0 5.0 0.31 0.31 2.5 2.5 0.5

Proteus mirabilis R 10 10 1.25 1.25 5.0 10 4.0

K. pneumoniae ATCC 70603 2.5 2.5 0.16 0.16 2.5 2.5 2.0

Klebsiella pneumoniae S 5 5.0 0.31 0.31 5.0 5.0 0.5

Klebsiella pneumoniae R 2.5 5.0 0.16 0.16 2.5 2.5 4.0

Moyenne générale 5.27 7.17 1.30 1.41 3.95 5.62 10.73

S : sensible aux ATB ; R : résiste aux ATB


97

D’après le tableau 41, on note que les plus faibles CMI et CMB enregistrées sont celles de

l’HE de C. cassia. En effet, celle-ci a montré l’activité la plus forte avec une CMI moyenne ≤ 1,30

mg/ml et une CMB moyenne ≤ 1,41 mg/ml. Mais comparé à l’ATB céfotaxime, ce dernier est actif

à une concentration moyenne basse (10,73μg/ml) que les trois HEs.

De point de vue sensibilité des souches, toutes les souches testées étaient sensibles à l’HE de

C. cassia avec des CMI et des CMB beaucoup plus faibles que celles des HEs de C. sativum et

Z. hispanica. Par contre, Pseudomonas aueruginosa s’est révélée plus résistante aux HEs de

coriandre et de fliou. Les souches E. coli BLSE ont enregistrés des CMI presque dix fois plus

petites que celles de C. sativum et Z. hispanica. Ce résultat confirme le diamètre moyen de la zone

d’inhibition obtenu (33,25 mm).

Les mêmes résultats sont obtenus pour les souches de K. pneumoniae et Proteus mirabilis qui

ont enregistrées des concentrations très faibles (CMI 1.25 mg/ml et CMB 1.25 mg/ml) d’HE de

cassia alors que par la méthode des disques, elles ont donnés des zones d’inhibitions moyennes de

34 et 27 mm respectivement.

Duman et al., (2010), ont montré que l'activité de l'huile essentielle de coriandre était

supérieure à l'activité de son constituant principal, le linalool. Le même résultat a été obtenu par

Inouye et al., (2011) qui ont trouvé que le linalol possède une activité modéré sur plusieurs

bactéries. Silva et al., (2011) ont trouvé que toutes les souches testées ont été inhibées par l'huile de

coriandre avec différents degrés d’inhibition mais P. aeruginosa était la souche la plus résistante

avec CMI (1,6% v/v). Pour E. coli ATCC 25922, ils ont enregistré une CMI= CMB= 0.2%.

Pour l’HE de C. cassia, les travaux de Regiane et al., (2014) ont enregistré une CMI de 88

mg/ml vis–à–vis d’E. coli. Canillac et Mourey, (2001), Friedman et al., (2002), Bruneton,

(2009), Pozzatti et al., (2010) et Unlu et al., (2010) ont démontré que C. cassia, a une activité

bactéricide contre E.coli . Dans une étude réalisée par Hofer et al., (2009) les huiles essentielles

extraites à partir des feuilles de la cannelle de Ceylan (riche en eugénol) ont une activité inhibitrice

et bactéricide sur S. aureus, E. coli et S. enterica. Par contre, Pseudomonas aeruginosa étai

résistante. Ce résultat contraste avec le notre, puisque P. aeruginosa s’est montré légèrement

sensible à l’HE (ϕmoy = 15 mm, CMI et CMB=2,5 à 5 mg/ml). Gill et Holley, (2004 et 2006) ont

montré que l’huile essentielle de C. cassia riche en cinnamaldéhyde (composé majoritaire de l’HE

de cassia) possède une activité antimicrobienne. En effet, ce composé inhibe les ATP synthétases

bactériennes et provoque une diminution de la production d’ATP intracellulaire. Chez E. aerogenes,

le cinnamaldéhyde pourrait interférer avec les mécanismes du quorum-sensing (Niu et al., 2006).

Chez B. cereus, le cinnamaldéhyde provoque un changement de la morphologie cellulaire (Kwon et


98

al., 2003) et agit sur la croissance, l'ultra-structure des hyphes et les facteurs de virulence d'A.

fumigatus, A. niger et T. rubrum. Les membranes cellulaires et certaines structures endo-

membranaires de la cellule fongique sont des sites d'action possibles (Khan et Ahmad, 2011).

Concernant l’HE de Z. hispanica, les études antérieures réalisés par Sezik et al., (1991) ;

Meral et al., (2002 ) ont montré que l’activité antibactérienne est due à des composant majeure et

mineur tel que pulégone, pipéritenone et 1,8-cinéole, donc on peut dire que l’activité

antibactérienne des HEs est due un une synergie entre les composant chimique. Bekhchi et al., en

(2007) n’ont pas montré d’activité antibactérienne intéressante. Cette faible efficacité est due

probablement à la faible activité de la pulégone (composé majoritaire de l’HE) (Arras et Usai,

2001).

Bien que l’HE de cassia est la plus efficace sur les souches testées, du essentiellement à son

composé majoritaire le cinnamaldéhyde (reconnu pour son activité antimicrobienne), il en demeure

que l’effet des composés mineurs n’est pas négligeable pour exhiber une activité antibactérienne

impliqué dans les phénomène de synergie entre les différents constituant qui peuvent être a l’origine

d’une activité antibacterienne beaucoup plus prononcée que celle prévisible par les compose

majoritaire ( Hammer et al., 2003; Burt, 2004).

III.20.3.3. Evaluation de la formation du biofilm in vitro par la microplaque

Les résultats de la formation du biofilm in vitro sont présentés dans le Tableau 48.

Tableau 48 : Evaluation de la formation du biofilm in vitro.

Technique Nombre de souches d’E. coli BLSE

Absence Faible Modéré Fort

Microplaque 0 Ec(6,22 et 24) Ec(1,2,3,5,8,9,11,12,14,15,

16, 18, 21, 23, 25, 26, et 27)

Ec(4,10,19,20,17,28 et 29)

Ec : Ecoli

D’après le tableau ci-dessus, on remarque que la capacité d‘adhésion variait largement d‘une

souche à une autre. Parmi les 27 souches testées, 3 (11.11%) étaient estimées comme faiblement

formatrices de biofilm, 17 (62.96%) comme intermédiaires et 7 (25.92%) sont considérés comme

fortement formatrices de biofilm

On remarque que les souches qui possèdent le gène pap sont plus formatrice de biofilm par

contre les souches qui possèdent le gène sfa sont moyenne ou faiblement formatrice de biofilm


99

Sargol et al., (2015) ont montré que 94% des souches formatrice de biofilm contient le

gène pap. Escherichia coli est l'un des principaux agents responsables des infections des voies

urinaires (UTI) à travers le monde. La capacité de cette bactérie pour former des biofilms sur des

dispositifs médicaux tels que des cathéters joue un rôle important dans le développement des

infections urinaires pour cela on a testé nos huile essentielle sur ces souches

III.20.3.4. Résultats des concentrations minimales inhibitrices et éradicatrices de biofilm

Les résultats de CMIB et CMEB des HEs envers les souches d’infection urinaire à l’état

biofilm sont présentés dans le Tableau 49.

Tableau 49. Effet des HEs étudiées vis–à–vis des souches d'E. coli en état du biofilm, exprimée par

les concentrations minimales inhibitrices (CMIB) et éradicatrices (CMEB) du biofilm en mg/ml.

HE

Souches

Z. hispanica

C. cassia C. sativum

CMIB CMEB CMIB CMEB CMIB CMEB

Escherichia coli ATCC 25922 7.5 15 0.93 0.93 3.75 7.5

Escherichia coli 72 S 3.75 7.5 1.875 3.75 7.5 7.5



Escherichia coli 75 S 7.5 15 1.875 3.75 3.75 7.5

Moyenne E. coli S 5.62 9.37 1.63 3.045 4.68 7.5

Escherichia coli 21 BLSE 60 60 7.5 7.5 30 60

Escherichia coli 17BLSE 30 30 3.75 3.75 15 30


Escherichia coli 02 BLSE 15 30 1.875 3.75 7.5 7.5


Escherichia coli 16BLSE 30 30 3.75 3.75 15 30



Escherichia coli 06BLSE 15 15 1.875 1.875 7.5 15




Moyenne E.coli BLSE 33.75 37.5 4.37 4.53 17.5 24.37


100

P. aueruginosa ATCC 27853 - - - - - -

Pseudomona aueruginosa S - - - - - -

Pseudomona aueruginosa R - - - - - -

P. mirabilis ATCC 35659 7.5 15 0.46 0.46 7.5 7.5

Proteus mirabilis S 7.5 15 0.46 0.46 3.75 7.5

Proteus mirabilis R 15 15 1.875 1.875 7.5 7.5

K. pneumoniae ATCC 70603 3.75 7.5 0.93 0.93 3.75 7.5

Klebsiella pneumoniae S 7.5 7.5 1.875 1.875 7.5 7.5

Klebsiella pneumoniae R 3.75 7.5 0.93 0.93 3.75 3.75

Moyenne générale 10.20 14.37 1.49 1.67 6.63 8.95

S : sensible aux ATB ; R : résiste aux ATB

D’après les résultats ci–dessous, on remarque bien que les CMIBs (concentration minimale

inhibitrice du biofilm) sont plus ou moins grandes par rapport à celles des CMIs. Comme à l’état

planctonique, l’huile de C. cassia est la plus active vis–à–vis des souches responsables d’infection

urinaire en biofilm. Cette HE peut inhiber la croissance de ces microorganismes sous forme de

biofilms avec des concentrations intéressantes, qui varient entre 0,46 à 7,5 mg/ml. Pour

C. sativum et Z. hispanica, leurs HE sont également actives mais avec des taux supérieurs. Aussi,

on remarque que les souches qui possèdent le gène pap sont plus résistantes que les souches qui

possèdent le gène sfa et que les CMEBs sont légèrement supérieures à celles des CMIBs.

Selon les souches, on constate qu’E.coli BLSE sous forme de biofilms sont plus ou moins

résistantes vis–à–vis des HEs que les souches de référence (sensible aux antibiotiques). Cette légère

résistance des souches cliniques est expliquée par le faite que le phénotype de formation des

biofilms est beaucoup plus répondu chez les souches multi–résistantes que chez les souches

sensibles (Sanchez et al., 2013). D’autre part, il est connu que la matrice extracellulaire du biofilm

entrave l'efficacité de nombreux agents antimicrobiens (Davies, 2003). Par conséquent, on peut dire

que les souches cliniques d’E. coli BLSE en biofilm ont été légèrement résistantes vis–à–vis des

HEs probablement en raison de leur grande capacité de formation des biofilms. Cependant, même si

on a noté une légère résistance des souches cliniques d’E. coli en biofilm envers les HEs étudiées,

ces agents antimicrobiens naturels restent très actifs et intéressants, surtout l’huile de C. cassia.

En comparant nos résultats de l’effet d'inhibiteur des HEs étudiées vis–à–vis des souches en

état de biofilm avec des travaux antérieurs, Andersen , (2001) ont trouvé que le cinnamaldehyde et

l’eugénol (principaux composants de l'HE de la cannelle) sont capables d’inhibés la formation de

biofilm par Escherichia coli ATCC 33456.

Des expériences récentes ont montré que l'effet des deux composés sur la réduction de la

signalisation cellulaire et la formation de biofilm est additif, non synergique. Dans l'ensemble, la


101

présence d'eugénol et de cinnamaldéhyde dans Cinnamomum spp. pourrait faire partie d'une réponse

évolutive pour réduire l'ampleur de la colonisation bactérienne de la phyllosphère ( Niu et Gilbert,

2004).

D’après Bazargani et Rohloff, (2016), l’huile essentielle de coriandre avait une activité

antibiofilm élevée contre un biofilm formé par S. aureus et E. coli avec une CMIB de 0,8 ul/ml et

1,6 ul/ml, respectivement. Alors, que nous avons trouvé avec la même huile une CMIB de 17,5

mg/ml contre E.coli BLSE.

Les biofilms sont responsables d’infections chroniques et posent de nombreux problèmes dans

le domaine médical. Les infections liées à des biofilms touchent majoritairement les personnes

légèrement ou fortement immunodéprimés et impliquent souvent des bactéries commensales

comme Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa

(Costerton et al., 1999). Elles sont caractérisées par des symptômes qui surgissent de façon

récurrente et contribuent de manière très importante aux infections nosocomiales. En effet, les

biofilms ont la capacité de se développer sur divers instruments médicaux : sondes urinaires,

cathéters veineux, tubes de ventilation artificielle, prothèses orthopédiques. Dans la majorité des

cas, la seule solution efficace est le retrait de l’instrument infecté. D’autre part, la contamination des

systèmes de climatisation, de ventilation et de distribution d’eau par des biofilms abritant des

microorganismes pathogènes, contribue à la propagation des infections en milieux hospitaliers ou

non hospitaliers, mais également dans les environnement agroalimentaires où les biofilms sont une

source importante de nuisance (donlan et costerton, 2002).

Nombreuses études actuelles se focalisent sur les huiles essentielles du fait de leurs effets

bénéfiques dans la prévention des infections urinaires. L’adhérence des bactéries à l’uroépithélium

est la première étape dans la pathogénicité des infections urinaires suivie par la multiplication

bactérienne et la colonisation du tractus urinaire (Lowe et Fagelman, 2001). L’adhérence va

permettre notamment aux Escherichia coli de remonter via l’urètre dans la vessie en évitant leur

élimination par le flux urinaire. Pour permettre cette adhérence, les bactéries ont des prolongements

appelés fimbriae ou adhésines. De nature protéique, ces adhésines sont spécifiques, se liant aux

récepteurs hydrocarbonés correspondants à la surface des cellules uroépithéliales (Beachey, 1981).

III.21. Étude de la combinaison des huiles essentielles avec la céfotaxime

L’étude de la combinaison de l’antibiotique céfotaxime a été réalisée avec deux huiles

essentielles qui sont : Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum. Les résultats de la combinaison

sont présentés dans le tableau 50.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713515302152

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713515302152


102

Tableau 50: CFI des huiles essentielles de Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum

Espèces CMI HE

combinée à

l’ATB /CMI de

HE seul

CFI de l’HE CMI ATB

combinée à HE

/CMI d’AB

seul

CFI ATB CFI Interprétation

Coriandrum sativum.

Cinnamomum cassia

1.25/2.5

0.31/0.63

0.5

0.5

0.0625/0.125

0.0625/0.125

0.5

0.5

1

1

Effet d’addition

Effet d’addition

Selon la formule CFI = CFI l’huile + CFI de la cefotaxime, toutes les HEs testées

présentent juste l’effet d’addition, avec des CFI égales à 1. Tandis qu’aucun effet de synergie ou

d’antagonisme envers E. coli n’a été observé.

En comparant nos résultats de la combinaison avec des travaux antérieurs, Yap et al., (2013)

ont montré que Cinnamomum verum présente un effet synergétique avec pipéracilline et

Ampicilline.

Les travaux sur les combinaisons des agents antimicrobiens en clinique ont montré leurs

efficacités en augmentant l’effet antimicrobien et en diminuant la concentration des antibiotiques.

Ces derniers gardent toujours leurs effets inhibiteurs surtout lorsqu’ils possèdent une forte synergie

entre eux (Denes et Hidri, 2009). Plusieurs travaux ont montré la possibilité de l’association des

antibiotiques avec les huiles essentielles dans le but d’augmenter leurs effets a de faibles doses et

ainsi pour diminuer la toxicité de plusieurs antibiotiques (Shin et Kang, 2003 ; Rosato et al.,

2008).

III.22. Cinétique de destruction d’E. coli avec les huiles essentielles

Afin d’évaluer la rapidité de l’activité antibactérienne pour se rapprocher d’un contexte

d’utilisation clinique, nous avons mesuré le taux de réduction de la population bactérienne par les

deux huiles essentielle les plus actifs (Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum) contre E. coli

BLSE 09 à la concentration de CMB (figures 25 et 26).


Cinnamomum cassia pendant 15, 30, 45 et 75 mn à la concentration de CMB= 5 mg/ml.


103


Coriandrum sativum pendant 15, 30, 45, 75,90,120,150,180 et 240 mn aux concentrations CMB=

10, 20 et 40 mg/ml.

Les résultats des figures 25 et 26 montrent que l’HE de Cinnamomum cassia a détruit toutes

les cellules bactériennes au bout de 75 min, alors qu’il a fallu 240 min pour détruire toutes les

cellules par Coriandrum sativum.

Senhaji et al., (2007), en étudiant la cinétique de destruction de la souche E.coli O157: H7 par

l’huile essentielle de Cinnamomum zeylanicum, ont trouvé que la souche est détruite au bout de 60

min à la concentration de 0.025℅.

Vu les résultats ci-dessus, on peut dire que l’HE de Cinnamomum cassia était la plus active

sur les souches E. coli BLSE avec une CMI= 1,97mg/ml et une CMB= 2,5mg/ml. Alors les HEs de

C. sativum et Z. hispanica étaient moins actives. Cette variabilité d’effet des HEs est due à

plusieurs paramètres dont la composition chimique. En effet, le cinnamaldéhyde, composant

majoritaire de Cinnamomum cassia, est très actif sur les souches alors que la pulégone et linalool

sont reconnu moins actif (Khani et Rahdari, 2012 et Chang et al., 2013).

Nombreux antibiotiques sont toxiques de manière intrinsèque, citons notamment la

néphrotoxicité des aminosides, les troubles de l'hémostase causés par les β-lactamines et les

troubles de la minéralisation dentaire et osseuse provoqués par les tétracyclines. Jamais de tels

effets indésirables n'ont été observés avec l'emploi des HEs non caustiques (Jouault, 2012. C’est

vrai, certaines sont toxiques, et c'est seulement par ignorance des précautions d'emploi les plus

basiques que des accidents surviennent. Mais respectant des conditions d'utilisation bien établies,

comme on le fait déjà pour les antibiotiques, le risque de survenue d'accidents iatrogènes serait

proche de zéro.

Il ne faut jamais utiliser les HEs à l’état pur. Bien que l’HE de cannelle à cinnamaldéhyde est

irritante pour les muqueuses et la peau à faible dose, son utilisation reste. La concentration


104

maximale est de 0.5% et ne doit être utilisée qu'en application externe. Elle est contre indiquée en

cas de gestation (Bruneton, 2009). La toxicité aiguë de l'huile essentielle est très faible (DL50 =

4.16 g/kg chez le rat par voie orale) (Bruneton, 2009). La consommation de cannelle ne présente

pas de risques à la dose journalière acceptable pour l'humain a été fixée à 1.25 mg/kg de

cinnamaldéhyde (Bruneton, 2009).

Ajoutons que de nombreux patients peuvent supporter les effets indésirables constants de la

plupart des antibiotiques : effets digestifs (nausées, maux de ventre, diarrhées), apparition de

mycoses (candidose buccale, intestinale, vaginale). Pour tenter de prévenir ces effets secondaires, il

est fréquent de voir prescrits sur la même ordonnance l'antibiotique associé à un probiotique comme

un extrait de cannelle (HE) car cette association n’entraine pas ces désagréments. En effet les HEs

n'entraînent pas ce genre de désagréments puisque la microflore intestinale de l'être humain est

accoutumée depuis des milliers d'années à être en contact avec ces molécules naturelles, que l'on

trouve pour la plupart dans les épices et les herbes condimentaires. En effet, il a été montré que les

bactéries commensales, celles faisant partie du pool habituellement retrouvé dans l'organisme

humain, exprimaient une résistance aux HE de 8 à 32 fois supérieure par rapport aux bactéries

pathogènes (Hammer et al., 1999).

Conclusion générale


105


La résistance aux antibiotiques est devenue un problème majeur de santé publique en

Algérie et à travers le monde. En effet, au cours de ces dix dernières années, nous avons

constaté une importante augmentation de la résistance aux antibiotiques en particulier chez les

bacilles à Gram négatif.

La multirésistance des souches d’E.coli BLSE, représente une vraie menace pour la santé

publique, puisqu’elle touche plusieurs molécules allant des β-lactamines, aux aminosides et

aux quinolones. Le risque étant la difficulté de traitement des infections à E. coli produisant

les gènes de résistance en milieu hospitalier.

L’objectif assigné à cette étude était d’évaluer l’effet inhibiteur de trois plantes

aromatiques : Cinnamomum cassia, Coriandrum sativum et Ziziphora hispanica sur

Escherichia coli (BLSE) responsables d’infections urinaires d’origine hospitalière.

D'après les résultats de l'étude rétrospective, 132 malades ayant eu des infections

urinaires (ECBU) ont été recensés durant la période allant de 2011 à 2013. La fréquence de

ces infections urinaires était élevée chez les femmes (33 ,83%) par rapport à celle des

hommes (24 %). Les patients qui ont un âge compris entre 20 et 40 ans ont montré une

incidence d'infection urinaire importante (33,89%). La fréquence des infections urinaires était

élevée dans le service de la médecine interne (33℅) suivi des services de maternité et

d’urologie (28℅ par service).

Parmi les germes isolés, Escherichia coli a été le plus fréquent (63%). On a constaté que

les taux de résistance les plus élevés sont observés avec les pénicillines (amoxicilline

83,13℅, ticarciline 75,9℅ et pipéraciline 61,44℅). L’association des pénicillines avec les

inhibiteurs de -lactamase a permis de récupérer l’activité de ces molécules. En effet, on note

des taux de 62,65℅ pour l’amoxiciline+acide clavulanique, 24,09℅ pour

pipéraciline+tazobactam et 39,75℅ pour ticarciline+acide clavulanique. Pour les

céphalosporines de troisième génération (céfotaxime et ceftazidime) on a noté une résistance

importante (56,62℅). Pour les autres classes d’antibiotiques, les aminosides et les quinolones

ont montré une bonne activité sur E. coli (18℅ à 39℅).

L’analyse des extraits d’ADN d’E. coli BLSE par amplification a révélé la présence des

gène de résistance aux -lactamine bla CTX-15 et TEM-1 avec un pourcentage élevée, des

gènes de résistance aux quinolones et aux aminoside à savoir les gènes aac(6)-lb, qnrB, qnrA,

armA et rmt B, et les gène de virulence l’opéron d’adition pap, et/ou l’opéron sfa et le gène

toxine d’hémolyse cnf1. L’étude ERIC/PCR à montré qu’il y a un polymorphisme de souches


106

E. coli BLSE, ce qui pourrait annuler l’hypothèse d’une épidémie ayant pour origine la même

souche clonale.

L’analyse chimique des trois huiles essentielles par CG/SM a révélé que ces huiles sont

chimiquement variées. L’huile de Cinnamomum cassia est riche en phénylpropanoides dont le

cinnamaldéhyde est le composé majoritaire (75,85%), alors que les huiles de Coriandrum

sativum et Ziziphora hispanica sont riches respectivement en linalol (85.57℅) et en pulégone

(88.33℅).

L’activité antimicrobienne des trois huiles essentielles envers E. coli BLSE, a montré

que l’huile de Cinnamomum cassia est la plus active contre ces souches testées à l’état

planctonique et biofilm. A l’état sessile, l’huile a donné un diamètre moyen d’inhibition de

33,25 mm, une CMImoy = 1,97mg/ml et une CMBmoy = 2,5 mg/ml. A l’état de biofilm, elle

a donné une CMIBmoy = 4,37 mg/ml et une CMEBmoy = 4,53 mg/ml. Par contre les huiles

essentielles de Coriandrum sativum et Ziziphora hispanica sont moins actif. Le même

résultat a été obtenu vis-à-vis des souches Klebsiella pneumoniae et Proteus mirabilis où

l’huile de Cinnamomum c’est révélée la plus active.

La combinaison des huiles avec l’antibiotique céfotaxime a montré que l’huile de

Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum présente un effet d’addition, alors, que le suivi

de la cinétique de destruction des cellules en fonction du temps, a montré que l’huile

essentielle de Cinnamomum cassia a détruit toutes les cellules bactériennes au bout de 30

min, mais il a fallu 240 min pour détruire toutes les cellules par Coriandrum sativum.

Les résultats obtenus affirment bien le pouvoir antimicrobien des huiles essentielles,

notamment l'HE de cannelle, qui a montré une forte activité in vitro contre les souches E. coli

BLSE d’origine hospitalière à une faible concentration.

L’utilisation de la cannelle comme alicament (utilisation alimentaire et thérapeutique)

constitue un alternatif aux antibiotiques pour lutter contre la flore pathogène (uropathogene)

tout en préservant la flore résidente. Cependant, il serait intéressant de valoriser la cannelle et

autres plantes aromatiques in vivo, d’élargir l’étude sur d’autres souches résistantes à d’autres

antibiotiques, d’étudier l’effet de ces huiles sur les types de β-lactamases et pourquoi pas

élaborer des produits pharmaceutiques à base d’huiles essentielles contre les diverses

infections.

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.

.

Annexe

Annexe1

Fiche d’enquête sur les infections urinaires

ETAT CIVIL

Nom :...................................Prénom : ....................................

Sexe : M / F

Femmes : enceinte : O / N

Age …………. ou date de naissance : ….. / .…. / …..

Adresse du patient (nom du quartier) : .…………….……

CLINIQUE

Date du prélèvement : ….. / .…. / ….. h

Motif de la consultation : Douleur / Fièvre>38°C / Ctrl après traitement / ne sais pas /

Autres : ………..

Anomalie rénale ou vaginale : N / anomalie rénale :…………….

Anomalie vaginale : ……………..

Terrain diabétique : O / N

Hospitalisation de moins de 6 mois dans une clinique ou un hôpital : O / N

Si oui, nom de la clinique ou de l’hôpital : …………………….

Présence de sonde urinaire il y a moins de 7 jours : O / N

Antécédent infection urinaire : O / N

Annexe1

Questionnaire sur l’utilisation des plantes anti-Infections Urinaires

1- Information sur les plantes anti-IU

Connaissez- vous des plantes traditionnelles pour le traitement des IU?

Oui Non

Si oui, les quelles et comment ?………………………………………………………

2- Utilisez-vous les plantes traditionnelles pour traiter les IU ?

Oui Non

Si oui, les quelles ?…………………………………………………………………….

3- Sous quelle forme vous utilisez ?

…………………………………………………………………………………………

4- Quelle est la fréquence avec laquelle vous utilisez les plantes médicinales ?

………………………………………………………………………………………….

Annexe 2

Sensibilité aux antibiotiques des bactéries isolées d’urine au CHU de Tlemcen

(2011-2013)

E. coli

ATB R I S TOTAL

PRL 51 (61.44℅)

12 (14.45℅)

21 (25.30℅)

83 (100℅)

TZP 20 (24.09℅)

0 (0℅)

63 (75.90℅)

83 (100℅)

TIM 33 (39.75℅)

12 (12.45℅)

38 (45.73℅)

83 (100℅)

KF 66 (79.51℅) 0 (0℅)

17 (20.48℅)

83 (100℅)

FEP 27 (32.53℅)

0 (0℅)

56 (67.46℅)

83 (100℅)

AMC 52 (62.65℅)

0 (0℅)

29 (34.93℅ )

83 (100℅)

AMX 69 (83.13℅)

0 (0℅)

12 (14.45℅)

83 (100℅)

AMT 47 56.62

0 (0℅)

36 (43.37℅)

83 (100℅)

FOX 29 (34.93℅)

0 (0℅)

55 (66.26℅)

83 (100℅)

CAZ 47 (56.62℅)

0 (0℅)

38 (45.78℅)

83 (100℅)

CTX 47 85.62

0 (0℅)

38 (45.78℅)

83 (100℅)

TIC 63 (75.90℅)

0 (0℅)

21 (25.30℅)

83 (100℅)

CIP 17 (20.48℅)

0 (0℅)

46 (78.13℅)

83 (100℅)

NA 33 (39.75℅)

0 (0℅)

51 (61.44℅)

83 (100℅)

ka 15 (18.07℅)

3 (3.61℅)

65 (78.33℅)

83 (100℅)

GN 16 (19.27℅)

0 (0℅)

67 (80.72℅)

83 (100℅)


TZP:Pipéraciline+Tazobactam;CAZ:Ceftazidine;ATM:Aztreonam ;TIC:Ticarciline ;

TIM:Ticaciline+Acide Clavulanique ; AMX:Amoxicilline ; AMC:Amoxicilline+Acide

Clavulanique ; IMP:Imipinème ; GN;Gentamicine ; AK:Amikacine ; CIP:Ciprofloxacine

NA : Acide Nalidixique.

E. c : E coli ; S : Sensible ; R : Résistance ; I : Intermédiaire

Annexe 2

Enterobacter sakazakic

ATB R I S TOTAL

PRL 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

TZP 0 (0℅)

1 (25℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

TIM 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

KF 3 (75℅)

0 (0℅)

1 (25℅)

4 (100℅)

FEP 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

AMC 3 (75℅)

0 (0℅)

1 (25℅)

4 (100℅)

AMX 3 (75℅)

0 (0℅)

1 (25℅)

4 (100℅)

AMT 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

FOX 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

CAZ 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

CTX 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

TIC 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

CIP 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

NA 2 (50℅)

0 (0℅)

2 (50℅)

4 (100℅)

KA 0 (0℅)

0 (0℅)

4 (100℅)

4 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

4 (100℅)

4 (100℅)

GN 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)







Annexe 2

Enterobacter cloacae

ATB R I S TOTAL

PRL 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

TZP 2 (66.66℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

TIM 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

KF 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

FEP 0 (0℅)

0 (0℅)

3 (100℅)

3 (100℅)

AMC 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

AMX 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

AMT 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

FOX 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

CAZ 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1(33.33℅) 3 (100℅)

CTX 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

TIC 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

CIP 1 (33.33℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

NA 2 (66.66℅)

0(0℅) 1 (33.33℅)

3 (100℅)

KA 1 (33.33℅)

0(0℅) 2 (66.66℅)

3 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0(0℅) 3 (100℅)

3 (100℅)

GN 1 (33.33℅)

0(0℅) 2 (66.66℅)

3 (100℅)







Annexe 2

Proteus mirabilis

ATB R I S TOTAL

TZP 0 (0℅)

2 (33.33℅)

2 (33.33℅)

6 (100℅)

PRL 3 (50℅)

1 (33.33℅)

2 (33.33℅)

6 (100℅)

TIM 2 (33.33℅)

1 (33.33℅)

3 (50℅)

6 (100℅)

KF 3 (50℅)

0 (0℅)

3 (50℅)

6 (100℅)

FEP 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

AMC 3 (50℅)

0 (0℅)

3 (50℅)

6 (100℅)

AMX 4 (66.66℅)

0 (0℅)

2 (33.33℅)

6 (100℅)

AMT 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

FOX 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

CAZ 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

CTX 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

TIC 4 (66.66℅)

0 (0℅)

2 (33.33℅)

6 (100℅)

CIP 3 (50℅)

1 (16.66℅)

2 (33.33℅)

6 (100℅)

NA 4 (66.66℅)

1 (16.66℅)

2 (33.33℅)

6 (100℅)

KA 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

GN 2 (33.33℅)

0 (0℅)

4 (66.66℅)

6 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

6 (100℅)

6 (100℅)







Annexe 2

Aeromonas hydrophila

ATB R I S TOTAL

PRL 0 (0℅)

0 (100℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

TZP 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

TIM 0 (0℅)

1 (100℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

KF 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

FEP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

AMC 0 (0℅)

1 (100℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMX 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMT 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

FOX 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

CAZ 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

CTX 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

TIC 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

CIP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

NA 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

KA 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

GN 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)







Annexe 2

Acinetobacter baumanii

ATB R I S TOTAL

PRL 2 (50℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

TZP 0 (0℅)

1 (25℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

TIM 1 (25℅)

1 (25℅)

2 (50℅)

4 (100℅)

KF 4 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

4 (100℅)

FEP 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

AMC 4 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

4 (100℅)

AMX 4 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

4 (100℅)

AMT 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

FOX 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

CAZ 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

CTX 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

TIC 2 (50℅)

0 (0℅)

2 (50℅)

4 (100℅)

CIP 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

NA 2 (50℅)

0 (0℅)

2 (50℅)

4 (100℅)

KA 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

GN 1 (25℅)

0 (0℅)

3 (75℅)

4 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

4 (100℅)

4 (100℅)







Annexe 2

Providencia stuartii

ATB R I S TOTAL

PRL 0 (0℅)

0 (100℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

TZP 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

TIM 0 (0℅)

1 (100℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

KF 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

FEP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

AMC 0 (0℅)

1 (100℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMX 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMT 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

FOX 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

CAZ 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

CTX 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

TIC 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

CIP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

NA 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

KA 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

GN 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)







Annexe 2

Citrobacter freundii

ATB R I S TOTAL

PRL 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

TZP 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

TIM 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

KF 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

FEP 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMC 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMX 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMT 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

FOX 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

CAZ 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

CTX 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

TIC 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

CIP 1 (0℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

NA 1 (0℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

KA 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

GN 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)







Annexe 2

Serratia marecesens

ATB R I S TOTAL

PRL 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

TZP 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

TIM 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

KF 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

FEP 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMC 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMX 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

AMT 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

FOX 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

CAZ 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

CTX 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

TIC 1 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

CIP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

NA 1 (0℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

KA 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

GN 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

1 (100℅)

1 (100℅)







Annexe 2

Klebsiella oxytoca

ATB R I S TOTAL

TZP 0 (0℅)

1 (33.33℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

PRL 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

TIM 0 (0℅)

1 (33.33℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

KF 3 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

3 (100℅)

FEP 1 (33.33℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

AMC 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

AMX 3 (100℅)

0 (0℅)

0 (0℅)

3 (100℅)

AMT 1 (33.33℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

FOX 1 (33.33℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

CAZ 1 (33.33℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

CTX 1 (33.33℅)

0 (0℅)

2 (66.66℅)

3 (100℅)

TIC 2 (66.66℅)

0 (0℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

CIP 1 (33.33℅)

1 (33.33℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

NA 2 (66.66℅)

1 (33.33℅)

0 (0℅)

3 (100℅)

KA 1 (33.33℅)

1 (33.33℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

GN 1 (33.33℅)

1 (33.33℅)

1 (33.33℅)

3 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

3 (100℅)

3 (100℅)







Annexe 2

Klebsiella pneumoniae

ATB R I S TOTAL

TZP 0 (0℅)

0 (0℅)

16 (100℅)

16 (100℅)

PRL 15 (93.75℅)

1 (6.25℅)

0 (0℅)

16 (100℅)

TIM 9 (56.5℅)

1 (6.25℅)

5 (31.25℅)

16 (100℅)

KF 13 (81.25℅)

0 (0℅)

3 (18.75℅)

16 (100℅)

FEP 12 (75℅)

0 (0℅)

3 (18.75℅)

16 (100℅)

AMC 10 (62.5℅)

0 (0℅)

6 (37.5℅)

16 (100℅)

AMX 15 (93.75℅)

0 (0℅)

1 (6.25℅)

16 (100℅)

AMT 12 (75℅)

0 (0℅)

4 (25℅)

16 (100℅)

FOX 5 (31.25℅)

0 (0℅)

11 (68.75℅)

16 (100℅)

CAZ 12 (75℅)

0 (0℅)

4 (25℅)

16 (100℅)

CTX 12 (75℅)

0 (0℅)

4 (25℅)

16 (100℅)

TIC 15 (93.75℅)

0 (0℅)

1 (6.25℅)

16 (100℅)

CIP 3 (18.75℅)

0 (0℅)

13 (81.25℅)

16 (100℅)

NA 5 (31.25℅)

0 (0℅)

11 (68.75)

16 (100℅)

KA 2 (12.5℅)

0 (0℅)

14 (87.5℅)

16 (100℅)

GN 2 (12.5℅)

0 (0℅)

14 (87.5℅)

16 (100℅)

IMP 0 (0℅)

0 (0℅)

16 (100℅)

16 (100℅)







Annexe 3

Pourcentage de résistance des entérobactéries aux antibiotiques

Espèce TZP PRL TIM KF FEP IMP AMC AMX ATM FOX CAZ TIC CTX CIP NA GN AK

E. coli 24,09 61.44 39,75 79.51 32.53 0 62.65

83.13 56.62 34.93 56.62 75.90 56.62 20.48 39.75

19.27

18,07

Enterobacter sakazakic 0 25 25 75 25 0 75 75 25 25 25 25 25 25 50 25 0

Enterobacter cloacae 66,66 66,66 66,66 66,66 0 0 66,66 66,66 66,66 66,66 66,66 66,66 66,66 33,33 66,66 33,33 33,33

Proteus mirabilis 0 50 33,33 50 33.33 0 50 66,66 33,33 33,33 33,33 66,66 33,33 50 66,66 33,33 33,33

Acinetobacter

baumanii

0 50 25 100 25 0 100 100 25 25 25 50 25 25 50 25 25

Providencia stuartii 0 100 0 0 0 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0 0 0

Aeromonas hydrophila 0 100 0 0 0 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0 0 0

Citrobacter freundii 0 100 100 100 0 0 100 100 100 0 100 100 100 100 100 0 0

Serratia marecesens 0 100 100 100 0 0 100 100 100 0 100 100 100 0 100 0 0

Klebsiella oxytoca 0 66.66 0 100 33,33 0 66,66 100 33,33 33,33 33,33 66,66 33,33 33,33 66,66 33,33 33,33

Klebsiella pneumoniae 0 93,75 56,25 81,25 75 0 62,5 93,75 75 31,25 75 93,75 68.75 18,75 31,25 12,5 12,5

CTX:Céfotaxine ; FOX:Cefotaxime ; CF:Céfalotine ; FEP:Péfloxacine ; PRL:Pipéraciline, TZP:Pipéraciline+Tazobactam ; CAZ:Ceftazidine ;

ATM:Aztreonam ; TIC:Ticarciline ;TIM:Ticaciline+Acide Clavulanique ; AMX:Amoxicilline ; AMC:Amoxicilline+Acide Clavulanique ;

IMP:Imipinème ; GN;Gentamicine ; AK:Amikacine ; CIP:Ciprofloxacine NA : Acide Nalidixique.

Annexe 4

Phénotype de résistance d’E. coli

Code TZP PRL TIM KF FEP IMP AMC AMX ATM FOX CAZ TIC CTX CIP NA GN KA Phénotype

E .c 01 S R R R R S R R

R

S R R R S S S I BLSE

E .c 02 S R R R R S R R R S R R R S R S S BLSE

E .c 03 S R S R R S S R R R R R R S S R R BLSE

E .c04 S R S R R S S R R S R R R S S S S BLSE

E .c 05 S R R R R S R R R S R R R R R R R BLSE

E .c 06 S R S R R S S R R R R R R S S R R BLSE

E .c 08 S R R R R S R R R S R R R S R R S BLSE

E .c 09 S R S R R S S R R S R R R S R S R BLSE

E .c 10 S R S R R S S R R S R R R R R S R BLSE

E .c 11 S R S R R S S R R S R R R S S S S BLSE

E .c 12 S R S R R S S R R S R R R S R S S BLSE


E .c 15 S R R R R S R R R S R R R R R R R BLSE

E .c 16 S R S R R S S R R S R R R R R S S BLSE

E .c 17 S R R R R S R R R S R R R R S S R BLSE

Annexe 4

E .c 18 S R R R R S R R R S R R R R S S R BLSE

E .c 19 S R R R R S R R R R R R R S R S S BLSE



E .c 22 S R S R R S S R R R R R R S R R S BLSE

E .c 23 S R R R R S R R R R R R R R S S S BLSE

E .c 24 S R R R R S R R R S R R R S R S I BLSE

E .c 25 S R R R R S R R R S R R R R S S S BLSE

E .c 26 S R R R R S R R R R R R R S S S I BLSE

E .c 27 S R R R R S R R R S R R R S R S S BLSE

E .c 28 S R S R R S S R R S R R R S R S S BLSE


E .c 30 R R R R S S R R R R R R R S R R R Case

E .c 31 R R R R S S R R R R R R R R R R R Case

E .c 32 S S S R S S R R S R S S S S S S S Case

E .c33 S S S R S S R R S R S S S S S S S Case

E .c 34 R R R R S S R R R R R R R S R S S Case


Annexe 4


E .c37 R R R R S S R R R R R R R S S S S Case


E .c 39 R R R R S S R R R R R R R R R S S Case






E .c 45 R R R R S S R R R R R R R R R R S Case

E .c 46 R R R R S S R R R R R R R S R R S Case

E .c 47 R R R R S S R R R R R R R S S S S Case

E .c 48 R R R R S S R R R S R R R S R R S Case

E .c 49 R R R R S S R R R S R R R R R R S Case

E .c 50 R R R R S S R R R S R R R R R R S Case


E .c 52 R R R R S S R R R R R R R S R R S Case


Annexe 4



E .c 56 S R S S S S S R S S S R S S S S S Pase


E .c 58 S I I R S S R R S S S R S S S S S Pase

E .c59 S I I R S S R R S S S R S S S S S Pase








E .c67 S I I R S S R R S S S R S S S S S Pase




E.c 71 S R S S S S S R S S S R S S S S S Pase

Annexe 4

E .c 72 S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible













E. c 85 S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible


ATM:Aztreonam ; TIC:Ticarciline ;TIM:Ticaciline+Acide Clavulanique ; AMX:Amoxicilline ; AMC:Amoxicilline+Acide Clavulanique ;

IMP:Imipinème ; GN;Gentamicine ; AK:Amikacine ; CIP:Ciprofloxacine NA : Acide Nalidixique.

E c : E coli ; S : sensible ; R :résistance ;BLSE: β-lactamase à spectre étendu ;Case :Céphalosporinase ;Pase :pénicillinase

Annexe 5

Données sur les patients infectés par E. coli

Code Service Date de

prélèvement

Sexe

Age Durée

d'hospitalisation

Antécédents

d'hospitalisation Motifs d'hospitalisation

Antécédents

d’infection

urinaire

Acte

adhésif

E .c 01 Maternité avr-2011 Femme 35 7 nom Anémie nom voie

veineuse

E .c 02 Maternité févr-2013 Femme 22 8 oui 2fois'maternité' HTA +enceinte'7 mois' oui nom

E .c 03 Maternité avr-2012 Femme 31 10 oui 3 fois 'maternité' MAP+enceinte'6mois' nom nom

E .c04 Maternité mars-2013 Femme 37 15 oui 2 fois 'maternité' HTA +enceinte'9 mois' oui nom

E .c 05 Maternité avr-2013 Femme 38 14 nom Problème

rénale+enceinte'8mois' nom nom

E .c 06 Maternité mai-2013 Femme 30 10 nom MAP nom nom

E .c 08 Maternité juin-2013 Femme 31 14 oui 2 fois 'maternité' MAP+enceinte'9mois' oui nom

E .c 09 Urologie nov-2011 Homme 91 2 oui Rétrécissement urétral nom nom

E .c 10 Urologie févr-2011 Homme 57 3 oui problème rénale

oui voie

veineuse

E .c 11 Urologie juin-2013 Homme 69 2 nom Tumeur vésicale nom voie

veineuse

E .c 12 Urologie Nov-2011 Homme 63 2 nom Rétrécissement urétral oui nom

E .c 14 Urologie nov-2012 Homme 90 2 oui 3fois'urologie Rétrécissement urétral nom nom

E .c 15 Urologie mars-2013 Homme 42 3 non Tumeur vésicale nom nom

E .c 16 Médecine Interne janv-2012 Femme 95 10 oui 2fois'urologie Diabète nom Nom

E .c 17 Médecine Interne juin-2013 Femme 56 15 nom Hépatite+diabète oui nom

E .c 18 Médecine Interne juin-2012 Femme 65 20 Oui (maternité et

médecine interne) Diabète nom nom

E .c 19 Médecine Interne déc-2012 Femme 40 15 Oui (maternité) Diabète oui nom

E .c 20 Médecine Interne févr-2012 Femme 37 11 Oui (maternité et

médecine interne) Diabète nom

voie

veineuse

E .c 21 Médecine Interne nov-2011 Femme 83 22 Oui (maternité et Gangrène oui voie

Données sur les patients infectés par E coli

Annexe 5


médecine interne) veineuse

E .c 22 Médecine Interne Févr2013 Homme 35 8 Ou i(maternité ) Diabète nom nom

E .c 23 Urologie mai-2013 Homme 30 13 Oui (maternité) Tumeur Vésical nom nom

E .c 24 Maternité mars-2013 Femme 39 4 nom HTA+ grossesse nom nom

E .c 25 Médecine Interne juin-2013 Femme 55 20 nom Gangrène nom nom

E .c 26 Urologie juin-2013 Homme 58 3 nom Abcès Rénale nom voie

veineuse

E .c 27 Maternité mars-2013 Femme 35 10 Oui (maternité) Anémie nom nom

E .c 28 Urologie nov-2012 Femme 62 3 nom Tumeur prostate' 2 Ans' oui nom

E .c 29 Urologie avr-2013 homme 79 2 non Tumeur de Vessie oui nom

E .c 30 Maternité

16/01/2012 Femme 35 20 nom Map oui voie

veineuse

E .c 31 Maternité 11/04/2011 Femme 23 15 nom HTA nom nom

E .c 32 Maternité 2011 Femme 30 11 nom Cancer utérus nom nom

E .c33 Maternité

04/02/2013 Femme 35 2j oui Kyste d'ovaire nom voie

veineuse

E .c 34 Maternité

05/02/2013 Femme 27 10 oui HTA nom voie

veineuse

E .c 35 Maternité 20/02/2013 Femme 28 15 nom Map nom nom

E .c 36 Maternité 2013 Femme 21 5 nom Map nom nom

E .c37 Maternité 16/01/2012 Femme 23 21 nom Abcès rénale nom nom

E .c 38 Urologie 16/10/2011 Femme 40 15 nom Adénome prostate 4 ans nom voie

veineuse

E .c 39 Urologie 09/11/2011 Homme 70 2 nom Tumeur de vessie oui nom

E .c 40 Urologie 2013 Homme 69 2 nom Tumeur de vessie oui nom

E .c 41 Urologie 2013 Homme 82 2 oui Tumeur de vessie oui nom

E .c 42 Urologie 2012 Homme 42 3 nom Insuffisante rénale oui nom

Annexe 5


E .c 43 Urologie 05/06/2012 Femme 65 15 oui Gangrène oui voie

veineuse

E .c 44 Urologie 2012 Homme 44 20 nom Plait infecte nom nom

E .c 45 Médecines Interne 16/11/2012 Homme 30 10 nom Plait infecte nom nom

E .c 46 Médecines Interne 25/05/2012 Femme 70 9 oui Plait infecte oui nom

E .c 47 Médecines Interne 15/02/2012 Femme 72 21 oui Diabète oui nom

E .c 48 Médecines Interne 2013 Homme 1941 15 oui Diabète oui nom

E .c 49 Médecines Interne 2013 Femme 24 17 nom Plait infecte non nom

E .c 50 Médecines Interne 2013 Femme 36 20 nom Plait infecte nom nom

E .c 51 Médecines Interne 30/05/2012 Homme 26 10 nom HTA nom nom

E .c 52 Maternité

Mars-11 Femme 34 5 non Map non voie

veineuse

E .c 53 Maternité

Juin-13 Femme 28 10 oui 2 fois 'maternité' HTA oui voie

veineuse

E .c 54 Maternité

Mars-13 Femme 34 7 non Map oui voie

veineuse

E .c 55 Maternité Juin-13 Femme 28 15 oui 2 fois 'maternité' Diabète oui nom

E .c 56 Maternité

29/08/2012 Femme 35 15 nom Diabète nom voie

veineuse

E .c 57 Maternité 10/06/2013 Femme 38 4 oui Kyste d'ovaire nom nom

E .c 58 Maternité 15/02/2012 Femme 45 16 oui Map nom nom

E .c59 Maternité 08/03/2013 Femme 35 8 nom Traumatisme rénale nom nom

E .c 60 Urologie 31/05/2011 Homme 37 3 nom Rétrécissement urétral

nom voie

veineuse

E .c 61 Urologie 31/05/2012 Homme 50 4 oui Abcès rein oui voie

veineuse

E .c 62 Urologie 05/05/2013 Femme 36 6 oui Tumeur de vessie oui voie

veineuse

Annexe 5


E .c 63 Urologie 07/04/2013 Homme 39 5 nom Lithiase rénale nom voie

veineuse

E .c 64 Urologie 27/03/2012 Femme 36 3 oui Hépatite oui voie

veineuse

E .c 65 Médecines Interne 15/06/2013 Femme 23 15 nom Diabète oui nom

E .c 66 Médecines Interne 04/01/2011 Femme 79 16 oui Thyroïde oui nom

E .c67 Médecines Interne 30/05/2012 Femme 26 10 non HTA bom nom

E .c 68 Médecines Interne

08/05/2012 Homme 67 15 nom Diabète oui voie

veineuse


22/08/2013 Homme 83 20 nom Diabète oui voie

veineuse

E .c 70 Médecines Interne 17/05/2013 Homme 77 17 nom Anémié oui nom

E.c 71 Maternité 10/04/2013 Femme 36 15 oui Diabète oui nom

E .c 72 Maternité

22/04/2011 Femme 33 11 oui HTA nom voie

veineuse

E .c 73 Maternité 12/05/2011 Femme 30 10 nom Diabète nom nom

E .c 74 Maternité 29/05/2011 Femme 35 6 oui HTA nom nom

E .c 75 Maternité 10/05/2011 Femme 25 12 oui Tumeur de vessie nom nom

E .c 76 Urologie 17/04/2013 Homme 61 2 nom Adénome prostate

nom voie

veineuse

E .c 77 Urologie 21/11/2011

Homme 90 2 nom Lithiase rénale nom voie

veineuse

E .c 78 Urologie 04/02/2012 Femme 45 4 oui Tumeur de vessie oui voie

veineuse

E .c 79 Urologie 07/03/2011 Homme 65 2 nom Lithiase rénale nom voie

veineuse

E .c 80 Urologie 05/08/2013 Femme 45 4 nom Diabète nom voie

veineuse

E .c 81 Médecines Interne 04/02/2011 Femme 54 10 oui Diabète oui voie

Annexe 5


MAP : accouchement prématuré

HTA : hypertension artérielle

Ec : E coli

veineuse


12/12/2013 Femme 31 7 nom Diabète nom voie

veineuse

E .c 83 Médecines Interne 08/02/2012 Femme 31 9 oui Diabète nom nom

E .c 84 Médecines Interne 16/03/2012 Homme 31 7 nom Diabète nom nom

E. c 85 Médecines Interne 15/05/2011 Homme 47 5 nom Map nom nom

Annexe 6

Caractéristiques d’E. coli BLSE

Code Gène de BLSE

Gène de

resistance aux

β-lactamine

Gène de resistance

aux quinolone

Gène de

resistance aux

aminosides

Genes de

virulence

groupement

phylogenetique ERIC

profile

E .c06 blaCTX-M-15 blaTEM-1 armA A0 c

E.c12 blaCTX-M-15 blaTEM-1 A0 f

E .c22 blaCTX-M-15 blaTEM-1 A0 j

E.c24 blaCTX-M-15 blaTEM-1 A0 e

E. c26 blaCTX-M-15 blaTEM-1, blaCMY-2 A0 p

E.c27 blaCTX-M-15 blaTEM-1 qnrB1 A0 o

E. c 01 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr A1 a

E.c02 blaCTX-M-15 blaTEM-1 qnrA1, aac(6')-Ib-cr A1 q

E .c04 blaCTX-M-15 blaTEM-1 qnrB1, aac(6')-Ib-cr pap A1 c

E.c05 blaCTX-M-15, blaCTX-M-14 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr sfa A1 c

E.c08 blaCTX-M 15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr armA ,rmtB sfa A1 e

E.c09 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr armA,rmtB sfa A1 f

E.c14 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr sfa, A1 g

E.c18 blaCTX-M-15 blaTEM-1 qnrB1 A1 c

E.c23 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr A1 k

E.c03 blaCTX-M-15, blaCTX-M-14 blaTEM-1 B1 b

E.c10 blaCTX-M-15 blaTEM-1 pap B1 f

E.c16 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr B1 h

E.c19 blaCTX-M-15 blaTEM-1, blaMOX pap B1 h

E.c25 blaCTX-M-15 blaTEM-1 B1 i

E.c20 blaCTX-M-1 blaTEM-1 pap B22 h

E.c11 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr B23 f

E.c15 blaCTX-M-15 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr sfa B23 h

E.c17 blaCTX-M-15 armA pap B23 h

E.c21 blaCTX-M-28 blaTEM-1 sfa,cf1 B23 i

E.c29 blaCTX-M-15, blaSHV-12 blaTEM-1 aac(6')-Ib-cr sfa,pap B23 n

E.c28 blaCTX-M-15 blaTEM-1 qnrB1, aac(6')-Ib-cr D1 e

Annexe7

Phénotype de résistance des Entérobactéries

Espece TZP PRL TIM KF FEP IMP AMC AMX ATM FOX CAZ TIC CTX CIP NA GN KA Phénotype

Enterobacter sakazakic I R R R R S R R R R R R R R R R S BLSE

Enterobacter sakazakic S S S R S S R R S S S S S S R S S CASE

Enterobacter sakazakic S S S R S S R R S S S S S S S S S CASE

Enterobacter sakazakic S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible

Enterobacter cloacae R R R R S S R R R R R R R R R R R CASE

Enterobacter cloacae R R R R S S R R R R R R R S R S S CASE

Enterobacter cloacae S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible

Proteus mirabilis I R R R R S R R R R R R R R R R R BLSE

Proteus mirabilis I R R R R S R R R R R R R R R R R BLSE

Proteus mirabilis S I I R S S R R S S S R S R R S S PASE

Proteus mirabilis S R S S S S S R S S S R S S R S S PASE

Proteus mirabilis S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible

Proteus mirabilis S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible

Acinetobacter baumanii S R R R R S R R R R R R R R R R R BLSE

Acinetobacter baumanii S S S R S S R R S S S S S S R S S CASE

Acinetobacter baumanii S S S R S S R R S S S S S S S S S CASE

Acinetobacter baumanii I R I R S S R R S S S R S S S S S PASE

Providencia stuartii S R S S S S S R S S S R S S S S S PASE

Aeromonas hydrophila S R S S S S S R S S S R S S S S S PASE

Citrobacter freundii S R R R R S R R R S R R R R R S S BLSE

Serratia marecesens S R R R R S R R R S R R R S R S S BLSE

Klebsiella oxytoca S R S R R S S R R R R R R R R R R BLSE

Klebsiella oxytoca S S S R S S R R S S S S S S R S S CASE

Klebsiella oxytoca S R I R S S R R S S S R S I I I I PASE

Klebsiella pneumoniae S R R R R S R R R R R R R R R R R BLSE

Klebsiella pneumoniae S R R R R S R R R R R R R R R R R BLSE

Annexe7

Klebsiella pneumoniae S R R R R S R R R R R R R R R S S BLSE

Klebsiella pneumoniae S R R R R S R R R R R R R S R S S BLSE

Klebsiella pneumoniae S R R R R S R R R R R R R S R S S BLSE

Klebsiella pneumoniae S R R R R S R R R S R R R S S S S BLSE




Klebsiella pneumoniae S R S R R S S R R S R R R S S S S BLSE



Klebsiella pneumoniae S S S S S S S S S S S S S S S S S Sensible

Klebsiella pneumoniae S I I R S S R R S S S R S S S S S PASE

Klebsiella pneumoniae S R S S S S S R S S S R S S S S S PASE

Klebsiella pneumoniae S R S S S S S R S S S R S S S S S PASE


ATM:Aztreonam ; TIC:Ticarciline ;TIM:Ticaciline+Acide Clavulanique ; AMX:Amoxicilline ; AMC:Amoxicilline+Acide Clavulanique ; IMP:Imipinème ;

GN;Gentamicine ; AK:Amikacine ; CIP:Ciprofloxacine NA : Acide Nalidixique.

E. c : E coli S : Sensible R : Résistance, PASE : PenecilinasE CASE :Cephalosprinase ; BLSE: β-lactamase à spectre étendu

Annexe8

Chromatogramme CPG/SM de l'HE brute de Ziziphora hispanica

Chromatogramme CPG/SM de l'HE brute de Coriandrum sativum

Chromatogramme CPG/SM de l'HE brute de Cinnamomum cassia

Annexe8

Annexe 9

Tampon et milieux de culture

1- Les tampons

Tampon TBE 1 X

Tris base…………………………………………………………10,78g

Acide borique………………………………….. ………………..5,50 g

EDTA 0,5 M ……………………………………………………. 0,58 g

Eau distillée …………………………………………………….1 litre

Tampon de charge

Glycérol …………………………………………………………...3 ml

Bleu de bromophénol ……………………………………………75 mg

Eau distillée ……………………………………………………….7 ml

2-Les milieux de culture :

Gélose nutritif :

Pour 1 litre de milieu :

Tryptone...........................................................................................5,0 g

Extrait de viande ..............................................................................3,0 g

Agar agar bactériologique..............................................................12,0 g

pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2.

Muller Hinton


Hydrolysât acide de caséine ..........................................................17,5 g

Infusion de viande............................................................................2,0 g

Amidon soluble ................................................................................1,5 g



Bouillon cœur-cervelle


Annexe 9

Extrait cœur-cervelle......................................................................17,5 g

Peptone pancréatique de gélatine ...................................................10,0 g

Chlorure de sodium..........................................................................05,0 g

Phosphate disodique .........................................................................2,5 g

Glucose..............................................................................................2,0 g


2- Gélose de MacConkey


Peptone pancréatique de gélatine ...................................................17,0 g

Tryptone...........................................................................................1,5 g

Peptone pepsique de viande ...........................................................1,5 g

Lactose ..........................................................................................10,0 g

Sels biliaires.....................................................................................1,5 g

Chlorure de sodium..........................................................................5,0 g

Rouge neutre ..............................................................................30,0 mg

Cristal violet ..................................................................................1,0 mg



Travaux

personnelle

Travaux personnelles

Travaux personnelles

Publications:

Fatima Zenati, Fethi Benbelaid, Abdelmounaim Khadir, Chafika Bellahsene, Mourad

Bendahou, 2014.Antimicrobial effects of three essential oils on multidrug resistant bacteria

responsible for urinary infections. Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 4 (11), pp.

015-018

Fatima Zenati, Abouddihaj Barguigua, Fethi Benbelaïd, Abdelmounaïm Khadir, Chafika

Bellahsene, Mourad Bendahou, Hassaïne Hafida, Mohammed Timinouni. Characterization of

extended-spectrum β-lactamase-produced by Escherichia coli isolates from patients with

urinary tract infection hospitalized in western Algeria (en cours)

Communications:

Fatima Zenati, Mourad Bendahou, Chafika Bellahsene, Fethi Benbelaid, Abdelmounaim

Khadir, 2013.Antimicrobial effects of essential oils on resistant bacteria responsible for

urinary infections.4th

international workshop on industrial biotechnology .April 10-11 2013,

Tlemcen;Algeria


Khadir, 2013. Activité antimicrobienne des huiles essentielles sur germes responsable

d’infection urinaire d’origine hospitalière. Forum sur le développent des sciences de la vie et

de l’univers.14-15 mai, Université de Tlemcen.


Khadir, 2014. Activité antimicrobienne des huiles essentielles sur germes responsable

d’infection urinaire d’origine hospitalière. Les 20emes

journées nationales de microbiologie .12

et 13 novembre, Jijel, Algérie.


Khadir, 2014. Effet de certains extraits des plantes aromatiques et médicinales sur les

bactéries responsables des infections urinaire. La 1eme

journée scientifique des sciences de

l’agroalimentaire, environnement et santé. 3 juin , Université de Tlemcen.

Publications

© 2014 Fatima Zenati et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License -NonCommercial-ShareAlike Unported License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/).

Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol. 4 (11), pp. 015-018, November, 2014 Available online at http://www.japsonline.com DOI: 10.7324/JAPS.2014.4113 ISSN 2231-3354

Antimicrobial effects of three essential oils on multidrug resistant bacteria responsible for urinary infections Fatima Zenati, Fethi Benbelaid, Abdelmounaim Khadir, Chafika Bellahsene, Mourad Bendahou

Laboratory of Applied Microbiology in Food, Biomedical and Environment (LAMAABE), Aboubekr Belkaïd University, PO Box 119, 13000 Tlemcen, Algeria.

ARTICLE INFO

ABSTRACT

Article history: Received on: 30/06/2014 Revised on: 18/07/2014 Accepted on: 02/08/2014 Available online: 27/11/2014

Urinary tract infections (UTIs) are ones of the most common nosocomial infections worldwide. Lesions which are mainly caused by microorganisms that inhabiting in hospitals, known and characterized by their both resistance against antibiotics and high ability of biofilms formation. In this study, we have evaluated the effect of three essential oils, which are Cinnamomum cassia, Coriandrum sativum and Ziziphora hispanica, against bacterial species most responsible for UTIs. A total of 18 bacterial strains were tested, which varies between reference strains and clinical multidrug resistant. Cassia oil was the most antimicrobial active against all strains, with interesting MICs values which doesn’t exceed 5 mg/ml. The finding of this study indicate that essential oil appears as an excellent solution for treatment of nosocomial UTIs, especially against failure problems seen in care services, which are over common in the last years.

Key words: Urinary tract infections, Essential oils, Antimicrobial activity, Multidrug resistance.

INTRODUCTION

Urinary Tract Infections (UTIs) are among the most common bacterial infections accounting for morbidity and mortality in all the human populations (Hooton, 2000), especially in women (Todar, 2006). Most of UTIs are hospital-acquired infections in which they represent up to 40% and 34% of infections acquired in long-stay units (Michelet and Tattevin, 2003). Regarding pathogenic responsible, Enterobacteriaceae were the most common bacteria detected, in which they causes up to 84.3% of UTIs (Gales et al., 2000). Others pathogens are also identified, especially Enterococcus faecalis (Singh et al., 2007) and Staphylococcus spp. (Kuroda et al., 2005; Muder et al., 2006).

UTIs present a real problem currently, not only because these types of infections are in increasing in last years, notably in developed countries (Nicolle, 2012), but also the pathogens responsible are commonly multidrug resistant bacteria to antibiotics used in routine (Manikandan et al., 2011).

.

* Corresponding Author Mourad Bendahou, Laboratory of Applied Microbiology in Food, Biomedical and Environment (LAMAABE), Aboubekr Belkaïd University, PO Box 119, 13000 Tlemcen, Algeria. Email : [email protected]

The resistance against antibiotics was detected in several genera, including Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia and Pseudomona (Noor et al., 2004). There is an urgent need thus, for highlighted new antimicrobial agents which will be used against treatment failures seen in UTIs related to multidrug resistance. Plants preparations have long been used in treatment of all kinds of human infectious diseases (Lai and Roy, 2004), including UTIs. Presently, it’s has been clear that plants are a promising and wealthy source for safe and effective new antimicrobial agents (Benbelaïd et al., 2013).

Among which, essential oils (EOs) are a mixture of violates compound derived from secondary metabolism of aromatic plants, and are one of the most interesting biomolecules of natural origin (Edris, 2007). Through scientific researches, some EOs possess an antimicrobial potency against microorganisms (Bakkali et al., 2008), activity which can be valorized in medicine against nosocomial infections, such as UTIs. Therefore, EOs appears as a probable solution against treatment failures seen in UTIs. The purpose of this study was to investigate the antimicrobial potency of three EOs against multidrug resistant bacteria responsible for urinary infections. We have tested multidrug resistant clinical strains, which are obtained from patients with UTIs, compared with other reference strains sensitive to antibiotics.

016 Zenati et al. / Journal of Applied Pharmaceutical Science 4 (11); 2014: 015-018 MATERIALS AND METHODS

Plant material Three medicinal plants were selected for this study,

including Coriandrum sativum (C. sativum), Ziziphora hispanica (Z. hispanica), and Cinnamomum cassia (C. cassia). The species choice was based on literature survey and their use in traditional medicine by Algerian population. The plant materials used for EOs obtention were purchased from commercial sources.

EOs obtention

EOs were obtained from dried plant materials by hydrodistillation for 3 h, using a Clevenger-type apparatus. Recovered EOs were dried using magnesium sulfate then stored at +4°C until tested.

Bacterial strains

A total of 18 bacterial strains were tested in this study, including reference and clinical ones (Table 1). The species are nine Escherichia coli (E. coli) strains, three Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), three Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) and three Proteus mirabilis (P. mirabilis).

Clinical strains were collected from patients with UTIs recruited at the University Hospital of Tlemcen, in the following services, internal medicine, urology, and maternity. UTIs in patients were confirmed by detection of significant bacteremia by urine culture and sensitivity method. Bacterial growth was carried out on Mac Conkey agar (Conda Pronadisa™, Spain) and Nutrient agar (Conda Pronadisa™, Spain), and the diagnosis of UTIs in urine samples was based on the presence of ≥ 105 CFU of microorganisms per ml in urine culture (Cardoso et al., 1998). Isolated bacterial strains were firstly identified by conventional biochemical methods, and the API 20E (BioMerieux® SA, Lyon, France) were used for final identification confirmation. Antibiogram

The multidrug resistance in clinical strains was determined according to the Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 2006). Antibiogram was carried out with the following antimicrobial agent-containing disks: Amoxicillin (25 μg), amoxicillin/clavulanic acid (30 μg), ticarcillin (75 μg), ticarcilline/clavulanic acid (85 μg), piperacillin (75 μg), piperacillin/tazobactam (85 μg), cephalotin (30 μg), cefuroxime (30 μg), cefixime (30 μg), cefotaxime (30 μg), ceftazidime (30 μg), cefepime (30 μg), imipenem (10 μg), aztreonam (30 μg), cefoxitin (30 μg), gentamicin (15 μg), tobramycin (10 μg), nalidixic acid (30 μg), ofloxacin (5 μg), ciprofloxacin (5 μg), and fosfomycin (50 μg) (Oxoid®, England). The resistance phenotype of studied strains is presented in Table 1.

EOs antibacterial activity Preparation and standardization of inocula

For inocula preparation, four to five isolated colonies of tested organisms were picked by sterile inoculating loop and

inoculated in tubes of BHIB (5 ml in each). The inoculated tubes were incubated at 37oC for 18 hours and standardized to 108CFU/ml (CLSI, 2006). Agar disc diffusion method

The agar well diffusion method was used for the antimicrobial evaluations. 18 ml of Mueller Hinton agar medium (Conda Pronadisa™, Spain) was casted in each Petri dish (9 cm) and then inoculated by swabbing with a suspension of 18h culture already standardized at 108 CFU/ml, as recommended by (CLSI, 2006). After that, discs of filter paper (6 mm diameter) thoroughly moistened with 5 μl of the oil were placed on surface of inoculated agar, then incubated at 37°C for 24 h. The result was determined by measuring diameters of the inhibition zones in millimeters. Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC)

The minimum inhibitory concentration (MIC) of studied essential oils was determined by micro dilution method described by (Wiegand et al., 2008). The essential oils were dissolved using Tween 80, then diluted by ½ at ten concentrations in external tubes ranging from 400 to 0.7 mg/ml. After that, the 96-well plates were prepared by distributing 180 μl of 105 CFU/ml inoculum with 20μl of each concentration of essential oil. The final concentration of oil in plat was ranged between 40 to 0.07 mg/ml, and the final concentration of Tween 80 was 1% in each well. The MIC was defined as the lowest concentration of essential oil inhibiting visible growth. RESULTS AND DISCUSSION

The antibiogram of different clinical isolates showed several susceptible and resistant phenotypes. From the eight strains of E. coli, four were resistant, among these last two strains showed increased MDR. Regarding the species P. aeruginosa from two collected strains one was resistant. The same result was obtained by P. mirabilis and K. pneumoniae (see Table 1).

The antimicrobial activity results of EOs against strains collected from urinary infections show that the most important activity is recorded by C. cassia, since this oil showed significant activity against all Gram positive and negative strains including P. aeruginosa, which is known by its resistance to essential oils. In addition, the greater diameters were obtained by this EO with inhibition zone of 39 mm for some strains such as the case of E. coli. Then the essential oil of C. sativum also gave satisfactory results with inhibitions zones up to 31 mm but with no inhibition effect against P. aeruginosa. The EO of Z. hispanica gave similar results to C. sativum since it didn’t inhibit the species P. aeruginosa. However, its effect was somewhat weaker than C. sativum that the greatest diameter was 17 mm (see table 2). From the inhibitions zones obtained and according to Ponce et al. (2003) the strains were extremely susceptible to C. cassia and C. sativum but they are also very sensitive to Z. hispanica. The results of minimum inhibitory concentrations MICs correlate with those of

Zenati et al. / Journal of Applied Pharmaceutical Science 4 (11); 2014: 015-018 017

the zones of inhibition since the smaller MICs were obtained with the larger inhibitions zones and vice versa. UTIs are the second most common type of infections in human body, which are one of the most serious health problem affecting millions of people each year. UTIs involve infection in the kidneys, ureters, bladder or urethra (Anjum et al., 2004).

For minimized risks of mortality, morbidity, and any renal damage which can be caused by UTIs, clinicians should use the appropriate antibiotic in treatment. Choosing the specific antimicrobial agents appear so difficult, especially because of resistance to antimicrobial agents remarked in bacteria responsible for nosocomial UTIs.

In this study, results obtained are corresponding to literature, in which we have found that almost of bacteria responsible for UTIs are especially E. coli, and at less degrees K. pneumoniae, P. mirabilis and P. aeruginosa (Hooton, 2012; Barber et al., 2013). Also, it’s been clear that pathogens responsible for UTIs are commonly from hospital origin, species

which are multi-resistant to antibiotics (Manikandan et al., 2011) and possess a high ability to biofilm formation (Tenke et al., 2012). Therefore, the resolution of UTIs problem depend especially in hygiene in hospitals and most important in highlight of new antimicrobial agents in case of treatment failures. Among selected essential oils for this study, the oil of C. cassia has shown an interesting antimicrobial activity against all studied bacterial species. According to the literature, it’s has been clear that cassia oils are possess an strong antimicrobial activity (Ooi et al., 2006; Yang et al., 2012), with interesting MICs values which varies between 0.018 and 0.7 mg/mL against Gram positive and negative bacteria and fungi. Also, cassia oil was active against P. aeruginosa a specie which are commonly resistant not only to antibiotics (Zavascki et al., 2010), but also against almost essential oils (Mann et al., 2000; Bekhechi et al., 2008). Given that the use of EOs in antiseptic is better than use of terpenoids alone (Benbelaïd et al., 2014), cassia oil seems to be an ingesting alternative treatment in nosocomial UTIs.

Table . 1: Data about studied clinical strains.

Strains Resistance phenotype Escherichia coli 1 Sensitive Escherichia coli 2 Sensitive Escherichia coli 3 Sensitive Escherichia coli 4 Sensitive Escherichia coli 5 TCC,TIC, FEP, KF, PRL, CXM, AMX, CAZ, ATM, CTX,AMC Escherichia coli 6 TCC,TIC, FEP, KF, PRL, CXM, AMX, CAZ, ATM, CTX,AMC Escherichia coli 7 AMX ,TIC ,CXM Escherichia coli 8 AMX ,TIC ,CXM,TCC Pseudomonas aeruginosa 1 Sensitive Pseudomonas aeruginosa 2 TCC, TOB, FF, CN Proteus mirabilis 1 Sensitive Proteus mirabilis 2 TCC,TIC, FEP, KF, PRL, CXM, AMX, CAZ, ATM, CTX Klebsiella pneumoniae 1 Sensitive Klebsiella pneumoniae 2 TCC,TIC, FEP, KF, PRL, CXM, AMX, CAZ, ATM, CTX,AMC Table . 2: Antimicrobial activity of studied essential oils against bacteria responsible for nosocomial UTIs.

Strains Cinnamomum cassia Coriandrum sativum Ziziphora hispanica Iz MIC Iz MIC Iz MIC

Escherichia coli ATCC 25922 30±1 0.63 13±1 2.50 14±1 2.50 Escherichia coli 1 35±1 0.63 31±1 1.25 17±1 2.50 Escherichia coli 2 32±1 0.30 29±1 1.25 17±1 2.50 Escherichia coli 3 39±1 0.63 16±1 2.50 16±1 2.50 Escherichia coli 4 38±1 0.63 11±1 2.50 13±1 2.50 Escherichia coli 5 26±1 2.50 11±1 5.00 11±1 5.00 Escherichia coli 6 30±1 1.25 11±1 5.00 11±1 5.00 Escherichia coli 7 27±1 1.25 11±1 5.00 12±1 5.00 Escherichia coli 8 29±1 1.25 11±1 5.00 11±1 5.00 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 15±1 2.50 - - - - Pseudomonas aeruginosa 1 19±1 2.50 - - - - Pseudomonas aeruginosa 2 12±1 5.00 - - - - Proteus mirabilis ATCC 35659 34±2 0.31 12±1 5.00 9±1 5.00 Proteus mirabilis 1 39±1 0.31 13±1 2.50 10±1 5.00 Proteus mirabilis 2 30±1 1.25 9±1 05.00 8±1 10.0 Klebsiella pneumoniae ATCC 70603 21±1 0.16 14±1 2.50 12±1 2.50 Klebsiella pneumoniae 1 32±1 0.31 14±1 5.00 13±1 5.00 Klebsiella pneumoniae 2 27±1 0.16 10±1 2.50 7±1 2.50 Iz: inhibition zones (mm). MIC: minimum inhibitory concentration (mg/ml).

018 Zenati et al. / Journal of Applied Pharmaceutical Science 4 (11); 2014: 015-018 CONCLUSION

In conclusion, UTIs in human are considered as the most serious health problems facing the world. The present study has revealed the importance of natural products to control antibiotic resistant in bacteria which are being a threat to human health. This scientific study can serve as an important platform for the development of inexpensive, safe and effective medicines. REFERENCES

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How to cite this article:

Fatima Zenati, Fethi Benbelaid, Abdelmounaim Khadir, Chafika Bellahsene, Mourad Bendahou. Antimicrobial effects of three essential oils on multidrug resistant bacteria responsible for urinary infections. J App Pharm Sci, 2014; 4 (11): 015-018.

Publication (en cours)

Title: Characterization of extended-spectrum β-lactamase-produced by Escherichia coli

isolates from patients with urinary tract infection hospitalized in western Algeria

Order of authors: Fatima Zenati1, Abouddihaj Barguigua

2,3, Fethi Benbelaïd

1,

Abdelmounaïm Khadir1, Chafika Bellahsene

1, Mourad Bendahou

1, Hassaïne Hafida

1,

Mohammed Timinouni2,*

1 Laboratory of Applied Microbiology in Food, Biomedical and Environment (LAMAABE),

AboubekrBelkaïd University, PO Box 119, 13000 Tlemcen, Algeria 2

Molecular bacteriology laboratory, Pasteur Institute of Morocco, 1Place Louis Pasteur,

20360, Casablanca, Morocco 3 Microbiology laboratory, Faculty of medicine and pharmacy, 1 Street Hospital, 20360,

Casablanca, Morocco

Corresponding author: Mohammed Timinouni

Corresponding Author Institution: Pasteur Institute of Morocco, Casablanca

Address of corresponding author: MolecularBacteriology Laboratory, Pasteur Institute of

Morocco.1, Place Louis Pasteur.Casablanca (20360) Morocco ; Tel : + (212) 05 22 43 44 50 ;

Fax: + (212) 05 22 26 09 57 ; E-mail:[email protected]

Running title: ESBL producing E. coli isolated from Algeria

Abstract

Background & objectives: Extended spectrum β-lactamases (ESBLs) produce bacteria have

emerged as a major threat worldwide with limited treatment options. The present study was

aimed to determine the occurrence of ESBLs in Escherichia coli, their molecular types and

associated risk factors.

Methods: A total of 83 clinical isolates of E. coli collected between 2011 and 2013 in

the Tlemcen university hospital Algeria were examined phenotypically for ESBL production.

ESBL strains were further typed for the blaTEM/SHV/CTX-M genes by PCR using specific primers.

Resistance to other antimicrobial agents was also studied. Various risk factors associated with

ESBL infections were analysed by logistic regressions.

Results: ESBLs were found in 32.5 percent E. coli isolates. The majority of typed isolates

harboured two or more ESBL genes. Overall bla CTX-M was the commonest genotype (100%)

followed by blaTEM (96%) and blaSHV (4%) either alone or in combination. The frequencies of

resistance to amoxicillin and cephalotin, which are antibiotics used in the treatment first-line

bladder infections, are relatively elevated in both groups.

Interpretation & conclusions: Our study showed high ESBL occurrence with CTX-M.

Keywords: Extended-spectrum β-lactamase; Urinary tract infections; Escherichia coli.

mailto:[email protected]

يسخشفى الانسؤونت ع االنخهاباث انبىنت و انعسونت ي E. coli BLSE عهى زىث عطرتثالديفعىل : العنوان

الملخص

,Cinnamomum cassia)د انقضاء عهى هذ انشكهت حى حجربت ثالثت زىث عطرت وف صذ.اإلساإ يقاويت انبكخرا نهضاداث انحىت يشكهت حققت حهذد صحت

Coriandrum sativum Ziziphora hispanica) ضذ . Ecoli BLSEأكثر انساء هى أ انخائج بج إ . انسؤونت ع االنخهاباث انبىنت و انعسونت ي يسخشفى حهسا

نهذ انبكخرا اها حهك PCR واظهر ححهم E. coli BLSE ℅32,5 يع انعهى ا سبت ℅63حثم انسالنت انرئست نهذا االنخهاب بسبت E. coliعرضت نالنخهاباث انبىنت وا

األكثر ه Cinnamomum cassia أ زىث عطرت بج ثالد نخأثر انعرضت E. coli BLSE إ.℅100 و℅96 بسبت TEM1وBla CTX-M سبت كبرة ي جاث

األدى انثبطيم وحركس /غ و2.5 األدىيم وحركس انقاحم /غ و1.97 اد انثبط يى يع انعهى ا قت حركس 33.23 انثبط انحانخ انهائت وانبىفهت يع قطر كهخا ف حأثرا

واظهر يسج انسىث .نها يفعىل اقمZiziphora hispanica و Coriandrum sativum أيم يع انعهى /غ و4,53 انبىفهى هىإلزانت األدىيم و انخركس /غ و 4,37 نبىفهىلا

حقخم Cinnamomum cassia انخال ا انبكخرت اضهرث أ زج حركت قخم أ كا إضاف يفعىال E. coli BLSE 09ضذ céfotaxime انعطرت يع انضاد انحىي

.دققت 120 ف غضى Coriandrum sativum و دققت 30 انبكخرا ف غضى

انفعانت ضذ انبكخرا, زىث عطرت,انقاويت , ,PCR , E. coli BLSE االنخهاباث انبىنت:انكهاث انفخاحت

Title: Inhibitory effect of essential oils of three aromatic plants on Escherichia coli (ESBL) responsible for urinary tract infections Hospita

Abstract

Bacterial resistance to antibiotics is a real public health problem. In order to find alternative fight against this resistance, the proposed study is to

evaluate the inhibitory effect of three essential oils (Cinnamomum cassia, Coriandrum sativum and Ziziphora hispanica) on ESBL E. coli strains

responsible for urinary tract infections isolated at the University Hospital of Tlemcen. The results showed that nosocomial urinary tract infection is high

among women and it is mainly due to E. coli (63℅). The effect of E. coli ESBL was 32,5%. PCR analysis of ESBL E. coli, revealed the presence of

genes Bla CTX-M and TEM1 with high percentage (100℅ and 96℅). ESBL E. coli strains subject to the effect of three essential oils, have shown great

sensitivity to essential oil of Cinnamomum cassia at state planctonic and biofilm. She gave an inhibition zone > 33,25mm, MIC=1,97mg/ml, MBC =

2,5mg/ml and a MBIC=4,37mg/mL, MBEC=4,53mg/ml. While, Coriandrum sativum and Ziziphora hispanica oils are less active. Essential oils

combined with the antibiotic cefotaxime against ESBL E. coli 09, showed an additive effect of Cinnamomum cassia and Coriandrum sativum essential

oils. The kinetics of destruction of bacterial cells with essential oil of Cinnamomum cassia was obtained after 30 min, while Coriandrum sativum oil

destroys bacterial cells after 240 min.

Keywords : Urinary tract infection ; ESBL E. coli ; PCR ; Résistance ; Essential oils Antibactérial activity.

Titre : Effet inhibiteur des huiles essentielles de trois plantes aromatiques sur Escherichia coli (BLSE) responsables d’infections

urinaires d’origine hospitalière.

Résumé

La résistance des bactéries aux antibiotiques pose un vrai problème de santé publique. Dans le but de trouver des alternatifs de

lutte contre cette résistance, l’étude proposé est d’évaluer l’effet inhibiteur de trois huiles essentielles (Cinnamomum cassia, Coriandrum

sativum et Ziziphora hispanica) sur des souches E. coli BLSE responsables d’infections urinaires isolées au CHU de Tlemcen. Les

résultats ont montré que l’infection urinaire nosocomiale est importante chez les femmes et elle est due principalement à E. coli (63℅).

L’incidence d’Escherichia coli BLSE a été de 32,5%. L’analyse par PCR de E. coli BLSE ces dernières, a révélé la présence des gènes

Bla CTX-M et TEM1 avec un pourcentage élevé (100℅ et 96℅). Les souches E. coli BLSE soumises à l’effet des trois huiles

essentielles, ont montré une grande sensibilité à l’huile essentielle de Cinnamomum cassia à l’état planctonique et biofilm. Elle a donné

en moyenne respectivement, une zone d’inhibition > 33,25mm, une CMI=1,97mg/ml, CMB=2,5mg/ml et une CMIB=4,37 mg/ml,

CMEB=4,53mg/ml. Par contre Coriandrum sativum et Ziziphora hispanica sont moins actif. En combinant les huiles à l’antibiotique

céfotaxime contre E.coli BLSE 09, les huiles essentielles de Cinnamomum cassia et Coriandrum sativum ont présenté un effet

d’addition. La cinétique de destruction des cellules bactériennes par l’huile essentielle de Cinnamomum cassia a été obtenue au bout de

30 min, par contre il a fallu 240 min pour les détruire par l’huile de Coriandrum sativum.

Mots clés : Infection urinaire ; E. coli BLSE ; PCR ; Résistance ; Huiles essentielles ; Activité antibactérienne.

Effet inhibiteur des huiles essentielles de trois plantes ...

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