Medio Ambiente

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“Diseño, evaluación y validación de un método

Presencia/Ausencia para analizar Clostridium

perfringens”Mariano Gómez - Applus+ Medio Ambiente

Santiago de Compostela

Manuel Araujo – I.I.A.A. Universidad Santiago de Compostela

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Antecedentes 1

El R.D. 140/03 establece "0" (cero) en cien ml como valor admisible

para coliformes, E. coli, enterococos y C. perfringens. Si se acepta

esto, no cabe duda de que se está en una situación en la que el

número de esos indicadores en agua es irrelevante, puesto que el

punto de corte, o sea, el valor discriminante, es 1. Esto es obvio, ya

que la mera presencia de UNO de esos microorganismos en

CUALQUIER volumen de agua, es suficiente para cambiar su

calificación. Basándose en esto, es lógico pensar que la metodología

analítica amparada por tal R.D., debiera ser la necesaria para dar una

respuesta de PRESENCIA/AUSENCIA en un volumen de agua

previamente definido

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� El R.D. 140/03 sigue propugnando métodos analíticos diseñados para

recuentos bacterianos, más propios de épocas en las que se consideraba

admisible una cierto número de bacterias indicadoras en agua, que de los

tiempos actuales, en los que el propio R.D. establece límites de tolerancia

nulos

� Es más, en el caso de la metodología analítica de referencia para C.

perfringens, no sólo mantiene la filosofía de emplear un método clásico de

recuento (filtración sobre membrana) en una situación en la que la mera

presencia de UN clostridio es determinante, sino que establece el uso del

medio m-CP como guía. Este medio, no sólo no tiene ninguna ventaja

sobre otros de recuento sino que, por si esto fuera poco, su uso introduce

un factor de riesgo innecesario (empleo de vapores de amoniaco) y unos

inconvenientes técnicos, posiblemente asumibles en la década de los

cincuenta, pero totalmente rechazables a las puertas del siglo XXI

Antecedentes 2

Medio AmbienteProyectos desarrollados

� Año 1999: La Xunta de Galicia subvenciona el proyecto : "Diseño de un

medio de cultivo y evaluación de la técnica de detección de Clostridium

perfringens en agua“. Proyecto PGIDTT00IN01E cuya culminación fue la

formulación de un medio P/A para la detección del citado

microorganismo.

� Año 2003: Se obtuvo número de solicitud de patente para la

formulación obtenida: PACp® (nº solicitud de patente P200402323)

�Año 2005 La Xunta de Galicia subvenciona el proyecto: "Evaluación y

validación del medio PACp® para detección de Clostridium perfringens

en agua”. Proyecto PGIDIT04TAL043E cuya culminación ha sido la

validación del medio mediante un ejercicio interlaboratorio

Medio AmbientePor qué de la iniciativa?

Se planteó este trabajo dirigido al desarrollo de una metodología eficaz y

simple para la detección de Clostridium Perfringens en muestras de agua

no sólo porque no se disponía de un procedimiento de presencia-

ausencia para la detección de este parámetro microbiológico, sino

también por su importancia como organismo indicador en aguas

destinadas al consumo humano. Payment ya demostró que las bacterias

esporuladas prácticamente se ven inafectadas por las concentraciones

de cloro residual libre. En este sentido, Clostridium perfringens, es

probablemente la mejor elección como indicador de la inactivación de

ooquistes y virus por cloro, así como un buen indicador de las eficacia del

tratamiento de agua.

Medio AmbienteObjetivos

� Diseñar un medio de cultivo fluorogénico apropiado para la

detección de Clostridium perfringens en aguas por la técnica de

presencia-ausencia.

� Analizar la capacidad del medio diseñado para la detección y

recuento de C. perfringens en aguas, en relación a otros medios

de cultivo, incluido el establecido como guía por el R.D. 140/03.

� Evaluar la capacidad del medio de cultivo y técnica diseñada para

detectar cepas de Clostridium perfringens en presencia y

ausencia de otros microorganismos acompañantes.

� Determinar las propiedades (sensibilidad, especificidad,

selectividad) del medio diseñado para detectar la presencia de

Clostridium perfringens en agua sometida a diferentes tipos de

tratamiento.

Medio AmbientePresentación del PACp®

Medio AmbienteCómo funciona el PACp®

MUESTRAS DE AGUA

PACp®

AGITACIÓN

PAPA

INCUBACIÓN AEROBIOSIS

44 ± 1ºC/18 ± 2h

UVUV

C. perfringensClostridiumsulfito-reductores

NMPNMP

INCUBACIÓN AEROBIOSIS

44 ± 1ºC/18 ± 2h

UVUV

10

0 m

l

10

ml

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Evaluación de selectividad y especifidad

Una vez optimizado el medio PACp® se llevaron a cabo ensayos con

cultivos axénicos de cepas de colección y aisladas del ambiente, con el

objeto de evaluar la capacidad del medio para detectar de forma selectiva

y diferencial Clostridium perfringens. Para ello, se inoculó el medio de

cultivo diseñado con diferentes cepas de Clostridium perfringens, otras

especies del género Clostridium, y otras bacterias reductoras del sulfito y

no reductoras del sulfito pertenecientes a diversas especies y géneros

microbrianos.

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Evaluación de selectividad y especifidad

�Clostridium perfringens: 20 cepas de colección y 50 cepas aisladas en muestras

de agua (muestras con formas vegetativas y muestras con esporas).

�- Otras especies del género Clostridium (C. difficile, C. sordellii).

�- Enterobacterias: 20 cepas de colección (Salmonella spp, Proteus spp,

Escherichia spp, Citrobacter spp, Enterobacter spp, Citrobacter spp).

�- Especies del género Enterococcus: 10 cepas de colección (E. faecium, E.

durans, E. faecalis).

�- Especies del género Staphylococcus: 5 cepas de colección (S. aureus, S.

epidermidis, S. simulans).

�- Especies del género Bacillus: 5 cepas de colección (B. cereus, B. subtilis, B.

coagulans).

�- Especies del género Lactobacillus: 10 cepas de colección (L. brevis, L. casei. L.

acidophilus).

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Metodología analítica

�El análisis de todas las muestras de agua con el medio PACp® se llevó

a cabo bajo dos condiciones de incubación: aerobiosis y anaerobiosis a

37±1°C y 44±1 °C. Se consideraron como un resultado positivo en PACp®

la presencia de crecimiento con precipitado negro y fluorescencia azulada

tras la irradiación con una lámpara de Wood.

�La obtención de resultados idénticos con el medio PACp® incubado en

aerobiosis y anaerobiosis permite confirmar las conclusiones obtenidas

previamente, en el sentido de que la detección de Clostridium perfringens

con el método PACp® puede llevarse a cabo con plena confianza cuando

la incubación se realiza en condiciones de aerobiosis.

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Evaluación de selectividad y especifidad

�Los resultados de estos ensayos permiten concluir que el medio es

especifico y selectivo, por cuanto que las cepas de Clostridium perfringens

dan una respuesta positiva y las cepas no pertenecientes a la citada

especie dan una respuesta negativa.

�Estos resultados se obtuvieron, tanto en ausencia de flora acompañante,

como en su presencia.

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Evaluación de la capacidad del medio de cultivo PACp para detectar Cl. perfringens en muestras de agua.

�Una vez diseñado el medio de cultivo PAcp y la técnica analítica a

emplear para la detección de la presencia-ausencia de Clostridium

Perfringens, la fase final de trabajo consistió en evaluar la capacidad de

esta metodología para detectar estas bacterias en muestras de agua

natural sometidas a diferentes condiciones ambientales.

�Para ello, se analizaron un total de 160 muestras de agua.

Medio AmbienteCuantificación

• El siguiente paso en el desarrollo del método fue estudiar la posible cuantificación de microorganismos utilizando el NMP.

• Para ello se utilizaron dos métodos:

• Un material de referencia fabricado y diseñado en Applus+ Medio ambiente Alicante

• Un ejercicio interlaboratorio para la comparación de metodologías siguiendo la norma ISO 17994:2004 y lasdirectrices de EMAG (European Microbiology Advisory Group).

• Los resultados tanto de muestras naturales como losiniciales del ejercicio se presentan a continuación

Medio AmbienteLaboratorios participantes

Medio AmbienteResultados

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MUESTRAS DE AGUA

FILTRACIÓN

Agar TSC

INCUBACIÓN ANAEROBIOSIS

44 ± 1ºC/21 ± 3h

Agar TSCF

4646ºCºC

1818--24 h24 h

PACp®

10

0 m

l

INCUBACIÓN AEROBIOSIS

45 ± 1ºC/21 ± 3h

UVUV

C. perfringensClostridiumsulfito-reductores

UVUV

C. perfringens

Lactosasulfito

C. perfringensCONFIRMACIÓN

Análisis muestras ambientales

Medio Ambiente

9384-

614213135+

-+-+

TSCFTSC

PACp®

Concordancia entre el número de muestras de agua cl asificadas como positivas y negativas por cada método.

Resultados muestras ambientales

Medio Ambiente

NºType

0012Negatives

93.9139148Positives

%Nº

Cultivos confirmados comoCl. perfringensCultivos a partir del medio PACp ®

Verificacion de cultivos positivos y negativos a partir del medio PACp ®

Resultados verificación de cultivos

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Material de referencia

fabricado en Applus+Medio

Ambiente

Disolución de la pastilla en 20 mL de agua

Dilución hasta 1000 mL de agua

Análisis de material de referencia

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0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Log NMP/100 mL (PACp)

Log

UF

C/1

00 m

L (m

CP

, TS

C)

TSC mCP

R2 mCP: 0,71

R2 TSC: 0,75

Resultado con material de referencia

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��La La DirectivaDirectiva 98/83/CE98/83/CE establece que los Estados establece que los Estados Miembros pueden emplear métodos alternativos Miembros pueden emplear métodos alternativos siempre que pueda demostrarse que los resultados siempre que pueda demostrarse que los resultados obtenidos sean al menos tan fiables como los obtenidos sean al menos tan fiables como los producidos por lo métodos de referencia o guía.producidos por lo métodos de referencia o guía.

��El Real Decreto 140/2003 establece que los El Real Decreto 140/2003 establece que los laboratorios podrán emplear métodos alternativos, laboratorios podrán emplear métodos alternativos, siempre que estén validados o acreditados o se siempre que estén validados o acreditados o se haya demostrado su equivalencia.haya demostrado su equivalencia.

Ensayos de equivalencia

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Requisitos de la Norma ISO 17994:2004 (Norma española UNE-EN ISO 17994: criterios para establecer la equivalencia entre métodos microbiológicos):

�Definir de los microorganismos diana.

�Participar un grupo de expertos.

�Describir los métodos analíticos y seguir el procedimiento escrito.

�Llevar a cabo una “Training” sesión.

�Participar laboratorios con sistemas de aseguramiento de la calidad.

�Emplear muestras representativas de amplia área geográfica.

�Emplear muestras incluidas en el campo de aplicación de ambos métodos:

�Las muestras naturales son las idóneas. No obstante, no tiene sentido analizar muestras reales de redes de distribución (el doble cero no se puede emplear en el análisis de comparación).

�Pueden prepararse muestras adecuadas por dilución, enriquecimiento o mezclado de diferentes tipos de agua.

�Puede resultar apropiado estresar las poblaciones microbiológicas de algunas muestras mediante la aplicación controlada de desinfectantes o por almacenamiento en condiciones de refrigeración.

Equivalencia entre métodos

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�Emplear muestras que contengan suficiente nº microorganismos diana (10 – 30).

�Las submuestras analizadas por los dos procedimientos deben proceder del mismo envase.

�Participar un mínimo de 6 laboratorios.

�Anotar los resultados presuntivos y confirmados.

�Excluir las muestras con doble cero y las que den resultados incontables.

�Evaluar los datos:

�Examen crítico de los datos (identificación de valores rechazables y otras irregularidades).

�Análisis de datos agrupados por laboratorio, tipo de muestra,…

�Cálculo de las diferencias relativas básicas, medias, desviaciones estándar, incertidumbres expandidas.

�Decisión sobre la idoneidad de los datos.

�Evaluación de la equivalencia de los métodos.

Requerimientos Norma ISO 17994:2004

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AGUA SUPERFICIALAGUA SUPERFICIAL

1 -

2 L FILTRACIÓNFILTRACIÓN

100 mL

10 mL

1 mL

4444ºCºC/18/18--24 h24 hanaerobiosisanaerobiosis

REFRIGERACIÓNREFRIGERACIÓN(24 h)(24 h)

40

0 m

LDILUCIÓNDILUCIÓN100 mL

FILTRACIÓNFILTRACIÓNAGAR mAGAR m --CPCP

NMPNMPPACpPACp

AGAR TSCAGAR TSC

100 mL

100 mL

Preparación de muestras de agua superficial

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4,5 L

AGUA SUPERFICIALAGUA SUPERFICIALAGUA EFLUENTE 2ºAGUA EFLUENTE 2º

500 500 mLmL

AGUA TRATADAAGUA TRATADA24 h a 24 h a TªTª ambienteambiente

5 L

AGITACIÓNAGITACIÓN5

00

m

L

50

0

mL

50

0

mL

50

0

mL

FIL

TR

AC

IÓN

FIL

TR

AC

IÓN

100

100

mL

mL

4444 º

CºC/1

8/1

8 --24

h24

han

aero

bios

isan

aero

bios

is

AGAR TSCAGAR TSC

60 UFC60 UFC 30 UFC30 UFC 8 UFC8 UFC 2 UFC2 UFC

REFRIGERACIÓN (24 h)REFRIGERACIÓN (24 h)

1/

3

1/

5

1/

2

1/

3

DILUCIÓNDILUCIÓN

FILTRACIÓNFILTRACIÓNAGAR mAGAR m --CPCP

NMPNMPPACpPACp

100 mL100 mL

5 L

AGITACIÓNAGITACIÓN

SEDIMENTACIÓNSEDIMENTACIÓN44ºCºC/1 h/1 h

10 ml

6 6 –– 12.5 12.5 mg Clmg Cl 22

CADA 1 CADA 1 minminTRAS 3TRAS 3--5 5 minmin

agitación agitación

Preparación de muestras de agua sometidas a tratamiento de desinfección

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Inicio

Finalm-CP

5 COLONIAS5 COLONIAS

SELECCIÓN DE 1 SELECCIÓN DE 1 COLONIA CADACOLONIA CADA

n/5n/5

PACp

TODOS: si nº de tubos positivos TODOS: si nº de tubos positivos es es << 55SELECCIÓN DE 5 TUBOS AL SELECCIÓN DE 5 TUBOS AL AZAR: si el nº de tubos AZAR: si el nº de tubos positivos es > 5positivos es > 5

Nº de tubos o colonias para confirmar

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m-CP

PACp

TSC-Yema huevo

TSC-Yema huevo

Incubación Incubación anaerobiosisanaerobiosis3535--3737ºCºC/24 h/24 h

Caldo Tioglicolato

Incubación Incubación anaerobiosisanaerobiosis3535--3737ºCºC/24 h/24 h

Caldo Tioglicolato

Caldo Tioglicolato

Tinción Gram

Lactosa-sulfito

Leche-hierro

Movilidad-nitratos

Lactosa-gelatina

4646ºCºC/18/18--24 h24 h

4646ºCºC/2 /2 -- 5 h5 h

3535ºCºC/24 h/24 h

4646ºCºC/24 h/24 h 44ºCºC/1 h/1 h

sólidosólido

3535ºCºC/24 h/24 h

líquidolíquido

Confirmación de colonias o tubos positivos

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+Liquefacción de la gelatina

+Reducción de Nitratos

-Movilidad

+Fermentación tumultuosa de la leche

+Fermentación de lactosa

+Reducción del sulfito

+Tinción Gram

Reacción típica deC. perfringens

Prueba

Reacciones típicas de C. perfringens

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Equivalencia: se fundamenta en la diferencia relativa media y la incertidumbre expandida (U)

Diferencia relativa, x = ln(ai)-ln(bi)

ai = valor confirmado por el método alternativo en la muestra i

bi = valor confirmado por el método alternativo en la muestra i

Incertidumbre expandida, U = ksx =

Intervalo de confianza,Límite inferior: xL = x – ULímite superior: xH = x + U

2s

√ √ √ √ n

Análisis estadístico: UNE-EN ISO 17994

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0,476

0,1644

1,152

X - U

- 0,0873

- 0,431

0,169

X + U

No concluyente0,28161,16150,1943Total

No concluyente0,29750,9408- 0,1331Agua sin

tratamiento

Diferencia positiva

0,49031,29750,6620Agua con

tratamiento

Interpretación(D = 0,1)

USXMuestras

Métodos “no diferentes” (Equivalentes): -D < xL < 0 y 0 <xH < +D

Métodos “diferentes”: xL > 0 ó xH < 0

No concluyente: xL < -D y xH > 0 ó bien xL < 0 y xH > +D

Indiferente: xL > -D y xH < 0 ó bien xL > 0 y xH < +D

Resultados preliminares equivalencia

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