KARAKTERISASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

PENGHAMBAT ENZIM α-GLUKOSIDASE DARI KAPANG

ENDOFIT Colletotrichum sp. YANG BERSIMBIOSIS DENGAN SPONS

SKRIPSI

DINI CHOIRUNNISA

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2018 M/ 1439 H

KARAKTERISASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

PENGHAMBAT ENZIM α-GLUKOSIDASE DARI KAPANG ENDOFIT

Colletotrichum sp. YANG BERSIMBIOSIS DENGAN SPONS

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh:

DINI CHOIRUNNISA

1113096000013

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2018 M/ 1439 H

ABSTRAK

DINI CHOIRUNNISA, Karakterisasi Senyawa Metabolit Sekunder Penghambat

Enzim α-Glukosidase dari Kapang Endofit Colletotrichum sp. yang Bersimbiosis

dengan Spons dibawah bimbingan RIZNA TRIANA DEWI dan DEDE

SUKANDAR.

Biota laut berupa mikroba endofit dari spons yang merupakan salah satu ekosistem terumbu

karang yang sangat potensial sebagai sumber senyawa aktif. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui senyawa metabolit sekunder yang berpotensi sebagai antidiabetes dari kapang

endofit spons. Senyawa metabolit sekunder diisolasi dengan cara ekstraksi pelarut yang

dipandu pengujian aktivitas penghambatan α-glukosidase dengan metode spektroskopi. Isolat fraksi 2 yang berasal dari filtrat kapang endofit spons memiliki nilai persen inhibisi 13,08%.

Karakterisasi senyawa aktif dilakukan dengan analisis UV-Vis, FTIR, LCMS dan LCMS-

MS. Hasil analisis dengan UV-Vis menunjukkan adanya hidrokarbon aromatik (λmax 230

nm). Analisa dengan FTIR menunjukkan adanya vibrasi dari gugus fungsi C=O ester

(1735,93 cm-1

), –CH3 (1402,25 dan 1456,26 cm-1

), C=C aromatik (1598,8 cm-1

), C–O tunggal

(1026,13; 1089,78 cm-1

), C–H Alifatik (2956,87; 2918,30 cm-1

). Analisa dengan LCMS dan

LCMS/MS menunjukkan isolat mempunyai massa m/z = 391,2834 [M+H]+ sesuai rumus

molekul C24H38O4 yang diduga merupakan senyawa DEHP atau di-(2-etilheksil) phtalat.

Kata Kunci : Colletotrichum sp., DEHP, kapang endofit, penghambat α-glukosidase.

ABSTRACT

DINI CHOIRUNNISA, Characterization of Secondary Metabolite Compounds

α-Glucosidase Enzym Inhibitors from Endophytic Fungi Colletotrichum sp. the

Symbiosis with Sponges under the guidance of RIZNA TRIANA DEWI and DEDE

SUKANDAR.

Marine biota as endophytic microbes from sponges which is one of the coral reef ecosystems

is very potential as a source of active compounds. The purpose of this research is to know the secondary metabolite compound potentially as antidiabetic from sponge endophytic fungi.

Secondary metabolite compounds were isolated by solvent extraction which was guided

α-glucosidase inhibitory activity assay with spectroscopy method. Isolate fraction 2 derived

from filtrate of sponge endophytic fungi has a percent value of 13.08% inhibition. Characterization of inhibiting compounds was carried out by UV-Vis analysis, FTIR, LCMS

and LCMS-MS. The results of the analysis with UV-Vis showed the presence of aromatic

hydrocarbons (λmax 230 nm). Analysis with FTIR showed vibration of functional groups C=O ester (1735.93 cm

-1), -CH3 (1402.25 and 1456,26 cm

-1), C=C aromatic (1598.8 cm

-1), Single

C-O (1026,13; 1089,78 cm-1

), C-H Aliphatic (2956,87; 2918,30 cm-1

). Analyzes with LCMS

and LCMS/MS showed the isolates having mass m/z = 391,2834 [M+H]+ according to the

C24H38O4 molecular formula in the assumption is a compound DEHP or known as di-(2-

ethylhexyl) phthalate.

Keywords : Colletotrichum sp., DEHP, endophytic fungi, α-glucosidase inhibitors.

i

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum warrahmatuallahi wabarakatuh

Syukur Alhamdulillah penulis haturkan kehadirat Allah SWT yang telah

memberikan rahmat dan karunia-Nya kepada penulis, sehingga penulis dapat

menyelesaikan Skripsi yang berjudul “Karakterisasi Senyawa Metabolit Sekunder

Penghambat Enzim α-Glukosidase dari Kapang Endofit Colletotrichum sp. yang

Bersimbiosis dengan Spons”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat

tugas akhir dalam menempuh pendidikan Strata 1 (S1) di Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Dalam menyusun skripsi ini saya sebagai penulis mendapat banyak bantuan dan

bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini saya ingin

menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada :

1. Rizna Triana Dewi, PhD selaku dosen pembimbing I di Pusat Penelitian

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia yang telah memberikan perhatian dan

bimbingannya kepada penulis untuk kelancaran penelitian ini.

2. Drs. Dede Sukandar, M.Si selaku dosen pembimbing II juga sebagai ketua

Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta yang telah membimbing dan memberikan saran kepada penulis dalam

melaksanakan penelitian ini.

3. Dr. Sandra Hermanto, M.Si selaku dosen penguji I yang telah memberikan ilmu

pengetahuan, pengarahan, waktu, serta bimbingannya kepada penulis.

ii

4. Dra. Nani Radiastuti, M.Si selaku dosen penguji II yang telah memberikan saran

dan perbaikan kepada penulis.

5. Dr. Agus Salim, M.Si selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan izin penulis untuk melaksanakan

penelitian.

6. Keluarga tercinta yang telah memberikan dukungan dan do’a, material maupun

moril kepada penulis dalam melaksanakan penelitian ini.

7. Sahabat-sahabat tercinta Siti Hardianti, Aulia Wulandari, Putri Pratiwi,

Balebellofams, Isnawati, dan Homsatun yang sudah memberikan motivasi dan

membantu jalannya penulisan skripsi.

8. Ade, Ika, kak Emil dan Teman-teman seperjuangan Kimia 2013 UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta yang selalu memberikan semangat dan dukungan.

Penulisan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari berbagai kekurangan, baik

dalam hal penulisan maupun dalam pemaparan dan pengolahan data. Untuk itu,

penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan

skripsi. Penulis berharap semoga proposal ini dapat bermanfaat dan memberikan

sumbangan pengetahuan khususnya di Program Studi Kimia Fakultas Sains dan

Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan pembaca pada

umumnya.

Jakarta, Februari 2018

Penulis

iii

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................ i

DAFTAR ISI ....................................................................................................... iii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... vii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................viii

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 4

1.3 Hipotesis ........................................................................................... 4

1.4 Tujuan Penelitian .............................................................................. 5

1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................ 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 6

2.1 Kapang Endofit ................................................................................. 6

2.2 Kapang Colletotrichum sp. ................................................................ 7

2.3 Spons ................................................................................................ 9

2.3 Diabetes Mellitus ............................................................................ 12

2.3.1 Diabetes Tipe 1 ....................................................................... 13

2.3.2 Diabetes Tipe 2 ....................................................................... 13

2.3.3 Diabetes Gestasional ............................................................... 13

2.3.4 Sindrom Metabolik ................................................................. 14

2.4 Enzim α-Glukosidase ...................................................................... 14

2.5 Ekstraksi ......................................................................................... 15

2.6 Kromatografi ................................................................................... 16

2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis ........................................................ 16

iv

2.6.2 Kromatografi Kolom Gravitasi ............................................... 18

2.7 Spektroskopi ................................................................................... 19

2.7.1 Spektrofotometer Ultraviolet Visible (UV-VIS) ...................... 19

2.7.2 Spektrofotometer FTIR .......................................................... 20

2.7.3 LCMS .................................................................................... 22

2.7.4 LCMS/MS .............................................................................. 24

BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 26

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan ...................................................... 26

3.2 Alat dan Bahan ................................................................................ 26

3.3 Prosedur Kerja ................................................................................ 27

3.3.1 Sterilisasi Alat ........................................................................ 27

3.3.2 Pembuatan Media ................................................................... 27

3.3.3 Isolasi Kapang Endofit ........................................................... 28

3.3.4 Pembuatan Stock Culture ....................................................... 29

3.3.5 Fermentasi .............................................................................. 29

3.3.6 Ekstraksi ................................................................................. 29

3.3.7 Uji Aktivitas Penghambatan α-Glukosidase ............................ 29

3.3.7 Pemurnian Senyawa ............................................................... 30

3.3.8 Penentuan Struktur Senyawa................................................... 31

3.4 Diagram Alir ................................................................................... 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 34

4.1 Peremajaan dan Fermentasi ............................................................. 34

4.2 Ekstraksi ......................................................................................... 35

4.3 Pemisahan ekstrak filtrat dengan kromatografi kolom ..................... 37

4.4 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi .................................................. 40

v

4.4.1 Analisis data UV-Vis .............................................................. 40

4.4.2 Analisis data FTIR .................................................................. 41

4.4.3 Analisis data LCMS ............................................................... 42

4.4.4 Analisis data LCMS/MS ......................................................... 44

4.5 Uji Aktivitas Antidiabetes ............................................................... 46

4.6 Senyawa DEHP ............................................................................... 47

BAB V PENUTUP............................................................................................. 50

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 51

LAMPIRAN ....................................................................................................... 56

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Isolat kapang SF1 (Colletotrichum sp.) ............................................... 7

Gambar 2. Pohon filogenetik SF1 ........................................................................ 8

Gambar 3. Struktur dysidine (1), manzamin-A (2) dan xestomanzamin A (3)..... 11

Gambar 4. Reaksi penghambatan enzim α-glukosidase ..................................... 14

Gambar 5. Kromatografi lapis tipis .................................................................... 17

Gambar 6. Struktur hippospongide B (4), dan ent-labdane (5) ........................... 24

Gambar 7. Inokulasi 3 buah cokbor pada fermentasi hari ke-0 (A) dan hasil

fermentasi selama 10 hari (B) ........................................................... 34

Gambar 8. Hasil KLT fraksi-fraksi kromatografi kolom dengan pelarut (A)

aseton:kloroform (1:1) dan (B) pelarut aseton:kloroform (1:2)

dibawah sinar UV ............................................................................. 37

Gambar 9. Hasil KLT fraksi 2,3,5, dan 6 dengan eluen CHCl3 : aseton .............. 38

Gambar 10. Hasil KLT isolat fraksi 2 dengan eluen n-heksan : etil asetat ........... 39

Gambar 11. Spektrum UV-Vis isolat raksi 2 ........................................................ 40

Gambar 12. Spektrum FTIR isolat fraksi 2 .......................................................... 41

Gambar 13. Spektrum LC isolat fraksi 2. ............................................................. 43

Gambar 14. Spektrum MS isolat fraksi 2 ............................................................. 43

Gambar 15. Senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate .................................................. 44

Gambar 16. Spektrum LCMS/MS isolat fraksi 2. ................................................. 44

Gambar 17. Fragmentasi senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate pada library ............ 45

Gambar 18. Pemecahan molekul senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate ................... 45

vii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Panjang gelombang maksimum gugus kromofor...................................20

Tabel 2. Bilangan gelombang spektrum FTIR ....................................................22

Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antidiabetes ekstrak kapang endofit ...............36

Tabel 4. Hasil uji aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase setiap fraksi ......38

Tabel 5. Hasil analisis FTIR isolat fraksi 2 .........................................................42

Tabel 6. Hasil analisis spektrum massa .............................................................44

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan IC50 ekstrak filtrat dan miselium isolat kapang endofit

Colletotrichum sp. ......................................................................... 56

Lampiran 2. Perhitungan nilai penghambatan α-glukosidase dari semua fraksi .. 57

Lampiran 3. Perhitungan Rf KLT isolat fraksi 2 ................................................. 59

Lampiran 4. Spektrum UV-Vis metanol ............................................................. 60

Lampiran 5. Hasil spektrum FTIR isolat fraksi 2 ................................................ 61

Lampiran 6. Hasil spektrum LCMS isolat fraksi 2 .............................................. 62

Lampiran 7. Hasil spektrum LCMS/MS isolat fraksi 2 ....................................... 63

Lampiran 8. Foto penelitian ............................................................................... 64

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Diabetes Mellitus (DM) merupakan penyakit metabolik dengan karakteristik

tidak seimbangnya kadar glukosa dalam darah. Peningkatan jumlah penderita DM

serta penanggulangannya menjadi salah satu masalah kesehatan utama di Indonesia.

International Diabetes Federation (IDF) menyebutkan sekitar 415 juta orang dewasa

memiliki diabetes dan Indonesia merupakan negara yang menempati urutan ke-7

dengan jumlah penderita DM tertinggi di dunia (IDF, 2015).

Penanggulangan DM secara kimiawi berbahan sintetik dapat berefek

samping. Pemberian insulin sintetik dalam jangka waktu yang lama terbukti

menyebabkan hipoglikemia, tetapi obat antidiabetes sintetik tersebut menyebabkan

perut kembung, diare, mual, dan hepatotoksik (Sudha et al., 2011). Oleh karena itu,

pengembangan obat antidiabetes yang bekerja efektif dengan efek samping yang

rendah melalui penggunaan bahan alami perlu dikembangkan. Berdasarkan ayat Al-

Qur’an dalam surat Al-Imran ayat 191 yang berbunyi:

Artinya: “(yaitu) orang-orang yang mengingat Allah sambil berdiri atau duduk atau

dalam keadan berbaring dan mereka memikirkan tentang penciptaan langit dan bumi

(seraya berkata): "Ya Tuhan Kami, Tiadalah Engkau menciptakan ini dengan sia-sia,

Maha suci Engkau, Maka peliharalah Kami dari siksa neraka.”

2

Surat Al-Imran ayat 191 menjelaskan bahwa Allah SWT

menundukkan/menciptakan langit dan bumi agar manusia mencari anugerah atas apa

yang terdapat di dalamnya karena tidak ada sesuatu hal apapun yang diciptakan

dengan sia-sia dan adanya penjelasan ciri khas orang yang berakal, yaitu selalu

terinspirasi oleh tanda-tanda kebesaran Allah SWT. dan memperoleh manfaatnya di

alam ini. Secara tersirat, ayat tersebut memberikan motivasi kepada kita untuk terus

mengkaji potensi apa yang terkandung dalam bumi sehingga dapat digunakan

semaksimal mungkin untuk kesejahteraan umat manusia.

Salah satu kajian marine-based saat ini adalah spons. Dengan beragam warna

dan bentuknya, spons memberikan peluang untuk diteliti tidak saja dari aspek

keanekaragaman biota yang bersimbiosis, tetapi juga memberikan harapan sebagai

sumber bahan alami (natural product) bagi penelitian medis. Kemampuan spons

dalam menghasilkan senyawa bioaktif dikarenakan adanya hubungan simbiosis

dengan mikroorganisme dalam hal ini kapang. Karena peranan ini maka mikroba

yang bersimbiosis dengan spons diduga memiliki potensi yang besar dalam

menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang selama ini diisolasi dari spons. Untuk

mengambil senyawa bioaktif dari biota laut secara langsung, dibutuhkan biomassa

yang sangat banyak sehingga untuk mengefisienkan cara memperoleh senyawa

tersebut, maka digunakan mikroba endofit yang diisolasi dari bagian biota laut

tersebut.

Mikroba ini dipilih sebagai sumber penghasil senyawa bioaktif, karena lebih

mudah penanganannya. Selain itu, keunggulan mikroba endofit sebagai sumber

senyawa bioaktif baru adalah siklus hidup mikroba endofit yang singkat dan

3

senyawa-senyawa yang dihasilkan dapat diproduksi dalam skala besar melalui proses

fermentasi (Prihatiningtias dan Sri, 2011). Salah satu contohnya yaitu kapang endofit

Diaporthe sp. yang diisolasi dari tanaman kina dapat memproduksi senyawa yang

alkaloid yang sama dengan tanaman kina (Maehara et al., 2011). Oleh karena itu,

mikroba endofit memiliki prospek yang baik dalam penemuan senyawa-senyawa baru

salah satunya antidiabetes.

Beberapa senyawa yang memiliki aktivitas farmakologi sudah berhasil

diisolasi contohnya senyawa manzamin A dan xestomanzamin A yang memiliki

aktivitas antimalaria dan anti-HIV telah diisolasi dari spons Petrosia hoeksemai yang

dikoleksi dari Pulau Menjangan, Bali-Indonesia (Usman, 2014). Senyawa terpen

dysidine, dari spons Dysidea sp. (Zhang et al., 2009) yang baru-baru ini telah

memasuki uji pre-klinis untuk pengobatan diabetes tipe-2 (Yamazaki et al., 2013).

Penelitian lain juga menjelaskan bahwa ekstrak etil asetat dari kapang endofit

Colletotrichum sp. yang diisolasi dari tanaman herba Polygala elongate yang

dikoleksi dari India, menunjukkan nilai inhibisi maksimum 81,72% terhadap aktivitas

antioksidan pada konsentrasi 100 μg/ml (Pawle dan Singh, 2014). Isolasi senyawa

bioaktif juga pernah dilakukan dari ekstrak metanol miselium kapang endofit

Colletotrichum sp. yang diisolasi dari tanaman cemara Sumatera (Taxus sumatrana)

dilaporkan memiliki aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase (Artanti et al.,

2012).

Yoice dan Desak (2015) melakukan screening kapang endofit yang

menghasilkan 12 isolat kapang endofit biota laut, yaitu 6 isolat rumput laut (kode:

SWeF), 2 isolat dari terumbu karang (kode: SWF), 1 isolat dari batu karang (kode:

4

Cr), dan 3 isolat dari spons (kode: SF). Hasil screening tersebut, ketiga isolat endofit

spons yang aktif pada aktivitas antibakteri hanya SF1 dan SF3. Pada pengujian

pendahuluan terhadap aktivitas penghambatan α-glukosidase, SF1 yang telah di

identifikasi sebagai kapang Colletotrichum sp. lebih berpotensi sebagai penghambat

enzim α-glukosidase dengan inhibisi filtrat 69,3% pada konsentrasi 100 μg/ml

sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui metabolit sekunder

yang dihasilkan oleh kapang endofit Colletotrichum sp. yang memiliki aktivitas

penghambatan enzim α-glukosidase.

Berdasarkan pemaparan di atas, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut

untuk mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktivitas

penghambatan α-glukosidase dari kapang endofit spons.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan permasalahan dalam penelitian ini adalah :

a. Apakah isolat kapang endofit Colletotrichum sp. dari spons mampu

menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktivitas

penghambatan α-glukosidase?

b. Bagaimana karakteristik senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari

mikroba endofit spons yang memiliki aktivitas penghambatan α-glukosidase

dengan menggunakan data UV-Vis, FTIR, LCMS, dan LCMS/MS?

1.3 Hipotesis

Hipotesis dari penelitian ini adalah dalam kapang endofit spons terdapat

senyawa aktif metabolit sekunder yang berpotensi sebagai inhibitor α-glukosidase.

5

1.4 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

a. Mengisolasi senyawa metabolit sekunder yang berpotensi sebagai inhibitor

α-glukosidase dari kapang endofit spons.

b. Mengetahui karakteristik senyawa metabolit sekunder yang berpotensi sebagai

inhibitor α-glukosidase dari hasil isolasi mikroba endofit spons berdasarkan

interpretasi data spektra UV-VIS, FTIR, LCMS, dan LCMS/MS.

1.5 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai

senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktivitas penghambatan α-glukosidase

dari biota laut berupa kapang endofit spons sehingga dapat dijadikan rujukan pada

penelitian selanjutnya, dan memberikan nilai tambah terhadap pengembangan biota

laut dan potensi mikroba endofit spons sebagai obat alternatif antidiabetes secara

alami.

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapang Endofit

Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tanaman dan

mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan tanpa membahayakan

tanaman inang. Mikroba endofit tidak hanya terdapat pada tanaman melainkan juga

terdapat pada beberapa biota laut seperti spons laut dan terumbu karang. Kemampuan

mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan organisme

inangnya merupakan peluang yang sangat besar untuk memproduksi metabolit

sekunder yang diisolasi dari organisme inangnya (Prihaningtias et al., 2011). Hal ini

karena mikroba merupakan organisme yang mudah ditumbuhkan, memiliki siklus

hidup yang pendek dan senyawa bioaktif yang dihasilkan dapat diproduksi dalam

skala besar melalui proses fermentasi.

Mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa bioaktif yang karakternya mirip

atau sama dengan inangnya. Hal ini disebabkan adanya pertukaran genetik yang

terjadi antara inang dan mikroba endofit secara evolusioner, sehingga mikroba endofit

dapat menjadi salah satu alternatif penemuan obat-obat baru karena senyawa-senyawa

bioaktif yang dikandungnya (Pratiwi, 2008). Mikroba endofit tidak memerlukan

lahan yang luas untuk tumbuh dan memerlukan waktu lebih pendek untuk

menghasilkan senyawa metabolit aktif dibandingkan bila menumbuhkan tanaman

inangnya (Nofiani, 2008). Salah satu contohnya yaitu kapang endofit Diaporthe sp.

yang diisolasi dari tanaman kina dapat memproduksi senyawa yang alkaloid yang

sama dengan tanaman kina (Maehara et al., 2011).

7

2.2 Kapang SF1 (Colletotrichum sp.)

Isolat kapang SF1 yang digunakan pada penelitian ini merupakan hasil isolasi

kapang dari laut Pameungpeuk, Garut, Jawa Barat, Indonesia. Kapang ini diketahui

hidup bersimbiosis dengan spons. Berdasarkan hasil identifikasi berdasarkan urutan

Internal Transcribe Spacer (ITS) yang dilakukan oleh Yoice dan Desak (2015),

bahwa isolat kapang SF1 adalah Colletotrichum sp. (Gambar 1). Hubungan

filogenetik Colletotrichum spp. berdasarkan ITS rDNA ditunjukkan pada (Gambar 2).

Menurut Ketut (2016) jamur yang disebut Colletotrichum sp. dapat diklasifikasikan

sebagai berikut:

Kingdom : Fungi

Phylum : Deuteromycota

Class : Deuteromycetes

Ordo : Melanconiales

Family : Melanconiaceae

Genus : Colletotrichum

Species : Colletotrichum spp.

Gambar 1. Isolat kapang SF1 (Collecotrichum sp.) (A) tampak belakang dan (B)

tampak depan (dokumentasi pribadi)

8

Gambar 2. Pohon filogenetik SF1 berdasarkan ITS rDNA (Srikandace dan

Andayani, 2015)

Pohon filogenetik (Gambar 2) menunjukkan maksimum angka kemiripan

urutan rDNA sampel dengan kapang Colletotrichum spp. Identifikasi molekuler

tersebut menunjukkan bahwa kapang endofit SF1 merupakan Colletotrichum sp. 3393

dengan kemiripan sebesar 93% dari identitas maksimum. Beberapa penelitian telah

mengisolasi jamur endofit Colletotrichum spp, salah satunya dari rumput laut Fucus

tali (Zuccaro et al., 2008). Menurut Ketut (2016), ciri-ciri umum jamur dari genus

Colletotrichum yaitu memiliki hifa bersekat dan bercabang serta menghasilkan

konidia yang transparan dan memanjang dengan ujung membulat atau meruncing

panjangnya antara 10-16 μm dan lebarnya 5-7 μm dengan massa konidia berwarna

hitam. Dari ciri-ciri yang ada, jamur yang digunakan dalam penelitian ini adalah

jamur Colletotrichum sp. dengan permukaan hifa bersekat dan berwarna hitam.

Colletotrichum sp. merupakan genus kapang yang bersimbiosis dengan

tanaman sebagai endofit atau fitopatogen (Rodriguez dan Redman, 2008). Beberapa

9

spesies Colletotrichum adalah patogen bagi tanaman, tetapi spesies yang lain

mempunyai hubungan simbiosis mutualistik dengan inangnya, bahkan diantaranya

menghasilkan beberapa senyawa bioaktif. Penelitian lain juga menjelaskan bahwa

ekstrak etil asetat dari kapang endofit Colletotrichum sp. yang diisolasi dari tanaman

herba Polygala elongate menunjukkan nilai inhibisi maksimum 81,72% terhadap

aktivitas antioksidan pada konsentrasi 100 μg/ml (Pawle dan Singh, 2014).

Tianpanich et al. (2011) melaporkan telah mengisolasi dan mengidentifikasi 5

senyawa turunan isocoumarins dan phtalide baru dari kapang endofit Colletotrichum

sp. CRI535-02 yang menunjukkan aktifitas antioksidan, sitotoksik dan radikal bebas.

Menurut Ketut (2016) menyatakan Colletotrichum sp. merupakan penyebab

penyakit antraknosa pada tanaman yang dicirikan dengan adanya bercak coklat

kehitaman pada permukaan buah, yang selanjutnya meluas menjadi busuk lunak,

pada bagian tengah bercak terdapat kumpulan titik-titik hitam yang terdiri dari

sekelompok seta dan konidium. Gejala berwarna hitam karena adanya seta yaitu

bagian kapang yang terbentuk pada aservulus. Kapang ini pada umumnya menyerang

buah cabai menjelang masak ketika buah mulai berwarna kemerahan (Mahasuk et al.,

2008).

2.3 Spons

Spons merupakan invertebrata laut yang mempunyai struktur pergerakan fisik

lebih terbatas dibanding dengan vertebrata laut yang mampu mengembangkan sistem

pertahanan diri dengan memproduksi senyawa bioaktif. Hal ini memungkinkan spons

menghasilkan metabolit yang mempunyai struktur kimia yang spesifik dan bervariasi

dan sangat berpengaruh terhadap bioaktivitasnya (Usman, 2014).

10

Spons merupakan salah satu komponen biota penyusun terumbu karang yang

mempunyai potensi bioaktif, sehingga menjadikan spons target yang sangat menarik

karena keanekaragamannya yang tinggi dan unik dan spons menduduki tempat teratas

sebagai sumber substansi aktif. Berbagai macam senyawa telah berhasil diisolasi dari

biota ini diantaranya adalah alkaloid, terpenoid, acetogenin, senyawa nitrogen, halida

siklik, peptide siklik dan lain-lain (Sumilat, 2017). Spons merupakan biota laut yang

tersebar pada daerah perairan pantai yang dangkal hingga kedalaman 5,5 km. Tubuh

hewan ini terdiri dari jaringan rangka yang disebut spikula. Spikula tersebut

mengandung senyawa kimia yaitu kalsium, karbonat, silika, serat kolagen dan serat

spons yang lentur (Abubakar et al., 2011).

Kemampuan spons dalam menghasilkan senyawa bioaktif dikarenakan

hubungan simbiosis dengan mikroorganisme dapat berbentuk simbiosis mutualisme

sampai hubungan yang patogen. Hubungan ini mencakup penyediaan nutrisi dengan

membantu translokasi metabolisme termasuk nitrifikasi, fiksasi nitrogen, fotosintesis

dan membantu pertahanan kimiawi serta berperan dalam biofouling. Hubungan

simbiosis mutualisme ditandai dengan hubungan yang saling menguntungkan antara

mikroba endofit dan inangnya. Mikroba endofit mengeluarkan senyawa metabolit

sekunder yang dapat melindungi inang dari serangan patogen. Organisme inang

menyediakan nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba endofit untuk melengkapi siklus

hidupnya. Karena peranan ini maka kapang yang bersimbiosis dengan spons diduga

memiliki potensi yang besar dalam menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif yang

selama ini diisolasi dari spons (Ginting et al., 2010).

11

Spons menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang tinggi serta memiliki

kemampuan untuk mensintesis bermacam-macam komponen organik seperti

polyketida, alkaloid, peptida dan terpene. Kandungan metabolit sekunder dalam

spons jenis tertentu ada yang lebih kuat daripada di dalam jenis lainnya yang ditandai

dengan warna yang timbul pada uji kualitatif (Usman, 2014).

Salah satu contohnya yaitu senyawa terpen dysidine (1) yang dihasilkan dari

spons Dysidea sp. (Zhang et al., 2009), yang baru-baru ini telah memasuki uji pre-

klinis untuk pengobatan diabetes tipe-2 (Yamazaki et al., 2013). Dua metabolit

sekunder juga telah diisolasi dari spons Petrosia hoeksemai yang dikoleksi dari Pulau

Menjangan, Bali-Indonesia. Senyawa tersebut adalah manzamin-A (2) dan

xestomanzamin A (3). Senyawa alkaloid manzamin dilaporkan memiliki aktivitas

antimalaria dan anti-HIV (Usman, 2014).

Gambar 3. Struktur dysidine (1), manzamin-A (2) dan xestomanzamin A (3)

(Usman, 2014)

12

Umumnya struktur kimia produk laut sering berbeda dari metabolit sekunder

daratan terutama pada halogenasi dengan bromin dan atau klorin. Perbedaan ini

dipengaruhi oleh lingkungan laut yang unik. Menurut Nofiani (2008), ada 3 fakta

yang membuktikan bahwa lingkungan laut unik. Pertama, air laut mengandung

bermacam-macam substansi yang aktif secara biologi seperti vitamin, dan banyak

mikroorganisme laut berkemampuan untuk menghasilkan vitamin. Kedua, air laut

mengandung agen inhibitor yang aktif untuk organisme. Beberapa faktor yang

menggambarkan kenyataan ini adalah air laut mempunyai kemampuan menghambat

bakteri gram positif, air laut dari alam lebih menghambat daripada air laut buatan, air

laut yang telah diberi perlakuan panas menunjukkan pengurangan aktivitas inhibitor

dibandingkan dengan air laut yang segar, aktivitas inhibitor air laut tidak disebabkan

oleh faga atau salinitas tapi karena ada agen antibakteri dalam air laut. Ketiga,

beberapa mikroorganisme yang diisolasi dari air laut menunjukkan aktivitas

antibakteri, antidiabetes, dan antimikroba.

2.4 Diabetes Melitus

Diabetes Melitus adalah suatu gangguan metabolisme yang ditandai oleh

hiperglikemia yang disertai gangguan metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein

sebagai akibat insufisiensi fungsi insulin. Insufisiensi insulin disebabkan oleh

gangguan atau defisiensi produksi insulin oleh sel-sel β langerhans kelenjar pankreas,

atau disebabkan oleh kurang responsifnya sel-sel tubuh terhadap insulin. Insulin

adalah hormon yang bertanggung jawab dalam mempertahankan kadar gula darah

13

yang normal (Najib, 2010). Secara umum, terdapat empat tipe diabetes melitus

(Ulbricht dan Seamon, 2010), yaitu:

2.4.1 Diabetes tipe 1 (Insulin-dependent diabetes mellitus)

Pada diabetes tipe 1, pankreas tidak dapat memproduksi cukup insulin untuk

memfasilitasi absorpsi glukosa ke dalam sel. Gangguan produksi insulin pada

diabetes tipe ini umumnya terjadi karena kerusakan sel β pulau langerhans yang

disebabkan oleh autoimun, dan ada pula yang disebabkan oleh virus. Destruksi

autoimun dari sel beta pulau langerhans kelenjar pancreas langsung mengakibatkan

defisiensi sekresi insulin.

2.4.2 Diabetes tipe 2 (Non-insulin-dependent diabetes mellitus)

Diabetes tipe 2 sering disebut sebagai non-insulin-dependent diabetes mellitus

(NIDDM) yang lebih sering terjadi pada orang dewasa dan memiliki berat badan

yang berlebihan. Pasien dengan diabetes tipe 2 mengalami penurunan produksi

insulin dari sel beta pankreas, penurunan sensitivitas reseptor insulin di sel, dan

penurunan kemampuan pemindahan glukosa ke dalam sel. Awal penyakit ini bukan

disebabkan oleh kurangnya sekresi insulin, tetapi disebabkan karena sel target insulin

tidak mampu merespon insulin secara normal.

2.4.3 Diabetes gestasional

Diabetes gestasional merupakan tipe diabetes yang terjadi selama kehamilan,

hal itu disebabkan karena disekresikan hormon oleh plasenta yang menyebabkan

resistensi insulin. Wanita yang memiliki kelebihan berat badan sebelum kehamilan,

berusia lebih dari 25 tahun, atau memiliki keturunan keluarga yang menderita

diabetes tipe 2 dapat meningkatkan resiko terjadinya diabetes gestasional.

14

2.4.4 Sindrom metabolik

Sindrom metabolik (atau sindrom X) disebabkan oleh keadaan atau sindrom

tertentu seperti penyakit pankreas, hormonal, keadaan yang disebabkan oleh obat atau

zat kimia, gangguan reseptor insulin dan sindrom genetik tertentu.

2.5 Enzim α-glukosidase

Enzim α-glukosidase adalah enzim yang bertanggung jawab terhadap konversi

karbohidrat menjadi glukosa. Karbohidrat akan dicerna oleh enzim di dalam mulut

dan usus menjadi gula yang lebih sederhana yang kemudian akan diserap ke dalam

tubuh dan meningkatkan kadar gula darah. Proses pencernaan karbohidrat tersebut

menyebabkan pankreas melepaskan enzim α-glukosidase ke dalam usus yang akan

mencerna karbohidrat menjadi oligosakarida yang kemudian akan diubah lagi

menjadi glukosa oleh enzim α-glukosidase yang dikeluarkan oleh sel-sel usus halus

yang kemudian akan diserap kedalam tubuh. Dengan adanya penghambatan kerja

enzim α-glukosidase, kadar glukosa dalam darah dapat dikembalikan dalam batas

normal (Bösenberg, 2008).

Pada pengujian in vitro, enzim -glukosidase akan mengkatalisis reaksi

pemecahan substrat p-nitrofenil--D-glukopiranosida pada suhu 37 °C menjadi

p-nitrofenol (berwarna kuning) dan glukosa. Aktivitas enzim ini diukur dengan

spektrofotometer berdasarkan serapan p-nitrofenol yang dihasilkan. Jika sampel

memiliki kemampuan menghambat aktivitas -glukosidase maka p-nitrofenol yang

dihasilkan akan berkurang (Sugiawati et al., 2009). Berikut ini merupakan reaksi

15

enzimatik -glukosidase yang menghidrolisis substrat p-nitrofenil--D-

glukopiranosida menjadi p-nitrofenol dan glukosa.

Gambar 4. Reaksi penghambatan enzim α-glukosidase (Sugiwati et al., 2009)

2.6 Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses penarikan kandungan kimia yang dapat larut dari

suatu serbuk simplisia, sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut. Metode

ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini merupakan metode ekstraksi cair-cair.

Ekstraksi cair-cair merupakan metode ekstraksi yang didasarkan pada sifat kelarutan

komponen target dan distribusinya dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur.

Ekstraksi cair-cair bertahap merupakan teknik ekstraksi cair-cair yang paling

sederhana, cukup dengan menambahkan pelarut pengekstraksi yang tidak saling

bercampur ke dalam corong pisah kemudian dilakukan pengocokan sehingga terjadi

distribusi zat terlarut diantara kedua pelarut (Khopkar, 2008).

Pada proses ekstraksi dilakukan pengocokan yang bertujuan untuk

memperluas area permukaan kontak diantara kedua pelarut sehingga pendistribusian

zat terlarut diantara keduanya dapat berlangsung dengan baik. Untuk senyawa-

senyawa yang berwarna, partisi dihentikan bila ekstrak terakhir sudah tidak berwarna.

16

Sedangkan untuk senyawa yang tidak berwarna, partisi dihentikan setelah tiga sampai

empat kali penggantian pelarut (Khopkar, 2008).

2.7 Kromatografi

Kromatografi adalah metode pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

distribusi molekul-molekul komponen di antara dua fase, yaitu fase diam dan fase

gerak (Hermanto, 2009).

2.7.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan satu di antara analisis kualitatif

dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan sistem pemisahan yang digunakan

berdasarkan prinsip like dissolves like, yaitu memisahkan komponen-komponen

sampel berdasarkan perbedaan kepolaran (Khopkar, 2008). Dalam KLT terdapat dua

fase yaitu fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Fase diam

berupa lapisan pelarut yang terjerap pada lapisan tipis alumina, silika gel, atau bagian

serbuk lainnya, dan fase geraknya berupa cairan disebut eluen atau pelarut atau gas

pembawa yang inert. Gerakan fase ini mengakibatkan terjadinya migrasi diferensial

komponen-komponen dalam sampel (Wulandari, 2011).

Prinsip KLT adalah sampel diteteskan pada lapisan tipis kemudian

dimasukkan ke dalam wadah yang berisi fase gerak sehingga sampel tersebut terpisah

menjadi komponen-komponennya dengan laju tertentu yang dinyatakan dengan Rf

(Retardation Factor), yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh komponen

terhadap jarak yang ditempuh fase gerak. Komponen yang mempunyai afinitas lebih

besar dari fase gerak atau afinitasnya lebih kecil dari fase diam akan bergerak lebih

cepat dari pada komponen yang mempunyai sifat sebaliknya. Deteksi hasil

17

kromatogram dilakukan di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366

nm, serta dapat dilakukan juga dengan pereaksi semprot (Wulandari, 2011).

Nilai Rf menunjukkan keberadaan suatu senyawa yang terdapat di dalam

suatu sampel. Senyawa yang terkandung antara suatu sampel dengan sampel yang

lain memiliki perbedaan. Sampel yang memiliki nilai Rf lebih rendah atau tinggi

dapat disebabkan adanya senyawa lain yang terkandung pada masing-masing ekstrak.

Ada beberapa faktor yang menyebabkan nilai Rf berubah. Nilai Rf berubah karena

faktor suhu, eluen dan banyaknya senyawa yang ditotolkan. Pemisahan yang baik

ditandai dengan nilai Rf KLT yang baik berkisar antara 0,2-0,8 (Gandjar dan

Rohman, 2008). Pada Rf kurang dari 0,2 belum terjadi kesetimbangan antara

komponen senyawa dengan fase diam dan fase gerak sehingga bentuk noda biasanya

kurang simetris. Sedangkan pada Rf lebih dari 0,8 noda analit akan diganggu oleh

absorbansi pengotor lempeng fase diam yang teramati pada visualisasi dengan lampu

UV (Wulandari, 2011). Oleh karena itu, nilai Rf tidak dapat diandalkan untuk

identifikasi senyawa sehingga perlu adanya pengujian lanjutan. KLT dapat dilihat

pada Gambar 5.

Gambar 5. Kromatografi lapis tipis (Wulandari, 2011).

18

Identitas noda dalam kromatografi lapis tipis dinyatakan dengan harga Rf

yang didefinisikan sebagai rasio jarak noda terhadap titik awal dibagi jarak eluen

terhadap titik awal. Secara matematis dapat ditulis:

Rf =

2.7.2 Kromatografi Kolom Gravitasi

Kromatografi kolom gravitasi merupakan metode konvensional yang

digunakan untuk fraksinasi dan juga pemurnian suatu senyawa. Prinsip dari

kromatografi kolom adalah pemisahan zat berdasarkan mekanisme adsorbsi,

pembagian ion, pertukaran ion, afinitas dan perbedaan ukuran molekul (Gandjar dan

Rohman, 2008).

Kromatografi kolom gravitasi merupakan salah satu cara pemisahan dimana

fase diam ditempatkan dalam suatu matriks penyangga khusus berbentuk silinder atau

kolom. Sejumlah kecil analit yang akan dipisahkan ditempatkan di atas permukaan

kolom. Selanjutnya dielusi oleh fase gerak yang dialirkan melewati kolom sehingga

terjadi pemisahan karena adanya perbedaan interaksi antara analit dengan fase diam

dan fase geraknya. Perbedan afinitas dan gaya interaksi dari setiap komponen ini akan

menyebabkan terjadinya perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen

sehingga terjadi pemisahan komponen tersebut dengan menampung setiap fraksi yang

dihasilkan di dasar kolom (Hermanto, 2009).

Hal yang dilakukan sebelum pemisahan menggunakan kromatografi kolom

adalah mencoba terlebih dahulu dengan KLT. Hal ini dilakukan untuk mengetahui

kompleksitas campuran yang akan dipisahkan dan sekaligus untuk menemukan

19

sistem eluen yang akan digunakan untuk proses pemisahan menggunakan

kromatografi kolom (Kristanti et al., 2008).

2.8 Spektroskopi

Spektroskopi adalah studi mengenai interaksi antara energi cahaya dan materi.

Suatu senyawa organik atau anorganik dapat mengadsorpsi energi cahaya pada

panjang gelombang tertentu, oleh karena itu teknik spektroskopi dapat digunakan

untuk menentukan struktur senyawa yang tidak diketahui. Untuk menentukan struktur

kimia suatu senyawa dapat digunakan metode spektroskopi seperti Spektrofotometri

UV-Vis, Fourier-Transform Infra Red (FT-IR), Liquid Chromatography Mass

Spectroscopy (LCMS), dan LC-MS/MS.

2.8.1 Spektrofotometri Ultraviolet-Visibel (UV-Vis)

Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah satu teknik analisis spektroskopi

yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet (190-380 nm) dan sinar

tampak (380-780 nm). Prinsip dari spektroskopi UV-Vis adalah adanya transisi

elektronik suatu molekul yang disebabkan oleh peristiwa absorpsi (penyerapan)

energi berupa radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai oleh

molekul tersebut (Gandjar dan Rohman, 2008).

Jika molekul menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi

perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju keadaan tereksitasi yang disebut

dengan transisi elektronik. Transisi elektronik disebabkan karena adanya interaksi

antara energi dengan gugus kromofor (Neldawati et al., 2013). Kromofor adalah

suatu gugus fungsi yang menyerap radiasi elektromagnetik. Berikut ringkasan data

20

transisi elektronik tertera pada Tabel.1

Tabel 1. Ringkasan data transisi elektronik

Gugus Kromofor λmax (nm) Transisi

Alkena 177 π – π*

Alkuna 178-225 π – π*

Karbonil 186-280 n – σ* atau n – π*

Karboksil 204 n – π*

Amida 214 n – π*

Azo 339 n – π*

Nitro 280 n – π*

Nitrat 270 n – π*

Olefin 184 Delokalisasi n*

Triolefin 250 Delokalisasi n*

Diolefin 217 Delokalisasi n*

Keton 282 n – π*

Keton (tidak jenuh) 278 n – π*

Keton (jenuh) 324 n – π*

H2O 167 n – σ*

Metanol 184 n – σ*

Metil klorida 173 n – σ*

Dimetileter 184 n – σ*

Metilamin 215 n – σ*

Benzen 204 π – π*

Toluene 207 π – π*

Fenol 211 π – π*

Anilin 230 π – π*

Naftalen 286 π – π*

Stiren 244 π – π*

Sumber: Khopkar (2008)

2.8.2 Spektroskopi Fourier Transform Infra Red (FTIR)

Spektrofotometri infra merah dapat digunakan untuk penentuan struktur,

khususnya senyawa organik dan juga untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2008).

Daerah radiasi spektroskopi infra merah berkisar pada panjang gelombang dari 0.78 -

1000 μm atau bilangan gelombang dari 12800 - 10 cm-1

. Umumnya daerah radiasi IR

21

terbagi dalam daerah IR dekat (12.800 - 4.000 cm-1

), daerah IR tengah (4.000 - 200

cm-1

), dan daerah IR jauh (200 - 10 cm-1

) (Hermanto, 2009).

Spektrofotometri Fourier Transform Infra Red(FTIR) merupakan suatu

metode analisis yang dipakai untuk analisis gugus fungsi, pengenalan senyawa, dan

analisa campuran. Penemuan gugus fungsional diperoleh berdasarkan bilangan

gelombang yang dibutuhkan untuk suatu molekul bervibrasi pada suatu ikatan baik

berupa rentangan (streaching) maupun berupa bengkokan (bending) dimana setiap

ikatan mempunyai bilangan gelombang yang spesifik sehingga setiap molekul

mempunyai spektra infra merah yang spesifik atau sidik jari (fingerprint) tertentu

(Ibrahim et al., 2013). Prinsip dari analisa FTIR adalah besarnya frekuensi sinar

inframerah yang diserap dengan tingkat energi tertentu ketika melewati sebuah

senyawaorganik sebanding dengan energi yang timbul pada getaran-getaran ikatan

vibrasi, translasi dan rotasi molekul (Hermanto, 2009).

Suatu molekul bila menyerap radiasi infra merah, maka energi yang diserap

menyebabkan kenaikan amplitudo getaran atom-atom yang terikat sehingga molekul

berada dalam keadaan tereksitasi. Energi yang diserap akan dilepaskan dalam bentuk

panas jika molekul kembali ke keadaan dasar. Panjang gelombang yang diabsorpsi

suatu ikatan bergantung pada jenis getaran dari ikatan tersebut. Dengan demikian,

spekroskopi infra merah dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus

fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya energi infra merah yang diserap oleh suatu

molekul beraneka ragam yang disebabkan perubahan momen dipol pada saat energi

diserap (Supratman, 2010). Berikut tabel bilangan gelombang spektrofotometer

FTIR.

22

Tabel 2. Bilangan gelombang spektrofotometer FTIR

Gugus Fungsi Jenis Vibrasi Frekuensi (cm-1

) Intensitas

C – H (Csp

3) alkana (rentang)

-CH3 (Bengkok )

3000 – 2850

1450 – 1375 Tajam

Sedang

-CH2- (Bengkok )

(Csp2) alkena (rentang)

1465 – 1450

3100 – 3000 Sedang

Sedang

(keluar bidang ) 1000 – 650 Tajam

Aromatik (rentang ) 3150 – 3050 Lemah

(keluar bidang ) 900 – 690 Sedang

(Csp) alkuna (rentang) 3300 Sedang

C – H Aldehida 2900 – 2700 Lemah

Amidana 1350 – 1000 Sedang – lemah

C = C Alkena 1680 – 1600 Sedang – lemah

Aromatik 1600 – 1475 Sedang – lemah

C ≡ C Alkuna 2250 – 2100 Sedang – lemah

C = O Aldehida 1740 – 1720 Tajam

Keton 1725 – 1705 Tajam

Asam karboksilat 1725 – 1700 Tajam

Ester 1750 – 1730 Tajam

Amida 1670 – 1640 Tajam

Anhidrida 1810 – 1760 Tajam

Klorida asam 1800 Tajam C – O Alkohol, ester, eter, asam

karboksilat, anhidrida 1300 – 1000 Tajam

O – H Alkohol , fenol, -bebas 3650 – 3600 Sedang ikatan –H 3500 – 3200 Sedang

Asam karboksilat 3400 – 2400 Sedang

N – H Amida dan amina (rentang) 3500 – 3100 Sedang

Bengkok 1640 – 1550 Sedang – tajam

C = N Imina dan oksin 1690 – 1640 Lemah – tajam

C ≡ N Nitril 2260 – 2240 Tajam X= C = Y Allena, ketena, isosianat,

Isotiosianat 2270 – 1450 Lemah – tajam

N = O Nitro (R-NO2) 1550 dan 1350 Tajam

S – H Merkaptan 2250 Lemah S = O Sulfon, sulfonil-klorida 1375 – 1300 Tajam

Sulfat dan sulfanamiad 1200 – 1140 Tajam

Sumber : Sastrohamidjojo (2013)

2.8.3 Liquid Cromatography-Mass Spectrometry (LCMS)

LCMS merupakan pengembangan teknologi dan kombinasi antara

kromatografi cair dengan spektrometri massa. Di dalam kolom terjadi pemisahan

23

senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda,

sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam.

Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar

terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam

akan keluar lebih lama. Data yang didapatkan adalah berat molekul ditambah

beberapa muatan dan berat molekul pelarut. Hasil ini memberikan informasi

mengenai berat molekul, jumlah, dan kemurnian sampel (Skoog et al., 2013).

Sampel yang telah terpisah dengan liquid chromatography diidentifikasi berat

molekulnya menggunakan spektroskopi massa. Hasil spektrum dari spektroskopi

massa berupa perbandingan antara intensitas (%) terhadap massa (m/z). Intensitas (%)

yang paling tinggi sebagai base peak dan mass (m/z) yang paling besar sebagai

[M+H]+ (Skoog et al., 2013).

Dalam LCMS, terdapat beberapa jenis Analyzer yaitu Triple Quadrapole

(TQD), Time of Flight (TOF), ion trap dan Fourier transform-ion cyclotron

resonance. LCMS memiliki beberapa macam teknik ionisasi yaitu Atmospheric

Pressure Ionization(API), Electrospray Ionization (ESI), Fast Atom Bombared

(FAB), dan Electron Ionization (EI). Teknik Ionisasi yang biasa digunakan pada

LCMS yaitu menggunakan analyizer TOF dengan teknik ionisasi ESI (Sriveena et

al., 2015).

Beberapa senyawa yang berasal dari spons telah berhasil diisolasi dan

dianalisis berat molekul serta formula molekulnya (Gambar 6) yaitu (4)

hippospongide B [M+H]+ 411.287 m/z dengan formula molekul C25H40O3, dan (5)

24

ent-labdane diterpene [M+H]+ 339.253 m/z dengan formula molekul C20H34O4

(Yu-Chia et al., 2012; Ramiro et al., 2012).

Gambar 6. Senyawa hippospongide B (4), dan ent-labdane (5) (Yu-Chia et al., 2012;

Ramiro et al., 2012).

2.8.4 Liquid Cromatography tandem Mass Spectrometry (LCMS/MS)

Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LCMS/MS) merupakan

teknik yang digunakan untuk banyak aplikasi yang memiliki sensifitas tinggi dan

selektivitas sebagai uji konfirmasi. Uji konfirmasi merupakan uji kualitatif pada

LCMS/MS dengan mengetahui fragmentasi ion dari senyawa, dilakukan sebelum uji

kesesuaian system untuk memperkuat identifikasi kualitatif dari senyawa dengan

melihat perbandingan massa terhadap muatan, senyawa pada kromatogram dapat

diketahui dari terbentuknya fragmen-fragmen ion pada perbandingan massa terhadap

muatan (m/z). Pada LCMS/MS, identifikasi senyawa secara kualitatif lebih spesifik

dan struktural dibandingkan dengan HPLC karena pada LCMS/MS tidak hanya

waktu retensi yang diamati tetapi juga pemisahan ion suatu senyawa (Turnipseed et

al., 2008; Lutter et al., 2011).

Spektrometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan

memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa sesuai rasio fragmentasi molekul

(m/z). Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion yang akan

25

menghasilkan ion, dan analisis massa yang menyeleksi ion. Dalam spektroskopi

massa, molekul-molekul senyawa organic ditembak dengan berkas elektron dan

diubah menjadi ion-ion positif yang bertenaga tinggi (ion-ion molekuler atau ion-ion

induk), yang dapat terpecah menjadi ion-ion yang sangat lebih kecil (ion-ion

pecahan). Lepasnya elektron dari molekul akan menghasilkan radikal kation

(Khopkar, 2008).

Teknik Ionisasi yang biasa digunakan pada LCMS/MS yaitu menggunakan

analyizer TOF dengan teknik ionisasi ESI-MS/MS. TOF-MS adalah metode

spektrometri massa dimana memiliki prinsip yaitu rasio massa terhadap muatan ion

yang ditentukan melalui pengukuran waktu. Pada analisis massa Time-Of-Flight

(TOF), sebuah gaya elektromagnetik yang seragam diterapkan untuk semua ion pada

waktu yang sama. Hal ini menyebabkan ion akan dipercepat menyusuri tabung

penerbangan. Ion yang lebih ringan berjalan lebih cepat dan tiba pada detektor paling

awal, sehingga rasio fragmentasi ion⁄muatan ditentukan oleh waktu kedatangan

mereka. Analisis massa (TOF) memiliki kisaran massa yang luas dan sangat akurat

pada pengukuran massa suatu senyawa. Selain itu, instrumen TOF-MS biasanya

menggunakan ionisasi MALDI dan ESI yang di kembangkan dalam resolusi tinggi

dan instrumen hybrid (seperti contoh Q-TOF dan konfigurasi TOF/TOF) (Sriveena et

al, 2015).

26

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2016 sampai dengan

November 2017 dan dilaksanakan di Laboratorium Bahan Alam dan Farmasi, Pusat

Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) kompleks

PUSPIPTEK Serpong, Tangerang Selatan.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan untuk penelitian ini antara lain kolom kromatografi

GF254 60, neraca analitik (KERN), lampu UV λ254 dan λ365 (CAMAG), Buchi

Rotavapor R-200, Buchi heating bath B-490, vakum, chamber (CAMAG), kondensor

dan alat pemanas (Heidolph MR Hei Standard), alat gelas (IWAKI Pyrex), pipet

mikro dan tip (Socorex), laminar air flow (ESCO), Cawan Petri Polystyrene 100 mm

(IWAKI pyrex), inkubator, microplate reader, dan autoklaf.

Senyawa murni yang diperoleh dianalisis dengan metode spektroskopi antara

lain spektrofotometer UV-Vis (Agilent Cary 60), spektrofotometer IR (Shimadzu

PRESTIGE 21), spektrofotometer LCMS (Mariner) dan spektrofotometer LCMS-MS

(Waters Acquity I UPLC Class).

27

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan untuk penelitian ini antara lain isolat kapang endofit

spons Colletotrichum sp. yang diperoleh dari Loka Teknologi Bersih LIPI, pelarut

organik teknis (etil asetat, n-heksan, aseton, metanol) yang terlebih dahulu didestilasi

sebelum digunakan, Potato Dextrose Agar (Difco), Potato Dextrose Broth (Difco),

aquadest, buffer fosfat pH 7.0 (100 mM), enzim α-glukosidase (0,065 unit/mL, EC

3.2.1.20 Saccharomyces sp., Wako Pure Chemical Industries, Ltd), p-Nitrofenil

α-glukopiranosida (5 mM, Wako Pure Chemical Industries, Ltd), dimetil sulfoksida

(DMSO, Merck), Natrium karbonat, silika gel untuk kolom GF254 60 (170 - 230 mesh,

Merck) dan plat KLT silika gel 60 untuk kromatografi (Merck).

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Sterilisasi Alat

Alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan. Alat

kemudian dibungkus dengan alumunium foil setelah itu dilakukan sterilisasi.

Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada 121 oC

(Pratiwi, 2015).

3.3.2 Pembuatan Media

3.3.2.1 Pembuatan Media Regenerasi

Pada pembuatan media untuk regenerasi bakteri, media yang digunakan

adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Sebanyak 3,9 gram PDA ditambahkan aquades

sebanyak 100 ml. Bahan medium dicampur dengan pengadukan menggunakan stirrer

hingga terlarut sempurna, kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf dengan suhu

121 °C dengan tekanan 1 atm. Setelah suhu dan tekanan turun, media dikeluarkan dan

28

diletakkan ke dalam laminar. Media steril (suhu 50°C) dituangkan ke dalam cawan

petri steril, di tunggu 10 menit sampai media dingin dan mengeras (Pratiwi, 2015).

3.3.2.2 Pembuatan Media Fermentasi (Pratiwi, 2015)

Pada penelitian ini media yang digunakan adalah Potato Dextrose Broth

(PDB). Sebanyak 24 gram PDB dilarutkan dengan aquadest lalu tepatkan pada tanda

tera 1000 mL. Media yang sudah ditambahkan dengan aquadest kemudian

dihomogenkan menggunakan magnetik stirer. Setelah homogen, media dituangkan

kedalam 20 gelas kaca masing-masing 50 mL. Lalu gelas yang sudah berisi media

ditutup rapih menggunakan alumunium foil, kemudian di sterilisasi dengan autoklaf.

3.3.3 Isolasi Kapang Endofit (Srikandace, 2015)

Prosedur pengambilan sampel spons dan isolasi kapang berdasarkan prosedur

Srikandace (2015) dilakukan di Loka Teknologi Bersih LIPI. Spesimen spons laut

yang dikumpulkan dari Laut Pameungpeuk, Garut, Jawa Barat, Indonesia. Spesimen

dipindahkan langsung ke kantong pendingin yang berisi air laut dan segera diproses

untuk isolasi jamur endofitik di laboratorium. Spons laut dibilas tiga kali dengan air

laut buatan yang steril dan didesinfeksi dengan etanol 70%. Spons laut dipotong

secara aseptik menjadi potongan-potongan kecil (2x2 cm) dengan menggunakan

pisau cukur disipasi steril dan ditanam dalam medium Potato Dextrose Agar (PDA)

(Himedia) dan Corn Meal Agar (CMA) (Oxoid) ditambah dengan Streptomisin 100

mg/L. Cawan petri diinkubasi pada suhu kamar selama 1-2 minggu sampai morfologi

jamur bisa dibedakan. Masing-masing isolat diangkat dan dipindahkan ke media PDA

untuk pengujian selanjutnya.

29

3.3.4 Pembuatan Stock Culture

Pembuatan Stock Culture dilakukan dengan menginokulasi koloni ke dalam

10 cawan petri. Koloni dipisahkan dari isolat awal dengan menggunakan ose dan

ditanam pada media PDA. Media diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 °C selama

7 hari. Stock disimpan pada suhu 4 °C dalam lemari pendingin.

3.3.5 Fermentasi Kapang Endofit (Rollando, 2016)

Media yang sudah diautoklaf masing-masing diinokulasi dengan kapang

endofit Colletotrichum sp. sebanyak 3 buah cokbor di inokulasi dalam media Potato

Dextrose Broth (PDB) sebanyak 50 mL sejumlah 7 liter, lalu difermentasi dengan

metode statik dalam inkubator dengan suhu 28 °C /suhu ruang selama 10 hari.

3.3.6 Ekstraksi (Modifikasi Rollando, 2016)

Miselium kapang dan filtrat media cair PDB hasil fermentasi dipisahkan

dengan cara disaring. Bagian miselium tersebut dihaluskan, dimaserasi selama 24 jam

dengan pelarut etil asetat dan dikocok dengan stirrer. Sedangkan bagian filtrat

medium kemudian dipartisi menggunakan corong pisah dengan pelarut etil asetat.

Kedua bagian tersebut diambil dan dipisahkan fasa organiknya, dilakukan secara

duplo. Kemudian pelarut fasa organiknya diuapkan menggunakan rotary vacum

evaporator pada suhu 40-50 °C hingga didapatkan ekstrak. Selanjutnya, ekstrak yang

diperoleh di cuci sedikit demi sedikit menggunakan etil asetat, dimasukkan ke dalam

vial dan dibiarkan pelarut menguap. Selanjutnya ekstrak dikeringkan dan ditimbang.

3.3.7 Uji Aktivitas Penghambatan α-Glukosidase (Maryani et al, 2017)

Ekstrak kental dan ekstrak yang sudah murni di uji inhibisinya terhadap

aktivitas enzim α-glukosidase. Pada uji aktivitas penghambatan α-glukosidase

30

terdapat 2 perlakuan yaitu sampel yang ditambahkan dengan enzim dan sampel yang

tidak ditambahkan enzim. Sampel yang sudah kering dilarutkan menggunakan

DMSO, kemudian sampel di pipet menggunakan mikropipet sebanyak 5 μL dan

dimasukkan kedalam microplate. Kemudian ditambahkan substrat paranitro fenol

(PNP). Selanjutnya ditambahkan buffer fosfat (pH 7,0) sebanyak 49,5 μL, lalu

diinkubasi selama 5 menit dengan suhu 37 °C. Setelah diinkubasi dimasukkan enzim

α-glukosidase sebanyak 25 μL. Enzim yang digunakan pada penelitian ini berasal

dari Saccharomyces cerevisiae. Untuk sampel yang tidak ditambahkan enzim

ditambahkan buffer fosfat agar volumenya sama. Kemudian diinkubasi selama 15

menit, setelah inkubasi ditambahkan Na2CO3 0.1 M. Setelah itu diukur absorbansinya

menggunakan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 410 nm.

Absorbansi kontrol = Absorbansi pelarut DMSO

Absorbansi sampel =

% Inhibisi =

3.3.8 Pemurnian Senyawa

3.3.8.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan untuk memonitor hasil pemisahan

dengan kromatografi kolom. Visualisasi hasil KLT dilakukan dengan melihat

dibawah lampu UV pada λ 254 nm dan 365 nm. atau dapat juga dilakukan dengan

reagen penampak noda yaitu asam sulfat (H2SO4) yang kemudian dipanaskan, hal ini

dilakukan agar spot yang sudah digambarkan dapat terlihat jelas.

31

3.3.8.2 Kromatografi Kolom

Disiapkan kolom kromatografi yang bersih dimasukkan kedalam kolom. Fase

diam yang digunakan yaitu silika gel GF254 60 (170 – 230 mesh). Perbandingan

sampel dengan silika gel yaitu 1:50. Silika gel dibuat kolom dengan cara basah yaitu

silika gel yang telah ditimbang ditambahkan n-heksana hingga menjadi bubur lalu

dimasukkan kedalam kolom dan dimampatkan dengan vakum. Ekstrak kering

dimasukan kedalam kolom silika gel yang telah dimampatkan, kemudian dielusi

dengan campuran pelarut n-heksan:etil asetat (peningkatan kepolaran secara gradien)

dari 100:0 hingga 0:100. Hasil pemisahan ditampung dalam ditampung dalam botol

dan selanjutnya diuapkan pelarutnya dengan rotary evaporator, ekstrak kental

disimpan vial-vial yang sebelumnya telah ditimbang dalam keadaan kosong lalu

diberi nomor. Eluat ditampung dan diuji pola kromatogramnya dengan KLT, eluat

dengan pola yang sama digabung menjadi satu fraksi. Fraksi yang memiliki spot

dengan nilai Rf yang sama digabung dan ditimbang beratnya. Selanjutnya diuji

aktivitasnya terhadap enzim α-glukosidase.

3.3.9 Penentuan Struktur Senyawa Murni

Senyawa aktif yang diperoleh diuji kemurniannya berdasarkan KLT.

sedangkan strukturnya ditentukan berdasarkan pengukuran menggunakan

spektrometer UV-Vis, FTIR, LCMS dan LCMS/MS.

3.3.9.1 Spektrofotometri UV-Vis

Senyawa isolat yang diperoleh dilarutkan dalam etil asetat dan kemudian

diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Agilent Cary 60) untuk

mengetahui serapan panjang gelombang maksimum dari gugus kromofor isolat pada

32

panjang gelombang () 200-400 nm.

3.3.9.2 Spektrofotometri FTIR (Ariyanti et al., 2013)

Sebanyak 1 mg fraksi yang memiliki aktifitas teraktif dicampur dengan 100

mg serbuk KBr sampai homogen dengan lumpang agate atau “vibrating ball mill”

hingga homogen. Setelah itu dimasukkan ke dalam spektrofotometer IR Shimadzu

PRESTIGE 21 dan dianalisis pada bilangan gelombang 400 – 4000 cm-1

.

3.3.9.3 Spektrofotometri LCMS

Bobot molekul dan kemurnian diidentifikasi dengan spektroskopi LCMS

Mariner menggunakan kolom C8 dengan pelarut metanol. Sebanyak 0,5 µl sampel

diinjeksikan dengan laju alir sebesar 0,2 ml/min.

3.3.9.4 Spektrofotometri LCMS/MS

Bobot molekul diidentifikasi fragmentasinya dengan spektrofotometer LCMS-

MS (Xevo G2-XS QTOF Waters) menggunakan kolom UPLC C8 ukuran partikel

1,8 µm dengan diameter kolom 2,1 mm dan panjang kolom 150 mm. Laju alir sebesar

0,2 ml/min dan digunakan energi rendah 4 volt sedangkan energi tinggi 25 sampai 70

volt. Fasa geraknya adalah gradient asetonitril:akuades dengan perbandingan 5:95

hingga 95:5. Hasil pengukuran kemudian diinterpretasikan dengan software

masslynk.

33

3.4 Diagram alir penelitian

Regenerasi

Inokulasi 3 buah cokbor,

Fermentasi 10 hari, dan

Saring

Ekstraksi dan partisi Maserasi (1x 24 jam),

cair-cair dengan etil asetat dengan etil asetat

dan saring,

Evaporasi

Evaporasi

KLT dan

Kromatografi Kolom

Uji penghambatan

α-glukosidase

F2 F1 Fn

Fraksi Aktif

Karakterisasi Senyawa dengan

UV-Vis, FTIR, LCMS dan

LCMS/MS

Uji penghambatan α-glukosidase

Ekstrak Filtrat Ekstrak Miselium

Isolat kapang endofit spons

(Isolat SF1)

Fraksi

Air

Fraksi Etil

Asetat

Uji penghambatan

α-glukosidase

Fraksi Air Fraksi Etil Asetat

34

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Peremajaan dan Fermentasi

Kapang endofit Colletotrichum sp. yang telah dilakukan peremajaan

kemudian difermentasi dalam PDB (Potato Dextrose Broth). Pada penelitian ini,

fermentasi dilakukan selama 10 hari karena pada umumnya metabolit sekunder akan

diproduksi oleh kapang pada saat fase stasioner setelah hari ke-7, hal yang sama juga

terjadi pada produksi metabolit aktif inhibitor α-glukosidase dari kapang A. terreus

(Dewi et al., 2006).

Gambar 7. Inokulasi cokbor pada fermentasi hari ke-0 (A) dan fermentasi setelah 10

hari (B) (dokumentasi pribadi)

Gambar di atas menunjukkan adanya pertumbuhan kapang pada hari ke-0 (A)

yaitu pada saat diinokulasikan 3 buah cokbor yang menunjukkan belum adanya

pertumbuhan kapang pada media, sedangkan setelah fermentasi 10 hari (B) kapang

yang di inokulasikan telah tumbuh pada medium PDB dengan adanya pertumbuhan

miselium pada permukaan medium. Hal ini sesuai dengan Kirana (2011), apabila

kapang ditumbuhkan pada medium padat, kontak antara kapang dengan nutrien hanya

terjadi pada permukaan medium, sehingga penyerapan nutrien oleh kapang menjadi

35

terbatas. Sebaliknya, jika dilakukan fermentasi pada medium cair, kontak antara

kapang dengan nutrien terjadi lebih optimal karena seluruh bagian dari kapang berada

di dalam medium tersebut. Penyerapan nutrien yang lebih banyak akan membuat

kapang lebih banyak menghasilkan metabolit sekunder yang dikeluarkan secara

ekstraselular. Oleh karena itu, fermentasi dengan medium cair diperkirakan akan

menghasilkan lebih banyak metabolit sekunder dibandingkan dengan medium padat.

Pada penelitian ini digunakan media cair PDB untuk proses fermentasi agar

didapatkan senyawa metabolit sekunder yang lebih banyak. Penggunaan media PDB

lebih diutamakan agar mempermudah adaptasi kultur yang diperoleh dalam media

PDA sehingga diperoleh kesamaan dalam menumbuhkan kultur isolat kapang

Colletotrichum sp. Sedangkan penggunaan metode statis dipilih karena menurut

Shahriarinour et al. (2011), terdapat pengaruh mekanis dari penggunaan shaker

incubator memperlihatkan efek penurunan aktivitas daripada kondisi statis. Senyawa

dapat berubah menjadi bentuk yang tidak memiliki aktivitas penghambatan

α-glukosidase ataupun antioksidan.

4.2 Ekstraksi

Pelarut etil asetat digunakan karena sifatnya yang semi polar dapat

mengekstrak senyawa yang bersifat non polar hingga semi polar lebih banyak

senyawa dibandingkan pelarut n-heksan dan metanol. Etil asetat mempunyai titik

didih relatif rendah hingga mudah diuapkan dengan bantuan vakum, lebih rendah

toksisitasnya dibandingkan pelarut semi polar lainnya seperti kloroform. Selain itu,

etil asetat tidak bercampur dengan media kultur sehingga mudah dipisahkan dengan

media kultur (Nursid, 2010). Senyawa aktif dan struktur-struktur yang telah

36

dilaporkan umumnya merupakan senyawa semipolar sehingga etil asetat sangat cocok

digunakan. Data hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 3 dan lampiran 1.

Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antidiabetes ekstrak kapang Colletotrichum sp.

Sampel Bobot

sampel (mg)

Inhibisi pada konsentrasi (µg/ml)

IC50 10

µg/ml

25

µg/ml

50

µg/ml

100

µg/ml

Filtrat 728 29.05 37.60 52.558 78.46 46.88

Miselium 590,4 11.58 22.5 44.438 82.03 58.83

Berdasarkan data tabel 3 hasil uji aktivitas penghambatan α-glukosidase, hasil

IC50 menunjukkan bahwa ekstrak filtrat dan ekstrak miselium memiliki aktivitas yang

tidak jauh berbeda. Hal ini dikarenakan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan

terjadi secara intraselular dan ekstraselular. Akan tetapi bobot sampel ekstrak yang

diperoleh dari filtrat lebih banyak, dan nilai IC50 menunjukkan bahwa ekstrak filtrat

memiliki nilai konsentrasi yang lebih rendah bila dibandingkan dengan ekstrak

miselium. Nilai IC50 yang lebih rendah menunjukkan semakin aktifnya senyawa

tersebut dalam menghambat enzim α-glukosidase. Ekstrak filtrat dimurnikan dengan

kolom kromatografi untuk mendapatkan senyawa aktif penghambat α-glukosidase.

Penelitian sebelumnya telah melaporkan ekstrak filtrat kapang endofit

Colletotrichum sp. dari tanaman kunyit (Curcuma longa L.) menunjukkan nilai

inhibisi 78,81% pada aktivitas antioksidan (Widowati et al., 2016). Telah dilaporkan

juga kandungan utama dari ekstrak miselium berupa minyak karena umumnya berupa

senyawa asam lemak dan derivatnya (FAME) yang telah dilaporkan aktif sebagai

penghambat α-glukosidase (Artanti, 2012). Menurut Artanti (2012), sebagian besar

asam lemak hadir dalam bentuk asam bebas yaitu metal ester asam palmitat, metal

37

ester asam stearat, metal ester asam oleat, metal ester asam linoleat, dan metal ester

asam linolenat dalam ekstrak metanol dari miselium Colletotrichum sp. dari tanaman

cemara Sumatera (Taxus Sumantrana).

4.3 Pemisahan ekstrak filtrat dengan kromatografi kolom

Pada pembuatan kolom, ekstrak yang digunakan sebanyak 728 mg dan dari

hasil kromatografi kolom terkumpul 27 fraksi. Hasil fraksi dari kromatografi kolom

dianalisa secara kromatografi lapis tipis untuk melihat kromatogramnya. Fraksi-fraksi

yang memiliki pola kromatogram yang sama digabung kemudian pelarutnya

diuapkan sehingga diperoleh 15 fraksi, berdasarkan pola bercak atau spot

kromatogram dari KLT seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8.

Gambar 8. Hasil KLT fraksi-fraksi kromatografi kolom dengan pelarut (A)

aseton:kloroform (1:1) dan (B) pelarut aseton-kloroform (1:2) dibawah

sinar UV

Hasil analisis KLT pada gambar 8 menunjukkan pemisahan dari 15 fraksi

dengan perbedaan perbandingan pelarut. Pelarut aseton-kloroform 1:2 (B)

menunjukkan adanya pemisahan yang lebih tinggi. Namun hasil analisis KLT dari

fraksi 2, 3, 5 dan 6 (gambar 9) tidak menunjukkan adanya pemisahan noda

menggunakan eluen CHCl3 : aseton (1:1) dan CHCl3 : aseton (1:2) karena senyawa

38

yang terkandung dalam spot tersebut merupakan senyawa non-polar sehingga

digunakan eluen n-heksan:etil asetat (9:1) agar dapat terlihat pemisahan noda yang

lebih baik.

Gambar 9. Hasil TLC fraksi 2,3,5, dan 6 dengan eluen n-heksan:etil asetat (9:1)

Fraksi-fraksi hasil pemisahan kromatografi kolom tersebut diuji aktivitas

penghambatan enzim α-glukosidase. Data hasil pengujian aktivitas penghambatan

enzim α-glukosidase dapat dilihat pada Tabel 4 dan lampiran 2.

Tabel 4. Hasil uji aktifitas penghambatan enzim α-glukosidase setiap fraksi

Keterangan: * Pengukuran dilakukan pada konsentrasi 100 µg/ml

- tidak menunjukkan aktivitas penghambatan

Sampel Bobot sampel (mg) % Inhibisi*

Fraksi 2 6.4 13.08

Fraksi 3 10.6 15.53

Fraksi 5 4 17.78

Fraksi 6 8.5 10.00

Fraksi 7 20.4 9.57

Fraksi 8 9.8 5.67

Fraksi 10 35 -

Fraksi 11 14.8 -

Fraksi 12 45.6 10.23

Fraksi 14 37.5 -

Fraksi 16 24.7 -

Fraksi 20 31.8 7.81

Fraksi 24 17.4 7.83

Fraksi 25 47.8 22.20

Fraksi 27 46.4 4.91

39

Hasil pengujian pada tabel 4 menunjukkan daya inhibisi fraksi dari ekstrak

kapang Colletotrichum sp. terhadap enzim α-glukosidase menghasilkan nilai inhibisi

yang berbeda-beda. Perbedaan ini terjadi karena adanya perbedaan distribusi

metabolit sekunder yang dapat menghambat aktivitas α-glukosidase (Purwatresna,

2012). Berdasarkan hasil pengukuran pada tabel 4, fraksi 25 memiliki bobot ekstrak

dan nilai inhibisi tertinggi tetapi noda spot yang ditunjukkan fraksi ke-25 terlalu

banyak dan sangat rapat. Fraksi 3 dan fraksi 5 memiliki nilai inhibisi yang cukup

tinggi tetapi noda KLT yang dihasilkan masih banyak serta bobot fraksi yang

dihasilkan sangat sedikit sehingga masih sulit dilakukan pemisahan lebih lanjut. Pada

fraksi 12 memiliki bobot sampel yang cukup untuk dilakukan pemisahan lebih lanjut,

tetapi hasil pemisahan masih belum mendapatkan senyawa murni.

Hasil KLT yang dilakukan pada semua fraksi, terdapat satu fraksi yang

memiliki 1 spot yaitu fraksi 2 dengan Rf 0,62 (Gambar 10 dan lampiran 3)

menggunakan pelarut n-heksan:etil asetat (9:1) yang langsung didapatkan dari kolom

kromatografi.

Gambar 10. Hasil KLT isolat fraksi 2 dengan eluen n-heksan : etil asetat (9:1)

40

Fraksi 2 berbentuk seperti kristal berwarna merah muda (Lampiran 8) yang

dihasilkan langsung dari kolom kromatografi dengan pelarut n-heksan:etil asetat (9:1)

dan fraksi inilah yang selanjutnya dilakukan identifikasi senyawa dengan

menggunakan spektroskopi UV-Vis, FTIR, LCMS, dan LCMS-MS.

4.4 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

4.4.1 Analisis data UV-Vis

Fraksi 2 yang aktif sebagai penghambatan enzim α-glukosidase, selanjutnya

dianalisa dengan spektrofotometer UV-Vis. Fraksi tersebut dilarutkan dalam metanol

dan diatur panjang gelombang 200-400 nm. Pengamatan data hasil UV-Vis dapat

dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. Spektrum UV-Vis isolat fraksi 2

Spektrum pada puncak pertama ada pada 230 nm dengan absorbansi 2,36 dan

puncak kedua ada pada 205 nm dengan absorbansi 1,5. Pita serapan yang muncul

pada panjang gelombang 230 nm pada gambar diatas disebabkan adanya transisi

41

ππ* yang menunjukkan adanya ikatan rangkap terkonjugasi pada isolat fraksi 6,

transisi ini mencirikan adanya hidrokarbon aromatik (Khopkar, 2008). Pita serapan

dari hidrokarbon aromatik berkisar pada panjang gelombang 215 nm tetapi semakin

banyak konjugasi pada cincin aromatik maka pita serapan akan bergeser ke panjang

gelombang yang lebih panjang. Sedangkan puncak pada 205 nm disebabkan adanya

transisi nσ* yang menunjukkan adanya metanol (Khopkar, 2008). Hasil analisis

UV-Vis metanol dapat dilihat pada lampiran 4.

4.4.2 Analisis Data FTIR

Fraksi 2 juga dianalisa gugus fungsinya dengan spektrofotometer FTIR. Hasil

analisis spektroskopi FTIR isolat fraksi 2 menunjukkan adanya serapan dari beberapa

gugus fungsi. Berikut merupakan data hasil analisis spektrofotometer FTIR dapat

dilihat pada Gambar 12 dan lampiran 5.

Gambar 12. Spektrum FTIR isolat fraksi 2

42

Berdasarkan spektrum FTIR pada fraksi 2 terdapat beberapa puncak pada

panjang gelombang. Hasil identifikasi gugus fungsi isolat fraksi 2 dibandingkan

dengan referensi dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Hasil analisis FTIR pada isolat fraksi 2

No Isolat Fraksi 2

Bilangan Gelombang (cm-1

)

Gugus Fungsi Supratman

(2010)

Sastrohamidjojo

(2013)

1. 1735,93 1705 – 1725 1705 – 1725 C=O ester

2. 1598,99 1500 – 1600 1475 – 1600 C=C Aromatik

3. 1402,25;1456,26 1340 – 1400 1375 – 1450 –CH3

4. 1026,13; 1089,78 1080 – 1300 1000 – 1300 C–O ester

5. 2956,87; 2918,30 2850 – 2950 2850 – 3000 C–H Alifatik

Pada panjang gelombang 1735,93 cm-1

terdapat serapan gugus C=O ester,

dugaan ini didukung dengan adanya gugus C–O pada panjang gelombang 1026,13

cm-1

dan 1089,78 cm-1

. Selanjutnya terdapat gugus C=C aromatik pada serapan

1589,99 cm-1

. Panjang gelombang 2956,87 cm-1

dan 2918,30 cm-1

merupakan serapan

gugus CH alifatik yang ada pada rentang 2850-3000 cm-1

(Sastrohmidjojo, 2013),

dan pada panjang gelombang 1402,25 cm-1

dan 1456,26 cm-1

menunjukkan adanya

gugus fungsi –CH3 . Berdasarkan hasil spektrum FTIR maka senyawa isolat fraksi 2

mengandung gugus aromatik dan gugus karboksil ester.

4.4.3 Analisis data LCMS

Analisa menggunakan LCMS digunakan untuk mengetahui puncak area, berat

molekul serta kemungkinan struktur senyawa yang terdapat pada ekstrak filtrat

kapang endofit. Hasil identifikasi menggunakan LCMS, fraksi 2 menghasilkan 1

puncak dengan waktu retensi 11,7 (Gambar 13) . Satu puncak tersebut sangat

dominan dengan intensitas 100%, sedangkan yang lainnya diperkirakan merupakan

43

pengotor yang memiliki intensitas masing-masing kurang dari 20%. Pengotor tersebut

diduga disebabkan tempat penyimpanan yang tidak bersih sehingga ikut tercampur

kedalam isolat tersebut atau kemungkinan lain yaitu isolat kapang Colletotrichum sp.

belum murni.

0 4 8 12 16 20

Retention Time (Min)

101.1

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

BPI=>NR(2.00)

T11.7

Gambar 13. Spektrum LC isolat fraksi 2

Hasil spektrum LC dari isolat fraksi 2 pada gambar menghasilkan puncak ion

molekul pada [M+H]+

m/z = 391,64. Berdasarkan data tersebut menunjukkan bahwa

isolat fraksi 2 memiliki berat molekul [M] m/z= 390,64. Adapun spektrum MS isolat

fraksi 2 dapat dilihat pada Gambar 14 dan lampiran 6.

99.0 319.2 539.4 759.6 979.8 1200.0

Mass (m/z)

0

95.8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

Mariner Spec /302:306 (T /11.60:11.75) -285:292 (T -11.60:11.75) ASC=>NR(4.00)[BP = 391.6, 96]

391.64

413.67

804.37

385.17 800.18

Gambar 14. Kromatogram MS isolat fraksi 2

Hasil spektrum MS menunjukkan pada isolat fraksi 2 memiliki beberapa

ion/fragmen. Adapun hasil analisis dari spektrum massa dapat dilihat pada tabel 6.

44

Tabel 6. Hasil analisis spektrum massa isolat fraksi 2

Ion/Fragmen m/z

[M+H]+ 391,64

[M+Na]+ 413,67

[2M+H+Na]+ 804,37

Pengolahan data pada LCMS digunakan database massbank secara online.

Berdasarkan analisa dengan database massbank dan masslynk diduga senyawa yang

didapat merupakan senyawa bis(2-ethylhexyl)phthalate atau biasa dikenal dengan

di(2-ethylhexyl)phthalate (7) dengan massa molekul [M+H]+ 391,64 m/z.

Gambar 15. Senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate (7)

4.4.4 Analisis data LCMS/MS

Gambar 16. Spektrum LCMS/MS isolat fraksi 2

Dari hasil spektrum (Gambar 16) menunjukkan adanya ion molekul [M+H]+

391,28 dan ion molekul [M+Na]+

413,26 yang menandakan bahwa berat molekul

senyawa isolat fraksi 2 adalah m/z 390 sesuai dengan rumus molekul C24H38O4 yang

45

dicocokkan menggunakan chemspider dan massbank yaitu senyawa di(2-

ethylhexyl)phthalate (7). Hasil ini diperkuat dengan pola fragmentasi yang di

sinkronisasi dengan MS yang ditunjukkan pada Gambar 17 dan lampiran 7.

Gambar 17. Fragmentasi senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate pada library UNIFI

Berdasarkan hasil spektrum LCMS/MS isolat fraksi 2 yang disesuaikan

dengan library MS, terdapat puncak-puncak fragmentasi yaitu pada m/z 149,022 ;

279,157 dan 391,28 yang muncul karena adanya pemecahan pada tiap ikatan C-C

pada ikatan struktur senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate (7). Hasil pemecahan ini

memperkuat bukti bahwa senyawa hasil isolasi yang didapatkan adalah DEHP.

Gambar 18. Pemecahan ikatan pada senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate

46

Identifikasi dilakukan berdasarkan spektrum massa yang terekam pada waktu

retensi tertentu dan dengan fragmentasi molekulnya yang disesuaikan dengan library

pada LCMS-MS serta dicocokkan dengan chemspider dan massbank . Hal ini berarti

membuktikan bahwa data hasil LCMS dan LCMS/MS memiliki kemiripan yang

sesuai dengan berat molekul yang sama yaitu [M+H]+ 391 m/z yang menunjukkan

adanya senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate (7). Perbedaan dari LCMS dan LCMS/MS

yaitu pada LCMS hanya menunjukkan peak dari senyawa yang dominan sedangkan

pada LCMS/MS terdapatnya pola fragmentasi yang muncul pada analisis.

4.5 Uji Aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase

Hasil pengujian penghambatan enzim α-glukosidase ditunjukkan dengan nilai

IC50. Nilai tersebut menunjukkan kemampuan suatu senyawa dalam menghambat

setengah atau lebih enzim α-glukosidase. Pada penelitian ini, kuersetin digunakan

sebagai larutan standar karena menurut penelitian Jo S-H (2009) yang menjelaskan

bahwa kuersetin memiliki kemampuan menghambat enzim α-glukosidase dengan

hasil yang signifikan dalam menghambat α-glukosidase dibandingkan dengan

akarbose yang selama ini dijadikan sebagai obat antidiabetes. Alasan lain penggunaan

kuersetin sebagai larutan standar, yaitu dikarenakan enzim yang digunakan berasal

dari Saccharomyces cerevisiae, sehingga jika menggunakan akarbose sebaga

pembanding maka hasilnya kurang sensitive dalam menghambat enzim

α-glukosidase, hal ini dikarenakan akarbose lebih aktif dalam menghambat enzim

α-glukosidase yang berasal dari mamalia bukan α-glukosidase yang berasal dari

bakteri atau ragi (Shinde et al., 2008). Febriyanti (2012) mampu membandingkan

47

aktivitas α-glukosidase dari kuersetin dan akarbose dengan nilai IC50 berturut-turut

sebesar 3,47 µg/ml dan 129,75 µg/ml.

Mekanisme kerja inhibisi dari ekstrak media kultur dan miselium kapang

terhadap enzim α-glukosidase yang berperan sebagai penghambat belum diketahui

secara pasti. Apabila ingin mengetahui mekanisme inhibisi dari suatu inhibitor maka

perlu dilakukan pemetaan kebalikan ganda data kecepatan enzim. Liu et al,. (2006)

menyatakan bahwa mekanisme inhibitor terhadap kerja enzim α-glukosidase yaitu

dengan mengikat enzim tersebut secara reversible kompetitif. Jenis inhibisi

kompetitif bersifat kompetisi antara substrat dengan inhibitor. Inhibitor dengan

struktur yang mirip dengan substrat normal berkompetisi dengan substrat normal

untuk berikatan pada sisi aktif dari enzim.

4.6 Senyawa DEHP

Phthalate, atau ester ftalat, adalah ester dari asam ftalat dan terutama

digunakan sebagai plasticizer (zat yang ditambahkan ke plastik untuk meningkatkan

fleksibilitas plastik, transparansi, daya tahan, dan umur panjang). Pthalat yang

pertama di produksi pada tahun 1920, dan telah diproduksi dalam jumlah besar sejak

tahun 1950-an, ketika PVC telah diperkenalkan.

DEHP telah diisolasi dari organisme darat dan laut termasuk tumbuhan,

ganggang laut dan filrat jamur dan bakteri. Namun, sulit untuk menentukan apakah

DEHP diproduksi oleh organisme ini, sampel tersebut terkontaminasi selama proses

pemisahan, atau DEHP terakumulasi dalam organisme, karena DEHP telah digunakan

secara melimpah pada ester phtalat petrokimia. Hal ini lah yang mendorong

48

penelitian Namikoshi et al. (2006) yang meneliti kandungan Dibutil phtalat (DBP)

dan DEHP terhadap 3 jenis alga yaitu U. pinnatifida, L. japonica dan Ulva sp. Hasil

penelitian tersebut menunjukkan bahwa DEHP disintesis secara alami dan bukan

berasal dari industri. Kemungkinan, ester phtalat disimpan dalam membran sel dan

ditemukan turun menurun terhadap keturunan dari mikroorganisme biota laut

(Namikoshi et al., 2006).

Penelitian sebelumnya melaporkan dibutil phtalat dan di-(2-etilheksil) phtalat

menunjukkan adanya inhibisi cathepsin B dengan nilai IC50 sebesar 0.42 and

0.38 mM (Hoang, 2008). Menurut Osama et al. (2015) bahwa senyawa di-2-

ethylhexyl-phthalate yang berhasil diisolasi dari Penicillium janthinellum mempunyai

aktifitas antioksidan pada konsentrasi maksimum 12 μg/ml adalah 77,99%, antitumor

pada konsentrasi maksimum 12 μg/ml adalah 77,29%, antivirus melawan H1N1 pada

konsentrasi yang berbeda dan sitotoksisitas terhadap sel karsinoma (MCF-7) dan sel

basal epitel manusia alveolar (A-549). Dibutil pthalat juga juga pernah diisolasi dari

Streptomyces melanosporofaciens yang dapat digunakan sebagai inhibitor

glukosidase dengan nilai IC50 sebesar 90 μg/ml (Namikoshi, 2006). DEHP juga telah

dilaporkan sebagai senyawa bioaktif dari organisme darat dan laut termasuk

Streptomyces bangladeshiensis, Pseudomonas sp. ganggang laut, dan jamur (Osama,

2015).

Umumnya jenis metabolit sekunder yang dihasilkan mikroba dimanfaatkan

oleh invertebrata laut untuk melawan serangan mahluk hidup lain. Berdasarkan hal di

atas diperoleh suatu konsep baru yang menyatakan bahwa simbiosis yang

menghasilkan metabolit sekunder dapat dipicu karena adanya halangan lingkungan

49

biotik. Metabolit sekunder dihasilkan untuk melengkapi perlindungan melawan

serangan mikroba atau eukariot (perlindungan langsung pertama), contoh senyawa

asetilenat. Selain itu, spons dapat juga menghasilkan metabolit sekunder berupa

protein yang dapat menahan pertumbuhan bakteri (perlindungan dengan sistem

imun), contohnya adalah perforin dan tachylectin (Nofiani, 2008). Secara fungsional,

senyawa ini beraksi sebagai molekul pertahanan. Akibat adanya interaksi metabolit

sekunder yang dihasilkan dengan bakteri yang berasosiasi dengan spons

menyebabkan kemungkinan bakteri terinduksi untuk menghasilkan suatu metabolit

sekunder. Metabolit sekunder yang dihasilkan memiliki bermacam-macam fungsi,

misalnya berfungsi dalam sistem pertahanan sekaligus pengaktivasi jalur penting

untuk pertahanan diri (activator metabolite). Dalam penelitian ini senyawa metabolit

sekunder yang dihasilkan yaitu di(2-ethylhexyl)phthalate. Senyawa yang sama telah

diisolasi dari tanaman lidah buaya dan ditemukan memiliki efek antileukemia dan

antimutagenik, sehingga menawarkan plastik ramah lingkungan untuk digunakan di

masa depan (Osama et al., 2015).

50

BAB V

PENUTUP

5.1 SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:

1. Ekstrak filtrat kapang endofit Colletotrichum sp. memiliki aktivitas

penghambatan enzim α-glukosidase dengan nilai inhibisi 78.46% pada 100

μg/ml dan hasil pemisahan fraksi yang memiliki aktivitas serta bobot sampel

yang cukup untuk identifikasi lebih lanjut yaitu fraksi 2 dengan nilai inhibisi

13,08% pada 100 μg/ml.

2. Fraksi 2 ekstrak filtrat kapang endofit Colletotrichum sp. diduga

mengandung senyawa di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP).

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang optimasi produksi senyawa

aktif penghambat α-glukosidase serta permurnian ekstrak dengan pelarut metanol

atau n-heksan dari isolat kapang endofit Colletotrichum sp.

51

DAFTAR PUSTAKA

Abubakar, H., Wahyudi, A.T., Yuhana, M. 2011. Skrining Bakteri yang Berasosiasi

dengan Spons Jaspis sp. Sebagai Penghasil Senyawa Antimikroba. Ilmu

Kelautan. Vol 16: 35-40.

Ariyanti, Dyah A, Khairul A, Dewi K. 2013. Identifikasi senyawa flavonoid dari

daun ketapang kencana (Terminalia muelleri) dan uji aktifitas antibakteri. Chem

info. Vol 1: 94-100.

Artanti, N., Tachibana, S., L.B.S. Kardono., dan H. Sukiman . 2012. Isolation of α-

glucosidase Inhibitors Produced by an Endophytic Fungus, Colletotrichum sp.

TSC13 from Taxus sumatrana. Pakistan Journal of Biological Science. Vol 15:

673-679.

Bösenberg, LH. 2008. The Mechanism of Action of Oral Antidiabetic Drugs: A

Review of Recent Literature. The Journal of Endocrinology, Metabolism and

Diabetes of South Africa. Vol 13: 80-88.

Dewi, R.T. 2006. Isolasi dan karakterisasi senyawa aktif inhibitor glukosidase dari

ekstrak etil asetat koji Aspergillus terreus. [Tesis]. Bandung: Institut Teknologi

Bandung.

Dewi, R.T., Artanti, N., Mulyani, H., Dewi, P., dan Minarti. 2011. Production of

Lovastatin and Sulochrin by Aspergillus terreus Using Solid State Fermentation.

Makara, Teknologi. Vol 15: 1 – 4.

Dewi, R.T., Tachibana, S., Dewi, P., Kardono, L.B.S., dan Ilyas, M. 2014. Isolation

Of Bioactive Compounds From Aspergillus terreus LS07. Indonesian Journal of

Chemistry. Vol 14: 304 – 310.

Dewi, R.T., Iskandar, Y.M., Hanafi, M., Kardono, L.B.S., Angelina, M., Dewijanti,

I.D., Banjarnahor, S. D.S. 2007. Inhibitory effect of Koji Aspergillus terreus on

α-glucosidase activity and postprandial hyperglycemia. Pakistan Journal of

Biological Science. Vol 18: 3131-3135.

Febriyanti. 2012. Uji Aktivitas Antidiabetes dengan Penghambatan Enzim Alfa-

Glukosidase dari Kulit Batang Kayu Tuah (Antidesma celebicum Miq.) dan

Identifikasi Golongan Senyawa Kimia dari Fraksi Teraktif. [Skripsi]. Depok (ID):

FMIPA UI.

Gandjar, I., dan Rohman, A. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta (ID): Pustaka

Pelajar.

52

Ginting, E. L., Waruow, V., Suleman, R.W. 2010. Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak

Kasar Bakteri yang Berasosiasi dengan Sponge Acanthostrongylophora sp. Jurnal

Perikanan dan Kelautan Tropis. Vol 6: 160-163

Hermanto, S. 2009. Buku Ajar Kimia Analisa Instrumen: Dasar-Dasar Analisa

Spektroskopi dan Kromatografi. Jakarta (ID): UIN Syarif Hidayatullah.

Hoang, VLT., Li, Yong., Kim, Se-Wong. 2008. Cathepsin B inhibitory activities of

phthalates isolated from a marine Pseudomonas strain. Bioorganic and Medici-

nal Chemistry Letters. Vol 18: 2083-2088.

Ibrahim, S., Sitorus, M. 2013. Teknik Laboraturium Kimia Organik. Edisi Pertama.

Yogyakarta (ID) : Graha Ilmu.

International Dabetes Federation. 2015. IDF Diabetes Atlas, 7th Ed. Brussels:

International Diabetes Federation. http://www.diabetesatlas.org/. diakses pada 24

Februari 2018.

Jo SH, Ka EH, Lee HS, Jang HD, Kwon YI. 2009. Comparison of Antioxidant

Potential and Rat Intestinal α-Glukosidase Inhibitory Activities of Quercetin,

Rutin, and Isoquercetin. IJARNP. Vol 2: 52-60.

Ketut, S.S. 2016. Isolasi Dan Identifikasi Jamur Colletotrichum Spp. Isolat Pcs

Penyebab Penyakit Antraknosa Pada Buah Cabai Besar (Capsicum annuum L.) Di

Bali. Jurnal Metamorfosa. Vol 3: 23-30.

Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta (ID): Universitas

Indonesia Press.

Kristanti, A.N., N.S. Aminah, M. Tanjung, dan Kurniadi, B. 2008. Buku Ajar

Fitokimia. Surabaya (ID): Universitas Airlangga Press.

Listiandiani, Kirana. 2011. Identifikasi Kapang Endofit ES1, ES2, ES3 dan ES4 dari

Broussonetia papyrifera Vent. dan Pengujian Aktivitas Antimikroba. [Skripsi].

Depok (ID): Departemen Biologi Fakultas MIPA UI.

Liu Y, Zou L, Lin M, Wen-Hua Chen, Bo Wang. 2006. Synthesis and

pharmacological activities of xanthone derivatives as alpha-glucosidase

inhibitors. Bioorganics and Medical Chemistry. Vol 14: 5683-5690.

Lutter P, Perroud MCS, Gimenez EC, Meyer L, Goldmann T, Bertholet MC, Mottier

P, Desmarchelier A, Florence M, Perrin C, Robert F, Delatour T. 2011. Screening

and confirmatory methods for the determination of melamine in cow’s milk and

milk-based powdered infant formula: validation and proficiency-test of ELISA,

HPLC-UV, GC-MS and LC-MS/MS. Food Control. Vol 22:903-913.

53

Maehara, S., Simanjuntak, P., Kitamura, C., Ohashi, K., Shibuya, H. 2011. Cinchona

Alkaloids are Also Produced by an Endophytic Filamentous Fungus Living in

Cinchona Plant. Chem Pharm Bull. Vol 59: 1073-1074.

Mahasuk P, Khumpeng N, Wasee S, Taylor PWJ, Mongkolporn O. 2008. Inheritance

of resistance to anthracnose (Colletotrichum capsici) at seedling and fruiting

stages in chili pepper (Capsicum spp.). Plant Breeding. Vol 128: 701-706.

Maryani, F. Mulyani, H., Artanti, N., Zalinar L.U., Dewi, R.T., Hanafi, M.,

Murniasih, T. 2017. Effects of culture medium compositions on antidiabetic

activity and anticancer activity of marine endophytic bacteria isolated from

sponge. AIP Conference Proceedings. Jakarta (ID): LIPI.

Najib, A. 2010. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Inhibitor α-Glukosidase dari

Fraksi N-Butanol Rimpang Acorus calamus L. [Tesis]. Depok (ID): FMIPA UI.

Namikoshi, M. Takeshi, F. Teruaki, Kazuyo, U. 2006. Natural Abundance 14C

content of Dibutyl Phthalate (DBP) from Three Marine Algae. Marine Drugs. Vol

4: 290-297.

Neldawati, R dan Gusnedi. 2013. Analisis Nilai Absorbansi dalam Penentuan Kadar

Flavonoid untuk Berbagai Jenis Daun Tanaman Obat. Journal Pillar of Physics.

Vol 2: 76 –83.

Nofiani, R. 2008. Urgensi dan Mekanisme Biosintesis Metabolit Sekunder Mikroba

Laut. Jurnal Natur Indonesia. Vol 10: 120-125.

Nursid, M., Pratitis, A. Chasanah, E. 2010. Kultivasi kapang MFW-01-08 yang

diisolasi dari ascidia Aplidium longithorax dan uji aktivitas sitotoksiknya

terhadap Sel kanker payudara T47D. Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi

Kelautan dan Perikanan. Vol 5: 103-110.

Osama, H.,El-Sayed, Mohsen, M. S., Asker, Seham, M., Shash, Shimaa, R., Hamed.

2015. Isolation, Structure elucidation and Biological Activity of Di-(2-ethylhexyl)

phthalate Produced by Penicillium janthinellum 62. International Journal of

ChemTech Research CODEN (USA). Vol 8: 58-66,

Pawle, G. & Singh, S. K. (2014). Antioxidant Potential of Endophytic Fungus

Colletotrichum spesies isolated from Polygala elongata. International Journal of

Pharma and Bio Sciences. Vol 5: 313-319.

Pratiwi, B.E. 2015. Isolasi Dan Skrining Fitokimia Bakteri Endofit Dari Daun

Rambutan (Nephelium Lappaceum L.) Yang Berpotensi Sebagai Antibakteri.

[Skripsi]. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah.

Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta (ID): Erlangga.

54

Prihatiningtias, W dan Sri, M. 2011. Prospek Mikroba Endofit Sebagai Sumber

Senyawa Bioaktif. Journal of Traditional Medicine. Yogyakarta (ID): Farmasi

UGM .

Purwatresna, E. 2012. Aktivitas Antidiabetes Ekstrak Air dan Etanol Daun Sirsak

secara In Vitro Melalui Inhibisi Enzim α-Glukosidase. [Skripsi]. Bogor (ID):

Institut Pertanian Bogor

Ramiro, Q.L., Rolando M.C., Ricardo, G.F., Hartmut, L., María, J.V., Humberto,

H.M., Patricia. T.G., Reyes, T.G. and Cristina. R.P. 2012. Bioassay-Guided

Isolation and Identification of Cytotoxic Compounds from Gymnosperma

glutinosum Leaves. Molecules Journal. Vol 17: 11229-11241

Rodriguez, R. & Redman, R. 2008. More than 400 million years of evolution and

some plant still can’t make it on their own: plant stress tolerance via fungal

symbiosis. Journal of Experiment Botany. Vol 59, 1109-1114.

Rollando. 2016. Aktivitas Sitotoksik Ekstrak Dan Fraksi Hasil Fermentasi Fungi

Endofit Genus Cephalosporium sp. Diisolasi Dari Daun Meniran (Phyllantus

niruri Linn.). Jurnal Wiyata. Vol. 3: 5-10.

Sastrohamidjojo, H., 2013. Dasar – Dasar Spektrokopi. Yogyakarta (ID): Gadjah

Mada University Press.

Shahriarinour, M., Abdul Wahab, M.N., Mohamad, R., Mustafa, S., Ariff A.B., 2011.

Effect of medium composition and curtural condition on cellulose production by

Aspergillus terreus. Afr. J. Biotechnol. Vol 10: 7459-7467.

Shinde, J., Taldone, T., Barletta, M., Kunaparaju, N., Bo, H., and Kumar, S. 2008. α-

Glukosidase Inhibitory Activity of Syzygium cumini (Linn.) Skeels Seed Kernel in

Vitro and in Goto-Kazizaki (GK) Rats. Carbohydrate Research . Vol 343(7):

1278-1281.

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, J.F. and Crouch, S.R. 2013. Fundamental of

Analytical Chemistry. 9th Edition. Nelson Education, Ltd.

Sriveena T, Srividya A, Ajitha A. 2015. Time of flight mass spectrofotometry : review.

World Journal Of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. Vol 4: 614-625

Sudha, P. Zinjarde, S.S, Bhagava, S.Y, Kumar, A.R. 2011. Potent amylase inhibitory

activity of Indian ayurvedic medicinal plants. BMC Comp. Alt. Med. Vol 11:2-5.

Sugiwati, S., Setiasi, S., Afifah, E. 2009. Antihyperglycemic activity of the mahkota

dewa [Phaleria macrocarpa (scheff.) boerl.] leaf extracts as an alpha-glucosidase

inhibitor. Makara, Kesehatan. Vol 13: 74-78.

Sumilat, D.A. 2017. Aktivitas Spons Laut Lamellodysidea herbacea Dari Perairan

Malalayang, Manado. Jurnal LPPM Bidang Sains dan Teknologi. Vol 4: 1-7.

55

Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung (ID): Widya

Padjadjaran.

Tianpanich, K., Prachya, S., Wiyakrutta, S., Mahidol, C., Ruchirawat, S. &

Kittakoop, P. 2011. Radical Scavenging and Antioxidant Activities of

Isocoumarins and a Phthalide from the Endophytic Fungus Colletotrichum sp.

Journal of Natural Product. Vol 74: 79-81.

Turnipseed S, Casey C, Nochetto C, Heller DN. 2008. Determination of melamine

and cyanuric acid in infant formula using LC-MS/MS. FDA Lab Inform Bull.

LIB. 4421.

Ulbricht, C., and Seamon, E. 2010. Natural standard herbal pharmacotherapy: An

evidence- based approach. St. Louis: Mosby Elsevier.

Usman, H. 2014. Laporan Hibah Penulisan Buku Ajar: Kimia Organik Bahan Alam

Laut. Makassar (ID): Universitas Hasanuddin.

Widowati, T., Bustanussalam, Sukiman, H., Simanjuntak, P. 2016. Isolasi dan

Identifikasi Kapang Endofit dari Tanaman Kunyit (Curcuma longa L.) sebagai

penghasil antioksidan. Bogor (ID) : Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI.

Wulandari, L. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Jawa Timur (ID): PT Taman Kampus

Presindo Jember.

Yamazaki, H. Sumilat, D.A. Kanno, S. Ukai, K. Rotinsulu, H. Wewengkang, D.S.

Ishikawa, M. Mangindaan, R.E. Namikoshi, M. 2013. A polybromodiphenyl ether

from an Indonesian marine sponge Lamellodysidea herbacea and its chemical

derivatives inhibit protein tyrosine phosphatase 1B, an important target for

diabetes treatment. Journal of Natural Medicine. Vol 67: 730–735.

Yoice Srikandace and Desak Sri Gede Andayani. 2015. Preliminary Study of

Antibacterial Activity from Indonesia Marine-Derived Endophytic Fungi.

Advances in Environmental Biology. Vol 9: 143-149.

Yu-Chia, C., Shang-Wei, T., Li-Lian, T., Chou, Y., Yuan-Shing, H., Mei-Chin, L.

and Jui-Hsin, S. 2012. Cytotoxic Sesterpenoid from a Sponge Hippospongia sp.

Journal Marine Drugs. Vol 10: 987-997

Zhang, Y. Li, Y. Guo, Y.W. Jiang, H.L. Shen, X. 2009. A sesquiterpene quinone,

dysidine, from the sponge Dysidea villosa, activates the insulin pathway through

inhibition of PTPases. Acta Pharm. Sin. Vol 30: 333–345.

Zuccaro, A., C.L. Schoch, J.W. Spatafora, J. Kohlmeyer, S. Draeger, J.I. Mitchell.

2008. Detection and identification of fungi intimately associated with the brown

seaweed Fucus serratus. Applied and Environmental Microbiology. Vol 74: 931-

941.

56

Lampiran 1. Perhitungan IC50 ekstrak filtrat dan miselium kapang endofit

Colletotrichum sp.

Tabel 5. Aktivitas penghambatan enzim α-glukosidase pada ekstrak filtrat dan miselium

Sampel Inhibisi pada konsentrasi (µg/ml) IC50

(µg/ml) 10 µg/ml 25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml

Filtrat 30.05 37.60 52.558 78.46 46.88

Miselium 11.58 22.5 44.438 82.03 58.83

Keterangan:

F = Ekstrak Filtrat

M = Ekstrak Miselium

% Inhibisi =

y = ax + b

IC50 = (y – b) : x

IC50 filtrat = (50 - 24.64) : 0.541

= 46.88 (µg/ml)

IC50 miselium = (50 – 3.701) : 0.787

= 58.83 (µg/ml)

57

Lampiran 2. Perhitungan nilai penghambatan enzim α-glukosidase pada semua fraksi

Tabel 6. Aktivitas Antidiabetes kapang SF1

Blanko

Enzim Non Enzim-Non Rata-Rata

0.572 0.056 0.516 0.5265

0.595 0.058 0.537

% Inhibisi =

F2 = (0.5265 – 0.251)/ 0.5265 x 100%

= 52.33

F3 = (0.5265 – 0.1995)/ 0.5265 x 100%

= 62.11

F5 = (0.5265 – 0.152)/ 0.5265 x 100%

= 71.13

F6 = (0.5265 – 0.316)/ 0.5265 x 100%

= 39.98

Fraksi Enzim Non Enzim Enzim - Non Enzim % Inhibisi

2 0.323 0.072 0.251 52.33

3 0.2595 0.06 0.1995 62.11

5 0.4655 0.3135 0.152 71.13

6 0.4705 0.1545 0.316 39.98

7 0.479 0.154 0.325 38.27

8 0.4945 0.0875 0.407 22.70

10 0.8105 0.134 0.6765 -28.49

11 0.8565 0.3035 0.553 -5.03

12 0.54 0.229 0.311 40.93

14 0.7585 0.2175 0.541 -2.75

16 1.073 0.377 0.696 -32.19

20 0.8285 0.4665 0.362 31.24

24 0.665 0.3035 0.3615 31.34

25 0.2965 0.2375 0.059 88.79

27 0.6095 0.1865 0.423 19.66

58

F7 = (0.5265 – 0.325)/ 0.5265 x 100%

= 38.27

F8 = (0.5265 – 0.407)/ 0.5265 x 100%

= 22.7

F10= (0.5265 – 0.6575)/ 0.5265 x 100%

= -28.49

F11= (0.5265 – 0.553)/ 0.5265 x 100%

= - 5.03

F12 = (0.5265 – 0.311)/ 0.5265 x 100%

= 40.93

F14 = (0.5265 – 0.541)/ 0.5265 x 100%

= -2.75

F16 = (0.5265 – 0.696)/ 0.5265 x 100%

= -32.19

F20 = (0.5265 – 0. 0.362)/ 0.5265 x 100%

= 31.24

F24 = (0.5265 – 0.3615)/ 0.5265 x 100%

= 31.34

F25 = (0.5265 – 0.059)/ 0.5265 x 100%

= 88.79

F27 = (0.5265 – 0.423)/ 0.5265 x 100%

= 19.66

59

Lampiran 3. Perhitungan nilai Rf kromatografi lapis tipis fraksi 2

Rf =

Rf KLT fraksi 2

Rf = = 0.62

60

Lampiran 4. Hasil Analisa UV-Vis metanol

61

Lampiran 5. Hasil analisa FTIR isolat fraksi 2

62

Lampiran 6. Hasil analisa LCMS isolat fraksi 2

Rizna –Dini SF LC MS –ESI pos ion

Vol injection 5 ul

Flow 0.2 ml/min

Collumn C-8 (15mm x 2 mm)

Eluent MeOH

0 4 8 12 16 20

Retention Time (Min)

101.1

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

BPI=>NR(2.00)

T11.7

Index Time Lower Bound Upper Bound Height Area

1 11.672783 11.326450 12.250783 101 681.85

99.0 319.2 539.4 759.6 979.8 1200.0

Mass (m/z)

0

95.8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sit

y

Mariner Spec /302:306 (T /11.60:11.75) -285:292 (T -11.60:11.75) ASC=>NR(4.00)[BP = 391.6, 96]

391.64

413.67

804.37

385.17 800.18

63

Lampiran 7. Hasil analisa LCMS/MS isolat fraksi 2

64

Lampiran 8. Foto penelitian

Ekstrak Miselium setelah

diuapkan pelarutnya dan

dikeringkan

Kolom kromatografi

ekstrak filtrat

Penampungan ekstrak

kolom kromatografi filtrat

fraksi 2

Microplate reader

Evaporasi ekstrak

Alat LCMS/MS

Alat LCMS

Hasil Peremajaan Isolat

Kapang Endofit

Colletotrichum sp.

Tiga buah cokbor yang di

inkulasikan ke dalam media

fermentasi

65

Proses ekstraksi Filtrat

Proses ekstraksi Miselium

Ekstrak kering fraksi 2

Analisis sampel dengan

microplate reader

BIODATA MAHASISWA

IDENTITAS PRIBADI

Nama Lengkap : Dini Choirunnisa

Tempat Tanggal Lahir : Tangerang, 24 Mei 1996

NIM : 1113096000013

Anak ke : 1 dari 2 bersaudara

Alamat Rumah : Jalan Puspiptek Raya BSD No.24 RT 02/07 Buaran,

Serpong, Kota Tangerang Selatan, Banten.

Telp/HP. : 08979389798

Email : dinichoirunnisaa@gmail.com

Hobby/ Keahlian (softskill) : Membaca dan Menyanyi

PENDIDIKAN FORMAL

Sekolah Dasar : SD Negeri Buaran 01 Lulus tahun 2007

Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 07 Tangerang Selatan Lulus tahun 2010

SLTA/SMK : SMA Negeri 09 Tangerang Selatan Lulus tahun 2013

Perguruan Tinggi : Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Masuk tahun 2013

PENDIDIKAN NON FORMAL

Kursus/Pelatihan

1. Manajemen Laboratorium : No. Sertifikat 068/ISP-S/V/2017

2. Manajemen Mutu : No. Sertifikat 067/ISP-S/V/2017

3. Keamanan dan Keselamatan

Kerja di Laboratorium Kimia

: -

PENGALAMAN ORGANISASI :

1. Himpunan Mahasiswa Kimia Jabatan Staff Ahli Departemen Kerohanian Islam

Tahun 2014 sd 2016

2. Karang Taruna RW 07 Buaran Jabatan Sekretaris Tahun 2016 sd 2018

PENGALAMAN KERJA :

1. Praktek Kerja Lapangan (PKL) : Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI

Kimia)/2016

Pengaruh Variasi Sumber Karbon Terhadap Aktivitas

Antidiabetes Dari Hasil Fermentasi Isolat Bakteri 8.9

2. PT. AEON INDONESIA : Cashier AEON Mall BSD City/2017

SEMINAR/LOKAKARYA

1. Seminar Nasional Sciencetech

Day

Bulan/Tahun 2013 Sertifikat Pemakalah (ada/tidak)

2. Kuliah Umum Perubahan Iklim Bulan/Tahun 2013 Sertifikat Pemakalah (ada/tidak)

3. Seminar Sosialisasi Badan

Penyelenggara Jaminan Sosial

Bulan/Tahun 2013 Sertifikat Pemakalah (ada/tidak)

4. Seminar Public Speaking Bulan/Tahun 2014 Sertifikat Pemakalah (ada/tidak)

5. Seminar Nasional Biokimia Bulan/Tahun 2014 Sertifikat Pemakalah (ada/tidak)