Cloning and expression of Aspergillus fumigatus allergen Asp f 16 mediating both humoral and...

10
Clinical and Experimental Allergy, 2001, Volume 31, pages 761±770 Cloning and expression of Aspergillus fumigatus allergen Asp f 16 mediating both humoral and cell-mediated immunity in allergic bronchopulmonary aspergillosis ABPA) B. BANERJEE, V. P. KURUP, P. A. GREENBERGER*, B. D. JOHNSON² and J. N. FINK Department of Paediatrics, Allergy-Immunology Division, Medical College of Wisconsin and Research Service, Veterans Affairs Medical Center, Milwaukee, WI, *Division of Allergy-Immunology, Northwestern University Medical School, Chicago, IL, and ²Department of Paediatrics, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA Summary Background Aspergillus fumigatus, a ubiquitous fungus, is responsible for a number of lung disorders in atopic and non-atopic individuals. Standardized, pure, and relevant allergens are desirable for reliable immunodiagnosis of the disease and to understand the structural and functional properties of these allergens and the role they play in causing ABPA. Objective Molecular cloning and characterization of a relevant allergen from A. fumigatus cDNA library. Materials and methods A cDNA library was constructed from 96 h old mycelium of A. fumigatus using l ZAP expression vector. A novel gene encoding an A. fumigatus allergen was identified by screening the library with sera from ABPA patients. The gene was cloned and the allergen over-expressed in Escherichia coli. This recombinant allergen, Asp f 16, was evaluated in ELISA and Western blots using sera from patients and normal subjects and peripheral blood mononuclear cells PBMC) for antigen-induced stimulation. Results Seventy percent of the patients with ABPA demonstrated high levels of serum IgE antibodies to Asp f 16, a 43-kDa protein, whereas patients with allergic asthma, Aspergillus skin test-positive asthmatics without clinical evidence of ABPA, and normal controls failed to show Asp f 16-specific IgE binding by ELISA. The deduced amino acid sequences of Asp f 16 showed extensive sequence homology to 30.6-kDa Asp f 9 at the N- terminal region of the protein. PBMC from the majority of patients with ABPA exhibited significant proliferation with the recombinant Asp f 16 allergen. Conclusion Specific humoral and cell-mediated immune responses of Af-sensitized patients against Asp f 16 suggest its usefulness in the immunodiagnosis of hypersensitivity diseases due to Af and understanding the pathophysiology of ABPA. Keywords: Af, Asp f 16, allergen, molecular cloning, cDNA library, ABPA, IgE antibody, ELISA, PBMC, stimulation index Clinical and Experimental Allergy, Vol. 31, pp. 761±770. Submitted 3 May 2000; revised 11 July 2000; accepted 29 October 2000. Introduction ABPA is a disabling hypersensitivity lung disease detected in about 1±2% of asthmatic 15% asthmatic patients sensitized to Af) and 7±35% of cystic fibrosis patients [1±4]. Unlike Aspergillus skin prick test-positive asthmatics, ABPA patients usually show significantly elevated total and specific serum IgE and IgG to Af proteins [5]. The clinical features of ABPA vary widely from episodes of mild asthmatic responses indistinguishable from uncomplicated asthma to severe asthma with fleeting radiological infiltrates, proximal bronchiectasis and lung fibrosis [6]. Diagnostic criteria such as skin prick test q 2001 Blackwell Science Ltd 761 Correspondence: Viswanath P. Kurup PhD, VA Medical Center, Research Service 151-I, 5000 West National Avenue, Milwaukee, WI 53295, USA. E-mail: [email protected]

Transcript of Cloning and expression of Aspergillus fumigatus allergen Asp f 16 mediating both humoral and...

�������� ��� ���� ����� �������� ����� ���� ��� � �� �������

������� �� �������� �� ���������� �� ������ ����� ���

� �� �� ���� ���� ���� � �� ������ �� ����� ��

������ ������������ � ����������� !�"#�$

"% "�&'()''� �% #% *+(+#� #% �% ,(''&"'(,'(-� "% .% )/0&1/&2 ��)% &% 34&*

����� ��� �� ������������ ��������� ������� ��������� ������� ������� �� ��������� ��� �������� ������� !�������

������� ������� ������� ���"��#��� ��� -�������� �� ��������� �������� $����"������ %��������� ������� ������

�������� �&� ��� 2����� ��� �� ������������ ������� ������� �� ���������� ���"��#��� ��� % �

�������

'��#������ ���������� �� ������� ���5������ ������� �� ��������� ��� ���� �� ����

�������� �� ����� �� ���� ����� ����6��� ��% 1� �� ���7�� ���� �� ��6 �� ������ �

���� �� ��� ��� �� ������ ������ �� �� ��� � �� �� ������ �� �� �������� � ��

�������� � �������� �� ��� ������ �� �� ��� �� �� �� � ����� �"#�%

()*������ 8����� � ������� �� �� � ����7 ���� �� ��6 �� ����� ��� �+

�� ������ �.&� ���� � %

��������� ��� ������ � �.&� ���� � 9 � ���������� ��� :� � ��� ���� �� �+

�� ������ ����� � ;�# �������� 6����% � ��6� �� ������� � �+ �� ������ �����

9 � �������� � ������� �� ���� � 9��� �� ��� �"#� � �����% <� �� 9 � �����

�� �� ����� �6�������� �� ����������� ����% <��� ������ �� ������ ��� � ���

9 � 6 �� �� �� '=41� �� >���� ����� ����� �� ��� � ����� �� ��� � ���?���

�� ������ � ����� ������� � ���� !#"8�$ ��� ������������ ����� ����%

������� 16�� ����� �� �� � ����� 9��� �"#� ������ �� ���� �6�� �� ���

4�' �������� �� ��� � ��� @��A. ������� 9�� � � ����� 9��� ������ ��� �

���������� �A�� ����������6 ��� ���� 9������ ������ � 6���� �� �"#�� �� ��� �

�������� � ��� �� ���9 ��� � ���������� 4�' ������� � '=41�% <� ����� ��� ���

�5���� �� ��� � �� ���9� �����6 �5��� ������ �� ��%��A. ��� � : � �� &�

���� � ����� �� �� ������% #"8� ��� �� ?���� �� � ����� 9��� �"#� �������

�������� �� ������� ���� 9��� �� ������ �� ��� � �� �����%

���������� 1������ ���� � �� ������ �� ��� ������� �� ���������7�

� ����� � ���� ��� � �� ������ ��� �������� �� �� ������ ������ �� � ��������6��

��� �� �� �� �� �� ������ ����� �� � ����� ������ �� �"#�%

,��"����- ��� ��� � ��� ������ ����� � �������� �.&� ���� � � �"#�� 4�' ������ �

'=41�� #"8�� ����� ���� ����

�������� ��� ���� ����� �������� ���% ��� ��% �������% 1������ � 8 ����B �6���

�� )�� ����B ����� �: /����� ����%

������ �

�"#� �� ��� ����� � ��������6�� ���� ��� �

����� �� ���� ���C �� ��� ��� !�DC ��� ���

� ����� ������7� �� ��$ �� ���DC �� � ���� ��������

� ����� E��@F% +���A ���������� �A�� ����A ����������6

��� ����� �"#� � ����� ��� �� ���9 �������� ���

�6 �� ��� � �� ������� ��� 4�' �� 4�, �� �� �������

EDF% <� ������ � � ���� �� �"#� 6 � 9��� ���

������ �� ��� ��� ��� ������� ������������� �� ���

�������� �� ��� �� �6� ��� 9��� ������

� �������� � ������� ��� ����� � ��������� ��� �� ����

�������� E�F% .� ������� ������ ���� � �A�� ����A ���

� ���� "� �A9�� 1���� =�� ���

�����������G ���9 � �� #% *���� #�.� �� 8��� � ����� (� ���

1�6�� �D��4� D��� >�� & ���� � �6��� 8��9 �A� >4 D��:D� +1�%

'� ��G 6A����H�9%��

� ����� �� �� ��� ��� �� ��� 4�, �� 4�' �������� ��

�� ������� � ���� ����� �� ���������7� ��� ����

9������ �"#� �� ��� ��� �������% ���� � ��������� �

���� �� �� � �������� � ��� �� �"#�� ����� � �����

��� �� �� � � �� � �� �� ��� � �� �� �������6 6 ��

�� �6� � ���� �� ������� ������ ���� � � ��������

��������� ���������� �� �A�� ����A ��� � �����

���� �� �6� � � ����� ��������� ����� ��� ��� �� ��

� �� �� ���?��� ������% �"#�� �� ��� ����� � ��

�� �� �� 6��� �� � �� �� ����� � �������� ��

����� ��� � ����% 4� 6�9 �� �� ���A ����� �� 9���

������� �"#�� �� �� ����� � �� �6��� ������6 ��

��� �� �� ����� ������ ������� ����� ��� ��

������� �� �"#� ����� 9�������� �� ������%

+���� ����� � �� ����� ���� �� ������ � ��� 4�'

�������� �� ������� ������ � 6 �� ������ 9���

���� ��� ��� �� ��% <� ���� ��� ��� ���� ��� �� �������

�� �� ��6 �� ������� � �� ���� �� ���� �������

�������� ��������� � ���� �� ��� �������� ������

����� �� 6� ������ E���F% 4� ���� ��� ���� ��

������ � 6 �� ��� ��� ��� �� � ����� � �������

�� ��� EI�:F% <� � ���6�� �� ��� ����6��� � ������

�� �� ��� �������� ���9� ������� �� 6 �� �����

��������� �� �� ��� ����� �� �� ������� �� ��6 ��

�� ������� ���������� ������ E:��@F% <� ������ ��

�������� � � � �� �� �A�� ��� ������ ������ �� �� �

�� �� �� ������ �� ������ ���6 ����� ��

�������� ���� �"#� ��� ���� ��������� ��� �� ��

� � � �� 6 �� �� ��������� ��� � ���������� ��

������ �� �� ��� E�D���F% <� ������ ��� � �� ��

������ � �� 4���� ���� � +���� �� 4�������� �

1������ !>0/J4+41$ ����� �I ������ ��� �+ �� ����

��� !.� > � <�� �� �� �� �� 4+41 &���� ���

������ ����� � ������ ����$% <� ����� ����

������� �� ����� � ������� �� �6���������� ��

@��A. ������ �� ����� !��� � ��$ ��� �� �.&�

���� � % ���� 6 ����� ���?�� ������ ������� �� ���

�"#� � ����� ������ �� ������� 4�' ������ �������

9��� ��� � ��� 9�� � ��� �� ��� � ���?��� � ���

�� ���9 4�' ������� 9��� ���� �����% #����� � �����

������� � ���� !#"8�$ ��� � ����� 9��� �"#� ���

������� �������� ������� ��6 ������� � ���� ��� � ���

����� ���� ��� ��6��6�� �� ������ �� ���

������� �� � �����%

����� �� <�� � ��� 4�'� ���������� ��� 4�' �� 4�,� �A�� ����A ��� �� � ����� 9��� �"#� �� ������ ���

1��?���

�"#�

<�� � 4�'

��J= 4�'��� 4�,���

#���A ���

�� ��

1��?���

����

<�� � 4�'

��J= 4�'��� 4�,���

#���A ���

�� ��

(1 �D�I &. &. &. .� ���� � �%I &� ��6

(. ���� &. &. &. 8� D�� �%�� �%�� &� ��6

"0 @��� &. &. &. ." ���� �%�� �%� &� ��6

)� ID:� &. &. &. 1" @:� �%�� �%D@ &� ��6

(< �@�D �%�� �%D� #�����6 �" ��: �%�� �%�D &� ��6

)< �D�� &. &. &. ." �:: �%�D �%�D #�����6

*& ���� &. &. &. ). �::� �%�� �%�@ &� ��6

*= �ID� I%�D �%DD #�����6 .) ��I �%�� �%�� &� ��6

,� ���� &. &. &. 88 @�� �%�I �%�I &� ��6

(" ��@@ &. &. &. (8 �I� �%II �%�� &� ��6

3. �: �D� �%: �%II #�����6 )# @�I �%D �%� &� ��6

#; I�I �%D: � #�����6 3# @�D� � �%I� &� ��6

(� ��:� �%I: �%�D #�����6 �( �I�I �%D � #�����6

)" &. �%�� �%� #�����6 .( �� �%�� �%�@ &� ��6

#� ::� �%� �%:� #�����6 (1 ��� �%�� �%�: &� ��6

). &. :%:I �%I #�����6 11 @@D �%:D �%@� &� ��6

1. �I� �%@@ @%�D #�����6 )< ��D@ �%DI �%�� #�����6

8. &. �%�� �%: #�����6 *1 �@ �%I� �%:@ &� ��6

', ���I �%�� �%�� &� ��6 �, I�� �%D� �%:� &� ��6

<* �:�� �%�� �%@ #�����6 *; �@ �%�� �%�: &� ��6

18 I�� I%D� �%�� #�����6 .. I�� �%I� � &� ��6

*8 �:� �%�� �%�� #�����6 ,# I�� �%�� �%�� &� ��6

11 @@ID D%ID @%�D #�����6 )" ��� �%�I �%�� &� ��6

.> �@@� D%� @%I� #�����6 (, ��� �%ID �%I� &� ��6

.> ���� �%�� �%�� #�����6 .< �� �%II �%DD &� ��6

<� ��� D%:� @%�� #�����6 �K ��%� �%I� �%:� &� ��6

��� �� �������� � �%

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

���� ��� ��� �����

��������

<� ���� ������ ����� �� �� ��� � ��� ��� ��� ��

9� ��� �� � ������� ��6����� E��F% <� �����

��� � ����� 9� �� � ����7� ��� ���� ������ ������ �

9�� � ��� � ���6�� � ���� ������� �� �������� �

��6����� ������� E��F%

���� )����� �� ��������

� �.&� �������� ���� � 9 � ��� �� ����� ��� !��$

(&� ���� �� ��� :� � ��� ���� �� �� !�3 ���B

�<�� @����$ �� � ;�# �������� 6����% <� ��� �

���� � �� � � ��D ������ ��� 9 � ������ �� ��� �

��������� �� � ����A% ����������� ���� ��� �� L=�� "��

9 � ������ 9��� D � ��@ �� �� 9��� �.&� ������ ��

�� �� �� =" � � �� ��% <��� �.&� ���� � 9 � �����

9��� ������ � ���� � ����� ��� �� ����� ���

� ��� ��� � ����� 9��� �"#� � ��6����� �������

E��F% <� �������� �� 5�� 9� ������� �� ����� ��

�"�������� �� ���� �� L=�� "��% /� �� �� ������6

����� ��������� ������ � ���6�� 9��� 4�' �� �� �����

�"#� �� 9 � ����� ��� �5������ �� ������

�� � ����7 ���� E�@F% <� �5��� ���� ��� � ����

9� � ���� ��� ����� �� "=�1< ����� �� �� & ���� �

���� ��� "���������� 4���� ���� �� 9��� �� ,����

������ ,����� � �A � E�I��:F%

(������������ �� �� � ./ �� �0 �������� �����

<� �.&� ���� �� �� 9 � ������ � ��� � � �� ��

� ����� !#�($ 9��� ��� ���� D � ,,�<��,,���

,��<<,,<�����,<,�� � � �� ������ ���� D �,�,,��,�<������,�<,,�,������� � �% <�

������ #�( ������� 9 � ������� ��� �� ��

�������� � �� " 0� �� &�� � ���� �� �'< ��������

6���� ��� � !�'< ��������B &�6 ��� 8 ������ >4�

+1�$% <� ������ ������ 9 � ���� ��� ��� � ��6

�� ����� ����������� �� � ��� !"��( �� (������� ���

+1�$ �� �� ������� ��� � �� 9 � � � �� �� 1.1�

#�,' � ������� ��6����� E�����F%

�)*����

1� ��� ��� ������ �� ���?��� 9� ����� ��� ��

���� % ,����� �� �� � ����� �� ��� ������ �� �������

�"#� �� ��� ��� ���� 9��� �� 9������ ��� � 9� �

�� �� � �A�� � ���6�� �� ��� ��� �� � ���� �� �"#�� 9�

������� E�����F% ��� ��� �� ��� ��� � ����� 9� �A��

����A�������6 �� ����� �� ������� ���������� ������

��� ��� ��� 9� �A�� ����A ����������6 �� ��% # �����

9� �� � �� ����� .�6������ �� &����9����

+��6���� 8��� � 1����� �� �� 8��� � ����� ��

>��������% 1�� � ��� ��� �� ��� � ������� ���?���

9��� �� ������ � 6���� �� ����� ��� ��� �� 9� ���

������� �� �� ���� % �"#� � ����� ������� �� ���� ����

�������� � � �� ��� �� �� �6� ������ ������� �

(������ �� ��% E�����F% 0� � ������ 9� � ���� ���

9��� �� ����6 � ��� 4���������� � �6�9 ������%

0���� ��� ���� ����� �� ���� �� ���

� ��������� ����������� ��� !3�1<B �8 .� �������

1 ���� 1 �� �� � � ��� +1�$ 9 � ��� ��� ��

����� ���� �� ��� � ��� 4�'% <� �������� �6� ���

�� ������� �� 4�' 9 � �%@ ��J= E��F%

���������� �� �� � ./ "��� ���� ���

<� ������� �� 4�' �� �� �� �� � ����� �� ���� � �� 9 �

� � �� � �������� � '=41� � ��6����� �������

E��F% 4� ����� 4���� � ��� �� �� �� �� !. � ���

= ��� �� ����� � ��� +1�$ 9� �� �� 9��� ���� � ��

!�� ��J=$ �� ���� ������ ����� � !� ��J=$ �� #"1 ���

�6������ � @��% <� 9��� 9� ����A� 9��� �C ��6��

��� ����� !"1�$ �� #"1 ��� � � � ��� ��� ���%

<��� 9 � �����9� � ������� � ����� ���� �� ���

��������� ��� 6 ����� ���?���% � �G�D �������� 9��� ���

9 � ��� ��� 4�' ������ % <� �� �� 9� ����� �� ���

� � �� 9 ��� ��� ��� 9��� #"1 ���� ����� �%�DC

<9� �� !#"1�<$ ��� D �� ��% "����� � �� �� � ����

�� � 4�' !����� = ��� 4��%� "������ � ��� +1�$

������ � �G���� 9 � ��� �� �� ������6 9���% ����

����� ���� �� 9 ������� �� 9��� 9� �� �� 9���

�G���� �������� �� ����� 6���� ������ � !; �� 1 �

3� ������� ��� +1�$ ��� � �% <� ����� �� 6 ��� �� ��

������ � ����� 9� � � �� � ��� ��� '=41� �� �

� �� !. � ���$ � 9 6����� �� @:� �% <� 6 ���

9� ��� ��� � ����� ����� ������� � �� �A� ��

�������� �� �� ������������� 9 � ���� ��� �

��� ���� 9��� A��9� ������6 �� �� ��6 �� %

>���� ���� � � ��� �� �� ���� � �� 9 � � ���� ���

����� ����� �� ��� �"#� � ������ ���������� �A��

����A ����������6 ��� ������ �� ��� � �������

���?��� � ������� ��6����� E��F%

�� � ./�������� �'�� ������������

#������ ���� �� #"8� 9 � ������ �� :��9�� �� ��

������ �������� �� �� �� ��� ���� �� ��

����� �� ������ �� ��� � �� �� �� ������ ����� �

������% #"8� 9� ��� ��� ��� ��� �"#� � �����

�� ���� �A�� ����������6 ��� ����% #"8� �

������� ���� �� � � ��DJ9�� 9� ������� �� (#84 ��@�

� � � � �� �+ �� ������ �������� ���

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

��� �������� 9��� � ��J= ���� ��� �������

��� ��� +J=� ������ ��� ��� ��J=� �� ��C � ��

�� ���6 �� �� � �" ���% <� ������� ��6 ������ ��

#"8� 9 � ������ ����� 6 ����� ������� ����� ��

������ �� � ����� ������� ���� �� D ��J= 9 �

����� ��� �� ������������ #"8� ����� ���� E�@F%

<� ���� 9� ����� �� � ���� �� �������� �/�

����� ��� ��� � � � ���� ������� 9��� �%D ���J9�� ��

�0��� ���� !������� ���6�� �� �%� ��J��B .�#���

.� ������� 4 ���� .�6������ "������ � 8�� +1�$ ��� ��

��� � �I � ������% <� ���� 9� � �6��� �� �� �� ����

����� �� �� � ��� ���6�� ������ 9� ���� �� ��

�������� ���� ������ !# �A �� 4������� ��%� .�9���

,��6� 4=� +1�$% 1���� ���� ������ !14$ 9� � ���� ��

� �����9�G 1%4% � !������ �� ����������� �� ������J

������ �� ������� ������ 9������ ������$%

� �� �� &������� �� ����� ��� ��� �5���� �� �.&� ���� ������� ��� � ��% <� ����� ��� ��� �5��� ����� 9���

�� ����� ������ � ����� ����� ���� ����� �<, !8$ �� ��� 9��� <,� ���� ����� ����� � �� �����A% <� ������� &�

�� ��� � ���� ��� �� �������� �� �� ��� �� � ���� ��� ����� �� ��� !�$ �� �� ����7� �� ��������%

��@ �� �������� � �%

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

���������� ��������

8 � � � 1%.% �� �� ��� �� 9� � A� � �������� ��%

<� � ����� �� �� ��� �"#� �� ������ ���

������ 9� ��� �� 9��� ���� �� �� ��� � ��������

� 1�����M� ����� !�9��� ���� �������� � ���$% �

��6 �� �� � �%�D 9 � �������� �� ������ �� �������� ��%

������

��������������� �� ���� )����� �������� �� � ./

<� ��� � ���� �� �� �� �������� �� �� �D@� ��

��� �� ����� ������ �� @�� ��� ���� !3��% �$% <�

������ �� � ��������� ��� ���� � �� &����� � ��

� �� �� ���������

� � � � �� �+ �� ������ �������� ��D

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

����� �� �� ����� �� � �I ���� ���� � �����

!,�" �A �������� &�% �3����D�$% <� ������� ��� �

�� � ���� ��� ��<,�� � �� � � �� �� ����� �I � ��

����� �� �� ��� !�$ � ��% <� ��� ��� ����������

�� �� ������ ����� �� �� � �� �� ���� �� ������� !��%�C$�

���� !��%�C$� � ��� !:%�C$� �� �� ��� !I%�C$% /�

������� �� ��� � ���� ��� !&11$ �� ����� �� �� ���

��� ������ ��I���� �� ��� � ��% <� � ���� ���� ������

�� �� ����� ����� 9 � � � �� 9��� 9����9 �� ��

��� ���� E�:F% <� ���� �� � ��������� ������ �� ��

����� 9� ������ �� �� �� ��� ��� ������

��I���@� ������@� �����D�� ������@� �� �I:�@�@%

3����� � � ��� 9��� <����� ����� �6 �� ?��

���� ���� ������ � ��� ��� ������ ���D� ��

�D���:�� 9���� ���� ��������� �� �� ������ � ���������� �� ������ E�DF%

� �� �� ���������

� �� �� 15��� ������ ��9� ��� � �� �� ��� � : 9 � ��� �� ����� ,�, � � ����� % <� &����� � ����� �� ��� � ��

��� ��� ���� ����@ ������� ���� �5��� ������ 9��� �� ������������ ��� ��� �5���� ��� ��� � :% <�� ����

�����9��� � � �� �� ��� ��� ������� ����� ������ 9 � ������ �� ��� ����� �� �� ��� ����� ������ ��� ����

�� ������� ��� ��� �� �:� �� ��� � �� �5���%

��� �� �������� � �%

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

��� � �� � ��� �� ���9 �������� �� �5��� ������

9��� � �� �� A��9� �������� � �� �������� � �������B

��96�� ��� ��� ������ �� �� ����� �� ::���@

������� ��C ������ �� @IC ���� ��� 9��� ���� ��

�� � ������ ��� �� �� ������� ���� �������

����% 4� ������ �� ��� ��� ������ �����@� ��� � ��

�� �� ��C ������ �� @�C ���� ��� 9��� �� � ����

������������@ ���� � �% ��� � �� ��� ������ ��

�������� �5��� ������ 9��� ����� �� ����� ��� �

: � �� &����� � ����� �� �� ������ !3��% �$� 9�� �

������ � ����� ��� ��� ���� ��@�@�� � ��� ��

���9 �������� �� ������ ���� �� �� ����� �� � ��

������ �� ��� ��� ������ ��� ��� �� �:�% <� @��A.

����� ������ �� ������� � �6� �� �5���

������ �� D�C 9��� �� ��%��A. ��� � :% <� �D@��

�� �� ������� �� ����� ����� � � ������� ��7

�� @�%� A. � 9��� ��� � : ����� ������ �� ��%� A. �

���� ����� ��� �� ������ ��7%

<� ���� �������� �� ��� � �� 9 � ����6� � ��

����� � 9���� � �� �� @��@� A. ��� � � 4#<,

���������% 1.1�#�,' � � ��� �� �� ������� ���� � �� ��

���9� �� 3��% � % <� ���� ��7 �� �� ���� � �� �� ��

���� ���� 9��� �� ������� ����� � ��7 ��

@�%� A. %

��� )������ �� ��� � ./ "��� ���� ��� �'�� �������

>���� ���� � � ��� �� �� �� ���� ���� � �� ��

������������ �� � ������� 4�' ������ �������

9��� �� ��� � ����� 9��� �"#�� 9�� � ����� ���

� ��� ��� ��� �� ��� � �������� � ��� �� ���9

������ ������� 9��� ���� � �� !3��% ��$%

<� ������ �� 4�' ������� � �� ��� � �����

�� ��� � ���?��� �� ��� � �� � ���9� �� 3��% @%

4� � ������������� '=41�� ���� � �� ������ ��

������� 4�' ������� 9��� �� ��� �"#� � �����%

<� � '=41� 4�' ����� �� !/.@:�$ ��� �"#�

� ����� !� � ��$ 9 � �%� � �%�D ��� �� 9���

�%�� � �%�� ��� ������ ��� �� �%��I � �%���

��� ��� � �������� !� � �%�D$% <� � ����� �

����� �� ���� � ���������� 4�' �� �� �� �� ��

�"#� � ����� 9 � ���� �%D����� ����� �� � ��� ��

�� ������ ����� � ������� � ���9� �� 3��% @% 1�

��� ������ ��� ���� 9������ �"#� �� ��� �

������� ���?��� � ��� �� ������ � 4�' ������� 9���

� ��� � ��% ���� 6 ����� ���?�� ������ �������

��� � �� ������� ���C ��������� � 9�� � ��C

� �� �� ! $ 1.1�#�,' � � ��� �� ������� ���� � ��% <�

������� ������ 9 � �� �� � �� ��J������ �� � � �� ��C

1.1���� �� � �� �� �� �� ��� 9��� ��� ��� ������ ��

���% = � �� #������ ���� � ��B � � �� ����� � 9����

�A��% !�$ >���� ����� �� ������� ���� � �� ��� 4�' ������

�������% = � �� >��� ������6 �"#� ��� ����B � � @� �

��� ��� ��� ����B � � D� ����� ��� � ��������%

� �� �� ��� � �� ����� ������� �� �� 4�' �������� �� �� �� ��

�"#� � ����� ��� �� 9��� �� � ��� ���������� �A�� ����A ����

������6 ������ ��� �� ��� � ��������% 4�' ������� ��

������ �� ��� � �� !�$ �� ���� ������ ����� � ������ �� ��

!�$ 9� ���9� ��� �� ��� � ��� �� ��� �� ����� ��

������% <� � 4�' ����� �� �� �"#� � �����M �� ����

� /.@:� 9 � �%� � �%�D ��� ��� � ��� 9�� � ��� ���� ������

����� � ������� �� � ����� �� � /.@:� 9 � �%D� � �%�:%

� � � � �� �+ �� ������ �������� ���

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

������6�� �� 4�' ������� 9��� �� ��� �"#�

� �����%

0���� ��� �� ��� ����

4� ���� ���� � ��� � 4�' �6�� �� �� ���?��� ��� ��

����� 9� ��� �� 9��� �� ������6 �� ������

����� ��������� 4�' ��������% &� ����� ���� 9 � ����

��� �� �� �� �6�� �� ��� � ��� 4�' �� ���������� 4�'

�� �"#� �� ���������� �A�� ����A ����������6 �� �

�� ��6 ��� � �����% �� ���9� �� < �� �� �"#�

� ���� !� ���� <�$ 9��� ��� � 4�' � ��9 � ��� ��J=

������ �� �������� ��� ���� �6� �� ���� � �� 4�'

������ 9��� � '=41� ���� �� D%:�% 4� ����� ��� ���

������7� ������ ��� � ���� !� ���� 3#$ 9��� ��� �

4�' � ���� � @�D� ��J= � ��� �� ���9 �������� �� 4�'

�������� !�%� '=41� ����$ � ���� ���� � �� ������%

�� ������� �� �'�� )� �� � ./

<� #"8� ��� ��� �"#� �� ���� ���������7� ���

� ����� 9� ����� �� �� ����� 9��� 6 ����� ������� �

����� �� ��� � �� !3��% D$% 3��� ��� �� ��� �"#� � �����

���9� �������� �� ����� ���� ������ 9�� D ��J= ��

��� � �� 9 � ��� �� #"8� ����� ����% � 14 �� �� � ��

�� ����� 9 � �� �� ��� � ������ 9��� ��� �� ����

������ ��� � ����� ���9� ��9� ������ ��� ��

9��� �"#� !3��% D$% <9� �� �� ��� �"#� � �����

������� ��9 14 �� �� � �� �� D��%

� ����� �

4� �� ����� ���� � 9 ����� �� �������� �5������� ��

�������� �� ������ �� �� ����� ����� �� � ���

� ��% <��� ����� ���9� �����6 �5��� ������

9��� ��� � : � �� &����� � ������ ��� �� ������ �

����� �� �� ������ ��������� ��� ��� ������ ���

��@ ��9 ��� � ��� �� ���9 �������� �� �5��� ������

9��� ��� � :% <� ����� �� ����� � � ����� �� ��

������ 9 � ���� ��� � �� �������� �5����

��<,�� �I � �� ����� �� ��� !�$% 1��� �

��� �� � ���� ���� � 6 ��� �� ������ ��� ����

���� � ������ E��F% <� ��� �����6� �5���

�������� � 6 �� �� ��� 9��� �7 ��������� � � �� ���� �� �� � ������ �� +

���������� � �� &����� � ����� �� �� ������% ��������

��� �� ������� &����A� �� ��� � ���� ��� � �� ���

��� � �� �� ��I����� �� �������� ��� ���� ������

������� �� ������ ��� � �� ������ �� ��� � ��

����� �� �� � � ���� �� � ����� ��� � ��6��6�

�� ������ ������ ���� �����%

<� ������ ������� ���� �� �� ����� � ������� �

��� � ���� ���� ������ �������� �6� � � ���������

������ ���������� �� �����% <�� ���� � �����

������ � �� ���� �� ��� ���� �� " ��� ������ ��

�� ����� E�:F% <��� �� 6����� � ���� 4�' ������

������� �� ��� � �� 9��� �� ��� � ����� 9��� �"#�%

4������ '=41� ����� ��� � �� ������ �� ������� 4�' ��

��C �� �� ��� �"#� � ������ 9��� ��� �� �� ��

��� ��� �� �� �������� ���9� 4�' ������� �� ����

�����% 4� �������6 '=41� ���������� �� � ��� �� ��

��� � �� ������� � :�C ���������� �� 4�' ������

������� �� ��� � ����� 9��� �"#� �� �������� �

�� �� ��� � �� !� � ��� ���9�$� ����� ���� �� ���������

�� ������ ������ � �����% 0�96�� ��� � : � � ��

������ �� ������7 4�' �� I:C �� �"#� �� ��C �� ��

�A�� ����������6 ��� ��� � ����� E:F% <� � ���� ��� ��

������ ������� �������� �� ��� � : �� ��� � ��

� �� �� �� �������� �� �� ��� ��� ������ � ��

������ � ����� �� �� ������� �� �� �� �� ��������

�� �� � ���� ������ ��� �� ��� ������% <��� ��� �

�� �� �� ������ � ���������� ��� �� �� �� �

������ ��� �9� ������� � ��� ����� ����� ��6��

����������%

0�96�� �� �����6 ������ ��9� ��� � : ��

��� � �� � �� &����� � �� ������� �� � ���� �������

� ����� � �� � ��� �� �� ������� ��

�������� �5���� �� ����� � ��7� ���� �

������� �� �� �� �������� �� � �� ����� �� (&�

������ �� ����������% � ���� � �� ��� � � ��

� �� �� 4��� �� ������� ��6 ������� �� ������ � �����

������� � ���� !#"8�$ ��� � ����� 9��� �"#� �� ��� �

�� �� ��� ����� 9��� �� ������� �� ���������7� �A�� ����A

����������6 ��� � �����% #"8� !� � ��DJ9��$ 9� �����

� �� 9��� � ����� ������� ���� �� D ��J= �� ��� � ��� ��

�� ������� ��6 ������� �� #"8� ��� ������� � ����� 9�

���� � �� �0��� ���� ��� A% 3��� ��� �� ��� �"#�

� ����� ���9� �������� �� ������� ���� �� �� � �� �� �����

����� ���� ���� !14$% /�� �� ��� � ���� 9��� �� �A�� ���

������6�� ���9� �������� �� ����� ����% 3�� �� ��� � 8 ��� ��

�� �����%

��I �� �������� � �%

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

������ ��� 6 ����� ������� �� ���� ����� ��

�� ������� 4�' ������ ������ ���� ��� �� �

�� E��F% 4� �������� ���� ������� �� � ����7 ���� ��

�� ������ ����� � ������� � � �� �� ����� �� �� �

� ��� � ������ ��� ��� ������� �� ������� ����� �

9����� ���� � ���� �@� �� ��� E�IF% <� ��������

����6� �� �� ����� � �� �� ��������� �

� ���6���� ��� ��� ������� � �������� �� ��

������� ��� ���� � ������ ���� �� ������ ��� ���������%

1��� �� ��� �� ����� �� ��� ��� �5���

�������� ��9� �� ������ ��� � � �� ��DD � �

�� &����� � ������ �� �� ������� E�I��:F% 4� ����� ���

�� ������ ��� � �� �� ��� � : ������� ��� ���

�5��� �������� � � �� ������ � ���� ���������

������� � �� ���� �� ��������� � � �� � � ����� ��

�� � ��%

(���� � 3��� �� �� ��% ������� � ������������� � � �� �� A. ��� ��� 9 �� ���� � � �� ��

E��F% <��� �� ��� � �� �7 �� ������ �� � ���� �

��� � ���������� � �� ��� �� �� � ������� ��6��6� ��

��� 9 �� ����������% �������� 9 � 6 ��� � ������

�� �� ��� ��� �������� �� ��� � ��� �� �5���

���� ����� ��9� �� ����� �� � ���� � � ����

����������@��� ����� � � � � ����� ���� ��

���� ����� � �� �� � ��� ��7 ���� �� ��� � ��% <�

��������� �� 4�' ������� �� ��� � �� �� �"#� � �����

� �������� �� �� �������� �� ���� ������ ������

�� ���� � ������7 ���� �� �� ����� � ��� �� ��� ��

�"#�� ��� ��� �� ��� % 4� �������� �� 6 �� ����� �� ���

� �� � ���� �� ����� ��� �� �� � �A ��

������� 4�' �� ���������7� ��� ��� � ����� � ���� ����

�����% #�6���� ������ � 6 ������ �6� � ���� �

����� � �� ������ ���� � ��� � �� ��� � @ �� ��� � �

9��� ������� 4�' ������� 9��� �� ��� �"#� � �����

E�����������F%

4� � � �� ������ �� � � ��� ���� �� �"#� ������ ��

���� ��� � ��� 4�' �� ��������� �� ��� �� � ����� ��

������� �� �������� �� ��� � ���� ����� �� 9���

����� �� ��� � ��� 4�' E��������F% 0�96�� 9 �����

��� ����� � �� ��� � ��� 4�' �� �"#� � ����� �� ��

����� �� ���������� 4�' ��������% 4� �"#� � �����

9��� ��� � ��� 4�' � D�� ��J=� �������� �� �6� ��

������������� 4�' ����� � ������ �� ����� ���� �� �

������������� 4�' �� ���� � ���� �� �������� �� ��

��� � 4�' �� ���%

16� � ��������� �� ������� ������ �� ��

������ � 6 ���9� �������� ������� ��6 ������� ��

�� #"8� ���� �� ��� �"#� � ������ ����� ���� ����

��6��6�� �� ������ �� ��� ������� �� � �����

E�@��@��DF% <� ���� � �� ����� �� ������ � �����

�� �� � �������� �� �"#�� ������ 9��� A��9�

�������� �� �������� � �������� � ���% �������

������� ������� ��6 ������� �� #"8� ��� �"#�

� ����� �� ��� � �� ���������� �� ��� � �� �� ��

�������� ����� � �7 � � 6 ����� �� ������

E����@F% 4� ����� ���� � ��� � ��������� < ��� ����

�� ������ ��� �"#� � ����� � 6 �� �� � ����7� �

�.@� <�� ��� � �� �� ���� � ��A�� ������� � ����

E�DF% 4� ���� 9��� �� ��6���� ����6 ����� �����

������ �� �� ������� ������ ��� � �� ��� � ���

������ �� ���A � ���� � ��� ������� �������� ����� �

������� �� � ����� 9��� �"#�% 4�6��6�� �� ��� � ��

�� ������ �� ��� ������� �� � ����� �� ������

����� ��� �� � �� ��������� �� �������� < ��� �����

������ �� �� ������% /� �� ��� �"#� � ������ #"8�

��� ���� ������� 14 �� � ��� 9�� � ��� �� ������

��� � ���� 9������ �"#� ���9� 14 �� ��%�% <���

� ���� 9��� ��9 �6�� �� ���������� ��� 4�' �� ��

� �������� � ���� �� �"#� ����� � �� ������ � � � ��

�"#��1 E��F% < A� ������� �� ������ ������ ?��

��� �� ��� � �� �� �������� ������� ����� � ���

������ �� �"#� � ������ �� ���� ������ ������6�

����� �� 9��� �� ��� � ���������� 4�' �������� �� ��

�� � �����% 4� ����������� �� ������ �� ����� ��� �

�� ���� �� ��� �.&� ���� � �� �� ������ ��

�������� �� ���� �� ���� ���� � �� ������ �� ���

������� �� � ����� 9��� �"#�� �� �� ������ ����� �

�� � ��� � �� � � �� ������� ��������� ��� �� �����������

������ ��� ��%

�� �!���������

<��� ��6���� ���� 9 � �������� �� � �� � �� ��� ��

�������� ���� 8��� � (� ���� &40 ,� �� �4@��@:�

�� � '���� 1% " 7� �� �� �� &����9���� 8��� �

0����� � �� &����9���� +��6���� % > �� �A = ��

� ������ �� & �� '�� ��� ������ � ����� �� ��

.��� 1������ ��� ������ � ����� ��%

��"�������

� " ��� )3� ,� 6� <1� " 7 8&% ������� ������������ �

����������� �� ������������� ������ ��� ����% ) �����

���� 4���� �:I�B �IG:I����%

� *����� �#� 1� 6�� (,% ������� ������������ � ����

�������� �� � ����� 9��� � ���� ��������% ���� (6 ����� �::�B

:G�����I%

� *� ����A )� ,������ #�� (����� 8� # ������ (%

������� ������������ � �����������G �������� ��� �

��� �::D% ) ���� = � 4���� �::DB @�G����@�%

@ &�A�� �7�A >0� "����� 8)� > ��� )/% ���������� ����

�� ������ ������������ � ����������� �� � ���� ��������%

#�� �� ����� 4���� �::�B �GI���%

D # ������ (% ������� ������������ � �����������% 4��

��� ����� ������� &���� ���� �::IB �IG@���I%

� *���� �#� *� � �% 4����� ������ �� �����������% ����

8�������� (6 �::�B @G@�:�D�%

� � � � �� �+ �� ������ �������� ��:

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������

� = �� )#% ���������� �� ������ �� �����������% ����

8������� (6 �:::B ��G����D�%

I �� �� (� "� �� *% ������� ���������� �� ������ ������

� �� �)�3� ��� ����� �� � ����� � ��% 4�� ����

����� 4���� �::�B ���G@��D%

: �� �� (% (����� �� ���������� �� ������ ������G

��� �� �������� �5���� �� ������ � ����� �����% 4��

���� ����� 4���� �::IB ��DG::���@%

�� " ��? "� *���� �#� #� ���� 1� ,������ #�� 3��A )&%

8����� � ������� �� �������� �� ������ �� ��������

��� �� ������ ������ ��� � 44 9��� �������� �� ������������

' � ���6�� �� ���� ������������ � �����������% ) = �

���� 8� �::�B ���G�D����%

�� " ��? "� ,������ #�� 3��A )&� *���� �#%

4�������� � �� � ����7 ���� �� ��� � �� ?��

����� ��� ���������� �� ������ ����� �� 9��� ������

������������ � �����������% 4���� 4�� �::IB

��GD��D�I�%

�� " ��? "� *���� �#� ,������ #�� 0��� � .(� & ��

.1� 3��A )&% #������ ���� �� ?�� ������ ��� � � �������

�� 4�' �� ������ ������������ � ������������ ���

������ ����� � �� ���������� �� ������% ) ����� ����

4���� �::�B ::GI����%

�� ����� =*� 8 �� ")� �� � � 8.% 1����6 �������� ��

?�� ����� �� � �������� ��� � 4� �� ���������� �� ������%

4���� ����� ��� �� ����� �������� �� �����������

�� �� ��� ��% ) 4���� �::�B �@:G��D@�:%

�@ *� � �� (�� =�� 1��� ��A �� *���� �#% 4��� ���� ��

�� � ����7 ���� �� ������ �� � � ����A ������ ��

���������� �� ������% ) ����� ���� 4���� �::�B

:�G���@���%

�D 0 � 1� 4� �� �� "� �� *� 8�7 ,� �� �� (% 1A������

� ���6�� �� ���� ��������� ��� ������� �� ������

� �� ��� � �� ?�� ����� �� ���������� �� ������% ����

'�� ����� �::IB �IGI����%

�� �� �� (� 0 � 1� 4� �� �� 8�7 ,� "� �� *%

.�� ��������� ������ �� ������ ��� �� �� ������ ��

������ ������������ � �����������% 4�� 4���� �::IB

��G������%

�� 8��� 8� �� �� (� "���� '� 1��� 8� 8�7 ,%

.� ������� 6 �� �� ������ �� ���������� �� ������

����� 4J ��� �A�� ������ �� ������ % ) ����� ����

4���� �::@B :�G����%

�I �������� 13� ,��� >� 8���� >� 8 �� '>� =�� � .)% " ���

��� � ������ � ��� ����% ) 8�� "��� �::�B ��DG@�����%

�: ,����� ������ ,����% #���� �� � ��� �� ,�,

� �A �� ������ :% 8 ������ >4G ,����� ������ ,�����

&�6�� �::�%

�� ,������ #�% .� ������ �� � ��� �� ������

������������ � �����������% ����� #��� �::@B

�DG��D�:%

�� (������ 8� # ������ (� 8���7� (� ����� ")� (����� 8�

0 ���� *'% ������ � �� ��������� ������ ��� �� �� ������

�� ������ ������������ � �����������% ��� 4���� 8�

�:��B I�G@�D��@%

�� *���� �#� " ��? "� 0 �� 1� ,������ #�� "� ��

*� �� �� (% 1���� ������ �� ���������� �� ������

������ ���� ������� �� �� 4�' �� �"#�% ���� '�� �����

����B ��G:II�:�%

�� *���� �#� ,������ #�� 3��A )&% ������� ������ ��

��9������ ��9���� ������ �� ���������� �� ������ ��

������ ������������ � �����������% ) ���� 8��������

�:I:B ��G������%

�@ 8�� �� #1� *���� �#� ,������ #�� 3��A )&%

���� � 6 ��� ������������ ���������� �� ������ �����G

?�� ������ �� ������ ������������ � ����

��������% ) = � ���� 8� �::�B ��:G����I@%

�D 3��� .�� � � ���7 �3% 4����� ��� ������� <���� ����%

& ��� �::�B �@:G�����%

�� ;� �� =� 8�� �� ,� ���� � 40�� (�� 0� ��? 08�%

�.&� ���� ��� ��� ��6� ������ �� � 444� ��

���������� ���)��� �������� � ������ � #� ������%

) 4���� �::DB �D@G�����%

�� ;� �� *� 8 � ''� �� � 0*� 1 ��� �% �����

���� ��6 (&� �������� �� �������������� �� ��������

������� (&�� ������� ���� ������ � ����� ������

�������% ) "��� �� �::@B ��:G@D����%

�I � �� )�� /6?�� 8�� =��7�8�� �� (� 1��� �� 8�

#��� #� = � 3% �� � ����7 ���� �� �� ���������� ��������

����� �� ������ �� �� � �� �1#&.� ������ 9���� ��

������ �� �6� � ���������� �� ������ �������� ��

������ ����� �� �� � � �� % 4���� 4�� �::�B

�DG���D�@@%

�: <��� (� 4A����� 0� 1 9 � ) � �% 4��� ���� ��

�� � ����7 ���� �� ?�� ������� ������� !��DD$ ��

���������� �� ������% ) ����� ���� 4���� �::�B

:�G�:I����%

�� 3��� �� <� 0 ��� �� (#� " �6 �� �� .� 5��� 8� = ��

)#% #������ ���� �� �� � ����7 ���� �� � ��� ���������� � � ��� ���������� �� ������% '�� ) "����

�::�B �@�G��D���%

�� �� �� (� 3 ��� �� 0 �� 1 � �% 0��� � �� ����

�� �� �������� �� ���� �� ���������� �� ������% )

'�� 8� �::�B �I@G��D���%

�� =�� �� * ��� � 03� ������9 � 1�� 8�7 ,% 1������

��� ����� ����� �� ������ � �� �� �� ������

������������ � �����������% ) ����� ���� 4����

�::�B :�GDI:�::%

�� ,������ #�� 1��� =)� 0�� ��� (����� 8� =���� )=%

�� � ��� �� ������� �6�� � � 6 � �� ������ ��������

����� � �����������G ��6���� ������� �� ������

������� �������� �� ��� � 4�'% ) ����� ���� 4����

�:IIB I�G��@���%

�@ *���� �#� " ��? "� 8�� �� #1 � �% 4������� ��

����� ������ �� ������ ��� � � ��� �� ������

���������� �� ������% #����� �::IB �:G�@�:���%

�D �� �� � "� *����� �#� 0������� #1� 1� 6�� (,� "����

�)% < ��� ������� ����� ������ �� 0=������������ ��

� ����� 9��� ������ ������������ � �����������% ) ����

4�6�� �::�B :�G���@���%

��� �� �������� � �%

� ���� "� �A9�� 1���� =��� �������� ��� ���� ����� �������� ��� �������