Biocapteurs SH-SAW. ADN et analogues, vers une discrimination de fragments courts et de mutations

Nom entier de la revue – n° 1/2012, 1-5 AR_pied-page1

Biocapteurs d’ADN à ondes acoustiques de surface

ADN et analogues, vers une discrimination de fragments courts et de mutations

Zouhour Mazouz1,2, Najla Fourati3*, Romain Lucas4, Ali Othmane2, Rafik Kalfat 1, Rachida Zerrouki5, Chouki Zerrouki 3*

1. Laboratoire Méthodes et Techniques d'Analyse, INRAP, BiotechPole, 2020, Sidi-Thabet, Tunisie 2. Laboratoire de Biophysique, Faculté de Médecine de Monastir, 5019, Monastir, Tunisie 3. Laboratoire de Physique-EC3B / MAQIM, Cnam, 2 rue Conté, 75003, Paris, France 4. SPCTS, Centre Européen de la Céramique, 12 Rue Atlantis, F-87068 Limoges, France 5. Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles, EA1069, Faculté des Sciences et Techniques, 123 Avenue Albert Thomas, F-87060 Limoges, France * {zerrouki, fourati}@cnam.fr

RESUME. Le potentiel offert par les capteurs piézoélectriques SH-SAW pour des détections en milieux biologiques est clairement démontré à travers deux applications particulières. La première concerne la mise en évidence d’un appariement entre un oligonucléotide et un analogue de tétranucléotide présentant un lien triazolique. Cette affinité, mise en évidence pour la première fois, permet d’envisager l’utilisation de ces analogues synthétiques en tant qu’agents thérapeutiques. La seconde est dédiée à la détection d’une mutation ponctuelle (SBM) au niveau d’un gène codant pour l’Apolipoprotéine E (ApoE). Outre la possibilité de discriminer une complémentarité totale ou partielle d’une non complémentarité, les biocapteurs SH-SAW ont également montré qu’ils étaient sensibles aussi bien à la nature qu’à la position d’une mutation dans une séquence ADN considérée.

ABSTRACT. SH-SAW piezoelectric sensors are suitable for biological investigations, as clearly demonstrated here through two specific applications. The first one concerns the hybridization between oligonucleotides and tetranucleotide analogues having a triazole as internucleoside link. Their affinity, established for the first time, allows to consider these synthetic analogs as potential therapeutic agents. The second use of the SH-SAW biosensor investigates the detection of a single base mismatch (SBM) in synthetic oligonucleotides and single nucleotide polymorphism ApoE, in real clinical genotypes. Besides the ability to discriminate fully

2 . Volume 1 – n° 1/2012 Biocapteurs ADN à ondes acoustiques de surface

matched DNA sequences from mismatched ones, the developed piezoelectric biosensors are also sensitive to both the nature and the position of the SBM.

MOTS-CLES : Capteurs SH-SAW ; ADN ; Analogues d’oligonucléotides ; greffage et hybridation d’ADN ; Détection de mutation ; Polymorphisme de l’Apolipoprotéine E.

KEYWORDS: SH-SAW sensor; DNA; oligonucleotides analogues; DNA grafting and hybridization; Mismatch detection; Apolipoprotein E polymorphism

DOI:10.3199/JESA.45.1-n © Lavoisier 2012 AR_DOI

Biocapteurs ADN à ondes acoustiques de surface 3

1. Introduction

Les capteurs à ondes acoustiques de surface à cisaillement horizontal (SH-SAW pour Shear Horizontal Surface Acoustic Waves), ont tout d’abord été utilisés en milieux gazeux, avant de montrer leur potentiel pour la détection d’espèces en solution (Andrä et al., 2008 ; Bender et al., 2014 ; Gizeli et Lowe, 2002 ; Hua et al., 2008 ; Malavé et al., 2006). Ils ont fait l’objet, et continuent encore, de nombreux développements, offrant ainsi de nouvelles perspectives pour identifier des substances jusqu’à aujourd’hui difficilement détectables. Leur principe de fonctionnement est fondé sur l’étude des variations des propriétés du milieu de propagation (atténuation de l’amplitude de l’onde acoustique et variation de sa vitesse de propagation). Leur versatilité est assurée par la diversité des couches chimiques et biologiques pouvant leur être associées. Ces couches, sensibles à une molécule ou à une famille de molécules, diffèrent selon les applications visées qui vont du dépistage de maladies (détection d’anticorps ou de protéines spécifiques, indicateurs de contamination bactérienne ou virale…), (Bergaoui et al., 2011 ; Hao et al., 2013 ; Rocha-Gaso et al., 2009), à la détection de contaminations dans l’environnement (pollution de l’air ou de l’eau par exemple) (Fertier et al., 2009 ; Jaffrezic, 2001 ; Mensah-Brown et al., 2012 ; Roh et al., 2004 ; Saha et al., 2003 ; Vivancos et al., 2012). Le greffage de ces couches spécifiques sur le trajet de l’onde acoustique, constitue donc une étape clé qui détermine et conditionne la qualité et les performances du capteur chimique ou du biocapteur envisagé.

Nous nous sommes engagés depuis près de dix ans dans cette thématique en plein essor, en concevant, réalisant et utilisant des capteurs SH-SAW (Bergaoui et al., 2009 ; Fourati et al., 2006 ; Fourati et al., 2009 ; Zerrouki et al., 2010-a). Le choix de ce genre de dispositifs a été essentiellement motivé par son potentiel pour la détection sans marquage de molécules chimiques ou biologiques, par sa grande sensibilité (confinement en surface de l’énergie transportée par l’onde) et par sa faible limite de détection (Josse et al., 2001). Parmi les différentes applications chimiques et biologiques que nous avons étudiées, nous nous sommes particulièrement intéressés à l’appariement d’acides désoxyribonucléiques (ADN). Cette étude, qui s’inscrit dans cette continuité thématique, relate le développement de deux biocapteurs SH-SAW pour la détection d’affinité entre ADN et analogues d’oligonucléotides synthétiques, ainsi que pour la détection de mutations singulières au niveau d’une seule base dans des séquences d’ADN spécifiques. Ces deux applications concernent le domaine de la santé avec les deux volets, diagnostic et thérapeutique.

Une présentation du design du dispositif et des chaînes de mesures associées, est faite en premier. Suit une partie dédiée à la caractérisation de la surface sensible du capteur SH-SAW, préalablement à sa fonctionnalisation pour en faire un biocapteur. Enfin, les différentes phases de reconnaissance entre des sondes greffées sur le capteur et des cibles à détecter (complémentaires ou potentiellement


complémentaires, présentes en solution) sont suivies en fonction du temps pour les applications concernées.

2. Biocapteur gravimétrique SH-SAW

2.1. Le Capteur physique

Le capteur SH-SAW objet de cette étude, est un capteur versatile fonctionnant aux alentours de 104 MHz. Il s’agit d’une ligne à retard réalisée sur un substrat piézoélectrique en tantalate de lithium (LiTaO3 36° rot), avec des peignes interdigités en Cr/Au (20 nm/80 nm) : double doigts de périodicité λ = 40 µm (Fig. 1a et b). Ces deux systèmes d’électrodes sont espacés d’une zone sensible métallisée (20 nm Cr/80 nm Au) de 8 mm de long, sur laquelle peuvent être greffées des couches chimiques ou biologiques selon l’application visée (Bergaoui et al., 2010 ; Fourati et al., 2010 ; Zerrouki et al., 2010-b). La métallisation de la zone centrale permet de favoriser la propagation d’un seul type d’onde de surface la LSAW (Leaky SAW) au dépens de la SSBW (Surface Skimming Bulk Wave).

Les capteurs sont réalisés en double lignes à retard pour permettre d’effectuer des mesures en mode différentiel. Indépendamment de leur utilisation future, ils sont systématiquement disposés dans un support métallique (Fig. 1c et d), conçu spécialement pour assurer un blindage et une robustesse mécanique.

(b)(a)

Peignes interdigités

Zone sensibleλ

Distance centre à centre : d

entrée sortie

(c) (d)

…

Figure 1. (a) Représentation schématique d’un capteur à ondes acoustiques de surface (de type ligne à retard). La périodicité λ des peignes et la distance centre à

centre d sont respectivement égales à 40 µm et 9,2 mm ; (b) photographie d’une puce avec deux capteurs ; (c) base du support mécanique avec emplacement du

capteur ; (d) système d’intégration complet du capteur dans un boitier métallique avec un circuit imprimé doté de pointes de contact pour déport des entrées et sorties

des deux voies de chaque capteur.


2.2. Les chaînes de mesure

2.2.1. Analyseur de réseaux

L’utilisation d’un analyseur de réseaux (Fig. 2) aussi bien pour le contrôle préalable des capteurs SAW, que pour le suivi des variations des propriétés du milieu situé au voisinage immédiat de la zone sensible, reste le moyen le plus répandu dans les laboratoires de recherche. Parallèlement à l’usage de cet appareil, nous avons ajouté deux méthodes en concevant deux chaines de mesures électroniques indépendantes, pour des détections en mode oscillateur et en mode impulsionnel.

Figure 2. Caractérisation électrique d’un dispositif SAW : mesure de la perte d’insertion en fonction de la fréquence

2.2.2. Montage oscillateur

Ce montage est constitué de deux oscillateurs indépendants suivis d’un mélangeur et d’un filtre passe bas (Fig. 3). Chaque ligne à retard est placée dans la boucle de contre réaction d’un amplificateur HF (à contrôle automatique de gain), qui assure la compensation des pertes d’insertion et entretient ainsi les oscillations du dispositif.


Mélangeur

Amplificateurs HFavec CAG

Coupleurs

directionnelsVoie de

référence

Voie de mesureavec couche sensible

Filtre passe bas

Fréquencemètre

Figure 3. Représentation schématique de la chaîne de mesure en mode oscillateur

2.2.3. Montage impulsionnel

Dans le cas du montage impulsionnel (Fig. 4), c’est la fréquence qui est maintenue constante, et le suivi des réactions se fait via les variations de la phase et/ou l’amplitude du signal de sortie du capteur. Pour cette électronique de mesure, le signal HF, délivré par un générateur, est modulé, via un amplificateur HF, par les signaux rectangulaires issus d’un générateur d'impulsions, avant d’être appliqué au capteur SAW (la fréquence des impulsions est de 10 kHz et leur durée est ajustée entre 1,5 et 2 µs). A la sortie du capteur, le signal est injecté au niveau d’un comparateur, qui en estimera les variations de phase et d’amplitude par comparaison au signal HF. Un intégrateur moyenneur, synchronisé sur le générateur d’impulsions, permettra de sélectionner le signal utile (selon son retard) et d’en envoyer la moyenne intégrée (sur une durée fixe) à un convertisseur analogique numérique.

AmplificateurHF

Voie de mesureCapteur SAW

Acquisition donnéesCAN

Générateurd’impulsions

Générateur HF

Intégrateur / moyenneur

Comparateurde Phase

Figure 4. Représentation schématique de la chaîne de détection en mode impulsionnel (le même circuit alimente également la seconde voie du capteur)


2.3. Fonctionnalisation de la surface sensible du capteur et système fluidique

2.3.1. Caractérisation de la surface de la zone sensible du capteur SH-SAW

Le passage du capteur physique au biocapteur SH-SAW, nécessite une étape clé de fonctionnalisation de sa zone sensible. Il convient donc de maîtriser cette étape pour garantir autant que possible sa reproductibilité. L’efficacité du nettoyage préalable de la surface, dépendant de la rugosité superficielle et des nature et quantité de contaminants, peut ainsi être contrôlée par microscopie à force atomique (AFM pour atomic force microscopy) et/ou par réflectométrie X à incidences rasantes (Tollens et al., 2004 ; Zerrouki et al., 2004). Lorsqu’on dispose d’outils de caractérisation de surface il devient relativement aisé de mener des études afin d’optimiser les procédures de nettoyage préparant la surface aux étapes de fonctionnalisation. La figure 5, représente un exemple d’images AFM (10×10) µm2, montrant l’efficacité du nettoyage.

(a) (b)

Figure 5. Images AFM représentatives de la surface de la zone sensible du capteur SH-SAW, a) avant et b) après nettoyage.

Une comparaison quantitative de ces deux images topographiques, pourrait se faire via un ou plusieurs paramètres statistiques. La hauteur quadratique moyenne (rms) Sq, la hauteur maximale des pics Sp, la profondeur maximale des vallées Sv nous ont semblés des plus pertinents pour notre application. Ces trois paramètres ont montré une diminution de 50%, 35% et 52% respectivement.

La microscopie à force atomique, une méthode locale, se révèle être un outil de choix pour la caractérisation de surface aux échelles nanométriques ; il peut d’ailleurs aussi servir pour vérifier l’état des peignes interdigités, leur périodicité ainsi que leur taux de métallisation (qui devrait être proche de 50%). Néanmoins,


l’aire restreinte des zones explorées nécessite un nombre élevé de mesures, distribuées sur la totalité de la zone sensible du capteur, pour que les résultats soient représentatifs de l’état de surface dans sa globalité. Il pourrait donc être intéressant de recourir en complémentarité, à une méthode de caractérisation globale telle que la réflectométrie X à incidences rasantes. C’est ce que nous avons entrepris pour caractériser la surface de nos capteurs.

Le mode le plus pertinent dans ce cas est le mode de réflectivité où l’intensité réfléchie spéculairement par la surface est relevée en fonction de l’angle d’incidence (entre le faisceau X incident et la surface analysée).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

100

Réf

lect

ivité

Angle d'incidence (°)

Figure 6. Relevé de réflectivité de la zone sensible du capteur SH-SAW

Deux informations importantes peuvent être extraites à partir des relevés de réflectivité effectuée sur la zone sensible du capteur SH-SAW (Fig. 6) :

– la rugosité rms globale, trouvée ici de l’ordre de 3 nm, en comparant les mesures à la réflectivité théorique d’une surface idéale, réduite d’un facteur de Debye-Waller (André, 1984) ;

– les épaisseurs des différentes couches, et ce en se basant sur les périodicités des franges de Kiessig ; ici les résultats confirment une épaisseur métallique Au/Cr de l’ordre de 112 µm.

Basé sur les études de caractérisation de surface, un protocole optimisé de fonctionnalisation de surface peut être défini et adopté pour tout autre capteur, réalisé dans les mêmes conditions et avec les mêmes matériaux.


2.3.2. Système fluidique associé au biocapteur

Dans le cadre de cette étude, le capteur envisagé est dédié à la détection d’espèces biologiques en solution. Nous avons donc utilisé un montage fluidique constitué d’une cuve en Kalrez (un polymère perfluoré biocompatible) de 1 mm d’épaisseur et d’une plaque en PMMA supportant les tubulures en téflon et permettant de fixer l’ensemble sur le capteur SAW. Les tuyaux en téflon sont reliés à une pompe péristaltique et permettent d’amener les différentes solutions au contact de la zone sensible du capteur (Fig. 7). Un couvercle métallique permet d’assurer l’assemblage des différentes parties de la cellule de mesure (le support métallique, le circuit imprimé et le montage fluidique. Cette dernière est ensuite placée sur un élément Pelletier, permettant de fixer la température, et l’ensemble est disposé dans un boitier métallique assurant un blindage électromagnétique (Fig. 7).

Figure 7. Vue d’ensemble des différentes parties du système d’intégration du capteur avec le support mécanique et le circuit fluidique.

2.3.3. Fonctionnalisation de la zone sensible du capteur SH-SAW

Le passage du capteur physique au biocapteur SH-SAW, passe par une étape de fonctionnalisation de la surface de sa zone sensible. Nous avons opté pour une procédure simple et reproductible qui consiste à greffer des ADN sondes thiolées, sur la zone sensible en or. Nous mettons ainsi à profit l’affinité naturelle entre l’or et


le soufre des groupements thiols. La zone sensible du biocapteur est dans un premier temps "lavée" avec une solution piranha (98% H2SO4/30% H2O2 3 :1, V/V) pendant 30 minutes. Elle est ensuite rincée avec de l’eau bidistillée. Le dispositif SAW est ensuite placé dans la cellule de mesure (Fig. 7) pour une utilisation en milieu liquide. Toutes les mesures sont réalisées à température ambiante. Une solution de chlorure de sodium (0.3 M) est injectée à l’aide d’une pompe péristaltique (Gilson) avec un débit constant, habituellement de l’ordre de 0,19 mL/min. Après stabilisation du signal, les ADN sondes sont introduits dans le circuit fluidique et leur greffage sur l’or peut ainsi être suivi en fonction du temps (voir Fig. 10, paragraphe 3.1), Cette étape validée, la solution de chlorure de sodium dans laquelle s’est effectué le greffage des sondes est drainée puis remplacée par une solution dans laquelle pourra se faire l’hybridation sondes/cibles. Dans notre cas, il s’agit d’une solution d’HEPES (acide 2-[4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine]éthanesulfonique).

3. Capteurs d’ADN en diagnostic et applications médicales innovantes

3.1. Les analogues d’oligonucléotides à visées thérapeutiques

La structure spatiale de l’acide désoxyribonucléique (ADN) est formée de deux chaines polynucléotidiques (haut polymère linéaire) complémentaires et antiparallèles. Les bases azotées reliées à deux squelettes pentose-phosphate se font face et s’apparient deux-à deux, adénine/thymine et guanine/cytosine, principalement par des liaisons hydrogène, formant ainsi un édifice hélicoïdal stable (Fig. 8). Les séquences de ces bases, support de l’information génétique, déterminent celles des acides aminés des protéines ainsi que celles des molécules d’ARN.


5’

3’

G

A

C

T

3’

5’

C

T

G

A

…

Figure 8. Structure de l’ADN naturel et représentations schématiques des quatre paires de bases.

Au-delà du séquençage des oligonucléotides, c’est leur utilisation dans la discipline thérapeutique et les disciplines connexes qui suscite l’intérêt. Depuis quelques dizaine d’années, les chercheurs se sont ainsi tournés vers l’utilisation de nucléotides à séquences spécifiques en tant qu’agents thérapeutiques (Lucas, 2009). Dans cet objectif, plusieurs stratégies d’utilisation des oligonucléotides ont été envisagées :

– l’approche "aptamère" où les oligonucléotides sont sélectionnés pour leur affinité structurale vis-à-vis d’une cible protéique ou un ARN ;

– l’approche "ribozyme" où les oligonucléotides ciblent l’ARN catalytique ;

– l’approche "sens" où les cibles sont certaines protéines possédant une affinité spécifique pour une séquence d’ADN ou d’ARN ;

– l’approche "antisens" où les oligonucléotides peuvent cibler l’ARN messager afin d’empêcher sa traduction.

Ces oligonucléotides sont toutefois confrontés à une rapide dégradation in vivo par des enzymes. Afin de remédier à cette fragilité, la synthèse d’analogues d’oligonucléotides a souvent été envisagée. Ces analogues à visées thérapeutiques


sont de courtes séquences de nucléotides (10 à 30 bases), dont la stabilité est améliorée en substituant les liaisons phosphodiesters, entre le sucre et la base, par des liaisons plus résistantes. La synthèse de tels polymères nécessitant plusieurs étapes réactionnelles, il devient donc primordial de s’assurer que les couplages internucléosidiques retenus soient efficaces ; notamment en termes d’affinité avec des ARN et/ou des ADN simples ou doubles brins complémentaires. Les oligomères que nous avons synthétisées dans ce cadre possèdent comme lien internucléosidique, une unité triazolique (Fig. 9) (Lucas et al., 2010). Un dimère (n=0), un trimère (n=1) et un tétramère (n=2) ont été synthétisés. Avant d’envisager la synthèse d’analogues d’oligonucléotides avec un plus grand nombre de bases, il importait déjà à ce stade de vérifier si les tétrathymidines synthétisés présentaient une complémentarité avec des oligonucléotides naturels. C’est un préalable si l’on souhaite utiliser ces macromolécules en tant qu’agents thérapeutiques antisens par exemple. C’est ce qui a été entrepris en utilisant les capteurs SAW associés à une chaîne de mesure en configuration oscillateur.

Figure 9. Oligonucléosides possédant une unité triazolique en tant que lien internucléosidique se substituant aux liaisons phosphodiesters.

3.2. Reconnaissance entre ADN et analogues d’oligonucléotides

Les séquences de brin d’ADN sondes ont été choisies de manière à avoir une répartition uniforme tout le long de la chaine, des séquences -AAAA-, et ainsi pouvoir tester les oligothymidines (n = 0 à 2). Avant cela, il fallait déterminer la réponse du biocapteur dans le cas d’une reconnaissance entre ADN complémentaires. Les séquences des ADN sondes et cibles utilisées sont les suivantes :

- Sonde : H-S-(CH2)6-5’-CCC CTT TTA AAA CAC TAA AAG GTC CTA AAA ACCTAA AAA CCT-3’.

- Cible : 5’-AGG TTT TTA GGT TTT TAG GAC CTT TTA GTG TTT T-3’.

La première étape a été la fixation des sondes sur la zone sensible du capteur. Ce greffage, fait selon la procédure présentée dans le paragraphe 2.3.3, a été


systématiquement suivi en fonction du temps (Fig. 10) dans nos différentes applications. Dans le cas présenté, l’introduction des sondes dans le circuit fluidique, une fois le signal de sortie du capteur stabilisé, engendre un décalage de fréquence de l’ordre de (840 ± 12) Hz. La fonctionnalisation du capteur SAW réussie, la solution de chlorure de sodium est drainée puis remplacée par une solution d’HEPES. Une fois le signal de sortie du biocapteur stabilisé, les ADN cibles sont injectés dans le circuit. Le suivi de l’hybridation cibles/sondes (Fig. 10) montre là aussi un décalage de fréquence de l’ordre de (590 ± 10) Hz avec une cinétique caractérisée par une constante de temps d’environ 500s, deux fois moindre que celle correspondant au greffage des sondes (de l’ordre de 1000s). Des injections supplémentaires d’ADN cibles (sans régénération du biocapteur), permettent de s’assurer de l’absence d’ADN sondes libres accessibles (absence de décalage de fréquence suite aux différentes injections).

Pour pouvoir régénérer le biocapteur, nous devons déshybrider le complexe sondes/cibles. Pour cela nous avons utilisé une solution d’hydroxyde de sodium à 0,1 M, que nous avons fait circuler en circuit ouvert sur la surface sensible du biocapteur pendant 1 heure. Le biocapteur et le circuit fluidique sont ensuite rincés à l’eau déionisée bidistillée pendant 1 heure avant réutilisation. Dans de précédents travaux nous avons montré qu’il était possible de régénérer un biocapteur SAW jusqu’à une dizaine de fois sans perte de spécificité mais avec toutefois une diminution progressive de la sensibilité (diminution cumulée de l’ordre de 40% pour la 10ème régénération) (Zerrouki et al, 2010-b). Cette baisse de sensibilité devra être prise en compte lors de comparaisons entre hybridations successives.

0 500 1000 1500

-800

-600

-400

-200

0

Hybridation sondes/cibles

Greffage des sondes

Var

iatio

n de

fré

quen

ce [H

z]

Temps [s]

Figure 10. Variation de la fréquence du système en fonction du temps, au cours du greffage des sondes ainsi que lors de l’hybridation des cibles avec les sondes

greffées.


Pour tester la complémentarité entre les ADN sondes et les tétranucléosides, nous avons utilisé le même capteur (après régénération) et procédé de la même façon que précédemment. Les essais menés avec cet analogue ont montré qu’il présentait bien une affinité vis-à-vis des ADN sondes, et que la cinétique d’hybridation est comparable à celle de l’hybridation des ADN cibles (Fig. 11).

0 200 400 600 800

-100

-50

0

Var

iatio

n no

rmal

isée

de

fréq

uenc

e [%

]

Temps [s]

ADN Analogues

Figure 11. Variation normalisée de la fréquence du système au cours du temps, lors de l’hybridation des cibles, ADN et analogues d’oligonucléotides, avec les sondes

ADN greffées.

Une comparaison quantifiée des valeurs absolues des décalages de fréquence, ne peut se faire qu’en tenant compte i) de l’ordre de l’essai (nombre de régénérations) et ii ) du nombre de bases contenus dans les cibles. Si pour la première condition il suffit de faire les essais après un nombre de régénérations comparable, pour la seconde, il faudrait plutôt raisonner en termes de taux d’hybridation τ, qui représente le pourcentage de brins ADN cibles qui se sont hybridés par rapport au nombre de brins sondes disponibles, tout en tenant compte du nombre de bases.

hybridation sonde

greffage cible

f M

f Mτ =

∆ ×∆ ×

(1)

Msonde et Mcible étant les masses molaires des sondes et des cibles respectivement.

Les taux d’hybridation calculés après un nombre comparable d’essais successifs valent 28% dans le cas des ADN cibles et 29% pour les tétranucléosides. Ces taux peuvent être considérés comme identiques compte tenu des incertitudes des mesures.


Ces essais de complémentarité nous ont donc permis pour la première fois de mettre en évidence l’hybridation entre un oligonucléotide et un analogue tétranucléotidique que nous avons synthétisé. En dépit d’un nombre d’atomes d’une unité triazolique supérieur au cas du lien phosphodiester, il apparait qu’il y a suffisamment d’espace et de flexibilité dans ce nouveau lien internucléosidique pour permettre une hybridation avec les bases adénines complémentaires.

3.3. Vers la détection d’une mutation au niveau d’une seule base : effet de sa position et de sa nature

L'identification précise d’une mutation même ponctuelle, c'est-à-dire n’affectant qu’une seule base (SBM pour Single Base Mismatch) dans les séquences d'ADN est d’une grande d'importance dans des domaines aussi variés que la résistance médicamenteuse, le diagnostic, l’étude de phénotype/génotype, … Les techniques, dites classiques, comme le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP), l'hybridation inverse (RH), la polarisation de fluorescence (FP) sont toutes des méthodologies robustes, fiables et capables de discriminer un SBM. Elles sont cependant onéreuses, consommatrices de temps, et nécessitent de grandes quantités d’ADN. Un des challenges actuels est donc l’utilisation de biocapteurs pour la détection des SBM sans marquage et/ou amplification préalables. Un travail pionnier est relativement complet dans cette thématique a été réalisé par Tombelli et al en 2000, utilisant une QCM en quartz coupe AT, fonctionnant à 10 MHz. Quant à la première étude utilisant un capteur SH-SAW pour la détection d’un SBM dans des fragments d'ADN, elle a été rapportée par Xu et al en 2012. Il a toutefois fallut recourir à une amplification enzymatique préalable pour que le capteur, utilisé dans un montage résonateur double port fonctionnant à 100 MHz, puisse discerner un SBM d’une complémentarité parfaite.

Dans cette partie nous nous sommes intéressés à une séquence d’ADN correspondant à un gène codant pour l’Apolipoprotéine E (ApoE), une protéine impliquée dans plusieurs pathologies humaines (maladies neurodégénératives, cardiovasculaires et métaboliques). La détermination de son génotype permet donc non seulement de diagnostiquer avec précision la nature de la maladie concernée, mais aussi et surtout de la prédire suffisamment tôt pour augmenter significativement les chances de succès des traitements préconisés.

3.3.1. Détection d’une mutation ponctuelle dans une séquence d’ADN

Signalons tout d’abord qu’on peut distinguer trois isoformes majeurs pour l’ApoE, E2, E3 et E4, qui sont liés à deux sites polymorphes situés sur les codons 112 et 158 du gène situé sur le chromosome 19. Il en résulte une combinaison de six génotypes possibles (trois homozygotes E2E2, E3E3 et E4E4, et trois hétérozygotes E2E3, E2E4 et E3E4) correspondant à six phénotypes protéiques différents.


Comme évoqué précédemment, le choix de la séquence ADN se fait selon le but visé. On se limitera dans cet article à quelques résultats significatifs, correspondant au biocapteur fonctionnalisé avec une sonde, dont la séquence contient une partie du codon 158. Pour davantage de détails, et notamment ceux relatifs aux sites polymorphes situés au niveau du codon 112, on pourra se référer aux travaux de Z. Mazouz (Mazouz et al., 2013 ; Mazouz., 2014). Ceci nous a permis de réaliser des tests avec les génotypes E3E3, E4E4 et E3E4, qui lui sont parfaitement complémentaires, les génotypes E2E3 et E2E4, qui présentent chacun un brin parfaitement complémentaire et un ayant un SBM, et enfin avec le génotype E2E2 qui est formé de 2 brins présentant chacun un SBM.

Pour cette application, Le capteur gravimétrique SH-SAW a été intégré dans une chaîne de mesure impulsionnelle. C’est donc via la mesure des variations temporelles de la phase Φ du signal de sortie, à une fréquence donnée de l’ordre de 103 MHZ, que se fera le suivi des différentes réactions (greffages et hybridations) se produisant sur la surface sensible du capteur. Le biocapteur réalisé a d’abord été testé avec des ADN cibles parfaitement complémentaires de la sonde, qu’on appellera synthétiques dans la suite ce paragraphe, avant d’être utilisés pour détecter les polymorphismes génétiques de l’ApoE dans des ADN extraits du sang humain et amplifiés par PCR (ADN naturels). Toutes les expériences ont été répétées au moins 5 fois pour avoir une estimation des incertitudes de nos mesures. Afin de comparer nos différentes mesures, les résultats seront exprimés en termes de taux d'hybridation τ (éq. 1).

Pour les cibles synthétiques, les taux calculés sont de 88% et 75% respectivement pour des cibles parfaitement complémentaires et celles présentant un SBM.

Suite à ces premiers résultats qui montrent la capacité du biocapteur SAW de distinguer une complémentarité totale d’une complémentarité partielle, nous avons testé les ADN naturels. Les résultats de ces mesures sont présentés dans la figure 12.


E4E4 E3E2 E2E20

2

4

6

8

10

Taux

d'h

ybrid

atio

n (%

)

Différents génotypes testés

Figure 12. Valeurs des taux d’hybridation pour différents génotypes présentant : deux brins parfaitement complémentaires (E4E4), un brin complémentaire et l’autre

avec un SBM (E3E2), et deux brins ayant chacun un SBM (E2E2).

On remarque qu’en dépit d’une diminution significative des taux d’hybridation, par rapport aux échantillons synthétiques, la discrimination entre échantillons selon leur complémentarité à la sonde, est toujours possible sans ambigüité. Ces résultats ont d’ailleurs été confirmés par des mesures électrochimiques (Mazouz et al., 2013). Néanmoins, cette baisse importante des taux d’hybridation laisse entrevoir toute la difficulté d’une détection en milieux réels, pour laquelle il s’agira de déterminer tous les facteurs d’influence et de tenir compte, dans l’interprétation de la réponse du capteur, des éventuels interférents présents en solution. Outre une détection combinant plusieurs modes de transduction, gravimétrique et électrochimique par exemple, il serait notamment important d’élucider l’effet de la position et de la nature de la base impliquée dans une mutation ponctuelle (SBM).

3.3.2. Effet de la position et de la nature de la base dans une mutation ponctuelle

Ayant réussi à détecter les mutations au niveau d’une seule base, nous avons entrepris d’étudier l’effet de le nature et de la position de la mutation dans la séquence ADN. Signalons à ce niveau que plusieurs études électrochimiques ont conclu à une meilleure détection d’un SBM quand il est placé au milieu plutôt qu’à l’extrémité d’une séquence (Ahangar et Mehrgardi, 2011 ; Shamsi et Kraatz, 2010) ; Zhang et al, 2012).

Nous avons choisi de suivre l’hybridation de cette sonde avec plusieurs types de mismatch (SBM) impliquant la guanine "G" (GG, GA et GT) situés soit au milieu soit à l’extrémité de la séquence.


Le détail des séquences étudiées est donné ci-après, où les SBM sont signalés en gras et soulignés. Notons que la lecture se fait comme suit : ATC/TGG � 5'ATC3' hybridé avec 3'TGG5'.

CGC/GAG 3'- GTG ACG GTC CGA GAA GAC GTC CA-5' (GA au milieu de la séquence)

CGC/GGG 3'-GTG ACG GTC CGG GAA GAC GTC CA-5' (GG au milieu de la séquence)

AGG/TTC 3'-GTG AGG GTC CGC GAA GAC GTT CA-5') (GT à la fin de la séquence)

AGG/TAC 3'-GTG ACG GTC CGC GAA GAC GTA CA-5' (GA à la fin de la séquence)

AGG/TGC 3'-GTG ACG GTC CGC GAA GAC GTG CA-5' (GG à la fin de la séquence)

La Figure 13 représente les variations du taux normalisé d’hybridation en fonction de la nature et de la position de la mutation ponctuelle relative à la guanine. Les valeurs de ces taux varient de façon plus ou moins importante selon la nature et la position du mismatch. Les mutations en milieu de séquence semblent toutefois donner lieux à des valeurs plus élevées en moyenne, comparées à celles trouvées pour une mutation située en extrémité de séquence. On remarque également que les taux d’hybridations restent globalement inférieurs à 60%, excepté le mismatch GT en milieu de séquence, pour lequel on trouve un taux normalisé de l’ordre de 85%. Ceci pourrait être dû au fait que la thymine est, tout comme la cytosine, une base pyrimidique, et qu’un tel désappariement induit moins de désaccord structural en milieu de séquence.


0

20

40

60

80

100

Complémentarité parfaite Mutation en milieu de séquence Mutation en fin de séquence

G-T G-TG-A G-AG-G G-GG-C

Taux

d'h

ybrid

atio

n no

rmal

isé

(%)

Nature de la mutation

Figure 13. Variations des taux d’hybridation en pourcent selon la nature et la position de la mutation ponctuelle.

Nous avons alors reproduit les mêmes expériences avec de nouvelles cibles où la mutation ponctuelle (par rapport à la sonde 2) placée en début de séquence était relative à la cytosine.

La Figure 14 illustre les variations du taux normalisé d’hybridation en fonction de la nature de la mutation ponctuelle, pour la base purique "G" et pour la base pyrimidique "C". Tout comme les précédentes mesures, les valeurs trouvées varient de façon plus ou moins importante, sans qu’une hypothèse plausible simple puisse être avancée selon uniquement la nature des bases impliquées.


0

20

40

60

80

100

Complémentarité parfaite Mutation par rapport à la base C Mutation par rapport à la base G

C-C G-TC-T G-AC-A G-GG-C

Taux

d'h

ybrid

atio

n no

rmal

isé

(%)

Nature de la mutation

Figure 14. Variations des taux d’hybridation en pourcent selon la nature d’une mutation ponctuelle en extrémité de séquence, pour les bases C et G.

Pour une mutation ponctuelle, la réponse du biocapteur, en termes de taux d’hybridation dépend aussi bien du type de mutation que de sa position. A cela s’ajoutent également la contribution des bases qui encadrent le mismatch (SantaLucia et al, 1996). C’est probablement sur la base du modèle des plus-proches voisins, que nous avons jugé suffisamment fiable pour prévoir la stabilité des brins d'ADN, que nous pourrons établir une approche pour interpréter nos résultats gravimétriques, et dégager une hypothèse de travail pour nos recherches futures dans cette thématique.

Allaoui et SantaLucia (1997) ont montré dans une de leurs études que le trimère CGC/GTG, est le plus stable de point de vue thermodynamique. Dans une autre étude (1998), ces mêmes auteurs ont pu estimer les variations d'enthalpie libres pour 16 séquences de trimères uniques contenant le mismatch GA. Ils ont constaté que la séquence CGC/GAG placée en fin de séquence est plus stable que celle placée au milieu.

Les résultats de ces deux études sont en parfait accord avec nos mesures. En effet, et comme on peut le remarquer sur la figure 13, le taux d’hybridation le plus important est celui correspondant au désappariement GT, placé au milieu des séquences de nos ADN cibles. D’un autre côté, et toujours en concordance avec les deux études citées, les valeurs de taux d'hybridation du mismatch GA sont plus élevée pour une position en milieu de séquence qu’à son extrémité.

Pour le dernier type de mismatch, GG, il a été étudié par plusieurs groupes, notamment par Peyret et al. (1999), qui dans une étude comparative des SBM AA, CC, GG et TT, concluent à une plus grande stabilité du trimère GGC/CGG placé au


milieu de la séquence. En ne considérant que le mismatch, GG, ce résultat est en accord avec les valeurs des taux normalisés d’hybridation que nous avons trouvés (Fig. 13). En revanche, en nous intéressant à une autre base, la cytosine, nous avons trouvé que le mismatch CC placé en début de séquence pouvait présenter un taux d’hybridation supérieur à ceux du mismatch GG placé en fin ou en milieu de séquence. Même si nos résultats sont majoritairement concordants avec ceux des principales études menées dans ce champ d’investigation, quelques différences subsistent. Ceci montre clairement toute la complexité de la reconnaissance entre brins ADN, qui peut avoir lieu en dépit d’une complémentarité imparfaite au niveau d’une ou plusieurs bases. D’autres investigations futures, impliquant différents modes de transduction en complèmentarité, devraient nous permettre d’élucider quelques parties de ce mécanisme complexe de reconnaissance entre brin d’ADN.

Néanmoins, nous pouvons noter le potentiel des capteurs SH-SAW non seulement pour discriminer parfaitement une complémentarité parfaite d’une complémentarité partielle ou d’une non complémentarité, mais également pour différencier les réponses des capteurs selon la nature et la position de la mutation dans la séquence ADN considérée.

4. Conclusion

Nous avons montré dans cet article tout le potentiel offert par les capteurs à ondes acoustiques de surface SH-SAW. Leur utilisation en tant que capteur chimique ou biocapteur nécessite une fonctionnalisation maitrisée de leur surface sensible. Deux applications innovantes, pouvant s’incérer dans une chaîne incluant la prévention, le diagnostic et le traitement, ont été présentées. La première, qu’on pourrait situer en amont, concerne la détection d’une mutation ponctuelle (SBM) au niveau d’un gène codant pour l’Apolipoprotéine E (ApoE). Dans ce cadre les biocapteurs SH-SAW ont montré leur potentiel non seulement pour discriminer parfaitement une complémentarité parfaite d’une complémentarité partielle ou d’une non complémentarité, mais également pour différencier les réponses des capteurs selon la nature et la position de la mutation dans la séquence ADN considérée. Ce qui ouvre la voie vers un diagnostic rapide et efficace de pathologies humaines en déterminant la présence de mutations au niveau de gènes bien identifiés. La seconde application présentée, pouvant être située en aval, concerne la possibilité pour des analogues oligonucléotides de présenter une affinité aux oligonucléotides complémentaires. Les suivis d’hybridations nous ont permis de mettre en évidence, pour la première fois, une affinité entre un brin naturel d’oligonucléotide et un analogue de tétranucléotide synthétisé, présentant un lien triazolique au lieu du lien phosphodiester. Ce résultat encourageant permet d’envisager l’utilisation de ces analogues synthétiques en tant qu’agents thérapeutiques, dans une stratégie "sens" ou "antisens" par exemple.

Notons que si l'hybridation entraîne bien une variation de masse, parfaitement détectée par les capteurs SH-SAW, elle engendre aussi des modifications de conformation dans la couche proche de la surface sensible ainsi que des variations


de ses propriétés diélectriques. Ceci montre tout l’intérêt de pouvoir disposer d’un mode combiné de transductions, sensibles à des paramètres différents, pour suivre un phénomène de reconnaissance chimique ou biologique. C’est ce que nous avons entrepris de réaliser en adaptant notre capteur SAW de façon à combiner les deux modes, gravimétrique et électrochimique, pour une détection simultanée (Lattach et al, 2011 ; Lattach et al, 2012).

Remerciements

Les auteurs adressent leurs sincères remerciements aux anciens de l’équipe de Physique du Cnam, Messieurs Jean-Marie Fougnion, Alain Changarnier et Patrick Lepeut, pour leur contribution à une partie de ces recherches ainsi que pour leur assistance technique et les réalisations mécaniques et électroniques lors des premiers essais. Ils souhaitent également présenter tous leurs remerciements au Professeur A. Ommezine et au Docteur L. Rebhi, pour leur contribution à la partie de l’étude concernant les mutations génétiques. Les remerciements d’une partie des auteurs vont également à Madame Françoise Le page et à Monsieur Félix Nal pour leur assistance tout au long de ces recherches.

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Biocapteurs SH-SAW. ADN et analogues, vers une discrimination de fragments courts et de mutations

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