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Contenido Bacterias Sulfato Reductoras en Pozos Petroleros Colombianos ................................................... 2

Ciclo del azufre ........................................................................................................................... 2

Hábitat, avinagramiento y corrosión ......................................................................................... 4

Diversidad ................................................................................................................................... 7

Métodos de control contra SRB ............................................................................................... 10

Detección de SRB ...................................................................................................................... 11

Aislamiento de SRB .................................................................................................................. 12

Panorama de las SRB en Pozos Petroleros Colombianos ....................................................... 14

Conclusiones ............................................................................................................................. 16

Apéndice 1 – Compuestos sulfurados presentes en petróleo. ............................................... 18

Apéndice 2 - Parámetro 𝜷. ....................................................................................................... 19

Apéndice 3 - Microorganismos aislados de campos petroleros. ............................................ 20

Apéndice 4 - Método de Pankhurst. ........................................................................................ 21

Apéndice 5 - Medio de cultivo en H2 ....................................................................................... 22

Agradecimientos ...................................................................................................................... 23

Bibliografía................................................................................................................................ 24

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Bacterias Sulfato Reductoras en Pozos Petroleros Colombianos

Ciclo del azufre

El azufre es el sexto elemento más abundante en la tierra. Se encuentra naturalmente en

minerales, principalmente pirita (FeS2) y aljez (CaSO4), en moléculas gaseosas como dióxido de

sulfuro (SO2) o sulfuro de hidrógeno (H2S) y en el agua en especies químicas tales como sulfato

(SO4-2) o ácido sulfhídrico (HS-). El azufre existe en estados de oxidación de +2 hasta -6, lo que lo

hace un elemento altamente reactivo y lo que le permite a una gran variedad de

microorganismos no solo incorporarlo en sus componentes celulares sino también utilizarlo para

transformaciones energéticas (Jan P. Amend, 2004). Anualmente 120Tg de azufre son extraídos

por el ser humano de la litósfera en forma de combustibles fósiles y materiales crudos para la

industria química. De estos 120Tg de azufre, el 60% es emitido a la atmosfera con productos de

combustión fósil, mientras que el 40% restante regresa directamente a ríos por aguas de cañería

y productos de fertilización agrícola. Paralelamente al azufre obtenido antropomórficamente, los

gases volcánicos contribuyen marcadamente al ciclo de azufre atmosférico donde el flujo es de

aproximadamente 29Tg/año. La mayor transferencia de azufre de los continentes a los Océanos

es debido a los vertidos de los ríos con una carga de 224Tg, donde el azufre por contaminación

antropomórfica representa 109Tg. El flujo total de varias formas de azufre (ej. orgánica, sulfato,

pirita) desde el mar a sedimentos y hacia la litósfera es de 130Tg/año. Por lo tanto, el flujo

antropomórfico de azufre a la atmosfera y a la hidrosfera llegan a un nivel comparable con el

flujo natural del elemento (Ivanov, 1981).

Los microorganismos tienen un papel muy importante en la transformación del azufre. El sulfato

es atrapado y reducido a sulfito, el cual es incorporado a algunos aminoácidos y a enzimas. Las

reacciones de óxido-reducción para la generación de energía metabólica son también

importantes, tal como la oxidación del azufre por bacterias quimiolitótrofas y la reducción de

sulfato por bacterias sulfato reductoras (SRB) (Gerard Muyzer, 2008). En el ciclo biológico del

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sulfuro, el sulfato es reducido a sulfito por microorganismos sulfato reductores y estos a su vez

proveen sustratos a bacterias que oxidan el sulfito, por medio de la vía de sulfuro elemental, de

nuevo a sulfato. En la reducción asimilatoria, el azufre presente en el sulfato pasa por el nivel de

oxidación de sulfito y llega a ser incorporado a amino ácidos en forma de proteína microbiana.

Una vez que la cadena trófica culmina, el azufre es eventualmente retornado al ciclo como sulfito,

formado durante la descomposición y putrefacción de los organismos (Postgate, 1981).

Figura 1. Ciclo biológico del azufre. Figura adaptada de The Sulfate-Reducing Bacteria, por

Postgate.

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Hábitat, avinagramiento y corrosión

El análisis químico de moléculas inorgánicas de rocas geológicamente antiguas indica que rocas

sedimentarias de hace 3.8Ga (Giga annum) no muestran discriminación de 34S sobre 32S en

compuestos sulfurados. Este hallazgo es interpretado como la falta de reducción biológica de

sulfato. Enriquecimientos de 32S fueron, sin embargo, detectados en rocas de hace 3.47Ga

indicando la antigüedad de la reducción microbiana del sulfato. Los depósitos sedimentarios

muestran más 32S, ya que las bacterias tienden a reducir más fácilmente compuestos con el

isotopo liviano (Emsley, 2001). Todo el sulfato presente en la tierra temprana fue probablemente

generado fotoquímicamente por SO2 volcánico y H2S en la atmosfera. Toda la evidencia

disponible indica que las primeras SRB evolucionaron antes que las cianobacterias y, por lo tanto,

la reducción desasimilatoria de sulfato surgió antes que la fotosíntesis con oxígeno, la cual ocurrió

hace 2.3-2.2Ga. Dado que la reducción desasimilatoria de sulfato es inhibida por la presencia de

oxígeno, las SRB pueden crecer a expensas de sulfato solo en la completa ausencia de oxígeno.

Las SRB son por lo tanto consideradas microorganismos estrictamente anaerobios y se

encuentran principalmente en hábitats anóxicos ricos en sulfato (Larry Barton, 2007).

Estas condiciones son típicas de los sedimentos marinos, ya que el agua oceánica es rica en

sulfato, con concentraciones hasta de 30mM. Las SRB están también presentes en sedimentos

de aguas frescas, donde la concentración de sulfato es usualmente menor a 1mM, pero se

mantiene continuamente a ese nivel debido a la reoxidación del H2S a SO4-2 en la interface

oxigenada/anóxica por la acción de bacterias quimiolitótrofas y fotolitótrofas (Marianne Holmer,

2001). En la industria petrolera, la inyección de agua en yacimientos para la recuperación de

petróleo está usualmente acompañada por avinagramiento. El agua contiene altos niveles de

sulfato, ya que se tiende a utilizar agua de mar o reciclada para la recuperación de los

hidrocarburos. Avinagramiento se refiere al aumento de la concentración de compuestos

sulfurados en el crudo. El abrupto incremento de sulfato en el yacimiento permite la reducción

bioquímica de SO4-2 por las SRB y, por consiguiente, un incremento en H2S (Yasunori Tanji, 2014).

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La lista de compuestos sulfurados presentes en el petróleo se encuentra en el Apéndice

1.

Pese a que no han sido publicados estudios sobre el efecto total de H2S en la industria petrolera,

existen análisis individuales sobre casos con pérdidas de hasta diez millones de dólares por

evento (Bhagobaty, 2014). Un pozo petrolero que produce H2S se le denomina avinagrado, en

contraste al pozo dulce, que no lo produce. Sin embargo, bajas concentraciones de H2S, hasta

alrededor de 3 partes por millón por volumen (ppmv), son típicamente benignos e incluso

beneficiosos para el pozo. Por lo tanto, cuando se hable de avinagramiento, se considera que la

cantidad de H2S sobrepasa el umbral de 3ppmv. Esta concentración es medida típicamente en

fase gaseosa relativa a la partición de la fase acuosa con pH 5 a temperatura y presión estándar.

Del mismo modo, la corrosividad del agua producida en un yacimiento de petróleo puede

cambiar con el tiempo. Esto es particularmente evidenciado en zonas petroleras que inicialmente

eran dulces, pero que con el paso del tiempo llegan a producir H2S hasta en miles de ppmv en

fase gaseosa. Mientras que el dióxido de carbono puede causar corrosión severa en acero, la

corrosión por H2S es localizada y puede producir corrosión por tensofisuración por sulfito (SSCC,

por las siglas en ingles de sulphide stress corrosion cracking), fragilización por hidrogeno (HE, por

las siglas en ingles de hydrogen embrittlement), fisuración inducida por hidrogeno (HIC, por las

siglas en ingles de hydrogen induced cracking) o inducción de tensofisuración orientada por

hidrogeno (SOHIC, por las siglas en ingles de stress orientated hydrogen induced cracking). Por lo

tanto, al incrementar H2S no necesariamente causa un incremento en la tasa de corrosión, pero

si conlleva a diversos materiales a fallar en sitios específicos, usualmente en infraestructuras

metálicas (Bob Eden, 1993).

Cuando el H2S se disuelve en agua, se torna en un ácido débil, lo que lo convierte en una fuente

de iones de hidrógeno y corrosivo. Los productos de corrosión son sulfuro de hierro (FeS) e

hidrógeno molecular (H2). En los oleoductos y tuberías de acero, el sulfuro de hierro forma una

escama que a bajas temperaturas puede actuar como barrera para disminuir la corrosión. En

altas temperaturas la escama corrosiva es catódica con relación al marco del material y la

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corrosión galvánica comienza. En presencia de iones de cloruro y a temperaturas superiores de

150°C la corrosión de cuello de ganso ocurre, la cual puede mantenerse bajo gruesos pero

porosos depósitos de sulfuro de hierro. El cloruro forma una capa de cloruro de hierro (FeCl2), la

cual es acida y previene la formación de una capa de FeS directamente en el acero corroído,

permitiendo que la reacción anódica continúe. El hidrógeno producido causa fragilización por

hidrogeno (Brondel, 1987 ).

La corrosión del hierro es la tendencia del metal a dar electrones de acuerdo a la reacción

Fe0 Fe+2 + 2e-, E°= -0.47V, donde E° es el potencial estándar de óxido-reducción. Los iones

ferrosos hidratados se disuelven en solución solo mientras los electrones son removidos por un

reactivo químico apto. El reactivo más común en la corrosión de hierro es el oxígeno molecular

con E°= 0.81V. La corrosión de hierro en ambientes oxigenados conlleva a la formación de varios

tipos de óxidos. En la ausencia de oxígeno, por otra parte, el aceptor de electrones más común

para la oxidación de hierro son los protones disociados de las moléculas de agua. En este caso, la

reacción catódica, consiste de la reducción de protones para formar hidrógeno molecular, 2e- +

2H-H2, E°= -0.41V (Dennis Enning, 2014). El oxígeno no está normalmente presente en las

formaciones de producción petrolífera. Solo en la etapa de taladrar es que fluidos contaminados

de oxígeno son introducidos a los yacimientos. Las aguas utilizadas para la recuperación de

petróleo son usualmente desoxigenadas. Por lo tanto, el hidrógeno molecular prevalece y puede

ser utilizado como fuente de energía de SRB. La posibilidad de las SRB de sobrevivir o prosperar

en ambientes petrolíferos depende de las características fisicoquímicas del ecosistema. La

temperatura es el factor principalmente limitante para el crecimiento de microorganismos en los

yacimientos de petróleo. Dado que la temperatura tiende a incrementar con la profundidad en

promedio 3°C por cada 100m, aunque gradientes geotérmicos regionales pueden variar

significativamente, aquellos yacimientos profundos con temperaturas superiores a 130-150°C no

soportan crecimiento bacteriano. Ese rango de temperatura es considerado el límite teórico para

el crecimiento bacteriano dado la inestabilidad térmica de las moléculas biológicas a esas

temperaturas. Varios tipos de datos sugieren que la presencia de bacteria endógenas en campos

petrolíferos puede estar limitada a un umbral de temperatura entre 80-90°C (Michel Magot,

2000). Bacterias sulfato reductoras han sido aisladas de pozos de petróleo y sulfuro de 2000-

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4000m de profundidad a 65 - 85°C bajo presiones hidrostáticas de 200-400atm. Incluso, se ha

logrado observar crecimiento en cultivos a 104°C bajo presiones de hasta 1000atm (Zobell &

Morita, 1957).

Existe una adaptación matemática para los patrones lineales y radiales de inundación que

describen el desempeño de inyección en términos de la distribución de la temperatura en los

inyectores de agua. Esto ha permitido el cálculo de los volúmenes de agua de la perforación que,

por consideraciones térmicas, pueden permitir la actividad de SRB en lo que se denomina

armazón de viabilidad térmica (TVS, por las siglas en ingles de thermal viability shell). El modelo

resultante predice cuan propenso es un yacimiento dulce a presentar avinagramiento dada la

creación de un armazón de viabilidad estable en los rangos de temperatura mesófilos (20-40°C)

o termófilos (40-80°C) de SRB. La presencia o ausencia de una fuente de H2S en una perforación

también puede ser descrita en términos del modelo, al igual que incrementos abruptos de H2S

subsiguientes a muchos años de producción dulce. Concretamente, 𝑆 = ∫ 𝛽𝑑𝑡, donde S es el

sulfato consumido por litro de actividad bacteriana en agua de producción en cierto tiempo t

(Bob Eden, 1993). Los parámetros de esta ecuación se pueden encontrar en el Apéndice 2.

Diversidad

Los primeros estudios que describieron la presencia de SRB en pozos productores de petróleo

fueron publicados en 1926. En ese estudio se preguntó lo que por mucho tiempo fue considerado

un enigma: eran las SRB endógenas del pozo o eran introducidas por el agua descendente de la

superficie o las operaciones de producción de petróleo. Hasta hace poco era considerado que el

entorno bajo la superficie de la tierra era estéril y que las bacterias aisladas de campos petroleros

podrían ser solo de origen exógeno. Esta percepción cambio cuando se descubrió una larga y

diversa población de microorganismos habitando bajo la superficie en ambientes acuáticos y

petrolíferos (Michel Magot, 2000).

Según análisis comparativos de secuencias de 16S rRNA, las SRB conocidas pueden ser agrupadas

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en siete linajes filogenéticos, cinco dentro del dominio Bacteria y dos dentro del dominio Arquea.

La mayoría de los microorganismos sulfato reductores pertenecen a los ~23 géneros dentro de

las delta-proteobacterias, seguidas por las SRB Gram-positivas dentro de Clostridia. Tres linajes,

Nitrospirae, Termodesulfobacteria y Termodesulfobiaceae solo contienen sulfatos reductores

termófilos. Dentro de las Arquea, las SRB pertenecen a Euryarchaeota y Crenarchaeota. La

herramienta más poderosa para la detección de SRB es la utilización de los denominados genes

funcionales, los cuales codifican enzimas que juegan un papel crucial en la ruta metabólica de la

reducción de sulfato, tales como dsrA, que codifica para la reductasa de sulfito desasimilatoria,

o aprBA que codifica para la adenosina-5-fosfo-sulfato reductasa. La electroforesis en gel con

gradiente de desnaturalización (DGGE) de amplificaciones de PCR de 16S rRNA, y fragmentos de

genes de dsr o aprA son utilizados para determinar la diversidad de SRB en sus hábitats. La

desventaja de estos métodos es que proveen poca o ninguna información sobre el número de

células de SRB presentes. Para cuantificar el número de SRB se pueden utilizar las técnicas de

PCR en tiempo real y FISH, tal y como demostró Mussmann en su estudio de la distribución

vertical de SRB en capas presentes en lodo (Gerard Muyzer, 2008).

Las ecuaciones y proteínas involucradas en la reducción desasimilatoria de sulfato con H2 han

sido descritas para Desulfovibrio vulgari. La bioquímica de esta delta-proteobacteria y la

secuencia del genoma de la cepa Hildenborough han servido para generalizar la capacidad de

crecimiento de otras SRB con H2 como única fuente de energía. La reducción desasimilatoria de

sulfato con H2 a H2S en D. vulgari se lleva a cabo con bisulfito HSO3- como intermediario. El

potencial de óxido-reducción de la pareja SO4-2/HSO3

- es de E°= -516mV y por lo tanto 100mV

más negativo que la pareja de H+/ H2. La reducción de sulfato a bisulfito con H2 puede proceder

solo si se agrega energía. Se ha demostrado que el sulfato es activado primero con ATP a

adenosina-5-fosfosulfato (APS) y que el potencial de óxido-reducción de la pareja APS/ HSO3- es

de -60mV. La reacción, APS + 2e- + 2H+ HSO3- + AMP, es catalizada por ATP sulfurilasa y

consume dos enlaces ricos en energía. Dado que -60mV es mucho más positivo con

respecto al potencial de la pareja H+/ H2, la oxidación de H2 procede incluso en bajas

concentraciones. La reducción de APS a HSO3- prosigue con la reducción de HSO3

- a HS-,

HSO3- + 6e- +6H+ HS- + 3H2O, reacción que es catalizada por una reductasa de bisulfito

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citoplásmica con E° = -116mV final. Se asume por lo tanto que APS y HSO3- son los únicos

intermediarios aceptores de electrones involucrados en la reducción desasimililatoria de sulfato

con H2 (Larry Barton, 2007).

Moléculas como butirato, propionato, acetato, hidrógeno, dióxido de carbono y otros ácidos

orgánicos de cadena corta, de C5 a C7, están presentes habitualmente en las aguas de campos

petrolíferos, siendo acetato la molécula presente en mayor concentración. El hidrógeno

molecular también está presente y puede generarse por reacciones geotérmicas, reducción de

protones disociados de moléculas de agua y por la fermentación de microorganismos termófilos

(Michel Magot, 2000). Cuando hay presencia de sulfato en exceso, las SRB compiten con

metanógenos por sustratos en común, específicamente H2 y acetato. Dada la alta afinidad y el

bajo umbral para la captación de H2, los metanógenos y homoacetógenos son fácil y rápidamente

vencidos por SRB con afinidad a H2. Sin embargo, muchas SRB tienen requerimientos de acetato

como fuente de carbono y, por lo tanto, cuando el acetato no está presente, las SRB coexisten

con homoacetógenos (Gerard Muyzer, 2008).

El desplazamiento por crecimiento entre poblaciones bacterianas endógenas en los yacimientos

petroleros también se puede explicar según su eficiencia termodinámica. Aunque ∆𝐺° entre SRB

y metanógenos es mínima, es suficiente para que las SRB predominen. Lo mismo ocurre entre

SRB y NRB, las cuáles serán mencionadas más adelante. Sin embrago, en el caso de SRB y NRB,

son las NRB las que predominan. Las reacciones termodinámicas para estos tres tipos de

bacterias son las siguientes:

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Métodos de control contra SRB

Típicamente, los métodos empleados por la industria petrolera para el control del

avinagramiento es la utilización de biocidas. Éstos tienden a ser moléculas orgánicas diseñadas

para matar un amplio espectro de microorganismos. Entre los biocidas empleados normalmente

se usa el glutaraldehido (Glut), THPS, BAC y cocodiamina. Los primeros dos son biocidas que

matan a los microorganismos por medio de reacciones químicas irreversibles, inactivándolos.

BAC y cocodiamina son biocidas físicamente reactivos que matan a los microorganismos al

perturbar la membrana y causar lisis celular. Estos biocidas permanecen activos y tóxicos. Sin

embargo, ya están empezando a surgir métodos biotecnológicos alternativos para el control del

avinagramiento tal y como lo es la inyección de nitrato a los pozos (Yuan Xue, 2015).

La inyección de nitrato aumenta la población de bacterias nitrato reductoras (NRB). Los pozos

petroleros, al igual que con las SRB, contienen NRB heterotróficas que utilizan moléculas

orgánicas solubles en petróleo para reducir nitrato a nitrito y nitrógeno a amonio. Estas bacterias

contribuyen al control del avinagramiento por exclusión competitiva. Concretamente, utilizan la

misma clase de moléculas orgánicas como donante de electrones que las SRB, previniendo la

actividad de las SRB. Las NRB también pueden contribuir a la disminución de sulfito, ya que el

nitrito que ellas producen puede reaccionar químicamente con el amonio. Un ejemplo de este

método ocurrió en Coleville, Canadá, donde al inyectar nitrato a un pozo petrolero, se logró

incrementar la población de la bacteria nitrato reductora, sulfito oxidante, Thiomicrospira sp.

cepa CVO. Esta bacteria oxida el sulfito con nitrato a sulfuro y sulfato, al igual que el nitrito a

nitrógeno. Los productos dependen de la tasa de nitrato y sulfito. Si la tasa es alta con exceso de

nitrato, sulfato y nitrito son formados, en caso de exceso de sulfito, nitrógeno y sulfuro son

producidos. Un factor aún sin resolver para este método de control, es la determinación de

moléculas orgánicas que son exclusivas para el crecimiento de NRB a diferencia de las de SRB

(Schaechter, 2009).

Otro método de biocontrol que se puede emplear para controlar las SRB en yacimientos

petroleros es la utilización de bacteriófagos. Los bacteriófagos han de ser específicos contra las

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bacterias problema. Éstos son usualmente endógenos del agua donde se encuentran las SRB o se

pueden utilizar bacteriófagos en stock contra SRB aisladas del sitio de interés. Para este método

es necesario establecer el ciclo que se utilizará para la continua generación del virus y la manera

en que será suministrado al yacimiento (Kazuo Kamimura, 1989).

Finalmente, existen también formas positivas de explotar metabólicamente a las SRB en el área

petrolera, como lo es durante el refinamiento. Durante esta etapa, SRB como Desulfovibrio

desulfuricans M6, han sido utilizadas para desulfurar compuestos presentes en el crudo. También

se ha demostrado que la mayoría del sulfuro ha sido removido de las fracciones más pesadas del

petróleo. Algunos compuestos de sulfuro han sido removidos en su totalidad, como lo son

aromáticos sulfurados que tienden a ser más susceptibles a la degradación por la bacteria, a

diferencia de los compuestos alifáticos con sulfuro. En el caso de compuestos tiofenos,

Desulfovibrio desulfuricans M6 ha logrado metabolizar el 96% del benzotiofeno y el 42% cuando

se trató del dibenzotiofeno (Rashad Javadli 2012).

Detección de SRB La detección directa de SRB es utilizada actualmente en estudios de estas bacterias. Este enfoque

ha ganado impulso en los últimos años e incluye varias técnicas como inmunoensayos para la

detección de la enzima APS de las SRB, epifluorescencia microscópica, y análisis de secuencias de

16S rRNA, particularmente el análisis de los genes dsrAB. Sin embargo, los métodos de detección

directa tienen limitaciones tales como que el número mínimo de detección de SRB por estas

técnicas esta entre 103 – 104 ml-1. Por otro lado, en métodos de cultivo, las formaciones de

precipitados de color negro de FeS han sido utilizadas como herramienta diagnóstica de SRB.

Diversos medios anaerobios han sido empleados para enumerar SRB en muestras ambientales,

donde se pueden contar las colonias de SRB crecidas en agar sólido y determinar el número más

probable en medio líquido. El instituto americano de petróleo (API) recomienda el medio RP-38

para la enumeración de SRB. Este método es ampliamente utilizado en el sector petrolero. Sin

embargo, el medio RP-38 exhibe esencialmente una eficiencia similar a la obtenida por el medio

Postgate B. Al comparar el crecimiento de SRB por dilución seriada, siembra y técnicas de

epifluorescencia, existe concordancia en resultados obtenidos por las anteriores técnicas y por

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lo tanto son consideradas pruebas confirmatorias para la presencia de SRB (Bhagobaty, 2014).

Las SRB más frecuentemente aisladas de pozos petroleros pertenecen a las delta-

proteobacterias. Éstas abarcan a microorganismos mesófilos de los géneros Desulfovibrio,

Desulfobulbus, Desulfobacterium, Desulfobacter y microorganismos termófilos de los géneros

Thermodesulforhabdus y Desulfacinum. Desulfovibrio sp. son las más frecuentes por su gran

capacidad de consumir H2 (Larry Barton, 2007). La lista de microorganismos hasta hoy

encontrados en pozos petroleros se presenta en el Apéndice 3.

Aislamiento de SRB El secreto del crecimiento de las SRB en cultivos puros radica en que el potencial de óxido-

reducción del medio sea de -100mV o menor (Postgate, 1981). Si se inoculan en medios

saturados con aire, solo unas pocas especies robustas pueden crecer. La remoción de O2, al

desplazarlo con otro tipo de gas como N2, elimina la posibilidad de dañar a las células y facilitan

su crecimiento. Dado que la remoción de O2 por medios físicos no es suficiente, la adición de

agentes reductores es necesaria. La rezasurina puede ser empleada como indicador de reducción

en los medios (Widdel, 1981). Algunos agentes reductores empleados para el cultivo de SRB son

los siguientes:

Las SRB están presentes en la mayoría de muestras de tierra, agua subterránea y agua con

petróleo. Sin embargo, éstas tienden a ser opacadas por otro tipo de microorganismos. Por lo

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tanto, primero ha de llevarse a cabo un enriquecimiento de la población de SRB antes de que el

aislamiento se pueda lograr. Para el enriquecimiento, se utilizan medios con fuentes de carbono,

electrones y potenciales de óxido-reducción adecuados para las SRB. Las bacterias pueden ser

posteriormente aisladas del enriquecimiento realizando una prueba de cuantificación. En la

prueba de cuantificación, se diluyen muestras tomadas del enriquecimiento en tubos de

anaerobiosis con el medio selectivo. Se lleva a cabo una dilución seriada hasta 10 -6. Después de

cinco a seis días ya deben existir colonias en los tubos con la mayor dilución. Por medio de la

utilización de una pipeta Pasteur, han de ser transferidas nuevamente a un medio enriquecido

después de haber sido analizadas microscópicamente. Cuando, después de repetir el

procedimiento, se logre observar por inspección microscópica que las bacterias son

prácticamente homogéneas, se puede considerar un cultivo puro (Postgate, 1981). Análisis de

16S rRNA sirven para determinar el género y especie de la SRB. En el Apéndice 4 se muestra una

adaptación del método por Pankhurts.

Para el aislamiento de SRB de los géneros Desulfovibrio, Desulfotomaculum, o Desulfomonas, un

agar que contenga lactato puede ser utilizado. El lactato sirve como el donante de electrones y

como la fuente de carbono. Sin embargo, algunas de las cepas obtenidas por este método puede

que no crezcan con hidrógeno como su donante de electrones, ni tampoco con acetato o dióxido

de carbono como su fuente de carbono. Cuando se adquieren muestras que posiblemente

contengan Desulfovibrio, Desulfotomaculum, o Desulfomonas, como aquellas provenientes de

pozos petroleros, es necesario transferirlas a medios selectivos para su crecimiento. Un medio

con cantidades aceptables de precipitados que ha sido exitoso para el enriquecimiento y el

cultivo de estas SRB, es el medio Postgate B. Cuando hay crecimiento por SRB, el medio se torna

negro, dada la producción de FS al reaccionar con H2S (Widdel, 1981). Otros medios utilizados

para el aislamiento de este tipo de SRB son API y Baar’s.

El enriquecimiento y aislamiento de Desulfovibrio sp. con hidrógeno molecular como donante de

electrones y acetato junto con dióxido de carbono como fuentes de carbono fueron demostradas

por primera vez por Sorokin en 1966. Se demostró que cepas de Desulfovibrio desulfuricans

podían llevar a cabo reducción desasimilatoria de sulfato con hidrógeno como fuente energética

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y con acetato y dióxido de carbono como fuentes de carbono, con una tasa de asimilación del

carbono celular de 70% proveniente del acetato y 30% del dióxido de carbono. Similarmente, dos

cepas de Desulfovibrio vulgaris fueron aisladas en 1978, con tasas del carbono celular parecidas

a las demostradas por Sorokin (Badziong, Thauer, & Zeikus, 1978). El medio selectivo utilizado

para estos aislamientos es provisto en el Apéndice 5. Los enriquecimientos de cultivos se llevan

a cabo en tubos de 23ml cerrados con tapas de neopreno. Diez mililitros del medio son

transferidos anaeróbicamente a los tubos e inoculados. Cuando el nitrógeno es la fase gaseosa

de los tubos de 13ml, este gas es posteriormente reemplazado con 80% hidrógeno y 20% dióxido

de carbono. Los tubos se encuban a 30-35°C. Después de varios pases en estas condiciones, la

colonias puras se preparan por el método de Hungate (Hungate, 1973) utilizando medio basal y

la adición de 1.5% de fase hidrógeno/dióxido de carbono (Widdel, 1981).

Panorama de las SRB en Pozos Petroleros Colombianos

La calidad del petróleo se mide por medio de unidades de gravedad API, las cuales se dividen en

cuatro grupos: liviano (API>31.1°), medio (22.3<API<31.1°), pesado (API<22.3°) y extra pesado

(API<10.0°). La gravedad API es expresada en grados y su valor permite determinar la densidad

de los hidrocarburos con respecto a la densidad del agua a una temperatura constante de 15.6°C.

La fórmula utilizada para obtener los grados API es la siguiente:

𝐴𝑃𝐼 =141.5

𝑆𝐺− 131.5

donde SG es la gravedad específica, que es el equivalente a dividir la densidad de la sustancia por

la densidad de agua. Si la gravedad API es mayor de 10°, el petróleo flota en el agua, en caso

contrario, se hunde. La gravedad API fue diseñada para que la mayoría de los valores estén entre

10° y 70° (Schlumberger, 2012). Adicionalmente, cuando la cantidad de sulfuro es mayor a 0.5%

en el yacimiento, se le considera agrio. Si el porcentaje es menor, el yacimiento es referido como

dulce. El petróleo dulce es preferido en el mercado ya que es más fácil de refinar, es más seguro

para extraer y no es tan corrosivo como lo es el petróleo agrio (Duissenov, 2013).

En Centro y Suramérica la producción de crudo totalizó 7.35 millones de barriles por día, o un

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8.54% de la producción mundial, en el 2012. La tasa total de crecimiento en la región fue de 0.8%

y la tendencia fue de un incremento de 700 barriles al día. Los principales productores fueron

Venezuela con 37.1%, Brasil con 29.2% y Colombia con 12.8%. Sin embargo, pese a la tendencia

positiva de Colombia, la proyección de una tasa constante de crecimiento en la incorporación de

reservas y producción tornan insostenible el autoabastecimiento para el 2020, a menos que se

hagan nuevos descubrimientos. Por lo tanto, para compensar la producción de crudo con

respecto a las reservas, Colombia va a incursionar en la obtención de hidrocarburos no

convencionales y offshore. Se considera un hidrocarburo no convencional a todos aquellos

hidrocarburos que estén presentes en yacimientos de baja permeabilidad, que posean petróleo

pesado y de alta viscosidad, y por lo tanto se necesite tecnología avanzada para su extracción

(Monroy, 2013). Una de las principales características de los hidrocarburos no convencionales es

que tienen un alto contenido de sulfuro, regularmente presente en forma de H2S (J., 2012).

Para incentivar este tipo de tecnología, el gobierno por medio de la Agencia Nacional de

Hidrocarburos (ANH), estipuló una reducción del 40% en regalías, además de descuentos a las

compañías interesadas. Las cuencas más promisorias en Colombia para este tipo de exploración

son las del Magdalena, Catatumbo, Putumayo y los llanos (Energy, 2015). Ese tipo de contratos

se proveen para incursiones en gas y crudo de API 15°. Después de llevar a cabo las licitaciones

para la adjudicación de bloques de áreas a las compañías, los contratos por la ANH constan de

tres fases diferentes: 1) Fase de exploración donde se cuenta con seis años para hacer el

descubrimiento, con una posible extensión de 2 años; 2) Fase de evaluación donde se cuenta con

dos años para evaluar si habrá desarrollo en el área; 3) Fase comercial donde se proveen 24 años

para el desarrollo del depósito antes de que el proyecto acabe. En el 2012 se llevó a cabo la

primera adjudicación de hidrocarburos no convencionales, abarcando el 30% de la oferta, con

empresas como Ecopetrol, ConocoPhillips, ExxonMobil y Shell entre otras (Openoil, 2015). Según

el ministerio de minas, los hidrocarburos no convencionales representan el 45% de reservas

probadas del país (Monroy, 2013).

Por otro lado, independientemente de si los hidrocarburos son no convencionales, las mezclas

de los hidrocarburos actualmente comercializadas en Colombia, también contienen altas

16

cantidades de sulfuro. La mayoría de los yacimientos en Colombia son agrios (Duissenov, 2013).

Una de las principales fuentes, sino la principal de la cantidad de compuestos sulfurados en los

hidrocarburos, son las SRB. Depende de la identificación y posterior control de las cepas nativas

del país para que se pueda obtener una mayor productividad en el sector petrolero. Esto debido

a que, a diferencia del petróleo dulce y ligero, el crudo agrio tiende a venderse más barato. Si se

logra disminuir la cantidad de compuestos sulfurados presentes en los hidrocarburos,

disminuyen los costos de refinamiento y se puede obtener un mayor valor de los mismos. Y con

más razón, si de ahora en adelante Colombia empezara a extraer hidrocarburos pesados

sulfurados en una mayor proporción.

Conclusiones En la industria petrolera, las bacterias sulfato reductoras (SRB) hacen uso del SO4

-2 presente en

aguas de extracción para llevar a cabo su respiración celular y producir sulfuro de hidrogeno una

vez oxidan la molécula. El contenido de compuestos sulfurados en el crudo determina que tan

agrio o dulce es. Entre más sulfuro este presente, mayor el costo del refinamiento.

Adicionalmente, la presencia de H2S conlleva a corrosión. La principal fuente de producción de

H2S en los yacimientos son las SRB, que además de ser la mayoría endógenas, prosperan en

ambientes anóxicos ricos en sulfato. Usualmente el agua empleada para procesos de extracción

es la fuente de exceso de SO4-2, conllevando a la proliferación de las SRB. La utilización de biocidas

no elimina a estas bacterias, lo que las convierten en una fuente de millones de dólares en

pérdidas para la industria petrolera.

Para cada yacimiento existen SRB nativas. Sin embargo, aunque se han aislado todo tipo de SRB,

las bacterias que predominan son aquellas pertenecientes a las denominadas delta-

proteobacterias. Éstas abarcan a microorganismos mesófilos de los géneros Desulfovibrio,

Desulfobulbus, Desulfobacterium, Desulfobacter y a microorganismos termófilos de los géneros

Thermodesulforhabdus y Desulfacinum. Para poder lograr su aislamiento y respectiva

identificación, es necesario hacer primero enriquecimientos en medios selectivos y después por

17

medio del método de cuantificación lograr aislarlas. El género y especie se podrán determinar

por PCR de la región 16S rRNA.

Las reservas de crudo en Colombia tienden a ser avinagradas, lo que significa que contienen más

de 0.5% de compuestos sulfurados. Por otro lado, según proyecciones de Ministerio de Minas, el

45% de las reservas en Colombia son hidrocarburos no convencionales. Esto significa que casi la

mitad de las reservas en Colombia están compuestas de hidrocarburos pesados, sulfurados y de

difícil extracción. Por lo tanto, en Colombia es imperativo para la industria petrolera disminuir

costos de producción y refinamiento, algo que se puede lograr si se controla la presencia de SRB

en los yacimientos. Para lógralo, se pueden implementar diferentes tipos de biocontrol, pero

primero es necesario determinar qué tipo de SRB abundan en los yacimientos.

18

Apéndice 1 – Compuestos sulfurados presentes en petróleo. Lista de compuestos sulfurados presentes en petróleo, adaptada de Oilfield Processing of

Petroleum: Oilfield Processing, por Manning

Sulfuro de hidrogeno

Mercaptanos alifáticos

Mercaptanos Aromáticos

Sulfitos alifáticos

Sulfitos Cíclicos

Bisulfitos alifáticos

Bisulfitos Aromáticos

Polisulfitos

Tiofeno y homólogos

19

Apéndice 2 - Parámetro 𝜷. El parámetro de la tasa de consumo de sulfato, como fracción de tiempo recorrido a través del

TVS, está dado por:

β = 0.6134F – (10.67 + 0.07048F)G + (1.476 – 0.001015F)G2 – 0.0249G3

Donde F – Pinj - dt

A

y G = a + b [ Tinj + c(16.684 𝑔𝑡

12

A12

+ 0.40804 g2 𝑡

A)]

con a = 20 – 30 TL/(TL – TU)

b = 30/TU

c = 10 – 5 [Tres - Tinj]

g = 40

ℎ √

715

𝑃𝑒 𝐶𝑐

A = 𝑝%ϕ𝜋ℎ

100𝑞

q = Tasa de producción de petróleo

p% = Porcentaje efectivo del tamaño de corte del tubo en el yacimiento

20

Apéndice 3 - Microorganismos aislados de campos petroleros.

21

Apéndice 4 - Método de Pankhurst.

Figura 2. Método cuantitativo de para aislamiento. Figura adaptada de Isolation of sulphate-reducing bacteria, por

Pankhurt.

22

Apéndice 5 - Medio de cultivo en H2 El medio se calcula por litro de agua destilada con 10ml de solución 1 y 1ml de solución 2. El pH

debe ser de 7.2

(NH4)2SO4 5.3g

Na-acetato 2.0g

KH2PO4 0.5g

NaCl 1.0g

MgSO4 7H2O 0.2g

CaCl2 2H2O 0.1g

Solución 1

Ácido Nitrilotriacetico (Neutralizado por NaOH) 12.8.g

FeCl2 4 H2O 300mg

CuCl2 20mg

MnCl2 4H2O 100mg

CoCl2 6H2O 170mg

ZnCl2 100mg

H3BO3 10mg

Na2MoO4 2H2O 10mg

Solución 2

Agua destilada 100ml

Resazurina 0.2g

23

Agradecimientos Doy gracias a la profesora Martha Vives por introducirme al mundo de las bacterias anaerobias,

particularmente a las bacterias sulfato reductoras. De igual manera, agradezco al profesor

Friedrich Widdel, pionero en el campo de las SRB, quien me proveyó de material y clarifico dudas

sobre el tema. A la profesora Silvia Restrepo por ser fuente de inspiración e incentivar a mi

generación en el ámbito de la investigación. A mi familia por su apoyo incondicional,

particularmente mi padre Antonio Medina. Finalmente, agradezco a Paula Laverde por ayudarme

a editar el texto.

24

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