Aislamiento y crecimiento de bacterias Mesófilas Aeróbicas Totales en superficies secas

LABORATORIO N° 1 - MICROBIOLOGIA - PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA, CALI 1

Aislamiento y crecimiento de bacteriasMesofilas Aerobicas Totales en superficies

secasGiann Karlo Aguirre Sambonı

Abstract—Determining the concentration of bac-teria in a sample is important for the food industry,medicine and biotechnology. However, none of themethods commonly used can to determine the ex-act number of microorganisms existing in a givensample. More than precision, these techniques pro-vide insights for estimating microbial content. Themesophilic aerobic group comprises a heterogeneousgroup, having in common the aerobic nature andproliferation between 20 and 37 °C, in this therebacilli, cocci, intermediate forms, Gram positive andGram negative. Therefore, this article presents twoprocedures, the CFU count and the OD measuredin order to make an analytical relationship betweenthe growth of TAM.

Resumen—La determinacion de la concentracionde bacterias en una muestra es importante para laindustria alimenticia, la medicina y la biotecnologıa.Sin embargo, ninguno de los metodos utilizadoshabitualmente permite determinar el numero exactode microorganismos que existe en una determinadamuestra. Mas que recuentos, estas tecnicas proveenmedios para estimar contenidos microbianos. En laconformacion del grupo de mesofilos aerobios seencuentra un grupo heterogeneo, teniendo en comunel caracter aerobio y proliferacion entre 20 °C y 37°C, en este hay bacilos, cocos, formas intermedias,Gram positivos y Gram negativos. Por lo tanto, eneste artıculo se presentan dos procedimientos, elrecuento de UFC y la medida DO, con el fin dehacer una relacion analıtica entre ambos para elcrecimiento de MAT.

I. INTRODUCCION

EL aislamiento, purificacion e identificacionde bacterias son los primeros pasos para estu-

dios bacteriologicos [1] . El aislamiento y siembrade las bacterias se realiza para poder hacer la iden-tificacion de los microorganismos en la muestra.

Profesor: PhD. Paola Andrea Caro Hernandez, Profesora deMicrobiologıa, PUJ, 2015

En este paso se pretende que los microbios de lamuestra crezcan en un sustrato elaborado en ellaboratorio y su aislamiento facilitara el estudiode dichos microbios [2].

Adicionalmente, el aislamiento y la identifi-cacion pueden hacerse por diversos metodos, laeleccion de la tecnica depende del proposito ydel tipo de microorganismo que se desea aislar.Para la identificacion se incluyen criterios comoel estudio de la morfologıa; las reacciones frentea colorantes; y el tipo de estructuras que puedentener como esporas, capsula, glucocalix, flagelo,etc. No obstante, algunas bacterias tienen produc-tos metabolicos y es de gran ayuda conocerlosdado que serıa una variable mas para la identifica-cion del microorganismo en estudio. Sin embargo,para identificar la morfologıa, la coloracion o lasreacciones bioquımicas se necesitan medios decultivo, sustrato natural o artificial o una solucionde ciertos nutrientes que permiten cultivar losmicroorganismos para su posterior uso en el labo-ratorio, correctamente determinados, preparados yalmacenados. El exito del trabajo en un laboratoriode microbiologıa depende de la adecuada elecciony buen uso de los metodos de esterilizacion ytecnicas asepticas [3] .

Asimismo, en el trabajo del muestreo, el pro-cedimiento varıa debido al ambiente de dondese coleccionaran las muestras pues el sustratoo medio son una referencia util para observarel comportamiento de los microorganismos conrespecto a parametros especıficos (T, pH, presion,nutrientes, etc.). Por lo tanto, las tecnicas emplea-das para la determinacion poblacional microbianase han desarrollado con base a: la naturaleza delmaterial a partir del cual se toman las muestras,el tipo de microorganismo y sus condiciones de


crecimiento. Teniendo en cuenta que las bacteriasson ubicuas, entonces pueden captarse igualmentede diversos sustratos. En ambientes como el sueloy aguas de ecosistemas naturales es comun encon-trar gran diversidad de organismos, en ambientescomo las cavidades gastrointestinales, mucosas deanimales, zonas volcanicas y otros, la diversidades menor. Algunas veces los microorganismos sehan adaptado a condiciones muy especıficas ypodran requerir procedimientos de trabajo paraaislamiento y siembra especiales como es el casode microorganismos anaerobios, autotrofos, etc.[3].

Los microbios mesofilos aerobios totales re-quieren para su cultivo una fuente de carbono, unafuente de nitrogeno, iones no metalicos como elazufre y el fosforo; elementos metalicos (Ca, Zn,K, Cu, Mn, Mg, F+2 y F+3); vitaminas y agua[4]; y segun el objetivo la siembra se hace poragotamiento, para observar colonias separadas yhacer el estudio de la identificacion, o se haceen cuadrıcula, para hace recuento de unidadesformadoras de colonias (UFC).

II. METODOLOGIA

La coleccion de muestras de microorganismosse hizo de tres superficies, la manija de una puerta,el bote de basura de un sanitario y las hecesfecales de un gato. Se sembraron las muestrasen un caja de petri. El hisopo con la muestrade la basura se sembro en un medio de cultivoenriquecido con Agar glucosa 4 % segun SABOU-RAUD; la muestra del hisopo de las heces fecalesse sembro en un cultivo enriquecido con AgarEMB; y la muestra del hisopo de la manija dela puerta se sembro en un cultivo enriquecidocon TSA (agar de tripticasa de soya). Todo estosfueron sembrados en superficie e incubados a unatemperatura ambiente (≈ 28°C − 37°C) durantetres dıas. Se hizo aislamiento por agotamiento yfinalmente para su identificacion, en un portaobje-tos, se implemento la tincion de Gram. Se sembroa profundidad para hacer recuento de unidadesformadoras de colonias (UFC) de cada bacteriacada hora; se hizo las diluciones respectivas enagar TSA y EMB. Por ultimo, con las cepasobtenidas, aisladas y purificadas, se caracterizaronaplicando la curva de crecimiento mediante lamedida espectrofotometrica de la absorbancia.

III. RESULTADOS

Tras la coleccion de muestras, siembra, cultivo,aislamiento y coloracion de Gram, el resultadoobtenido de esta tincion fue: Escherichia coli, ba-cilo gram negativo, sacado de las heces fecales deun gato, una enterobacteria; bacilo gram positivo,obtenido del bote de basura; coco, gram positivo,extraıdo de la manija de la puerta. En la fasepara contar UFC, los resultados, tras la siembra aprofundidad y las diluciones en diferentes tiempos,fueron poblaciones de crecimiento masivo, lo queimposibilito su recuento en agar TSA, y en agarEMB no hubo crecimiento:

Figura 1: Bacilo sembrado por extension, volumende 10 ml del cultivo mixto. Siembra 2-D.

Figura 2: Bacilo sembrado por extension, volumende 10 ml del cultivo mixto. Siembra 1-inicial


Figura 3: Bacilo sembrado por extension, volumende 1 ml del cultivo 2-D y 9 ml de caldo nutritivo.

Figura 4: Bacilo sembrado por extension, volumende 1 ml del cultivo 2-10−1 y 9 ml de caldonutritivo.

Finalmente, se aplico la curva de crecimiento,para cada una de las bacterias, exceptuando alcoco gram positivo pues no hubo crecimiento decolonias, mediante la medida de absorbancia, losdatos estan registrados en los cuadros: Cuadro I yCuadro II, y en las graficas: Figura 6 y Figura 7,respectivamente.

Segun los datos obtenidos, se observa que lafase exponencial se da alrededor de los 50 minu-tos despues de la primera medida para el bacilogram positivo, es decir, su tiempo de generacion.Ademas, para E. coli se muestra que su tiempo degeneracion es menos de 90 minutos y para el coco

Figura 5: Bacilo sembrado por extension, volumende 1 ml del cultivo 3-10−1 y 9 ml de caldonutritivo.

gram positivo no se marco una medida espectro-fotometrica. Con estos resultados se evidencia queen la coleccion de muestras de mesofilos aerobiostotales existe una mayor probabilidad de encontrarbacterias gram positivas, debido al coco y al bacilomuestreado, en un ambiente universitario y debidoa la siembra de estos en condiciones optimas sepuede inferir que su fase de adaptacion es brevey su fase exponencial es extensa que se prolongamas alla de las tres horas.

IV. DISCUSION

El procedimiento presento inconsistencias, alhacer las siembras a profundidad, debido a queno se consiguio lo que se esperaba, dado quese dio un crecimiento masivo y no se pudo ha-cer conteo de UFC, por lo tanto, se aconsejahacer mas diluciones o tener menos concentradala muestra de bacterias para el cultivo. En 1981se desarrollo un procedimiento para enumerar aE. coli y para ello se usaron diluciones en PBS(phosphate-buffered saline) y se pipeteo 0.2 mlde cada dilucion en 5 placas diferentes con EMB(eosin methylene blue agar) y posteriormente laspacas de EMB fueron incubadas en una posicioninvertida a 35°C durante 24 horas [5]. Ahorabien, para un recuento de bacilos se hizo otrainvestigacion en 1998 la cual buscaba compararel conteo de placas con el metodo estandar (pourplate procedure with Plate Count Agar (PCA))


Cuadro I: Datos de la medida espectrofotometrica de la absorbancia con el bacilo gram positivo quesin tincion presentan fluorescencia.

Numero Descripcion Longitud de onda (nm) Absorbancia (A) Tiempo (min)1 Bacilos fluorescentes 600 0.007 0

2 Bacilos fluorescentes 600 0.012 49




Cuadro II: Datos de la medida espectrofotometrica de la absorbancia con E. coli.

Numero Descripcion Longitud de onda (nm) Absorbancia (A) Tiempo (min)1 E. coli 600 0.030 0

2 E. coli 600 0.210 90

3 E. coli 600 0.676 150

4 E. coli 600 0.862 180

y con metodos alternativos (PCA/spread plates,R2A medium/pour plates and R2A medium/spreadplates). Para ello, usaron inoculos con 0.1 ml delas muestras y 0.1 ml en las diluciones de 10−1

y de 10−2 y los resultados permitieron determinarque el conteo con el metodo R2A medium/spreadplates, a 22°C y despues de 7 dıas de incubacion,tuvo mas efectividad que con el metodo PCA/pourplate [6].

Adicionalmente, para el caso de los cocos grampositivos queda en incertidumbre el hecho de queno hayan presentado medida crecimiento indirectocoherente, dado que mostro un valor en la medi-da espectrofotometrica sin sentido. No obstante,existe la hipotesis de que formo conglomeradopues presento crecimiento en cultivo en siembraa profundidad. Madigan, et al. describen estefenomeno argumentando que algunas bacteriasforman pequenos a grandes grumos, y en talescasos, las mediciones de OD pueden ser bastanteinexactas como una medida de la masa microbianatotal, ademas pudo ser que crecieron en pelıculasadheridas a los lados de los tubos mimetizandoseen el cultivo lıquido como crecen en la naturaleza[7].

Por otro lado, en cuanto la curva de crecimientose encontraron investigaciones que demuestransimilaridad con lo resuelto en este trabajo segunla densidad optica de la absorbancia, sin embargo,en esa investigacion midieron la turbidez de las

diluciones 10−1 y 10−2 durante 240 minutos ycada 30 minutos tomaron la medida y por lo tantoparece que la fase exponencial fuera mas reducida[8].

V. CONCLUSION

El presente artıculo de aislamiento bacterianorevelo una correlacion entre los metodos demedida para el crecimiento de bacterias dado quepara la metodologıa por recuento de placas, unprocedimiento directo, las bacterias presentaronuna poblacion masiva tras una incubacion detres dıas y para la medida de densidad opticapor absorbancia, un procedimiento indirecto,las bacterias presentaron una prolongada faseexponencial que elucido en la medida dandocomo resultados cercanos a la unidad, y debidoa esta correlacion se puede afirmar que si enmenos de cinco horas los microorganismospresentaron altos niveles de turbidez, con unvolumen de 1 ml y en algunos casos de 0.5ml, entonces para tres dıas de incubacion ycon insuficientes diluciones, las bacterias ibana presentar crecimiento masivo. Ahora bien,quedan estudios pendientes tras este artıculocomo resolver la identificacion taxonomica delos microorganismos para determinar y relacionarsus productos bioquımicos y hacer analisisbiotecnologico.


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REFERENCIAS

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