UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DO ARAGUAIA

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE GRADUAÇÃO DE BIOMEDICINA

ANNA KELLY NUNES

EFEITO DO EXTRATO DA FOLHA DE PSIDIUM GUAJAVA NA ATIVIDADE DE

FAGOCITOSE DE CÉLULAS DO SANGUE HUMANO SOBRE AS BACTÉRIAS

ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)

Barra do Garças- MT

2020

I

ANNA KELLY NUNES

EFEITO DO EXTRATO DA FOLHA DE PSIDIUM GUAJAVA NA ATIVIDADE DE

FAGOCITOSE DE CÉLULAS DO SANGUE HUMANO SOBRE AS BACTÉRIAS

ESCHERICHIA COLI ENTEROPATOGÊNICA (EPEC)

Monografia apresentada à banca examinadora do curso de Biomedicina do Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, do Campus Universitário do Araguaia - UFMT, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.

ORIENTADOR: André Henrique Furtado Torres. COORIENTADOR: Prof. Dr. Eduardo Luzía França.

Barra do Garças-MT

2020

I

II

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por me permitir concluir mais uma etapa, por me dar força nos momentos difíceis e árduos e nunca me deixar desistir.

A minha mãe Rociene Silva Nunes, luz da minha vida que sempre acreditou em mim e me amparou, por todo amor, dedicação e por todo suporte todos esses anos, muito obrigada!

Ao meu pai Marcelo Cruz Ribeiro, que mesmo não estando mais aqui sei que cuida de mim e está sempre ao meu lado.

A minha grande amiga Sônia Furman, que infelizmente partiu antes de me ver chegar aqui, mas, onde quer que esteja sei que está olhando por mim, obrigada por tudo!

Ao meu Noivo Thales Hebert Regiani Pereira, por todo apoio e compreensão por acreditar em mim mesmo quando eu não acreditava, por toda motivação e ajuda todo esse tempo, obrigada por sempre estar ao meu lado, amo você!

Ao meu orientador André Henrique Furtado Torres, por me receber com toda atenção, pelos ensinamentos e dedicação no decorrer do meu trabalho.

Ao Prof. Dr. Eduardo Luzía França, por toda atenção, incentivo e ensinamentos.

Aos membros da Banca Examinadora Prof. Dr. Aníbal Monteiro de Magalhães, Prof. Dr. Eduardo Luzía França e Prof. Dr. Paulo Roberto da Fonseca Filho, pela disponibilidade.

A todos do Laboratório da Relação Materno Infantil e Laboratório de Cronoimunomodulação, por toda ajuda e atenção no decorrer do meu trabalho.

As minhas amigas Jéssica Baçalo, Renata Cristina e Leticia Muller por apesar da enorme distância estarem comigo nessa trajetória, me apoiando e incentivando.

A minha amiga Débora Rodrigues, pela parceria todos esses anos, pelas risadas, descontração e companheirismo mesmo nos momentos mais difíceis.

Aos meus amigos Carlos, Jhonatan, Bruno e Vitor por todas as palavras de carinho e incentivo.

Aos queridos Simone e Marcelo, por todo apoio e incentivo, jamais esquecerei.

E a todos que de forma direta ou indireta, contribuíram para que eu chegasse até aqui, MUITO OBRIGADA!

III

RESUMO

A Psidium guajava conhecida popularmente como goiabeira é uma pequena árvore tropical frutífera da família myrtaceae, possui cerca de 133 gêneros e mais de 3800 espécies, podendo crescer até 35 metros de altura, ela é utilizada na medicina popular devido suas propriedades curativas no tratamento de distúrbios gastrointestinais, resfriados e inchaços. Umas das principais causadoras de distúrbios gastrointestinais em crianças é a bactéria Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), sendo associada à altas taxas de mortalidade infantil em países em desenvolvimento. Visando as propriedades da Psidium guajava e a necessidade de novas alternativas para o tratamento de infecções causada pelas bactérias Escherichia coli enteropatogênica, foi avaliado os efeitos da Psidium guajava em fagócitos sanguíneos para ação antibacteriana sobre as bactérias Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). O extrato da folha de Psidium guajava foi extraído e preparado nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL, para realização dos ensaios de viabilidade, fagocitose, enzima superóxido dismutase e reologia as células sanguíneas junto com as bactérias Escherichia coli enteropatogênica foram incubadas com o extrato nas diferentes concentrações. As diferentes concentrações do extrato de Psidium guajava apresentaram efeitos imunomoduladores sobre a função das células sanguíneas, estimulando a fagocitose e modulando a função da enzima superóxido dismutase (SOD), da mesma forma o extrato nas concentrações de 200 mg/mL e 200 µg/mL modificou a viscosidade do sangue, enquanto as concentrações de 200 ng/mL e 200 pg/mL manteve o sangue com sua viscosidade normal. O extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 ng/mL e 200 pg/mL possuem efeitos antibacterianos e não alteram o comportamento fisiológico do sangue humano.

Palavras-chave: Psidium guajava, Escherichia coli enteropatogênica, Fagocitose, Viscosidade, Estresse oxidativo.

IV

ABSTRACT

The Psidium guajava, popularly known as guava tree, is a small tropical tree from the family Mytraceae. It has about 133 genres and more than 3800 species and it can reach 35 meters in height. This tropical tree is used in popular medicine because of your healing effects in the treatment of gastrointestinal disorders, colds and bumps. One of the main causes of gastrointestinal disorders in children is the bacterium Escherichia coli enteropathogenic (EPEC), which is associated with high rates of infant mortality in developing countries. It was evaluated the effects of Psidium guajava on blood phagocytes for antibacterial action over the bacterium Escherichia coli enteropathogenic (EPEC) because of the necessity of new alternatives to treat disorders caused by this bacterium plus the healing effects of the Psidium guajava. Extraction and preparation of the extract of Psidium guajava leaf in concentrations 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL and 200 pg/mL to perform the viability tests, phagocytosis, superoxide dismutase enzyme (SOD) and rheology the blood cells together with the bacterium Escherichia coli enteropathogenic were incubated with the extract in each of this concentrations. The different concentrations of Psidium guajava showed immunomodulatory effects over blood cells function, stimulating phagocytosis and modulating the function of the superoxide dismutase enzyme (SOD). In concentrations 200 mg/mL and 200 µg/mL, the extract modified blood viscosity. However, in concentrations 200 ng/mL and 200 pg/mL the blood viscosity was the same as the normal one.The Psidium guajava’s extract in a certain concentration has antibacterial effects and does not change the physiological behavior of human blood.

Key words: Psidium guajava, Enteropathogenic Escherichia coli, Phagocytosis, Viscosity, Oxidative stress.

.

V

LISTA DE SIGLAS, ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

E. COLI – Escherichia coli

EPEC – Escherichia coli enteropatogênica

F.P.G – Folha de Psidium guajava

MN – Células mononucleares

PBS- Phosphatase Buffered Saline

SOD – Enzima superóxido dismutase

NBT – Nitro Blue Tetrazoluim

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-ácetico

UI – Unidades internacionais

ANOVA – Análise de Variância

LPO – Lipoperoxidação

CAT – Atividades das enzimas catalase

PEG – Polietilenoglicol

.

VI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Curvas de fluxo dos grupos analisados sangue na presença do extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL e sangue sem estimulo como controle. .................................................17

Figura 2. Viscosidade dos grupos analisados sangue na presença do extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL e sangue sem estimulo como controle. ................................................................................................................... 18

Figura 3. Índice de Viabilidade Celular (%) das células fagocíticas do sangue periférico incubados com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/ml, 200 µg/ml, 200 ng/ml e 200 pg/ml. ....................................................................................................................... 19

Figura 4. Índice de fagocitose (%) das bactérias Escherihia coli enteropatogênica pelas células fagocíticas do sangue periférico tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL ........................................................................................................................ 20

Figura 5. Índice Microbicida (%) das bactérias Escherichia coli enteropatogênica pelas células fagocíticas do sangue periférico tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL ........................................................................................................................ 21

Figura 6. Concentração de enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) no sobrenadante das células MN do sangue periférico tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL ................................................................................................................... 22

Figura 7. Concentração de enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) no sobrenadante das bactérias EPEC tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL ........................................................................................................................ 23

Figura 8. Concentração de enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) no sobrenadante das células MN incubadas com bactérias EPEC e tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL .............................................................................................................. 24

VII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Correlação da concentração da enzima superóxido dismutase (Cu- Zn-SOD) com a viscosidade sanguínea ........................................................ 25

VIII

SUMÁRIO

APÊNDICE- ARTIGO...................................................................................

1- INTRODUÇÃO. ........................................................................................ 10

2- MATERIAIS E METÓDOS ....................................................................... 12

3- RESULTADOS E DISCUSSÃO. .............................................................. 17

4- CONCLUSÃO. ......................................................................................... 26

5- REFERÊNCIAS .........................................................................................2

6- ANEXOS .................................................................................................. 32

IX

APÊNDICE - ARTIGO

TÍTULO: Efeito do extrato da folha de Psidium guajava na atividade de fagocitose de

células do sangue humano sobre as bactérias Escherichia coli enteropatogênica

(EPEC)

AUTORES: Nunes, A. K.; França, E. L.; Torres, A. H. F. Instituto de Ciências Biológicas e

da Saúde, UFMT- Universidade Federal de Mato Grosso, Barra do Garças, Mato Grosso,

Brasil.

Autor correspondente – André Henrique Furtado Torres

Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde.

UFMT- Universidade Federal de Mato Grosso

Avenida Valdon Varjão, nº 6.390. CEP: 78600-000 Barra do Garças,

Mato Grosso, Brasil.

10

1. Introdução

As plantas são utilizadas a muito tempo pela medicina popular por possuírem

compostos bioativos e devido suas propriedades curativas. Dentre as plantas,

encontra-se a Psidium guajava, popularmente conhecida como goiabeira é muito

conhecida no tratamento de resfriados, inchaço e distúrbio gastrointestinal como as

diarreias (Farjana et al., 2014).

A Goiabeira é uma pequena árvore tropical frutífera, amplamente cultivada que pode

crescer até 35 metros de altura. É membro da família Myrtaceae, com cerca de 133

gêneros e mais de 3.800 espécies. Suas folhas, casca e os frutos vem sendo utilizados

como medicamentos e exibem muitos usos terapêuticos (Kafle et al., 2018).

A literatura apresenta alguns estudos sobre as propriedades medicinais da Psidium

guajava, onde tem relatado algumas propriedades como: triterpenóides, flavonóides,

taninos, carotenoides e polifenólicos (Jang et al., 2014; Vyas et al., 2010).

Além disso, a folha da Psidium guajava possui efeitos farmacológicos como atividade

anti-inflamatória, antioxidante, antimicrobiana, antiproliferativa (Ajizah, 2018) e

atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Kafle et al.,

2018).

As bactérias Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), é uma das mais comuns

causadoras de diarreia em crianças, ligada também a alta taxas de mortalidade infantil

(Yang et al., 2018). A diarreia é uma condição fisiológica associado a patologias, onde

pode ser observado um aumento acentuado no volume, diminuição na consistência e

maior fluidez das fezes (Parmar et al., 2019).

Para eliminação das bactérias EPEC o organismo conta com a participação do

sistema imunológico, mais precisamente com ação de fagocitose realizada pelos

11

fagócitos. Durante o processo de fagocitose, ocorrerá a eliminação desses

microrganismos, através da liberação de enzimas lisossômicas ou pela produção de

metabolitos ativos de oxigênio (ânion superóxido) (Barbior 1978; Mundi et al., 1991;

Corrêa et al., 2006). Após o processo de fagocitose as enzimas superóxido dismutase

(SOD) catalisam e convertem o ânion superóxido em oxigênio e água podendo

sintetizar peróxido de hidrogênio permitindo assim a eliminação do ânion superóxido

(Barreiros et al., 2006).

Dentre os fatores fisiológicos importantes para eliminar microrganismos, encontra-se

a viscosidade sanguínea, o sangue devido à presença de glóbulos vermelhos possui

um comportamento não newtoniano (Pereira et al., 2015). Avaliar o comportamento

do fluxo sanguíneo tem papel importante para o diagnóstico ou monitoramento da

doença (Lowe, 1987).

Visando os feitos terapêuticos da planta Psidium guajava e a necessidade de novos

fármacos antibacterianos para tratamento de infecção causada pela bactéria

Escherichia coli enteropatogênica, o presente estudo teve como objetivo avaliar os

efeitos imunomodulador da folha da Psidium guajava em fagócitos mononucleares

sanguíneos para ação antibacteriana sobre as bactérias Escherichia coli

enteropatogênica.

12

2. Materiais e métodos

2.1. Coleta da folha da Psidium guajava

As folhas da Psidium guajava foram coletadas na Universidade Federal de Mato

Grosso, Campus Universitário do Araguaia, MT, Brasil, localizado em Lat. 15 º

55’7.0824” e Long. 52º 16’36.8112” a uma altitude de 354.0 m.

2.2. Extrato da folha da Psidium guajava

O preparo do extrato foi feito através das folhas em que envolveu um procedimento

de mistura e de maceração de acordo com o código farmacêutico brasileiro (França

et al., 2014). As folhas passaram por um processo de maceração, colocando 200 g de

folha de Psidium guajava em 1 L de água destilada. A preparação foi filtrada e diluída

na concentração de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL e colocado em

tubos falcon de 15 e 50 mL, o extrato da folha de Psidium guajava foi armazenado a

4 ° C.

2.3. Obtenção de Sangue Humano e de Células Mononucleares do Sangue

Periférico

Foram coletados 5 mL de sangue periférico de oito indivíduos (n= 8) clinicamente

saudáveis, na faixa etária de 19 a 25 anos de idade. Os voluntários assinaram o Termo

de Consentimento Livre e Esclarecido antes de participarem da pesquisa, o qual foi

aprovado pelo comitê de ética local da Universidade Federal de Mato Grosso (Anexo).

Uma parte do sangue total foi utilizada para as análises reológicas e o restante foi

utilizado para obtenção de células mononucleares.

As células mononucleares (MN) foram obtidas de acordo com método de Boyum,

(1968) por gradiente de densidade utilizando Ficoll Paque Plus® (GE Healthcare). Foi

adicionado 3 mL de Ficoll Paque Plus® acrescidos de 5 mL de sangue no tubo falcon

(15mL). As amostras foram centrifugadas por 40 minutos a 1600 rpm. Em seguida,

13

com auxílio de uma pipeta pasteur, foi realizado a coleta do anel de células MN. O

anel celular foi lavado por duas vezes em solução salina tamponada (PBS). Diante

disso, foi realizada a contagem na câmara de Neubauer, e ajustadas a uma

concentração de 2x106 células/mL de meio de cultura.

2.4. Análise Reológica

As análises reológicas foram realizadas pelo Modular Compact Rheometer – MCR

102 (Anton Paar GmbH, Ostfildern, Germany). As amostras foram divididas em 5

grupos sendo um controle com 600 µL de sangue e os demais grupos com 600 µL de

sangue e 60 µL do extrato em cada concentração estudada.

As leituras foram realizadas com controle permanente do gap de medição com suporte

TruGap™ em 0,099 mm, célula de medição tipo cone Toolmaster™ CP 50 (ângulo 1°)

e controle preciso da temperatura com recurso TReady™, utilizando Software

Rheoplus V3.61. Os gráficos reológicos foram todos realizados com o Software

Rheoplus. Para as curvas de fluxo e viscosidade os parâmetros estabelecidos foram

baseados no controle da tensão de cisalhamento (τ) de 0 a 5 Pa para curva

ascendente e de 5 a 0 Pa para a curva descendente de acordo com método de França

et al. (2014).

2.5. Viabilidade Celular

A viabilidade dos fagócitos do sangue periférico humano foi avaliada pela técnica de

alaranjado de acridina (Bellinati-pires et al., 1989). O Alaranjado de acridina é um

corante fluorocromo vital, metacromático, que se liga ao DNA ou RNA celular (Frester,

1971; Smith & Rommel, 1977). Quando examinado sob um microscópio ultravioleta,

em contato com DNA de cadeia dupla, emite cor verde, ortocromática e quando em

contato com o DNA desnaturado ou despolarizado, ou RNA de cadeia simples, na

14

forma metacromática, emite cor alaranjado ou avermelhado (Smith & Rommel,

1977;Mcfeters et al., 1991).

Após a separação e ajuste da concentração as células foram separadas em 5 grupos

sendo um o grupo controle e os demais tratados com o extrato nas diferentes

concentrações e incubadas em banho maria por 2 horas. A seguir as amostras foram

lavadas duas vezes com PBS e centrifugadas a 1600 rpm por 10 minutos. Após a

centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o pellet corados com 200 µL de

alaranjado de acridina por um minuto. Após a coloração foi acrescido 5 mL de PBS e

centrifugado por 10 minutos a 1600 rpm. A lavagem foi repetida por duas vezes em

PBS. Após a lavagem das células, o pellet foi desfeito e pipetado 10 µL de células em

uma lâmina e sobreposta uma lamínula. A contagem e classificação (morta e viva) foi

realizado em microscópio de fluorescência na objetiva de 40x. O índice de viabilidade

celular, foi obtido através da contagem de 100 células e expresso em porcentagem,

onde foram contabilizadas as células vivas que possuíam coloração verde e as células

mortas que possuíam coloração alaranjada, obtendo-se uma relação de células

vivas/mortas (França et al., 2011).

2.6. Linhagem de Escherichia Coli Enteropatogênica (EPEC)

A bactéria utilizada foi a Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) sorotipo 0111: H-

AL-, eae+, eaf+, bfp+ e conservada a -70ºC. A cultura de estoque foi armazenada em

ágar semissólido a temperatura laboratorial na ausência de luz. Com a utilização

dessa cultura de estoque, foram realizados repiques 24 horas antes do ensaio em

tubos de BHI de 10 mL, e estes foram incubados em estufas a 37ºC por 24 horas. Em

seguida, as bactérias foram lavadas duas vezes com PBS, e a concentração ajustada

para 1x107 bactérias por mL, medidas então com o espectrofotômetro (540 nm, DO=

0,1) de acordo com método de França et al. (2009).

15

2.7. Fagocitose

A fagocitose das células MN do sangue periférico humano foi avaliada pela técnica de

alaranjado de acridina (Bellinati-pires et al., 1989). Volumes iguais de bactérias EPEC

(2x107 bactérias/mL) e células MN (2x106 células/mL) foram adicionadas em tubos

falcon e estimuladas com o extrato de Psidium guajava nas diferentes concentrações.

O volume final da mistura fagocitária foi de 0,5 mL. As suspensões das bactérias

EPEC e células MN foram submetidas à incubação prévia por 30 minutos, em banho

maria a 37ºC, sob agitação. Após esse período as suspensões foram centrifugadas

por 10 minutos, a 160 G sob refrigeração a 4 ºC. O "pellet" foi corado com 200 µL de

alaranjado de acridina (concentração 14,4 mg/mL) por 1 minuto e a seguir foi

ressuspendida em PBS, centrifugado e lavado com PBS mais uma vez. A seguir foram

montadas lâminas e contadas às células em microscópio de fluorescência (Nikon-

Eclipse E200).

Para a definição do índice de fagocitose, foram contadas 100 células com presença

ou ausência de bactérias intracelular. Foi considerado fagocitose positiva somente as

células que apresentaram pelo menos 3 bactérias no interior do fagócito (Honorio-

frança et al., 1997).

2.8. SOD (Enzima Superóxido Dismutase (Cu-Zn-SOD))

O método de determinação da concentração da enzima SOD foi através do método

de Crouch et al. (1981), que se baseia na capacidade da enzima de inibir a redução

de NBT (Nitro Blue Tetrazolium), compõe-se na ação da enzima catalisar por meio de

transformação o peróxido de hidrogênio e o superóxido de oxigênio. A enzima SOD

presente na amostra inibe a redução do azul de nitrotetrazólio (NBT) pelo ânion

superóxido. O ânion superóxido é gerado a partir da auto- oxidação da hidroxilamina

em pH alcalino.

16

A atividade enzimática da SOD foi realizada com o sobrenadante de células

mononucleares, incubadas com o extrato da folha de Psidium guajava nas diferentes

concentrações por duas horas, em banho maria sob agitação constante as quais

foram pipetados 0,5 mL de cada amostra e colocados em tubos de ensaio (vidro),

conforme protocolos produzidos no laboratório. Foi incorporado 0,5 mL de mistura

clorofórmio-etanol (1:1), 0,5 mL da mistura reativa de NBT em conjunto com ácido

etilenodiamino tetra-acético (EDTA) (1:1.5) e 2,0mL de tampão carbonato com

hidroxilamina, perfazendo ao final uma solução com volume de 3,5 mL. A mistura

reativa foi utilizada como branco para calibrar o aparelho e para a análise do padrão

foram utilizados 0,5mL de mistura hidro- alcoólica (1:4), 0,5mL de mistura clorofórmio-

etanol (1:1), 0,5mL da mistura reativa de NBT e EDTA (1:1.5) e 2,0mL de tampão

carbonato com hidroxilamina.

Todas as amostras foram incubadas em temperatura laboratorial por 15 minutos e

após esse período a reação foi paralisada em gelo. A quantidade de enzima foi

determinada a partir da seguinte fórmula:

SOD = (Ab. Padrão – Ab. Amostra) Ab. Padrão x 100 = % de redução do NBT SOD.

O resultado foi expresso unidades internacionais (UI) de SOD.

2.9. Análises Estatísticas

Para análise estatística foram realizados testes de Análise de Variância (ANOVA),

seguidos de pós-testes de comparações múltiplas de Tukey e teste de correlação de

Spearman pelo software Biostat 5.0.

17

3. Resultado e Discussão

3.1. Determinação dos parâmetros reológicos

O extrato da folha de Psidium guajava na concentração de 200 mg/mL, apresentou

alteração no comportamento sanguíneo diminuindo significativamente a média da

curva de fluxo do sangue periférico, entretanto, o extrato nas demais concentrações

não alterou o comportamento do fluxo sanguíneo (Figura 1), a figura 2 apresenta a

análise da viscosidade sanguínea tratada com o extrato da folha de Psidium guajava

nas diferentes concentrações, onde pode-se observar que o extrato nas

concentrações de 200 mg/mL e 200 µg/mL diminuiu significativamente a viscosidade

do sangue periférico, já nas concentrações de 200 ng/mL e 200 pg/mL o extrato não

alterou a viscosidade do sangue corroborando, Possamai e colaboradores (2020) em

seu estudo com Bryophytes spp. sobre o sangue periférico humano, em seus ensaios

de reologia, foi observado que a Bryophytes spp. não alterou o comportamento da

curva de fluxo e a viscosidade sanguínea. Porém, em um trabalho realizado com

extrato de Curcuma longa L. foi relatado que o extrato alterou o comportamento da

curva de fluxo e viscosidade do sangue periférico humano (Silva et al., 2020).

Demonstrando assim, que extrato de plantas medicinais possui diversos

comportamentos sobre o sangue humano, alertando a importância do estudo

reológico do fluxo e viscosidade do sangue, na presença de extratos de plantas

medicinais.

18

5

Pa

4.5

4

3.5

Shear Stress

3

2.5

2

1.5

SANGUE

*F. P. G. (200 mg/ml) + SANGUE

F. P. G. (200 µg/ml) + SANGUE

F. P. G. (200 ng/ml) + SANGUE

F. P. G. (200 pg/ml) + SANGUE

1

0.5

0

0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 1/s 2,000 .

Shear Rate

F. P. G. = Folha de Psidium guajava Figura 1. Curvas de fluxo dos grupos analisados sangue na presença do extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL e sangue sem estimulo como controle.

0.05

Pa·s

0.045

0.04

0.035

Viscosity

0.03

0.025

0.02

0.015

SANGUE

*F. P. G. (200 mg/ml) + SANGUE

*F. P. G. (200 µg/ml) + SANGUE

F. P. G. (200 ng/ml) + SANGUE

F. P. G. (200 pg/ml) + SANGUE

0.01

0.005

0

0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 1/s 2,000 .

Shear Rate

F. P. G. = Folha de Psidium guajava Figura 2. Viscosidade dos grupos analisados sangue na presença do extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL e sangue sem estimulo como controle.

* = p < 0,05

* = p < 0,05

19

3.2. Índice de viabilidade das células MN tratadas com extrato da folha de

Psidium guajava em diferentes concentrações

O extrato da folha de Psidium guajava nas diferentes concentrações não alterou a

viabilidade das células MN, e apresentou viabilidade superior à 90% (Figura 3). Em

estudo semelhante (Jang et al., 2014) utilizando extrato de folha de goiabeira em

diferentes concentrações sobre células RAW 264.7, observaram que o extrato da folha

de goiabeira também não afetou a viabilidade celular. Corroborando, Silva e

colaboradores (2020) também relataram resultados de viabilidade semelhante em sua

pesquisa com células mononucleares tratadas com Curcuma longa L. Desta forma,

pode-se observar que alguns extratos de plantas medicinais não afetam a viabilidade

celular.

F. P. G. = Folha de Psidium guajava MN = Células Mononucleares Figura 3. Índice de Viabilidade Celular (%) das células fagocíticas do sangue periférico incubados com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL.

3.3. Atividade de fagocitose das células MN do sangue periférico humano contra

bactérias EPEC

20

A atividade de fagocitose das células MN presente no sangue periférico humano,

aumentou quando tratadas com o extrato da folha de Psidium guajava em todas as

concentrações estudadas (Figura 4). Côrtes e colaboradores (2013) em seu estudo

com nanofrações do extrato de Strychnos pseudoquina mostrou um aumento no

índice de fagocitose de bactérias EPEC. Da mesma forma, trabalho com óleo de

babaçu como imunomodulador de fagócitos, demonstrou aumento na atividade de

fagocitose de células mononucleares (Pessoa et al., 2014). Outro estudo com

resultados semelhantes utilizando extrato de planta também relatou aumento no

índice de fagocitose de fagócitos sanguíneos (França et al., 2010). Dentre a

diversidade de plantas existentes, pode-se afirmar que a Psidium guajava, possui

efeito imunomodulador de fagócitos presente no sangue periférico humano, elevando

sua ação de fagocitose para eliminação de bactérias.

MN. = Células mononucleares F. P. G. = Folha de Psidium guajava EPEC = Escherichia coli enteropatogênica Figura 4. Índice de fagocitose (%) das bactérias Escherihia coli enteropatogênica pelas células fagociticas do sangue periférico tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações

de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL.

21

As análises de índice microbicida das células MN tratadas com o extrato da folha de

Psidium guajava nas diferentes concentrações, mostraram que os extratos nas

concentrações de 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL aumentaram a atividade

microbicida das células, entretanto, a concentração de 200 mg/mL não apresentou

alteração (Figura 5). Um importante mecanismo de defesa do organismo é a atividade

microbicida (Côrtes et al., 2013). Em um estudo onde foi analisado o efeito

antimicrobiano dos extratos de folha de goiabeira e do mamão, observou-se um

aumento na atividade de fagócitos em combate as bactérias Staphylococcus aureus

e Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) (Vieira et al., 2001).

MN. = Células mononucleares F. P. G. = Folha de Psidium guajava EPEC = Escherichia coli enteropatogênica Figura 5. Índice Microbicida (%) das bactérias Escherichia coli enteropatogênica pelas células fagociticas do sangue periférico tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL.

3.4. Concentração da enzima superóxido dismutase (CuZn-SOD) das células MN

e bactérias EPEC

O extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200mg/mL e 200 µg/mL

aumentou a atividade da enzima SOD das células MN do sangue periférico humano,

porém, as demais concentrações não alteraram a atividade da enzima nas células

22

(Figura 6). França e colaboradores (2012) em sua pesquisa com o composto “mais

vida”, observaram que o composto estimulou o aumento dos níveis de radicais livres

das células MN de ratos diabéticos. Em outro estudo, com óleo de babaçu também

pode-se verificar aumento nos níveis de radicais livres em fagócitos do sangue

periférico humano (Pessoa et al., 2014).

* = p < 0,05 comparado com o grupo controle. F. P. G. = Folha de Psidium guajava MN = Células Mononucleares Figura 6. Concentração de enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) no sobrenadante das células MN do sangue periférico tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200pg/mL.

As bactérias EPEC tratadas com o extrato da folha da Psidium guajava nas diferentes

concentrações, demonstraram resultados semelhantes aos ensaios das células MN

tratadas com o extrato, apresentando aumento significativo da atividade da enzima

SOD das bactérias EPEC quando tratadas com o extrato nas concentrações de

200mg/mL e 200 µg/mL e nas demais concentrações não houve alterações (Figura

7). O estudo de Hirudkar e colaboradores (2020) demonstrou um potencial

antioxidante do extrato da Psidium guajava e Quercetina contra a EPEC, e observou-

se também que o nível da lipoperoxidação (LPO) diminuiu e houve aumento da SOD

23

e da CAT, corroborando diretamente com o presente trabalho. Um estudo avaliando

o estresse oxidativo das bactérias EPEC tratadas com melatonina, demonstrou níveis

espontâneos de ânion superóxido (França et al., 2009), justificando presença das

enzimas antioxidantes SOD.

* = p < 0,05 comparado com o controle. F. P. G. = Folha de Psidium guajava EPEC = Escherichia coli enteropatogênica Figura 7. Concentração de enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) no sobrenadante das bactérias EPEC tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL.

No entanto, na cultura de células MN junto às bactérias EPEC tratadas com extrato

da folha de Psidium guajava nas diferentes concentrações, notou-se que nas

concentrações de 200 ng/mL e 200 pg/mL o extrato reduziu significativamente a

atividade da enzima SOD, resultado diferente foi observado com o extrato na

concentração de 200mg/mL, onde ocorreu aumento significativo da atividade da

enzima SOD (Figura 8). Côrtes e colaboradores (2013) em seu estudo, avaliaram

efeito imunomodulador da Strychnos pseudoquina adsorvido em PEG sobre fagócitos

sanguíneos e bactérias EPEC, onde relatou que houve aumento nos níveis de radicais

livres de fagócitos quando incubado junto com as bactérias EPEC. Em outro estudo,

24

com células MN tratadas com extrato de Momordica charantia L. observaram aumento

significativo na produção de radicais livres das células (Ormonde et al., 2014). Nesse

sentido, pode-se observar nos resultados deste estudo, que o nível de estresse

oxidativo celular para eliminação de patógenos é diretamente dependente da

concentração do imunomodulador utilizado, com esses dados o extrato da folha de

Psidium guajava exalta as evidências da nanomedicina.

* = p < 0,05 comparado com o grupo controle. F. P. G. = Folha de Psidium guajava MN = Células Mononucleares EPEC = Escherichia coli enteropatogênica Figura 8. Concentração de enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) no sobrenadante das células MN incubadas com bactérias EPEC e tratadas com extrato da folha de Psidium guajava nas concentrações de 200 mg/mL, 200 µg/mL, 200 ng/mL e 200 pg/mL.

3.5. Correlação da viscosidade sanguínea com a concentração da enzima

superóxido dismutase (CuZn-SOD)

Na Tabela 1 observou-se que os níveis da enzima superóxido dismutase das células

MN e das bactérias EPEC não dependem da viscosidade sanguínea, ou seja, não

apresentou correlação entre os ensaios da enzima SOD com os ensaios de

viscosidade do sangue. Porém, Connes e colaboradores (2016) descrevem que os

radicais livres de oxigênio danificam as hemácias e diminuem a deformabilidade e sua

25

agregabilidade, aumentando assim a força dos agregados de glóbulos vermelhos

podendo interferir na viscosidade sanguínea. Um estudo realizado com sangue

periférico humano tratado com extrato de Bryophytes spp. relatou correlação

inversamente proporcional entre os ensaios de viscosidade com os níveis da enzima

SOD (Possamai et al., 2020). Justificando que extratos de algumas plantas medicinais

podem apresentar efeitos terapêuticos correlacionados, enquanto outras plantas

podem ter efeitos moduladores direcionados.

Tabela 1. Correlação da concentração da enzima superóxido dismutase (Cu-Zn-SOD) com a viscosidade sanguínea.

GRUPOS VISCOSIDADE / SOD

Valor - p Valor - r

CEL. 0.5528 -0.3591

CEL. + F. P. G (200 mg/mL) 0.2847 -0.6000

CEL. + F. P. G (200 µg/mL) 0.4937 0.4093

CEL. + F. P. G (200 ng/mL) 0.3108 -0.5747

CEL. + F. P. G (200 pg/mL) 0.2847 -0.6000

F. P. G. = Folha de Psidium guajava CEL. = Células

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4. Conclusão

Em conclusão, pode-se afirmar que o extrato da folha de Psidium guajava nas

concentrações de 200 ng/mL e 200 pg/mL, possuem efeitos antibacterianos e não

alteram o comportamento fisiológico do sangue humano, podendo ser uma opção para

complementar o tratamento de infecção causada pela bactéria Escherichia coli

enteropatogênica.

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5. Referências

AJIZAH, A. Sensitivitas salmonella typhimurium terhadap ekstrak daun (psidium

guajava L.) Bioscientiae, v. 1, n. 1, 2018.

BABIOR, B. M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes. New England

Journal of Medicine, v. 298, n. 12, p. 659-668, 1978.

BARREIROS, A. L.B.S.; DAVID, J. M.; DAVID, J.P.; Estresse oxidativo: relação entre

geração de espécies reativas e defesa do organismo. Química Nova, v. 29, n. 1, p.

113-123, 2006.

BELLINATI-PIRES, R.; MELKI, S.E.; COLLETTO, G.M.; CARNEIRO-SAMPAIO, M.M.;

Evaluation of a fluorochrome assay for assessing the bactericidal activity of neutrophils

in human phagocyte dysfunctions. Journal of Immunological Methods, v. 119, n. 2,

p. 189-196, 1989.

BOYUM, A.; Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.

Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining

centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., v. 97, p.

77, 1968.

CONNES, P.; ALEXY, T.; DETTERICH, J.; ROMANA, M. The role of blood rheology

in sickle cell disease. Blood Reviews, v. 30, n. 2, p. 111-118, 2016.

CORRÊA, V. S. C.; MAYNIÉ, J. C.; FRANÇA, E. L.; HONÓRIO-FRANÇA, A. C.;

Atividade funcional de fagócitos na presença do fitoterápico ‘’Mais Vida’’. Revista

Brasileira de Plantas Medicinais, v. 8, n. 2, p. 26-32, 2006.

CÔRTES, M. A.; FRANÇA, E. L.; REINAQUE, A. P. B.; SCHERER, E. F.; HONORIO-

FRANÇA, A. C.; Imunomodulação de fagócitos do sangue humano pelo extrato de

Strychnos pseudoquina ST. HILL adsorvido em microesferas de Polietilenoglicol.

Polímeros, v. 23, n. 3, p. 402-409, 2013.

28

CROUCH, R. K.; GANDY, S. E.; KIMSEY, G.; GALBRAITH, R. A.; GALBRAITH, G.

M.; BUSE, M. G.; The inhibition of islet superoxide dismutase by diabetogenic drugs.

Diabetes, v. 30, n. 3, p. 235-241, 1981.

FARJANA, A.; ZERIN, N.; KABIR, M. S.; Antimicrobial activity of medicinal plant leaf

extracts against pathogenic bacteria. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, v.

4, p. S920-S923, 2014.

FRANÇA, E. L.; BITENCOURT, R. V.; FUJIMORI, M.; DE MORAIS, T. C.;

CALDERON, I. D. M. P.; HONORIO-FRANÇA, A.C.; Human colostral phagocytes

eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.

Journal of Microbiology, Immunology and Infection, v. 44, n. 1, p. 1-7, 2011.

FRANÇA, E. L.; FAGUNDES, D. L. G.; LEÃO, L. D.; HONÓRIO-FRANÇA, A. C. Efeito

do composto" mais vida" na ativação de macrófagos de ratos diabéticos. Revista

Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 1, p. 1-7, 2012.

FRANÇA, E. L.; MAYNIÉ, J.C.; CORREA,V.C.; PEREIRA,U.C.R.;BATALINI,C.;

FERRARI,C.K.B.; HONORIO-FRANÇA,,A.C.; Immunomodulatory effects of herbal

plants plus melatonin on human blood phagocytes. International Journal of

Phytomedicine, v. 2, n. 4, 2010.

FRANÇA, E. L.; PEREIRA JR, A.; OLIVEIRA, S. L.; & HONORIO-FRANÇA, A. C.;

Chronoimmunomodulation of melatonin on bactericidal activity of human blood

phagocytes. Int J Microbiol, v. 6, p. 1-13, 2009.

FRANÇA, E. L.; RIBEIRO, E.B.; SCHERER, E.F.; CANTARINI, D.G.; PESSOA, R.S.;

FRANÇA, F.L.; HONORIO-FRANÇA, A.C.; Effects of Momordica charantia L. on the

blood rheological properties in diabetic patients. BioMed Research International, v.

2014, 2014.

FRENSTER, J. H.; Electron microscopic localization of acridine orange binding to DNA

within human leukemic bone marrow cells. Cancer Research, v. 31, n. 8, p. 1128-

1133, 1971.

29

HIRUDKAR, J. R.; PARMAR, K. M.; PRASAD, R. S.; SINHA, S. K.; LOMTE, A. D.;

ITANKAR, P. R.; PRASAD, S. K.; The antidiarrhoeal evaluation of Psidium guajava L.

against enteropathogenic Escherichia coli induced infectious diarrhoea. Journal of

Ethnopharmacology, v. 251, p. 112561, 2020.

HONORIO‐FRANÇA, A. C.; CARVALHO, M.P.S.M.; ISAAC, L.; TRABULSI, L.R.;

CARNEIRO-SMPAIO, M.M.S.; Colostral mononuclear phagocytes are able to kill

enteropathogenic Escherichia coli opsonized with colostral IgA. Scandinavian

Journal of Immunology, v. 46, n. 1, p. 59-66, 1997.

JANG, M.; JEONG, S-W.; K.CHO, S.; YANG, J.; YOON, D-S.; CHANKIN, J.; PARK,

K-H.; Improvement in the anti-inflammatory activity of guava (Psidium guajava L.) leaf

extracts through optimization of extraction conditions. Journal of Functional Foods,

v. 10, p. 161-168, 2014.

KAFLE, A.; MOHAPATRA, S.S.; REDDY, I.; CHAPAGAIN, M.; A review on medicinal

properties of Psidium guajava. Journal of Medicinal Plants, v. 6, n. 4, p. 44-47, 2018.

LOWE, G. D. O. Blood rheology in vitro and in vivo. Bailliere's Clinical Haematology,

v. 1, n. 3, p. 597-636, 1987.

MCFETERS, G. A.; SINGH, A.; BYUN, S.; CALLIS, P. R.; WILLIAMS, S.; Acridine

orange staining reaction as an index of physiological activity in Escherichia coli.

Journal of Microbiological Methods, v. 13, n. 2, p. 87-97, 1991.

MUNDI, H.; BJORKSTÉN, B.; SVANBORG, C.; OHMAN L.; DAHLGREN.;

Extracellular release of reactive oxygen species from human neutrophils upon

interaction with Escherichia coli strains causing renal scarring. Infection and

Immunity, v. 59, n. 11, p. 4168-4172, 1991.

ORMONDE, J. V. S.; FERNANDES, R. T. S.; NUNES, G. T.; SCHERER, E. F.;

HONORIO-FRANÇA, A. C., & FRANÇA, E. L; Momordica charantia l. Plus melatonin

present an effective immunomodulatory effect to eliminated enteropathogenic

30

escherichia coli and streptococcus pneumoniae. World Journal of Pharmacy and

Pharmaceutical Sciences, V. 4, n. 3, p 58-75, 2014.

PARMAR, K.M.; HIRUDKAR, J.R.; BHAGWAT, D.S.; PRASAD, S.K.; Antidiarrheal

potential of Eriosema chinense vogel. against enteropathogenic Escherichia coli-

induced infectious diarrhea. Pharmacognosy Magazine, v. 15, n. 66, p. 455, 2019.

PEREIRA, M. G.; MALAGONI, R. A.; FINZER, J.R.D.; Reologia do escoamento do

sangue em artéria. Blucher Chemical Engineering Proceedings, v. 1, n. 3, p. 2135-

2140, 2015.

PESSOA, R. S. et al. Microemulsion of babassu oil as a natural product to improve

human immune system function. Drug Design, Development and Therapy, v. 9, p.

21, 2015.

POSSAMAI, M. M.; NUNES, G. T.; MACHADO, S. S.; ATHAYDE-FILHO, F. P.; SILVA,

K. P. G.; TORRES, A. H. F.; FAGUNDES-TRICHES, D. L. G.; HONORIO-FRANÇA,

A. C.; FRANÇA, E. L.; SILVA, J. M. Bryophytes from cerrado-amazon transition region

can acts on breast cancer cells. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

Sciences, v. 9, n. 1, p. 1491-1504, 2020.

SILVA, L. C. P.; CORRÊA, I. C. S.; TORRES, A. H. F.; LINHARES, T. M.; SOUZA, C.

C.; HONORIO- FRANÇA, A. C.; FRANÇA, E. L. Biological effects of curcuma longa l.

on phagocytosis of enteropathogenic escherichia coli. World Journal of Pharmacy

and Pharmaceutical Sciences, v. 9, n. 4, p. 1056-1070, 2020.

SMITH, D.L.; ROMMEL, F.; A rapid micro method for the simultaneous determination

of phagocytic-microbiocidal activity of human peripheral blood leukocytes in vitro.

Journal of Immunological Methods, v. 17, n. 3-4, p. 241-247, 1977.

VIEIRA, R. H. S. F.; RODRIGUES, D. D. P.; GONÇALVES, F. A.; MENEZES, F. G. R.

D.; ARAGÃO, J. S.; SOUSA, O. V. Microbicidal effect of medicinal plant extracts

(Psidium guajava Linn. and Carica papaya Linn.) upon bacteria isolated from fish

muscle and known to induce diarrhea in children. Revista do Instituto de Medicina

Tropical de Sao Paulo, v. 43, n. 3, p. 145-148, 2001.

31

VYAS, N.; TAILANG, M.; GAVATIA, N.P.; GUPTA, B.K.; Antioxidant potential of

Psidium guajava Linn. International Journal of PharmTech Research, v. 2, n. 1, p.

417-419, 2010.

YANG, F.; CHANG, Z.; CHANG, L.; YANG, B.; Regulation of virulence and motility by

acetate in enteropathogenic Escherichia coli. International Journal of Medical

Microbiology, v. 308, n. 7, p. 840-847, 2018.

32

6. Anexos

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