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VALORACIÓN Y ESTUDIO DEL ACHIOTE COMO FUENTE DE COLORANTE NATURAL EN ALIMENTOS

Cecilia K. Curi-Borda1,2, Juan-Antonio Alvarado2 y Bjorn Bergenstahl1 1. Departamento de Tecnología de Alimentos, Ingeniería y Nutrición, Universidad de Lund, P.O. Box 124, SE-22100 Lund, Suecia. 2. Instituto de Investigaciones Químicas, Universidad Mayor de San Andrés, Calle 27 de Cota Cota, Casilla 303, La Paz, Bolivia. Resumen El objetivo principal de este trabajo de divulgación es elucidar la valoración, el impacto social y la contribución del estudio del achiote como colorante natural en alimentos. El sustento científico de este proyecto radica y se basa en el estudio del microencapsulamiento del colorante del achiote para su dispersibilidad en agua y estabilización frente a la luz. Del arilo que recubre las semillas de la especie vegetal Bixa orellana se puede obtener el colorante natural “bixina”. También se puede obtener un extracto purificado denominado “annatto” compuesto por bixina y por los carbohidratos nativos del arilo de la semilla. El proyecto consta de dos partes. La primera consistió en la caracterización de las formas y colores de frutos de Bixa orellana colectados de los yungas de La Paz. Obtener un balance de masas mostrando los porcentajes de agua, de semilla sin colorante, de colorantes y de carbohidratos nativos. La segunda parte, consistió en estudios de microencapsulamiento de bixina y del extracto de annatto mediante secado por aspersión (spray dryer). Se utilizaron materiales encapsulantes como maltodextrina y sacarosa, añadiendo gelificantes para comparar sus propiedades encapsulantes. Una vez obtenidas las microcápsulas, se realizaron estudios de dispersibilidad de las microcápsulas de colorante disueltas/dispersas en agua. Después, se estudió la estabilidad de los polvos microencapsulados frente a luz visible. Finalmente, se prepararon dulces coloreados con annatto y se realizaron análisis colorimétricos y estudios sensoriales. Los resultados permiten generar investigación y desarrollar formulaciones de colorantes naturales y expandir sus usos en alimentos y cosméticos. Palabras Claves: Bixina, achiote, urucú, extracción, microencapsulamiento, eficiencia de encapsulamiento, dispersibilidad en agua, estabilidad frente a la luz, aplicaciones 1 Introducción Bolivia es uno de los países con mayor biodiversidad, tanto en vegetación como en formaciones geológicas (Romero and West, 2006). Existen más de 23 700 especies de plantas que se encuentran en Bolivia, de las cuales alrededor de 980 especies vegetales han sido domesticadas por tener una importancia nutricional, medicinal u otra importancia económica (Villegas and Gandarillas, 2008). Dentro de la producción boliviana existen alimentos y especies vegetales con componentes que presentan colores muy intensos (achiote, maíz morado, Zea mays; papas moradas, Solanum tuberosum; Mashua o Isaño, Tropaeolum tuberosum; Oca, Oxalis tuberosa; Ayrampo, Ayrampo ayrampo, camote, Ipomoea batatas, Quinoa, Chenopodium quinoa, etc.). Estos componentes presentan valor para ser utilizados como colorantes naturales potenciales. Los colorantes responsables de estos colores son los carotenoides como la bixina y la norbixina en el caso del achiote (Figura 1) (Scotter, 2009). Otros colorantes naturales son las antocianinas como en el caso

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del maíz morado, las cianidinas solubles en agua, betacianinas, xantofilas y otros (Peñarrieta et al., 2014, Cortez et al., 2017) El achiote es un arbusto cuyo nombre científico es Bixa orellana. El achiote contiene en sus frutos semillas que están recubiertas por un arilo de color naranja-rojizo, del cual, se extrae los colorantes naturales bixina y norbixina. También se extraen extractos llamados “annatto” enriquecidos con estos colorantes y con los carbohidratos naturales del arilo de la semilla(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA). Meeting, 2007). Los extractos de annatto tienen una gran importancia a nivel internacional para colorear productos como quesos, mantequillas, y productos pasteleros entre otros (Satyanarayana and Prabhakara, 2003). Del total de colorantes naturales utilizados en alimentos y otros productos, el annatto constituye el 70% de ese mercado (LC Albuquerque and AA Meireles, 2011). Los principales consumidores son Estados Unidos, Europa y Japón (Green, 1995). Bolivia, en el año 2007 exportó alrededor de 96,400 toneladas de achiote equivalente a 90,000 USD dólares (IBCE, 2009).

Figura 1: Colorantes naturales Bixina y Norbixina obtenidos de las semillas del Achiote.

Annatto tiene un gran potencial para extender su aplicación en productos alimenticios con base acuosa, cosméticos y otros. Sin embargo, existen desafíos que abordar. Los principales desafíos incluyen la prospección de variedades vegetales con alto contenido colorante para el establecimiento de programas de cruzamiento (Akshatha et al., 2011, Dias et al., 2017, Mantovani et al., 2013). El entender la relación entre el aspecto de los frutos y el contenido de pigmento permite generar criterios de selección de variedades potenciales de achiote (Taboada and Salm, 1997). Posteriormente, una vez cosechadas las semillas, cualquier procesamiento del pigmento comienza con su extracción. La insolubilidad acuosa del pigmento de las semillas (Scotter, 2009), con la bixina como componente principal, supone un desafío para los procesos de extracción sin disolventes. En ese sentido es de interés la obtención de formulaciones dispersables en agua. Otro aspecto importante es su inestabilidad frente a la luz (Scotter, 2009). Por eso es de interés el desarrollo de formulaciones que protejan al colorante frente a la degradación por la luz. El microencapsulamiento es una técnica que permite modificar las propiedades físicas de las sustancias y ofrecer características como dispersibilidad en agua y protección frente a la luz (Cortez et al., 2017). Por eso, el microencapsulamiento por secado por aspersión se sugiere como una técnica asequible y que está bastante extendida en la industria para afrontar los desafíos mencionados (Gouin, 2004). Por lo tanto, el objetivo de este estudio tuvo dos partes. En la primera parte, hacer una evaluación de las variedades y contenidos colorantes que se pueden encontrar en las regiones de ocurrencia de esta especie vegetal en el departamento de La Paz. En la segunda parte, abordar los desafíos de insolubilidad en agua e inestabilidad del annatto desde una perspectiva coloidal y tecnológica utilizando el microencapsulamiento por secado por aspersión (spray drier). Y finalmente evaluar la fotoestabilidad de los colorantes microencapsulados (en polvo), y aplicados en dulces. De esta manera, lograr extender la

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vida útil del colorante y conocer sus propiedades para planificar los posibles requisitos de comercialización como por ejemplo el envoltorio del producto y sus condiciones de uso. 2. Material y Métodos 2.1 Características morfológicas de los frutos de Bixa orellana Un equipo de 5 personas colectó frutos de 27 especímenes en distintos puntos de muestreo de la región del norte de La Paz – Bolivia (Yungas de La Paz) en un rango altitudinal que varía desde los 400 hasta los 1900 m.s.n.m (Figura 2). Se trabajó en colaboración con el biólogo, Lic. Luis Marconi, que forma parte del Herbario Nacional de Bolivia. Se midieron y calcularon un total de 23 variables morfológicas en los frutos. Estas mediciones incluyen el largo, ancho y el perímetro de los frutos entre otros. También se midieron nueve variables relacionadas al color de los frutos. Por otro lado, se determinaron los contenidos de los colorantes presentes en las semillas. En base a un análisis de estos componentes principales y un clúster jerárquico (herramientas estadísticas), se encontraron grupos con características botánicas diferenciables que permitieron clasificar las muestras en grupos.

Figura 2: Puntos de muestreo de los frutos de Achiote de diferentes municipios del norte de La Paz. Manuscrito 1: Curi-Borda et. al., Caracterización morfológica y fitoquímica de muestras de achiote

Los contenidos de bixina y norbixina en las semillas fueron analizados por HPLC 1 año después de la colecta. El colorante extraído de las semillas fue analizado por técnicas fotométricas y de separación de sustancias (espectroscopía UV-vis y HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución). Por otro lado, se realizó un balance de masas de la semilla, arilo y contenido de humedad por gravimetría. 2.2 Extracción del colorante El achiote (Bixa orellana) presenta semillas recubiertas por un arilo que contiene carbohidratos nativos, los colorantes naturales bixina y norbixina, y compuestos fenólicos minoritarios (Curi-Borda et al., 2019). Los métodos más comunes de extracción utilizan aceite, solventes, saponificación de bixina en norbixina mediante abrasión con soluciones alcalinas fuertes y extracción de extractos enriquecidos en bixina por abrasión con soluciones alcalinas débiles (H.D. Preston, 1980). Existe amplia cabida para mejorar los

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métodos de extracción del arilo que no modifiquen la composición de los colorantes en la semilla y permita así su cuantificación y caracterización fitoquímica. Uno de los métodos de extracción desarrollado y utilizado en este proyecto es el reportado en el primer artículo de este proyecto que fue publicado en la revista científica Internacional “Foods” (Curi-Borda et al., 2019). Este método es una modificación del método de abrasión con soluciones alcalinas débiles (Additives and Nation, 2006). Este método fue empleado para procesar las 27 muestras de semillas colectadas en los municipios del norte de La Paz. El método consistió en mezclar una base débil como el carbonato de sodio con las semillas de achiote. Primero se realiza la mezcla de ambos componentes en estado sólido, para luego añadir agua gradualmente para suspender el colorante en agua. Luego se separa las semillas de la suspensión utilizando un tamiz y se repite la operación hasta extraer todo el colorante de las semillas. La concentración del álcali en la suspensión final es menor a 0.4% tal que no exista saponificación (Manke Nachtigall et al., 2009). 2.3 Microencapsulación por secado por aspersión (Spray Drier) El microencapsulamiento de los colorantes se realizó utilizando cristales purificados de bixina y un extracto de annatto que contenía a la bixina y a los carbohidratos nativos del arilo. El microencapsulamiento consiste en cubrir las moléculas pequeñas de colorante con macromoléculas (sustancias más grandes que los colorantes). Estas macromoléculas pueden ser espesantes como maltodextrina y gelificantes como la gelatina, goma arábica, pectina y CMC (carboximetilcelulosa) (Gouin, 2004). Para realizar el microencapsulamiento, se utiliza un equipo llamado secador por aspersión o Spray Dryer (en inglés). El líquido que contiene al colorante y al espesante es introducido dentro del equipo. El líquido pasa a través de un ciclón que produce gotitas de líquido que son introducidas en una cámara caliente donde el agua se evapora. Lo que queda es el polvo del colorante microencapsulado en el espesante. Ese polvo se colecta al final del proceso en un contenedor. La eficiencia de encapsulamiento puede entenderse como la cantidad de colorante que está dentro de las microcápsulas con respecto al total de colorante de la cápsula. Tal como se muestra en la Figura 3. Esta eficiencia de encapsulamiento nos dice qué porcentaje de color estará protegido (Barbosa et al., 2005).

Figura 3: Eficiencia de encapsulamiento del color en las microcápsulas producidas

Las eficiencias de encapsulamiento de nuestras muestras fueron obtenidas por estudios gravimétricos y espectrofotométricos.

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2.4 Determinación del tamaño de partículas La determinación del tamaño de las partículas fue realizada utilizando un equipo basado en la difracción laser (Curi-Borda et al., 2019). Este equipo mide la distribución del tamaño de partículas de los polvos microencapsulados. Este equipo permite obtener información valiosa para poder mejorar el proceso de secado por aspersión de cualquier polvo en el ámbito alimenticio. 2.5 Estabilidad física de las dispersiones acuosas Como se mencionó anteriormente, el colorante del achiote, en particular la bixina no se disuelve en agua. Sin embargo, el microencapsulamiento permite obtener formulaciones o partículas de colorante que pueden ser dispersadas en el agua. Imagínese usted como pequeñas gotitas de aceite mezcladas en el agua. Las gotas de aceite nunca se disolverán en el agua (el azúcar si se disuelve en agua), pero si, las gotitas de aceite estarán mezcladas por cierto tiempo hasta que el agua y el aceite se separen completamente. En nuestro caso, las gotitas de aceite equivalen a las partículas de colorante que están dispersas en agua. Los estudios de estabilidad física, se realizaron utilizando técnicas de dispersión de la luz en partículas, específicamente el equipo TURBISCAN (Mengual et al., 1999). 2.6 Estabilidad de los polvos frente a la luz Los polvos coloreados (microcápsulas) fueron irradiados con una lámpara que emitía luz con un espectro de luz visible parecido al espectro de luz recibido por la luz del sol. Los polvos fueron irradiados por 30 días lo que equivalía a 3000 mol de fotones / m2. Las muestras de los polvos fueron colectadas cada 3 tres días para ser analizadas. Las muestras fueron analizadas por espectrofotometría visible y HPLC. Esto con el objetivo de analizar como variaba la concentración de colorante a lo largo del tiempo. Y así, ver si la concentración de colorante se mantenía constante o si iba disminuyendo a causa de la radiación visible de la lámpara. A partir de estos datos, se generaron unas curvas de degradación a lo largo del tiempo, y además se calculó la sensibilidad frente a la luz, de los colorantes sin protección y de las microcápsulas. 2.7 Variación del color en los dulces Se prepararon dulces utilizando el extracto de annatto o con sus microcápsulas para darle color. Los parámetros de color RGB fueron determinados de las fotos de los dulces preparados. Estos parámetros RGB son utilizados para describir los colores de manera digital. Los dulces fueron irradiados de igual forma que los polvos con la lámpara de luz visible. Se midió el color (en RGB) y la concentración del colorante a lo largo del tiempo. Los valores colorimétricos de los dulces recién preparados, a las diferentes concentraciones de colorante, fueron utilizador para las pruebas sensoriales. 3. Resultados En esta sección presentaremos los resultados más importantes del proyecto de colorantes.

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3.1 Características de los frutos de achiote Los análisis de las muestras colectadas muestran que existe una amplia variedad en las formas y los colores de los frutos de achiote. Las muestras más abundantes presentan frutos con dos colores y formas cuspidadas. También se encontraron frutos redondeados, un rasgo que se atribuye a Bixa urucuana, su pariente silvestre más cercano 3. En base a sus parámetros morfométricos, químicos y de color se lograron clasificar las muestras en 3 grupos, dentro de los cuales se observaron 8 subgrupos en total y que se muestran en la Figura 4. El promedio general de contenido en las muestras es de 3.1 ± 0.6%. Frutos con contenidos de pigmento por encima de este promedio corresponden a frutos con formas agudas hacia el ápice, tonos oscuros y dehiscentes. Los modelos lineales empleados indican que frutos con tonos más claros suelen poseer mayor proporción de norbixina. Y también, que a medida que los frutos son más grandes y más aplanado-ovalados, mayor es el porcentaje de pigmento que podrían contener (ambas variables únicamente explican el 20% de la variación del modelo). Finalmente se encontró y que la altura no tiene una relación clara con el contenido de colorante, lo que indica que podrían cultivarse a diferentes alturas obteniendo elevados contenidos de pigmento.

Figura 4: Variedad de las formas y color de frutos de achiote clasificados a partir de las 27 muestras colectadas de Los Yungas de La Paz.

Manuscrito 1: Curi-Borda et. al., Caracterización morfológica y fitoquímica de muestras de achiote 3.2 Balances de masas de las semillas La semilla muestra una composición promedio de todas las muestras colectadas de 13,5% de arilo seco, 81.5 % de semilla seca y 5 % de agua. Del 13,5% de contenido de arilo, el 3% corresponde al contenido de colorante (2.4% de Bixina y 0.6% de norbixina). El restante 10.5% comprende almidón, arabinogalactanos y compuestos fenólicos entre otros (Curi-Borda et al., 2019). Se encontró una alta correlación entre los contenidos de bixina y norbixina. A mayor bixina menor contenido de norbixina y viceversa. Además, se presume que el contenido de compuestos fenólicos aumenta con la altura (m.s.n.m) gracias a una correlación estadísticamente significativa entre un compuesto fenólico analizado por HPLC y la altura. 3.3 Eficiencia de encapsulamiento de las microcápsulas de colorante La bixina y el extracto de achiote fue extraído y secado en el secador por aspersión con diferentes materiales encapsulantes: maltodextrina (MD), sacarosa y mezclas con los

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agentes gelificantes goma arábica, carboximetilcelulosa (CMC) y Pectina. Se determinó la eficiencia de encapsulamiento de los diferentes polvos. Los resultados muestran que las muestras de colorante que contienen los carbohidratos nativos presentan mayor eficiencia de encapsulamiento como se aprecia en la Figura 5.

Figura 5: Eficiencia de encapsulamiento (EE) en función de los diferentes materiales encapsulantes. Las barras amarillas corresponden al colorante de la bixina pura y Las barras verdes corresponden al extracto de

annatto que contiene carbohidratos nativos. Extraído de (Curi-Borda et al., 2019). También se encontró que los mejores encapsulantes incluyen a la maltodextrina y también a la maltodextrina con la adición de un gelificante como goma arábica o pectina. Un resultado muy interesante fue que los carbohidratos nativos por si solos no son un agente encapsulante eficiente. No obstante, en cuanto se mezcla la sacarosa con los carbohidratos nativos, la mezcla se convierte en un excelente agente encapsulante con una elevada eficiencia de encapsulamiento. Durante este tiempo se supervisaron a dos estudiantes de pregrado quienes realizaron pasantías en nuestro laboratorio y trabajaron en los procesos de extracción y encapsulación del colorante. 3.4 Formas y tamaños de las microcápsulas Utilizando un microscopio electrónico de barrido, SEM (Scanning Electron Microscopy), se obtuvieron las imágenes de las partículas de las cuales están compuestas los diferentes polvos microencapsulados. Las formas de las microcápsulas y poder observar el polvo nos permite obtener información acerca de las propiedades de ese polvo. Por ejemplo, en la Figura 6c se puede observar que, si mezclamos bixina pura con azúcar, no se producen microcápsulas, y por esa razón se obtiene una eficiencia de encapsulamiento muy baja para este sistema. De igual forma, podemos apreciar la mejora de las microcápsulas que contiene solo los carbohidratos (Figura 6b) cuando agregamos la sacarosa (Figura 6d). Además, podemos ver la importancia de los carbohidratos para mejorar el microencapsulamiento del colorante en la Figura 6. Cuando son cristales de bixina pura, se pueden observar cristales que no están microencapsulados. En cambio, cuando se encapsula el extracto de annatto, no se observan partículas de colorante fuera de las microcápsulas.

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Figura 6: Microcápsulas de los sistemas microencapsulados observados mediante un microscopio de barrido electrónico (SEM). A la izquierda se observa: a) Extracto de annatto sin encapsular, b) bixina encapsulada con sus carbohidratos (Annatto), c) bixina encapsulada con sacarosa, d) annatto encapsulado con sacarosa. A la derecha microcápsulas de: e) Bixina (B) con maltodextrina (MD), f) annatto (A) con MD, g) B con MD y goma arábica (GA) y h) Annatto con MD y GA. Extraído de (Curi-Borda et al., 2019) 3.5 Dispersibilidad de los colorantes en agua Disolviendo las microcápsulas en agua, y regulando el pH = 3 (medio ácido), se monitoreó el tiempo que tardaron las partículas de color en sedimentar mediante técnicas de dispersión de la luz (Equipo TURBISCAN). Los resultados muestran que las partículas de bixina pura sedimentan muy rápidamente durante las primeras horas. En cambio, las partículas de annatto que contienen carbohidratos nativos sedimentan más lentamente para tamaños de partícula similares en comparación con partículas de bixina. Las muestras con annatto mantienen el color hasta los 40 días (Figura 7). Después de este tiempo, podemos ver que en las muestras con annatto, contenían todavía partículas de tamaños entre 0.2 y 0.8 µm que permanecían dispersas en agua ofreciendo color.

Figura 7: Dispersiones acuosas de microcápsulas de annatto y bixina pura a 0,3 mg/ml a pH ácido después de 40 días del estudio de estabilidad física. De izquierda a derecha: I: Annatto-MD, II: Annatto-Sacarosa, III: Annatto-Suero, IV: Annatto-encap, V: Annatto, VI: Annatto-MD-CMC, VII: Annatto-MD-GA, VIII: Annatto-MD-

Pectin, IX: Bixina-MD, X: Bixina-Suero, XI: Bixina-Sacarosa, XII: Bixina-MD-GA, XIII: Bixina-MD-CMC. Extraído de: (Curi-Borda et al., 2019)

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3.6 Estabilidad de los colorantes frente a la luz Después de realizar las pruebas de estabilidad de los colorantes bixina y annatto y de los polvos microencapsulados frente a una lámpara de luz visible, se graficaron las curvas de concentración en función de la dosis de luz recibida desde la lámpara. Se determinó que las muestras se degradan de manera lineal pero que las curvas lineales pueden presentar formas exponenciales cuando la dispersión de la luz producida por el polvo se vuelve significativa. Durante estos estudios, Vandana Tannira, una maestrante de la Universidad de Lund, obtuvo su grado en las pruebas de fotoestabilidad de las microcápsulas. Este trabajo constituyó el material para una segunda publicación sobre este trabajo. Una vez determinadas las curvas de degradación se calcularon los rendimientos cuánticos de las muestras. Estos rendimientos cuánticos indican el grado de sensibilidad del colorante frente a la luz visible. Los resultados muestran que el microencapsulamiento protege a los colorantes bixina y annatto hasta 70 veces más que si irradiáramos a los colorantes sin ninguna protección (Figura 8). Nuestros resultados muestran que la sensibilidad del colorante frente a luz dependerá de la eficiencia de microencapsulamiento del colorante. A mayor eficiencia de encapsulamiento, menor será la sensibilidad del color frente a la luz.

Figura 8: Rendimientos cuánticos de los colorantes bixina y annatto y de sus microcápsulas. B: Bixina, A: annatto. Manuscrito 2: Curi-Borda et. al., Modelo para medir la estabilidad frente a la

luz de sustancias fotolábiles en camas de polvo utilizando microcápsulas de bixina obtenidas mediante secado por aspersión

3.7 Dulces coloreados con los colorantes obtenidos La estabilidad de los colorantes en los caramelos frente a la luz visible se realizó bajo una lámpara visible de igual forma que en los polvos microencapsulados. Se utilizaron tres colorantes: un extracto de annatto, el extracto de annatto microencapsulado con sacarosa y el extracto de annatto microencapsulado con maltodextrina. Dado que las cápsulas se disuelven en el preparado de los dulces, no se observaron diferencias en la degradación del color con la dosis de luz recibida. Esto significa que los tres tipos de colorante en los dulces presentaron el mismo rendimiento cuántico. Este valor de sensibilidad frente a la luz resultó similar al valor de las microcápsulas en los experimentos de estabilidad en los

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polvos. El promedio de los valores obtenidos fue de 3,4 µ mol bixina/µmol quanta. Esto indica que la matriz del dulce estaría actuando como protector del colorante. Es importante mencionar que cuanto más concentrado esté el colorante, mayor tiempo tomará en degradarse a una velocidad dada por su rendimiento cuántico. Durante estos estudios la maestrante de la Universidad de Lund, Mina Hajian, durante sus prácticas de investigación, trabajó en los estudios de fotoestabilidad de los caramelos.

Figura 9: Dulces preparados utilizando el colorante natural annatto y sus microcápsulas: annatto

con sacarosa y annatto con maltodextrina. Manuscrito 3: Curi-Borda et. Al. Estudios colorimétricos y de estabilidad en dulces coloreados con extractos de annatto.

Los estudios de estabilidad fueron monitoreados por espectrofotometría y la variación de color se midió por sus valores RGB de las fotos de los dulces. Después de prepararse los dulces (antes de los estudios de degradación), se midieron los parámetros RGB de las fotografías observadas en la Figura 9. Utilizando estas fotografías se realizó un estudio de análisis sensorial en formato electrónico. De 58 participantes internacionales en nuestro estudio sensorial o de aceptación hedónica, el 16% de las personas dijeron que les gustaba mucho el color de los dulces. El 69% dijo que les gustaba el color de los caramelos y el 16% dijo que no les gusta ni les disgusta el color (Indiferentes). También, el 84% de los participantes dijeron que comerían los dulces por el color que presentaban. Los participantes estuvieron de acuerdo con que las coloraciones de los extractos de achiote podrían estar asociadas con ciertos sabores como la naranja (36%), la papaya (21%) y mandarina (36%). Otros sabores sugeridos fueron Tutti fruti (2%) y maracuyá (2%). El resto 3% dio sugerencias con respecto al color o no entendió la pregunta. 4. Discusión Los resultados de la colecta de las muestras de achiote muestran que contamos con una gran variedad de formas y colores en los frutos de achiote, lo que implica una gran diversidad de material genético de la especie. Conocer estas variedades permite sentar las bases para un programa de mejoramiento del achiote para lograr incrementar la producción de colorante en la planta. Es importante mencionar, que esta planta se reproduce por alogamia. Es decir, existe una polinización cruzada entre plantas. Esto genera que las variedades se vayan mezclando, produciéndose esa gran cantidad de variedades observadas. El cruzamiento controlado entre variedades apuntaría a un mejoramiento de las características deseadas de las plantas como mayor cantidad de colorante y que los frutos no se abran en la madurez de la planta (indehiscencia). Los resultados de este trabajo abren la puerta para generar nuevas colaboraciones tanto con productores como con otros investigadores en el área agronómica.

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Debido a la insolubilidad del colorante en agua, es más difícil extraerlo de una manera sencilla. Y por tanto, el control del contenido de colorante que está relacionado con su precio de venta es más difícil de determinar para un productor. Como resultado de este trabajo se ofrece una alternativa sencilla para extraer el colorante y medir la cantidad en peso de pigmento que presenta la semilla. Esto se puede lograr utilizando una balanza, y pesando la semilla antes y después de la extracción del colorante. Si bien es un método rápido y no exacto, puede ser una buena medida para para dar una idea a los productores sobre los contenidos de pigmento de sus semillas. Y además, el procedimiento podría ser mejorado para dar un valor exacto de porcentaje de masa de arilo en base seca si se incluye un hornito de secado de las semillas. Una vez obtenido el colorante de achiote, nuestros resultados muestran que es posible microencapsularlo por secado por aspersión. Se pudo constatar que tanto materiales como maltodextrina y potenciadores como goma arábica, pectina y CMC ofrecerán una alta eficiencia de microencapsulamiento del colorante. Estos resultados son comparables con estudios previos reportados por Mercadante (18). Su gran calidad como encapsulantes podría explicarse por las propiedades emulsionantes y formadoras de películas de CMC 39 y GA 40. Además, mantener los carbohidratos nativos junto con el colorante como en el caso de los extractos de annatto permitirá incrementar la eficiencia de microencapsulamiento. Esto, en comparación con el microencapsulamiento de la bixina pura, donde se observa una menor eficiencia de encapsulamiento por parte de los encapsulantes. Los carbohidratos nativos no ofrecen tan alta eficiencia de encapsulamiento, probablemente debido a la baja cantidad con respecto al colorante. Sin embargo, añadir azúcar convierte la mezcla de azúcar y carbohidratos nativos en un excelente encapsulante. Otro parámetro importante que afecta a la eficiencia de encapsulación es la distribución del tamaño de partícula de la dispersión colorante. Nuestros resultados muestran una tendencia lineal de aumento en la eficiencia de encapsulación con la disminución del diámetro promedio de las partículas de colorante. Esto significa que se logrará una mejor protección del colorante disminuyendo el tamaño de la partícula de la cápsula. Esto se observa tanto con bixina pura como con microcápsulas de extracto de annatto. Las pruebas de estabilidad de las dispersiones de las formulaciones de colorante en agua mostraron que las partículas tienden a sedimentar y flocular a lo largo del tiempo. Se observó una mayor estabilidad para las dispersiones acuosas que contenían el extracto de annatto (con carbohidratos nativos) en comparación con las dispersiones de bixina pura. Esto, incluso para diámetros de volumen promedio similares (4µm). Esto sugiere fuertemente que la presencia de los carbohidratos nativos (hemicelulosa y almidón) puede estar estabilizando las partículas del extracto de annatto de alguna manera. Es posible que después del secado por aspersión de los carbohidratos nativos, su estructura se vuelva más amorfa, ayudando a la dispersión de las partículas de color en agua por mayor tiempo. La sensibilidad frente a la luz (Rendimiento cuántico) de los extractos de annatto y de la bixina pura en estado sólido es de aproximadamente 100 moles de Bixina/mol quanta. Los rendimientos cuánticos de las muestras encapsuladas muestran una tasa de degradación aproximadamente 70 veces menor. Los sistemas con una alta eficiencia de encapsulación muestran una baja sensibilidad frente a la luz visible. Los resultados actuales muestran una disminución en la sensibilidad a la luz del achiote que puede ser alcanzada por una protección contra la luz dada por la matriz de los dulces.

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Esta protección es similar a la otorgada por el azúcar en el sistema (polvo) de bixina pura mezclada con azúcar. Finalmente, los dulces son una alternativa interesante para la expansión del annatto como colorante en alimentos. Se observó que se pueden generar una variedad de colores en los dulces, y que diferencias de color entre estos dulces serán percibidas visualmente en diferencias de color por encina de E > 3. 5 Conclusiones Los resultados de la primera parte de nuestros estudios muestran una gran variedad de las formas y colores de los frutos (gran número de morfotipos) de las muestras de frutos colectados de Bixa orellana provenientes de los yungas de La Paz. Veintisiete muestras recolectadas de los municipios de La Paz se clasificaron en 3 grupos de acuerdo con 16 parámetros morfológicos, 4 parámetros de color y 4 parámetros fitoquímicos. Los ocho subgrupos confirman la alta diversidad fenotípica de Bixa orellana dada su reproducción por alogamia. Entre los grupos, el tamaño y la forma de los frutos tienen relación con el contenido de bixina. Cuanto más grandes y largos sean los frutos, se puede apreciar que mayor será el contenido de colorante esperado. Los cultivares bien manejados conducirán a mayores contenidos de colorante (por encima del 3%) en los diferentes grupos. Con respecto a las características de color, las diferencias en el color de las variedades de frutos no demostraron tener una influencia significativa en el contenido total de colorante. Más estudios son necesarios al respecto. Todas las muestras de achiote recolectadas tenían un contenido de colorante total promedio de 3,1%. El arilo seco de la semilla que contiene los colorantes y los carbohidratos nativos representa el 10,5% del peso total. Las semillas secas incoloras representan el 81,5% y el 5% corresponde al contenido de humedad con respecto al peso total de las semillas. No se encontró una correlación entre la altura y el contenido de colorante. Sin embargo, se encontró una correlación entre el contenido de un compuesto fenólico y la altura. Mostrando que, a mayor altura que conlleva a una mayor exposición a radiación UV, existirá mayor concentración de un compuesto fenólico. Esto podría indicar, mayor producción de compuestos fenólicos. La bixina no es soluble en agua, lo cual dificulta su extracción. Sin embargo, es posible suspenderla en agua en condiciones alcalinas débiles. Gracias a su dispersión, es posible microencapsular dispersiones de bixinas y de extractos de annatto mediante secado por aspersión (spray dryer). Los materiales encapsulantes pueden ser mezclas de sacáridos con polisacáridos de mayor peso molecular y/o proteínas. También es posible utilizar maltodextrinas y espesantes como goma arábica, pectina y carboximetilcelulosa. Los carbohidratos nativos del arilo de la semilla de achiote mejoran la eficiencia de encapsulamiento de los materiales encapsulantes. De la misma forma, a menor tamaño de partícula, aumentará su eficiencia de encapsulación. El microencapsulamiento de los carbohidratos nativos permitirán que las formulaciones de colorante mantengan su color y puedan mantenerse dispersadas en agua durante al menos 40 días en soluciones acuosas a pH ácido. Esto, coadyuvado cuando se tienen pequeñas partículas. Si bien hay aspectos en los que se debe trabajar como la floculación y la sedimentación a largo plazo, estas microcápsulas tienen potencial para su uso en productos acuosos como refrescos, jugos, preparaciones de dulces, etc. Nuestro trabajo posibilita incrementar el uso del colorante de achiote a través de su microencapsulamiento, disminuir

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los costos de producción y continuar con la investigación para el desarrollo de nuevas formulaciones dispersables en agua con colorantes naturales. En el ámbito de investigación básica, nuestro trabajo de fotoestabilidad contribuyó con el desarrollo de un modelo para describir la degradación de sustancias fotolábiles en estado sólido basado en técnicas analíticas y utilizando herramientas computacionales. El modelo comprende tres escenarios: El primero, la degradación exponencial de sustancias coloreadas para líquidos homogéneos. El Segundo escenario, la degradación lineal de polvos coloreados cuando la dispersión de la luz a causa del polvo es no significativa. Y el tercero, la degradación exponencial en estado sólido debido a una dispersión de la luz significativa en el sólido. El extracto de annatto o microcápsulas utilizadas para colorear dulces seguirán el segundo y tercer escenario del modelo de degradación en estado sólido. La degradación será lineal a menos que la dispersión de la luz en el sistema se vuelva significativa. En el ámbito de investigación aplicada, los resultados de nuestros experimentos muestran que el microencapsulamiento por secado por aspersión es una técnica eficaz para aumentar la estabilidad frente a la luz, de los polvos de bixina y de los extractos de achiote. La estabilidad del colorante frente a la luz en estado sólido será directamente proporcional a la eficiencia de encapsulación. A mayor eficiencia de encapsulamiento, menor sensibilidad del colorante. Los carbohidratos nativos incrementan la estabilidad del colorante frente a la luz al incrementar la eficiencia de encapsulamiento del colorante. En el caso de los dulces, debido a que los agentes encapsulantes de las cápsulas se disuelven al momento de añadirlas a los dulces, la sensibilidad del colorante (extracto de annatto) en cualquiera de las formulaciones utilizadas será la misma (Sacarosa, maltodextrina). Sin embargo, la matriz de caramelo actúa como un protector de los colorantes disminuyendo su sensibilidad a la luz. Estos resultados nos permiten planificar el empaquetamiento de los dulces para mantener su color por más tiempo y otorgar una larga vida útil. A medida que la concentración de colorante en dulces aumenta, diferentes concentraciones de colorante pueden producir coloraciones similares ante la percepción visual humana. Es decir, presentar parámetros similares de color a*, b* y L*. Las diferencias entre los colores de los dulces son perceptibles para diferencias de color mayores a ΔE >> 3 Estos resultados son válidos tomando en cuenta que nuestro estudio sensorial fue realizado en formato electrónico. En general, el color de los caramelos tuvo una buena aceptabilidad por parte de los participantes en el análisis sensorial. Esto es un buen indicador para esperar una buena aceptabilidad del color de los dulces en una población más amplia. El proyecto generó material y resultados para cuatro artículos científicos correspondientes al achiote. Durante el proyecto, 3 estudiantes de Masterado de la Universidad de Lund obtuvieron su diploma, desarrollando su proyecto de grado en nuestro proyecto. Además, una estudiante boliviana de ingeniería obtuvo su título en Ingeniería de alimentos en la UMSA. La estudiante realizó su tesis de grado dentro de nuestro proyecto con el colorante del maíz morado. Así mismo, dos estudiantes de pregrado de la carrera de Ciencias Químicas realizaron sus pasantías en nuestro laboratorio de alimentos de la UMSA. Ellas participaron en el proyecto de colorantes, trabajando con el colorante de la bixina y su microencapsulamiento. Durante el proyecto se realizó la compra del equipo de secado por aspersión, del equipo para la medición del tamaño de las partículas, y de otros equipos para trabajo en el laboratorio.

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Los resultados de este estudio muestran de modo fehaciente que la interacción social con los sectores productores y las comunidades agrarias debe construirse a partir de los frutos de la investigación de alto nivel, aplicada a campos similares al de este estudio, dentro de la disciplina de la Ciencia y Química de Alimentos. Los resultados ofrecen la posibilidad de la aplicación de estos resultados en la industria de procesamiento del achiote para el mejoramiento de productos y procesos. Por otro lado, abren la posibilidad de nuevas investigaciones y colaboraciones en el ámbito agrícola y comunitario productivo para el mejoramiento de los rendimientos de los cultivos de achiote y un control de contenido de pigmento en la semilla relativamente sencillo y que coadyuva a establecer un control de calidad que facilita la exportación con mayor valor agregado 6. Futuras perspectivas Estos resultados, muestran como la investigación científica aplicada desde la ciencia de alimentos tienen una clara vocación promotora de la producción económica y la diversificación productiva avanzando hacia una integración vertical de valor agregado, estableciendo nuevas cadenas de valor en el departamento de La Paz y en toda Bolivia. Estos estudios y el trabajo de campo desarrollado han permitido establecer relaciones sociales con los productores abriendo espacio para la cooperación como pymes productoras. Y con productores individuales. Además, se continuará con el trabajo de investigación con respecto a otro colorante con gran potencial que es el maíz Morado. Los avances sobre este tema serán presentados en una próxima oportunidad conjuntamente con los futuros resultados en este tema. Estos resultados incluirán estudios sobre la extracción, microencapsulamiento, estabilidad térmica y estabilidad frente a la luz de microcápsulas del colorante del maíz morado. 7. Colaboraciones Las colaboraciones que tuvieron lugar durante el desarrollo del presente proyecto incluyen además de la UMSA y de la Universidad de Lund a personas pertenecientes a las siguientes instituciones: 1. Herbario Nacional de Bolivia, Campus Universitario UMSA, Casilla 1007, La Paz, Bolivia. 2. Departamento de Arquitectura y Medioambientes Construidos, Universidad de Lund, P.O. Box 118, SE-22100 Lund, Suecia. 3. División de Biotecnología, Departamento de Química, Universidad de Lund, P.O. Box 124, SE-22100 Lund, Suecia. 4. Carrera de Ingeniería Química, Instituto de Investigación y Desarrollo de Procesos Químicos IIDEPROQ, Universidad Mayor de San Andrés UMSA, Calle Andrés Bello s/n, Campus Universitario Cota-Cota, La Paz, Bolivia 5. Departamento de Ingeniería de Alimentos, Universidad de Ankara, Ankara, Turquía Agradecimientos Se agradece a la Agencia Sueca de Cooperación Internacional para el Desarrollo por el financiamiento a las presentes investigaciones. Se agradece a la UMSA el haber dado las condiciones para la realización de estos trabajos en la Unidad de Investigación del Proyecto “Valorización de Compuestos Bioactivos de Bajo Peso Molecular en Alimentos” del Instituto de Investigaciones Químicas. Se agradece a todos los estudiantes y a todos los científicos que participaron del presente proyecto por el trabajo, la colaboración y la dedicación

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brindada para el desarrollo de las investigaciones del presente proyecto. Se da un reconocimiento especial al Área Desconcentrada y de Difusión del DIPGIS y a sus CEO. Bibliografía ADDITIVES, J. F. W. E. C. O. F. & NATION, F. A. O. O. T. U. 2006. Compendium of Food Additive Specifications: Combined

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CURI-BORDA CECILIA K., LUIS MARCONI, ÁLVARO SALINAS, MARCO QUINO, JUAN-ANTONIO ALVARADO, BJÖRN BERGENSTÅHL. 2020. Caracterización morfológica y fitoquímica de muestras de achiote del Norte de La Paz (Manuscrito en proceso de submisión).

CURI-BORDA CECILIA K., VANDANNA TANNIRA, NIKO GENTILE, JUAN-ANTONIO ALVARADO, BJÖRN BERGENSTÅHL. 2020. Modelo para medir la estabilidad frente a la luz de sustancias fotolábiles en camas de polvo utilizando microcápsulas de bixina obtenidas mediante secado por aspersión (Manuscrito en proceso de submisión).

CURI-BORDA CECILIA K., MINA HAJIAN, NIKO GENTILE, JUAN ANTONIO ALVARADO, BJÖRN BERGENSTÅHL. 2020. Estudios colorimétricos y de estabilidad en dulces coloreados con extractos de annatto. (Manuscrito en proceso de submisión).

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CEDIB.