Agar Hierro de Lisina(LIA)

Medio de cultivo utilizado para detectar si los miembros de la familia Enterobacteriaceae descarboxilan o desaminan la lisina.

Medio de selección preliminar básico para detectar patógenos fecales; ayuda a la identificación de especies de Salmonella, la mayoría de los cuales son H2S (acido sulfhídrico) positivas y lisina positiva.

Ayuda a la diferenciacion entre generos: Edwardsiella (+) y Salmonella (por lo comun +) de las

especies C itrobacter (-) Escherichia coli (+) de la especies de Shigella (-)

IngredientesFormula en g/ltPeptona de gelatina 5gExtracto de levadura 3gGlucosa 1gLisina 10gCitrato de hierro y amonio 0.5g

Tiosulfato de sodio 0.04gPurpura de bromocresol 0.02

Agar 15

Suspender 35g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar reposar unos 15 min. Calentar cuidadosamente agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y estabilizar a 121°C durante 15 min. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción.

pH final 6.7 +/- 0.2

Preparación del medioInstrucciones

Fraccionar en cantidades de 4 ml (13 x100mm); extremo inferior profundo / pico de flauta corto. Colocar inclinado

Con una aguja de inoculación, estriar el pico de flauta y punzar en el fondo del medio dos veces.

Con las tapas flojas; 18 a 24 hrs de incubación a 35°C

Verificar con controles.

Técnica

En el medio de cultivo la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.

El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de acido sulfhídrico.

El purpura de bromocresol es el indicador de pH, el cual es de color amarrillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Fundamento:

Interpretación: La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especificas atacan los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y dióxido de carbono. Por descarboxilación de la Lisina, se produce la amina cadeverina (una diamina) y dióxido de carbono por la acción de la enzima especifica lipasa descarboxilasa que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta.

En las bacterias la cadeverina es responsable de la putrefaccion (olor).

Desaminación de la lisina:La desaminación oxidativa se caracteriza por la ruptura de un grupo amino.

Edwar y Fire encontraron que cuando se omite el indicador de pH, las especies Proteus y Providencia producen un color anaranjado, debido a la desaminación de la lisina; este producto de color naranja se combina con el indicador de pH purpura de bromocresol para producir un color rojo característico en el pico de flauta(aerobiosis). Sin embargo aun no se conoce cual es el compuesto formado responsable del desarrollo del color rojo.

1.- Descarboxilación de la lisina

Positivo (+) : pico violeta/fondo violetaNegativo(-) : pico violeta/ fondo amarrillo2.- Desaminación de la lisinaPico rojizo/ fondo amarrillo. Esto sucede con cepas del genero Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella spp.3.- Producción de ácido sulfhídricoPrueba positiva(+): Ennegramiento del medio especialmente en el límite del pico y fondo.

Resultados

Es una enzima producida por algunos microorganismos capaces de coagular el plasma

por la acción de la enzima coagulasa (estafilocoagulasa)

Coagulasa

Se utiliza de manera especifica para diferenciar especies dentro del genero Staphylococcus.

1.- S. aureus subesp. aureus, S. aureus subesp. anaerobius, S. schleiferi subesp. coagulans son todos positivos para la estafilocoagulasa (cuagulasa libre, prueba en tubo)

2.- S. aureus subesp. aureus, S. schleiferi subesp. schleiferi y S. lugdunensis son todos positivos para el factor de agregacion (coagulasa ligada, prueba en portaobjetos).

3.- Otras especies de Staphylococcus de origen humano o animal son positivas por ambas técnicas; sin embargo se les encuentra con menor frecuencia.

Aplicación.

La eslafilocuagulasa (coagulasa): la enzima producido por S. aureus es relativamente estable al calor y resiste temperatura de hasta 60°C durante 30min, se inactiva con facilidad por las enzimas proteolíticas. Se desconoce su estructura química.

Esta enzima actúa sobre algunos constituyentes del suero para producir un coagulo o trombo. La coagulosa aumenta la velocidad de coagulación del plasma lo que produce la formación de un coagulo de fibrina.Duthrie mostro evidencia de que la enzima coagulasa, la que Burrows y col, sostienen que es una procoagulasa, esta presente en dos formas la coagulasa ligada (unida a la célula) y la coagulasa libre.

Fundamento:

Coagulasa ligada:Se detecta por el procedimiento en portaobjetos la prueba de agregación del plasma. Se encuentra en la superficie de las paredes celulares. La coagulasa ligada o factor de agregación CF es responsable de la absorción del fibrinógeno y lo altera de modo tal que precipita sobre los estafilococos y causa la agregación de estos, lo que produce la aglutinación rápida de las células. El factor de agregación convierte el fibrinógeno en fibrina de manera directa, sin la participación de los factores del plasma y no es inhibido por los anticuerpos contra la coagulasa libre.

Coagulasa libre:La prueba de coagulasa en tubo detecta ambas coagulasas.La coagulasa libre extracelular reacciona con una sustancia en el plasma (factor del suero) que Dubos y cols. denominaron factor de reacción de la coagulasa o CRF, una sustancia termoestable similar a la trombina. La coagulasa libre reacciona con el CRF para formar un complejo coagulasa-CRF, una sustancia similar a la trombina .Este complejo actúa de manera indirecta para convertir el fibrinógeno en fibrina.La diferencia principal es que el CRF que reacciona con la coagulasa no requiere iones de calcio para formar un coagulo y es insensible a la heparina.Estudios realizados por Soulier y col. mostraron que la estafilocoagulasa y la protrombina no poseen actividad enzimática pero su interacción produce la formación de un complejo estable con actividad proteolítica especifica denominada estafilotrombina.

Materiales y reactivos Tubos de hemolisisAsaPipetas de o.5 mlMecheroBaño termostato a 37°C

Estufa de cultivoPortaobjetos Solución fisiológica o agua destilada.

PlasmaRecomendado humano o de conejo .Alternativas de equino, ovino u bovino.Plasma fresco proveniente de sangre entera:- Dejar los glóbulos rojos sedimentar o centrifugar un abolsa de sangre entera.- De manera aséptica, eliminar el sobrenadante (plasma)que contiene anticoagulante en un recipiente estéril. Evitar extraer los glóbulos rojos.

El plasma o fibrinógeno deben estar en refrigeración a 4°C o congelados a -20°C.

Chapman estableció que se prefiere el plasma de conejo sobre el de humano debido a que el coagulo es mas firme y la coagulación es mas rápida..

En un tubo de hemolisis estéril se ponen 0.5 ml de plasma al que se le añadirá 0.5 ml de cultivo joven en medio liquido de 18 a 24 h de Staphylococcus o una gran ansada de una colonia pura en la placa de agar.

Rotar el tubo suavemente para lograr la suspensión de las bacterias. No sacudir.

Incubacion: baño maria a 37°C, 4h: observar cada 30´ para la coagulacion

Inclinar suavemente el tubo para ver el cuaguloSi no se observa el coagulo derante las 4 h, dejar el tubo en el baño maria o colocarlo en una incubadora durante la noche (24h) a 35°C.

Prueba en tubo.

Colocar una gota estéril de agua destilada o solución fisiológica (NaCl al 0.85%) sobre un portaobjetos limpio.

Emulsionar una cantidad espesa de microorganismos Staphylococcus (provenientes de un cultivo puro en caldo de 18 a 24 h), en una gota de solución fisiológica o agua destilada.

Con suavidad agregar una gota de plasma humano o de conejo fresco

Observar la inmediata formación de precipitados macroscópicos en forma de grupos blancos.

Prueba en portaobjetos

Un resultado positivo en una prueba de coagulasa constituye por lo común y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia o patogenicidad.Procedimiento en portaobjetos 1.- positivo (+)A) marcada agregación de los 5-20 seg.B) S. aureus, cepa virulenta2.-Positivo tardíoA) Cualquier agregación después de 20seg hasta 1 min.B) S. aureus, cepa virulenta. 3.- DudosoA) Cualquier granulación después de 1 min.B) repetir si el resultado es idéntico por técnica del tubo.4.- Negativo(-)A) sin cambios la solución permanece homogéneaB) confirmar por prueba de tuboC) S, epidermidis, S. saprophyticus u otro organismo.

Posibles resultados

Procedimiento en tubo.1.- Positivo(+)A)Formación de coagulo o filamentos de fibrina separados 1.- completo coaguló en todo el tubo2.- parcial el coaguló no se entiende en toda la columna liquidaB) S. aureus, cepa virulenta2.- Negativo(-)A) ausencia de la formación de coágulosB) S, epidermidis, S. saprophyticus u otro organismo