ADN mitocondrial humanoJulio Montoya y Giuseppe Attardi

Reseña: Las mitocondrias son unos orgánulos subcelularescuya principal función consiste en proporcionar la energíarequerida para mantener la vida. La presencia de estosorgánulos, con un sistema respiratorio muy especializado,es una de las características que distinguen las célulaseucariotas (células animales, plantas, hongos y protozoos)de las células procariotas (bacterias).

En las mitocondrias, presentes en el citoplasma de lascélulas eucariotas, se llevan a cabo una serie dereacciones bioquímicas encaminadas a conservar, en forma detrifosfato de adenosina (ATP), la energía química que selibera en la oxidación final de las moléculas orgánicascombustibles.

En este trabajo se ocupan de la organización y expresióndel ADN mitocondrial humano, tomado como modelo por ser elgenoma mitocondrial de mamíferos mejor conocido.

ADN mitocondrial humano

La organización de los genes, su expresión y laspropiedades de los ARN mitocondriales confieren a estesistema genético unas características únicas de simplicidady economía. Se ha identificado la función de todos losgenes.

Julio Montoya y Giuseppe Attardi

Las mitocondrias son unosorgánulos subcelulares cuyaprincipal función consisteen proporcionar la energíarequerida para mantener lavida. La presencia de estosorgánulos, con un sistemarespiratorio muyespecializado, es una delas características quedistinguen las célulaseucariotas (célulasanimales, plantas, hongos yprotozoos) de las célulasprocariotas (bacterias). Enlas mitocondrias, presentesen el citoplasma de lascélulas eucariotas, sellevan a cabo una serie dereacciones bioquímicasencaminadas a conservar, enforma de trifosfato de

adenosina (ATP), la energíaquímica que se libera en laoxidación final de lasmoléculas orgánicascombustibles.

Las mitocondrias estándotadas de un sistemagenético propio y contienentodos los elementosnecesarios para suexpresión, es decir, para lasíntesis de ARN y de lasproteínas que codifica. Estesegundo sistema genético,presente en todas lascélulas eucariotas,desempeña un papel esencialen la biogénesis de lospropios orgánulos porquecodifica una serie deproteínas integrantes de losmismos.

Las primerasindicaciones acerca de laexistencia de un sistemagenético en el citoplasmadatan de 1949, cuando BorisEphrussi descubrió unosmutantes de la levadura quepresentaban deficiencias enlas funcionesrespiratorias, debidas a unfactor citoplasmático, nonuclear, hereditario. No esde extrañar, por tanto, queel estudio del ADNmitocondrial comenzase enla levadura, y queestuviese facilitado por ladisponibilidad de mutantesy de refinadas técnicas genéticas. Por el contrario,el análisis del contenidogenético del ADNmitocondrial de célulasanimales estuvoobstaculizado durante muchotiempo por la dificultad deaplicar las técnicasgenéticas a este sistema.La biología molecular delas mitocondrias de célulasanimales comienza en losaños 60 con el aislamientodel primer ADN devertebrados y lademostración de laexistencia de un ARNcitoplasmático heterogéneo,con secuencias homólogas alas del ADN mitocondrial.Estudios posterioresrevelaron que el genomamitocondrial era el menor

de todos los conocidos coninformación para las tresclases mayoritarias de ARN(ribosómico, mensajero y detransferencia).

La necesidad demantener dos sistemasgenéticos separados, con uncosto considerable para lacélula, y el mecanismo queregula la interrelaciónentre estos sistemas, haintrigado a los científicosdurante mucho tiempo. En losúltimos años, el desarrolloy aplicación de nuevastécnicas en el análisis deADN, ARN y proteínas hanpermitido obtener una imagendetallada de la estructura yfunción del genomamitocondrial, especialmentedel humano, con unaresolución que hasobrepasado las técnicasgenéticas más refinadas.Algunos de los interrogantesplanteados empiezan a hallarsolución.

Se conoce ya lasecuencia nucleotídicacompleta del ADNmitocondrial de algunosmamíferos (humano, bovino,ratón y rata), así como lade la mosca del vinagre,rana, Tripanosoma yLeishmania, amén de granparte de la secuencia deotros organismos (erizo demar, levadura, hongosfilamentosos, etcétera). Se

ha podido comprobar que,aunque las funcionesgenéticas esenciales delADN mitocondrial se hanconservado en múltiplesorganismos de distintonivel evolutivo, laestructura y organizaciónde los genes y la forma deexpresarse ha evolucionadode una manera muy diferenteen ellos. Así, por ejemplo,mientras que el genomamitocondrial humano y demamíferos en generalmuestra una estructura muyempaquetada con los genescontiguos unos a otros ycarentes de intrones.(secuencias no informativasque fragmentan los genes),los genes mitocondriales delevadura se hallanseparados entre sí porregiones de ADN noinformativas, algunas deellas fragmentadas porintrones. Se ha visto quealgunos de estos intronesdeterminan proteínas que serequieren para lamaduración de los ARNmensajeros (las llamadasmaturasas).

En este trabajo nosocuparemos de laorganización y expresióndel ADN mitocondrialhumano, tomado como modelopor ser el genomamitocondrial de mamíferosmejor conocido. La de

terminación de la secuenciacompleta del ADNmitocondrial humano en ellaboratorio de F. Sanger,del Consejo deInvestigaciones Biomédicasde Cambridge, en Inglaterra,y el trabajo desarrollado ennuestro laboratorio delInstituto de Tecnología deCalifornia sobre laspropiedades y organizaciónde los productos detranscripción (ARN) del ADNmitocondrial humano hanrevelado una serie decaracterísticas únicas ysorprendentes sobre elcódigo gen ético,organización de los genes yestructura del ARN, y nos hapermitido establecer algunasconclusiones sobre elmecanismo de expresión deeste genoma y su regulación.Asimismo, se acaba deidentificar y determinar lafunción de todos lospéptidos codificados en elADN mitocondrial humano.

El ADN mitocondrialhumano consta de dos cadenasde nucleótidos enroscadas entorno a un eje común,formando una doble hélicecircular. Cada cadena de ADNestá formada por unasecuencia lineal de basesnucleotídicas: adenina (A),guanina (O), citosina (C) ytimina (1). La secuencia debases a lo largo de las dos

cadenas soncomplementarias: una Asituada en una cadena seempareja siempre con una Tde la otra, y una G siemprecon una C. El mensajegenético de una cadena sedetermina por la secuenciade nucleótidos. El ADNmitocondrial humano estálocalizado dentro de losconfines de la membranainterna, a la que estáunido por un punto cercanoal origen de síntesis de lacadena pesada (OH). Midecinco micrometros delongitud y presenta un pesomolecular de 10 millones,que corresponde exactamentea 16.569 pares de bases. Sutamaño es semejante al delADN de las mitocondrias detodas las células animales,pero mucho más pequeño queel de las levaduras yplantas.

El ADN mitocondrial,que no está estrechamenteasociado a proteínas,recuerda al ADN "desnudo"bacteriano. Cada célulacontiene unos pocos milesde moléculas de ADNmitocondrial; enparticular, las célulasHeLa (línea celular humanaprocedente de un tumor deútero, mantenida encultivo), utilizadas parala mayor parte de estetrabajo, contienen entre

1000 y 2000 moléculas, loque representa solamente un0,5 por ciento del ADNcelular entero. Aunque todaslas moléculas de ADNmitocondrial de un individuoson iguales entre sí, puedenvaciar de un individuo aotro de la misma especie. Apesar de la pequeñaproporción de ADNmitocondrial que existe enla célula, se ha obtenido ensu forma pura, libre decontaminación con ADNnuclear, gracias a ladistinta densidad quemanifiestan en presencia deun colorante, bromuro deetidio, que se intercala conuna proporción diferente enlos dos tipos de ADN. Esto,unido a la posibilidad deseparación de las dos hebrasdel ADN mitocondrial en lasllamadas cadena pesada yligera, ha ayudadoenormemente a desentrañarlos misterios de estegenoma.

¿Es suficiente lainformación contenida en elADN mitocondrial humano parala construcción de lasmitocondrias? Lasmitocondrias contienencientos de proteínas, de lascuales sólo una fracción muypequeña, aproximadamente el5 por ciento, estáncodificadas y se sintetizanen esos orgánulos. La

mayoría son proteínashidrófobas que forman partede los complejosenzimáticos de la membranainterna mitocondrial. Elresto de las proteínas quecomponen el orgánulo(matriz, membrana interna ymembrana externa) estándeterminadas por el ADNnuclear y se sintetizan enlos ribosomascitoplasmáticos, paraintroducirse luego en elorgánulo. Se requiere,pues, la expresión de losdos sistemas genéticoscelulares, el nuclear y elmitocondrial, para labiogénesis de lamitocondria. Elmantenimiento del sistemagen ético mitocondrialnecesita también de laaportación, por parte delcitoplasma, de una serie deproteínas codificadas porel núcleo: enzimasimplicadas en lareplicación del ADN, ARNpolimerasas, ligasas,proteínas ribosómicas (50-70), aminoacil sintetasas,enzimas implicadas en lasíntesis de proteínas,enzimas modificantes,etcétera. Uno de losaspectos más fascinantes dela biología estriba en laestrecha colaboración delos sistemas genéticosmitocondrial y nuclear en

el ensamblaje de lamaquinaria sintetizadora deproteínas y de los complejosenzimáticos de la membranainterna mitocondrial.

El ADN mitocondrialhumano contiene lainformación necesaria parasintetizar dos ARNribosómicos, ARN 16S y 12S,que forman parte de losribosomas mitocondrialesdonde se van a sintetizarlas proteínas, 22 ARN detransferencia (moléculas quetransportan los aminoácidosconstituyentes de lasproteínas hasta losribosomas) y 13 proteínas.Hasta hace muy poco,conocíamos sólo la funciónde cinco de estas 13proteínas. Corresponden alas subunidades 1(COI), II(COII) y III (COIII) de lacitocromo c oxidasa, a lasubunidad 6 de la ATPasa yal citocromo b. Los ochomarcos de lectura restantes(secuencias que codificanuna determinada proteína)permanecían sin identificar(URF, del inglés"unidentified readingframes"). El hecho de queestos URF se hayanconservado en el ADNmitocondrial de mamíferos yque se correspondan con ARNmensajeros sugirió quedichos genes debíanexpresarse en las

mitocondrias humanas. Lahipótesis ha sidocorroborada recientementeen nuestro laboratorio porPaolo Mariottini y AnneChomyn al identificar ydeterminar la funciónfisiológica de los ocho URFmitocondriales humanos;siete de los cualescorresponden a otras tantassubunidades de la NADHdeshidrogenasa de la cadenarespiratoria denominadasND1, ND2, ND3, ND4, ND4L,ND5 y ND6. El octavoconstituye la subunidad 8de la ATPasa. De estaforma, queda identificadala función fisiológica detodas las proteínascodificadas por el ADNmitocondrial humano.

La determinación de lasecuencia nucleotídicacompleta del ADNmitocondrial humano,llevada a cabo por B. G.

Barrel y sus colaboradoresen el laboratorio de F.Sanger, ha mostrado que esteADN presenta unaorganización genéticaextremadamente compacta conlos genes codificados porambas cadenas. Enparticular, la cadena pesada(denominada así porpresentar un coeficiente desedimentación mayor engradientes alcalinos decloruro de cesio), a partirde la cual se transcribenlos genes para los dos ARNribosómicos, 14 ARN detransferencia y 12 marcos delectura, se encuentrasaturada de secuenciascodificantes a excepción deuna pequeña región alrededordel origen de replicación(OH). La cadena ligeracodifica ocho ARN detransferencia y un marco delectura.

1. ADN MITOCONDRIAL. De las células de HeLa (línea celular humanaprocedente de un tumor de útero), aumentado unas 100.000 veces en lamicrografía. La molécula es un anillo de ADN bicentenario de 5micrometros de longitud formada por 15.569 pares de nucleótidos(moléculas similares del ADN) cuya secuencia determina la informacióngenética que contiene. En la parte inferior central se observa laasociación del ADN con un fragmento de la membrana.

En la cadena pesada,los genes se disponen deuna forma continua: unoprecede o sigueinmediatamente al otro, ocon sólo unos pocosnucleótidos intermedios enalgún caso. No estántampoco interrumpidos porintrones, como sucede en lalevadura. Ni apenas se dasolapamiento entre losgenes codificados en ambascadenas. Sin embargo, dosde las secuencias

determinantes de proteínas,codificadas en la cadenapesada, están solapadas conel marco de lecturaadyacente.

Una de lascaracterísticas que másllaman la atención a

propósito de laorganización genética delADN mitocondrial humano serefiere al esparcimiento delos genes de los ARN detransferencia a lo largo dela secuencia del ADN:separan, casi con absolutaregularidad, los genes delos ARN ribosómicos y delos mensajeros(codificantes deproteínas). Esta estructuratan ceñida de los genestiene su equivalentedirecto en la disposición,muy apretada también, desus productos detranscripción (ARN) yconfiere a los ARN

mensajeros unos rasgos muy peculiares, como veremosmás adelante.

2. BIOGENESIS DE LA MITOCONDRIA: Se realiza mediante lacooperación de los sistemas genéticos nuclear y mitocondrial. Elorgánulo consta de dos membranas, una externa y otra legada, queencierran una matriz en donde se localiza el ADN mitocondrial unidoala membrana. Este se trascribe en los tres tipos fundamentales deARN: ARN ribosómico (ARNr), ARN mensajero (ARNm) y ARN detransferencia (ARNt). En la mitocondria se sintetizan los polipéptidoscodificados en el ADN nuclear y sincronizados en los ribosomascitoplasmáticos, forman los complejos enzimáticos de la membranainterna. La mayoría de las proteínas constituyentes de lasmitocondrias así como las necesarias para la expresión del ADNmitocondrial, están determinadas en el ADN nuclear, se sintetizan enel citoplasma y se introducen, desde aquí, en la mitocondria.

La replicación del ADNmitocondrial humano(síntesis de moléculashijas idénticas), y demamíferos en general, esunidireccional yasimétrica. Requiere dosorígenes de replicacióndistintos, OH y OL, para lasíntesis de la cadenapesada y ligerarespectivamente. El procesocomienza en OH con lasíntesis de un corto tramode cadena pesada (ADN 75),que desplaza la cadenaparenteral pesada formando

el bucle de desplazamiento(bucle-D), y continúa,unidireccionalmente, con laextensión del bucle dedesplazamiento en elsentido de las agujas delreloj. La síntesis de lacadena ligera comienzacuando la cadena pesadahija encuentra el origen dereplicación OL, localizadoen el mapa en la posición67/100 (relativa al origenOH tomado como 0/100),entre los genes para losARN de transferencia decisteína y asparagina. A

continuación, las doscadenas se prolongan ensentidos opuestos hasta laseparación final de lasmoléculas hijas de ADN yaformadas.

La región del ADNmitocondrial humanocomprendida entre los genespara los ARN detransferencia defenilalanina y prolina estáocupada fundamentalmentepor el bucle dedesplazamiento con elorigen de replicación de la

cadena pesada (OH). En estazona se alojan, a su vez,los puntos de iniciaciónpara la transcripción(síntesis de ARN) de ambascadenas del ADN y lasecuencia de la cadenaligera que codifica un ARNpoliadenilado pequeño (ARN75). Esta porción del ADNes, no obstante, la quepresenta mayor divergenciaentre los ADNmitocondriales demamíferos.

3. CODIGO GENÉTICO MITOCONDRIAL: Presenta una serie de desviacionescon respecto al código considerado, hasta hace pocos años como“universal”. En la figura se presentan las diferencias existentesentre el código genético utilizado por la mitocondrias de mamíferos(derecha) y el código “universal”.

Cada uno de losaminoácidos componentes deuna proteína estáespecificado en el ADN poruna secuencia de tresnucleótidos que se denominacodón. El código genético,que está formado porcodones de tres letras,viene a ser una suerte dediccionario que relacionala información contenida enel alfabeto de cuatronucleótidos de los ácidos

nucleicos con el alfabetode veinte aminoácidos delas proteínas. Estediccionario gen ético secreía universal, utilizadoindistintamente poranimales, bacterias, virus,etcétera. Sin embargo,sorprendentemente, se haencontrado que lasmitocondrias presentan uncódigo genético alterado enel cual algunos codonesreciben una lectura

diferente. En lasmitocondrias humanas, VGAcodifica el aminoácidotriptófano en lugar de serun codón de terminacióncomo le corresponde en elcódigo gen ético universal.De igual forma, A VA es uncodón para metionina en vezde isoleucina; AUA y AUU seutilizan, al igual que AUG,

como codones de iniciación,y AGA y AGG, codones dearginina en el códigouniversal, se convierten encodones de terminación enlas mitocondrias humanas.Estas u otras alteracionessemejantes se hanencontrado en lasmitocondrias de todos losorganismos estudiados.

4. EL ARN DE TRANSFERENCIA codificados en el ADN mitocondrial humano.Los veintidós que existen pueden leer todo el código genético porpresentar una pauta de reconocimiento de codones diferentes de lapropuesta por Crack. Los ARN de transferencia mitocodriales puedenleer dos o bien cuatro codones sinónimos (codificantes de un mismoaminoácido), según cual sea la primera base del anticodón, formado portres nucleótidos. Se ilustra la región del anticodón (marrón). Elsímbolo (*) representa una U modificada.

Otra de laspropiedades llamativas delsistema genéticomitocondrial tiene que vercon el uso de un nuevomecanismo de reconocimientode codones, que permite lalectura del código genéticocon un número menor de ARNde transferencia. Lamolécula del ARN detransferencia tiene tresnucleótidos, llamadosanticodón, que reconocen yleen sencuencialmente loscodones de un ARNmensajero; en el desarrollode ese proceso, vancolocando los aminoácidosque transportan en el lugarpreciso que le correspondeen la proteína enformación. De acuerdo con

la hipótesis del tambaleode F. H. C. Crick, paraleer los 61 codones quecodifican los diferentesaminoácidos (64 codonesmenos tres codones determinación), basta con 32ARN de transferencia. Lasmitocondrias humanaspresentan, sin embargo, unnúmero menor de ARN detransferencia. Paraexplicar este hecho sepropusieron tres hipótesis:que la mitocondriaimportase ARN detransferencia queestuvieran codificados enel núcleo, que utilizasenuna cifra muy restringidade codones o que los ARN detransferencia de lamitocondria tuvieran una

forma distinta dereconocimiento de loscodones. De todas ellas, laúltima ha resultado ser lacorrecta.En efecto, el análisis dela secuencia completa delADN mitocondrial humano hamostrado la existencia desolamente 22 ARN detransferencia qué puedenleer todo el códigogenético sirviéndose de unmodelo de reconocimientodistinto. Así, las ochofamilias del código concuatro codones para unaminoácido determinado sonleídas por un solo ARN detransferencia mitocondrial,y no por dos como en elsistema de reconocimientodel código universal. Encada caso estos ARN detransferencia tienen una Uen la primera posición delanticodón (posición detambaleo). En las otrasseis familias de Codones,se sigue utilizando dos ARNde transferencia para leerlos cuatro Codones, deforma que los codones deltipo NN-AG son reconocidospor ARN de transferenciacon una U modificada en laprimera posición delanticodón, y los del tipoNN-UC lo son por ARN detransferencia con una Gendicha posición delanticodón. Este modelo

explica que la síntesis deproteínas en lasmitocondrias pueda llevarsea cabo con el reducidonúmero de ARN detransferencia encontrada.Además, el código genéticomitocondrial humanopresenta otrasimplificación representadapor el hecho de que A GA yA GG por lo que no existenARN de transferencia paralos mismos.

El ADN no dirigedirectamente la síntesis deproteínas. En primer lugar,tiene que transcribir alARN la información genéticaque contiene, moléculacompuesta por una solacadena de nucleótidos conuna secuenciacomplementaria a una de lascadenas del ADN. El ARNestá también formado porcuatro tipos de bases, delas cuales tres (A, G y C)son iguales a las del ADN yla cuarta es uracilo (U).Durante la transcripción,las cuatro bases A, G, C yT del ADN se convierten enU, C, G y A en el ARN.

Mientras que losestudios sobre lareplicación del ADNmitocondrial estuvieronfacilitados por disponer detécnicas que permitían suaislamiento en una forma

bastante pura, lasinvestigaciones sobre lanaturaleza de latranscripción y, por tanto,de los productos de lamisma, encontraronnumerosas dificultades. Lacantidad de ARNmitocondrial que contienela célula es muy pequeña(de 0,1 a 0,5 por ciento)comparada con la del ARNcelular total, por lo quesu purificación requería

procedimientos preparativosmuy laboriosos. Así, hastahace muy poco tiempo eranecesario tratar lascélulas con drogas quesuprimieran la síntesis delos productos detranscripción del ADNnuclear, y de ese mododetectar los productos dela transcripciónmitocondrial.

son codones de terminación,

5. MAPA GENÉTICO y DE TRANSCRIPCION del ADN mitocondrial humano. Losdos círculos interiores representan las dos cadenas del ADNmitocondrial con los genes que codifican: ARN ribosómicos (verdeclaro), ARN de transferencia (rojo), señalados con la abreviatura delaminoácido específico que les corresponde, y marcos de lectura osecuencias codificadoras de proteínas (azul claro). Las posiciones delos productos de transcripción (ARN) de la cadena pesada estánindicadas en color verde oscuro (ARN ribosómicos y su precursor) yazul oscuro (poli(A)-ARN); los de la cadena ligera en color marrón.Las flechas azul oscuro y marrón indican la dirección del atranscripción la cadena pesada y ligera respectivamente. OH y OLsimbolizan el origen de síntesis de la cadena pesada y ligera. Lasflechas a la derecha de OH y debajo de OL indican la dirección desíntesis de la cadena pesada y ligera. Por CO hay que entender lassubunidades de citocromo c oxidasa; por Cyt b, el citocromo b, y por NDlas subunidades de NADH deshidrogenasa.

ARN16

6. REGIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL HUMANO que determina la subunidad IIdel citocromo c oxidasa. Se puede observar el alto grado deempaquetamiento de la información, característico del ADN. El marco dela lectura de la subunudad II de citocromo oxidasa está franqueado,en ambos extremos, por genes de ARN de transferencia. Nótese que esteARN mensajero comienza directamente por el codón de iniciación AUG.El ejemplo ofrecido en la muestra uno de los pocos ARN mitocondrialeshumanos que tiene codificado el codón de terminación completo (UAG) ensecuencia del ADN mitocondrial.

Los caracteres únicosde la organización delgenoma mitocondrial humano,descritos anteriormente, sehan visto acompañadostambién por mecanismos deexpresión genética pococomunes. El ADNmitocondrial humanocodifica dos ARNribosómicos, 22 ARN detransferencia y una seriedeARN poliadenilados en suextremo 3', la mayoría de

los cuales corresponden alos ARN mensajeros.

Una de lascaracterísticas másllamativas del proceso detranscripción del ADNmitocondrial de célulasHeLa es su simetría, esdecir, ambas cadenas setranscriben completamente.La velocidad detranscripción de la cadenaligera duplica, si notriplica, la de la cadenapesada; sin embargo, lamayoría de los ARN que

TATATAGAATTACCGTGTACGTCGCGTTCAT……………AAATGGGATATCGTGGGGGAGATGGGGGAGATCTCGCGTGACATTTTC…. ADN MOLDE

SUBUNIDAD II DE CITOCROMO C OXIDASA

AUGGCACAUGCAGCGCAAGUA…………UUUACCCUAUAGCACCCCCUCUACCCCCUCUAGACCCAAAAA…AN

PROCESAMIENTO TRANSCRIPCIÓN

CACUGUAAAG…AUAUAUCUUA

t ARN Lis

proceden de ella tienen unavida media mucho más cortaque los de la cadena pesaday no se acumulan en grandescantidades. Esta simeten latranscripción del ADNmitocondrial humanocontrasta con el alto gradode asimetría en ladistribución del contenidoinformacional de este ADN,puesto que la mayoría delos genes identificados setranscriben a partir de lacadena pesada. La puesta apunto de un procedimientopara el aislamiento, de losdiferentes ARN mitocondrialen forma pura ha permitidoacometer un análisisminucioso de suspropiedades estructurales ymetabólicas. Esteprocedimiento consiste entratar la fracción demitocondrias, obtenida por

centrifugación, connucleasa de micrococos,enzima que destruye losácidos nucleicosextramitocondriales. Así sepueden detectar los ARNmitocondriales sin tenerque utilizar inhibidores dela síntesis de ARN nuclear.Esto, unido a laposibilidad de crecimientode las células HeLa con unalto rendimiento, y aldesarrollo deprocedimientos para laobtención de ácidosnucleicos mitocondrialesmarcados "in vivo" con unaactividad específica muyalta, ha permitido vencerlas dificultades derivadasde la presencia depequeñísimas cantidades deARN mitocondrial en lacélula.

7. PRODUCTOS DE TRANSCRIPCION del ADN mitocondrial humano. Los ARNmitocondriales se dividen en dos grupos, según puedan o no serretenidos por una columna de oligo (dT)-celulosa. Los poli(A) ARN quese unen al brazo de oligo (dT) presentan en su extremo 3' una cola deunos 55 nucleótidos de adenina (A) que no está codificada en el ADN.Por electroforesis se separan los distintos ARN. El tamaño indicadopara los poli(A)-ARN se refiere exclusivamente a la parte del ARNcodificado en el ADN; no incluye la cadena de poli(A). Existe unacorrespondencia perfecta entre los genes y sus productos detranscripción. A cada gen le corresponde un ARN específico. Las únicasexcepciones de la regla son los ARN mensajeros 7 y 14 que contienendos marcos de lectura cada uno. ARNm es la abreviatura de ARNmensajero; ARNr, la de ARN ribosómico; ARNt, ARN de transferencia; CO,la de citocromo c oxidasa; ND, la de NADH deshidrogenasa.

El ARN mitocondrialobtenido por extracción apartir de las mitocondriasse divide, porcromatografía a través decolumnas de oligo (d1)-celulosa, en dos fraccionessegún que el ARN quede o noretenido por la columna.Posteriormente, loscomponentes de cada una deestas fracciones se separanpor electroforesis en gelesde agarosa que contienenhidróxido de metil mercurio(agente muydesnaturalizarte). De estaforma se han identificado18 especies de ARN en lafracción que es retenidapor la columna y que estáconstituida por ARN quecontiene una cadena depoli(A), de unos 55residuos, en el extremo 3'(poli (A)-ARN). Este tramode poli(A), que no estácodificado en el ADN

mitocondrial, se añadedespués de latranscripción. Los poli(A)-ARN adquieren un tamaño queva desde 215 a 10.400nucleótidos. De ellos, lostres mayores (ARN 1, 2 y 3)y el menor (ARN 18) sonproductos de transcripciónde la cadena ligera del ADNmitocondrial, mientras queel resto lo son de lacadena pesada. Entre estosúltimos, los ARN 5, 7, 9 ydel 11 al 17 son los ARNmensajeros de polipéptidossintetizados por lamitocondria y se hanidentificado 12 como losARN mensajeros para lassubunidades I, II y III dela citocromo c oxidasa (ARN9, 16 y 15), para elcitocromo b (ARN 11), paralas subunidades 6 y 8 de laATPasa (ARN 14) y para 6subunidades de la NADHdeshidrogenasa (ARN 5, 7,

12, 13 y 17). Los ARN 7 y14 contienen dos marcos delectura solapados, comoveremos posteriormente. ElARN 6 es el precursor delARN 9 y el ARN 10representa una pequeña

fracción del ARN ribosómioo16S, que ha sidopoliadenilado. Acerca delARN 4 y de los productos detranscripción de la cadenaligera hablaremos másadelante.

8. MODELO PROPUESTO PARA EL PROCESAMIENTO del ARN naciente. El ARN quese va sintetizando se procesa simultáneamente, mientras forma parte delos complejos de transcripción, para dar lugar a los ARN maduros (ARNribosómicos, ARN de transferencia y poli(A)-ARN).\EI ARN primario seva cortando por los extremos de las secuencias de los ARN detransferencia (o), localizados en los flancos de casi todos los genes.En la figura superior se muestra el procesamiento del ARNpolicistrónico correspondiente a la totalidad de la cadena pesada, queda lugar a los ARN mensajeros; en la figura inferior, el procesamientode los precursores de los ARN ribosómicos.

La fracción de ARNmitocondrial no retenidapor la columna de oligo(d1) celulosa está formadapor los ARN ribosómicos 12S

y 16S y por los ARN detransferencia. Los ARNribosómicos mitocondrialeshumanos se transcriben apartir de la cadena pesada

del ADN y la mayoría de susmoléculas poseen un tramode 1 a 9 residuos de A ensu extremo 3'.

De los 22 ARN detransferencia codificadospor el ADN mitocondrial, 14se transcriben a partir dela cadena pesada y 8 de lacadena ligera. Los ARN detransferenciamitocondriales presentancaracteres que losdistinguen de losprovenientes de otroorigen. Su tamaño es de 59-75 nucleótidos. Son, pues,menores que los ARNs de

transferencia delcitoplasma, el extremo 3'común de todos ellos, -CCA,no está codificado en elADN mitocondrial y tieneque añadirseposteriormente; el nivel demetilación de sus bases estambién menor que el de losARN de transferencia nomitocondriales. Una de lasdesviaciones más llamativascorresponde a uno de losARN de transferencia parala serina, que carece deuno de los bucles de suestructura típica en hojade trébol.

9. MARCOS DE LECTURA MITOCONDRIALES HUMANOS. La mayoría carece decodón de terminación que señala la finalización de la traducción aproteínas. Los ARN que se transcriben de estos marcos de lectura

terminan en UA o U, siguiendo al último codón con sentido (codificadorde aminoácidos). Al formarse eI ARN, mensajero, por procesamiento delARN primario con la consiguiente poliadenilación del mismo en elextremo 3' (adición de una cola de nucleótidos de adenina), se generael codón de terminación UAA. En la figura se muestra el extremo 3' dedos marcos de lectura (subunidad 1 de NADH deshidrogenasa v subunidadII de citocromo c oxidasa) y el extremo 5' de los ARN de transferenciaque hay adyacentes.

Los ARN mensajeros decélulas eucariotas poseenun tramo no codificante ensu extremo 5' delante delcodón de iniciación (primercodón de un marco delectura), que es utilizadopara la unión de ribosomasal ARN en la traducción aproteínas. Al analizar lassecuencias del ADNmitocondrial humano quecodifican las distintasproteínas (marcos delectura), se observa que elcodón de iniciación de cadauna es inmediatamentecontiguo, o está separadopor uno a tres nucleótidos,del gen adyacente por suextremo 5'. Así, porejemplo, el codón deiniciación del gen para lasubunidad II de lacitocromo c oxidasa (COIl)está localizado acontinuación del gen parael ARN de transferencia delácido aspárticp, sin ningúnnucleótido intermedio.Cabe, por tanto,preguntarse si los ARNmensajeros mitocondrialeshumanos, correspondientes adichos marcos de lectura,

poseen también en elextremo 5' un tramo sinmisión codifidora. Detenerlo, las secuencias delADN que los codificasenformarían parte, a su vez,del gen inmediatamenteanterior al codón deiniciación. Con el fin deresponder a esta cuestiónse secuenció el extremo 5'de cada uno de los ARNmensajeros. Los resultadosobtenidos indicaron quetodos los ARN mensajerosmitocondriales humanoscomienzan directamente porel codón de iniciación,AUG, AUA o AUU, o muy cercadel mismo; carecen, pues,de uno de los caracterestípicos de los ARNmensajeros de eucariotas,como es la presencia de untramo no codificante en elextremo 5'. Esta propiedaddistintiva de los ARNmensajeros mitocondrialeshumanos abre una serie deinterrogantes acerca delmecanismo de unión de losribosomas a dichos ARN .Esmuy posible que loscaracteres especiales delos ribosomas mitocondria

les humanos les permitareconocer directamente elcodón de iniciación, sinvalerse de otra indicaciónprecedente.

El extremo 3' de losARN mensajerosmitocondriales humanospresenta tambiénpropiedades únicas. Lamayoría de estos ARNcarecen de un tramo nocodificante en dichoextremo y de codón determinación (señal deparada en la síntesis delas proteínas por losribosomas); acaban con losnucleótidos U o UA quesiguen al último codón consentido (codificante de unaminoácido determinado).¿Qué señal reconocerán,pues, los ribosomas paraterminar la síntesis deproteínas? Como hemosindicado antes, todos losARN mensajerosmitocondriales humanos sepoliadenilan en su extremo3' después de latranscripción, generando deesta forma el codón determinación UAA.

La posibilidad deseparación de las doshebras del ADN mitocondrialhumano por gradientesalcalinos de cloruro decesio ha facilitadoenormemente el estudio dela naturaleza de los

productos de transcripcióndel mismo.Mediante técnicas dehibridación de ARN/ADN, sedeterminó de qué cadena delADN mitocondrial procedíacada ARN. Posteriormente,la aplicación de las nuevastécnicas de cartografía delos extremos del ARN en elADN (técnica de protecciónala nucleasa 51) y lasecuenciación de los ARNmensajeros y ribosómicosproporcionaron un mapa detranscripción del ADNmitocondrial humano muydetallado. El análisis deeste mapa muestra que laorganización compacta delos genes en el ADN sevuelve a reflejar fielmenteen la organización de susproductos de transcripción.Todos los ARN identificadosson colindares con el ADN,lo que indica que, adiferencia del ADNmitocondrial de levadura yde otros hongos, los genesmitocondriales humanoscarecen de intrones. Salvouna pequeña zona,equivalente aun 7 porciento del genoma,alrededor del origen dereplicación de la cadenapesada, el ADN mitocondrialhumano está saturado porlos ARN ribosómicos,mensajeros y detransferencia.

Existe unacorrespondencia perfectaentre los distintos genesde la cadena pesada del ADNy los ARN. En la mayoría delos casos, cada ARNmensajero contiene sólo unmarco de lectura. Hay dosexcepciones, sin embargo:los ARN 7 y 14 quecontienen dos marcos delectura cada uno(subunidades 4L y 4 de laNADH deshidrogenasa ysubunidades 8 y 6 de laATPasa, respectivamente)solapados entre sí endistinta fase de lecturapara su traducción. Encuanto a la subunidad 6 dela NADH deshidrogenasa,codificada por la cadenaligera, no se ha encontradotodavía un ARN mensajero detamaño semejante; sinembargo, esta secuenciaforma parte del extremo 5'de los ARN poliadeniladoslargos (ARN 1, 2 y 3), queposiblemente funcionan comoARN mensajeros para dichasubunidad.

La secuenciación delos ARN mensajeros yribosómicos, transcritos dela cadena pesada del ADNmitocondrial humano, harevelado que, junto con losARN de transferencia, estosARN son contiguos unos aotros, sin ningúnnucleótido intermedio;

corresponden a la casitotalidad de la cadenapesada, extendiéndose desdelas coordenadas 2/100 hasta95/100 relativas al origende replicación (OH), tomadocomo 0/100. Estasobservaciones han llevado adeducir que latranscripción acontecesintetizando una moléculade ARN primario que, segúnva creciendo, se vatroceando mediante cortesprecisos delante y detrásde las secuencias de losARN de transferencia, paraoriginar los ARN maduros.En el procesamiento del ARNprimario, los ARN detransferencia, esparcidosentre las secuencias de losARN ribosómicos ymensajeros, representan lasseñales de reconocimientopara las enzimas deprocesamiento, al adquirirla configuración en hoja detrébol mientras formanparte de la cadena reciénte del ARN.

Todos los ARN maduros,a excepción de los ARN detransferencia, están oligoo poliadenilados. Indicaesto que el procesamientoque origina el extremo 3'de estos ARN ha de estarligado aun proceso deadenilación. Lascaracterísticas de losgenes mitocondriales exigen

que los cortes, originadospor las enzimas deprocesamiento, debenproducirse exactamente enlos extremos 5' y 3' de losARN de transferencia.

Si, como indica elmodelo de transcripciónpropuesto, todos losproductos maduros de latranscripción de la cadenapesada proceden de unaúnica molécula gigante deARN, los distintos ARNribosómicos, mensajeros yde transferencia deberíansintetizarse en cantidadesequivalentes. ¿Cómoexplicar, entonces, que eneste sistema mitocondriallos ARN ribosómicos seencuentren en unaproporción 30 o 60 vecessuperior a la de los ARNmensajeros? Estadesigualdad se debefundamentalmente a unadiferencia en la velocidadde síntesis de ambos tiposde ARN. ¿Cuál es elmecanismo que controla lasíntesis de los ARNribosómicos y de los ARNmensajeros? Experimentosmuy recientes han aportadouna serie de datos que hanayudado a dilucidar elproceso involucrado en laregulación de la síntesisde los ARN ribosómicos ymensajeros. Se hanidentificado dos lugares de

iniciación de latranscripción de la cadenapesada del ADN mitocondrialhumano. Uno de estoslugares (IHT) se encuentramuy próximo al extremo 5'del gen para el ARNribosómico 12S y el otro(IHR) 19 bases por delantedel gen para el ARN detransferencia defenilalanina, a unas 90bases del primero.

La existencia de estosdos lugares de iniciaciónde la transcripción de lacadena pesada, y el hechode que la región de lacadena pesada del ADNmitocondrial que codificalos dos ARN ribosómicos setranscriba con unavelocidad muy superior a ladel resto de la cadena, nosllevó a estudiar con másdetalle los productos detranscripción primarios deesta zona del ADN. En ellase localizan, además de losdos ARN ribosómicos 125 y165, el ARN4, poliadeniladoen su extremo 3', y el ARN4a nopoliadenilado. Estasdos especies de ARNpresentan el mismo extremo3' que el ARN ribosómico165, pero difieren en laposición de su extremo 5'.Así, mientras que el ARN 4ªcomienza muy cerca delprimer lugar de iniciaciónde la transcripción,

aproximadamente 19 pares debases por delante del genpara el ARN detransferencia defenilalanina, el poli(A)-ARN 4 tiene su extremo 5'muy próximo al extremo 5'del gen para el ARNribosómico 125.

Más tarde, sedeterminó que el ARN 4a esel precursor de los dos ARNribosómicos, mientras queel poli(A)-ARN ni es elprecursor ni estárelacionado tampoco con elARN 4a. Estos resultadoshan establecido unacorrelación entre los doslugares de iniciación de latranscripción de la cadenapesada del ADNmitocondrial, mencionadosanteriormente, y dosprocesos de transcripcióndiferentes, solapados entresí, que tienen lugar en laregión del ADN que codificalos ARN ribosómicos. Uno deestos procesos detranscripción comienza enel lugar de iniciación(IHR)' localizado 19nucleótidos por delante delgen del ARN detransferencia defenilalanina, y sintetiza,a una velocidadrelativamente alta, un ARNno-poliadenilado (ARN 4a),que termina en el extremo3' del gen del ARN

ribosómico 16S, y que estádestinado a ser procesadoproduciendo los dos ARNribosómicos y los ARN detransferencia defenilalanina y valina. Elsegundo proceso detranscripción, mucho menosfrecuente que el anterior,comienza en el lugar deiniciación (IHT), próximoal extremo 5' .del gen parael ARN ribosómico 12S y seextiende más allá delextremo 3' del gen para elARN ribosómico 16S,produciendo un ARNpolicistrónico quecorresponde a casi latotalidad de la cadenapesada. El poli(A)-ARN 4,que se localiza en laregión de los ARNribosómicos, los ARNmensajeros y los ARN detransferencia, codificadospor el resto de la cadenapesada, derivan de esteARN policistrónico porprocesamiento del mismo.

¿Por qué dos unidadesde transcripción paratranscribir la misma regióndel ADN mitocondrialhumano? Su existenciaparece que está justificadaI por la necesidad que lacélula tiene de controlarla velocidad de síntesis delos ARN ribosómicos y delas otras dos clases deARN. Una diferente eficacia

de los dos promotores de latranscripción puede ser elfactor que determina ladistinta velocidad desíntesis. De acuerdo conesto, los productos detranscripción de esta zonatienen marcado su destinosegún comiencen en uno uotro lugar de iniciación.

Uno de los aspectosmenos conocidos acerca delADN mitocondrial humano esel significado de latranscripción de la cadenaligera. Los genescodificados por esta cadenaincluyen 8 ARN detransferencia y unasubunidad de la NADHdeshidrogenasa (ND6). Todasestas secuenciasrepresentan solamente un 7por ciento de la longitudde la cadena ligera. Apesar de esto, la cadenaligera se transcribe casien su totalidad y lo hacecon una velocidad dos otres veces superior ala dela cadena pesada. Entre losproductos de transcripciónque se han aislado figuranlos 8 ARN de transferencia,un ARN poliadeniladopequeño (ARN 18 o ARN 7S) ytres ARN poliadenilados muylargos (ARN 1,2 y 3), quetienen una vida media muycorta y que pueden serintermedios en la formaciónde los ARN de transferencia

codificados en la cadenaligera. La secuencia de lasubunidad 6 de la NADHdeshidrogenasa codificadapor esta cadena (ND6)corresponde a los 500primeros nucleótidoscomunes de estos tres ARN;ello sugiere que estos ARN,o algunos derivados suyos,funcionan como ARNmensajeros para este marcode lectura. Se haidentificado un solo lugarde iniciación de latranscripción próximo alextremo 5' del ARN 18.

¿Qué función tiene elARN 18? Este ARN,cartografiado muy cerca delorigen de replicación (OH),tiene unos 200 nucleótidosde longitud, es el másabundante y es el único,entre los ARNpoliadenilados procedentesde la cadena ligera, que seacumula. Su función estodavía desconocida, perose especula que, por sulocalización cerca delorigen de síntesis de lacadena pesada, el ARN delcual este ARN ha sidoprocesado pueda actuar comoiniciador de la replicaciónde la cadena pesada.También, por poseer untramo de 11 nucleótidos quees complementario alextremo 3' del ARNribosómico 12S y un pequeño

marco de lectura para 22 o23 aminoácidos, se suponeque intervendría en lamodulación o en la propiasíntesis de proteínas.Hasta ahora, este ARN sólose ha identificado en lasmitocondrias humanas.

¿Por qué se transcribela cadena completa si poseetan poca informacióngenética? Es muy posibleque, como los genes quecodifica esta cadena estánmuy esparcidos, latranscripción completa dela cadena ligera, bajo elcontrol de un solopromotor, represente laforma más económica deexpresión de estos genes.Sin embargo, esto nojustifica la elevadavelocidad de transcripción,por lo que se especula sino desempeñará algún papelen la expresión de losgenes de la cadena pesada.

El análisis de lasecuencia del ADNmitocondrial de otrosmamíferos (bovino, ratón yrata) permite afirmar quetodos ellos presentan lamisma organizacióngenética. Es más, parecemuy probable que estaconclusión pueda extendersea todos los animalesvertebrados en general,puesto que también se haencontrado la misma

disposición de los genes enla rana Xenopus laevis . Deesta identidad en laorganización gen ética, sepuede deducir que el modelode transcripción del ADN yde procesamiento del ARNobservados en lasmitocondrias humanas esaplicable también a todoslos vertebrados. La mayordiferencia en la secuenciade los genomasmitocondriales de mamíferosradica en la regióncomprendida entre los genespara los ARN detransferencia defenilalanina y prolina. Eneste tramo se encuentran elbucle de desplazamiento, elorigen de la síntesis de lacadena pesada y los lugaresde iniciación de latranscripción de ambascadenas.

La organización genética de invertebradospresenta, sin embargo,notables diferencias conrespecto a la de mamíferos.Así, tomando como ejemplo aDrosophila (mosca delvinagre), se observa enprimer lugar que el ADNtiene una región, de tamañovariable (de 1000 a 5100pares de bases), rica en A-T, donde se encuentra elorigen de síntesis de laprimera cadena que sereplica. En estos insectos,

la síntesis de la segundacadena no comienza hastaque se ha sintetizado un 99por ciento de la primera.La distribución de losgenes, entre las doscadenas del ADN no es tandesigual como en lasmitocondrias humanas. EnDrosophila, las secuenciasque codifican los dos ARNribosómicos y los marcos delectura para lassubunidades 1, 4, 4L y 5 dela NADH deshidrogenasaestán localizadas endistinta cadena conrespecto a los genes de lassubunidades I, II y III dela citocromo c oxidasa, delas subunidades 6 y 8 de laA TPasa, citocromo b ysubunidades 2 y 3 de laNADH deshidrogenasa. Laorganización compacta delos genes y la distribuciónde las secuencias de losARN de transferencia vistasen humanos están tambiénpresentes en estosorganismos. En el erizo demar, la organizacióngenética del ADNmitocondrial difiere de lacorrespondiente a losmamíferos en que lassubunidades 1 y 2 de laNADH deshidrogenasa estánlocalizadas entre los genesde los dos ARN ribosómicos.La disposición del resto delos genes en el

ADN es equivalente a la delas células humanas.

A pesar de quesolamente se ha analizadoel ADN mitocondrial de unospocos animales, se puedentrazar ya ciertas líneasgenerales de su evolución.Parece que el ADNmitocondrial de todos losvertebrados exhibe el mismomodelo de organización yexpresión de los genes queel descrito en mamíferos yla rana Xenopus laevis. Sinembargo, será necesarioexaminar otros vertebrados,especialmente los másprimitivos, antes degeneralizar. Los datosobtenidos al analizar elADN mitocondrial deanimales invertebradosindican que, a pesar dehaber sufrido unareconstrucción de los genesdurante su evolución,conservan todavía lascaracterísticas básicas decompacticidad y economía.

Hemos abordado, a lolargo del artículo,aspectos de la estructura yfunción del ADNmitocondrial que no tienenparalelo en otro sistemagenético. La información deque hasta ahora se disponeha puesto los cimientos quenos facultan para acometerla solución de otrosproblemas relacionados con

los mecanismos deregulación de este genoma ysu evolución. El desafíoconsistirá en llegar alconocimiento de losmecanismos implicados en lacoordinación y control

recíproco de la expresiónde los genes mitocondrialesy de los genes nuclearesimplicados en la biogénesismitocondrial.

10. DOS PROCESOS ALTERNATIVOS de transcripción tienen lugar en laregión del ADN mitocondrial humano que codifica los ARN ribosómicos.Uno de ellos, el menos frecuente (azul), comienza en el lugar deiniciación l HT y va a transcribir la totalidad de la cadena pesada,derivándose del mismo los ARN mensajeros, el ARN 4 y la mayoría de losARN de transferencia codificados en la cadena pesada. El segundoproceso de transcripción (verde), mucho más frecuente que el anterior,empieza en l HR y se limita a la región que codifica los ARNribosómicos produciendo, por procesamiento del precursor ARN 4a, losdos ARN ribosómicos y los ARN de transferencia de fenilalanina yvalina. En la parte superior de la figura se muestra un segmento de lacadena pesada correspondiente a esta zona del ADN. IHT e IHR indicanlos lugares de iniciación de la transcripción de la cadena pesada. PHTsimboliza al promotor para la transcripción de la totalidad de la

cadena pesada; PHR' al promotor para la síntesis de los ARNribosómicos; ND, NADH deshidrogenasa.