尤永隆 1. 林丹军

动物学报 54( 2) : 271- 281, 2008

Acta Zoologica Sinica

2007-09-07收稿, 2007-11-28接受

* 福建省自然科学基金资助 (No1B0310006) [ This research was funded by Natural Science Foundat ion of Fujian Province ( No1B0310006) ]

** 通讯作者 ( Corresponding author)1 E-mail: djl in@ fjnu1edu1 cn

Z 2008动物学报 Acta Zoologica Sinica

泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响*

李桑1, 2 尤永隆1, 2 林丹军1, 2**

1. 福建师范大学生命科学学院, 福州 350108

2. 发育与神经生物学福建省高等学校重点实验室, 福州 350108

摘要通过组织学方法观察了泽蛙 ( Rana limnocharis ) 原始生殖细胞 ( PGCs) 的迁移、原始性腺的形成和性腺

分化, 并且探讨在不同的培育温度条件下性腺分化的差异。泽蛙的性腺分化有其特殊性: 生殖嵴形成时, 其中

既有体细胞, 又有原生殖细胞; 无论原始性腺是分化成为精巢还是卵巢, 其中都出现一个初生性腔。蝌蚪孵化

后的 17- 34 d ( Gosner 26- 38 期) 为性腺分化的敏感时期。在蝌蚪孵化后的第 2 d ( Gosner 25 期) , 分别用不同水

温18 e ? 1e 、30e ? 1e 、32e ? 1e 、34 e ? 1 e 培育蝌蚪, 直至完成变态幼蛙 ( Gosner 46期) 形成。自然水温

23 e - 25 e 为对照。对照组的雌、雄性比接近 1B1 ( 1B11 06) ; 18e ? 1e 实验组的雌、雄比例为 1183B1, 雄性率

仅 3511% ( P< 01 01) ; 从 30 e ? 1 e 实验组起, 雄性率提高, 34 e ? 1 e 实验组的雄性率达 7410% ( P < 0101)。

较高的培育温度可使泽蛙蝌蚪性别分化趋向雄性, 而较低的培育温度则使蝌蚪雌性化。泽蛙的性别分化属于温

度依赖型性决定 ( TSD)。当前全球性气候变暖对两栖类性比的稳定存在着威胁 [动物学报 54 ( 2) : 271- 281,

2008]。

关键词泽蛙性腺分化温度性比

Gonad differentiation and the effects of temperature on sex

determination in the rice frog Rana limnocharis*

LI Sang1, 2

, YOU Yong-Long1, 2

, LIN Dan- Jun1, 2**

1. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China

2. Higher Educational Key Laboratory for Developmental Biology and Neurobiology of Fujian Province, Fuzhou 350108, China

Abstract There are only a few reports on amphibian ( mainly newt) gonadal differentiation and the effect of temperature on sex

differentiation. This paper describes the migration of primordial germ cells ( PGCs) , formation of the germinal ridge and primordial

gonad, and gonadal differentiation of rice frog Rana limnocharis . The effect of temperature on its gonad differentiation was also

investigated. In newly hatched tadpoles, PGCs were located in the dorsal mesentery. In day 1 tadpoles, PGCs migrated to the

peritoneal epithelium beside the dorsal mesentery. The germinal ridges were formed on the peritoneal epithelium of day 4 ( Gosner

stage 25) tadpoles. Two types of cells could be distinguished in the germinal ridges: PGCs and somatic cells. The differentiation

of germinal ridge into primordial gonad was observed on day 17 ( Gosner stage 26) . In the primordial gonad, there was a primary

cavity. From day 22 ( Gosner stage 32) on, primordial gonads began to differentiate into ovaries. Testes began to differentiate on

day 30 ( Gosner stage 36) . Rana limnocharis displays two unique characteristics of gonadal differentiation. The first concerns the

formation of the germinal ridge. In general, when the germinal ridge forms in vertebrates, there are no PGCs associated with it.

PGCs normally migrate into the germinal ridge later on. However, in Rana limnocharis , after PGCs migrate to the peritoneal

epithelium, they are surrounded by some somatic cells from the peritoneal epithelium. PGCs and somatic cells form the germinal

ridge and protrude into the dorsal coelom. The second distinct characteristic involved gonadal formation. In vertebrates, if a cavity

appears in the primordial gonad, it will differentiate into an ovary, otherwise it will become a testis. However, in Rana

limnocharis , there is a primary cavity in every primordial gonad, regardless of whether it will become an ovary or a testis.

Day 17 to day 34 ( Gosner stage 26- 36) was a sensitive period of time for gonadal differentiation in Rana limnocharis .

From day 2 ( Gosner stage 25) on, tadpoles were divided into 5 groups. Every group was cultured under one of the five

temperatures: 18e ? 1e , 23e - 25e , 30 e ? 1 e , 32e ? 1e and 34 e ? 1e . The control group was held at 23e -

25 e . The sex ratio in the control group was approx imately 1B1 ( female to male was 1B1106) . In the 18e ? 1 e group, female

to male was 1183B1. The rate of male gonadal differentiation was progressively higher from 30 e ? 1 e to 34e ? 1e . In the

30 e ? 1 e group, the male rate was 6211% ( P < 0101) , and in 32e ? 1e group, 6614% (P < 0101) . When the temperature

was 34e ? 1e , the male rate was as high as 7410% ( P < 0101) . At higher temperature, some individuals displayed

hermaphroditic characteristics. These results show that sex determination in Rana limnocharis is temperature senisitive. High water

temperatures will inducemasculination. Global temperature change may skew the sex ratio of TSD animals and current global warming

represents a risk for extant TSD species, including Rana limnocharis [ Acta Zoologica Sinica 54 ( 2) : 271- 281, 2008] .

Key words Rana limnocharis , Gonad differentiation, Temperature, Sex ratio

动物的性别决定和性分化一直是生物学领域颇

受关注的课题之一。有关脊椎动物原生殖细胞的起

源、形成、迁移已有许多深入的研究 ( Balinsky,

1975; Nieuwkoop, 1979; 张天荫, 1987; Gilbert,

2003)。目前已经知道, 脊椎动物的性别决定机制

主要有遗传性决定 ( Genet ic sex determination, GSD)

和环境性决定 ( Environmental sex determination,

ESD) 两大类。高等脊椎动物如哺乳类的性别分

化, 主要受到遗传的控制, 而那些难以在形态上分

辩性染色体或性决定基因 ( Sex determining genes)

的鱼类、两栖类和爬行类, 其性别分化受到性分化

敏感期的环境特别是温度的巨大影响 ( Dournon et

al. , 1990; Manolakou et al. , 2006; 陈玉红等,

2007; 程晓春等, 2007) , 因此又可以称为温度依

赖型性决定 ( Temperature-dependent sex

determinat ion, TSD)。

有关温度对两栖类性腺分化影响的研究, 早在

20 世纪初就有过报道 ( Dournon et al. , 1990 )。

Witschi ( 1929) 用高温 32 e ? 2 e 培育美洲林蛙(Rana sylvatica ) 的蝌蚪, 发现有雄性化的趋势。

以后在北非肋突螈 ( Pleurodeles poireti )、欧非肋突

螈 ( Pleurodeles waltl )、冠欧螈 ( Triturus cristatus )

和滞育小鲵 ( Hynobius retardatus ) 等一些两栖类,

都有相类似的报道 ( Dournon et al, 1984; Chardard

and Dournon, 1999; Wallace and Wallace, 2000;

Sakata et al. , 2005)。在探讨温度影响两栖类性分

化的机制中发现 P450芳香化酶 ( P450 aromatase)

基因和 Dmrtl 基因在性分化中的作用 ( Sakata et

al. , 2005; Murdock and Wibbels, 2006)。在我国,

有关两栖类的性腺分化以及温度对性腺分化影响的

研究极少, 仅中国林蛙 ( Rana temporaria

chensinensis) 有这方面的报道 (李新红等, 2001)。

泽蛙 ( Rana limnocharis ) 体型小、分布广, 是

我国南方常见的种类。其生殖期较长, 每年的 4-

9月都可以从野外获得性腺发育成熟的雌、雄蛙进

行人工催产, 获得受精卵, 因此是进行发育生物学

实验的好材料。本文采用不同温度培育泽蛙的性别

尚未分化的蝌蚪, 观察在不同温度条件下, 蝌蚪的

发育状况、性分化规律以及雌、雄性比变化, 探讨

温度对泽蛙性腺分化的影响。

1 材料与方法

111 实验材料的获得

泽蛙捕获自福州市郊城门镇农田。2006- 2007

两年在泽蛙的繁殖季节 ( 4- 9 月) , 挑选性腺发育

成熟的雌蛙共 150只, 每批次人工催产雌蛙 20- 30

只, 获产率 9015%。催产激素为 LRHA2 (宁波第

二激素制品厂) , 剂量为 2- 5 LgP只。在 30 e 室温

经过 6- 7 h 激素效应期, 雌蛙可排卵; 此时取出

雄蛙精巢, 置于 0175%的生理盐水中, 捣碎制成

精子悬浮液, 将雌蛙的卵挤入精子悬浮液中, 轻轻

摇动使卵均匀受精。加入曝气过的自来水。来自不

同亲本的受精卵混合置于大盆 (直径 100 cm) 中充

氧孵化, 密度为 5000卵粒Pm3水体, 发育温度为自

然水温 ( 23 e - 25 e ) , 观察胚胎发育、蝌蚪孵化

直至变态幼蛙形成。发育各期参考 Gosner ( 1960)

的分期方法确定, 并根据泽蛙发育特点以孵化后日

龄加以区分。

112 不同水温的培育方法将同一批次刚孵出蝌蚪 ( Gosner 25 期) 随机

分成5组, 每组 150尾, 其中 4组为实验组, 分别

设定为 18 e ? 1 e 、30 e ? 1 e 、32 e ? 1 e 、34 e

? 1 e 温度处理组; 在自然水温 23 e - 25 e 中发育

的则为对照组。水温调控方法: 实验组 18 e ? 1 e水温低于自然水温, 采用空调制冷控温; 实验组

30 e ? 1 e 、32 e ? 1 e 、34 e ? 1 e 水温高于自然

水温, 采用可控温加热棒进行控温。温度处理从孵

化后2 d开始, 无论是升温或降温都缓慢进行, 以

使蝌蚪逐渐适应。各实验组在所设定的水温中培育

至蝌蚪变态为止。养殖方法各组相同, 刚孵化的蝌

蚪营养由自体卵黄提供; 孵化后 2 d, 卵黄将被吸

收殆尽, 此时要及时投喂浮游生物 (水蚤) ; 7 d后

改投喂鳗鲡配合饲料 (福州大昌盛饲料有限公司生

产)。培育期间昼夜光照同自然环境。

272 动物学报 54卷

对各实验组和对照组发育至完成变态的幼蛙进

行成活率和雌、雄性比的计算。采用性腺切片或性

腺压片方法观察性腺, 以确定幼蛙的性别。以上实

验每年各重复 3个批次。

113 取材及组织学制片

按上述方法另外培育一批每批次的蝌蚪, 用以

定期取样, 制作组织学切片, 观察原始生殖细胞的

迁移、生殖嵴的形成以及性腺分化。孵化后 1- 10

d的蝌蚪 ( Gosner 23- 25期) , 每 1- 2 d取样 6尾;

10 d以后的蝌蚪, 每 5 d取样 6 尾。采用 Bouin 液

固定组织, 常规梯度乙醇脱水, 二甲苯透明, 石蜡

包埋; 制作连续横切片, 切片厚 7 Lm, HE 染色。

切片标本置OLYMPUS BX51显微镜 (配冷光源数码

相机 OLYMPUS DP70) 下观察、拍照。对完成变态

的幼蛙, 进行解剖区分精巢或卵巢结构。对各期生

殖细胞进行测量, 同期细胞至少测量 10个。

114 数据分析

对于测量数据以平均值 ? 标准差 (Mean ? SD )

表示。以 Spss 1310统计学软件对实验数据进行 V2

测验 ( V2-Test) , 主要比较各实验组幼蛙的成活率

和雄性率与对照组的差异显著性 ( P< 0105为差异显著)。

2 结果

211 性腺发生及分化泽蛙的性腺分化以对照组 23 e - 25 e 的为准。

从孵化期蝌蚪开始至完成变态的幼蛙为止, 体内原

生殖细胞 ( Primordial germ cells, PGCs) 的迁移、生

殖嵴和原始性腺形成, 以及性腺分化过程如下述。

21111 原生殖细胞的迁移和原始性腺的形成

刚孵出的蝌蚪 (相当Gosner 23期) , 平均全长

610 mm ? 012 mm。此时, 鳃盖褶形成, 蝌蚪眼变

黑, 躯干前端的头部和背部有零星褐色素分布, 尾

部透明。腹部较大, 消化道充满卵黄, 呈淡黄色。

口凹形成, 但尚未开口。观察蝌蚪躯干部过前肾和

消化道的连续横切片, 背大动脉之下腹膜上皮与消

化道之间的背肠系膜上, 可发现 PGCs 单个分布

(图Ñ : 1) , 数量很少。PGCs呈圆形或椭圆形, 胞

体明显较其周围的体细胞大, 胞径均值 (长径@ 短径, 下同) 为 1018 Lm @ 818 Lm, 核径均值为 618Lm @ 512 Lm。核大, 着色浅, 核膜清晰可见, 核

仁1- 2个。

孵化后 1 d蝌蚪 ( Gosner 25期) , 全长 615 mm

? 013 mm。此时, 鳃盖已闭合, 转为内鳃呼吸。

头部和躯干部的色素增多。腹部由于卵黄吸收变

小, 肠管延长并盘曲。口开启, 上下颌可张闭。切

片观察, PGCs已迁移到背肠系膜两侧的腹膜上皮

上, 仍旧单个分布, 胞径均值为 1114 Lm @ 812 Lm,核径均值为 519 Lm @ 416 Lm (图 Ñ : 2)。

2 d 蝌蚪 ( Gosner 25 期) , 全长 710 mm ? 015mm。卵黄吸收殆尽, 蝌蚪开始摄食。肠管盘曲达

3- 4圈, 有时可见肛门有排泄物排出。前肾已退

化, 中肾形成。在过中肾及中肠切面上, 可见腹膜

上皮的不同位置有数个 PGCs (图 Ñ : 3)。在 PGCs

外周, 围有构成腹膜上皮的体细胞 ( Somatic cell)

(图 Ñ : 4)。PGCs 的胞径均值为 1813 Lm @ 1417Lm, 核径均值为 1316 Lm @ 1012 Lm。

4 d 蝌蚪 ( Gosner 25 期) , 全长 717 mm ? 016mm。在中肾管下方, 靠近背大动脉的腹膜上皮上,

左右两侧各向腹腔突出形成 1对纵行隆起, 此为生

殖嵴 ( Germinal ridge)。刚出现的生殖嵴很小, 由

体细胞和 PGCs构成。在生殖嵴中可以观察到 1- 2

个 PGCs (图 Ñ : 5)。PGCs 的胞径均值为 1611 Lm

@ 1212 Lm, 核径均值为 1315 Lm @ 1015 Lm。6 d 蝌蚪 ( Gosner 25 期) , 全长 912 mm ? 015

mm。生殖嵴体积略有增大, 生殖嵴中的 PGCs的数

量增加, 在一个切面上最多可见到 5 个 PGCs (图

Ñ : 6)。PGCs体积有所变小, 胞径均值为 1416 Lm

@ 1110 Lm, 核径均值为 1016 Lm @ 614 Lm。从 6 d

蝌蚪至 12 d蝌蚪, 生殖嵴变化不大。

17 d蝌蚪 ( Gosner 26期) , 全长 1712 mm ? 018mm。后肢芽基突出。生殖嵴中的 PGCs和体细胞数

量继续增多, 体积增大。在生殖嵴中央出现了一个

小腔隙, 为初生性腔 ( Primary cavity)。PGCs 和体

细胞位于腔隙的周围。此时的生殖嵴可改称为原始

性腺 ( Primordial gonad)。原始性腺横切面呈梨形。

背方狭窄, 通过背系膜悬挂于中肾管下的腹膜上皮

两侧 (图 Ñ : 7)。观察 Gosner 26- 30 期所有的蝌

蚪切片标本, 在原始性腺中都有大小不等的初生性

腔。此时, 还不能在形态上区分哪些原始性腺将分

化成卵巢, 哪些原始性腺将分化成精巢。

21112 卵巢的分化

22 d蝌蚪 ( Gosner 32期) , 全长 2013 mm ? 017mm。从蝌蚪外形观察, 躯体伸长, 后肢芽末端膨

大部的浅表面出现趾的分化。原始性腺体积明显增

大, 呈长囊状。原始性腺中的初生性腔扩大, 并且

在腔的表面有一层单层扁平上皮, 形成次生性腔

( Secondary cavity)。PGCs 位于腔的周围, 并突向表

2732期李桑等: 泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响

面, 在PGCs的周围分布着体细胞。PGCs形态变化

不大, 有的正处于有丝分裂期 (图 Ñ : 8)。

34 d 蝌蚪 ( Gosner 38 期) , 全长 30 mm ? 115mm。大多数蝌蚪的后肢五趾形成。在原始性腺中,

次生性腔周围的 PGCs 大部分已分化成卵原细胞

(图 Ò : 9)。卵原细胞呈圆形或椭圆形, 体积较大,

细胞核大, 核内的染色丝明显。胞径均值为 3914Lm @ 3412 Lm, 核径均值为 3319 Lm @ 2712 Lm。此

时的原始性腺可以改称为卵巢, 其中的次生性腔称

为卵巢腔。

在Gosner 40- 45期, 大多数的蝌蚪体长不再

增长, 而是躯体变大, 后肢变壮, 前肢形成, 四肢

能够支撑身体着陆, 最后尾部缩短直至消失。至孵

化后的第 45 d ( Gosner 46期) , 大部分蝌蚪完成变

态, 形成幼蛙。幼蛙的一对卵巢位于中肾靠近中央

的腹面, 卵巢浅灰色略透明, 外形呈长囊状, 有分

叶。在卵巢的前端有脂肪体分布 (图 1A)。切片观

察表明, 卵巢伸长, 近卵巢腔有一些早期的初级卵

母细胞。初级卵母细胞体积大, 细胞质嗜碱性, 着

色深。细胞核嫌色性, 其中有明显的染色质丝和多

个核仁。胞径均值为 8216 Lm @ 7017 Lm, 核径均值

为5412 Lm @ 4614 Lm (图 Ò : 10)。

21113 精巢分化

30 d蝌蚪 ( Gosner 36期) 的原始性腺切片中观

察到一种体积较小的原始性腺, 呈椭圆形。初生性

腔扩大, 腔的表面没有单层扁平上皮, 腔中出现了

一些体细胞和血细胞。PGCs 分布在腔的周围, 胞

径均值为1411 Lm@ 1013 Lm, 核径均值为 919 Lm@

716 Lm (图 Ò : 11)。

在 34- 36 d ( Gosner 38- 40期) 的蝌蚪中, 该

类型原始性腺的初生性腔中, 体细胞数增多, 腔隙

变小。腔外的PGCs也随着腔隙的缩小而向中央渗

入, 最终初生性腔消失。PGCs 分化为精原细胞。

部分精原细胞正处于分裂增殖期, 并组成精小囊

( Spermatogenic cyst ) , 此时的原始性腺可以改称为

精巢 (图 Ò : 12)。

蝌蚪完成变态形成幼蛙 ( Gosner 46 期 ) 时,

其一对精巢位于中肾靠近中央的腹面。精巢表面光

滑, 不分叶, 外形呈长椭圆形, 颜色为浅灰色略透

明。在精巢的前端有脂肪体分布 (图 1B)。精巢髓

质部没有腔隙, 主要分布体细胞。精巢皮质部主要

为精原细胞 (图 Ò : 13)。精原细胞的核大, 核膜

明显, 核仁 1- 2 个, 核外的细胞质少, 着色浅。

精原细胞胞径均值为 4713 Lm@ 3515 Lm, 核径均值

为 2319 Lm @ 1811 Lm。体积略小于卵原细胞。

图 1 泽蛙幼蛙解剖, 示性腺

A. 雌蛙, 箭头示卵巢。B. 雄蛙, 箭头示精巢。

Fig1 1 Anatomy of Rana limnocharisps young frog, showing gonads

A. Female, arrows indicated ovaries. B. male, arrows indicated testes.

212 温度对性腺分化的影响

21211 温度影响性腺生成和分化的进程在不同水温中培育的蝌蚪, 其生长速度差别很

大, 但都能正常发育。各实验组与对照组的成活率

都在 90%以上, 无明显差异 ( P> 0105) (见表 1、

2)。组织学观察各实验组蝌蚪原始性腺形成和性腺

分化规律都与对照组的相似, Gosner 25期, 生殖

嵴出现; Gosner 26 期, 原始性腺形成; Gosner 32


期, 卵巢分化; Gosner 38期, 精巢分化。但是以

同样培育天数比较其性腺分化的进程, 则有所差异

(见表 1)。低温实验组 18 e ? 1 e 蝌蚪孵化后 12 d

才出现生殖嵴, 27 d原始性腺形成; 50 d才开始性

腺分化; 65 d出现明显的精巢和卵巢结构。高温实

验组 30 e ? 1 e 、32 e ? 1 e 、34 e ? 1 e 在 2 d出

现生殖嵴, 8- 9 d时原始性腺形成, 12- 15 d 卵巢

分化, 至17 d精巢分化。

表 1 温度对泽蛙性腺分化进程的影响

Table 1 Influence of different temperatures on gonads differentiation advance of Rana limnocharis

组别

Groups

生殖嵴形成

( Gosner 25期, d)

Germinal rige formation

( Gosner stage 25, day)

原始性腺形成

(Gosner 26期, d)

Primorial gonas formation

(Gosner stage 26, day)

卵巢分化

( Gosner 32期, d)

Ovary different iation


精巢分化

(Gosner 38期, d)

Test is dif ferentiat ion

(Gosner stage 38, day)

完成变态

( Gosner 46期, d)

Metamorphosis complete


18 e ? 1 e 12 27 50 65 90

23e - 25e 4 17 22 34 45

30 e ? 1 e 2 9 15 17 25

32 e ? 1 e 2 9 13 17 24

34 e ? 1 e 2 8 12 16 22

21212 温度影响群体雌雄性比例在蝌蚪发育至变态成幼蛙时, 对各实验组和对

照组幼蛙的性腺进行解剖观察或切片观察, 以分辩

雌、雄, 并统计群体性比例 (表 2)。统计结果显

示: 对照组幼蛙的雌、雄比例约为 1B1; 18 e ?

1 e 实验组幼蛙的雌、雄比例为 1183B1; 30 e ? 1 e

实验组的幼蛙雌、雄比例为 1B1167; 32 e ? 1 e 实

验组的幼蛙雌、雄比例为 1B1197; 34 e ? 1 e 实验组的幼蛙雌、雄比例为 1B2186 (见表 2)。由此观

之, 在18 e ? 1 e 水温中培育的蝌蚪有雌性化的趋

势 ( P < 0101) , 随着培育水温的升高, 雄蛙数量

显著增加, 至 34 e ? 1 e , 雄性率达 7410% ( P<

0101) , 有明显的雄性化趋势。此外, 在幼蛙的性腺连续切片观察中, 也发现

一些性腺的结构异常。如有的精巢中央腔隙不完全

消失, 外形是精巢而内部结构却似卵巢 (图 Ò :

14) ; 有的个体出现三个性腺 (图 Ò : 15) ; 还有少

数个体呈雌雄同体特征, 一侧性腺呈精巢组织结

构, 另一侧则为卵巢结构 (图 Ò : 16)。

表 2 不同温度对泽蛙幼蛙性比的影响

Table 2 Influence of different temperatures on the sex ratio of Rana limnocharis

组别

Groups

尾数

n

成活率

Mortality rate

% V2 P *

性比

FemaleBMale

雄性率

Male rate

% V2 P**

18 e ? 1 e 450 9718 01054 P > 0105 1183B1 3511 221852 P < 0101

30 e ? 1 e 450 9715 01205 P > 0105 1B1167 6211 111299 P < 0101

32 e ? 1 e 450 9711 01745 P > 0105 1B1198 6614 221451 P < 0101

34 e ? 1 e 450 9615 01773 P > 0105 1B2186 7410 511246 P < 0101

23e - 25e

对照 Control450 9811 1B1106 5110

成活率: 采用 V 2-test 将各实验组分别与对照组进行比较, P > 0105, P* 均无显著差异。

雄性率: 采用 V 2-test 将各实验组分别与对照组进行比较, P < 0101, P**均有显著性差异。

Mortality rate: comparing each experimental group with control using V 2-test , P> 0105, no signif icant difference.

Male rate: comparing each expermental group with control using V 2-test , P < 0101, significantly different .


3 讨论

311 泽蛙性腺分化的特点

原生殖细胞是一种在胚胎发育初期形成, 具有

特殊形态与发育成雄性配子或雌性配子潜能的细

胞。泽蛙的 PGCs 形态特点与其它脊椎动物的相

似: 细胞体积比体细胞的大, 着色浅; 细胞核大,

核膜清晰可见, 因此极易辨认。在 23 e - 25 e 水

温下, 刚孵化出来的蝌蚪 ( Gosner 23期) , PGCs位

于肾管下方的背肠系膜上。2 d ( Gosner 25期) 时,

PGCs已迁移到两侧中肾管下方的腹膜上皮, 并形

成生殖嵴; 17 d (Gosner 26期) 时, 生殖嵴中间出

现腔隙, 原始性腺形成; 22 d ( Gosner 32 期) , 卵

巢分化; 精巢的分化则较迟, 34 d ( Gosner 38期)

才出现明显的精巢分化。

泽蛙的性腺分化与脊椎动物通常所描述的性腺

分化对比有 2点不同。其一, 生殖嵴形成的差异。

一般认为, 脊椎动物的生殖嵴形成时, 其中没有原

生殖细胞, 原生殖细胞起源于生殖嵴以外的地方。

两栖类的 PGCs起源于内胚层中含有生殖质的细胞

( Balinsky, 1975; Nieuwkoop, 1979; 张天荫, 1987;

Gramapurohit et al. , 2000; Gilbert , 2003; Falconi et

al. , 2004)。例如非洲爪蟾 ( Xenopus laevis ) 的

PGCs分布于植物极的细胞 (未来的内胚层细胞)

之间。随着发育的进展, PGCs出现在胚胎近尾部

的内胚层中央。之后 PGCs通过运动迁移到生殖嵴

( Kamimura et al. , 1976; Balinsky, 1975;

Nieuwkoop, 1979; Wylie, 2000; Gilbert, 2003)。以

后, 在生殖嵴和其他组织发出的诱导信号作用下,

PGCs向生殖嵴迁移, 进入生殖嵴并与生殖嵴中的

体细胞共同形成未分化生殖腺 ( Balinsky, 1975;

Gilbert , 2003)。而在泽蛙的生殖嵴形成中, 始终未

观察到先是体细胞形成细胞团, 向腹腔突出成为生

殖嵴, 然后PGCs再迁入其中的现象。而是在 PGCs

迁移到腹膜上皮上后, 在 PGCs 周围有几个体细胞

将其包围, 随后 PGCs 和体细胞一起向腹腔突出,

形成生殖嵴 (图 Ñ : 3、4、5)。由此可见, 泽蛙的

生殖嵴的形成与已经报道的脊椎动物的生殖嵴形成

有很大的差异。其二, 性腺分化的差异。一般认

为, 脊椎动物的原始性腺中若出现初生性腔, 该性

腺将分化成为卵巢; 若原始性腺中没有出现腔隙,

将分化成为精巢 ( Balinsky, 1975; Gilbert, 2003;

Sakata et al, 2005; 陈玉红等, 2007; 程晓春等,

2007)。而泽蛙的原始性腺, 无论其将来是分化成

精巢还是卵巢, 中央都出现初生性腔, PGCs分布

在腔的外周即皮层的位置 (图 Ñ : 7、8)。在初生

性腔的基础上, 有的原始性腺将形成次生性腔, 有

的不形成次生性腔。所谓次生性腔, 即初生性腔的

表面出现了单层扁平上皮 (图Ñ : 8)。那些形成了

次生性腔的性腺将分化成为卵巢, 其中的原生殖细

胞分化成为卵原细胞 (图 Ñ : 8; 图 Ò : 9、10) ;

而不形成次生性腔的原始性腺, 体细胞和血细胞渗

入初生性腔中, 使腔隙变小直至消失 (图 Ñ : 11、

12、13) , 这种原始性腺分化成为精巢, 其中的原

生殖细胞分化成为精原细胞。因此, 不能仅根据原

始性腺中是否形成腔隙来判断是分化成卵巢还是精

巢, 这是泽蛙的性腺分化与脊椎动物通常的性腺分

化规律明显不同之处。在两栖类中还有一些种类,

其性腺分化具另一种特性, 如短吻蛙 ( Rana

curtipes) 的原始性腺先分化成具有中央腔的卵巢,

其中出现卵母细胞, 随后在一些卵巢中卵母细胞退

化, 体细胞渗入到中央区域, 卵巢转化成精巢

( Gramapurohit et al. , 2000)。

312 温度对泽蛙性腺分化的影响

温度可以影响蛙的胚胎发育及生长速度。早在

1898年, Hertwig 就观察到在高温下培育的两栖类

蝌蚪的发育速度加快 ( Dournon et al. , 1990)。张健

等在泽蛙的胚胎发育研究中也发现随着培育水温的

升高, 胚胎发育速度加快 (张健、林丹军, 1987)。

本研究表明, 随着培育水温的升高、泽蛙的胚胎发

育速度加快的同时, 性腺的生成和分化的进程也加

快。在低温条件 18 e ? 1 e 下培育的蝌蚪, 由于发

育缓慢, PGCs 的迁移、原始性腺的形成和性腺分

化都比对照组的慢, 而在较高温度 30 e ? 1 e 、

32 e ? 1 e 、34 e ? 1 e 下培育的蝌蚪则明显快得

多, 但是性腺分化的规律是一样的 (见表 1)。

对大多数两栖类来说, 16 e - 26 e 范围内, 个

体的雌、雄比例大约为 1B1, 而在极冷或极暖的温

度条件下, 个体性腺的分化可能会受到干扰, 产生

明显偏差的性比 ( Dournon et al. , 1984, 1990)。本

实验表明, 在 23 e - 25 e 自然水温下, 17 d

( Gosner 26期) 时, 原始性腺形成, 22 d ( Gosner 32

期) 时, 卵巢分化, 34 d ( Gosner 38期) 时, 精巢

分化。因此泽蛙性分化的敏感时期是在蝌蚪 17-

34 d ( Gosner 26- 38期) 之间。在此期间对蝌蚪进

行不同温度的培育, 对其性腺分化有明显的影响。

在 23 e - 25 e 自然水温下培育, 幼蛙的雌、雄比

接近1B1 ( 1B1106) ; 而在 18 e ? 1 e 水温培育下,


幼蛙的雌性率明显偏高 ( 1183B1) ; 如果培育的水

温在 30 e - 34 e 范围内, 雄性幼蛙的数量明显比

雌性多。实验表明, 泽蛙的性决定属于温度依赖型

的性决定 ( TSD) , 高温能诱导蝌蚪雄性化, 这一

结果与其它几种两栖类的研究结果相似。如美洲林

蛙和冠欧螈, 低温有利于胚胎的性腺雌性化, 而高

温有利于雄性化 ( Witschi et al. , 1929; Wallace et

al. , 1999)。但是在滞育小鲵, 温度对性分化的影

响则相反, 高温促使性腺雌性化, 雌性率可高达

9513% (Sakata et al. , 2005)。因此, 高温可以影

响蛙的性腺分化, 但是性腺是趋向雄性或雌性有种

的差异。

此外, 在本实验中还发现了雌雄同体的个体。

其性腺的一侧为精巢, 而另一侧为卵巢 (图 Ò :

16) , 或者外形是精巢而内部结构却似卵巢 (图 Ò :

14)。这种现象可能是在高温处理下, 性腺由卵巢

向精巢转化的过渡状态, 也可能在成体中将永久存

在。雌雄同体现象在性逆转的实验中常有发现。例

如, 在冠欧螈皮质亚种 ( Triturus cristatus carnifex ) ,

高温促进雄性化, 但是高温诱导的性反转雄性是不

育的, 其生殖管道和生殖腺都发育不正常 ( Wallace

et al. , 1999)。在性逆转的泥鳅个体中, 也有雌雄

同体现象 (陈玉红等, 2007)。

外界温度的变化对于温度依赖型性决定的动物

群体性别比例的稳定有重大影响。当前全球气候变

暖, 对于那些温度依赖型性决定的种类来说, 可能

是一种潜在的生殖威胁 ( Miller et al. , 2004)。泽

蛙的性别分化属于温度依赖型性决定, 其生殖周期

跨越了炎热的夏季 (每年的 4月至 9月) , 当前地

球夏季气温持续升高, 泽蛙的种群性比稳定也存在

着潜在的威胁。

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图版说明Ac: 腹腔。Da: 背主动脉。F: 脂肪体。G: 消化道。GR: 生殖嵴。M: 中肾。Md: 中肾管。Mu: 肌肉。O: 卵巢。Oc: 卵巢腔。Oo: 卵原

细胞。Pd: 前肾管。PGC: 原生殖细胞。Po: 初级卵母细胞。S: 体细胞。Sc: 次生性腔。Sg: 精原细胞。T: 精巢。

图版 Ñ1. 孵化期 (Gosner 23期) 蝌蚪过前肾横切面, 示 1个 PGC位于背肠系膜 ( * ) 上。

2. 1 d (Gosner 25期) 蝌蚪过前肾横切面, 示 PGCs位于背肠系膜 ( * ) 两侧的腹膜上皮上。

3. 2 d (Gosner 25期) 蝌蚪过中肾横切面, 示多个 PGCs迁移到腹膜上皮 ( { ) 上。

4. 2 d (Gosner 25期) 蝌蚪过中肾横切面, 示 PGC外由几个体细胞 ( { ) 包绕。

5. 4 d (Gosner 25期) 蝌蚪过中肾横切面, 示一侧生殖嵴 ( { ) , 生殖嵴中有PGCs, 星号示背肠系膜。

6. 6 d (Gosner 25期) 蝌蚪过中肾横切面, 生殖嵴 ( { ) 中的PGCs数量增加, 星号示背肠系膜。

7. 17 d ( Gosner 26期) 蝌蚪过中肾横切面, 示原始性腺。原始性腺中出现初生性腔 ( { ) , 星号示背肠系膜。

8. 22 d ( Gosner 32期) 蝌蚪过中肾横切面, 示原始性腺, 次生性腔形成, 腔表面为单层扁平上皮 ( { ) , PGCs位于腔周围。有此形态特征

的性腺将分化为卵巢。

图版 Ò9. 34 d ( Gosner 38期) 蝌蚪卵巢横切面, 卵原细胞处于增殖期, 核大, 染色丝明显。

10. 完成变态幼蛙 ( Gosner 46期) 卵巢横切面, 卵巢伸长, 近卵巢腔有一些早期的初级卵母细胞。

11. 30 d (Gosner 36期) 蝌蚪过中肾横切面, 示原始性腺呈椭圆形, 在初生性腔中分布着体细胞 ( { ) 和血细胞, 有此形态特征的性腺将分

化为精巢。

12. 34 d ( Gosner 38期) 蝌蚪过中肾横切面, 示精巢中的精小囊 ( { ) , 星号示背肠系膜。

13. 完成变态的幼蛙 ( Gosner 46期) 精巢横切, 示皮质部的精原细胞和精小囊 ( { ) , 以及髓质部的体细胞。

14. 32e 实验组完成变态幼蛙 ( Gosner 46期) 过精巢横切面, 示精巢中央仍保留初生性腔 ( { )。

15. 30e 实验组完成变态幼蛙 ( Gosner 46期) 卵巢横切, 在一个个体中同时可观察到三个卵巢切面。星号示背肠系膜。

16. 34 e 实验组完成变态幼蛙 (Gosner 46期) 过性腺横切面, 示一侧性腺为精巢, 另一侧为卵巢, 其中有一个早期的初级卵母细胞。星号示

背肠系膜。

Explanation of PlatesAc: abdominal cavity. Da: dorsal aorta. F: fat body. G: gut . GR: germinal ridge. M : mesonephros. Md: mesonephric duct . Mu: muscle. O:

ovary. Oc: ovarian cavity. Oo: oogonium. Pd: pronephric duct . PGCs: primordial germ cells. Po: primary oocyte. S: somat ic cells. Sc: secondary

cavity. Sg: spermatocyte. T: testis.

Plate Ñ

1. A cross section at the level of pronephros in a newly hatched tadpole ( Gosner stage 23) , showing a PGC on the dorsal mesentery ( * ) .

2. A cross section at the level of pronephros in day 1 (Gosner stage 25) tadpole, showing PGCs on the peritoneal epithelium beside the dorsal mesentery ( * ) .

3. A cross section at the level of mesonephros in day 2 (Gosner stage 25) tadpole, show ing more than one PGC on the peritoneal epithelium ( { ) .

4. A cross section at the level of mesonephros in day 2 (Gosner stage 25) tadpole, show ing that one PGC was surrounded by serval somatic cells ( { ) .

5. A cross section at the level of mesonephros in day 4 ( Gosner stage 25) tadpole, show ing one germina ridge ( { ) at one side of the dorsal mesentery ( * ) .

There were PGCs in the germina ridge.

6. A cross section at the level of mesonephros in day 6 ( Gosner stage 25) tadpole, showing there were more PGCs in the germina ridge ( { ) . Asterisk indicated

dorsal mesentery.

7. A cross section at the level of mesonephros in day 17 ( Gosner stage 26) tadpole, showing primordial gonad. There was one primary cavity ( { ) in one

primordial gonad. Asterisk indicated dorsal mesentery.

8. A cross section at the level of mesonephros in day 22 ( Gosner stage 32) tadpole, showing primordial gonad. Secondary cavity had formed in the gonad. There

was simple squamous epithel ium on the surface of the secondary cavity. PGCs surrounded the cavity. Gonads show ing this characterist ics would differentiate

into ovaries.


Plate Ò9. A cross section of an ovary in day 34 ( Gosner stage 38) tadpole, showing oogonia at prol if erat ive stage. The oogonia had big nuclei in which chromat in was

obvious.

10. A cross section of an ovary in a young frog having completed metamorphosis ( Gosner stage 46 ) , showing long ovary. Some early oocytes surrounded the

ovarian cavity.

11. A cross sect ion at the level of mesonephros in day 30 ( Gosner stage 36) tadpole, showing oval primordial gonad. There were somatic cells ( { ) and blood

cells in the primary cavity. Gonads showing this characteristics would different iate into testes.

12. A cross sect ion at the level of mesonephros in day 34 ( Gosner stage 38) tadpole, showing spermatogenic cysts ( { ) in the testes. Asterisk indicated dorsal

mesentery.

13. A cross sect ion of a testis in a young frog having completed metamorphosis (Gosner stage 46) , showing spermatogonia and spermatogenic cysts ( { ) in the

cortex and somatic cells in medulla of the test is.

14. A cross sect ion at the level of testes in a young frog having completed metamorphosis ( Gosner stage 46) at 32 e , showing the primary cavity in the center

of the testes.

15. A cross sect ion at the level of ovaries in a young frog having completed metamorphosis ( Gosner stage 46) at 30e , showing three ovaries in the froge.

Asterisk indicated dorsal mesentery.

16. A cross section at the level of gonads in a young frog having completedmetamorphosis ( Gosner stage 46) at 34 e , showing a testis on one side, and an ovary

on the other side. There was an early oocyte in the ovary. Asterisk indicated dorsal mesentery.


李桑等: 泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响图版 Ñ

LI Sang et al. : Gonad differentiat ion and the effects of temperature on sex determination in the rice

frog Rana limnocharis Plate Ñ

图版说明见文后 (Explanat ion at the end of the text )

李桑等: 泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响图版 Ò

LI Sang et al. : Gonad differentiat ion and the effects of temperature on sex determination in the rice

frog Rana limnocharis Plate Ò

图版说明见文后 (Explanat ion at the end of the text )

尤永隆 1. 林丹军

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