TEKNOLOGI SEDIAAN SEMI SOLID DAN LIQUID

UJI PIROGEN

DOSEN :Amelia Febriani, S.Farm, M.Si.Apt

Penyusun:

Tyas Moro Widowati 16334002

Peggy Elvira Septiani 16334003

Mohammad Ghani Setiawan 16334015

Villya Sukmaningsih 16334019

Vera Maulida 16334026

PROGRAM STUDI FARMASI

INSTITUT SAINS DAN TEKNOLOGI NASIONAL

JAKARTA

2019

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah

memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah tentang

“Uji Pirogen” ini dengan tepat waktunya. Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas mata

kuliah Teknologi Sediaan Semi Solid dan Liquid

Penulis menyadari bahwa makalah ini masih banyak kekurangan dan masih jauh dari

kesempurnaan. Penulis juga memohon maaf apabila dalam penulisan makalah ini terdapat

kesalahan pengetikan dan kekeliruan sehingga membingungkan pembaca dalam memahami

maksud penulis. Oleh karena itu penulis berharap akan kritik dan saran yang sifatnya

membangun dari segenap pembaca guna sempurnanya makalah ini.

Demikianlah, semoga makalah yang telah dibuat ini dapat bermanfaat bagi saya

khususnya dan bagi pembaca umumnya. Terimakasih.

Jakarta, Mei 2019

Penulis

i

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.....................................................................................................................i

DAFTAR ISI..................................................................................................................................ii

BAB I PENDAHULUAN..............................................................................................................1

1.1 LATAR BELAKANG........................................................................................................1

1.2 RUMUSAN MASALAH...................................................................................................2

1.3 TUJUAN ...........................................................................................................................2

BAB II LANDASAN TEORI........................................................................................................3

2.1 PIROGEN...........................................................................................................................3

2.2 DEPIROGENASI...............................................................................................................3

2.3 TEKNIK DETERMINASI ENDOTOKSIN......................................................................5

2.4 SUMBER SUMBER PIROGEN........................................................................................7

2.5 PENCEGAHAN TERHADAP PIROGEN........................................................................9

2.6 UJI UJI PIROGEN...........................................................................................................10

BAB III PEMBAHASAN............................................................................................................21

BAB IV KESIMPULAN..............................................................................................................25

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................................................26

ii

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Demam merupakan regulasi panas pada suatu tingkat suhu yang lebih tinggi dan

berhubungan dengan peningkatan tolak ukur hipotalamus (Ernst Mutschler, 1991).

Demam paling sering dijumpai di Indonesia, diperkirakan angka kejadian jauh lebih

tinggi, mengingat banyaknya kejadian infeksi (Soeroso, 1989). Demam berhubungan

dengan banyak penyebab baik patologis maupun nonpatologis namun menyertai hampir

semua infeksi, terjadi dalam waktu singkat, meskipun dalam beberapa kasus dapat

berlangsung lebih lama. Bahan-bahan bakteri dan virus dapat menyebabkan demam yang

disebut demam pirogen eksogen (Ernst Mutschler, 1991); (Braunwald, et al., 2005). Suhu

tubuh normal berkisar antara 35,9-37,3ºC dengan variasi berbeda (Houssay, 1955).

Sejak zaman purbakala, demam telah dikenal sebagai tanda utama penyakit,tetapi

pengertian tentang patofisiologi demam tergolong relatif masih baru. Substansiyang dapat

menimbulkan demam disebut pirogen. Ada dua macam pirogen, yaitu pirogen endogen

yang dibentuk oleh sel-sel tubuh sebagai respons terhadap stimulusdari luar (misal:

toksin), dan pirogen eksogen yang berasal dari luar tubuh.

Pada1948, dr. Paul Beeson menemukan bahwa demam timbul karena adanya produk

sel peradangan hospes yang merupakan pirogen endogen. Belakangan ini, terbukti bahwa

fagosit mononuklear merupakan sumber utama pirogen endogen dan bahwa bermacam-

macam produk sel mononuklear dapat menjadi mediator timbulnyademam.Dewasa ini

diduga bahwa pirogen adalah suatu protein yang identik denganinterleukin-1. Di dalam

hipotalamus zat ini merangsang penglepasan asam arakidonatserta mengakibatkan

peningkatan sintesis Prostaglandin E2 yang langsung dapatmenyebabkan suatu pireks.

Dalam tekhnologi sediaan steril, keberadaan pirogen di dalam sediaan sangatlah

diharamkan karena akan membahayakan kesehatan pasien. Untuk itu perlu dipelajari hal-

hal yang berkaitan dengan pirogen agar kita memahami berbahanya pirogen bagi

kesehatan.

Pada makalah ini akan di bahas mengenai pirogen dan hal-hal penting untuk

mengetahui keberadaannya serta cara-cara menghindari dan cara-cara menghilangkan

pirogen.

1

1.2 Rumusan masalah

1. Apa saja sumber-sumber pirogen ?

2. Bagaimana cara-cara pencegahan pirogen ?

3. Apa saja uji-uji untuk mengetahui adanya pirogen ?

1.3 Tujuan Penulisan

1. Agar mahasiswa mengetahui dan memahami apa saja sumber-sumber pirogen

2. Agar mahasiswa mengetahui dan memahami bagaimana cara-cara pencegahan

pirogen

3. Agar mahasiswa mengetahui dan memahami apa saja uji-uji untuk mengetahui adanya

pirogen

2

BAB II

LANDASAN TEORI

2.1 Pirogen

Pirogen adalah racun (toksin) yang menimbulkan demam bila diberikan secara

intravena dalam jumlah tertentu (Goeswin Agus, 2009). Ada dua kelas utama pirogen,

yaitu endogenus dan eksogenus. Pirogen endogen merupakan senyawa yang diproduksi

oleh tubuh setelah seseorang mengkonsumsi pirogen eksogen. Respon ini merupakan

mediator utama dari proses demam. Senyawa pirogenik yang paling poten adalah yang

diproduksi oleh bakteri gram negatif (endotoksin), akan tetapi gram positif dan fungi juga

menghasilkan pirogen dengan potensi yang lebih rendah. Selain pirogen beberapa

senyawa lain juga diketahui menyebabkan reaksi piretik ini, yaitu steroid, virus, bahan

kimia dan obat tertentu. Akan tetapi, yang paling menjadi perhatian industri farmasi

adalah, eksogenus pirogen yang paling penting, yaitu endotoksin.

Endotoksin, disebut juga LPS, merupakan komponen utama dari membran terluar

bakteri gram negatif. Endotoksin tersusun dari polisakarida hidrofilik, yang terikat secara

kovalen dengan kandungan lipid yang hidrofobik (Lipid A). LPS dari sebagian besar

spesies bakteri tersusun dari tiga bagian yang berbeda, yaitu: bagian antigen-O,

oligosakarida inti (core oligosacharida) dan Lipid A.

Lipid A merupakan bagian yang paling konservatif, dan merupakan bagian yang

menjadi penyebab aktifitas biologi endotoksin, misalnya toksisitas endotoksin. Bagian

hidrofobik dari endotoksin tersebut tersusun secara heksagonal, sehingga secara struktur

lebih rigid (kuat) dibandingkan dari molekul lain. Bagian oligosakarida inti memiliki

struktur konservatif dengan bagian dalam berupa 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid

(KDO)-heptose region, terdapat lima tipe inti yang berbeda, sedangkan spesies salmonella

memiliki hanya satu tipe. Antigen-O secara umum tersusun dari sekuens oligosakarida

yang identik (masing-masing terdiri dari 3-8 monosakarida), yang spesifik sesuai

jenisnya.

Molar mass dari monomer endotoksin bervariasi dari 10-20 KD, bervariasi

tergantung pada ikatan oligosakaridanya, akan tetapi ada juga yang mencapai 70 KD.

Telah diketahui bahwa endotoksin membentuk berbagai agregat supra-molekular di

larutan yang mengandung air, yang disebabkan oleh interaksi non-polar antara ikatan

lemak dan juga jembatan yang dihasilkan antara gugus fosfat oleh kation divalen.

3

Berbagai studi telah dilakukan yang menghasilkan bahwa pada larutan aquous,

endotoksin dapat self assemble menjadi berbagai bentuk, seperti lamela, kubik dan

heksagonal, dengan diameter hingga 0,1 mikrometer, dan memiliki stabilitas yang tinggi

tergantung pada sifat larutan (pH, ion, surfaktan).

Endotoksin dihasilkan pada jumlah besar pada saat sel mati dan selama

pertumbuhan dan pembelahan. Endotksin memiliki sifat haet-stable dan tidak dapat

dihancurkan dengan kondisi sterilisasi biasa, karena banyak pirogen tahan terhadap

proses autoklaf, dan dapat lolos filtrasi dengan ukuran pori-pori 0,2 mikrometer yang

biasa digunakan untuk sterilisasi akhir.

Endotoksin baru bisa diinaktivasi ketika diekspos pada suhu 2500C selama lebih

dari 30 menit, atau 1800C selama lebih dari 3 jam. Asam dan alkali dengan kekuatan

minimal 0,1 M dapat juga digunakan untuk menghancurkan endotoksin pada skala

laboratorium.

Level endotoksin maksimum untuk aplikasi intravena pada produk farmasi dan

biologi adalah 5 endotoksin unit (EU) per kg berat badan per jam yang dicantumkan pada

farmakope. Istilah EU menunjukan aktivitas biologis endotoksin. Sebagai contoh, 100 pg

standar endotoksin EC-5 dan 120 pg endotoksin dari Eschercia coli O111:B4 memiliki

aktivitas 1 EU. Untuk memenuhi persyaratan ini, merupakan tantangan bagi industri

farmasi.

2.2 Depirogenasi

Depirogenasi bahan, alat dan wadah pada produksi sediaan farmasi dapat dilakukan

dengan dua cara, yaitu inaktivasi (destruksi) atau removal.

1. Inaktivasi

Inaktivasi biasanya melibatkan beberapa reaksi kimia (contohnya oksidasi, alkilasi,

atau hidrolisis endotoksin). Metode tersebut tidak banyak digunakan untuk

depirogenasi bahan awal dan air. Bila menggunakan metode ini maka harus

memperhatikan bahan kimia yang digunakan untuk memastikan tidak adanya efek

samping. Inaktivasi dengan panas kering merupakan metode yang efektif untuk

inaktivasi pirogen pada alat-alat gelas dan minyak yang tahan panas, juga bubuk tahan

panas. Temperatur yang disarankan untuk insinerasi adalah 170-350 deg C. Suhu

yang paling umum digunakan adalah 2500C selama 30 menit (Remington: 45 menit).

4

Suhu lain bisa digunakan 6500C selama 1 menit atau 1800C selama 4 jam. Dengan

suhu yang lebih rendah membutuhkan waktu insinerasi selama 1 hingga 12 jam.

2. Removal

Removal pirogen secara fisik lebih menguntungkan dari pada penambahan bahan

kimia karena tidak ada bahan kimia yang ditambahkan pada bahan yang akan di

sterilisasi.

2.3 Teknik Determinasi Endotoksin

Untuk pengujian pirogen, digunakan kelinci, dimana hewan coba diukur

peningkatan suhu tubuhnya setelah diinjeksi IV larutan steril yang diuji. Digunakan

kelinci oleh karena respon fibrilnya mirip dengan manusia. Farmakope telah

mensyaratkan, apabila tidak dipersyaratkan untuk melakukan uji bakteri endotoksin,

maka uji ini harus dilakukan pada semua larutan parenteral dimana volume

konsumsinya untuk dosis tunggal adalah 15 ml atau lebih.

Kerugian dari rabbit test ini adalah biaya yang mahal dan waktu yang panjang

untuk pengujian; tidak dapat dikuantifikasi dan larutan parenteral tertentu (misalnya

yang mengan dung fosfat kalium disis tinggi) akan memberikan respon pirogen.

Uji untuk bakteri endotoksin, diketahui sebagai Limulus Amoebocyte Lysate

(LAL) test. Uji ini merupakan uji yang telah umum dilakukan di industri farmasi

dimana diperlukan hasil yang terkuantifikasi. Basis dari uji ini adalah lysate dari

amoebocyte yang berasal dari darah Horseshoe Crab (Limulus polyphemus), dengan

penambahan endotoksin, akan terjadi clotting atau gelasi, sehingga menimbulkan

turbiditas atau presipitasi.

Saat ini telah dikembangkan kit untuk uji LAL ini yang banyak digunakan di

industri. Uji ini telah banyak digunakan untuk uji air dan end-process-testing untuk

sediaan parenteral, radiofarmasi dan alat-alat kesehatan.

5

Rhodes dan Hoft mengemukakan alasan mengapa pengujian LAL lebih disukai

dibandingkan dengan pengujian pirogen pada kelinci untuk radiofarmasetikal:

1. Pengujian lebih sensitif

2. Pengujian lebih cepat

3. Memerlukan material uji dalam jumlah kecil

4. Keduanya, baik kontrol positif maupun kontrol negatif, dapat dilakukan untuk

setiap pengujian

5. Tidak menyebabkan kelinci mengandung bahan radio aktif sehingga lebih disukai

dari segi keamanan radiologi.

6. Lebih murah dan lebih mudah disimpan.

Akan tetapi terdapat beberapa kerugian dari metode LAL ini. Beberapa faktor

sangat mempengaruhi hasil uji, yaitu pH larutan uji, sumber reagen yang digunakan,

konsentrasi kation (kalsium atau magnesium) pada larutan uji, dan level agregasi dari

bakteri juga mempengaruhi hasil uji. Sedangkan keuntungan dari metode LAL adalah

waktu singkat untuk uji, relatif murah, mudah dilakukan, dan terkuantifikasi.

Uji pirogen dilakukan untuk mengetahui apakah sediaan uji (sediaan parenteral)

bebas dari pirogen. Uji pirogen ini sangat penting, karena pirogen yang ada dalam

sediaan, jika disuntikan ke tubuh manusia dapat menimbulkan peningkatan suhu tubuh

atau demam. Selain itu pirogen memberikan efek vasokontriksi, dilatasi pupil, depresi

nafas, dan peningkatan tekanan darah. Mungkin reaksi yang muncul juga adalah nyeri

pada persendian dan punggung, sakit kepala, mual dan malaise, shok endotoksin,

kerusakan jaringan tubuh dan kematian. Akan sangat berbahaya untuk pasien dengan

kondisi sakit yang menerima LVP (Large Volume Parenteral) yang mengandung

endotoksin.

Salah satu metode uji pirogen adalah Rabbit Test. Digunakan kelinci sebagai

hewan coba. Hal ini dikarenakan kelinci memiliki respon fibriel yang mirip dengan

manusia. Pada uji pirogenitas, penyuntikan dilakukan pada pembuluh vena. Hal ini

bertujuan agar obat atau sediaan uji yang disuntikan, langsung terdistribusi ke dalam

aliran darah. Sehingga efek panas dari pirogen dapat langsung diamati.

6

Penyuntikan dilakukan pada vena auricularis, karena vena auricularis adalah

vena terbesar yang ada pada tubuh kelinci. Sehingga vena dapat dengan mudah dicari

dan dilihat. Sebelum dilakukan uji pirogen terhadap kelinci, perlu dilakukan

pengadaptasian terhadap kelinci, dengan tujuan untuk menghindari hasil yang positif

palsu, kelinci mengalami kenaikan suhu tubuh bukan disebabkan oleh sediaan uji,

melainkan kelinci stress dengan lingkungan yang baru karena sebelumnya tidak

diadaptasikan terlebih dahulu.

Uji pirogen dapat ditentukan dengan beberapa cara yaitu:

Penentuan pirogen secara fisiko kimia. (kuantitatif pirogen)

1. Dengan fotokolorimetri. Reagen Tetrabrom phenolphthalein (TBP) dan

penambahan asam acetat 0,2 N, sehingga timbul warna.

2. Polarografi. Pirogen mempunyai panjang gelombang maksimum oksigen pada

polarografi.

3. Elektroforesis

4. Spektrofotmetri. Pirogen mempunyai absorbsi spektrum ultraviolet pada E

maksimum 265nm.

Penentuan pirogen secara biologis. (kualitatif dari pirogen)

1. Pengujian pengukuran temperatur badan hewan percobaan. (Rabbit Test)

2. Perhitungan sel darah putih

3. Tes limulus (LAL test)

2.4 Sumber-sumber Pirogen

Pirogen dapat masuk dalam sediaan dalam arti berupa mikroorganisme hidup/mati.

Mungkin sumber terbesar dari berbagai kontaminasi adalah air yang digunakan pada

proses pembuatn. Walaupun destilasi yang tepat akan menyediakan air bebas pirogen,

kondisi penyimpanannya harus tidak dapat dimasuki oleh mikroorganisme dan

pertumbuhannya dicegah.

Sumber potensial yang lain dari kontaminasi adalah perlengkapan. Bahan-bahan

pirogenik melekat kuat pada gelas atau permukaan lain. Residu dari larutan dalam

peralatan yang digunakan sering terjadi menjadi kultur bakteriyang terkontaminasi

pirogenik. Walaupun peralatan yang sudah dicuci dibiarkan di udara dapat mengandung

nutrisi yang nyata untuk pertumbuhan mikroorganisme karena pengeringan tidak

menghancurkan pirogen, pirogen dapat tinggal dalam peralatan selama jangka panjang.

7

Pencucian yang baik akan menurunkan dan pemanasan kering akan mencegah

kontaminasi peralatan yang cocok untuk digunakan bahan terlarut dapat menjadi

sumber nitrogen. Bahan terlarut dapat mengkristal/mengendap dari larutan berair yang

mengandung kontaminasi pirogenik. Pada proses ini, pirogen dapat didihalangi melalui

lapisan partikel. Dalam beberapa kasus, bahan terlarut dapat dimurnikan dengan

rekristalisasi dan pencucian pengendapan atau cara lai untuk penghilangan pirogen.

Proses pembuatan harus diperhatikan sekali dansecepat mungkin untuk meminimalkan

kontaminasi. Tidak ada produk yang seharusnya disiapkan dengan proses yang lengkap

dalam satu hari kerja termasuk sterilisasi (RPS 18th : 1550).

Sumber-sumber pirogen adalah sebagai berikut :

1. Scoville’s : 196

Pada prinsipnya sumber pirogen adalah air destilat yang terlalu terkontaminasi

oleh bakteri yang tahan udara yang tumbuh dan menghasilkan endotoksin.

Sebagai tambahan, pirogen dapat dibawa ke destilat pada proses destilasi. Sumber

lain dari pirogen adalah air yang melekat pada permukaan dalam wadah atau botol

labu, yang dipakai dalam penyiapan larutan. Zat terlarut seperti dekstrosa dan

NaCl juga dapat dapat mengandung pirogen.

2. RPS 18th : 1550

Pirogen dapat masuk kedalam sediaan melalui beberapa cara berupa

mikroorganisme hidup atau mati. Mungkinsumber potensial terbesar dari berbagai

kontaminasi adalah air yang digunakan dalam proses. Walaupun destilasi yang

tepat akan menyediakan air bebas pirogen, kondisi penyimpanan harus tidak dapat

dimasuki oleh mikroorganisme dan pertumbuhannya dicegah. Sumber potensial

yang lain dari kontaminasi adalah perlengkapan. Bahan-bahan pirogen melekat

kuat pada gelas dan permukaan lain. Residu larutan dalam peralatan yang

digunakan sering menjadi media kultur bakteri dengan kontaminasi pirogenik.

Walaupun peralatan yang sudah dicuci dibiarkan basah dan dibiarkan diudara

dapat mengandung nutrisi yang nyata untuk pertumbuhan mikroorganisme karena

pengeringan tidak menghancurkan pirogen, pirogen dapat tinggal dalam peralatan

dalam jangka panjang. Pencucian akan mengurangi kontaminasi dan pemanasan

kering akan mencegah kontaminasi peralatan yang cocok untuk digunakan. Bahan

terlarut dapat menjadi sumber pirogen. Bahan terlarut dapat mengkristal atau

mengendap dari larutan berair yang mengandung kontaminasi pirogenik. Pada

proses ini, pirogen dapat dihalangi melalui lapisan partikel. Dalam beberapa

8

kasus, bahan terlarut dapat dimurnikan dengan rekristalisasi dan pencucian

pengendapan atau cara lain untuk penghilangan pirogen.

3. SDF : 46

Kebanyakan sumber utama dari pirogen adalah air yang digunakan untuk

membuat larutan. Walaupun air itu sendiri medium kultur yang buruk,

kontaminasi dapat terjadi melalui mikroorganisme yang membuat udara dan debu.

Seperti yang telah didiskusikan, inilah alasan satu-satunya digunakan dalam

sediaan adalah air untuk injeksi. Jika destilasi digunakan untuk menyiapkan air

untuk injeksi, masih perlu dirancang dan digunakan dengan lebih baik. Pirogen

dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap. Destilasi bebas

pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Jika wadah tidak

bebas pirogen, pirogen dalam wadah akan dilarutkan dalam air, hal ini yang

menyebabkan pirogenik. Jika wadah tidak steril, mikroorganisme dapat tumbuh

dan memproduksi pirogen, menghasilkan larutan pirogenik. API, ketika

dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus digunakan kurang dari

24 jam untuk sediaan produk parenteral yang disterilakan pada perode ini. Jika air

untuk injeksi disimpan untuk waktu yang lebih panjang, air untuk injeksi dapat

disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5o atau 30o, suyhu

dimana mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan

pirogen. Pilihan lain adalah sterilisasi air untuk injeksi, dengan demikian

mempertahankan stabilitas sampai waktu penggunaaan.

2.5 Pencegahan Terhadap Pirogen

a. Scoville’s : 196-197

Ada beberapa langkah yang dapat diambil untuk mencegah pemasukan dan

peningkatan pirogen dalam cairan parenteral. Hal paling penting adalah dengan

tepat merancang dan pengoperasian penyulingan, dicocokkan untuk mencegah

tetesan dari air mendidih kedalam destilat. Destilat harus dikumpulkan dalam

wadah yang telah dibilas dengan air destilat segar. Perlakuan untuk menghilagkan

tetesan-tetesan air yang terakumulasi yang dapat mengandung pirogen atau untuk

menghilangkan bahan pirogenik yang dapat mengering dan melekat pada bagian

dalam permukaan wadah.Usaha perlindungan menghindarkan kontaminasi destilat

oleh bakteri tahan udara harus dilatih. Air destilasi harus terlindung selama

penggumpalan dan harus digunakan sesegera mungkin setelah didestilasi untuk

9

mencegah perkembangbiakan bakteri yang mungkin ada. Larutan seharusnya

disaring, dikemas, disegel, dan disterilkan dengan secepat mungkin.

b. Scoville’s : 194

Jauh lebih baik mencegah pembentukan pirogen daripada mengusahakan

pemindahan atau penghancurannya. Namun, pirogen dapat dihilangkan dengan

adsorbsi pada penyaring asbestos aktif atau pada arang aktif. Kedua metode ini

digunakan, khususnya bila diperkirakan bahwa bahan kimia terkontaminasi

dengan pirogen. Metode penyaring asbes aktif terdiri dari sediaan larutan yang

dilewatkan melalui penyaring asbes kompresi dari serum seitz no 3 pirogen

diabsorbsi pada permukaan dari asbes dan oleh karena itu pirogen dihilangkan

dari larutan. Juga telah disebutkan bahwa pirogen dapat dihilangkan dengan

filtrasi melewati alat penyaring yang lain. Arang aktif juga menghilangkan

pirogen dari larutan dengan absorbsi. Larutan dikocok dengan 0,1 % arang aktif

serbuk halus selama 5-10 menit. Arang dibiarkan mengendap dan cairan

supernatan didekantasiatau arang dapat dihilangkan dengan penyaringan kertas

saring yang keras karena serbuk halus arang sulit dihilangkan dengan kertas

saring. Hudson menyarankan sistem penyaringan menggunakan kombinasi pasir

murni, kertas saring dan penyaring gelas sinter. Arang yang tergranulasi tidak

efektif menghilangkan pirogen.

2.6 Uji-Uji Pirogen

Untuk mendukung fakta bahwa larutan parenteral, perangkat serta untuk

administrasi mereka, bebas dari jumlah kontaminan berbahaya dari pyrogenic, Sampel

diambil dari setiap batch produksi dikenakan tes resmi untuk pirogen. Tes ini adalah tes

biologis menggunakan kelinci sebagai hewan uji, karena kelinci sangat sensitif terhadap

pirogen. (SDF, 1974 : 48)

Uji pirogen menggunakan kelinci sehat yang telah dijaga dalam keadaan

lingkunagan dan makanan yang tepat sebelum dilakukan uji. Temperature normal atau

temperature control diukur untuk tiap hewan yang akan digunakan. Temperatur ini

digunakan sebagai dasar penentuan setiap kenaikan temperature yang ditimbulakan

akibat dari penyuntikan larutan yang akan diuji. Kelinci-kelinci yang digunakan

temperaturnya tidak boleh berbeda lebih dari 1o, satu dengan yang lainnya, dan

temperature tubuh tersebut diperkirakan tidak akan meningkat. Ringkasan prosedur uji

tersebut adalah sebagai berikut : (Ansel, 1989: 419)

10

Jadikanlah alat suntik, jarum dan alat gelas bebas pirogen dengan cara memanaskan

pada temperature 250oC selama tidak kurang dari 30 menit atau dengan cara lain yang

sesuai. Hangatkan produk yang akan diuji sampai temperature 37oC ± 2oC. (Ansel,

1989: 419)

Suntikkan produk yang akan diuji pada vena telinga setiap kelinci sebanyak 10 ml

per kg berat badan, selesaikan tiap suntikan dalam waktu 10 menit dihitung dari awal

pemberian. Catat temperature pada 1,2, dan 3 jam sesudah penyuntikan. Bila masing-

masing kelinci tidak ada ynag temperaturnya meningkat 0,6oC atau lebih dari

temperature control masing-masing, dan jika hasil penjumlahan kenaikan temperature

dari 3 kelinci tidak lebih dari 1,4oC. Maka zat yang diuji memenuhi persyaratan bebas

pirogen. Jika kelinci-kelinci menunjukkan kenaikan temperature 0,6oC atau lebih atau

hasil penjumlahan kenaikan temperature 3 kelinci lebih dari 1,4oC, ulangi dengan

menggunakan 5 kelinci lain. Jika tidak lebih dari 3 dari 8 kelinci, masing-masing

menunjukkan kenaikan temperature 0,6oC atau lebih dan jumlah kenaikan temperature 8

kelinci tidak lebih dari 3,7oC, maka larutan memenuhi ppersyaratan bebas pirogen.

(Ansel. 1989: 419)

Baru-baru ini telah ditemui bahwa ekstrak sel darah ketam sepatu kuda (Limulus

polyphemus) mengandung system enzim dan protein yang menggumpal bila ada

liposakarida dalam jumlah kecil. Penemuan ini, merangsang perkembanga uji Limulus

amebocyte lysate (LAL) untuk mengetahui adanya pirogen dalam kerja penelitian dan

pengawasan selama proses berlangsung. Usulan-usulan untuk uji produk akhir obat

dengan LAL sedang dipertimbangkan oleh FDA. (Ansel, 1989: 419)

Uji LAL adalah metode spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen

yang signifikan pada kebanyakan pabrik farmasetikal dan peralatan medis. Test

didasarkan pada mekanisme primitive penggumpalan darah dari kepiting seperti Kuda

Amerika (Limuluspolyphemus). Berberapa enzim diletakkan pada sel darah amoeba

kepiting yang dipicuh oleh endotoksin perpanjangan koagulasi enzimatik yang di akhiri

dengan produksi di gel protenose. (Pharmaceutical Practice, 1990)

Test harus dihindarkan dari kontaminasi antimikroba sebelum dihindarkan, test ini

penting untuk memastikan bahwa tidak ada factor campuran dalam sediaan, peralatan

tidak menyerap endotoksin (seperti pada beberapa plastic) dan sensitifitas dari lisat

diketahui. (Pharmaceutical Practice, 1990)

Reagen test LAL disediakan dengan lyopilisasi sel di mubasit limulus. Volume

setara reagen LAL dan larutan test (0,1 mikron per masing-masing)dicampurkan dalam

11

gelas tube test elipirogenasi. Tube diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 jam, setelah

test wadah dibaca. Tube diambil dari incubator dan diubah. Bekuan oleh yang rusak

mengandung energy padatan merupakan factor dari test positif. Ketika digunakan pada

bagian ini bekuan gel uji awalnya, melewati test kegagalan dibatasi dan reagen sensitive

LAL. (Pharmaceutical Practice, 1990)

Test LAL tambahan test ini dapat digunakan dalam laboratorium farmaseutikal. Test

ini spesifik untuk endotoksin gram negative, dimana test pirogen kelinci sensitive untuk

semua pirogen endotoksin dan sumber lain disbanding gram negative. (Pharmaceutical

Practice, 1990).

1. Rabbit Pyrogen Test

Sejak awal mula dicantumkannya di USP pada tahun 1942, rabbit pyrogen test

secara esensial tetap tak berubah hingga sekarang. Oleh sebab itu, pada makalah ini

akan dibahas spesifikasi rabbit test yang tercantum pada edisi ke 22 dari USP dan

ulasan artikel yang ditulis oleh Peroneus pada tahun 1973. Mayoritas industri

parenteral bergantung pada LAL test untuk meyakinkan terbuatnya produk yang

bebas endotoksin. Untuk urusan biologis, beberapa negara seperti Kanada masih

membutuhkan pelaksanaan rabbit pyrogen test untuk produknya.

Uji pirogen dirancang untuk membatasi level yang masih dapat diterima dari

resiko reaksi demam yang dialami pasien saat administrasi sediaan dengan injeksi

dari produk. Tes ini melibatkan pengukuran kenaikan suhu dari kelinci setelah

pemberian injeksi intervena dari larutan uji dan dirancang untuk produk yang dapat

ditoleransi oleh kelinci uji pada dosis yang tidak melebihi 10ml per kg injeksi secara

intravena dalam periode waktu kurang dari 10 menit.Untuk produk yang

membutuhkan penyiapan dulu sebelumnya atau butuh administrasi dengan kondisi

khusus, ikuti aturan tambahan yang tercantum pada monografi masing-masing

sediaan, untuk senyawa antibiotik atau biologis, gunakan arahan yang tercantum

dalam federal regulation.

Pemilihan Hewan

Tes pirogen dipilih menggunakan hewan kelinci karena kelinci dan manusia

memiliki respon fisiologis yang identik. Greisman dan Herrick membuktikan

bahwa pada kelinci dan manusia memiliki respon yang mirip pada nanogram

per kilogram untuk jumlah pirogenik endotoksin.

12

Bedasarkan USP, kelinci yang digunakan memiliki ketentuan sebagai

berikut:

• Kelinci sehat dan dewasa.

• Kelinci ditempatkan secara individual pada area dengan suhu seragam

(20-23°C)

• Sebelum menggunakan kelinci untuk pertama kalinya untuk tes pirogen,

kondisikan kelinci dengan tes menurut prosedur kecuali injeksi tidak

lebih dari tujuh hari sebelum digunakan

• Jangan menggunakan kelinci untuk pengujian pirogen lebih dari sekali

setiap 48 jam, atau sebelum 2 minggu setelah kenaikan maksimum dari

suhu 0,6°C saat sedang diuji pirogen

Beberapa strain kelinci dapat digunakan sebagai hewan uji untuk uji

pirogen. Faktor kunci dalam memilih kelinci adalah peternak hewan,

ketahanan kelinci terhadap penyakit, ukuran yang cukup untuk kemudahan

penanganan, telinga yang besar, dan laju kenaikan berat badan. Kelinci

albino adalah kelinci yang paling banyak digunakan, terutama strain dari

Selandia Baru dan Belgia.

Sangat penting bahwa kelinci koloni diperlakukan dengan hati-hati.

Tempat kelinci disimpan harus dikontrol suhu, kelembaban, pencahayaan,

dan kontaminasi potensial udara, dan makanannya. Setiap kelinci baru harus

dikarantina dan dipantau selama 1 sampai 2 minggu setelah diterima untuk

melihat adanya penyakit yang muncul. Bila kelinci sakit maka kelinci tidak

dapat disertakan dalam uji pirogen.

Kelinci harus dilatih untuk menyesuaikan dan beradaptasi dengan

lingkungan baru mereka di laboratorium pengujian pirogen. Metode yang

diterapkan telah ditinjau oleh Personeus. Kelinci harus terbiasa berada dalam

kandang mereka dan ditangani selama penyisipan termokopel ke rektal

kelinci dan injeksi produk uji.

Suhu basal tubuh kelinci berkisar antara 38,9°C dan 39,8°C (102,0–

103,6°F). Suhu awal diketahui dengan mengukur suhu rektal selama

konduktansi dengan tes palsu (mengikuti seluruh prosedur uji pirogen

menggunakan larutan natrium klorida bebas pirogen sebagai sampel yang

diinjeksi). Variasi suhu akan muncul dengan rentang yang dapat diterima

±0,2 ° C. jika lebih dari rentang, kelinci tidak dapat disertakan dalam uji

13

pirogen karena akan mempengaruhi kenaikan suhu akibat adanya pirogen.

Kisaran suhu normal kelinci bisa berubah-ubah. Oleh karena itu dibutuhkan

pemulihan kembali suhu tubuh kelinci ke suhu normal sebelum diinjeksi

Kelinci dapat menjadi toleran terhadap aktivitas pirogenik setelah

suntikan berulang. Oleh karenanya kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu

tubuhnya 0,6°C atau lebih selama tes pirogen tidak dapat digunakan lagi

sebagai hewan uji pirogen selama minimal 2 minggu. Hal ini dilakukan untuk

menormalkan kembali kelinci setelah terkena efek pirogen.

Prosedur Rabbit Test (USP)

Berikut adalah hal-hal yang harus diperhatikan dalam uji pirogen

menggunakan kelinci berdasarkan USP:

a. Ruang

Uji dilakukan di area terpisah yang ditujukan untuk uji pirogen dan di

bawah kondisi lingkungan yang mirip dengan lingkungan dimana hewan

disimpan dan bebas dari gangguan yang membuat hewan stress. Fasilitas

yang digunakan memiliki dua ruangan dasar. Ruangan pertama digunakan

untuk kelinci uji antara, dan ruang yang lain digunakan untuk pengujian

pyrogen yang sebenarnya. Kelinci dalam restraining boxes dipindahkan

dengan gerobak (cart/wagon) dari ruang penahanan ke ruang uji. Kedua

ruangan harus memiliki pintu pemisah yang ditutup selama periode

pengujian pyrogen. Kondisi lingkungan di kedua ruangan harus identik.

b. Makanan dan minuman

Makanan ditahan terhadap kelinci selama periode pengujian. Akses air

diperbolehkan sepanjang waktu, tetapi dilarang selama pengujian.

c. Suhu

Jika pengukuran suhu rektal dimasukkan selama periode pengujian, maka

kelinci diberikan dalam kondisi cahaya yang pas agar kelinci dalam sikap

istirahat alami. Tidak lebih dari 30 menit sebelum injeksi dosis uji, suhu

kontrol dari masing-masing kelinci ditentukan. Suhu kontrol menjadi

dasar untuk menentukan kenaikan suhu yg dihasilkan dari injeksi larutan

uji. Kriteria kelinci yang digunakan adalah yg memiliki perbedaan suhu

kontrol tidak lebih dari 1° satu sama lain, dan tidak menggunakan kelinci

yg suhunya melebihi 39,8°.

14

d. Larutan uji

Kecuali dinyatakan lain dalam masing-masing monografi, injeksikan ke

dalam masing-masing vena telinga dari tiga ekor kelinci sebanyak 10ml

dari larutan uji per kilogram berat badan, setiap suntikan dalam waktu

10menit setelah pemberian dimulai.

e. Pengujian alat

Untuk pengujian pirogen pada perangkat atau alat injeksi, lakukan

pencucian dan pembilasan permukaan yang bersentuhan dengan

parenterally-administered material atau dengan tempat suntikan atau

jaringan internal pasien. Sebagai contoh, 40ml salin steril dan bebas

pirogen, TS pada laju alir sekitar 10ml per menit dilewatkan melalui

setiap tabung dari 10 alat infus. Pastikan bahwa semua larutan uji

terlindungi dari kontaminasi. Lakukan injeksi setelah pemanasan larutan

uji pada suhu 37 ±2° C. catat suhu pada 1 dan 3 jam, serta interval

10menit antara injeksi setelahnya.

f. Kandang

Kelinci berada dalam suatu fasilitas dengan suhu terkontrol, sebagai

contoh pada 70° ± 5°F. kandang yang digunakan haruslah kandang

individual yang dirancang untuk menjaga kebersihan. Kandang didesain

harus sesuai dengan standar yang ditetapkan oleh AAALAC.

g. Kebisingan

Kebisingan merupakan masalah besar dalam menjaga dan penggunaan

kelinci untuk pengujian pyrogen. Ruangan yang digunakan untuk

pengujian harus bebas kebisingan dan bebas dari aktivitas apapun.

Apapun yang menyebabkan kegembiraan pada kelinci (excitement)

berpotensi menyebabkan peningkatan suhu tubuh sebesar 0,2-1,0°C yang

tidak kembali normal dalam waktu 60-90 menit.

Uji pirogen menggunakan kelinci berlangsung selama 4-6 jam, oleh

karena itu kelinci uji harus berada dalam restraining box agar tidak bergerak

lincah, namun sebisa mungkin kelinci tetap nyaman. Kelinci ditahan di

bagian leher dan kepala untuk memungkinkan injeksi dosis uji ke dalam vena

telinga tanpa kelinci aktif menggerakkan kepalanya, namun kelinci tetap bisa

menggerakkan kaki dan punggungnya.

15

Gambar 7. Restraining boxes untuk kelinci.

Yang dibutuhkan untuk uji pirogen adalah:

a) Thermocouple

Thermocouple ini akan dimasukkan ke dalam rektum kelinci

dengan kedalaman tidak kurang dari 7,5 cm untuk mengukur suhu

pengujian. Setelah periode aklimatisasi (pengadaptasian) 30-45

menit, dicatat pembacaan pada suhu kontrol. Dalam 30 menit

perekaman suhu kontrol, dosis uji diadministrasikan ke kelinci.

Gambar 8. Pemasangan thermocouple pada restraining box kelinci.

b) Jarum suntik steril

16

Jarum berukuran 20-23 Gauge dibutuhkan untuk administrasi

dosis. Ukuran tepatnya jarum tergantung pada volume dosis. Pada

USP tertera bahwa dosisnya yaitu 10 ml/kg berat badan, kecuali

dinyatakan lain pada monografi obat. Misalnya, untuk injeksi

Phytonadione, dosis untuk tes pirogen adalah 2 ml/kg; sementara

untuk injeksi protamin sulfat, dosisnya hanya 0,5 ml/kg

(mengandung 10 mg/ml).

c) Larutan uji

Larutan uji harus dihangatkan pada suhu 37oC sebelum

diinjeksikan.

d) Alkohol 70%

Alkohol 70% diusapkan pada vena telinga kelinci sebelum obat

diinjeksikan, untuk membasmi kuman dan memperjelas vena.

Prosedur uji pirogen menggunakan kelinci adalah sebagai berikut:

1. Pilih dan timbang kelinci yang sehat, sudah dilatih, dan suhu tubuhnya

stabil.

2. Atur kelinci pada restraining box dan pasang thermocouple pada rektum

kelinci sesuai kondisi yang dibutuhkan.

3. Tahan telinga kelinci di antara jari-jari tangan kiri dan arahkan telinga ke

bawah, tekan dengan ibu jari.

4. Posisikan perlahan jarum dengan ujung miring ke atas dekat ujung vena

telinga.

5. Secara perlahan injeksikan sejumlah kecil sampel untuk mengetahui

apakah jarum benar-benar berada di dalam vena. Jika tidak, gelembung

akan terbentuk atau akan terasa tekanan balik. Tarik jarum sedikit dan

tusuk kembali di tempat yang sesuai.

6. Usahakan menekan plunger jarum suntik dengan stabil, dan selesaikan

injeksi dalam waktu 10 menit.

7. Tarik kembali jarum dan tekan tempat injeksi dengan ibu jari untuk

menghindari perdarahan dan timbul bekas luka.

17

Gambar 9. Injeksi pada Pembuluh Vena Telinga Kelinci

8. Catat suhu di bagian rektal saat 1, 2, dan 3 jam setelah injeksi.

9. Cek keadaan kelinci dan peralatan secara berkala. Kadang-kadang, kelinci

bisa saja mengalami perdarahan dubur, iritasi, atau merasa tidak nyaman di

bagian kaki atau punggung; atau kawat thermocouple dapat rusak atau

perekam panas elektronik dapat tidak berfungsi. Jika hal ini terjadi,

penanganan segera harus dilakukan.

Keterbatasan Uji Pirogen Kelinci USP

Pada USP, uji pirogen kelinci memiliki beberapa keterbatasan,dimana yang

ditetapkan kesempatan untuk uji Limulus Amebocyte Lysate sebagai

alternative yang mungkin untuk prosedur uji pirogen resmi.

Gangguan dari Uji Pirogen Kelinci

Banyak produk parenteral yang diberikan tidak dapat diuji untuk pirogen

dengan uji kelinci karena gangguan yang mereka buat pada respon kelinci

terhadap pirogen jika mereka muncul dalam produk tersebut. Setiap produk

memiliki efek samping menurunkan suhu badan, seperti prostaglandin dan

agen kemoterapi kanker, akan mengganggu respon kelinci. Beberapa produk

secara inheren toksik untuk kelinci dan harus diencerkan dengan konsentrasi

jauh di bawah dosis farmakologis efektif obat.

18

Tabel 3. Contoh Obat yang tidak Dapat diuji dengan Uji Pirogen USP

Meskipun sebagian besar keterbatasan dan kekacauan saat ini dari uji LAL,

tidak bisa dilupakan bahwa uji pirogen kelinci USP selama beberapa dekade

telah dianggap sebagai test yang cukup sensitif untuk pirogen dan telah

membantu untuk menghilangkan kontaminasi pirogenik dari obat-obat yang

telah dipasarkan, walaupun sebagian besar pabrik farmasetik dan peralatan

farmasi saat ini menggunakan uji LAL untuk tes pirogen.

2. Model In Vivo

Sebuah metode pengujian (model in vivo) yang menggunakan hewan hidup

sebagai modelnya tentunya memberikan sejumlah permasalahan yang diberikan oleh

system biologi. Variabilitas pada system biologi menimbulkan masalah besar. Tidak

ada dua kelinci yang akan memiliki suhu tubuh yang sama atau respon yang identic

pada sampel pirogen yang sama. Kelinci sangat sensitif dan rentan terhadap

lingkungannya. Hal Ini diartikan menjadi sebuah proposisi mahal dalam hal fasilitas,

kontrol lingkungan, dan penyesuaian hewan.

Pengujian pirogen kelinci tidak hanya mahal, tetapi juga melelahkan. Beberapa

jam dihabiskan dalam melakukan uji pirogen, termasuk sejumlah besar perlakuan

awal dalam penyiapan hewan. Kelinci harus diberi makan dan minum dengan benar,

kandang dibersihkan untuk mencegah penyakit, dan waktu yang dihabiskan dalam

penyesuaian hewan untuk beradaptasi dengan kondisi fasilitas pengujian pirogen dan

uji itu sendiri.

19

3. LAL (Limulus Amebocyte Lysate)

Kelebihan :

1) Penanganan praktis

2) Pelaksanaan dan persiapan cepat

3) Personil dan ruangan lebih kecil

4) Sensitifitas terhadap endotoksin mencapai 0,01 — 0,04 ng/ml atau lebih kecil

Kelemahan :

1) LAL mendeteksi endotoksin dan tidak mampu mendeteksi pirogen eksogen

lain

2) LAL tidak dapat digunakan untuk memeriksa beberapa sediaan secara

langsung, seperti Sediaan yang tidak dapat dinetralkan menjadi pH 6—7, dan

Sediaan yang mengandung zat penghambat pembentukan gel ( Ca2+,

tetrasiklin, kloramfenikol, dll)

20

BAB III

PEMBAHASAN

Sumber-sumber pirogen menurut beberapa ahli :

1. Menurut Scoville’s : 196 , piroen adalah air yang terkontamnasi oleh bakteri yang

tahan udara dan tumbuh dan menghasilkan endotoksin . zat seperti dextrose dan nacl

dapat mengandung zat pirogen.

2. RPS 18th : 1550

Sumber potensial terbesar dari berbagai kontaminasi adalah air yang digunakan dalam

proses. Kondisi penyimpanan harus tidak dapat dimasuki oleh mikroorganisme dan

pertumbuhannya dicegah. Sumber potensial yang lain adalah perlengkapan. Bahan-

bahan pirogen melekat kuat pada gelas dan permukaan lain. Residu larutan dalam

peralatan yang digunakan sering menjadi media kultur bakteri dengan kontaminasi

pirogenik.

3. SDF : 46

Kebanyakan sumber utama dari pirogen adalah air yang digunakan untuk membuat

larutan. Walaupun air itu sendiri medium kultur yang buruk, kontaminasi dapat terjadi

melalui mikroorganisme yang membuat udara dan debu. Jika destilasi digunakan

untuk menyiapkan air untuk injeksi, masih perlu dirancang dan digunakan dengan

lebih baik. Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap.

Pencegahan Terhadap Pirogen

a. Scoville’s : 196-197

merancang dan pengoperasian penyulingan dapat mencegah zat pirogen masuk

kedalam sediaan steril , dicocokkan untuk mencegah tetesan dari air mendidih

kedalam destilat. Destilat harus dikumpulkan dalam wadah yang telah dibilas dengan

air destilat segar. Perlakuan untuk menghilagkan tetesan-tetesan air yang terakumulasi

yang dapat mengandung pirogen atau untuk menghilangkan bahan pirogenik yang

dapat mengering dan melekat pada bagian dalam permukaan wadah.Usaha

perlindungan menghindarkan kontaminasi destilat oleh bakteri tahan udara harus

dilatih. Air destilasi harus terlindung selama penggumpalan dan harus digunakan

sesegera mungkin setelah didestilasi untuk mencegah perkembangbiakan bakteri yang

21

mungkin ada. Larutan seharusnya disaring, dikemas, disegel, dan disterilkan dengan

secepat mungkin.

b. Scoville’s : 194

Jauh lebih baik mencegah pembentukan pirogen daripada mengusahakan pemindahan

atau penghancurannya. Namun, pirogen dapat dihilangkan dengan adsorbsi pada

penyaring asbestos aktif atau pada arang aktif. Kedua metode ini digunakan,

khususnya bila diperkirakan bahwa bahan kimia terkontaminasi dengan pirogen.

Metode penyaring asbes aktif terdiri dari sediaan larutan yang dilewatkan melalui

penyaring asbes kompresi dari serum seitz no 3 pirogen diabsorbsi pada permukaan

dari asbes dan oleh karena itu pirogen dihilangkan dari larutan. Juga telah disebutkan

bahwa pirogen dapat dihilangkan dengan filtrasi melewati alat penyaring yang lain.

Arang aktif juga menghilangkan pirogen dari larutan dengan absorbsi. Larutan

dikocok dengan 0,1 % arang aktif serbuk halus selama 5-10 menit. Arang dibiarkan

mengendap dan cairan supernatan didekantasiatau arang dapat dihilangkan dengan

penyaringan kertas saring yang keras karena serbuk halus arang sulit dihilangkan

dengan kertas saring. Hudson menyarankan sistem penyaringan menggunakan

kombinasi pasir murni, kertas saring dan penyaring gelas sinter. Arang yang

tergranulasi tidak efektif menghilangkan pirogen.

Macam macam tes pirogen

a. Rabbit Test

• Merupakan injeksi intravena ke tubuh kelinci di bawah kondisi tertentu ,

mencatat kenaikan suhu badan kelinci sebagai respon terhadap substansi

pirogenik dalam sediaan yang disuntikkan ke tubuh kelinci. Dipantau dan dicatat

temperatur 3 kelinci dalam jangka waktu tertentu

• Bahan dan alat yang dibutuhkan

1) Kelinci yang sudah dewasa dan sehat, serta memiliki spesies , umur, berat

badan dan jenis kelamin yang sama.

2) Syringe bebas pirogen

3) Gelas bebas pirogen

4) Thermometer yang sensitive terhadap perubahan suhu

• Prosedur

1) Kelinci dipuasakan 30 menit sebelum di injeksi

22

2) Tentukan suhu control kelinci masing masing berbeda , tidak boleh lebih

dari 1oC

3) Suntikkan 10 mL larutan uji / kg BB, ke pembuluh vena kelinci yang ada di

telinga

4) Catat Suhu Tubuh kelinci pada interval waktu 30 menit, 1 jam, dan 3 jam

setelah pemberian larutan uji

b. Model In Vivo

Sebuah metode pengujian (model in vivo) yang menggunakan hewan hidup

sebagai modelnya tentunya memberikan sejumlah permasalahan yang diberikan oleh

system biologi. Variabilitas pada system biologi menimbulkan masalah besar. Tidak

ada dua kelinci yang akan memiliki suhu tubuh yang sama atau respon yang identic

pada sampel pirogen yang sama. Kelinci sangat sensitif dan rentan terhadap

lingkungannya. Hal Ini diartikan menjadi sebuah proposisi mahal dalam hal fasilitas,

kontrol lingkungan, dan penyesuaian hewan.

Pengujian pirogen kelinci tidak hanya mahal, tetapi juga melelahkan. Beberapa

jam dihabiskan dalam melakukan uji pirogen, termasuk sejumlah besar perlakuan

awal dalam penyiapan hewan. Kelinci harus diberi makan dan minum dengan benar,

kandang dibersihkan untuk mencegah penyakit, dan waktu yang dihabiskan dalam

penyesuaian hewan untuk beradaptasi dengan kondisi fasilitas pengujian pirogen dan

uji itu sendiri.

c. LAL Test

Kegunaan untuk mengetahui keberadaan endotoksin

• Bahan dan alat yang dibutuhkan

1. LAL reagen water

2. Stop Reagen

3. NaOH

4. asam hidroklorat

5. tabung endotoksin

6. pipet ukur otomatis

7. stopwatch

8. vortex

9. spektrofotometer

10. microplate reader

23

• Cara Pengujian

d. Test Tube Method

1) Sampel diletakan keddalam tube bebas endotoksin (37°C)

2) Pada menit ke 0 tambahkan 50ɥl LALR

3) Pada menit ke 10 tambahkan 100ɥl reaen kromogenik

4) Pada menit ke 16 tambahkan 100ɥlstop reagen

5) Baca absrobansi pada 405-410 nm

e. Microplate Methode

1) Letakan sampel kedalam micoplate (37°C)

2) Pada menit ke 0 tambahkan 50ɥl LALR

3) Pada menit ke 10 tambahkan 100ɥl reaen kromogenik

4) Pada menit ke 16 tambahkan 100ɥlstop reagen

5) Baca absrobansi pada 405-410 nm

24

BAB IV

PENUTUP

Kesimpulan

a. Pirogen adalah senyawa yang jika masuk ke dalam aliran darah akan mempengaruhi suhu

tubuh dan biasanya akan menimbulkan demam (Sudjadi, 2008).

b. Depirogenasi

Depirogenasi bahan, alat dan wadah pada produksi sediaan farmasi dapat dilakukan

dengan dua cara, yaitu inaktivasi (destruksi) atau removal.

c. Sumber sumber pirogen

1) alat-alat produksi,

2) pelarut yang digunakan

3) raw material

4) kemasan yang digunakan

d. Test pirogen

1) Rabbit test

2) LAL

3) In Vitro Pyrogen Test

25

DAFTAR PUSTAKA

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta : Penerbit UI

Press.

Aulton, Michael. 1990.Pharmaceutical Practice. London : Oritic Livingston.

Ganong, W.F. 2002. Pengaturan Sentral Fungsi Visera. Dalam :Widjajakusumah

M.D., Editor. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 20. Jakarta: EGC.

Gennaro,A.R,et al.1990. Remingons Pharmaceutical Science 18th Edition.

Pensylvania:Marck publishing company.

Nelwan, R.H.H., 2006. Demam: Tipe dan Pendekatan. Dalam: Sudoyo, A.W.,

Setiyohadi, B., Alwi, I., Simadibrata M., dan Setiati, S., Editor. Buku Ajar Ilmu

Penyakit Dalam. Edisi Keempat. Jilid Ketiga. Jakarta: Pusat Penerbit Departemen

Ilmu Penyakit Dalam.

Sudjadi.2008.Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: penerbit kanisius(anggota IKAPI).

Suwandi. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt Lysate.

Cermin Dunia Kedokteran no.52.

Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. London : Published in

Great Britain by Henry Kimpton Publishers.

Walter F., PhD. Boron. 2003. Medical Physiology: A Cellular And Molecular

Approaoch. Elsevier/Saunders. p. 1300. ISBN 1-4160-2328-3.

26