Prof. (R).Dr. IKA MARISKA SOEDHARMA

METABOLIT SEKUNDER

1. Industri farmasi : obat, pewarnaMis : aspirin dan salicylate

1. Bumbu penyedap makanan2. Kosmetik : minyak wangi3 A i ik b3. Anti mikroba4. Bioinsektisida, biofungisida5. Obat tradisional

Metabolit sekunder - End product (Caspek, 1921) - Natural product (Croteau et al., 2000)

FUNGSI DALAM TANAMAN

1. Antraktan untuk serangga/hewan lainnya : polinasi2. Melindungi dari stress lingkungan3. Mekanisme pertahanan dari serangan hama, penyakit,

herbivora,molusca & vertebrata (phytoalexins)

METABOLIT SEKUNDER

4. Zat pengatur tumbuh5. Meningkatkan kemampuan tanaman dalam bersaing

dengan tanaman lain (alelopati) mis : monoterpenoid6. Penyimpan & sistim transport nitrogen7. Proteksi terhadap ultra violet (Wink, 1987)

Bourgard et al., (2001) : peran penting pada tanamanuntuk adaptasi terhadap lingkungan

METABOLIT SEKUNDER(Robins, 1994 dan Mann, 1995)

• Tidak disintesa secara terusmenerus tetapi hanya padatingkat pertumbuhan danperkembangan tertentu

atau

• Selama periode stress biotikkarena kurang nutrisi ataufaktor abiotik

1. Disimpan dalam biji dan organ penyimpan

2. Mempunyai peran penting untukmetabolisme primer (fotosintesa + respirasi) (terlibat dalam prosesfisiologis utama dengan mekanismeyang sudah diketahui pasti)

3 Volume besar

Essential&

selalu tersedia3. Volume besar

4. Nilai rendah kecuali mesoinositol, ß‐caroten karena untuk ektrasi, isolasi dan pemurnian sulit

5. Untuk bahan mentah makanan, produk nabati, asam lemak (sabun, deterjen), dan karbohidrat.

6. Tersedia banyak di pasar

(terlibat dalamproses fisiologis

utama)

1. Disintesa pada tingkat pertumbuhan tertentu atau adanyastress

2. Disintesa pada sel tertentu dan pada group taksonomitertentu

3. Tidak berperan penting dalam metabolisma primer tapiuntuk kelangsungan hidup dihabitatnya (peran ekologi)untuk kelangsungan hidup dihabitatnya (peran ekologi)

4. Konsentrasi kecil dan persediaan terbatas

5. Nilai ekonomi tinggi

6. Umumnya struktur lebih kompleks sulit disintesis

7. Sulit ditemukan dipasar baru ±15% dari spesiestanaman yang sudah diisolasi

FOTOSINTESA

Penangkapan dan pengumpulan cahaya : klorofil

ATP + NADPH

2. GELAP : asimilasi O2

Reduksi Pentosa Fosfat (siklus Calvin)  RUBP

CO2   Fruktosa‐6 P atau Piruvat Malat (C4)

k P UDP l k f k 6 P

FOTOSINTESA …

a. Sukrosa P UDP glukosa + fruktosa 6 PSukrosa P sukrosa + P

b. NDP-D-9-glukosa+Fruktosa Sukrosa+ NDP

Sukrosa D‐glukosa + D‐fruktosa

C3

CO2 – Rubisco

RUBP

C4 (1966)CO2 – PEPC

Anatomi KRAN 2

(mesofil + bundle sheet)

Malat, aspartat, oxaloacetat

FOTOSINTESA

3 PGA

Calvin

Hexosafosfat

p

(mesofil)

3 PGA

Hexosafosfat

(Bundle Sheet)

KARBOHIDRAT FOTOSINTESAPenyimpanan : pati + fruktanSukrosa : transport glukosa, fruktosa- Monosakarida :

glukosa, manosa, arabinosa, xylosa, fruktosa, rhamnosa, galaksana

- Oligosakarida : disusun dari 2 – 5 sakarida (glukosa),

METABOLISME PRIMER :Sukrosa pada tebu bitsukrosa, trehalose, raffinosa, starchyoset

- Polisakarida:Selulosa, amilosa, amilopektin

(BM tinggi) Poligalakturonase, glukomanan, xylans

glikosa, kitin

‐ Sukrosa pada tebu, bit

‐ 3 enzim yang berperan(SPS, SS, Invertase)

JalurMalonat asetat

Karbohidrat

Glikolisis

Asam Fosfoenol Piruvat

Asam Piruvat

Asetil co‐A

CO2 + H2O

Jalur Pentosa FosfatAsam Sikhimat

JalurAsam Shikimat

Senyawa Aromatik

Asam Sitrat(siklus asam)

AsamAmino

Erythrosin‐4‐P

Alkaloid

Asam SinamatJalurMevalonat asetat

Malonit Co‐A

SteroidKarotenoid

Asam Lemak

Poliasetilen

Poliketida

Senyawa Aromatik

Golongan flavonoid

Gambar 1. Jalur biosintesa pada tanaman

Terpenoid

UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI DANAKUMULASI METABOLIT SEKUNDER

Seleksi gen yang berperan atau pohon induk

Seleksi sel

Manipulasi lingkungan

Mutasi

Rekayasa genetik

JALUR METABOLIT SEKUNDER(diluar biosintesa sukrosa + protein)

1. Malonat asetat

2. Mevalonat asetat

3. Asam shikimat

(1885 tanaman Illicum religliosum)

CO2 + H2O    Klorofil sukrosa Pentosa fosfat glukosa 6‐fosfat

fruktosa 6‐fosfat

PREKUSOR METABOLIT SEKUNDER

1. Eritrosa‐4‐fosfat

2. PEP

Prekusor dan produk primer dari glukosa-6-fosfat

Senyawa Aromatikberasal dari

Asam Korismik T i t f ti i PAL ( d k khi

Jalur asam shikimat

Asam Korismik(prekusor)

Triptofan, tirosin, PAL (produk akhirasam shikimat)

‐ Auksin a.l. 2,4-D : Trigger sintesis metabolit sekunder seperti fitoaleksinFitoaleksin : anti mikroba (Deverall, 1982)

- PAL Cinnamic acid-Tirosin p = coumaric acid

‐ Tirosin sumber cincin utama Quinon

Hidroksi Benzoat (senyawa antara)

‐ PAL : fenol, lignin, fitoaleksin (dopamin, asam klorogenik, asam shikimik)

Respirasi, sintesa IAA, fisik

Ca, B (1,3), glukanase

Fitoaleksin(senyawa anti mikroba yang disintesa dan diakumulasi pada tanaman sebagairespon terhadap infeksi mikroorganisma)

PAL = enzim yang berperan dalam produksi molekul dasar komponen organik yang berhubungan dengan ketahanan terhadap penyakit

As. Co. A : 

1. Titik awal elaborasi metabolit sekunder

2. Kunci perombakan hidrat arang, lemak, protein

Asam palmitat (metabolit primer  derivatif metabolitsekunder dari jalur asam malonat (selain asam lainnya)

A l t l t k bi i t t idAsam mevalonat : senyawa awal untuk biosintesa terpenoid& steroid

PAL  asam sinamat asam ß‐coumarat

TIROSIN

(umumnya komponen aromatik)

• Pada tanaman tinggi dan jamur

• Asetil Co.A Malonyl Co.A poliketida

• Orsellinic acid (>pada jamur), derivatif phloroglucinol

Jalur Acetat Mevalonat1. Essential oil2. Squalent3. Monoterpenoid4. Mentol5. Korosinoid6. Streoid7. Terpenoid8. Sapogenin9. Geraniol10 ABA GA3

Jalur Asam Shikimat1. Asam Sinamat Fenol2. Asam benzoik3. Lignin4. Koumarin5. Tanin6. Asam amino benzoik7. Quinon

Benzenoid berasal dari 2 jalur10. ABA, GA3 1. Asam shikimat

2. Acetat mevalonat

• Terpenoid : isoprenoid (5 unit carbon),  mis: peppermitM. piperita, spermintM. psicata

• Monoterpenoid (C10) : volatile essence (herbs + spices)

PiruvatGliseraldehyde IPP (prekussor)  terpenoid (>25.000)

JALUR ASETAT MALONAT

1. Asam lemakLaurat, Miristat, Palmitat, Stearat,Oleat,Linoleat dan Linolenik

2. Poliasetilen3. Gliserid4. Fosfolipid5. Glikolipid

Pada berbagai tanaman :Jarak pagar, kelapa sawit, kelapa, jagung, kacang tanah, zaitun, bungamatahari, kedelai, wijen, kapas, coklat, alpukat

: (kultur kalus, sel & akar rambut = KAT)

1. Bonner Aireguin (1950): Biosintesa karet dari kalusGuayule

2. Tulecke + Nickell (1956)

KULTUR JARINGAN METABOLIT SEKUNDER YANG BANYAK DIKENAL

KOMERSIAL (1983)

1. Mitsui Petrochemical IND: skala industri

• Shikonin dari kultur sel Lithospermumerithorhizon (anti bakteri, zat pewarna, kosmetik untuk luka dll) Kultur akar

Lithospermum erithorhizonkosmetik, untuk luka dll). Kultur akarrambut bioreaktor 20.000 ml

• Sikonin dari alam dari akar pada saattanaman umur 5 – 7 tahun (1‐2 %) melaluikultur jaringan = 12 – 15%

2…

2. Ginsenoida dari akar ginsengSaponin + Ginsenoida. Nitro Denko Comp. (1991)  Bioreaktor 20.000 l (kultur akar)

3. Vinblastine + Vincristine dari Catharanthus roseusAlkaloid untuk leukimia

4. Ajmalicine dari Rauvolvia sp anti hipertensi Rauvolvia sp

Clove

Cengkeh

HASILKELTI BIOLOGI SEL DAN JARINGAN

Artemisia

1. Alkaloid – Rauvolvia serpentina2. Atropine – Hyoscymus niger3. Caffeine – Coffea arabica4. Cocaine – Erythorxylon coca5. Nikotin – Nicotiana tabacum6. Quinine – Cinchona officinalis7. Scopolamine – N. niger8. Vinblastine – Catharanthus roseus

•Alkaloid – 12.000 senyawa organik

SELEKSI SEL

1. Visual terutama pigmen

2. Analisis kimia : RIA

3. Ukuran/agregat sel

1. Pertumbuhan sel dengan biosintesa sejalan(pada seluruh pertumbuhan), mis: Nikotin dari tembakauAnthosianin dari kultur sel Haplopapus gracilis

Morinda sp

Nitotiana tabacum

Anthraquinon dariMorinda sp

2. Pembentukan pada pertumbuhan sel meningkatMis : Shikonin dari kultur kalus Lithospermum sp

3...

Haplopapus gracilis

Lithospermum erithorhizon

3. Kurva produksi diphasic danproduksi tertinggal(pertumbuhan monoton) dibelakang kurva pertumbuhan

mis : 

Diosgenin dari kultur selDioscorea deltiodea

4. a. Diferensiasi morfologimis :

Pada kultur kalus Atropa belladona(alkaloid) terbentuk saat kalusmembentuk akar

Atropa belladona

4. b. Diferensiasi morfologiDatura innoxia alkaloid bagiandari akar (hyoscyamine, scopolamine) Datura innoxia

Linsdsey + Yeomann (1983) : Diferensiasi ada 2

Linsdsey + Yeomann (1983) : Diferensiasi ada 2

1. Terjadi perubahan bentuk + struktur + fungsi dariindividu sel sitodiferensiasi

2. Perubahan dalam organisasi selPembentukan struktur morfologi yang dapat dikenal

BERBAGAI FAKTORPRODUKSI METABOLIT SEKUNDER

Formulasi media

Faktor Fisik

G ti lGenotipa sel

• Logam berat, elicitor, sinar UV

Stress

Precusor

Elicitor :Toksin,filtrat dari mikroba

1. Frekuensi pemberian2. Fase pertumbuhan sel3. Periode pemberian

Elicitor glucan a.l. phenyl propanoid- CHS kunci biosintesa isoplavonoid- CHI kunci biosintesa phenylpropanoid

• 1) Kultur harus mempunyai enzim untukbiotransformasi

• 2) Hasil akhir harus dibentuk lebih cepatdibanding metabolit lain

) l h d l l d k• 3) Sel harus dapat mentolelir adanya prekusor

Murah, cepat + mudah membentuk senyawa akhir(dihindarkan perkusor untuk metabolit primer)

(Steele & Constabel, 1974)

Ketersediaan enzim (tidak ada/terbatas

Hambatan dalam sistem transportasi

(Bohm, 1981)

prekusor ke sel target

Keterbatasan prekusor

Modifikasi dari prekusor menjadi produk lebih berhargayang digunakan untuk industri farmasi, kimia dengan

menggunakan biokatalistik (Pros, 1990)

1. Sudah dikenal (solasodin, diosgenin dll.)

2. Senyawa baru (tidak ada dalam tanaman)

3. Biotransformasi (tidak ada/ada dalam tanaman)

• Mulai 1980 : Kultur akar dengan A. rhizogenes

1. Pertumbuhan lebih cepat2. Produksi metabolit sekunder lebih

stabil3. Lebih mudah untuk memanipulasi4. Kemungkinan dapat berfotosintesa

baik untuk produksi metabolitsekunder

5. Tanpa zat pengatur tumbuhk

CIRI KAT :Derajat percabangan lateraltinggiK t b h i

KEUNTUNGAN DENGAN KAT

eksogen6. Resistensi tinggi terhadap

kontaminasi7. Derajat percabangan tinggi

Kurva tumbuh menyerupaikultur suspensiTidak terpengaruhgeotropismeStabil dalam produksimetabolit sekunder

Hamill et al., 1986 + Tappi, 1996

• Agrobaterium (plasmid T‐DNA + Vir.)

‐ Untuk induksi Tumor Ti 

‐ Untuk induksi akar Ri : pRi = T‐DNA + vir region

TL d TR

Kultur AkarRambut …

T‐DNA = TL dan TR(Hunter, 1990)

• Vir (35 kb, 60 peran) : efisiensi transformasi

• TL + TR TL untuk determinasi fenotipa akar & memelihara akar rambut

TL + TR = Inisiasi akar vigorous

Triptophan monooksigenaseIndol acetamide hidrolase

Isopenteniladenosin

• TL : iaa M (tms 1) iaa H (tms 2) IAA

• TR : ip t : Isopentenil pirofosfatAdenosin monofosfat SITOKININ

• Strain yang banyak dipakai : pRi A4, pri Hri, pri 1855, pri 8196, LBA 9457, AT (c15834 dan 07.2001)

Strategi Produksi Metabolit Sekunder dengan KAT

Tanaman

Seleksi

KAT(Eksplan)

RegenerasiVarietas/regeneran

• KAT• Produksi• Pertumbuhan

Skala besar(Bioreaktor)

• Regeneran• Produksi• PertumbuhanMikropropagasi

(Lapang)

Regenerasi

Produksi metabolitSekunder

untuk Produksi Metabolit Sekunder(PERBAIKAN)

1. Variasi seleksiKAT kalus (radiasi) variasi suspensi sel

sel tunggal seleksi KAT (lini baru)

T f i2. Transformasi3. Biotransformasi (+prekusor)4. Elisitasi : biotik (Co + Cad) + abiotik5. Regeneran : pRi6. Pohon induk : produksi tinggi

TANTANGANPRODUKSI METABOLIT SEKUNDER

(Whitaker & Hashimoto, 1985)

1. Mendapatkan varian + sistim kultur untuk produksitinggi

2 Mengembangkan bioreaktor yang tepat agar2. Mengembangkan bioreaktor yang tepat agarkemampuan genetis + biokimia sel dapatdieksploitasi

1. Warna bunga : modifikasi warna

a. Flavonoid, betalain, carotinoid

antisensing gen chalcone (petunia, ros, gerbera,   

ti k i t)carnation, krisant)

b. Golden rice : 

Precusor geranyl diP ß‐carotene phytoene synthase

2…

2. Sintesa lignin 

• Industri kertas : dipisahkan lignin dari selulosa (selulosalebih berharga

• Lignin  untuk memudahkan ekstraksi

3. Industri Farmasi

Terutama dari golongan alkaloidg g

Mis : Attropa belladona (Yun et al., 1992)

Gen H6H dari Hyoscyamus niger Hyoscyamine

scopolamine

Penguasaan : Biopathway

• Tanaman menghasilkan senyawa organik (tidakberhubungan langsung dengan proses produksimetabolit primer) untuk pertumbuhan & perkembangan

metabolit sekunder.• Fungsi ekologi (ketahanan terhadap faktor biotuk +

penarik polinator dan menyebarkan biji) + untukberinteraksi dengan lingkungan (keuntungankompetitif) dengan species lain.

• “Natural product” (3 komponen besar) : terpenoid & steroid, alkaloid dan phenolic (phennyl propanoids).

• Terpenoid (5 karbon) : dari jalur mevalonat + asetatatau jalur piruvat (gliseroldehid 3-P). Umumnya toksikh bi idherbisida.

• Alkaloid dari asam amino. Proteksi tanaman dariherbivora + senyawa berguna untuk industri farmasi.

• Phenol berasal dari phenyl 1 propanoid, phenyl.

• Fenol dari asam shikimat :

mis : 

a. Tanin, flavonoid, lignin + fenolsederhana proteksi terhadapherbivora + patogen

PENDEKATANBIOTEKNOLOGIherbivora + patogen

b. Flavomoid: pigmen, alelopati(mempengaruhi pertumbuhantanaman lain)

BIOTEKNOLOGI

PENDEKATANBIOTEKNOLOGI

Konsentrasi metabolismeMis : insektisida alami

Hasil untuk industri farmasi, Parfum, kosmetik, insektisida

yang bernilai ekonomi tinggiSeleksi mutan pada sisten sistem regulatorSeleksi mutan pada sisten sistem regulatorMencegah inhibitor untuk produk targetMeningkatkan aktifitas enzimModifikasi lintasan yang adaManipulasi gen regulatorMengurangi reaksi/lintasan yang sudah ada