VALIDASI METODE PARAMETER LOD DAN LOQ

PADA TABLETPARASETAMOL MENGGUNAKAN

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

 

I.                   Tujuan

 Praktikan dapat mengetahui dan melakukan validasi metode parameter batas deteksi (LOD)

dan batas kuantifikasi (LOQ) terhadap tablet parasetamol menggunakan spektrofotometri UV-

Vis.

II.                Prinsip

1.      Akurasi

2.      Presisisi

3.      Linieritas

4.      Spesifisitas

5.      LOD dan LOQ

III.             Teori Dasar

            Validasi   metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian

terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis

bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai

untuk peruntukannya (Gandjar, 2007).

            Klasifikasi Metode Analisis

Menurut USP 30-NF25 (2007), metode analisis diklasifikasikan dalam 3 kategori,

yaitu:

a.      Kategori I :Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau bahan aktif lainnya seperti pengawet

b.      Kategori II :

Metode analisis yang digunakan untuk penetapan cemaran dalam bahan baku obat atau hasil degradasinya dalam sediaan obat jadi

c.       Kategori III :Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kinerja dan kualitas sediaan obat jadi, seperti uji disolusi dan uji pelepasan obat (Gandjar, 2007).

Parameter Validasi Metode Analisis

Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian,

yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji

kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain

itu, terdapat 8 parameter validasi metode

analisis yaitu spesifisitas, presisi/ketelitian, akurasi/ketepatan, linearitas, kisaran, limit

deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji

tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004).

a.      AkurasiAds by Webexp%20EnhancedAd Options

Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar

analit yang sebenarnya. Accuracy   dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit

yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di

dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi

hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan

peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan

suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur  (Gandjar, 2007).

 Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo

recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Riyadi,

2009). Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam

keseluruhan tahapan analisis. Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan

ke dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar

standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara

membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan

konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian

dianalisis dengan metode yang akan divalidasi (Riyadi, 2009).

Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit

yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi.

Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya. Pada metode penambahan

baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika

penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan

menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dll. Recovery

dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya

persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5% (Riyadi, 2009).

b.      PresisiAds by Webexp%20EnhancedAd Options

Precision   adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang

homogen. Presicion diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif

(koefisien variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau

reproducibility (ketertiruan). Repeatability adalah keseksamaan metode jika dilakukan

berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang

pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap

sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran

keseksamaan pada kondisi yang normal (Riyadi, 2009).

Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang

berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda

menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis

dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang

sama. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD)

atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel

tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi

laboratorium (Riyadi, 2009).

c.       Linieritas dan Rentang

Linearitas   menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil

pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi

tertentu. Sedangkan rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang

sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat

diterima. Rentang dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set

larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (Ermer & Miller 2005).Ads by Webexp%20EnhancedAd Options

Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat

terkecil, yaitu y = a + bx. Persamaan ini akan menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien

korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Penetapan

linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang

memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0.9970 (ICH, 1995).  Linearitas juga dapat

diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller 2005).

d.      Selektivitas (Spesifisitas)Selektivitas   atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang

hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti kromatografi, hhanalisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas (Riyadi, 2009).

e.      Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi

            Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi adalah

jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat

ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif

untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk

menentukan adanya pengotor atau degradasi produk. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung

dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang

diperoleh  (ICH, 1995).

Asetaminofen

Ads by Webexp%20EnhancedAd Options

Parasetamol atau asetaminofen adalah turunan para-aminophenol memiliki

khasiat sebagai analgesik, antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah. Parasetamol

merupakan analgesik non-opioid sering dicoba pertama untuk pengobatan gejala berbagai

tipe sakit kepala termasuk migrain dan sakit kepala tipe tensi.

Pemerian          : serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.

Berat jenis        : 1.263 g/cm3

Titik lebur        : 169°C (336°F)

Kelarutan         : dalam air 1,4 g/100 mL atau 14 mg/mL (20°C); larut

                           dalam air medidih, dan dalam NaOH 1 N; mudah larut

                           dalam etanol, methanol, tidak larut dalam kloroform,

               praktis tidak larut dalam eter, pentana dan benzene

Nama Kimia :  N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau

                           4’- hidroksiasetanilida

Rumus Empiris: C8H9NO2

Berat Molekul :  151,16

Jarak lebur       :  antara 168-172  (Depkes RI, 1995).

            Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257 nm (A11=715a) sedangkan pada inframerah memperlihatkan puncak pada 1506, 1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm−1. (Moffat dkk, 2005).

Spektrofotometri UV-VisibleAds by Webexp%20EnhancedAd Options

            Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel. Spektrofotometer UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion anorganik atau kompleks dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm. Sebagai sumber cahaya biasanya di gunakan lampu

hydrogen atau deuterium untuk pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran pada cahaya tampak (Dachriyanus, 2004).

IV.              Alat dan Bahan

Alat dan gambar alat

No Alat Gambar Alat

1 Beaker glass

2 Bulb pipet

3 Labu Ukur

4 Mortir dan stamper

5 Neraca Analitik

6 Spektrofotometer UV

7 Volume pipet

Bahan

1.      Etanol 95%

2.      Tablet parasetamol

V.                 Prosedur

Pembuatan kurva baku

            Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke

dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga tanda batas.

Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat pengenceran hingga

diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-

masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang

gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Preparasi sampel dan pembuatan larutan stock parasetamol

            Tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus menggunakan mortir dan stamper hingga

halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu

dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok

hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan

tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya

diambil.

Pengenceran sampel parasetamol

1.      Larutan 100 ppm

Dipipet 2 ml larutan parasetamol 1000 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20

ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 100 ppm.

Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

2.      Uji LOD ,8415 ppm

Dipipet 0,17 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20

ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 0,8415 ppm.

Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

3.      Uji LOQ  2,8052 ppm

Dipipet 0,56 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20

ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 2,8052 ppm.

Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

VI.              Data Pengamatan dan Perhitungan

DATA PENGAMATAN AKURASI TABLET PARACETAMOL

        Pembuatan larutan tablet parasetamol

  Massa tablet rata- rata = 545,24 mg

  Dibuat konsentrasi larutan stok sampel

=  500 mg/ 50 ml

= 10000 ppm

  Diencerkan = 400 ppm

  Dibuat 3 variasi konsentrasi :

1.      12 ppm

V x 400 ppm = 20 x 12 ppm

V = 0.6 ml

2.      10 ppm

V x 400 ppm = 20 x 10 ppm

V = 0.5 ml

3.      8 ppm

V x 400 ppm = 20 x 8 ppm

V = 0.4 ml

        Nilai absorbansi

Konsentrasi

Absorbansi

I II III Rata- rata

8 ppm 0.5256 0.5256 0.5254 0.5255

10 ppm 0.6888 0.6885 0.6888 0.6887

12 ppm 0.8231 0.8230 0.8241 0.8234

Persamaan garis larutan baku : y = 0.07012x – 0.091472

        Perhitungan konsentrasi sampel

1.      8 ppm

0.5255 = 0.07012x – 0.091472

x = 8,800 ppm

2.      10 ppm

0.6887 = 0.07012x – 0.091472

x = 11,126 ppm

3.      12 ppm

0.8234 = 0.07012x – 0.091472

x = 13,047 ppm

        Persen recovery

Persen recovery (%) =  x 100 %

Keterangan :

a = konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang ditambahkan

b = konsentrasi contoh

c = konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan

1.      8 ppm

=  x 100 % = 110 %

2.      10 ppm

=  x 100 % = 111,26 %

3.      12 ppm

=  x 100 % = 108,725 %

Dari hasil yang diperoleh, nilai ini masih dapat diterima akurasinya karena menurut

(AOAC, 1998), secara umum nilai akurasi yang dapat diterima sebesar 80- 120%.

DATA PENGAMATAN PRESISI TABLET PARACETAMOL

        Penimbangan Tablet dan Sampel

Berat 20 tablet  = 12,6672 gram

Berat 1 tablet    = 0,63336 gram

Jumlah parasetamol dalam tablet 0,63336 gram adalah 0,5000 gram atau 500 mg

Berat Sampel obat yang ditimbang                    = 0,0632 gram

Berat parasetamol dalam sampel adalah            = 0,4989 gram

        Perhitungan konsentrasi sampel

Kadar Sampel =  = 1995,6 ppm

        Pengenceran Sampel

V1 x N1           = V2 X N2

V1 x 1995,6     = 25 ml x 6 ppm

V1                   = 0,075 ml ...........  Ad hingga 25 ml

        Hasil Absorbansi

Pengulangan Absorbansi

1 0,3315

2 0,3072

3 0,3040

4 0,3024

5 0,3028

6 0,3036

        Perhitungan Standar Deviasi

SD =  =  = 3,713

        Perhitungan RSD

RSD =  = 0,0367

        Perhitungan CV

CV = 0,0367 X 100 % = 3,67 %

        Perhitungan CV Harwitz

CV (%) = 0,66 X 2 1 – ( 0,5 X 6 ) = 0,165 %

DATA PENGAMATAN LINEARITAS TABLET PARASETAMOL

Larutan baku paracetamol 100 ppm

Blanko H2O : NaOH (1:1)

Pengenceran (Volume 10 ml)

Volume standar (ml)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Pengukuran Absorbansi

Konsentrasi (ppm) A1 A2 A3 A4 A5 A6

4 0,2092 0,2097 0,2120 0,2106 0,2102 0,2097

6 0,3050 0,3048 0,3052 0,3061 0,3062 0,3055

8 0,4622 0,4618 0,4610 0,4621 0,4621 0,4620

10 0,6176 0,6176 0,6174 0,6170 0,6181 0,6147

12 0,7561 0,7549 0,7562 0,7550 0,7558 0,7545

Linearitas

Pengukuran R

1 0,9971

2 0,99703

3 0,99677

4 0,99712

5 0,997132

6 0,99714

Rata-Rata 0,99704

DATA PENGAMATAN SPESIFISITAS TABLET PARASETAMOL

a.       Berat tablet total (19 tablet)            = 13095,1 mg

b.      Berat satuan tablet (1/19 tablet)      = 677,6 mg

c.       Berat serbuk total   (19 tablet)        = 12900 mg

d.      Berat serbuk (1/19 tablet)               = 682 mg

e.       Konsentrasi filtrate tablet Parasetamol (larutan filtrate stock)

Konsentrasi = 5000 ppm

f.        Pengenceran filtran tablet parasetamol

-         400 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

5000 ppm x V1 = 400 ppm x 25 mL

V1 = 2 mL

-         40 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

400 ppm x V1 = 40 ppm x 10 mL

V1 = 1  mL

g.       Pembuatan larutan Saccharum Lactis

Konsentrasi = 5000 ppm

h.       Pembuatan larutan uji tablet parasetamol

No. Larutan Filtrat Larutan SL Pelarut Total

1. 2,5 mL 0 22,5 mL 25 mL

2. 2,5 mL 1 mL 21,5 mL 25 mL

3. 2,5 mL 2 mL 20,5 mL 25 mL

4. 2,5 mL 3 mL 19,5 mL 25 mL

5. 2,5 mL 4 mL 18,5 mL 25    L

i.         Perhitungan parasetamol teoritis

-         4 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

400 ppm x V1 = 4 ppm x 25 mL

V1 = 2,5 mL

j.        Perhitungan saccharum lactis teoritis

-         200 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

5000 ppm x V1 = 200 ppm x 25 mL

V1 = 1 mL

-         400 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

5000 ppm x V1 = 400 ppm x 25 mL

V1 = 2 mL

-         600 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

5000 ppm x V1 = 600 ppm x 25 mL

V1 = 3 mL

-         800 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

5000 ppm x V1 = 800 ppm x 25 mL

V1 = 4 mL

k.      Pembuatan Kurva Baku Parasetamol

Konsentrasi = 100 ppm

Pengenceran :

-         4 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

100 ppm x V1 = 4 ppm x 10 mL

V1 = 0,4 mL

-         6 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

100 ppm x V1 = 6 ppm x 10 mL

V1 = 0,6 mL

-         8 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

100 ppm x V1 = 8 ppm x 10 mL

V1 = 0,8 mL

-         10 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

100 ppm x V1 = 10 ppm x 10 mL

V1 = 1 mL

-         12 ppm

M1 x V1 = M2  x V2

100 ppm x V1 = 12 ppm x 10 mL

V1 = 1,2 mL

l.         Absorbansi Baku Parasetamol

Konsentrasi

(ppm) A1 A2

4 0,2092 0,2097

6 0,4622 0,4618

8 0,3050 0,3048

10 0,6176 0,6176

12 0,7561 0,7549

Persamaan Garis

-         y = 0,07032 x – 0,09254

r2 = 0,9971

-         y = 0,07016 x – 0,091152

r2 = 0,99703

-         y = 0,07003 x – 0,08988

r2 = 0,99677

-         y = 0,069985 x – 0,08972

r2 = 0,99712

-         y = 0,070155 x – 0,09076

r2 = 0,997132

-         y = 0,070075 x – 0,09078

r2 = 0,99714

rata-rata persamaan garisnya :

y = 0,070120833 x – 0,0908053

m.     Absorbansi Larutan Uji

No. A1 A2

1 0,3063 0,3060

2 0,3166 0,3167

3 0,3132 0,3133

4 0,3727 0,3726

5 0,3299 0,3294

n.       Perhitungan Konsentrasi Parasetamol nyata

y = 0,070120833 x – 0,0908053

x = 

1.     x =  = 5,66 ppm

2.     x =  = 5,81 ppm

3.     x =  = 5,76 ppm

4.     x =  = 6,61 ppm

5.     x =  = 5,99 ppm

o.      Perhitungan % Recovery

% recovery =  x 100 %

1.      % recovery =  x 100 % = 0,332 %

2.      % recovery =  x 100 % = 0,362 %

3.      % recovery =  x 100 % = 0,352 %

4.      % recovery =  x 100 % = 0,522 %

5.      % recovery =  x 100 % = 0,398 %

Rata-rata % Recovery = 0,3932 %

DATA PENGAMATAN LOD DAN LOQ TABLET PARASETAMOL

 Tabel Hasil Pengukuran AbsorbansiNo Konsentrasi

1 4 ppm

2 6 ppm

3 8 ppm

4 10 ppm

5 12 ppm

Rata-rata

            Perhitungan pengenceran larutan baku

            Larutan Baku Stock   100 ppm

1.      

2.      

3.      

4.      

5.      

           No Konsentrasi (x) Absorbansi (y)

1 4 ppm 0.21023

2 6 ppm 0.30547

3 8 ppm 0.46187

4 10 ppm 0.61752

5 12 ppm 0.75542

Jumlah

yi  didapat dari persamaan regresi y = 0.07012 x – 0.09087x1  = 4 ppm        y = 0.07012 x 4 – 0.09087  = 0.18961x2  = 6 ppm        y = 0.07012 x 6 – 0.09087 = 0.32985x3  = 8 ppm        y = 0.07012 x 8 – 0.09087 = 0.47009x4  = 10 ppm      y = 0.07012 x 10 – 0.09087= 0.61033x5  = 12 ppm      y = 0.07012 x 12 – 0.09087= 0.75057

            Tabel Hasil Pengukuran LOD dan LOQKonsentrasi

LOD 0.8415 ppm 0.0722

LOQ 2.8052 ppm 0.0724

            Larutan stock sampel   1000 ppmPengenceran stockM1     x V1 = M2 x V2

1000 x V1 = 100 x 20            V1 = 2 mL

Pengenceran larutan uji LODM1   x V1 = M2   x V2

100 x V1 = 0.8415 x 20

          V1 = 0.1683 mL

Pengenceran larutan uji LOQM1   x V1 = M2  x V2

100 x V1 = 2.8052 x 20          V1 = 0.56104 mL

VII.                   Pembahasan Validasi LOD dan LOQ

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa obat, serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi, akurasi, presisi, LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan adalah tablet paracetamol dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu praktikum selama 2 kali pertemuan.

         Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk  mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektra UV-Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan atau atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. 

      Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif.  Pada analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu panjang gelombang maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan membuat spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk.

Langkah awal yang dilakukan adalah tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya diambil. Setelah tahap preparasi sampel, dilakukan tahap pembuatan kurva baku. Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan

12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh konsentrasi 10 um/mL . setelah  itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk menentukan panjang gelombang maksimum. Setelah dianalisis dengan spektrofotometer didapatkan panjang gelombang maksimum untuk paracetamol adalah 243 nm. Berdasarkan literature,  panjang gelombang paracetamol 245 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan panjang gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Setelah itu, membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang gelombang maksimum yang diperoleh, dibuat lima seri konsentrasi larutan  dari larutan induk dengan menggunakan rumus Lambert Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi larutan sebelumnya, ditentukan nilai konsentrasi minimum dan maksimum dengan rumus  A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat adalah 4 ppm dan nilai konsentrasi maksimumnya 12 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri konsentrasi larutan yaitu 4,6,8,10,12, ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada panjang gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu y=0,0702x - 0,09087. sehingga diperoleh nilai resapan 0,997 . 

Selanjutnya dihitung parameter validasi. Parameter validasi berguna untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi parameter adalah untuk menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal serta dapat dipercaya. Parameter yang diuji dalam validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas, dan uji kesesuaian sistem.

Setelah itu dicari batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ). Batas deteksi adalah titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini adalah konsentrasi terendah dari analit dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak selalu diukur. Batas deteksi sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari metode analisis adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit atau massa.

Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan baseline. Selain itu sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode lebih lanjut:

1.                  Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit dapat dipercaya terdeteksi.

2.                  Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong: Pengukuran besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis jumlah sampel yang tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini.

3.                  Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah kurva kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung analit

dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau standar deviasi dari y-perpotongan garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai standar deviasi.

Gambar 1. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan Batas kuantifikasi (LOQ) adalah jumlah minimum yang disuntikkan

menghasilkan pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari dasar suara.

Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan, EURACHEM (Gambar 2) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan penurunan jumlah analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari ketepatan diplot terhadap jumlah analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan presisi didefinisikan sebelumnya adalah sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting untuk tidak hanya menggunakan standar murni untuk tes ini tetapi juga matriks runcing yang erat merupakan sampel yang tidak diketahui.

Untuk batas deteksi, para ICH   merekomendasikan, di samping prosedur seperti yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan kurva kalibrasi.

Gambar 2. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.

Berdasarkan hasil perhitungan tersebut, didapat yaitu nilai LOD 0.8415 dan nilai LOQ yaitu 2.8052. LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.

VIII.                Kesimpulan

LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan. Nilai LOD yaitu 0.8415 dan nilai LOQ yaitu 2.8052.

DAFTAR PUSTAKA

Association of Official Analytical Chemists. 1998. AOAC Perr- Verified Methods Program. Arlington : AOAC International.

Chan, C. C,. Lam, Herman. Lee, Y. C. and Zhang, Xue-Ming. 2004. Analytical Method Validation and Instrument Performance Verification. John Wiley & Sons. Canada.

Dachriyanus. 2004.  Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi Edisi I. Penerbit Andalas University Press.  Padang.

Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI. Jakarta.Ermer, J.H. and Miller, McB. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best

Practice. Wiley-Vch. Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim.Gandjar, G.I & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar. Yogyakarta. [ICH] International Conference on Harmonization. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and

Methodology Q2(R1). Tersedia di http://www.ich.org. [diakses tanggal 06 Juni 2013].Moffat, A.C., dkk. 2005. Clarke‘s Analysis Of Drug And Poisons. Thirth edition. Pharmaceutical Press.

Electronic version. London.Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di

http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-analisis/ [diakses tanggal 06 Juni 2013].

Read more: http://laporanakhirpraktikum.blogspot.com/2013/07/aa.html#ixzz2oSG4RUDI