UJI BATAS MIKROBA

FARMAKOPE INDONESIA EDISI IV

Uji batas mikroba dilakukan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada dalam

semua jenis perbekalan farmasi, baik bahan baku farmasi maupun sediaan jadi. Selain itu, uji

batas mikroba ini bertujuan untuk menyatakan apakah suatu sediaan farmasi bebas dari

mikroba tertentu atau tidak. Uji ini harus dilakukakan secara aseptik. Terdapat istilah-istilah

yang terdapat dalam uji ini, diantaranya :

- Inkubasi menempatkan wadah dalam suatu ruangan yang dijaga suhunya pada

suhu antara 30OC dan 35OC selama 24-48 jam.

- Tumbuh adanya kemungkinan pertumbuhan suatu mikroba tertentu.

A. UJI PENDAHULUAN

Uji pendahuluan dilakukan dengan cara menginokulasikan sampel uji secara terpisah

dengan biakan mikroba Staphylococcus aureus, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa,

dan Salmonella. Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1 ml biakan mikroba yang

berumur 24 jam yang sudah diencerkan sebanyak 10-3 ke sampel uji dalam dapar fosfat pH

7,2 yang menggunakan media Fluid Soybean-Casein Digest atau media Fluid Lactose

Medium.

Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba pada media, pengujian tersebut dinyatakan

tidak berlaku dan perlu adanya modifikasi prosedur sampai terdapat pertumbuhan mikroba.

Modifikasi tersebut dapat dilakukan dengan cara :

a. Meningkatkan volume pengenceran dengan tetap mempertahankan jumlah bahan uji

b. Menambahkan zat inaktivator secukupnya ke dalam pengencer

c. Kombinasi modifikasi a dan b

LARUTAN DAPAR DAN MEDIA

Pada pembuatan media agar, larutkan bahan padat yang dapat larut adalam air. Jika

perlu, panaskan hingga larut sempurna. Tambahkn larutan asam klorida atau natrium

hidroksida secukupnya hingga diperoleh media dengan pH yang diinginkan. Tetapkan pH

pada suhu 25O ± 2O. Air yang digunakan pada pembuatan media agar, gunakan air murni dan

kadar air pada agar tidak lebih dari 15%.

Larutan dapar yang digunakan dalam pengujian batas mikroba ini adalah larutan

dapat fosfat pH 7,2. Larutkan 34 gr kalium fosfat monobasa P dalam 500 ml air di dalam labu

ukur 1000 ml. Selanjutnya tambahkan 175 ml natrium hidroksida 1 N hingga pH 7,2 ± 0,1.

Tambahkan air sampai tanda, lalu campur. Masukkan ke dalam wadah, sterilkan, dan simpan

dalam lemari pendingin. Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian larutan dengan 800 bagian

air dan sterilkan.

Terdapat berbagai media yang terdapat dalam pengujian batas mikroba. Pemilihan

media-media ini berdasarkan jenis mikroba yang akan diuji. Jika dinyatakan lain, media harus

disterilkan dengan pemanasan dalam autoklaf. Waktu pemanasan tergantung pada volume

media yang akan disterilkan. Berikut contoh media yang digunakan dalam uji batas mikroba :

1. Media FCDSLP (Fluid Casein Digest-Soy lecithin-Polysorbate 20 Medium)

2. Media SDA (Soybean-Casein Digest Agar Medium)

3. Media FSCD (Fluid Soybean Casein Digest Medium)

4. Media MSA (Mannitol-Salt Agar Medium)

5. Media BPA (Baird-parker Agar Medium)

6. Media VJA (Vogel-Johnson Agar Medium)

7. Media CETA (Cetrimide Agar Medium)

8. Media PAF (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Fluorescin)

9. Media PAP (Pseudomonas Agar Medium for Detection Pyocyanin)

10. Media FLM (Fluid Lactose Medium)

11. Media FSCM (Fluid Selenite-Cystine Medium)

12. Media FTM (Fluid Tetrathionate Medium)

13. Media BGA (Brilliant-Green Agar Medium)

14. Media XLDA (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar Medium)

15. Media BSA (Bismuth Sulfite Agar Medium)

16. Media TSIA (Triple Sugar-Iron Agar Medium)

17. Media MCA (MacConkey Agar Medium)

18. Media LEMBA (Levine Eosin-Methylen Blue Agar Medium)

19. Media SDA (Sabouraud Dextrose Agar Medium)

20. Media PDA (Potato Dextrose Agar Medium)

B. PROSEDUR PENGUJIAN

Untuk sampel uji yang berbentuk salep, krim, malam, dan sediaan yang sukar larut dalam

air, sampel harus dibuat suspensi dengan menggunakan emulgator steril (misalnya salah satu

polisorbat). Gunakan blender mekanik. Jika perlu, hangatkan hingga suhu tidak lebih dari

45OC. Selanjutnya lakukan pengujian seperti yang tertera pada Angka Aerob Total, Uji

Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella dan Escherichia coli.

ANGKA MIKROBA TOTAL

Terdapat 2 metode dalam pengujian angka mikroba total, yaitu metode lempeng dan

metode tabung ganda. Mula-mula suspensikan 10,0 gr sampel uji di dalam dapar fosfat

dengan media FSCD atau media FCDSLP hinga 100 ml. Masukkan sampel uji ke dalam

media tidak lebih dari 1 jam sesuai untuk inokulasi.

a) Metode Lempeng

Encerkan cairan sedemikian rupa hingga 1 ml cairan dapat menghasilkan 30-

300 koloni mikroba. Pipet 1 ml enceran akhir ke dalam 2 cawan petri steril.

Tambahkan 15-20 ml media SCDA yang sudah dicairkan dan didinginkan hingga

suhunya 45O. Tutup cawan petri. Campur cairan dengan agar dengan cara

memiringkan cawan. Biarkan isi cawan memadat pada suhu kamar. Balikkan cawan

dan inkubasi selama 48-72 jam. Amati pertumbuhan mikroba.

Hasil : Hitung jumlah mikroba yang ada di kedua cawan petri tersebut. Hasil

yang didapat kemudia dirata-ratakan.

b) Metode Tabung Ganda

Siapkan 14 tabung yang berukuran sama. Tambahkan 9,0 media FSCD steril ke

semua tabung. Pisahkan 12 tabung dan kelompokkan menjadi 4 kelompok. Kelompok

1 menjadi kelompok kontrol. Sedangkan 3 kelompok lain sebagai kelompok 1

(“100”), kelompok 2 (“10”), dan kelompok 3 (“1”). Sisa 2 tabung akan menjadi

tabung A dan tabung B. Masukkan 1 ml suspensi sampel uji kedalam tabung

kelompok 1 dan taabung A, lalu campur. Pipet 1 ml dari tabung A ke dalam tabung B,

dan campur. Tabung A dan tabung B masing-masing berisi 100 mg dan 10 mg

suspensi sampel uji. Tambahkan 1 ml dari tabung A ke dalam tabung kelompok 2.

Selanjutnya tambahkan 1 ml dari tabung B ke dalam tabung kelompok 3. Buang sisa

isi dari tabung A dan tabung B. Tutup semua tabung dan inkubasikan. Amati

pertumbuhan mikroba di setiap tabung. Tabung kontrol akan tetap jernih. Untuk

melihat pertumbuhan mikroba yang ada di tabung kelompok 1, 2 dan 3 gunakan acuan

tabel Nilai Duga Terdekat.

C. UJI MIKROBA SPESIFIK

1. Uji Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa

Tambahkan media FSCD ke dalam suspensi sampel uji hingga 100 ml, campur dan

inkubasikan. Amati pertumbuhan mikroba pada media. Jika terdapat pertumbuhan

mikroba, inokulasikan biakan bakteri pada permukaan lempeng media VJA (atau media

BPA atau media MSA) dan media CETA. Tutup, balikkan cawan, inkubasi. Amati

pertumbuhan mikroba yang terjadi. Jika setelah pengamatan tidak ada satupun mikroba

yang tumbuh, maka sampel uji memenuhi persyaratan bebas bakteri Staphylococcus

aureus dan Pseudomonas aureus.

a) Uji Koagulase

Uji koagulase dikhususkan untuk bakteri Staphylococcus aureus. Pindahkan

sejumlah koloni bakteri ke permukaan media VJA atau media BPA atau media

MSA ke dalam tabung yang berisi 0,5 ml plasma mamalia (kelinci atau kuda).

Inkubasi di dalam penangas air pada suhu 37OC. Amati tabung pada 3 jam

pertama, selanjutnya pada jarak waktu yang sesuai selama 24 jam. Lakukan uji

kontrol positif dan negatif bersamaan dengan uji suspensi sampel. Jika sama

sekali tidak terjadi reaksi koagulase, maka sampel uji dinyatakan bebas

Staphylococcus aureus.

b) Uji Oksidase dan Pigmen

Uji oksidase dan pigmen dikhususkan untuk bakteri Pseudomonas

aeruginosa. Pindahkan sejumlah koloni bakteri dari permukaan media CETA ke

permukaan media PAF (untuk mendeteksi fluoresin) dan media PAP (untuk

mendeteksi piosianin). Tutup dan balikkan cawan. Inkubasi pada suhu 35O ± 2O

selama 3 hari. Amati permukaan cawan dibawah sinar ultraviolet.

Lakukan uji oksidase untuk mengonfirmasi adanya bakteri Pseudomonas

aeruginosa. Pindahkan koloni bakteri ke atas potongan kertas saring yang

sebelumya telah diimpregnasi dengan N,N-dimetil-p-fenilendiamina

dihidroklorida. Jika tidak terjadi perubahan warna merah muda menjadi

lembayung, sampel uji dinyatakan bebas dari bakteri Pseudomonas aeruginosa.

2. Uji Salmonella dan Escherichia coli

Tambahkan sejumlah volume media FLM ke dalam suspensi sampel uji hingga 100

ml, dan inkubasi. Amati pertumbuhan pada media. Jika terdapat pertumbuhan koloni

mikroba, pipet 1 ml ke dalam wadah yang berisi 10 ml media FSCM dna media FTM,

campur, dan inkubasi selama 12-24 jam. Simpan sisa media FLM.

a) Uji Salmonella

Pindahkan sebagian media FSCM dan media FTM ke permukaan media

BGA, XLDA, dan media BSA yang terdapat di dalam cawan petri. Tutup dan

balikkan cawan petri. Jika tidak terdapat pertumbuhan sama sekali, maka sampel

uji dinyatakan bebas bakteri Salmonella. Sedangkan jika ada pertumbuhan

bakteri, lanjutkan identifikasi dengan memindahkan sejumlah koloni ke dalam

media TSIA. Goreskan ke permukaan media kemudian lakukan penusukan ke

dasar media, dan inkubasi. Jika pada permukaan tidak terdapat reaksi alkali yang

ditandai dengan warna merah dan reaksi asam yang ditandai dengan warna

kuning pada tusuka ke dasar media, maka sampel uji dinyatakan bebas bakteri

Salmonella. Berikut beberapa uji untuk mengidentifikasi adanya bakteri

Salmonella dalam suatu sediaan farmasi :

Jenis Uji Media yang

digunakan

Warna yang dihasilkan

Uji Indol Media Indol + terbentuk gelang merah

- tidak berwarna atau warna kuning

kecoklatan

Uji Voges

Proskauer

Media methyl red-

voges prokauer (MR-

VP)

+ warna merah muda hingga merah tua

- warna tidak berubah

Uji

Dekarboksilasi

Lisin

Media cair lysine

decarboxylase broth

+ timbul warna ungu

(Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan

Kedokteran. Jakarta : EGC)

b) Uji Escherichia coli

Goreskan sebagian dari sisa media FLM pada permukaan media MCA.

Tutup, balikkan cawan, dan inkubasi. Jika tidak terdapat pertumbuhan, maka

sampel uji langsung dinyatakan bebas bakteri Escherichia coli. Sebaliknya, jika

terdapat pertumbuhan, lanjutkan pengujian dengan cara memindahkan koloni

bakteri ke permukaan media LEMBA ke dalam cawan petri. Tutup, balikkan

cawan, dan inkubasi. Jika pada pengamatan tidak terdapat pertumbuhan koloni

bakteri yang ditandai dengan kilauan logam yang khas di bawah cahaya yang

dipantulkan dan warna biru hitam pada cahaya yang diteruskan, maka sampel uji

bebas dari bakteri Escherichia coli. Berikut beberapa reaksi khusus untuk

menguji adanya bakteri Escherichia coli :

Jenis Uji Media yang

digunakan

Warna yang dihasilkan

Uji Indol Media trytone broth + warna merah tua

Uji Metil

Merah

Media methyl red-

voges prokauer (MR-

VP)

+ warna merah

- warna kuning

Uji Voges

Proskauer

Media methyl red-

voges prokauer (MR-

VP)

+ warna merah muda hingga merah tua

- warna tidak berubah

Uji Sitrat Media simmons citrate + warna biru

- warna hijau

(Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan

Kedokteran. Jakarta : EGC)

UJI STERILITAS SEDIAAN FARMASI

Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan

Kedokteran. Jakarta : EGC

Uji sterilitas adalah suatu pengujian yang dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui

adanya mikroorganisme yang hidup atau memiliki daya hidup dalam suatu sediaan yang

sudah disterilkan. Prinsip uji sterilitas ini adalah menginokulasikan atau membiakkan

mikroorganisme yang terdapat dalam sediaan uji dalam media perbenihan yang sesuai. Media

yang digunakan dalam uji ini adalah media tioglikat cair dan Soybean-Casein Digest

Medium.

Terdapat 2 cara dalam uji sterilitas, yaitu :

a) Pengujian secara langsung

Pengujian ini dilakukan dengan cara menginokulasikan secara langsung sediaan yang

akan diuji ke dalam media perbenihan yang sesuai secara aseptis. Sediaan yang

disterilisasi dengan cara ini diantaranya :

- Sediaan yang bervolume kurang dari 10 ml

- Sediaan yang tidak mengandung antibiotik atau antimikroba. Apabila sediaan

tersebut mengandung antimikroba, antimikroba tersebut harus diinaktivasi

terlebih dahulu dengan larutan inaktivator.

b) Pengujian dengan menggunakan penyaring membran

Pengujian ini dilakukan dengan cara menyaring larutan sediaan melalui suatu

membran yang sesuai, kemudian membran tersebut diletakkan pada media perbenihan

yang sesuai secara aseptis. Membran filter yang biasa digunakan adalah membran

yang memiliki ukuran pori-pori 0, 45 µg dan garis tengah 47 mm. Kecepatan alir

larutan 55-75 ml/menit pada tekanan 70 mmHg. Terdapat 3 jenis membran filter,

yaitu membran hidrofilik, membran hidrofobik, dan membran hidrofilik-hidrofobik.

Sediaan yang disterilisasi dengan cara ini diantaranya :

- Sediaan yang bervolume besar seperti cairan infus

- Sediaan yang mengandung lemak/minyak

- Sediaan yang bervolume lebih dari 10 ml

- Sediaan yang mengandung antibiotik atau antimikroba

Untuk beberapa jenis sediaan, biasanya dilakukan pembilasan membran filter

setelah penyaringan sediaan. Larutan pembilas yang digunakan untuk membilas

membran filter dibagi menjadi 3 jenis, diantaranya :

Larutan A : larutan pepton 0,1%. Biasanya digunakan untuk larutan air

Larutan D : larutan pepton 0,1% dan tween 80 0,1% . larutan ini digunakan

untuk larutan yang mengandung lemak/minyak.

Larutan K : larutan pepton 0,5%, ekstrak daging sapi 0,3%, dan polisorbat 80

0,1%. Larutan ini digunakan untuk larutan selain lemak/minyak, seperti

petrolatum.

Sebelum dilakukan pengujian sterilitas, perlu dilakukan uji fertilitias media. Uji

fertilitas ini dilakukan untuk mengetahui apakah media yang digunakan dalam uji

sterilitas layak untuk digunakan.

A. Pengujian Sterilitas secara Langsung untuk Sediaan yang Berbentuk Salep, Minyak, atau

Lemak yang Tidak Larut dalam Isopropil Miristat

Sampel dibagi menjadi 2 kelompok dimana masing-masing terdiri dari 10 wadah. Dari

kesepuluh wadah tersebut, diambil dan ditimbang masing-masing sebanyak 100 mg sampel

uji. Kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml larutan pendispersi dan kocok homogen. Larutan

pendispersi disesuaikan dengan sampel dan tidak bersifat antimikroba. Sebanyak 10 ml

suspensi sampel uji dimasukkan kedalam 80 ml media trypticase soy broth dan 80 ml fluid

thioglycollate medium, kemudian homogenkan dengan hati-hati. inkubasi selama 14 hari pada

suhu 35OC untuk fluid thioglycollate medium dan pada suhu 25OC untuk trypticase soy broth.

B. Pengujian dengan Sterilitas untuk Sediaan yang Berbentuk Salep, Minyak, atau Lemak

yang Larut dalam Isopropil Miristat

Siapkan wadah sebanyak 20 buah. Ambil dan timbang 100 mg sampel uji kemudia

larutkan dalam 100 ml larutan isopropil miristat yang telah disterilkan dengan penyaringan

menggunakan membran 0,22 µg, pH 6,5. Jika perlu, hangatkan pada suhu 45OC selama 15

menit, kemudian disaring melalui membran filter dengan bantuan pompa vakum. Setelah

penyeringan, membran dicuci 2 kali dengan menggunakan 200 ml Larutan pembilas D,

kemudian dibilas sekali lagi dengan menggunakan larutan pembilas A.

Bila sediaan zat uji mengandung vaselin (petrolatum), cairan pembilas yang digunakan

adalah larutan pembilas K. Sebelum penyeringan, membran dibasahi terlebih dahulu dengan

200 ml larutan pembilas. Setelah penyaringan, membran dibilas 3 kali dengan 100 ml larutan

pembilas K.

C. Penafsiran Hasil Uji

Setelah akhir masa inkubasi, pertumbuhan mikroba diamati disetiap wadah.

Pertumbuhan mikroba ditandai dengan terjadinya kekeruhan atau pertumbuhan pada

permukaan media. Jika tidak terjadi pertumbuhan, sampel dinyatakan memenuhi syarat

sterilitas. Jika tidak memenuhi syarat, pengujian ini dilakukan ulang dengan jumlah sampel

dinaikkan menjadi 2 kali lipat dari pengujian pertama.

UJI POTENSI ANTIBIOTIK

Sumber : Radji, M. (2010). Buku Ajar Mikrobiologi : Panduan Mahasiswa Farmasi dan

Kedokteran. Jakarta : EGC

Antibiotik adalah suatu senyawa yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme

tertentuyang pada konsentrasi rendah dapat memusnahkan atau mebghambat pertumbuhan

mikroorganisme lain. Uji potensi antibiotik ini dilakukan untuk memberikan jaminan kualitas

dan mutu antibiotik yang digunakan dalam pengobatan memenuhi syarat yang telah

ditentukan. Prinsip dari pengujian ini adalah membandingkan dosis larutan sediaan uji

terhadap dosis larutan baku pembanding yang menghasilkan derajat hambatan yang sama

pada mikroorganisme uji. Terdapat 2 metode dalam uji potensi antibiotik ini, yaitu :

a) Metode turbidimetri (tabung)

Prinsip dari metode ini adalah membandingkan hambatan pertumbuhan

mikroorganisme dalam media cair yang mengandung larutan antibiotik.

Mikroorganisme diinokulasikan ke dalam media cair yang mengandung antibiotik ke

dalam tabung. Pertumbuhan mikroorganisme ditandai dengan adanya kekeruhan

media pada tabung uji. Rasio potensi antibiotikya adalah perbandingan kekeruhan

media dalam tabung uji dengan kekeruhan media dalam tabung antibiotik baku

pembanding.

b) Metode lempeng silinder (difusi agar)

Prinsip dari metode ini adalah membandingkan zona hambatan pertumbuhan

mikroorganisme uji oleh dosis antibiotik uji terhadap zona hambatan oleh dosis

antibiotik baku pembanding pada media lempeng agar. Mikroorganisme

diinokulasikan ke dalam media lempeng agar di cawan petri. Kemudian dimasukkan

silinder besi tahan karat kedalamnya. Larutan antibiotik akan berdifusi keluar dari

silinder besi tersebut dan menghambat pertumbuhan mikroorganisme uji yang berada

di sekeliling silinder. Rasio antibiotiknya adalah perbandingan ukuran garis tengah

zona hambatan yang disebabkan oleh larutan antibiotik uji dan larutan antibiotik baku

pembanding.

Penetapan potensi antibiotik menurut Farmakope Indonesia edisi IV

Prinsip uji potensi antibiotik menurut FI IV adalah menginterpolasikan derajat

hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji yang diperoleh secara difusi agar dari dosis

sediaan uji terhadap kurva baku dari dosis sediaan baku. Penetapan ini menggunakan 5 dosis

larutan baku pembanding (S1, S2, S3, S4, S5) dan satu dosis larutan uji dengan konsentrasi

yang sama dengan dosis standar 3 (S3). Uji ini menggunakan 15 buah cawan petri karena

penetapan dilakukan secara triplo.

Inokulum

Inokulum mikroorganisme dibuat dalam media cair.konsentrasi yang dibutuhkan

adalah 106 sampai 107 sel/ml. Syarat-syarat mikroorganisme yang digunakan adalah galur

murni koleksi laboratorium berstandar, peka terhadap antibiotik, dan selalu dilakukan

peremajaan minimal 1 minggu sekali.

Larutan antiobiotik pembanding

Terdapat 3 jenis antibiotik baku pembanding, diantaranya adalah baku pembanding

internasional, baku pembanding nasional, dan baku pembanding kerja. Namun yang biasa

digunakan dalam penetapan potensi antibiotik adalah baku pembanding kerja.

Tingkat dosis

Terdapat 5 tingkatan dosis, yaitu : S1, S2, S3, S4, S5. S3 bertindak sebagai acuan.

Contoh :

Apabila S3 adalah 10 µg/ml, maka dosis baku lainnya adalah :

o S2 = 4/5 x 10 µg/ml = 8 µg/ml

o S1 = 4/5 x 8 µg/ml = 6,4 µg/ml

o S4 = 5/4 x 10 µg/ml = 12,5 µg/ml

o S5 = 5/4 x 12,5 µg/ml = 15,625 µg/ml

Cara Perhitungan

Untuk menghitung data potensi, gunakan metode garis lurus transformasi log dengan

prosedur penyeseuaian kuadrat terkecil dan uji linearitas. Bila sejumlah penetapan dari bahan

uji yang sama dilakukan menggunakan kurva baku yang sama, hitung koefisien variasi dari

hasil semua penetapan bahan uji.