Uji Efektivitas Pengawet (AET) dalam Sediaan Obat

Marlia Singgih WibowoSekolah Farmasi ITB

Februari 2014

Apa itu AET?

• Mengacu pada USP Chapter <51>, the Antimicrobial Effectiveness Test (AET) adalahuji untuk membuktikan effectiveness darisuatu sistem preservative dalam suatu produk

• Produk di inokulasi dengan mikroorganismespesifik dgn jumlah diketahui. Uji tersebutmembandingkan jumlah mikroorganismedalam bahan kontrol terhadap sample selamaperiode 28  hari. 

Apa itu preservatives?• Antimicrobial preservatives adalah senyawa yang ditambahkan ke dalam non‐sterile dosage forms untukmelindungi nya dari pertumbuhan microorganismeatau dari mikroorganisme yang masuk ke dalamprosuk selama atau setelah proses manufacturing. 

• Dalam hal sediaan steril dikemas dalam wadah dosisganda, antimicrobial preservatives  berfungsi untukmenghambat pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin masuk ke dalam produk selama proses penggunaan pengambilan berulang. Contohantimicrobial preservatives misalnya alkohol, formaldehid dan iodine.

Mengapa harus menambah pengawetdalam sediaan obat?

• For Non‐sterile Dosage Forms To protect from microbiological growth or frommicroorganisms that are introduced during or subsequent to the manufacturing  process.* 

• For Sterile Dosage Forms For products packaged in multi‐dose containers, to inhibit growth of microorganisms that might beintroduced from repeatedly withdrawing doses.* 

*USP Chapter <51> 

Beberapa jenis pengawet

• Benzoic acid and garam nya• Sorbic acid and garam nya• Parabens

Antimicrobial Effectiveness Test 

• AET  di beberapa kompendial dikenal denganistilah : 

1. Antimicrobial Effectiveness Test (USP)2. Efficacy of Antimicrobial Preservation (EP)3. Preservation Effectiveness Test (JP) 

• Mikroorganisme uji : bakteri, kapang, khamir• Product requirements : biasanya 20‐100mL 

AET bedasarkan Farmakope

• Not truly harmonized around the world • USP Chapter <51> “Antimicrobial Effectiveness Test” while EP Chapter 5.1.3 “Efficacy of Antimicrobial Preservation” 

• Testing to confirm that the preservatives added in a formulation will work as expected over time.

• Used during formulation development and in stability programs. 

Prosedur Dasar

• Gunakan mikroorganisme specific ATCC (atausumber lain yg sah) : – Escherichia coli (required for USP, recommended for oral products for EP) 

– Pseudomonas aeruginosa– Staphylococcus aureus– Candida albicans– Aspergillus brasiliensis

Additional/tambahan Organisme• Zygosaccharomyces rouxii (EP) untuk produkdengan kadar gula tinggi

• Atau isolat2 dari lingkungan• menurut EP: “…designated microorganisms are supplemented, where appropriate, by other strains or species that may represent likely contaminants to the preparation.” • Untuk sediaan parenteral, mungkin dapatdimasukkan mikroorganisme nosocomial infections. 

Examples  :• Resistant organism in cosmetic formulation : Bacillus

• Nosocomial Organisms : Serratia marscens, Candida albicans, Streptococcus, Staphylococcus aureus

Catergory of product (USP)

Test Microorganisms• Menurut USP <51>, 5 mikroorganismeindikator digunakan untuk uji preservative system  dalam suatu produk.  

• Tiga dari lima USP indicator organisms :  Escherichia coli , Pseudomonas  aeruginosa, and Staphylococcus aureus,  uji untukpertumbuhan bakteri.  

• Candida albicans sebagai representative utkyeast, sedangkan Aspergillus niger adalahkapang

• Mikroorganisme tersebut adalah dari koleksiATCC  dan harus disiapkan sesuai prosedur USP untuk menjamin viabilitasnya .  (mikroorganismelain dapat digunakan sesuai kebutuhan nya) 

• Suatu produk di inokulasi (sengaja di kontaminasi) dengan sejumlah mikroorganismeantara 1 x 105 (100,000) to 1 x 106 (1,000,000) colony forming units (CFU) per mL produk.  

• Pada rentang yg bervariasi, tgt category, produkdiuji ntuk menetapkan kemampuannyamengontrol reproduksi atau membunuhmikroorganisme.

Product criteria

• A logarithmic reduction is evaluated at each test interval required for the category.  By test definition, any growth over the allotted amount for any of the indicated microorganisms renders the preservative in the product not effective. 

• Jadi hal penting adalah :Pengurangan jumlah logaritmik

Garis besar prosedur

• Untuk setiap mikroorganisme uji ditempatkanpada wadah terpisah, termasuk juga kontrolpositif dan kontrol negatif. 

• Sampel yang akan diuji di tempatkan pada wadahsteril dan terlindung dari cahaya.

• PASTIKAN inokulum mikroorganisme uji yang disiapkan telah diketahui dengan pasti jumlahkoloni nya (CFU/mL) yaitu antara 105 ‐ 106 cfu/mL

• Biakan mikroorganisme harus disiapkansegar/baru (freshly prepared) 

• Lakukan uji rekoveri (perolehan kembali) untukmenjamin jumlah mikroba yang diinokulasikan kedalam produk/sampel. 

• Untuk EP,  perlu dilakukan recovery jam ke 0• Simpan /inkubasi sampel uji pada suhu 22.5±2.5ºC selama waktu yg telah ditetapkan untuk masing2 kategori . 

• Saat pengamatan pada selang waktu yang ditentukan, ambil sejumlah volume sampel, lalulakukan TPC.

• Tentukan log 10  dari konsentrasimikroorganisme yang tertinggal dalam sampeldan bandingkan hasilnya untuk setiap jenismikroorganisme dengan menggunakan tabel.  

• Setiap produk memiliki persyaratan masing‐masing.   

• Tidak boleh ada penambahan lebih besar dari0.5 log 10 perhitungan nya. 

Kapan Validasi?

• Saat pertama kali suatu produk diuji untukAntimicrobial Effectiveness, perlu dilakukanvalidasi untuk menjamin formula yang diuji dapatmenghambat pertumbuhan mikroorganisme.

• Full validation harus dilakukan dalam 3 (three) pekerjaan independent , dan setiap pekerjaanharus menunjukkan recovery pertumbuhanmikroorganisme pada inokulum dan kontrol tidakberbeda kurang dari 70% (not less than 70% of the growth inoculum versus the control)

Kapan harus re‐validasi?

Revalidasi perlu dilakukan jika ada perubahanformula produk, atau proses produksi, atauperubahan pada pengemasan. 

• Jika produk dalam bentuk cair, volume ygdiperlukan tidak kurang dari 20 mL 

• Jika bentuk granular atau powder diperlukan20 grams.  

• Validasi untuk produk tersebut memerlukantambahan 100 mL atau grams.  

• Uji di bawah kondisi normal memerlukanwaktu uji selama 7 minggu mulai daripersiapan mikroorganisme sampai uji selesai.  

Validasi untuk produk yang di inaktivasi

• Harus dapat membuktikan inaktivasipengawet dengan menunjukkan adanyapertumbuhan mikroorganisme dgn adanyapengawet.  (bukti bhw inaktivasi berhasil)

• Inaktivasi dpt dilakukan dengan cara• menggunakan neutralizers • Pengenceran /Dilution

• Untuk sediaan Parenteral, dpt menggunakanBacteriostasis/Fungistasis

Hal hal berikut harus dinyatakan

• Neutralizer Efficacy – utk membuktikan The neutralizer effectiveness

• Neutralizer Toxicity – tidak boleh toxic thpmicroorganisms. 

• The challenge cfu harus tidak boleh kurangdari 70%  viable count. 

The neutralizer (inactivating agent) harus memenuhi kriteria berikut : 

• Tidak memberikan efek inhibisi terhadapmikroorganisme

• Harus benar‐benar menghilangan aktivitaspengawet

• Jika inaktivasi terjadi, pastikan bahwa produkakhir nya tidak toksik thp mikroorganisme. 

Sumber Variabilitas• Sumber mikroorganisme

• ATCC • Berbagai sumber lain / collections• Pertumbuhan dan cara panen

• Asal biakan : Liquid vs agar cultures • Komposisi buffers • Komposisi neutralizers• Cara perhitungan Plate counting • Konversi /Mathematical transformations

Jika uji ini dilakukan oleh Lab lain (sub contract) maka pastikan bahwa lab tersebut : • memiliki knowledge ttg bgm melaksanakan ujitsb

• memahami bhw uji ini tidak mudah• harus selalu update thp perubahan padakompendia

• harus siap dan selalu punya kontrol thpproses uji

• selalu mendokumentasikan setiap uji secaralengkap

Finish