LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGIPRAKTIKUM VIIUji Aktivitas Antimikroba : Metode Dilusi Padat

Disusun Oleh :Nama / NIM: 1. Nimas Ayu / 10129 2. Almira Rahmayani / 10132 3. Bambang Hidayat / 10135 4. Siti Muntadliroh / 10138 5. Retika Gien Syaputri / 10141Kelas / Golongan: B / IVTanggal Praktikum: 4 Mei 2015Dosen Jaga: Asisten :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIBAGIAN BIOLOGI FARMASIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS GADJAH MADAYOGYAKARTA2015A. TujuanSetelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji.

B. Dasar TeoriAntibiotika adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan oleh organisme hidup, termasuk turunan senyawa dan struktur analognya yang dibuat secara sintetik, dan dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme. (Soekardjo dkk, 200)Hal yang paling penting mengenai konsep antimikrobia adalah selective toxicity yaitu selektif dalam menghambat pertumbuhan organisme tanpa merusak inang. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel bakteri dan manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak dimiliki oleh sel manusia, sehingga antibiotik dengan mekanisme kegiatan pada dinding sel bakteri mempunyai toksisitas selektif relatif tinggi. (Ganiswarna, 1995)Berdasarkan toksisitas selektif ada antibakteri yang bersifat bakteriostatik dan bakterisid. Kelompok yang pertama menghambat pertumbuhan atau perkembangan bakteri, kelompok yang kedua bekerja mematikan bakteri. Bakterisid merupakan antibiotik yang mempengaruhi pembentukan dinding sel atau permeabilitas membran, sedang bakteriostatik adalah antibiotik yang bekerja pada sintesa protein. Antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dan bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar antibakterinya ditingkatkan melebihi KHM. (Setiabudi, 1995)Kadar Hambat Minimal (KHM) atau Minimum Concentration (MIC) adalah kadar minimal yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri sedangkan konsentrasi terendah dari antibiotik yang membunuh 99,9% inokulum bakteri disebut Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimum Killing Concentration (MCK). (Brander, 1991)Mekanisme kerja sebagian besar antibiotik dapat dibagi menjadi 5 cara :1. Menghambat pembentukan dinding sel, contoh: penisilin, ampisilin, metsilin, sefalosforin.2. Mengganggu pembentukan membran sel, contoh : polimiksin B.3. Menghambat sintesis protein, contoh: streptomisin, gentamisin, kloramfenikol.4. Menghambat sintesis asam nukleat, contoh : siprofloksazin, nifampin.5. Antagonis metabolit, contoh : isoniazid.6. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba yaitu pH lingkungan, komponen-komponen perbenihan, stabilitas obat, besarnya inokulum bakteri, masa pengeraman, dan aktivitas metabolik mikroorganisme. (Jawetz et al., 1995)Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat (solid dilution). Metode dilusi cair (broth dilution) mengukur MIC (Minimum Inhibitory Concentration) atau KHM (Kadar Hambat Minimum) dan MBC (Minimum Bactericidal Concentration atau Kadar Bunuh Minimum, KBM). Metode dilusi padat (solid dilution) serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan metode padat. Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang di uji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).Pada metode dilusi cair, masing-masing konsentrasi antimikroba obat antibiotik ditambah suspensi bakteri, sedang dalam dilusi padat pada tiap konsentrasi dicampur dengan media agar lalu ditanam bakteri, diinkubasi 24 jam.Pada dilusi padat, prinsipnya adalah sejumlah antimikroba diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi padat tiap konsentrasi obat dicampur dalam media agar, lalu ditanami bakteri dan diinkubasi. Setelah masa inkubasi selesai, diperiksa konsentrasi berapa obat dapat menghambat pertumbuhan atau mematikan mikroba. (Pelczar, 1988).Keuntungan dari metode dilusi padat adalah bisa menguji lebih dari satu mikroba uji dalam setiap cawan petri, sedang kelemahannya adalah sulit membedakan antara aktivitas penghambat (KHM) atau mematikan mikroba uji (KBM). Sedangkan pada dilusi cair memiliki keuntungan dapat ditentukan KHM dan KBM secara jelas, sedangkan kerugiannya adalah hanya dapat menguji satu mikroba uji dalam setiap cawan petri.Bakteri yang diamati praktikan pada praktikum ini adalah sebagai berikut.1. Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulatberdiameter 0,7-1,2 m, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teraturseperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidakbergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37 C, tetapimembentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25 C). Koloni padaperbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning keemasan, berbentuk bundar,halus, menonjol, dan berkilau. Lebih dari 90% isolat klinik menghasilkan S.aureus yang mempunyai kapsul polisakarida atau selaput tipis yang berperandalam virulensi bakteri (Jawetz et al., 1995 ; Novick et al., 2000)

Ilustrasi Bakteri Staphylococcus aureus

2. Eschericia ColiE. coli adalah adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif. berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 m, diameter 0,7 m, lebar 0,4-0,7m dan bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata. (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz et al., 1995). Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E. Coli tidak berbahaya, tetapi beberapa, seperti E. Coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia. E. Coli yang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K2, atau dengan mencegah bakteri lain di dalam usus (Anonim, 2011).Ilustrasi bakteri E.coliMinyak atsiri adalah suatu substansi alami yang telah dikenal memilikiaktivitas sebagai antibakteri. Bahkan minyak atsiri cengkeh telah digunakan sejaklama di berbagai rumah sakit Eropa untuk mengatasi infeksi Mycobacteriumtuberculosis (Yulliasri dkk., 2000). Minyak atsiri dapat menghambat beberapa jenis bakteri merugikan seperti Escherichia coli, Salmonella sp, Staphylococcus aureus,Klebsiella, dan Pasteurella (Agusta, 2000). Dilaporkan dalam berbagai penelitian bahwa minyak cengkeh adalah mengandung eugenol, ketika diuji pada beberapa jenis bakteri memiliki sifat antibakteri dan memperlihatkan penghambatan pada L. monocytogenes, Campylobacter jejuni, S.enteridis, E.coli dan S.aureus (Beuchat, 2000; Cressy et al., 2003; Smith-Palmer et al., 1998). Selanjutnya ditambahkan oleh Frosch et al., (2002) bahwa penelitian terbaru menunjukkan aktivitas antibakteri minyak cengkeh dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen : A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, P.melaninogenica, P. gingivalis, C. gingivaiis and F. nucleatum. Juga mampu menghambat pertumbuhan Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus. Dilaporkan oleh Smith et al.,(1998 dan 2001) bahwa minyak cengkeh efektif menghambat L. monocytogenes dan S. enteridis dalam TSB dan keju.

C. Alat dan BahanAlat: Cawan petri Tabung reaksi Mikropipet dan yellow tip Glass spreader Mikropipet dan tips Eppendorf Lampu spiritus Korek api

Bahan: Minyak atsiri : adas dan cengkeh Pelarut DMSO Media NA atau Mueller Hilton Mikroba (Staphlococcus aureus dan Eschericia coli)

D. Cara KerjaSampel uji (minyak atsiri kadar 205 v/v dalam DMSO) dibuat 6 kadar seri pengenceran kadar kelipatan secara aseptis

Disiapkan kontrol uji

Pembuatan kontrol uji dan pembuatan seri kadar dilakukan seperti pada P-6

Dari setiap seri pengenceran diambil 1 ml untuk kemudian ditambahkan 9 ml media agar Mueler Hinton di dalam petri, kemudia digoyang dan dibiarkan memadat. 1 cawan petri untuk 1 kadar

Didapat 1 seri 6 petri media yang sudah padat, kemudian dibagi media menjadi 2 bagian dengan cara menggaris bagian bawah cawan dengan spidol

Digoreskan 1 ose suspensi bakteri yang berbeda pada setiap bagian. Bakteri uji yang digunakan adalah E. Coli dan S. Aureus

Diinkubasi selama 24 jam

Diamati koloni bakterinya

E. Hasil PengamatanSeri kadar 1% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk koloni, keruhKoloni terbentuk paling sedikit pada seri kadar ini.

Seri kadar 0,5% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk koloni, keruh

Seri kadar 0,25% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk koloni, keruh

Seri kadar 0,125% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk koloni, keruh

Seri kadar 0,0625% SA: terbentuk koloni, keruhE.coli : terbentuk koloni, keruh

F. PembahasanTujuan praktikum ini adalah menentukan kadar hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji. Dalam praktikum ini, digunakan 1 macam ekstrak tumbuhan, yaitu minyak atsiri Langkah pertama adalah membuat larutan stok dari minyak atsiri sebanyak 50 l dalam metanol 500 l dan dimasukkan ke dalam eppendorf menggunakan mikropipet dan yellow tip. Minyak atsiri inilah yang memiliki aktivitas antimikroba atau fungistatik. Setelah itu diambil 30 l larutan stok tersebut dan diencerkan 1470 l akuades di dalam eppendorf kedua sehingga diperoleh sampel uji yang mengandung 1% v/v minyak atsiri. Lalu diambil 750 dari sampel uji 1% v/v minyak atsiri tersebut dan dimasukkan ke eppendorf ketiga sehingga diperoleh sampel uji yang mengandung 0,5% v/v minyak atsiri Dengan cara yang sama dibuat sampel uji yang mengandung; 0,25% ; 0,125% ; 0,0625% v/v minyak atsiri. Pada seri 0,0625% dibuang 750 l juga, sehingga menghasilkan suatu buangan, agar semua seri pengenceran memiliki volume yang sama yaitu 750 l. Setelah itu, atau bisa dilakukan sembari melakukan seri untuk menghemat waktu, dicairkan media agar NA dengan cara memanaskannya di atas kompor listrik. Setelah mencair, lalu ditunggu hingga suhunya sudah tidak terlalu tinggi dan cukup dingin. Setelah semuanya siap langkah berikutnya dilakukan di dalam LAF (Laminair Air Flow) secara aseptik. Lalu dibagi permukaan petri menjadi 2 bagian dengan menggaris bagian bawah petri dengan spidol untuk menguji 2 bakteri, yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Setelah itu, masing-masing eppendorf yang berisi hasil pengenceran minyak atsiri dituangkan seluruh volumenya ke masing- masing cawan petri yang totalnya berjumlah 5 cawan petri. Sebelum diisi seri pengenceran, masing-masing cawan petri diberi dulu media agar NA sebanyak 9 ml. Setelah semua media dalam cawan petri memadat, kemudian digoreskan suspensi bakteri uji yang berbeda untuk setiap bagian bakteri uji yang digunakan dalam larutan salin menggunakan ose yang dipanaskan dahulu mengguakan bunsen sampai merah membara untuk menghindari kontaminasi. Menggoreskan suspensi bakteri dilakukan dengan arah zig-zag agar mempermudah dalam mengetahui koloni bakteri yang akan diamati. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C yang merupakan suhu yang optimum untuk pertumbuhan bakteri.Setelah diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37C, cawan petri dikeluarkan dan diamati. Pada pengamatan, terlihat adanya permukan jernih dan keruh. Jika terdapat koloni bakteri (keruh) pada bagian yang digoreskan maka bakteri tersebut resisten terhadap sampel uji yaitu minyak atsiri dari cengkeh. Dan jika tidak terdapat koloni bakteri pada bagian yang digoreskan suspensi bakteri maka bakteri tersebut tepengaruh oleh adanya antibiotik pada sampel uji dan media.Hasil yang diperoleh adalah adanya koloni bakteri di masing-masing cawan petri. Dengan hasil kadar pengenceran 1% mempunyai koloni bakteri yang paling sedikit. Hal ini dapat menunjukkan minyak atsiri yang digunakan memberikan hasil negatif terhadap uji aktivitas antimikroba. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena minyak atsiri telah sudah lama dikenal memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Ketidaksesuain praktikum dengan teori dapat dikarenakan adanya ketidaktelitian dan ketidakcermatan praktikan dalam percobaan, seperti kesalahan jumlah pengambilan sampel dengan mikropipet, proporsi media NA yang lebih banyak sehingga kadar minyak atsiri menjadi sangat kecil dan sulit menunjukkan aktivitas antimikroba yang dimiliki, ataupun hal lain yang praktikan tidak sadari.G. Kesimpulan1. Uji aktivitas antimikroba pada praktikum ini menggunakan metode dilusi padat2. Metode dilusi padat memiliki keuntungan dapat menguji lebih dari satu mikroba uji dalam setiap cawan petri dan kelemahannya adalah sulit membedakan antara aktivitas penghambatan dan mematikan mikroba uji.3. Sampel antimiroba yang dipakai adalah minyak atsiri dan mikroba uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.4. Hasil menunjukkan minyak atsiri yang digunakan memberikan hasil negatif terhadap uji aktivitas antimikroba karena masih adanya koloni bakteri di masing-masing cawan petri.

H. Daftar PustakaBrander, G.C., Pugh, D.M., Baywater, R.J., and Jenkins, W.C., 1991. Veterinary Applied Pharmacology and Therapeutics 5th ed, The English Book Society and Baillere Tindal, London.Beuchat, L. R. 2000, Control of Foodborne Pathogens and Spoilage Microorganisms by Naturally Occurring Antimicrobials. In C. L.Wilson & S. Droby (Eds.), Microbial Food Contamination. Boca Raton, FL: CRC Press. pp. 149169Cressy, H. K., Jerrett, A. R., Osborne, C. M., & Bremer, P. J, 2003, A Novel Method for the Reduction of Numbers of Listeria Monocytogenes Cells by Freezing in Combination with an Essential Oil in Bacteriological Media, J. of Food Protection, 66, 390395.Frosch, P. J. , J.D. Johansen, T. Menn, C. Pirker, S.C. Rastogi, K.E, 2002, Essesnsial oil and antimicrobia review, Vol. 47(5): 279-287, Nov 2002.Ganiswara, 1995, Farmakologi dan Terapan Edisi IV, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta.Jamal, Yuliasri dan Agusta, 2000, Komposisi Kimia Minyak Atsiri Neolitsea cassia dan Nectandra angustifolia (Lauraceae), Prosiding Seminar PERHIPBA Pemanfaatan Obat Alami IIIJawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Brooks., J.S. Butel., dan L.N. Ornston. 1995. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20 (Alih bahasa : Nugroho & R.F.Maulany), Penerbit Buku Kedokteran EGC, JakartaPratiwi, 2008, Uji Aktivitas Anti Mikroba, http://etd.ugm.ac.id/index.php?, diakses pada tanggal 10 Mei 2015, pukul 8.15Setiabudy, R dan Gan, V.H.S. 1995, Farmakologi dan Terapi, Edisi Keempat, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.Smith-Palmer, A., Steward, J., & Fyfe, L, 1998, Antimicrobial Properties of Plant Essential Oil and Essences Against Five Important Food-borne Pathogen, Letters in Applied Microbiology (26) : 118122.Soekardjo, B., Hardjono, S., Sondakh, R., 2000, Kimia Medisinal, Edisi Kedua, Airlangga University Press, Surabaya.

Mengetahui,Yogyakarta, 16 Maret 2015Asisten Koreksi Praktikan