METODE DILUSI (PENGENCERAN) Paramita Koriston

(J111 14 517)

1. Pengertian dan fungsi media

Culture media atau media yang digunakan untuk pengkulturan yaitu formulasi

zat kimia yang kaya akan nutrisi yang dipersiapkan untuk menumbuhkan

mikroorganisme secara in vitro. Beberapa mikroorganisme dapat bertumbuh dengan

baik secara in vitro dengan nutrisi dari segala media umum; ada beberapa

mikroorganisme lain yang membutuhkan suatu media khusus, contohnya parasit yang

bersifat obligat tidak dapat bertumbuh pada media yang tidak hidup.1

Suatu media harus mengandung nutrisi, memiliki kelembaban dan pH yang

sesuai, memiliki suplai oksigen yang memadai, dan memiliki temperatur yang sesuai

untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan baik. Media diformulasi dan

dimodifikasi atau direvisi secara berkala dari makanan, air, tanah dan sampel klinis

untuk digunakan dalam proses isolasi, pengkulturan dan identifikasi mikroorganisme.1

2. Unsur yang terkandung dalam media

Berikut adalah unsur dari culture media2:

a. Pepton, yaitu campuran dari protein yang tercerna sebagian, mengandung asam

amino, polipeptida, fosfat, dan mineral (seperti kalium dan magnesium).

b. Meat extract, mengandung produk degradasi protein, garam anorganik,

karbohidrat dan subtansi yang diperlukan untuk stimulasi pertumbuhan sel-sel

hidup (seperti vitamin dan hormon).

c. Elektrolit, berupa natrium klorida.

d. Air, sebagai sumber hidrogen dan oksigen.

e. Agar, yaitu produk alami yang berasal dari rumput laut. Agar mengandung

karbohidrat, sebagian kecil material yang menyerupai protein, dan beberapa

macam garam anorganik. Agar tidak mengandung nutrisi dan hanya digunakan

sebagai bahan pemadat, digunakan dengan konsentrasi 2-3%. Bahan ini

meleleh pada suhu 95C dan memadat pada suhu 40C.

3. Klasifikasi media

Media terbagi menjadi beberapa jenis menurut beberapa kategori:

a. Klasifikasi menurut karakteristik fisiknya:

1) Media padat, digunakan untuk mengisolasi suatu bentukan murni dari

mikroorganisme.

2) Media cair, digunakan untuk mengkulturkan bakteri dalam kuantitas yang

besar untuk menyiapkan antigen atau vaksin.2

b. Klasifikasi menurut unsur yang terkandung dan kegunaanya:

1) Media sederhana, yaitu media yang paling sederhana dan secara rutin

digunakan dalam laboratorium. Contohnya yaitu nutrient broth dan nutrient

agar.

2) Media diperkaya, yaitu media yang mengandung protein alami, seperti

darah, serum, telur dan glukosa. Contohnya yaitu glucose broth, blood

agar, chocolate agar, dan Loefflers serum agar.

3) Media selektif, yaitu media yang hanya membantu pertumbuhan

mikroorganisme tertentu saja dan mengandung zat inhibitor bagi

mikroorganisme lain. Contohnya yaitu alkaline peptone water, blood

tellurite medium, deoxycholate agar dan Aronsons medium.

4) Media diferensial, yaitu media yang mengandung suatu subtansi yang dapat

mendiferensiasikan dua tipe bakteri dengan karakter berbeda. Contohnya

yaitu MacConkey agar.

5) Media indikator, yaitu media yang mengandung subtansi tertentu yang

menghasilkan perubahan warna pada koloni sebagai hasil dari aktivitas

metabolisme dari beberapa organisme. Contohnya yaitu sugar media,

MacConkey agar, dan Wilson and Blair medium.2

c. Klasifikasi menurut kebutuhan oksigen

1) Anaerobic culture media, yaitu media yang disiapkan untuk isolasi

organisme anaerob. Contohnya Robertsons cooked meat medium dan

thioglycollate broth.

2) Mycobacterial culture media, yaitu media yang khusus digunakan untuk

mengisolasi mycobacteria. Mycobacteria membutuhkan media khusus

karena merupakan organisme yang pertumbuhannya lambat dan kulturnya

harus diinkubasikan sekitar 6 minggu dalam suhu 37C. Jadi, media khusus

untuk mycobacteria dikembangkan untuk bertahan selama masa inkubasi

yang panjang. Contohnya Lowenstein-Jensen medium dan Middlebrooks

medium.2

4. Persiapan media

Bahan medium biasanya dilarutkan, dan kemudian disterilkan. Ketika agar

digunakan sebagai bahan pemadat, medium harus dipanaskan perlahan, biasanya

hingga mendidih, untuk melarutkan agar. Pada beberapa kasus dimana interaksi dengan

komponen, misalnya metal, dapat mengakibatkan penggumpalan medium, larutan

harus disiapkan dan disterilkan terpisah sebelum mencampurkan larutan dan

mempersiapkan medium.3 Berikut adalah beberapa metode sterilisasi yang berbeda:

a. Tyndallization

Panas uap air 100C selama 30 menit dapat membunuh sel bakteri vegetatif,

tetapi tidak dengan endosporanya. Metode ini dapat dilakukan dengan

menggunakan Arnold Sterilizer. Dengan mendinginkan medium dalam

inkubator setelah dipanaskan, maka endospora yang tersisa nantinya akan

berkecambah. Setelah itu, bakteri yang telah berkecambah dari endospore

tersebut dimatikan lagi dengan mengulang proses pemanasan tadi. Apabila

proses ini diulangi selama tiga hari, medium akan menjadi steril karena semua

endospore telah berkecambah dan kemudian dibunuh dengan pemanasan uap

air. Proses ini disebut Tyndallization, sesuai dengan nama penemunya, John

Tyndall.3

b. Inpissation

Inpissation adalah metode dimana medium dipaparkan dengan panas; ini

dilakukan pada material dengan protein tinggi, seperti media yang mengandung

telur, yang tidak dapat menahan panas pada proses autoclaving. Proses ini

menyebabkan pembekuan protein tanpa mengubah susunan kimianya. Metode

ini dapat dilakukan dengan beberapa prosedur berbeda: dengan Arnold

sterilizer atau dengan specialized inpissator. Medium dipanaskan dalam suhu

75-80C selama 2 jam secara berulang setiap harinya dalam 3 hari. Inpissation

dengan menggunakan autoclave dilakukan pada suhu 85-90C selama 10

menit, lalu temperatur dinaikkan menjadi 121C dengan hanya menggunakan

uap bertekanan, dan lalu perlahan suhu diturunkan hingga kurang dari 60C.3

c. Autoclaving

Autoclaving menggunakan uap air bertekanan, untuk membunuh

mikroorganisme. Pemanasan 15 menit pada tekanan 15 psi dan suhu 121C

adalah metode yang paling umum digunakan. Metode ini dpat membunuh sel

bakteri sekaligus endosporanya. Bagaimana pun, beberapa subtansi media tidak

dapat menoleransi panas tersebut, sehingga terkadang metode ini dilakukan

dengan suhu yang lebih rendah. Media yang mengandung karbohidrat biasanya

disterilisasi pada suhu 116-118C untuk mencegah dekomposisi karbohidrat

dan pembentukan zat toksik yang dapat menghambat perkembangan bakteri.3

d. Metode Filtrasi

Filtrasi adalah metode yang umum digunakan untuk mensterilkan komponen

yang tidak tahan panas (mengalami perubahan susunan kimia apabila terekspos

panas berlebih). Media cair dialirkan melalui kaca sinter atau membran yang

terbuat dari selulosa asetat atau nitroselulosa, dengan ukuran pori yang kecil.

Membran dengan ukuran pori 0.2 mm akan menjebak sel bakteri, sehingga

sering disebut sebagai filter bakteriologis. Dengan mencegah lewatnya bakteri,

filtrasi membuat cairan bebas dari bakteri dan mikroorganisme eukariotik, atau

bebas dari organisme, sehingga disebut steril. Banyak larutan karbohidrat,

larutan antibiotik dan larutan vitamin disterilkan dengan filter dan ditambahkan

ke media yang sudah didinginkan pada temperatur di bawah 50C.3

5. Metode isolasi dengan pengenceran bersambung

Beberapa metode diketahui dapat mengisolasi dan memperbanyak jumlah

mikroorganisme (bakteri, fungi, protozoa, alga, mycoplasma dan virus) dengan

menggunakan tanah, makanan, susu, air, dan lain-lain. Metode pengenceran

bersambung adalah salah satu prosedur yang paling umum digunakan untuk

mengisolasi jamur, bakteri dan actinomycetes. Prinsip dasar dari metode ini yaitu

ketika sampel cair yang mengandung mikroorganisme dikulturkan, masing-masing

mikroorganisme yang bertahan hidup akan berkembang menjadi suatu koloni, sehingga

jumlah dari koloni yang muncul di atas wadah (atau cawan petri) mewakili jumlah dari

organisme yang ada di dalam sampel.1

Dalam metode ini, sejumlah material yang diketahui banyaknya (10 ml atau 10

gram) dicampurkan dengan sejumlah air suling steril (90 ml untuk mendapatkan larutan

100 ml) untuk mendapatkan suspensi mikroba. Pengenceran bersambung 10-2, 10-3, 10-

7, dan seterusnya dibuat dengan memindahkan (dengan pipet) sejumlah volume terukur

(umumnya 1 atau 10 ml) ke dalam air suling steril (9 atau 90 ml). Terakhir, 1 ml dari

tiap-tiap larutan yang telah diencerkan ditambahkan ke dalam cawan petri dimana

kemudian dituangkan 25 ml agar steril yang masih cair (45C). Media yang digunakan

yaitu NA (nutrient agar) untuk bakteri, Saborauds agar atau Czapeks Dox agar untuk

fungi, Glycerol yeast agar untuk actinomycetes dan Wort agar untuk ragi. Umumnya,

pengenceran 10-2 hingga 10-5 dipilih untuk memperbanyak jumlah fungi, 10-3 hingga

10-6 untuk actinomycetes dan 10-4 hingga 10-7 untuk bakteria tergantung proporsinya.

Setelah agar mengeras, cawan petri kemudian diinkubasikan dalam posisi terbalik

selama 3-7 hari pada suhu yang diinginkan (28-37C). Jumlah koloni yang muncul

pada cawan petri dihitung, dirata-ratakan dan dikalikan dengan faktor pengenceran

untuk mendapatkan jumlah sel/spora atau cfu (colony per unit) per gram atau mililiter

dari sampel.1

Daftar Pustaka

1. Kango N. Textbook of microbiology. New Delhi: I.K. International Publishing

House; 2010. P.154,160.

2. Vasanthakumari R. Textbook of microbiology. New Delhi: BI Publications; 2007.

P.32-35.

3. Atlas RM. Handbook of microbiological media. 4th Ed. Boca Raton: Taylor and

Francis Group; 2010. P.8-9.