25

5 BAB 4

5 METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah True Experimental-Post test

only Control Group Design dengan menggunakan rancangan penelitian

eksperimental laboratorik secara in vitro dengan menggunakan metode

dilusi tabung (Tube Dilution Test) sehingga diketahui efek antifungi

ekstrak rimpang kencur terhadap Malassezia furfur. Metode dilusi tabung

meliputi tahap pengujian bahan pada media SDB (Sabouraud Dextrose

Broth) dan tahap uji streaking pada SDA (Sabouraud Dextrose Agar)

dengan olive oil.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada 15-21 Mei 2018.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah jamur M. furfur biakan

murni diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran Universitas Diponegoro.

4.3.2 Sampel Penelitian

Sampel dalam penelitian ini adalah jamur M. furfur yang

diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling.

26

4.3.3 Estimasi dan Jumlah Pengulangan

Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak

rimpang kencur dan 2 kelompok kontrol, sehingga ada 10

kelompok. Berdasarkan rumus Faderer (1991) dengan p adalah

jumlah kelompok dan n adalah jumlah pengulangan, maka:

(p-1) (n-1) ≥ 15

(10-1) (n-1) ≥ 15

9 (n-1) ≥ 15

9n-9 ≥ 15

n ≥ (15+9)/9

n ≥ 2,67 3 (pembulatan)

Keterangan :

p = jumlah kelompok total

n = jumlah pengulangan tiap kelompok

Dari hasil perhitungan diatas, maka diperlukan tiga kali pengulangan

untuk sampel.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak rimpang

kencur dalam konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%,

1,56%, 0,78%, 0,39% dan 0%.

27

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah jumlah

koloni M. furfur pada Sabouraud Dekstrosa Agar (SDA) setelah

diberi ekstrak rimpang kencur dalam berbagai konsentrasi.

4.5 Definisi Operasional

No. Variabel Definisi Operasional Cara

Pengukuran

Indikator

penilaian

Skala

Variabel Bebas

1. Ekstrak

rimpang

kencur

(Kaempferia

galanga L.)

Ekstrak rimpang kencur

adalah rimpang kencur

yang telah dideterminasi

di Materia Medica yang

dikeringkan kemudian

diekstraksi dan

dimaserasi dengan

larutan etanol 96 % dan

diambil filtratnya dengan

penyaring kemudian

diuapkan dalam rotary

evaporator sehingga

menghasilkan ekstrak

rimpang kencur.

Ekstrak

rimpang

kencur diukur

menggunakan

mikro pipet

sesuai dengan

konsentrasi

pada pada

setiap tabung.

Konsentrasi:

1. 0 %

2. 0,39 %

3. 0,78%,

4. 1,56%,

5. 3,125%,

6. 6,25%,

7. 12,5%,

8. 25%,

9. 50%,

10. 100%.

Kategorik

(Ordinal)

Variabel Tergantung

2. KHM (Kadar

Hambat

Minimum)

Konsentrasi ekstrak

Kaempferia galanga L.

terendah yang mampu

menghambat

pertumbuhan jamur M.

furfur yang ditandai

dengan kejernihan dalam

tabung.

Membandingk

an kejernihan

setiap tabung

dengan

kontrol negatif

dengan latar

belakang

kertas putih.

a. Jernih

b. Tidak

jernih

(keruh)

Kategorik

(Nominal)

3. KBM (Kadar

Bunuh

Minimum)

Kadar terkecil ekstrak

rimpang kencur

(Kaempferia galanga L.)

yang mampu membunuh

99,9% jamur dari

goresan hasil dilusi cair

pada SDA.

Penghitungan

dengan

Colony

Counter.

Jumlah koloni

jamur

Numerik

(Rasio)

28

4.6 Alat dan Bahan Penelitian

4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Rimpang Kencur Kaempferia

galanga L.

1. Alat

a. Pisau

b. Blender

c. Kain saring

d. Timbangan digital

e. Gelas erlenmeyer

f. Evaporator

g. Labu evaporasi

h. Water bath

i. Pendingin spiral

j. Vacum

k. Water pump

l. Bak untuk menampung aquades

m. Selang plastik

n. Cawan

o. Oven

2. Bahan

a. Rimpang kencur (Kaempferia galanga L.)

b. Etanol 96%

c. Aquadest

29

4.6.2 Alat dan Bahan Uji Kepekaan Ekstrak Kaempferia galanga L.

1. Alat

a. Tabung reaksi steril

b. Mikropipet 1 ml

c. Lampu spirtus

d. Vortex

e. Colony counter

f. Ose Lengkung

g. Label

h. Inkubator

i. Spektrofotometer

2. Bahan

a. Perbenihan cair jamur Malassezia furfur

b. Ekstrak rimpang kencur

c. Sabouraud Dextrose Broth (SDB)

d. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

e. Olive oil

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dengan cara:

a. Mencuci semua peralatan dengan sabun hingga bersih dan

membiarkannya hingga kering.

b. Alat-alat yang dapat disterilkan dalam autoklaf dibungkus

dengan kertas sampul dan dimasukan dalam autoklaf pada

30

suhu 121oC dengan tekanan 15 atm selama 15 menit.

Sedang alat yang tidak dapat disterilkan dengan autoklaf

disterilkan dengan alkohol 70% selama 20 menit.

4.7.2 Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dengan olive

oil

a. Menimbang SDA sebanyak 39 gram dan 0,6 ml olive oil,

lalu ditambahkan aquades sebanyak 600 ml.

b. SDA direbus dengan suhu 200°C sampai tercampur lalu

disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 15 atm pada suhu

121°C 15 menit.

c. SDA yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam masing-

masing cawan petri sebanyak 20 ml (Setyarini dan

Krisnansari, 2011; Tiwari et al., 2011).

4.7.3 Pembuatan Media Sabouraud Dextrose Broth (SDB) dengan olive

oil

a. Timbang bahan sebanyak kebutuhan, lalu tambahkan

aquades dan olive oil sesuai kebutuhan dan diaduk secara

merata.

b. SDB direbus sampai tercampur rata.

c. SDB yang sudah direbus disterilisasi dalam autoklaf pada

suhu 121°C selama 15 menit.

d. SDB yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam masing-

masing tabung (Sharma et al., 2012).

31

4.7.4 Pembuatan Perbenihan Cair

Pembuatan perbenihan cair jamur M. furfur memerlukan

kepadatan 106 CFU/ml sebagai syarat Dilusi Tabung. Caranya

adalah dengan menggunakan 0,5 McFarland Standard yang

diencerkan 100 kali (Tiwari et al., 2011).

4.7.5 Pembuatan Ekstrak Kaempferia galanga L.

a. Rimpang kencur dicuci bersih kemudian dikupas kulitnya dan

dipotong dengan ketebalan 2-5 mm.

b. Potongan rimpang kencur dimasukkan ke dalam oven hingga

kering atau kadar air ≤ 10% pada suhu 40 - 50°C.

c. Rimpang kencur yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan

dengan blender hingga menjadi seperti serbuk kemudian

ditimbang sebagai sampel kering.

d. Sampel kering yang berupa serbuk rimpang kencur yang telah

ditimbang dimasukkan ke dalam gelas erlenmeyer.

e. Direndam dengan larutan etanol 96% dengan 3 kali

penggantian selama 3 hari.

f. Ekstrak cair yang telah dikumpulkan diuapkan dengan rotary

evaporator pada suhu 40-50ºC.

g. Kemudian maserat dipanaskan di atas water bath pada suhu

tidak lebih dari 50ºC dengan tujuan untuk mendapatkan

ekstrak kental (Riasari et al., 2016).

32

4.7.6 Uji Kepekaan Ekstrak Rimpang Kencur Terhadap M. furfur

Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi

tabung. Pada penelitian ini beberapa macam konsentrasi ekstrak

Kaempferia galanga L. diinokulasi dengan perbenihan cair jamur

M. furfur. Proses selanjutnya diinkubasikan selama 72 jam pada

suhu 37ºC dengan cara sebagai berikut:

Hari ke-1 :

a. Sediakan 10 tabung; beri nama sesuai nomor urut. Masukkan 1

ml Sabouraud Dextrose Broth (SDB) pada tabung 3 s.d. 9 dan

2 ml ekstrak Kaempferia galanga L. pada tabung 1 serta 2 ml

jamur pada tabung 10.

Gambar 4.1

Penuangan SDB dan Pengisian Tabung Kontrol

b. Masukkan masing-masing 1 ml ekstrak ke dalam tabung 2 dan

3.

Gambar 4.2

Memasukkan 1 ml Ekstrak Ke Tabung 2 dan Tabung 3

33

Konsentrasi ekstrak rimpang kencur

Tabung 2 1 ml (100%)

Tabung 3 2 ml (50%)

c. Campurlah hingga rata larutan broth dengan ekstrak

Kaempferia galanga L. pada tabung 3, kemudian pindahkan 1

ml ke dalam tabung 4.

Gambar 4.3

Memindahkan 1 ml Larutan Ke Tabung Selanjutnya

Konsentrasi ekstrak rimpang kencur

Tabung 3 1 ml (50%)

Tabung 4 2 ml (25%)

d. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8 dan 9.

e. Pada tabung 9 setelah larutan tercampur rata dibuang 1 ml.

f. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antijamur dari

masing-masing tabung adalah:

Gambar 4.4

Konsentrasi Awal Ekstrak Kaempferia galanga L.

34

g. Setelah itu tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair

jamur 1 ml.

h. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2

ml sehingga konsentrasi akhir antijamur berubah seperti

gambar berikut ini:

Gambar 4.5

Konsentrasi Akhir Masing-Masing Tabung

Kemudian semua tabung diinkubasikan ke dalam inkubator

pada suhu 37ºC selama 72 jam.

Pada hari ke-4 tabung dikeluarkan dari inkubator, akan

didapatkan KHM dengan cara melihat kejernihan tabung,

kemudian dari masing-masing tabung diambil 1 ose dan

diinokulasikan atau digoreskan pada medium agar Sabouraud

Dextrose Agar. Lalu diinkubasikan lagi 72 jam pada suhu 37oC.

Pada hari ke-7 Sabouraud Dextrose Agar dikeluarkan dari

inkubator kemudian dilakukan pengamatan kuantitatif pada

masing-masing konsentrasi dengan cara menghitung jumlah koloni

jamur dengan colony counter sehingga didapatkan data KBM

(Kumala, 2009; Shams-Ghahfarokhi et al., 2006). Pengamatan

dilakukan oleh peneliti dan dikonfirmasi oleh analis laboratorium.

35

4.8 Skema Alur Penelitian

Mengamati kekeruhan tabung untuk menentukan KHM

Penghitungan jumlah koloni jamur (KBM)

Analisis hasil

Pembuatan ekstrak rimpang

kencur (Kaempferia galanga L.)

Pengisian tabung kontrol (tabung 1 dan 10) dan pengenceran ekstrak rimpang

kencur (Kaempferia galanga L.) dan SDB dalam tabung 2-9 dengan

konsentrasi 100 %, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56% dan 0,78%

masing-masing 1 ml

Penambahan 1 ml jamur pada tabung 2-9 sehingga konsentrasi menjadi 50%,

25%,12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, dan 0,39% dengan volume 2 ml

Inkubasi selama 72 jam dengan suhu 37°C

Penggoresan pada SDA

Inkubasi selama 72 jam dengan suhu 37°C

Gambar 4.6

Alur Kerja Metode Dilusi Tabung

36

4.9 Analisis Data

Analisis data dimulai dengan uji parametrik, yaitu uji normalitas

menggunakan uji Shapiro-wilk karena jumlah sampel yang digunakan

kurang dari 50 dan uji homogenitas menggunakan uji Levene.

Apabila data terdistribusi normal dan varian data sama yaitu jika hasil

uji menunjukkan p>0,05, maka dilanjutkan dengan uji one way ANOVA.

Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan yang bermakna

antara kelompok perlakuan. Untuk mengetahui perbedaan yang bermakna

antara masing-masing kelompok dilakukan uji Post-Hoc Bonferroni apabila

sampel homogen. Apabila sampel tidak homogen menggunakan uji Post-

Hoc Tamhane.

Apabila data terdistribusi tidak normal dan varian data tidak sama,

maka menggunakan uji Kruskal-wallis kemudian dilanjutkan dengan uji

Post-Hoc Mann-Whitney.

Setelah itu, analisis data dilanjutkan dengan uji regresi linier dengan

tujuan untuk melihat mulai dosis berapa ekstrak rimpang kencur

memberikan efek antifungi terhadap jumlah koloni M. furfur yang tumbuh

pada SDA.