FARMASI – UHAMKA2013

Priyo Wahyudi

Kuliah 14UJI POTENSI ANTIMIKROBA

UJI POTENSI ANTIMIKROBA

• Metode Difusi Agar• Metode Dilusi

Mengapa Antimikroba perlu ditentukan Potensinya ?

• Penggunaan antimikroba yg meningkat kadarnya, menyebabkan meningkat pula resistensi berbagai mikroba patogen terhadapnya

• Efektivitas antimikroba sangat tergantung pada kadar dan kekuatan zat aktifnya

• Kadar jumlah per satuan berat/volume• Potensi ukuran kekuatan atau daya bunuh zat aktif

terhadap mikroba • Respons mikroba thd antimikroba berbeda-beda,

umumnya bersifat SPESIFIK dan SENSITIF

Prinsip Uji Potensi Antimikroba(berdasar FI IV 1995)

• Estimasi potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik dan umum digunakan sebagai rujukan

• Tujuan: sebagai standar utk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas (potensi) antibiotik terhadap mikroba

Potensi Antimikroba

• Potensi Antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg (iu=international unit) atau µg/mg

• Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi merupakan metode penetapan pada sistem hayati (mikroorganisme)

• Dilakukan pada :– HILIR : Pemantauan Potensi Antibiotik terhadap mikroba

Uji / Terjadinya Resistensi antibiotik pada mikroba– HULU : Penemuan zat aktif antibiotik baru

Potensi Antimikroba

• Prinsip : membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap percobaan dalam kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji

• Baku standar : zat/senyawa yg sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya

• Mikroba yang digunakan adalah mikroorganisme yang diketahui kemurnian dan susceptibilitasnya

Potensi Antimikroba

• Cara analisis :– Metode difusi agar (lempeng)– Metode dilusi (Turbidimetri)

• Respon yang diamati :– Efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang

ditentukan oleh daerah bening (inhibition zone) di sekeliling zat uji (cara difusi)

– Kekeruhan (turbiditas) yg ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba dalam medium cair (cara turbidimetri) menggunakan tabung reaksi dan spektrofotometer

METODE DIFUSI AGAR & TURBIDIMETRI

1. DIFUSI AGAR• Prinsip : zat antimikroba yang akan diuji berdifusi

dari reservoir ke dalam medium agar yg telah diinokulasi dengan mikroba uji.

• Inkubasi selama waktu tertentu, kemudian diamati adanya hambatan pertumbuhan mikroba uji dan diukur diameter hambatannya

• Diameter hambatan yang terbentuk dibandingkan dengan diameter baku standar

2. CARA TURBIDIMETRI• Digunakan media cair, hambatan pertumbuhan

mikroba uji diukur dengan menentukan kekeruhan (turbiditas) larutan dengan spektrofotometer

Bahan untuk Uji Potensi Antimikroba

Bahan-bahan yang diperlukan dalam uji potensi antibiotik:• Mikroba uji• Baku pembanding biologis• Media pertumbuhan• Larutan dapar (penyangga)

Mikroba / Inokula Uji

• Mikroba uji harus berasal dari galur murni, dapat memberikan respon yg bertingkat antara peningkatan konsentrasi dgn peningkatan daerah hambatannya.

• Mikroba uji utk jenis antibiotik tertera pada Tabel FI IV, dipelihara pada agar miring dan diremajakan setiap minggu

• Untuk cara difusi, daerah hambatan yg terbentuk harus jelas dan mudah diukur.

• Untuk penetapan cara tabung, perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas

Penyiapan Inokula

• Inokula diperbanyak dalam media cair, inkubasi dilakukan selama 24 jam hingga transmitan suspensi inokula 25% blanko

• Ukuran inokula juga dapat dinyatakan sesuai dengan prosedur uji potensi antibiotika untuk jenis bakteri tertentu berdasar skala McFarland

• Skala McFarland adalah standard yang digunakan sebagai referensi utk menentukan kekeruhan suspensi inokula uji, sehingga jumlah inokula sesuai dengan kisaran yang dipersyaratkan

Skala McFarland

• Standard McFarland awalnya dibuat dengan mencampurkan jumlah tertentu BaCl dengan H2SO4. campuran keduanya akan menyebentuk barium sulfat yang tersuspensi, sehingga menyebabkan kekeruhan

• Saat ini standard McFarland dibuat dari suspensi partikel latex yg lebih awet dan stabil.

• Standard diperbandingkan secara visual dengan suspensi inokula yang ditumbuhkan pada nutrient broth. Jika suspensi inokula terlalu keruh, maka dilakukan penambahan larutan media. Jika suspensi inokula kurang keruh, maka dapat ditambahkan suspensi bakteri

Skala McFarlandMcFarland Standard No. 0.5 1 2 3 4

1.0% Barium chloride (ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.41.0% Sulfuric acid (ml) 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6

Approx. cell density (1X10^8 CFU/mL) 1.5 3.0 6.0 9.0 12.0

% Transmittance* 74.3 55.6 35.6 26.4 21.5Absorbance* 0.132 0.257 0.451 0.582 0.669

Panjang gelombang 600 nm

MacFarland 0.5 & Suspensi Inokula

18

Baku Pembanding (Biological Reference)

• Baku pembanding (biological reference) ; Digunakan antibiotik yg telah diketahui kemurnian dan potensinya secara pasti. Baku pembanding ini direkomendasikan oleh WHO dan di Indonesia seperti BPOM, SPI, SPN, SBL (S=standar, B=baku, P=pembanding, L=lab, I=intern)

Media Pertumbuhan

Media yang digunakan harus mendukung pertumbuhan mikroba uji dgn baik, tidak boleh mengandung zat yg bersifat antagonis ataupun yg mempengaruhi aktivitas antimikroba dari antibiotik yg diperiksa

Larutan Dapar

Digunakan untuk melarutkan antibiotik yang akan diperiksa baik baku pembanding maupun sampel uji. Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yabg akan diuji.

Metode difusi agar

• Metode analisis potensi antibiotik secara difusi agar merupakan cara yang sederhana dan hasil yg diperoleh cukup teliti.

• Cara ini mrp cara terpilih dan direkomendasikan oleh International Collabotrative Study di Swedia dan FDA di AS untuk pengujian mutu antibiotik

• Prinsip penetapannya yaitu mengukur luas hambatan pertumbuhan mikroba uji yg disebabkan oleh zat baku standar dan zat yg di uji

• Dlm range konsentrasi tt terdapat hub yg linear antara peningkatan konsentarsi dgn luas daerah hambatan pertumbuhan mikroba uji

Faktor yang mempengaruhi luas daerah hambatan dengan cara difusi agar

• Ingredien / komposisi medium pertumbuhan• Pemilihan medium pertumbuhan • Pengaruh pH• Ukuran inokulum• Stabilitas mikroba uji• Aktivitas antibiotika• Waktu inkubasi

Ingredien medium pertumbuhan

• Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi pertumbuhan mo adalh ; pepton, tripton, ekstrak ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)

• NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida dan menahan aktivitas ferosidin

• KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin atau ampisilin

Pemilihan medium

• Diperlukan persiapan medium yg cocok bagi pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata pada medium agar

• Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan oleh aktivitas antibiotik yg tergantung pada pH medium. Misalnya aktivitas aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin dalam suasana basa

• Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH 0,1N

Ukuran inokulum

• Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.

• Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum semakin besar kandungan mikroorganismenya.

• Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan mikroorganismenya homogen, misal 1-10%

• Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan terjadinya penumpukan pada tempat tt

Stabilitas mikroba uji

Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya.

Aktivitas antibiotik

Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat minimum (KHM) dari antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian larutan antibiotik ke dalam medium agar

Waktu Inkubasi

Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal, sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk pengukuran zona bening yang muncul sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya antara 18-24 jam

Reservoir

• Resevoir pada Teknik difusi agar dapat berupa:– Silinder gelas / logam– Cakram kertas (paper disc)– Cetak lobang (punched holes)

• Cakram : tempat meletakkan sampel antimikroba yang akan diuji potensinya pada medium agar yang telah memadat

Uji Difusi Agar

The standard procedure that assesses antimicrobial activity is called the Kirby–Bauer method (Figure 24.8).

• Agar media are inoculated by evenly spreading a defined density of a suspension of the pure culture on the agar surface. Filter paper disks containing a defined quantity of the antimicrobial agents are then placed on the inoculated agar.

• After a specified period of incubation, the diameter of the inhibition zone around each disk is measured. Table 24.4 presents zone sizes for several antibiotics.

• Antibiograms are periodic reports that indicate the susceptibility of clinically isolated organisms to the antibiotics in current local use.

Select colonies

Prepare inoculumsuspension

Mix well

Standardize inoculumsuspension

Swab plate

Remove sample

Add disks

Incubate overnight

Measure Zones

Transmitted Light Reflected Light

Tube dilution tests• A series of culture tubes are prepared, each containing a

liquid medium and a different concentration of a chemotherapeutic agent. The tubes are then inoculated with the test organism and incubated for 16-20 hours at 35C. After incubation, the tubes are examined for turbidity (growth).

• Minimum Inhibitory Concentration (MIC): Is the lowest concentration of chemotherapeutic agent capable of preventing growth of the test organism.

• Minimum Bactericidal Concentration (MBC): Is the lowest concentration of the chemotherapeutic agent that results in no growth (turbidity) of the subcultures.

MIC

• Minimal inhibitory concentration• The lowest concentration of antimicrobial

agent that inhibits the growth of a bacterium• Interpret:– Susceptible– Intermediate– Resistant

Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) Antimikroba

• Metode Dilusi Cair• Medium cair ditambahkan zat antimikroba dengan

konsentrasi separuhnya (2 fold serially diluted antibiotic solutions) yang diinokulasi mikroba uji

• Setelah inkubasi, KHM diperoleh dari medium pertama yg menunjukkan terjadinya penghambatan pertumbuhan mikroba uji

• Mikroba yang resistan, akan mempunyai KHM tinggi

• If the bacteria removed from the drug can grow on drug free medium at highest concentrations, the drug is known to have bacteristatic action

• If the bacteria removed from the drug can not grow on drug free medium at most concentrations, the drug is known to have bactericidal action. One tube difference is allowed in this test

Microdilution MIC tray

Prepare inoculumsuspension

Dilute & mix inoculum suspension

Pour inoculum into reservoir and

inoculate MIC tray

Inoculate purity plate

Incubate overnight

Read MICs

Reflected light Transmitted light

Examining purity plate

Optimal Use of Purity Plates

• Sub final test suspension to non-selective medium (after inoculating MIC test)

• Streak for isolation (avoid several specimens per plate - may not reveal contaminants if no isolated colonies)

• Examine before reading MIC (usually at 16-20 h)

• Re-incubate if antibiogram questionable

Microbroth Dilution Method– Microdilution plates: • “Microdilution/ Microbroth

dilutions”• 96 wells/ plate: simultaneously

performed with many tests organisms/ specimens, less reagent required

- +

643216

8 4

2 1

>64

0.5

>64

Epsilo-meter test

• It’s a new technique for direct detection of MIC, a graduated increasing concentration of the antibiotic is fixed along a rectangular plastic test strip which is applied to the surface of an inoculated agar plate, after over night incubation a tear drop shaped inhibition zone is seen.

• The zone edge intersect the graded test strip at the MIC of the antimicrobial.

E Test

E Test

S. pneumoniae Penicillin MIC = 3 g/ml

Uji Antifungi Filamentous

• Teknik Gores Silang

Cawan Petri

Kertas filter mengandung antibiotik uji

Goresan silang Fungi Uji

Zona hambat pertumbuhan fungi

Koloni Fungi Uji