UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Validasi Metode Analisis ...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat dalam

Plasma secara In Vitro menggunakan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT)

SKRIPSI

ANI KURNIAWATI

1112102000042

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN


JULI 2016


Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat dalam

Plasma secara In Vitro menggunakan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ANI KURNIAWATI

1112102000042

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN


JULI 2016

v

ABSTRAK

Nama : Ani Kurniawati

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat

dalam Plasma secara In Vitro Menggunakan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu metabolit sekunder yang

terdapat pada tanaman kencur (Kaempferia galanga. L) dari family Zingiberaceae.

Senyawa ini memiliki aktivitas farmakologinya sebagai antiinflamasi dan

analgesik. Tujuan penelitian ini adalah memperoleh optimasi kondisi analisis dan

metode yang tervalidasi untuk analisis EPMS dalam plasma secara in vitro

menggunakan KCKT dengan Diode Array Detector (DAD). EPMS diekstraksi

dari plasma dengan metode pengendapan protein menggunakan metanol. Metanol

dimasukkan ke dalam plasma dengan perbandingan 4:1 kemudian divortex selama

20 detik, dan disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Analisis

dilakukan dengan isokratik pada kolom C18 fase terbalik Acclaim®

Polar

Advantage II (4,6 x 150 mm, 3µm) dan fase gerak metanol-aquabidestilata

(60:40v/v) pada laju alir 1,0 mL/menit. Deteksi dilakukan pada panjang

gelombang 308 nm dan volume penyuntikan 20 µL. Pada rentang konsentrasi

2,02-40,4 µg/mL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier dengan koefesien korelasi

(r) sebesar 0,9989. Nilai %diff akurasi metode ini berada diantara -12,4507% dan

10,5212% dengan nilai presisi (KV) antara 0,1417% dan 7,5913% serta uji

perolehan kembali antara 87,5493% dan 110,5212%.

Kata kunci: Etil p-metoksisinamat, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

pengendapan protein, validasi metode.

vi

ABSTRACT

Name : Ani Kurniawati

Programme Study : Farmasi

Title : Analytical Method Validation of Ethyl P-

methoxycinnamate Plasma In Vitro using High

Performance Liquid Chromatography

Ethyl p-metoxycinnamate (EPMC) is one of secondery metabolite which is found

in kencur (Kampferia galangal Linn) family Zingiberaceae. These compounds

have biological activity as anti-inflammatory and analgetic. The aim of this study

was to obtin the optimum conditions and validated methods for analysis of EPMC

in plasma in vitro. The method of analysis using High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) with Diode Array Detector. EPMC was extracted from

plasma by protein deproteination method using methanol. A mixture of plasma

and methanol (1:4 (v/v)) is shaked with vortex for 20 seconds and centrifuged on

3000 rpm for 10 minutes. The analysis was done by using isocratic technique on

reverse phase C18 column Acclaim®

Polar Advantage II (4,6 x 150 mm, 3µm) and

mobile phase consisted methanol-aquabidest (60:40v/v) at flow rate of 1,0

mL/min. Samples were detected at a wavelength of 308 nm and injection volume

is 20 µL. Linierity was established for range concentration of 2,02-40,4 µg/mL

with correlation (r) of 0,9989. Accuracy (%diff) of this method is between -

12,4507% to 10,5212% with precision between 0,1417% to 7,5913% and test

relative recovery between 87,5493% to 110,5212%.

Keywords: Ethyl p-metoxycinnamate, High Performance Liquid Chromatography.

protein deproteination, method validation.

\

vii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur senantiasa penulis panjatkan kehadirat

Allah SWT, karena berkat rahmat dan hidayah-Nya yang telah dilimpahkan serta

segala anugerah-Nya yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan

skripsi ini. Salawat serta salam senantiasa penulis curahkan kepada Nabi

Muhammdad SAW, keluarga, sahabat, dan para pengikutnya. Skripsi ini berjudul

Validasi Metode Analisis Etil p-metoksisinamat dalam plasma secara In Vitro

menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang telah diajukan sebagai

persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi Program Studi Farmasi

FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Dalam penyelesaian skripsi ini, penulis mendapatkan bantuan dari

berbagai pihak berupa ilmu pengetahuan, pengarahan, semangat, bantuan materi,

dan motivasi. Oleh karena itu, dengan tulus penulis ingin mengucapkan banyak

terimakasih kepada nama-nama yang telah terlulis dibawah ini, semoga Allah

senantiasa melimpahkan rahmat dan karunia-Nya kepada:

1. Bapak Supandi, M.Si., Apt selaku Pembimbing I dan Ibu Zilhadia,

M.Si., Apt selaku Pembimbing II yang telah meluangkan waktunya

untuk memberikan bimbingan, saran, bantuan dan dukungan kepada

penulis serta kesabaran dan kepercayaanya selama penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

2. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan banyak motivasi dan

bantuan.

3. Ibu Dr.Nurmeilis, M.si.,Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi

Falkutas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta.

4. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi Falkutas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif hidayatullah Jakarta.

x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i

HALAMAN PERSYARATAN ORISINILITAS .............................................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iv

ABSTRAK ........................................................................................................... v

ABSTRACT ......................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ......................................................................................... vii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................... ix

DAFTAR ISI ....................................................................................................... x

DAFTAR TABEL…………………………………………………………….. xiii

DAFTAR GAMBAR………………………………………………………….. xiv

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………….. xvi

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 LatarBelakang .................................................................................... 1

1.2 PerumusanMasalah ............................................................................ 2

1.3 TujuanPenelitian ................................................................................ 3

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................. 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 4

2. 1. Etil p-metoksisinamat...................................................................... 4

2. 2. Plasma ............................................................................................ 5

2. 3. Analisis Obat dalam Plasma............................................................. 6

2. 4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ................................................... 8

2.4.1 Pendahuluan………………………………………………….8

2.4.2 Keuntungan KCKT…………………………………………..9

2.4.3 Cara Kerja .............................................................................. 9

2.4.4 Instrumentasi KCKT ............................................................... 10

2.4.4.1Wadah Fase Gerak pada KCKT .................................. 11

2.4.4.2 Fase Gerak KCKT ....................................................... 11

2.4.4.3 Pompa pada KCKT ..................................................... 12

xi

2.4.4.4 Penyuntikan (injector) sampel pada KCKT ................ 12

2.4.4.5 Kolom pada KCKT ..................................................... 12

2.4.4.6 Fase Diam KCKT ........................................................ 13

2.4.4.7 Detektor KCKT ........................................................... 14

2.4.4.8 Intergrator .................................................................... 16

2.4.5 Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi .......................... 16

2.4.6 Analasis Kuantitatif ................................................................. 16

2.4.6.1 Metode Baku Eksternal ............................................... 16

2.4.6.2 Metode Baku Internal .................................................. 17

2.4.6.3 Metode Presentase Tinggi/Lebar Puncak atau

Metode Normalisasi Internal ....................................... 17

2. 5. Validasi Metode Analisis ................................................................. 18

2.5.1 Ketepatan (Akurasi) ................................................................ 19

2.5.2 Presisi ...................................................................................... 20

2.5.3 Perolehan Kembali (%Recovery) ............................................ 20

2.5.4 Kurva Kalibrasi ....................................................................... 21

2.5.4.1 Linieritas ..................................................................... 21

2.5.4.2 Batas Deteksi (limit of detection, LOD) ...................... 21

2.5.4.3 Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ) ...... 22

2.5.5 Selektivitas .............................................................................. 22

2.5.6 Uji Kesesuaian Sistem............................................................. 23

2.5.7 Stabilitas .................................................................................. 23

2.5.7.1 Stabilitas Beku dan Cair .............................................. 23

2.5.7.2 Stabilitas Suhu Jangka Pendek .................................... 24

2.5.7.3 Stabilitas Jangka Panjang ............................................ 24

2.5.7.4 Stabilitas Larutan Stok ................................................. 24

2.5.7.5 Stabilitas Post-Preparatif ............................................. 25

BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 26

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 26

3.2 Bahan dan Alat ................................................................................... 26

3.2.1 Bahan ...................................................................................... 26

3.2.2 Alat .......................................................................................... 26

xii

3.3 Prosedur Kerja .................................................................................... 26

3.3.1 Pembuatan Larutan Induk EPMS ............................................ 26

3.3.2 Pembuatan Fase Gerak ............................................................ 27

3.3.3 Tahapan Optimasi ................................................................... 27

3.3.3.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ............... 27

3.3.3.2 Pemilihan Komposisi Fase Gerak ............................... 27

3.3.3.3 Uji Kesesuaian Sistem ................................................ 28

3.3.3.4 Penetapan Metode Ekstraksi ....................................... 28

3.3.4 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma ..................... 28

3.3.4.1 Pengukuran LLOQ ...................................................... 28

3.3.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi ........................................ 29

3.3.4.3 Selektivitas .................................................................. 29

3.3.4.4 Uji Akurasi .................................................................. 30

3.3.4.5 Uji Presisi .................................................................... 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 31

4.1 Penetapan Panjang Gelombang Analisis ............................................. 31

4.2 Optimasi Kondisi Analisis .................................................................. 32

4.2.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak .............................................. 32

4.2.2 Uji Kesesuaian Sistem................................................................ 34

4.2.3 Penetapan Metode Ekstraksi ...................................................... 34

4.3 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma In Vitro .................... 36

4.3.1 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ) ....................... 36

4.3.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi ....................................................... 37

4.3.3 Uji Selektivitas ........................................................................... 38

4.3.4 Uji Akurasi ................................................................................. 39

4.3.5 Uji Presisi ................................................................................... 40

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 41

5.1 Kesimpulan ....................................................................................... 41

5.2 Saran .................................................................................................. 42

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 43

LAMPIRAN ......................................................................................................... 46

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak ........................................................................27

Tabel 4.1 Hasil Penetapan Komposisi Fase Gerak .............................................33

Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-rata Kesesuain Sistem EPMS ......................................34

Tabel 4.3 Hasil Optimasi Pengendapan Protein Plasma .....................................35

Tabel 4.4 Data Hasil Uji Selektivitas ..................................................................39

Tabel 5.1 Uji Kesesuaian Sistem ........................................................................48

Tabel 5.2 Data Hasil Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ) ..............49

Tabel 5.3 Data Hasil Uji Linieritas .....................................................................50

Tabel 5.4 Data Hasil Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi

(LOQ) .................................................................................................52

Tabel 5.5 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi Hari ke-1 .....................................53

Tabel 5.6 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi Hari ke-2 .....................................53

Tabel 5.7 Rumus-rumus......................................................................................54

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

Gambar 2.1 Struktur Kimia EPMS .....................................................................4

Gambar 2.2 Diagram Alir KCKT .......................................................................10

Gambar 4.1 Spektrum Serapan Gelombang Maksimum EPMS .........................31

Gambar 4.2 Kromatogram EPMS Murni pada Fase Gerak Metanol 100% ........33

Gambar 4.3 Kromatogram EPMS Murni pada Fase Gerak Metanol-Air

(80:20 v/v) ......................................................................................33


(70:30 v/v) ......................................................................................33


(60:40 v/v) ......................................................................................33

Gambar 4.6 Kromatogram Blangko Plasma dengan Perbandingan Metanol-

Plasma (1:1) ...................................................................................36

Gambar 4.7 Kromatogram EPMS pada Perbandingan Metanol dalam Plasma

(1:1) ................................................................................................36

Gambar 4.8 Kromatogram Blangko Plasma dengan Perbandingan Metanol-

Plasma (4:1) ...................................................................................36

Gambar 4.9 Kromatogram EPMS pada Perbandingan Metnaol dalam Plasma

(4:1) ................................................................................................36

Gambar 4.10 Kurva Kalibrasi EPMS dalam Plasma ..........................................37

Gambar 5.1 Kromatogram Sampel Plasma Kosong (Blangko) ..........................47

Gambar 5.2 Kromatogram EPMS dalam Sampel Plasma ...................................47

Gambar 5.3 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...........................................55

Gambar 5.4 Overlay dari Beberapa Kromatogran pada Kurva Kalibrasi ...........56

Gambar 5.5 Plasma .............................................................................................57

Gambar 5.6 EPMS dalam Plasma Setelah Divortex ...........................................57

Gambar 5.7 Vial KCKT ......................................................................................57

Gambar 5.8 Pot Penyimpanan Sampel EPMS ....................................................57

Gambar 5.9 Penyaringan Fase Gerak ..................................................................57

xv

Gambar 5.10 Kolom KCKT ................................................................................57

Gambar 5.11 Sentrifugator ..................................................................................58

Gambar 5.12 Sonikator .......................................................................................58

Gambar 5.13 Vortex ............................................................................................58

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

Lampiran 1 Alur Penelitian .................................................................................46

Lampiran 2 Kromatogram Hasil Analisa ............................................................47

Lampiran 2 Uji Kesesuaian Sistem .....................................................................48

Lampiran 3 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ) ............................49

Lampiran 4 Uji Linearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi ...............................50

Lampiran 5 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ...........................................52

Lampiran 6 Uji Akurasi dan Presisi ....................................................................53

Lampiran 7 Rumus-rumus ..................................................................................54

Lampiran 8 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...........................................55

Lampiran 9 Overlay Kromatogram Kurva Kalibrasi ..........................................56

Lampiran 10 Dokumentasi Penelitian .................................................................57

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Etil p-metoksisinamat merupakan senyawa hasil isolat dari kencur

(Kaempferia galanga. L) yang termasuk kedalam spesies tumbuhan dari suku

zingiberaceae, bagian yang sering digunakan ialah rimpangnya. Senyawa Etil p-

metoksisinamat (80,05%) merupakan kandungan utama yang terdapat didalam

ekstrak kencur (Umar et al., 2012).

Etil p- metoksisinamat telah dilaporkan memiliki aktivitas sebagai anti-

tuberkulosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastik dan potensi

sebagai antimikroba (Umar et al., 2014). Selain itu, Etil p-metoksisinamat telah

terbukti berperan penting dalam efek farmakologinya sebagai antiinflamasi.

Dalam studi in vitro, etil p-metoksisinamat secara non-selektif mampu

menghambat aktivitas COX-1 dan COX-2, dengan masing-masing 1,12 µM dan

0,83 µM. Hasil ini memvalidasi aktivitas antiinflamasi kencur yang dihasilkan

oleh penghambatan COX-1 dan COX-2 (Umar et al., 2012). Hasil penelitian baru-

baru ini yang dilakukan oleh Umar et al, (2014) menunjukkan bahwa EPMS

memiliki efek analgesik dan antiinflamasi melalui mekanisme penghambatan

sintesis sitokin pro-inflamasi meliputi TNF-α dan IL-1 secara in vivo dan in vitro.

Efek ini juga melibatkan penghambatan vital sel endogen seperti proliferasi,

sistesis dan migrasi dari vascular endotel growth factor.

Aktivitas antiinflamasi EPMS dapat digunakan untuk pengembangan obat

baru. Dalam pengembangan obat tradisional, kandidat obat tersebut akan melalui

serangkaian uji yaitu uji praklinik dan uji klinik sebelum diresmikan sebagai obat

oleh badan pemberi izin. Uji praklinik merupakan persyaratan uji untuk

memperoleh informasi tentang efikasi (efek farmakologi), profil farmakokinetik

dan toksisitas kandidat obat. Setelah dinyatakan memenuhi persyaratan uji

praklinik, suatu senyawa kandidat obat selanjutnya akan diuji pada manusia (uji

klinik) (Sukandar., 2006).

Dalam pengembangan obat baru, tahap penting yang harus dilakukan

adalah analisis obat pada cairan biologis atau biasa disebut bioanalisis. Dari data

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

yang diperoleh dalam bioanalisis akan menjadi pedoman untuk studi klinis dan

studi keamanan obat (Harahap., 2010). Analisis dapat dilakukan apabila metode

yang digunakan telah divalidasi sehingga didapatkan metode bioanalisis yang

valid berdasarkan pada Food and Drug Administration, Guidance for Industry:

Bioanalytical Method Validation, 2001. Selain itu, validasi perlu dilakukan agar

hasil analisis yang diperoleh terpercaya, cermat, handal dan dapat dipertanggung

jawabkan secara ilmiah (Ganjar & Rohman., 2007). Parameter-parameter penting

dalam validasi metode bioanalisis adalah linearitas, limit of detection (LOD), limit

of quantification (LOQ), selektivitas, akurasi dan presisi.

Metode analisis yang dipilih adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT) dimana telah digunakan secara luas untuk penemuan dan pengembangan

metode analisis baru (Evans., 2004). Salah satu keuntungan dari KCKT adalah

dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah sehingga dapat

digunakan untuk konsentrasi obat dalam plasma yang diukur mencapai level

mikrogram sampai nanogram atau pikogram (Johnson & Stevenson., 1991). Cara

ini ideal untuk analisis beragam obat dalam cairan biologis karena selektif,

sederhana dan kepekaannya tinggi (Parwa., 1991).

Pada penelitian ini, akan dilakukan validasi metode analisis EPMS dalam

plasma secara in vitro menggunakan KCKT dimana pemisahan pada kromatografi

menggunakan fase diam C18 (Oktadesil silika atau ODS). Fase diam tersebut

paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar & Rohman., 2007).

Penyiapan sampel plasma dilakukan dengan menggunakan metanol. Fase gerak

yang digunakan adalah metanol dan akuabidestilata yang dilakukan secara

isokratis. Pemilihan fase gerak didasarkan pada senyawa EPMS yang mampu larut

dalam beberapa pelarut dengan kepolaran bervariasi seperti metanol, air, etanol,

etil asetat dan heksana (Taufikhurohmah, 2008). Detektor yang digunakan adalah

DAD (Diode Array Detector).

1.2 Perumusan masalah

a. Bagaimanakah optimasi kondisi analisis EPMS menggunakan KCKT?

3


b. Bagaimanakah metode ekstraksi untuk analisis EPMS dalam plasma

menggunakan KCKT?

c. Apakah analisis EPMS dalam plasma secara in vitro menggunakan KCKT

memiliki nilai validitas yang sesuai dengan persyaratan?

1.3 Tujuan Penelitian

a. Mendapatkan optimasi kondisi analisis EPMS menggunakan KCKT.

b. Mendapatkan metode ekstraksi untuk analisis EPMS dalam plasma

menggunakan KCKT.

c. Memperoleh metode yang tervalidasi untuk analisis EPMS dalam plasma

secara in vitro menggunakan KCKT.

1.4 Manfaat penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu mendapatkan metode yang

valid untuk analisis EPMS dalam plasma menggunakan KCKT.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etil p-metoksisinamat (EPMS)

EPMS merupakan senyawa hasil isolat dari rimpang kencur (Kaempferia

galanga. L). EPMS merupakan senyawa yang mampu larut dalam beberapa

pelarut dengan kepolaran bervariasi seperti metanol, air, etanol, etil asetat dan

heksana. Hal ini disebabkan karena karena EPMS bersifat non polar yang

merupakan suatu ester yang mengandung cincin benzene dan gugus metoksi.

Selain itu, bersifat agak polar karena mengandung gugus karbonil yang mengikat

etil (Taufikhurohmah, 2008).

Gambar 2.1 Struktur kimia Etil p-metoksisinamat

[www.chemicalbook.com]

EPMS memiliki rumus molekul C12H14O3 dan berat molekul 206,4 g/mol

yang berbentuk kristal berwarna putih, berbau aromatik khas lemah dan memiliki

titik lebur 49oC (Umar et al., 2012).

EPMS termasuk kedalam turunan asam sinamat, dimana asam sinamat

termasuk kedalam turunan senyawa fenil propanoad yang sebelumnya

dimanfaatkan sebagai bahan tabir surya (Windono et al., 1997). Pada dekade

terakhir penelitian lebih lanjut mengenai efek farmakologi EPMS banyak

dilakukan. Etil p- metoksisinamat telah dilaporkan memiliki aktivitas sebagai anti-

tuberkulosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastik dan potensi

sebagai antimikroba (Umar et al., 2014). Selain itu, Etil p-metoksisinamat telah

terbukti berperan penting dalam efek farmakologinya sebagai antiinflamasi.

http://www.chemicalbook.com/

5


Mekanisme kerja EPMS sebagai antiinflamasi melalui penghambatan non-

selektif pada aktivitas COX-1 dan COX-2 secara in vitro dimana enzim ini

berguna dalam pembentukan mediator inflamasi yaitu prostaglandin (Umar et al.,

2012). Hasil penelitian baru-baru ini yang dilakukan oleh Umar et al. (2014)

menunjukkan bahwa EPMS memiliki efek analgesik dan antiinflamasi melalui

mekanisme penghambatan sintesis sitokin pro-inflamasi meliputi TNF-α dan IL-1

secara in vivo dan in vitro. Efek ini juga melibatkan penghambatan vital sel

endogen seperti proliferasi, sistesis dan migrasi dari vaskular endotel growth

factor.

2.2 Plasma

Darah membentuk sekitar 8% dari berat badan tubuh total dan memiliki

volume rata-rata 5 liter pada wanita dan 5,5 liter pada pria. Darah terdiri dari tiga

jenis unsur sel khusus yang terendam dalam cairan kompleks plasma, yaitu

eritrosit dalam jumlah yang besar, leukosit dalam jumlah yang relatif sangat

sedikit 2 permil dari jumlah eritrosit dan trombosit yang memiliki fungsi penting

pada penggumpalan darah (Sherwood.,1996).

Apabila suatu sampel darah utuh ditaruh dalam sebuah tabung reaksi dan

diberi zat antikoagulan, unsur-unsur sel yang lebih berat akan secara perlahan

mengendap di dasar dan plasma yang lebih ringan naik kebagian atas. Proses ini

dipercepat oleh pemusingan (sentrifugasi), yang dengan cepat menyebabkan sel-

sel mengendap di dasar tabung (Sherwood.,1996). Bobot jenis darah bervariasi

antara 1,054-1,060, sedangkan bobot jenis plasma darah sekitar 1,024-1,028

(Poedjaji., 1994)

Hampir 90% plasma darah terdiri dari air, disamping itu terdapat pula zat-

zat lain yang terlarut didalamnya (Syaifuddin., 2006). Volume rata-rata plasma

pada wanita adalah 58% dan pada pria 55% dari volume darah. Plasma akan

membeku pada saat terpapar oleh udara karena plasma mengandung suatu

senyawa pembeku. Sehingga plasma dapat ditambahkan suatu antikoagulan

seperti sitrat atau heparin untuk mencegah pembekuan tersebut (Sherwood.,

1996).

6


2.3 Analisis Obat dalam Plasma

Penentuan kadar obat dalam sampel biologis merupakan hal yang sangat

penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika. Cairan biologis

yang umum digunakan untuk analisis adalah darah, plasma (serum), dan urin.

Analisis konsentrasi obat dalam darah biasanya tidak digunakan dalam

farmakokinetik karena darah merupakan sistem fisik kompleks yang mengandung

sel darah merah, sel darah putih dan platelet yang tersuspensi dalam plasma.

Darah dengan elemen selular yang telah dihilangkan dengan sentifugasi (plasma)

atau pembekuan (serum) lebih disukai (Rosenbaun., 2011). Sampel biologis yang

paling umum digunakan adalah plasma karena hubungan konsentrasi obat dalam

plasma dengan efek terapetik yang ditimbulkan baik (Kelly., 1992).

Pemeriksaan kadar obat dalam plasma merupakan suatu metode yang

sesuai untuk pemantauan pengobatan dan memungkinkan untuk penyesuaian

dosis obat dan mengoptimasi terapi (Shargel., 2005). Salah satu keuntungan dari

KCKT adalah dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah

sehingga dapat digunakan untuk konsentrasi obat dalam plasma yang diukur

mencapai level mikrogram sampai nanogram atau pikogram (Johnson &

Stevenson., 1991).

Pada matriks biologis seperti plasma mengandung sejumlah besar

komponen endogen yang dapat menggangu analisis dimana sebagian besar obat

akan berikatan dengan protein plasma sehingga harus dibebaskan terlebih dahulu.

Oleh karena itu, diperlukan preparasi sampel dengan tujuan agar dapat

memisahkan atau mengisolasi obat yang akan ditentukan dari komponen endogen

plasma yang dapat mengganggu analisis, membebaskan obat dari sisi pengikatan

protein dan memekatkan obat agar diperoleh analisis yang sensitif. Kegiatan

preparasi sampel merupakan hal penting dalam bioanalisis (Harahap., 2010).

Beberapa teknik preparasi sampel yang digunakan untuk mengisolasi obat dari

matriks biologis antara lain:

a. Pengendapan protein

Pada metode ini, dapat dilakukan dengan cara penambahan asam atau

pelarut organik untuk mendenaturasi dan mengendapkan protein. Penambahan

asam pada kosentrasi 5-20% seperti asam trikloroasetat (TCA) dan asam perkolat,

7


sangat efesien untuk mengendapkan protein. Penambahan larutan yang berisi ion

logam berat atau penambahan pelarut organik seperti metanol, etanol, asetonitril

dan aseton kedalam sampel biologis telah digunakan secara luas dalam bioanalisis

karena kompatibilitasnya dengan fase gerak KCKT, meskipun memiliki efesiensi

yang relatif rendah dalam memisahkan protein. Pelarut organik akan

mengendapkan protein bedasarkan prinsip polaritas dan menurunkan solubilitas

protein. (Evans., 2004; Harahap., 2010)

b. Ultrafiltrasi

Larutan bebas protein dapat diperoleh melalui proses penyaringan dengan

melewatkan larutan pada suatu membran semipermeabel yang selektif dengan

menggunakan tekanan hidrostatik (1-10 atm) untuk memberikan dorongan dalam

proses pemisahan. (Harahap, 2010)

c. Ekstraksi cair-cair (Liquid-liquid Extraction)

Ekstraksi cair-cair adalah proses pemindahan atau pemisahan suatu

komponen dari satu fase ke fase lainnya yang tidak saling bercampur satu sama

lain, proses ini disebut partisi atau distribusi. Salah satu fasenya yaitu fase

aqueous dan fase lainnya merupakan pelarut organik. Larutan aqueous yang dapat

digunakan adalah air, larutan yang bersifat asam/basa, garam dan lainnya. Pelarut

organik yang dapat digunakan adalah heksan, etil asetat, toluene dan lainnya.

Pelarut organik non polar untuk mengekstraksi senyawa yang bersifat lipofil,

sedangkan senyawa hidrofil lebih mudah larut dalam pelarut organik yang relatif

polar.

Metode ekstraksi dengan pelarut organik merupakan cara yang paling

umum digunakan untuk pemisahan parsial. pH fase air harus dioptimasi agar

diperoleh bentuk tidak terionisasi, karena obat dapat terekstraksi dalam pelarut

organik apabila dalam bentuk tidak terionisasi. Optimasi dapat dilakukan dengan

menghitung atau menentukan pKa obat.

Penguapan dapat menggunakan bantuan evaporator vakum atau diuapkan

pada temperatur kamar. Untuk mempercepat penguapan, dapat ditambahkan

beberapa tetes etanol, dan penambahan sedikit natrium sulfat anhidrat pada saat

8


penyaringan dapat menghilangkan air dari fase organik. Selanjutnya hasil

penguapan direkonstitusi menggunakan pelarut yang sesuai. Kelemahan dari

metode yaitu terjadinya pembentukan emulsi dan tidak dapat diaplikasikan

kesemua analit, contohnya metode ini sulit digunakan untuk analit yang bersifat

sangat polar (Evans 2004.; Harahap., 2010)

d. Ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction)

Prinsip mekanisme pemisahan dan isolasi yang digunakan dalam

pemisahan fase padat yaitu fase terbalik, fase normal dan ion exchange sama

seperti yang digunakan dalam KCKT. Metode ekstraksi fase padat ini berdasarkan

prinsip kromatografi. Prinsip umum dari ekstraksi fase padat yaitu adsorpsi obat

dari larutan kedalam adsorben atau fase diam. Partikel silika berukuran 40-60 µm

merupakan adsorben yang sering digunakan berkaitan dengan membentuk fase

hidrokarbon. Adsorben yang paling baik kapasitasnya dalam mengadsorbsi analit

adalah C18.

Pada metode ini, digunakan kolom berukuran kecil (catridge) dengan

adsorben yang memiliki sifat mirip dengan sifat analit yang diperiksa. Ekstraksi

fase padat adalah suatu teknik yang dapat mengatasi beberapa masalah yang

ditemui pada ekstraksi cair-cair. Secara umum SPE menggunakan 5 tahap yaitu

pengkondisian, penyeimbangan fase diam, memasukkan sampel, pencucian untuk

menghilangkan senyawa pengganggu, dan elusi sampel (Evans., 2004; Harahap.,

2010).

2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

2.4.1 Pendahuluan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut

dengan HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa

tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang. KCKT dikembangakan

pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. KCKT merupakan metode

yang tidak destrukstif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan

kuantitatif.

9


KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-

senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-

protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif

obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi

dalam sediaan farmasi; memonitor sampel-sampel yang berasal dari

lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan

polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran;

kontrol kualitas; dan mengikuti jalnnya reaksi sintesis.

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa,

kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS) dan

apabila sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

(Gandjar & Rohman., 2007)

2.4.2 Keuntungan KCKT

KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik

kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat.

Adapun keuntungan dari KCKT, yaitu : cepat, daya pisah baik, peka, detektor

unik, pemilihan kolom dan eluen sangat bervariasi, dapat menghitung sampel

dengan kadar yang sangat rendah, kolom dapat dipakai kembali, ideal untuk

molekul besar dan ion, mudah memperoleh kembali cuplikan, mampu

memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah melaksanakannya,

dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang dianalisis,

dan resolusi yang baik (Johnson & Steveson., 1991; Effendy., 2004).

2.4.3 Cara kerja KCKT

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk

bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel

diantara suatu fase gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fase diam

yang juga bisa berupa cairan ataupun padatan (Effendy., 2004). KCKT

merupakan teknik yang mana solut atau zat–zat terlarut terpisah oleh

perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom

kromatografi. Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase

10


gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap

suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari

berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, panjang

dan diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran

sampel (Gandjar & Rohman., 2007).

2.4.4 Instrumentasi KCKT

Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen

pokok yaitu: wadah fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom,

detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan

suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar & Rohman., 2007).

.

Keterangan: 1 = Tempat fase gerak + penyaring; 2 = saluran penghubung dengan frit; 3 = pompa

(dengan monometer); 4 = injector sampel (autosampler); 5 = kolom (dengan thermostat) ; 6 =

detektor; 7 = pembuangan; 8 = pengolah data

Gambar 2.3 Diagram Alir KCKT

(Meyer., 2010)

11


2.4.4.1 Wadah Fase Gerak pada KCKT

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah

pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai

wadah fase gerak. Wadah yang digunakan dapat menampung fase gerak

antara 1 sampai 2 liter. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan

degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya

gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan

detektor sehingga akan mengganggu analisis (Gandjar & Rohman.,

2007).

2.4.4.2 Fase gerak pada KCKT

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang

dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan

resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas

keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen

sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),

kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari fase gerak),

kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase

gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase

gerak berubah-ubah selama elusi). Elusi bergradien digunakan untuk

meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel

mempunyai kisaran polaritas yang luas.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan

dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol

atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase

normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran

pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau

menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase

normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik (Gandjar &

Rohman., 2007).

12


Fase gerak adalah salah satu variabel yang mempengaruhi

pemisahan. Oleh karena itu setidaknya fase gerak harus murni (tidak

terdapat kontaminan), tidak bereaksi dengan wadah (packing), sesuai

dengan detektor, melarutkan sampel, memiliki viskositas rendah, bila

diperlukan memudahkan “sample recovery”, dan diperdagangan dapat

diperoleh dengan harga murah (reasonable price) (Johnson & Steveson.,

1991).

2.4.4.3 Pompa pada KCKT

Pompa berfungsi untuk menggerakan fase gerak melalui kolom

(Johnson & Steveson., 1991). Tujuan penggunaan pompa adalah untuk

menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Pompa yang cocok

untuk KCKT adalah pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang

umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, telfon, dan

batu nilam. Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu : pompa dengan

tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan

sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan

alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit (Gandjar

& Rohman., 2007).

2.4.4.4 Penyuntikan (injektor) sampel pada KCKT

Injektor berfungsi memasukkan sampel-sampel cair dan larutan

kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom. Alat

penyutik terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang

dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal

(Gandjar & Rohman., 2007). Ada dua ragam utama : aliran henti dan

pelarut mengalir. Jenis-jenis dasar injektor, yaitu : aliran henti, septum,

katup jalan-kitar (Johnson & Steveson., 1991).

13


2.4.4.5 Kolom pada KCKT

Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau

kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja

yang tepat. Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing

komponen. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu (Johnson

& Steveson., 1991) :

1. Kolom analitik : Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung

pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,

panjang yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros

mikropartikulat, 10-30 cm.

2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih

besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

2.4.4.6 Fase Diam pada KCKT

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang

dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, polimer-

polimer stiren dan divinilbenzen. Permukaan silika adalah polar dan

sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan

reagen-reagen seperti klorosilan yang akan bereaksi dengan gugus

silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil

terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan (Si-O-O-Si).

Silika yang dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografik dan

selektifitas yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak

dimodifikasi.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang

paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa

dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar &

Rohman., 2007).

14


2.4.4.7 Detektor KCKT

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen

sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya

(analisis kuantitatif) (Johnson & Steveson., 1991). Detektor pada KCKT

dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : detektor universal (yang

mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, tidak

bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor

spektrofotometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya

akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-

Vis, detektor flouresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai

berikut (Gandjar & Rohman., 2007) :

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel,

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil,

3. Stabil dalam pengoperasiannya,

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentraasi solut

pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier), dan

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254

nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi

banyak senyawa dengan rentang yang lebih luas. Detektor indeks

refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi

eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan

detektor UV (Johnson & Steveson, 1991). Beberapa detektor yang sering

digunakan pada KCKT (Gandjar & Rohman, 2007) :

a. Detektor Spektofotometri UV-Vis

Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi

ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang

190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur-struktur atau

15


gugus-gugus kromofik. Detektor spektrofotometri UV-Vis dapat berupa

detektor dengan panjang gelombang tetap (merupakan detektor yang

paling sederhana) serta detektor dengan panjang gelombang bervariasi.

b. Detektor Photodiode-array (PDA)

Detektor PDA meruapakan detektor UV-Vis dengan berbagai

keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram

secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda pada sekali

proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada

panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400) dapat

ditampilkan.

c. Detektor Flouresensi

Flouresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika

suatu senyawa menyerap sinar UV atau visible lalu mengemisikannya

pada panjang gelombang yang lebih besar. Tidak semua senyawa obat

mempunyai sifat flouresen sehingga detektor flouresensi ini sangat

spesifik. Disamping itu, detektor ini juga sangat sensitif dibandingkan

dengan detektor UV.

d. Detektor Indeks Bias

Detektor ini akan merespon setiap perbedaan indeks bias antara

analit (zat terlarut) dengan pelarutnya (fase geraknya). Penggunaan

detektor ini terutama untuk senyawa-senyawa yang tidak mempunyai

gugus kromofor.

e. Detektor Elektrokimia

Detektor ini bekerja bedasarkan oksidasi dan reduksi senyawa

organik (termasuk obat) secara elektrokimia pada elektroda yang cocok.

Kelebihan detektor ini adalah terkait dengan kepekaannnya yang tinggi,

sementara kelemahannya membutuhkan keterampilan dan latihan yang

16


cukup untuk mengoperasikannya supaya didapatan garis dasar (baseline)

yang stabil.

2.4.4.8 Intergrator

Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh

detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang

selanjutnya dievaluasi oleh analisis (pengguna). Alat pengumpul data

seperti komputer, integrator, atau rekorder, dihubungkan dengan detektor

(Gandjar & Rohman, 2007).

2.4.5 Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metoda

pemisahan canggih dalam analisis farmasi yang dapat digunakan sebagai uji

identitas, uji kemurnian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah untuk

analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada

suhu tinggi, yang tidak bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas (Effendy.,

2004). Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk

menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan maupun dalam

sampel hayati. Hal ini disebabkan KCKT merupakan metode yang

memberikan sensitifitas dan spesifitas yang tinggi (Gandjar & Rohman.,

2007).

2.4.6 Analisis Kuantitatif

Mengukur luas puncak dari suatu komponen zat yang dianalisis

merupakan dasar perhitungan kuantitatif. Beberapa metode yang dapat

digunakan, yaitu :

2.4.6.1 Metode Baku Eksternal

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi

senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah

menggunakan plot kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan-

larutan baku eksternal ini dirujuk sebagai baku eksternal karena larutan-

larutan baku eksternal ini disiapkan dan dianalisis secara terpisah dari

17


kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang

mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan

telah disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang

sama (Gandjar dan Rohman., 2007).

2.4.6.2 Metode Baku Internal

Sejumlah baku internal ditambahkan pada sampel dan standar.

Baku internal dapat menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-

perubahan pada ukuran sampel atau konsentrasi karena variasi

instrumen. Salah satu alasan utama digunakan baku internal adalah jika

suatu sampel memerlukan suatu perlakuan sampel yang sangat

signifikan sehingga dapat mengakibatkan berkurangnya sampel. Jika

baku internal ditambahkan pada sampel sebelumnya dilakukan preparasi

sampel, maka baku internal dapat mengoreksi hilangnya sampel-sampel

ini. Syarat-syarat suatu senyawa dapat digunakan sebagai baku internal

adalah (Gandjar dan Rohman., 2007):

1. Terpisah dengan baik dari senyawa yang dituju atau puncak-puncak

yang lain.

2. Mempunyai waktu retensi yang hampir sama dengan analit.

3. Tidak terdapat dalam sampel.

4. Memiliki kemiripan sifat-sifat dengan analit dalam tahapan-tahapan

penyiapan sampel.

5. Tidak mempunyai kemiripan sifat kimiawi dengan analit.

6. Tersedia dalam perdagangan dengan kemurnian yang tinggi.

7. Stabil dan tidak reaktif dengan sampel atau dengan fase gerak.

8. Mempunyai respon detektor yang hampir sama dengan analit pada

konsentrasi yang digunakan.

2.4.6.3 Metode Presentase Tinggi/Lebar Puncak atau Metode

Normalisasi Internal

Untuk analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi

Puncak (Peak) sebanding (proportional) dengan kadar/konsentrasi zat

18


yang menghasilkan puncak. Dalam metoda yang paling sederhana diukur

lebar atau tinggi puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa

setiap lebar atau tinggi puncak diekspresikan sebagai suatu persentase

dari total). Hasil normalisasi dari lebar atau tinggi puncak memberikan

komposisi dari campuran yang dianalisis.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu: Kita harus yakin

bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap

komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada

kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di

dalam kolom, atau terelusi tanpa terdeteksi. Kemudian, Kita harus

mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk

setiap komponen. Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor

diperlukan (Gandjar dan Rohman., 2007).

2.5 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita.,

2004).

Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa

parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,

karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika (Gandjar dan Rohman., 2007) :

a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis

tertentu.

b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan

atau karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa

metode baku tersebut harus direvisi.

c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah

berubah seiring dengan berjalannya waktu.

d. Metode baku digunakan dilaboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh

analisis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.

19


e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara

metode baru dan metode baku.

Pada validasi metode bioanalisis terdapat tiga tipe dan tingkatan validasi,

yaitu (Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Bioanalytical

Method Validation., 2001) :

a. Validasi lengkap (full validation)

Validasi lengkap ini sangat penting apabila ingin mengembangkan metode

dan mengimplementasikan metode bioanalisis untuk pertama kalinya. Validasi ini

penting untuk obat baru dan untuk penentuan metabolitnya.

b. Validasi parsial (partial validation)

Validasi parsial merupakan modifikasi dari metode bioanalisis yang yang

sudah divalidasi.

c. Validasi silang (cross validation)

Validasi silang dilakukan dengan membandingkan parameter-parameter

validasi apabila digunakan dua atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan

data pada studi yang sama atau pada studi yang berbeda. Pada validasi ini

digunakan metode validasi yang original sebagai pembanding dan metode

bioanalisis lainnya sebagai komparator.

Validasi metode analisis yang dilakukan dalam matriks biologi biasanya

disebut sebagai validasi metode bioanalisis. Validasi metode bioanalisis ini

digunakan pada studi farmakologi klinis, pengujian bioavaibilitas (BA) dan

bioekuivalensi (BE), serta uji farmakokinetika (PK). Metode analisis yang selektif

dan sensitif untuk evaluasi obat dan metabolitnya (analit) secara kuantitatif sangat

berpengaruh terhadap kesuksesan studi farmakologi pre-klinik dan klinik.

Parameter-parameter penting dalam validasi metode bioanalisis adalah akurasi,

presisi, selektivitas, sensitivitas, reprodusibilitas, dan stabilitas. Pengembangan

metode analisis meliputi evaluasi selektivitas, akurasi, presisi, uji perolehan

kembali (%recovery), kurva kalibrasi, dan stabilitas (Harahap, 2010).

2.5.1 Ketepatan (Akurasi)

Akurasi menggambarkan kedekatan rata-rata hasil pengujian dengan

kadar analit yang sebenarnya. Akurasi ditentukan oleh analisis berulang dari

20


sampel yang mengandung analit dalam jumlah yang diketahui. Akurasi

dilakukan minimal lima kali pengukuran untuk setiap konsentrasi. Minimal

dari tiga konsentrasi didalam rentang konsentrasi yang direkomendasikan,

yaitu pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Pengukuran akurasi

memenuhi syarat jika nilai rata-rata berada pada 15% nilai sebenarnya, kecuali

jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh melebihi 20%.

Perbedaan nilai rata-rata dan nilai yang sebenarnya menentukan akurasi (US

FDA., 2001; Harahap., 2010)

2.5.2 Presisi

Presisi menggambarkan kedekatan hasil pengukuran individual analit

yang satu dengan yang lainnya. Presisi diukur menggunakan sedikitnya lima

kali pengukuran untuk setiap konsentrasi dan menggunakan minimal tiga

kosentrasi yaitu rendah, sedang, tinggi. Pengukurannya dapat dilakukan intra

assay (dalam satu kali analisis) dan inter assay (dilakukan analisis selama 5

hari). Pengukuran presisi pada setiap level konsentrasi, harus memiliki nilai

koefesien variasi (KV) tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ dimana nilai KV

tidak boleh lebih dari 20% (US FDA., 2001; Harahap., 2010)

2.5.3 Perolehan kembali (%Recovery)

Uji perolehan kembali (%Recovery) merupakan pengujian respon

detektor yang diperoleh dari sejumlah analit yang ditambahkan dan diekstraksi

dari matriks biologi, dibandingkan dengan respon detektor yang diperoleh dari

konsentrasi yang sebernarnya dari standar murni. Perolehan kembali dari

analit tidak perlu 100% tetapi perolehan kembali dari analit dan baku dalam

harus konsisten, presisi, dan reprodusibel. Uji perolehan kembali harus

dilakukan dengan membandingkan hasil analisis dari sampel yang diekstraksi

pada tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dengan standar yang tidak

diekstraksi yang mewakili perolehan kembali 100% (US FDA., 2001)

21


2.5.4 Kurva Kalibrasi

Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dengan

konsentrasi analit yang diketahui. Kurva kalibrasi harus terdiri dari 1 sampel

blanko (matriks tanpa baku dalam), 1 sampel zero (matriks dengan baku

dalam) dan 6-8 sampel non-zero yang mencakup kisaran konsentrasi

pengukuran (termasuk konsentrasi pada LLOQ).

Kurva kalibrasi dapat diterima jika memenuhi persyaratan berikut:

20% simpangan dari nilai LLOQ, 15 % simpangan dari standar selain LLOQ

dan setidaknya empat dari enam sampel non zero memenuhi persyaratan

tersebut, termasuk LLOQ dan kosentrasi tinggi pada kurva kalibrasi.

2.5.4.1 Linearitas

Linearitas suatu metode bioanalisis harus diuji untuk mengetahui

adanya hubungan yang linier antara kadar zat dengan respon detektor.

Liniearitas diperoleh dari koefesien korelasi (r) pada analisis regresi

linear yang didapat dari kurva kalibrasi. Dengan dilakukan uji ini, maka

dapat diketahui batas-batas konsentrasi dari analit yang memberikan

respon detektor yang linier. Analisis harus dilakukan pada konsentrasi

yang termasuk batas-batas linier dari konsentrasi yang telah dilakukan

(Harahap., 2010)

2.5.4.2 Batas Deteksi (limit of detection, LOD)

Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah

dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat

dikuantifikasi. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan

dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit

yang memberikan respon sebesar respon blangko (yb) ditambah dengan 3

simpangan baku blangko (3Sb).

ICH menggunakan 2 metode pilihan untuk menentukan LOD

yakni: metode non instrumental visual dimana pada teknik kromatografi

lapis tipis dan metode titrimetri. Kemudian metode perhitungan

bedasarkan pada standar deviasi (SD) respon dan kemiringan (slope, S)

22


kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD

= 3 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan berdasarkan pada

standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual dari garis regresi,

atau standar deviasi intersep y pada garis regresi (Gandjar dan Rohman.,

2007).

2.5.4.3 Batas Kuantifikasi (limit of quantification, LOQ)

Batas kuantifikasi didefinisikan sebagai kosentrasi analit

terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi

yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.

ICH menggunakan 2 metode untuk menentukan LOQ yaitu: metode non

instrumental visual dan metode perhitungan bedasarkan pada standar

deviasi respon (SD) dan kemiringan (slope, S) kurva baku sesuai dengan

rumus, LOQ = 10 (SD/S). Standar deviasi respon dapat ditentukan

berdasarkan pada standar deviasi blanko, pada standar deviasi residual

dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi

(Gandjar dan Rohman., 2007).

Batas kuantifikasi terendah (Lower limit of quantification,

LLOQ) adalah analit terkecil yang dapat ditentukan dengan ketelitian

dan akurasi tertentu (Harahap, 2010). Standar terendah pada kurva

kalibrasi harus diterima sebagai LLOQ jika: respon analit pada LLOQ

minimal lima kali respon sampel blanko dan puncak analit dapat

diidentifikasi, tidak ada gangguan, reprodusibel dengan presisi 20% dan

akurasi 80-120% (US FDA.,2001).

2.5.5 Selektivitas

Selektivitas merupakan kemampuan metode analisis untuk

membedakan dan mengukur kadar analit dengan adanya komponen-komponen

lain dalam sampel (cairan biologis). Pada uji selektivitas pada sampel blanko

matriks biologi yang sesuai dilakukan pada 6 blangko dari dari sumber yang

berbeda. Setiap sampel blanko sebaiknya diuji terhadap adanya gangguan atau

23


interferensi dan selektivitas pada lower limit of quantification (LLOQ) (US

FDA,2001).

2.5.6 Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk

menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yag

dapat diterima. Seorang analisis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur

yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima.

United State Pharmacopeia (USP) menentukan parameter yang dapat

digunakan untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis. Parameter-

parameter yang digunakan meliputi: bilangan lempeng teori (N), faktor tailing,

kapasitas (k’ atau α) dan nilai standar deviasi relative (RSD) tinggi puncak dan

luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada umumnya ada 2 kriteria yang

biasanya dipersyaratkan untuk kesesuaian sistem suatu metode yaitu jika nilai

RSD < 1% untuk 5 kali injeksi larutan baku pada pengujian komponen yang

jumlahnya banyak (komponen mayor) dan untuk senyawa-senyawa dengan

kadar sekelumit, nilai RSD dapat diterima jika antara 5-15% (Gandjar dan

Rohman., 2007).

2.5.7 Stabilitas

Stabilitas obat dalam cairan biologis adalah fungsi dari kondisi

penyimpanan, sifat kimia obat, matriks dan sistem penyimpanan.

Penyimpanan dapat membuat obat yang ada didalam matriks biologis dapat

terurai sehingga tidak dapat terdeteksi sewaktu sampel dianalisis.

Semua penentuan stabilitas harus menggunakan sampel yang disiapkan

dari larutan stok analit yang dibuat baru, dalam matriks biologis yang bebas

analit dan bebas gangguan. Larutan stok dari analit untuk pengujian stabilitas

harus disiapkan dalam bahan pelarut yang tepat pada konsentrasi yang

diketahui. Jenis-jenis uji stabilitas, yaitu (US FDA., 2001) :

24


2.5.7.1 Stabilitas Beku dan Cair (Freeze and Thaw Stability)

Stabilitas analit harus ditentukan setelah tiga siklus beku dan

cair. Setidaknya tiga aliquot dari masing-masing kosentrasi rendah dan

tinggi disimpan pada suhu penyimpanan yang diinginkan selama 24 jam

dan dicairkan pada suhu kamar. Ketika mencair seluruhnya, sampel

dibekukan kembali selama 12-24 jam pada kondisi yang sama. Siklus

beku cair diulang sebanyak dua kali, kemudian analisis dilakukan pada

siklus ketiga. Jika analit tidak stabil pada suhu yang diinginkan, maka uji

dapat dilakukan dengan menyimpan sampel pada suhu -70OC selama

tiga siklus beku dan cair.

2.5.7.2 Stabilitas Suhu Jangka Pendek (Short-Term Temperature

Stability)

Tiga aliquot dari masing-masing konsentrasi rendah dan tinggi

harus diberikan pada suhu kamar dan disimpan pada suhu ini selama 4-

24 jam (atau berdasarkan durasi yang diinginkan dimana sampel akan

dijaga pada temperature ruang sesuai dengan uji yang diinginkan)

kemudian dianalisis.

2.5.7.3 Stabilitas Jangka Panjang (Long-Term Stability)

Waktu penyimpanan pada evaluasi stabilitas jangka panjang

harus melebihi waktu antara pengumpulan sampel pertama kali dan

sampel terakhir dianalisis. Stabilitas jangka panjang ditentukan dengan

menyimpan sedikitnya tiga aliquot dari masing-masing konsentrasi

rendah dan tinggi pada kondisi yang sama seperti uji sampel.

Konsentrasi dari semua sampel harus dibandingkan dengan rata-rata nilai

perolehan kembali yang sesuai dengan konsentrasi standar dari hari

pertama uji stabilitas jangka panjang.

2.5.7.4 Stabilitas Larutan Stok (Stock Solution Stability)

Stabilitas larutan stok dari obat dan baku dalam harus dievaluasi

pada suhu ruang selama minimal enam jam. Jika larutan stok dibekukan

25


selama periode tertentu, stabilitas harus terdokumentasi. Setelah

tercapainya waktu penyimpanan yang diinginkan, stabilitas harus diuji

dengan membandingkan respon instrument terhadap larutan baru yang

telah disiapkan.

2.5.7.5 Stabilitas Post-Preparatif

Stabilitas sampel yang diproses, termasuk waktu selama sampel

berada di dalam autosampler harus ditentukan. Stabilitas obat dan baku

dalam harus ditetapkan selama waktu analisis untuk ukuran batch dalam

validasi sampel, dengan menentukan konsentrasi berdasarkan kalibrasi

standar.


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia,

Laboratorium Kimia Obat, Laboratorium Penelitian 1 dan Laboratorium

Penelitian 2 Program Studi Farmasi FKIK Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta pada Februari 2016 sampai Juni 2016.

3.2 Bahan dan Alat

3.2.1 Bahan

Etil p-metoksisinamat (hasil isolasi), metanol (Merck), akuabides

(Otsuka), plasma (PMI DKI Jakarta)

3.2.2 Alat

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Dionex UltiMate® 3000) yang

terdiri dari; pompa, autosampler, kolom Acclaim®

Polar Advantage II (C18; 3

µm; 4,6 x 150 mm), detektor DAD (Diode Array Detector), program

komputer PC (Chormeleon®). Spektrofotometer Ultraviolet-Visibel (Hitachi

U-2910), vortex, sentrifugator (Eppendorf Centrifuge 5417R) dengan tabung

sentrifugasi, syringe filter (Sartorius, RC 0,45 µm), pompa vakum (Welch®),

timbangan analitik (AND-6H202), Suntikan (Terumo), mikropipet (Rainin),

tabung vacutainer, lemari pendingin, dan sonikator (Elmasonic 5), alat-alat

gelas.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Larutan Induk EPMS Konsentrasi 1000 µg/mL

Ditimbang sebanyak 50,5 mg EPMS. Dilarutkan ke dalam metanol

hingga volume akhir 50 mL sehingga diperoleh konsentrasi 1010 µg/mL.

Konsentrasi 1010 µg/mL digunakan sebagai larutan induk.

27


3.3.2 Pembuatan Fase Gerak

Berbagai perbandingan komposisi fase gerak dibuat dengan

mencampurkan metanol dan akuabides. Fase gerak yang telah dibuat

kemudian disaring menggunakan vakum dan filter 0,45 µm. Gas yang terdapat

di dalam larutan dihilangkan menggunakan sistem penghilang gas (degasser).

Perbandingan komposisi fase gerak dapat dilihat pada Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Komposisi Fase Gerak

No. Metanol Akuabides

1 100 -

2 80 20

3 70 30

4 60 40

3.3.3 Tahapan Optimasi

3.3.3.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum untuk Analisis

Larutan induk EPMS diencerkan hingga diperoleh konsentrasi

5,05 µg/mL dengan metanol. Masing-masing larutan tersebut diukur

nilai serapannya pada panjang gelombang 200-400 nm menggunakan.

Spektrofotometri UV-Visibel, ditentukan panjang gelombang

maksimumnya.

3.3.3.2 Pemilihan Komposisi Fase Gerak

Larutan induk EPMS diencerkan hingga konsentrasi 10,1 µg/mL

dengan metanol. Kemudian diinjeksikan sebanyak 20 µL pada komposisi

fase gerak metanol-akuabides pada perbandingan tertentu dengan

kecepatan laju alir 1,0 mL/menit. Kemudian dideteksi pada panjang

gelombang terpilih. Dicatat waktu retensi, luas puncak, dihitung jumlah

plat teoritis, HETP (Height Equivalent Theoritical Plate), dan

asimetrisitas.

28


3.3.3.3 Uji Kesesuaian Sistem

Larutan EPMS dengan konsentrasi 10,1 µg/mL diinjeksikan

sebanyak 20 µL ke alat KCKT dengan kondisi analisis terpilih, diulangi

sebanyak lima kali. Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, HETP

(Height Equivalent Theoritical Plate), asimetrisitas dan %RSD (Relative

Standard Deviation).

3.3.3.4 Penetapan Metode Ekstraksi (Polson, 2002)

Kedalam tabung sentrifus dimasukkan 0,5 ml plasma dan

dicampur metanol dengan perbandingan 1:1 dan 1:4. Kemudian dikocok

dengan vortex selama 20 detik. Setelah itu, disentrifugasi pada 3000 rpm

selama 10 menit. Lalu supernatan diambil dan disaring menggunakan

syringe filter 0,45 µm. Kemudian diinjeksikan supernatan sebanyak 20

µL ke alat KCKT. Kemudian dianalisis kromatogram dari masing-

masing perbandingan untuk mengetahui kondisi kromatogram blanko

plasma.

Setelah itu, dibuat larutan dalam plasma yang mengandung

larutan EPMS dengan konsentrasi 10,1 µg/mL. Kemudian diambil

sebanyak 0,5 mL dari larutan tersebut, diekstraksi menggunakan metanol

dalam plasma dengan perbandingan 1:1 dan 1:4. Sebanyak 20 µL

diinjeksikan ke alat KCKT kemudian dicatat waktu retensi dan luas

puncak, asimetrisitas dan resolsinya.

3.3.4 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma

3.3.4.1 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)

Larutan EPMS dalam plasma dengan konsentrasi 5,05; 10,1;

15,15; 20,2; 25,25; 40,4 µg/mL disiapkan. Setelah itu dipreparasi sesuai

prosedur. Kemudian sebanyak 20 µL dari masing-masing larutan

tersebut disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi analisis terpilih. Setelah

itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi

29


EPMS dalam plasma dari masing-masing konsentrasi dan dibuat kurva

kalibrasinya. Dari data pengukuran kemudian dihitung nilai LOQ.

Setelah nilai batas kuantitasi (LOQ) diperoleh, nilai LLOQ

diperoleh dari konsentrasi setengah atau seperempat nilai LOQ.

3.3.4.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Plasma In

Vitro

Dibuat larutan blangko plasma dan 7 sampel yaitu larutan EPMS

dengan konsentrasi 2,02; 5,05; 10,1; 15,15; 20,2; 25,25; 40,4 µg/mL

dimana dalam rentang konsentrasi tersebut terdapat LLOQ didalamnya,

Kemudian dipreprasi sesuai prosedur. Lalu supernatan masing-masing

sebanyak 20 µL diinjeksikan ke alat KCKT pada kondisi analisis

terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap

konsentrasi EPMS dalam plasma dari masing-masing konsentrasi dan

dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier (y=a + bx).

Dihitung koefesien korelasi (r) dari kurva tersebut. Kemudian dihitung

LOQ (limit batas kuantitasi) dan LOD (limit batas deteksi).

LOQ (limit batas kuantitasi) dihitung melalui persamaan garis

regresi linier dari kurva kalibrasi, dengan rumus :

LOQ = 10 (

𝑆𝑦

𝑥)

𝑏

Sedangkan nilai batas deteksi (LOD) diperoleh dengan rumus :

LOD =3 (

𝑆𝑦

𝑥)

𝑏

Dimana (Sy/x) adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari

persamaan regresi.

3.3.4.3 Uji Selektivitas

Sebanyak 20 µL supernatan sampel plasma hasil deproteinasi

yang mengandung EPMS pada konsentrasi LLOQ (2,02 µg/mL)

disuntikkan kedalam instrument KCKT dengan kondisi terpilih, yang

diulang sebanyak 6 kali menggunakan enam plasma dari sumber yang

30


berbeda. Kemudian dihitung nilai % KV (Koefesien Variasi) dengan

nilai < 20% dan akurasinya (%diff) dengan nilai + 20%.

3.3.4.4 Uji Akurasi

Dibuat larutan EPMS dengan 3 kosentrasi. Konsentrasi rendah (3

kali LLOQ) yaitu 6,06 µg/mL; konsentrasi sedang yaitu 18,18 µg/mL

dan konsentrasi tinggi yaitu 30,3 µg/mL bedasarkan kurva kalibrasi.

Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak 20 µL

diinjeksikan ke alat KCKT dengan kondisi terpilih, yang diulangi

sebanyak 3 kali. Kemudian dihitung presentase akurasi (%diff) dan

perolehan kembali (% recovery) dari masing-masing konsentrasi larutan

tersebut. Nilai rata-rata %diff disyaratkan + 15% dari nilai sebenarnya.

Sedangkan nilai perolehan kembali dihitung dengan cara

membandingkan konsentrasi EPMS dalam darah yang diperoleh dari

hasil ekstraksi dengan konsentrasi EPMS yang sebenarnya dikalikan

dengan 100%. Perolehan kembali tidak harus 100%, tetapi tingkat

perolehan kembali analit dan baku dalam harus konsisten, presisi, dan

reprodusibel.

3.3.4.5 Uji Presisi

Dibuat larutan EPMS dengan 3 kosentrasi. Konsentrasi rendah (3

kali LLOQ) yaitu 6,06 µg/mL; konsentrasi sedang yaitu 18,18 µg/mL

dan konsentrasi tinggi yaitu 30,3 µg/mL bedasarkan kurva kalibrasi.

Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak 20 µL

diinjeksikan ke alat KCKT dengan kondisi terpilih, yang diulangi

sebanyak 3 kali. Dilakukan pengukuran selama 2 hari berturut-turut,

kemudian dihitung persentase koefesien variasinya atau %KV pada

masing-masing konsentrasi dengan nilai < 15%.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penetapan Panjang Gelombang Analisis

Pada penelitian ini, pemilihan panjang gelombang analisis dilakukan

menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Senyawa aktif EPMS pada

konsentrasi 5,05 µg/mL diukur pada panjang gelombang 200 hingga 400 nm,

dimana senyawa EPMS memiliki gugus kromofor di dalam molekulnya sehingga

dapat diperoleh spektrum serapannya. Spektrum serapan yang dihasilkan

menunjukkan bahwa EPMS berada panjang gelombang sinar UV yaitu 308 nm.

Sehingga didapatkan panjang gelombang maksimum untuk analisis yaitu 308 nm.

Hal ini sesuai dengan literatur, dimana analisis EPMS dideteksi pada panjang

gelombang 308 nm (Salkar,2014). Pemilihan panjang gelombang analisis ini

berguna untuk meningkatkan selektivitas dan sensitifitas analisis dari sampel yang

digunakan. Data spektrum serapan senyawa zat aktif EPMS dapat dilihat pada

Gambar 4.1 dibawah ini.

Gambar 4.1 Spektrum serapan panjang gelombang maksimum EPMS konsentrasi 5,05 µg/mL

pada spektrofotometer UV-Vis

32


4.2 Optimasi Kondisi Analisis

4.2.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak

Analisis EPMS dalam plasma secara in vitro menggunakan

kromatografi cair kinerja tinggi dilakukan pada kondisi optimum dengan laju

alir 1 mL/menit, panjang gelombang analisis 308 nm, volume penyuntikan 20

µL dan menggunakan kolom Acclaim® (C18) 150 mm. Sistem kromatografi

yang digunakan adalah sistem isokratik dengan komposisi fase gerak metanol

dan air dalam berbagai perbandingan. Fase gerak tersebut bersifat polar

sehingga dapat memisahkan senyawa EPMS yang memiliki molekul-molekul

bersifat polar.

Komposisi fase gerak sebagai kondisi awal yang digunakan adalah

metanol 100%. Pada fase gerak metanol 100% diperoleh kromatogram

senyawa EPMS yang memiliki waktu retensi (tR) 2,077 menit. Kemudian

komposisi fase gerak diubah dengan penambahan air dalam perbandingan

metanol-air (80:20 v/v); (70:30 v/v) dan (60:40 v/v). Dimana pada komposisi

fase gerak tersebut menghasilkan waktu retensi secara berurutan yaitu (tR)

3,393 menit, 6,440 menit dan 10,037 menit. Pengubahan fase gerak metanol

100% dengan penambahan air pada komposisi fase gerak dilakukan untuk

menghasilkan puncak EPMS pada waktu retensi diatas menit kedua, karena

pengotor dalam plasma umumnya muncul pada menit kedua sehingga

nantinya dapat mengganggu puncak dari senyawa EPMS.

Metode yang dipilih adalah pada kondisi metanol-air (60:40 v/v),

dikarenakan tidak ada puncak pengganggu pada waktu retensi EPMS yang

dapat dilihat dari kromatogram plasma blangko dan kemungkinan memiliki

daya pisah yang baik antara senyawa aktif EPMS dengan pengotor pada

plasma. Dalam hasil percobaan, komposisi fase gerak tersebut memberikan

luas puncak yang lebih besar yaitu 21,4820 dan jumlah lempeng teoritis (N)

yang lebih besar yaitu 245 (> 2500), nilai HETP yang diperoleh lebih kecil

yaitu 0,6122 dan asimetrisitas yang baik yaitu 1,86 (<2,5). Data dapat dilihat

pada tabel 4.1 dan data kromatogram hasil analisis tercantum dalam Gambar

4.2-4.5 dibawah ini.

33


Tabel 4.1 Hasil penetapan komposisi fase gerak pada konsentrasi 10,1 µg/mL, kecepatan alir 1

mL/menit, panjang gelombang 308 nm, dan volume penyuntikan 20 µL.

Fase gerak (v/v) TR

(menit)

Luas puncak

(mAU)

N HETP Asimetrisitas

Metanol 2,077 23,4096 165 0,9090 1,52

Metanol-Air (80:20) 3,393 22,7340 86 1,7442 0,98

Metanol-Air (70:30) 6,440 20,4664 129 1,1628 2,16

Metanol-Air (60:40) 10,037 21,4820 245 0,6122 1,86

Gambar 4.2 Kromatogram EPMS murni pada

konsentrasi 10,1 µg/mL dengan fase gerak

metanol 100%, kecepatan alir 1 mL/menit,

panjang gelombang 308 nm dan volume

penyuntikan 20 µL.


konsentrasi 10,1 µg/mL dengan komposisi fase

gerak metanol-air (80:20 v/v), kecepatan alir 1

mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan

volume penyuntikan 20 µL.











34


4.2.2 Uji Kesesuaian Sistem

Sebelum metode analisis yang terpilih akan digunakan perlu dilakukan

uji kesesuaian sistem. Dimana uji kesesuaian sistem ini dilakukan untuk

memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu

memberikan data yang dapat diterima. Dalam uji kesesuaian sistem terdapat

beberapa parameter-parameter, yaitu plat teoritis (N) dengan syarat > 2500,

asimetrisitas dengan syarat < 2,5 dan syarat utama yaitu nilai koefesien variasi

luas puncak dengan syarat %RSD < 2 % dari pengulangan injeksi. Suatu

metode dapat diterima apabila dari uji kesesuaian sistem terdapat minimal dua

parameter yang memenuhi persyaratan (Gandjar & Rohman., 2007).

Dari hasil analisis 5 kali penyuntikan, didapatkan luas puncak dari zat

aktif EPMS. Nilai koefesien variasi yang diperoleh dari luas puncak adalah

sebesar 1,2491% dan nilai koefesien variasi yang diperoleh dari waktu retensi

adalah sebesar 0,8924 %. Uji kesesuaian sistem yang telah dilakukan telah

memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kecuali pada parameter plat teoritis

(N). Keefesienan kolom dapat dilihat beberapa diantaranya pada nilai

bilangan plat teoritis, HETP dan asimetrisitas. Dari data yang diperoleh plat

teoritis yang dihasilkan tidak memenuhi persyaratan hal ini menunjukkan

bahwa kondisi kolom yang digunakan kurang baik. Data dapat dilihat pada

Tabel 4.2 dan data selengkapnya tercantum dalam Lampiran 2 Tabel 5.1.

Tabel 4.2 Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem EPMS pada konsentrasi 10,1 µg/mL

dengan komposisi fase gerak metanol-air (60:40 v/v) pada kecepatan alir 1 ml/menit, panjang

gelombang 308 nm dan volume penyuntikan 20 µL.

Parameter Syarat Hasil yang diperoleh Kesimpulan

%RSD waktu retensi < 2% 0,8924% √

%RSD Luas puncak < 2% 1,2491% √

Lempeng Teoritis (N) > 2500 153 X

Asimetrisitas < 2,5 0,934 √

4.2.3 Penetapan Metode Ekstraksi

Metode ektraksi yang dilakukan bertujuan untuk memisahkan EPMS

dari gangguan yang terdapat didalam plasma seperti protein dan senyawa

endogen lainnya. Metode ekstraksi EPMS dalam plasma dilakukan dengan

35


cara pengendapan protein menggunakan pelarut organik untuk mendenaturasi

dan mengendapkan protein. Pelarut organik akan mengendapkan protein

bedasarkan prinsip polaritas dan menurunkan solubilitas protein. Penambahan

volume pelarut organik perlu dioptimasi agar EPMS terekstraksi dengan baik.

Didalam prosedur penetapan metode ekstraksi adanya perlakuan vortex adalah

untuk mencampurkan plasma yang telah ditambahkan dengan pelarut organik

dan perlakuan sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan pelarut pengestrak

dengan protein-protein plasma setelah pengocokan. Pelarut organik yang

digunakan adalah metanol dengan perbandingan metanol dalam plasma 1:1

dan 4:1. Setelah dilakukan pengamatan, dari dua perbandingan tersebut, tidak

ada puncak pengotor protein yang mengganggu pada waktu retensi EPMS

yang dilihat dari kromatogram blangko plasma. Gambar dapat dilihat pada

Gambar 4.6 dan 4.8.

Kemudian dilakukan pengamatan pada kromatogram plasma yang

mengandung EPMS dengan melakukan metode ekstraksi yang sama. Data

hasil analisis menunjukkan bahwa komposisi metanol sebanyak 4 kali bagian

plasma merupakan metode pengendapan protein yang baik, dikarenakan

menghasilkan asimetrisitas yang baik dan nilai resolusi yang paling besar

sehingga dapat memisahkan puncak pengotor plasma dengan EPMS jika

dibandingkan dengan perbandingan komposisi metanol sebanyak 1 kali bagian

plasma. Data dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan Gambar 4.7 dan 4.9.

Tabel 4.3 Hasil optimasi pengendapan protein plasma

Perbandingan Pelarut

Metanol dengan plasma

Luas puncak

(mAu)

N Resolusi Asimetrisitas

1:1 3,8328 442 0,96 1,67

4:1 3,4680 235 5,45 1,07

36


4.3 Validasi Metode Analisis EPMS dalam Plasma In Vitro

4.3.1 Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)

Validasi diawali dengan pengukuran batas kuantitasi (LOQ) dan batas

kuantitasi terendah (LLOQ). Rentang konsentrasi dalam plasma yang

digunakan adalah 5,05-40,4 µg/mL. Dari rentang konsentrasi tersebut

didapatkan persamaan regresi linear Y=0,4215x-0,4924. Kemudian dihitung

nilai LOQ, nilai LOQ yang diperoleh adalah 5,3767 µg/mL. data perhitungan

dapat dilihat selengkapnya pada Lampiran 3 Tabel 5.2. Kemudian dihitung

nilai LLOQ dengan melakukan pengenceran konsentrasi LOQ menjadi

Gambar 4.6 Kromatogram blangko plasma

pada perbandingan metanol dalam plasma 1:1

dengan fase gerak metanol-air (60:40v/v),

kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang

308 nm dan volume penyuntikan 20 µL.

Gambar 4.8 Kromatogram blangko plasma

pada perbandingan metanol dalam plasma 4:1

dengan fase gerak metanol-air (60:40v/v),

kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang

308 nm dan volume penyuntikan 20 µL.

Keterangan: A. Pengotor plasma dan B. EPMS

Gambar 4.9 Kromatogram EPMS pada

perbandingan metanol dalam plasma 4:1 dengan

fase gerak metanol-air (60:40v/v), kecepatan alir

1 mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan


Keterangan: A. Pengotor plasma dan B. EPMS

Gambar 4.7 Kromatogram EPMS pada

perbandingan metanol dalam plasma 1:1 dengan

fase gerak metanol-air (60:40v/v), kecepatan alir

1 mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan


A

B

A

B

37


setengah atau seperempatnya, sehingga nilai LLOQ yang diperoleh dari

setengah atau seperempat LOQ adalah sekitar 2,02 µg/mL. Setelah nilai

LLOQ diperoleh, maka dilakukan pembuatan kurva kalibrasi dan uji linearitas

EPMS dalam plasma dengan rentang konsentrasi 2,02-40,4 µg/mL dimana

didalamnya terdapat konsentrasi LLOQ.

4.3.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi

Analisis EPMS dalam plasma dibuat plasma blanko dan 7 konsentrasi

EPMS dalam plasma (termasuk LLOQ). Seri konsentrasi EPMS dalam plasma

yang dibuat adalah 2,02 µg/mL; 5,05 µg/mL, 10,1 µg/mL; 15,15 µg/mL; 20,2

µg/mL; 25,25 µg/mL dan 40,4 µg/mL.

Berdasarkan hasil perhitungan luas puncak yang didapatkan persamaan

kurva kalibrasi yang diperoleh, yaitu Y = 0,4226x - 0,5206; dimana x adalah

konsentrasi EPMS dan y adalah rata-rata luas puncak EPMS. Kurva kalibrasi

dari persamaan garis dapat dilihat pada Gambar 4.10 dibawah ini dan data

hasil percobaan selengkapnya tercantum pada Lampiran 4.

Gambar 4.10 Kurva kalibrasi EPMS dalam plasma

Uji Linearitas diperoleh dari kurva kalibrasi EPMS dalam plasma.

Linieritas EPMS dalam plasma dapat dilihat pada Gambar 4.10. Metode

analisis EPMS dalam plasma dengan rentang konsentrasi 2,02-40,4 µg/mL

y = 0,4226x - 0,5206

R² = 0,9989

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 10 20 30 40 50

Rat

a-ra

ta L

uas

Punca

k m

Au

Konsentrasi (µg/mL )

Kurva Kalibrasi EPMS dalam Plasma

Series1

Linear (Series1)

38


memenuhi kriteria uji linearitas dan dapat diterima untuk suatu metode

analisis yang valid dikarenakan dalam pembuatan kurva kalibrasi, diperoleh

persamaan regresi linier Y = 0,4226x-0,5206 dengan koefesien korelasi r =

0,9989. Dimana kriteria linearitas untuk sediaan dalam matriks biologis adalah

r = 0,95 atau lebih (FDA, 1998). Maka dapat disimpulkan bahwa metode telah

memenuhi persyaratan kurva kalibrasi yang baik.

Dengan menggunakan kurva kalibrasi diatas, kemudian dihitung Limit

Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ). LOD adalah konsentrasi analit

terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu

dapat dikuantifikasi. LOQ adalah kosentrasi analit terendah dalam sampel

yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada

kondisi operasional metode yang digunakan. Nilai LOD yang didapatkan

adalah 1,4511 µg/mL dan nilai LOQ yang didapatkan adalah 4,8370 µg/mL.

Data perhitungan nilai LOD dan LOQ dapat dapat dilihat selengkapnya pada

Lampiran 5.

4.3.3 Uji Selektivitas

Selektivitas dilakukan untuk mengetahui bahwa metode yang

ditetapkan dapat membedakan dan mengukur kadar analit dengan adanya

komponen-komponen lain dalam sampel (cairan biologis). Persyaratan untuk

uji selektivitas yaitu %KV dengan nilai tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ

dimana nilai KV tidak boleh lebih dari 20% dan akurasi nya (%diff) dengan

nilai + 15% dari nilai sebenarnya (FDA, 2001).

Dari hasil uji selektivitas yang dilakukan terhadap enam blangko

plasma manusia yang berbeda pada konsentrasi LLOQ yaitu 2,02 µg/mL,

diperoleh nilai %KV sebesar 4,1112% dan % diff antara -11,1933% sampai -

0,5684% serta tidak adanya gangguan dari senyawa lain atau pengotor plasma

pada kromatogram analisis. Data hasil uji selektivitas dapat dilihat pada Tabel

4.4. Dari hasil percobaan, uji selektivitas yang telah dilakukan untuk analisis

EPMS dalam plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan.

39


Tabel 4.4 Data hasil uji selektivitas

Konsentrasi

(µg/mL)

Plasma

Luas

puncak

(mAu)

Konsentrasi

terukur

(µg/mL)

SD

% KV

% diff

2,02

A 0,3032 1,9494

0,0779

4,1112

-3,4970

B 0,2628 1,8538 -8,2296

C 0,2614 1,8504 -8,3936

D 0,2375 1,7939 -11,1933

E 0,3282 2,0085 -0,5684

F 0,2909 1,9203 -4,9378

Rata-rata 1,8960 -6,1366

4.3.4 Uji Akurasi

Uji akurasi dilakukan dengan menggunakan plasma yang mengandung

EPMS dengan 3 konsentrasi yaitu rendah, sedang dan tinggi (FDA, 2001). Uji

akurasi ini bertujuan untuk memperoleh data kedekatan hasil pengujian

dengan kadar sebenarnya. Konsentrasi rendah merupakan tiga kali dari nilai

konsentrasi LLOQ. Konsentrasi sedang merupakan 50% dari konsentrasi

tertinggi pada rentang kurva kalibrasi. Sedangkan konsentrasi tinggi adalah

setidaknya 75% dari konsentrasi tertinggi pada rentang kurva kalibrasi

(European Medicines Agency, 2011). Dari perhitungan, didapatkan

konsentrasi rendah 6,06 µg/mL, konsentrasi sedang 18,18 µg/mL dan

konsentrasi tinggi 30,3 µg/mL. Analisis pada konsentrasi tersebut dilakukan

pengulangan sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi.

Untuk uji akurasi, persyaratan yang harus dipenuhi yaitu nilai rata-rata

%diff disyaratkan + 15% dari nilai sebenarnya, kecuali jika pengukuran

dilakukan pada kadar LLOQ maka tidak boleh melebihi 20% dan nilai dari uji

perolehan kembali berada dalam rentang 80-120% (FDA, 2001).

Hasil rata-rata % diff yang diperoleh untuk uji akurasi pada hari

pertama konsentrasi 6,06 µg/mL; 18,18 µg/mL dan 30,3 µg/mL adalah sebesar

1,8903%; 1,7745% dan 3,2315% dengan rata-rata %recovery sebesar

101,8903%; 101,7745% dan 103,2315%. Sedangkan, hasil rata-rata % diff

yang diperoleh untuk uji akurasi pada hari kedua konsentrasi 6,06 µg/mL;

18,18 µg/mL dan 30,3 µg/mL adalah sebesar -9,0847%; -0,8829% dan -

2,9914% dengan rata-rata %recovery sebesar 90,9153%; 99,1171% dan

40


97,0086%. Dari hasil percobaan, uji akurasi yang telah dilakukan untuk

analisis EPMS dalam plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan.

Data % diff dan %recovery untuk uji akurasi selengkapnya dapat dilihat pada

Lampiran 6 Tabel 6.5 dan 6.6.

4.3.5 Uji Presisi

Uji Presisi dilakukan dengan menggunakan plasma yang mengandung

EPMS dengan 3 konsentrasi yaitu rendah, sedang dan tinggi (FDA,2001). Uji

presisi ini menggambarkan kedekatan hasil pengukuran individual analit yang

satu dengan yang lainnya. Konsentrasi rendah merupakan tiga kali dari nilai

konsentrasi LLOQ. Konsentrasi sedang merupakan 50% dari konsentrasi

tertinggi pada rentang kurva kalibrasi. Sedangkan konsentrasi tinggi adalah

setidaknya 75% dari konsentrasi tertinggi pada rentang kurva kalibrasi

(European Medicines Agency, 2011). Dari perhitungan, didapatkan

konsentrasi rendah 6,06 µg/mL, konsentrasi sedang 18,18 µg/mL dan

konsentrasi tinggi 30,3 µg/mL. Analisis pada konsentrasi tersebut dilakukan

pengulangan sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi yang

dilakukan pengukuran selama 2 hari berturut-turut.

Pengukuran presisi pada setiap level konsentrasi, harus memiliki nilai

koefesien variasi (KV) tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ dimana nilai KV

tidak boleh lebih dari 20% (FDA, 2001; Harahap., 2010)

Dari percobaan ini, diperoleh nilai %KV untuk konsentrasi 6,06

µg/mL; 18,18 µg/mL dan 30,3 µg/mL pada hari pertama masing-masing

adalah sebesar 7,5913%; 2,5043%; dan 4,8409%. Untuk hari kedua, nilai

%KV yang diperoleh adalah 4,9695%; 0,7743%; dan 0,1417%. Hasil uji

presisi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 6 Tabel 5.5 dan 5.6. Dari

hasil percobaan, uji presisi yang telah dilakukan untuk analisis EPMS dalam

plasma sudah memenuhi kriteria yang dipersyaratkan.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

5.1.1 Kondisi optimasi metode analisis Etil p-metoksisinamat dalam plasma

secara in vitro menggunakan KCKT dengan detektor DAD, kolom

Acclaim® (C18) dengan panjang kolom 4,6 x 150 mm ukuran partikel

3 µm adalah dengan menggunakan fase gerak metanol-akuabidestilata

(60:40v/v) dengan laju alir 1,0 mL/menit yang dianalisis pada panjang

gelombang 308 nm untuk Etil p-metoksisinamat.

5.1.2 Proses optimasi ekstraksi Etil p-metoksisinamat dalam plasma untuk

metode analisis dalam KCKT adalah dengan menggunakan metanol

dalam plasma 4:1, waktu vortex selama 20 detik dan sentrifugasi

selama 10 menit pada kecepatan 3000 rpm.

5.1.3 Persyaratan untuk validasi yaitu kriteria linearitas untuk sediaan dalam

matriks biologis adalah r = 0,95 atau lebih. Uji selektivitas dengan

%KV dengan nilai tidak lebih dari 15%, kecuali LLOQ dimana nilai

KV tidak boleh lebih dari 20% dan akurasi nya (%diff) dengan nilai +

15% dari nilai sebenarnya. Untuk uji perolehan kembali berada dalam

rentang 80-120%. Dari hasil validasi diperoleh pada rentang

konsentrasi 2,02-40,4 µg/mL dihasilkan kurva kalibrasi yang linier

dengan koefesien korelasi sebesar 0,9989. Pada uji selektivitas

diperoleh nilai %KV sebesar 4,1112% dan % diff antara -11,1933%

sampai -0,5684%. Nilai %diff akurasi pada metode ini berada diantara

-12,4507% dan 10,5212% dengan nilai presisi (KV) antara 0,1417%

dan 7,5913% serta uji perolehan kembali antara 87,5493% dan

110,5212%. Dari hasil validasi menunjukkan bahwa metode analisis

yang digunakan telah memenuhi persyaratan linieritas, selektivitas,

akurasi dan presisi yang berlaku.

42


5.2 Saran

Untuk penelitian selanjutnya, disarankan untuk dapat melakukan

pengembangan metode validasi analisis Etil p-metoksisinamat dalam plasma

secara in vitro sehingga diharapkan hasil analisa menjadi lebih sempurna dan

dapat juga dilakukan uji in vivo.


DAFTAR PUSTAKA

Arief, Indra Akbar. 2013. Penetapan Kadar Etil p-metoksisinamat dalam Ekstrak

Etanol Rimpang Kencur (Kampferia galanga L.) secara Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi. Falkutas Farmasi. Universitas Pancasila Jakarta.

Skripsi.

Chemical Book. Akses online via http://www.chemicalbook.com/ (Diakses pada

tanggal 18 Januari 2016).

Evans, G. 2004. A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism. USA: CRC

Press.

Effendy 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. USU.

European Medicines Agency. 2011. Guideline on bioanalytical method

validation. Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP).

Food and Drug Administration. 1998. Guidance for Industry: Bioanalytical

Method Validation for Human Studies. Rockville: Center for Drug

Evaluation and Research

Food and Drug Administration. 2001. Guidance for Industry: Bioanalytical

Method Validation. Rockville: Center for Veterinary Medicine.

Gandjar, I. G., & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka

Pelajar.

Harahap, Y. 2010. Peran Bioanalisis dalam Penjaminan Kualitas Obat dan

Peningkatan Kualitas Hidup Pasien. Jakarta: UI Press.

44


Harahap, Y. 2009. Validasi Metode Analisis Rebamipid dalam Plasma secara

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi-Ultraviolet. Majalah Ilmu Kefarmasian

Vol. I. No. 3 hal. 156-167.

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian Vol. I. No. 3 hal. 117-135.

Johnson, E.L. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terj. Kosasih

Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB Press.

Kelly, M.T. 1992. Drug Analysis in Biological Fluids. Dalam: Chemical Analysis

in Complex Matrices. New York: Ellis Horwood.

Meyer, Veronika R. 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography

5th

Edition. Chichester: Wiley.

Parwa, B. 1991. Analisis Farmasi: Metode Modern. Surabaya : Airlangga

University Press.

Poedjaji, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.

Polson, Cara; Pratibha Sarkar; Bev Incledon; Vanaja Raguvaran; Russell Grant.

2003. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of

protein removal and ionization effect in liquid chromatography– tandem

mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 785 (2003) 263-275.

Rosenbaum, Sara. 2011. Basic Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. USA:

John Wiley and Sons.

Shargel, L. dan Andrew B.C.Yu. 2005. Biofarmasetika dan Farmakokinetika

Terapan. Terj. Siti Sjamsiah. Surabaya: Universitas Airlangga Press.

45


Sheerwood, Lauralee. 1996. Fisiologi Manusia dari Sel ke Sistem Edisi Kedua.

Terj. Brahm U. Pendit. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Sukandar, E. Y. 2006. Tren dan Paradigma Dunia Farmasi, Industri-Klinik-

Teknologi Kesehatan, disampaikan dalam orasi ilmiah Dies Natalis ITB.

Syaifuddin. 2006. Anatomi Fisiologi untuk Mahasiswa Keperawatan Edisi 3.

Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Taufikurohmah, T; Rusmini; Nurhayati. 2008. Pemilihan Pelarut dan Optimasi

Suhu pada Isolasi Etil Para Metoksisinamat (EPMS) dari Rimpang

Kencur sebagai Bahan Tabir Surya pada Industri Kosmetik.

Umar, Muhammad I; Mohd Zaini Asmawi; Amirin Sakudin; Item J. Atangwho I;

Mun Fei Yam; Rabia Altaf; Ashaq Ahmed. 2012. Bioactivity-Guided

Isolation of Ethyl-p-methoxycinnamate, an Anti-inflammatory

Constituent, from Kampferia galangal L. Extracts. Molecules, 17, 8720-

8734.

Umar, Muhammad I; Mohd Zaini Asmawi; Amirin Sakudin; Item J. Atangwho I;

Mun Fei Yam; Rabia Altaf; Ashaq Ahmed. 2014. Ethyl-p-

methoxycinnamate Isolated from Kampferia galangal L. Inhibits

Inflammation by Suppressing Interleukin-1, Tumor Necrosis Factor-α, and

Angiogenesis by Blocking Endothelial Functions. Clinics 2014;69(2);134-

144.

Windono, Tri; Jany, Widji Surartri. 1997. Aktivitas Tabir Matahari Etil p-

metoksisinamat yang diisolasi dari Rimpang Kencur. Warta Tumbuhan

Obat Indonesia Volume 3 No.4.

46


Lampiran 1. Alur Penelitian

Etil p-

metoksisinamat

(EPMS)

Analisis EPMS dalam plasma

menggunakan KCKT

Optimasi kondisi analisis EPMS

Penetapan panjang gelombang

optimum analisis

Pemilihan fase

gerak

Uji kesesuaian sistem

Penyiapan sampel EPMS dalam plasma

Validasi metode analisis

Uji

Selektivitas

Uji LOD

& LOQ

Uji

linearitas

Uji

Akurasi

Uji

Presisi

Penetapan metode ekstraksi

Terbukti memiliki

aktivitas sebagai

antiinflamasi

Senyawa isolat

dari rimpang

kencur

(Kaempferia

galanga. L)

Analisis EPMS

dalam plasma

47


Lampiran 2. Kromatogram Hasil Analisa

Gambar 5.1 Kromatogram sampel plasma kosong (blangko) dengan komposisi fase gerak

metanol:air (60:40 v/v), kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang 308 nm dan volume

penyuntikan 20 µL.

Gambar 5.2 Kromatogram EPMS dalam sampel plasma pada konsentrasi 20 µg/mL dengan

komposisi fase gerak metanol:air (60:40 v/v), kecepatan alir 1 mL/menit, panjang gelombang 308

nm dan volume penyuntikan 20 µL.

48


Lampiran 3. Uji Kesesuaian Sistem

Tabel 5.1 Uji kesesuaian sistem EPMS pada konsentrasi 10,1 µg/mL dengan komposisi

fase gerak metanol:air (60:40 v/v) pada kecepatan alir 1 ml/menit, panjang gelombang 308 nm dan


Konsentrasi

(µg/mL)

Waktu Luas Area

(mAu)

N HETP Asimetri

10,1 10,060 23,2469 248 0,6048 0,90

10,1 10,197 22,6231 91 1,6484 0,88

10,1 10,000 23,0969 180 0,8333 1,00

10,1 10,037 23,1422 172 0,8721 1,00

10,1 10,187 22,675 75 2 0,89

Rata-rata 10,096 22,9568 153 1,1917 0,934

SD 0,0901 0,2868 - - -

KV % 0,8924% 1,2491% - - -

Syarat KV <2% KV<2% > 2500 < 1 < 2,5

Kesimpulan √ √ X X √

49


Lampiran 4. Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)

Tabel 5.2 Data Hasil Pengukuran Limit Kuantitasi Terendah (LLOQ)

Konsentrasi

(µg/mL)

Rata-rata

Luas Puncak

(mAu)

Luas puncak

berdasarkan

persamaan

regresi linear

(Y-Y’)

(Y-Y’)2

5,05 1,6736 1,6151 0,0585 0,0034

10,1 3,5159 3,7226 -0,2067 0,0427

15,15 5,6731 5,8301 -0,157 0,0246

20,2 8,1607 7,9376 0,2231 0,0498

25,25 10,2894 10,0451 0,2443 0,0597

40,4 16,2089 16,3676 -0,1587 0,0252

Jumlah (Y-Y’)2 0,2054

Persamaa regresi linear : Y=0,4215x-0,4924

S (y/x) = √∑(𝑌−𝑌′)2

𝑛−2= √

0,2054

4 = 0,2266

LOQ = 10 𝑥 𝑆(

𝑦

𝑥)

𝑏 =

10𝑥 0,2266

0,4215 = 5,3767 µg/mL

LLOQ = ½ LOQ = 2,6883 µg/mL

= ¼ LOQ = 1,3442 µg/mL

50


Lampiran 5. Uji Linearitas dan Pembuatan Kurva Kalibrasi

Tabel 5.3 Data hasil uji linearitas

Konsentrasi

(µg/mL)

Luas Puncak

(mAU)

Rata-rata Luas Puncak

(mAu)

2,02

0,2909

0,2772 0,2634

5,05

1,6822

1,6736 1,6649

10,1

3,4680

3,5159 3,5637

15,15

5,8701

5,6731 5,4761

20,2

8,2559

8,1607 8,0655

25,25

10,4337

10,2894 10,1361

40.4

16,3614

16,2089 16,0564

y = 0,4226x - 0,5206

R² = 0,9989

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 10 20 30 40 50

Rat

a-ra

ta L

uas

Punca

k m

Au

Konsentrasi (µg/mL )

Kurva Kalibrasi EPMS dalam Plasma

Series1

Linear (Series1)

51


Kondisi Analisis

Kolom : Dionex C18 150 x 4,6 x 3 µm

Fase gerak : Metanol -Air dengan perbandingan 60:40 v/v

Laju alir : 1 ml/menit

Teknik : Isokratik

Panjang Gelombang : 308 nm

Volume Injeksi : 20 µl

Suhu kolom : Ambient

52


Lampiran 6. Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Tabel 5.4 Data hasil perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Konsentrasi

(µg/mL)

Rata-rata

Luas Puncak

(mAu)

Luas puncak

berdasarkan

persamaan

regresi linear

(Y-Y’)

(Y-Y’)2

2,02 0,2772 0,3246 -0,0474 0,0022

5,05 1,6736 1,5924 0,0812 0,0066

10,1 3,5159 3,7054 -0,1895 0,0359

15,15 5,6731 5,8184 -0,1453 0,0211

20,2 8,1607 7,9314 0,2293 0,0526

25,25 10,2894 10,0444 0,2450 0,0600

40,4 16,2089 16,3834 -0,1745 0,0305

Jumlah (Y-Y’)2 0,2089

Persamaan regresi linear : Y=0,4226x-0,5206

S (y/x) = √∑(𝑌−𝑌′)2

𝑛−2= √

0,2089

5 = 0,2044

LOD = 10 𝑥 𝑆(

𝑦

𝑥)

𝑏 =

3𝑥0,2044

0,4226 = 1,4511 µg/mL

LOQ = 10 𝑥 𝑆(

𝑦

𝑥)

𝑏 =

10𝑥 0,2044

0,4226 = 4,8370 µg/mL

53


Lampiran 7. Akurasi dan Presisi

Tabel 5.5 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi (Hari ke-1)

Konsentrasi

(µg/mL)

Luas

puncak

(mAu)

Konsentrasi

terukur

(µg/mL)

%

recovery

% diff SD %KV

6,06

1,9273 5,7925 95,5854 -4,4146

0,4687

7,5913 2,0292 6,0336 99,5644 -0,4356

2,3098 6,6976 110,5212 10,5212

Rata-rata - 6,1745 101,8903 1,8903 - -

18,18

7,4736 18,9167 104,0523 4,0523

0,4634

2,5043 7,3351 18,5890 102,2496 2,2496

7,0871 18,0021 99,0216 -0,9784

Rata-rata - 18,5026 101,7745 1,7745 - -

30,3

13,0515 32,1157 105,9924 5,9925

1,5142

4,8409

11,9593 29,5312 97,4628 -2,5372

13,0831 32,1905 106,2392 6,2392

Rata-rata - 31,2791 103,2315 3,2315 - -

Tabel 5.6 Data Hasil Uji Akurasi dan Presisi (Hari ke-2)

Konsentrasi

(µg/mL)

Luas

puncak

(mAu)

Konsentrasi

terukur

(µg/mL)

%

recovery

% diff SD %KV

6,06

1,7215 5,3055 87,5493 -12,4507

0,2738

4,9695

1,7624 5,4023 89,1464 -10,8536

1,9392 5,8206 96,0501 -3,9499

Rata-rata - 5,5095 90,9153 -9,0847 - -

18,18

7,1527 18,1574 99,8755 -0,1245

0,1395

0,7743 7,0958 18,0227 99,1348 -0,8651

7,0348 17,8784 98,3409 -1,6591

Rata-rata - 18,0195 99,1171 -0,8829 - -

30,3

11,9155 29,4276 97,1208 -2,8792

0,0416

0,1417 11,8815 29,3471 96,8552 -3,1448

11,9064 29,4061 97,0497 -2,9503

Rata-rata - 29,3936 97,0086 -2,9914 - -

54


Lampiran 8. Rumus-rumus

Tabel 5.7 Rumus-rumus

Nama Rumus Formula

Simpangan baku residual

Batas Deteksi

Batas Kuantitasi

%diff

% recovery

Simpangan Deviasi

Relative Standar Deviation

N (Jumlah Lempeng Teoritis)

Height Equivalent to A

Theorotical Plate

Asimetrisitas

Resolusi (R)

S(y/x) = √∑(𝑌−𝑌𝑖)2

𝑛−2

LOD = 3,3 S(y/x)

𝑏

LOQ = 10 S(y/x)

𝑏

%diff = 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠−𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎

% recovery = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎𝑥 100%

RSD = 𝑆𝐷

𝑋𝑥 100%

N= 16 (𝑡𝑅

𝑊)2

HETP = 𝐿

𝑁

Tf = 𝑊 0,05

2𝑓

R = 2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)

𝑊1+𝑊2

55


Lampiran 9. Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Keterangan Gambar :

A. Wadah penampung fase gerak

B. Pompa

C. Injector

D. Kolom C18; 3µm 4,6 X 150 mm (Dionex, Acclaim® Polar Advantage II)

E. Detektor (Diode Array Detector)

F. Komputer dengan perangkat lunak Chormeleon

Gambar 5.3 Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dionex Ultimate ® 3000

A

B

C

E

C

D

C

F

56


Lampiran 10. Overlay Kromatogram Kurva Kalibrasi

Gambar 5.4 Overlay dari Beberapa Kromatogram pada Kurva Kalibrasi

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 17.0

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

15.0

1 - KURVAKALIBRASI #7 2 PPM UV_VIS_1






7 - KURVAKALIBRASI #1 25 PPM UV_VIS_1mAU

min

7654321

1 - 1.4002 - 1.590

3 - 5.400 4 - 10.407

WVL:308 nm

57


Lampiran 11. Dokumentasi Penelitian

Gambar 5.5 Plasma

Gambar 5.7 Vial KCKT

Gambar 5.9 Penyaringan Fase gerak

Gambar 5.6 EPMS dalam plasma setelah

divortex

Gambar 5.8 Pot penyimpanan sampel EPMS

Gambar 5.10 Kolom KCKT

58


Gambar 5.11 Sentrifugator

Gambar 5.13 Vortex

Gambar 5.12 Sonikator

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Validasi Metode Analisis ...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Validasi Metode Analisis ...