UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA -...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI MIKROBA ENDOFIT DARI DAUN

TANAMAN Garcinia benthami Pierre TERHADAP

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium

SKRIPSI

ARINI EKA PRATIWI

NIM. 1111102000051

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

JUNI 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI MIKROBA ENDOFIT DARI DAUN

TANAMAN Garcinia benthami Pierre TERHADAP

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

ARINI EKA PRATIWI

NIM. 1111102000051

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

JAKARTA

JUNI 2015

vi

ABSTRAK

Nama : Arini Eka Pratiwi

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi, Seleksi dan Uji Aktivitas Antibakteri Mikroba

Endofit dari Daun Tanaman Garcinia benthami Pierre

terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella

typhimurium

Mikroba endofit dapat ditemukan di hampir setiap tanaman di bumi. Mikroba

endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan pada periode

tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa

membahayakan inangnya, bahkan seringkali bersimbiosis secara mutualisme.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menyeleksi isolat mikroba endofit

dari daun Garcinia benthami Pierre yang berpotensial dalam menghasilkan

senyawa antibakteri. Aktivitas antibakteri isolat mikroba endofit dapat dilihat dari

pembentukan zona hambat di sekitar koloni menggunakan metode difusi agar

padat dan difusi cakram dengan bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus

ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 35218,

Shigella dysenteriae ATCC 13313 dan Salmonella typhimurium ATCC 14028.

Hasil isolasi mikroba endofit dari daun Garcinia benthami Pierre memberikan 18

isolat kapang endofit dan 7 isolat bakteri endofit. Fermentasi dilakukan terhadap 6

isolat kapang endofit pada media Potato Dextrose Yeast (PDY) selama tiga

minggu dengan kondisi stasioner dan 7 isolat bakteri endofit pada media Nutrient

Broth (NB) selama dua hari dengan kultur kocok. Hasil fermentasi kapang endofit

menunjukkan bahwa isolat kapang GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18

aktif terhadap Bacillus subtilis ATCC 6633; isolat kapang GB18 aktif terhadap

Escherichia coli ATCC 35218; isolat kapang GB2, GB16, dan GB17 aktif

terhadap Shigella dysenteriae ATCC 13313; isolat kapang GB2 dan GB8 aktif

terhadap Salmonella typhimurium ATCC 14028. Hasil fermentasi bakteri endofit

menunjukkan bahwa isolat bakteri IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan

IGB7 aktif terhadap Escherichia coli ATCC 35218; isolat bakteri IGB3, IGB5,

dan IGB6 aktif terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538; isolat bakteri IGB1

dan IGB3 aktif terhadap Bacillus subtilis ATCC 6633; isolat bakteri IGB3 dan

IGB6 aktif terhadap Shigella dysenteriae ATCC 13313; isolat bakteri IGB3 aktif

terhadap Salmonella typhimurium ATCC 14028.

Kata Kunci: Garcinia benthami Pierre, mikroba endofit, antibakteri, metode difusi

agar padat, metode difusi cakram.

vii

ABSTRACT

Nama : Arini Eka Pratiwi

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolation, Selection and Antibacterial Assay of Endophytic

Microbes from the Leaves of the Plant Garcinia benthami

Pierre against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Shigella dysenteriae, and Salmonella

typhimurium

Endophytic microbes can be found in almost every plant on earth. Endophytic

microbes are microbes that live inside plant tissues on certain periodes and is able

to form a colony inside plant tissues without indangering the host of the plant,

moreover it undergoes symbyosis mutualistically. The purpose of this research

was to isolate and select endophytic microbes from Garcinia benthami Pierre

leaves that have potential to produce antibacterial compounds. Antibacterial

activity was determined by measuring the inhibition zone with Diffusion Agar

Plate and Disc Diffusion methods using pathogenic bacteria i.e. Escherichia coli

ATCC 35218, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633,

Shigella dysenteriae ATCC 13313 and Salmonella typhimurium ATCC 14028.

The results of the endophytic microbes isolation in these experiments showed that

there were 18 isolates of endophytic fungi and 7 isolates of endophytic bacteria.

Fermentation carried out against 6 isolates of endophytic fungi in medium Potato

Dextrose Yeast (PDY) for three weeks with stationary conditions and 7 isolates of

endophytic bacteria in medium Nutrient Broth (NB) for two days with shaker

culture. The result of the endophytic fungi fermentation showed that GB2, GB8,

GB14, GB16, GB17, and GB18 isolates of fungi were active against Bacillus

subtilis ATCC 6633; GB18 isolates of fungi were active against Escherichia coli

ATCC 35218; GB2, GB16, and GB17 isolates of fungi were active against

Shigella dysenteriae ATCC 13313; GB2 and GB8 isolates of fungi were active

against Salmonella typhimurium ATCC 14028. The result of the endophytic

bacteria fermentation showed that IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, and

IGB7 isolates of bacteria were active against Escherichia coli ATCC 35218;

IGB3, IGB5, and IGB6 isolates of bacteria were active against Staphylococcus

aureus ATCC 6538; IGB1 and IGB3 isolates of bacteria were active against

Bacillus subtilis ATCC 6633, IGB3 and IGB6 isolates of bacteria were active

against Shigella dysenteriae ATCC 13313, IGB3 isolates of bacteria were active

against Salmonella typhimurium ATCC 14028.

Keyword: Garcinia benthami Pierre, endophytic microbes, antibacterial, diffusion

agar plate methods, disc diffusion methods.

viii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmannirrahim

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT yang telah

melimpahkan segala rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat

menyelesaikan penulisan skripsi dengan judul “Isolasi, Seleksi dan Uji Aktivitas

Antibakteri Mikroba Endofit dari Daun Tanaman Garcinia benthami Pierre

terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella

dysenteriae, dan Salmonella typhimurium”. Shalawat serta salam semoga

senantiasa tercurah limpahkan pada Nabi Muhammad SAW beserta para keluarga

dan sahabatnya.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat kelulusan tingkat sarjana di

Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian ini tidaklah dapat

terselesaikan tanpa dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Dalam kesempatan

ini, penulis ingin mengucapkan terima kasih terkhususkan kepada:

1. Ibu Puteri Amelia, M.Farm., Apt. selaku pembimbing I dan Bapak Saiful

Bahri, M.Si selaku pembimbing II, yang telah meluangkan waktu, tenaga, dan

pikiran serta dengan sabar membimbing dan mengajari penulis sehingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, S.KM., M. Kes, selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akademika Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan ilmunya kepada penulis.

5. Ayahanda tercinta, Bapak Nurtejo dan Ibunda tercinta, Ibu Rosadah terima

kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih sayang, dan dukungannya

yang menguatkan penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

ix

6. Adikku tersayang Rashanda dan Quesy Al Farroby yang selalu mendoakan

dan menghibur disaat penulis kesulitan.

7. Seluruh laboran di PLT dan FKIK, Mba Puji, Mba Festy, Kak Amal, dan Mba

Rani yang telah banyak membantu selama proses penelitian.

8. Teman-teman seperjuangan mikrobiologi yakni Brasti, Ati, Rahma, Puput,

Ambar, Meri, Imeh, Fitri, Cumi, Dila, Syaima, Adit, BTR, dan Mozer.

9. Sahabat-sahabatku yaitu Sheila, Meryza, Puput, dan Athiyah.

10. Seluruh teman-teman Farmasi Angkatan 2011 BD. Kebersamaan kita di dalam

suka dan duka akan selalu terkenang di dalam hati.

11. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi ini.

Dengan keterbatasan pengalaman, pengetahuan, maupun pustaka yang

ditinjau, penulis menyadari bahwa dalam skripsi ini terdapat banyak kekurangan.

Untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran. Semoga skripsi ini dapat

memberikan manfaat bagi kepentingan keilmuan maupun aplikasi di bidang

kesehatan.

Jakarta, 19 Juni 2015

Penulis

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ……………………………………………….………. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS …………………………. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …....……………………. iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI …………………………………. v

ABSTRAK …………………………………………………………………. vi

ABSTRACT ……………………………………………………………….. vii

KATA PENGANTAR …………………………………………………….. viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ……….. ix

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI …………. x

DAFTAR ISI ……………………………………………………….…….… xi

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………. xiv

DAFTAR TABEL ………………………………………………………….. xvi

DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………. xvii

DAFTAR ISTILAH ………………………………………………………... xviii

BAB 1 PENDAHULUAN …………………………………..……………... 1

1.1 Latar Belakang ………..…………………………..……………. 1

1.2 Rumusan Masalah ……………………………….………….….. 3

1.3 Tujuan Penelitian …………………………….…………….…… 3

1.4 Manfaat Penelitian ……………………………….………….….. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ………………………………..………….. 5

2.1 Mikroba Endofit ……………………………………..………….. 5

2.1.1 Mikroba Endofit yang Menghasilkan Antibiotika .….…… 6

2.1.2 Isolasi Fungi Endofit ………….………………………….. 6

2.2 Mikroba …………………….…………………………………... 7

2.2.1 Definisi ………………………….………………………... 7

2.2.2 Jenis ………………………………………….…………… 7

2.2.2.1 Bakteri ……………………………………………. 7

2.2.2.2 Kapang …………………………………………… 10

2.2.3 Patologis ………………………………………….………. 11

2.3 Karakterisasi Mikroba ………………….………………………. 12

2.3.1 Karakterisasi Bakteri ……………………….…………….. 12

2.3.1.1 Teknik Pewarnaan ………………………………... 12

2.3.2 Karakterisasi Kapang ………………………….…………. 14

2.4 Antimikroba …………………..…………………………..…….. 14

2.4.1 Definisi …………………………………………..……….. 14

2.4.2 Aktivitas dan Spektrum …………………………….....….. 14

2.4.3 Mekanisme Kerja ………………………………….....…… 15

2.5 Uji Aktivitas Antimikroba ……..……………………..……….... 16

2.5.1 Metode Difusi ………………………………..………….... 16

2.5.2 Metode Dilusi ………………...…………………………… 18

2.5.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Metode Difusi pada

Pengujian Aktivitas Antimikroba…………….…………… 18

2.6 Pemilihan Media ……………………………………………….. 20

2.7 Bakteri Uji ……………………………………..………….……. 20

xii

2.7.1 Staphylococcus aureus ………………………………...…. 20

2.7.2 Bacillus subtilis ……………….......…………...…………. 21

2.7.3 Escherichia coli …………………………….…………..… 22

2.7.4 Shigella dysenteriae ………………………………..…….. 22

2.7.5 Salmonella typhimurium ……………………………...….. 23

2.8 Genus Garcinia …………………………………...……….…..... 24

2.9 Garcinia benthami Pierre ……………………..……...……..… 25

BAB 3 METODE PENELITIAN ……………………………………..…... 28

3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian ……………………………..…….. 28

3.2 Alat …………………………………...…………………………. 28

3.3 Bahan ………………………………………...…………………. 28

3.3.1 Sampel Penelitian ……………………………………..….. 28

3.3.2 Bahan untuk Proses Sterilisasi Permukaan …………….… 28

3.3.3 Bahan untuk Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba … 29

3.3.4 Bakteri Uji …………………………………………...….. 29

3.3.5 Bahan untuk Karakterisasi Mikroba Endofit dan

Uji Kemurnian Mikroba Uji ………………………..…….. 29

3.3.6 Kontrol Uji Aktivitas Antibakteri ………..…….……….… 29

3.4 Prosedur Penelitian ……………………………………………… 29

3.4.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba ………………… 29

3.4.1.1 Pembuatan Media PDA ……………….………..…. 29

3.4.1.2 Pembuatan Media Agar Miring PDA ………..…… 30

3.4.1.3 Pembuatan Media NA …………………..….....….. 30

3.4.1.4 Pembuatan Media Agar Miring NA …………….… 30

3.4.1.5 Pembuatan Media MHA ………………………..… 31

3.4.1.6 Pembuatan Media PDY Broth ………….…….…… 31

3.4.1.7 Pembuatan Media NB …………...……..…………. 31

3.4.2 Isolasi Mikroba Endofit ……………………..…………….. 31

3.4.2.1 Sampling Tanaman ……………….…….…………. 31

3.4.2.2 Sterilisasi Permukaan ………………….………….. 32

3.4.3 Pemurnian Mikroba Endofit ……………………...……….. 32

3.4.3.1 Pemurnian Kapang Endofit ………………..……… 32

3.4.3.2 Pemurnian Bakteri Endofit …………...…………… 33

3.4.4 Karakterisasi Mikroba Endofit …………………….…..….. 33

3.4.4.1 Karakterisasi Kapang Endofit ……………….……. 33

3.4.4.2 Karakterisasi Bakteri Endofit ..……………………. 34

3.4.5 Uji Kemurnian Bakteri Uji ………………………………... 35

3.4.6 Peremajaan Bakteri Uji …………………………………… 35

3.4.7 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ………………………….. 35

3.4.8 Skrining Mikroba Endofit yang Berpotensi sebagai

Antibakteri …………………………………….………….. 36

3.4.8.1 Skrining Fungi Endofit yang Berpotensi sebagai

Antibakteri…………………………………..…….. 36

3.4.8.2 Skrining Bakteri Endofit yang Berpotensi sebagai

Antibakteri…………………………………...……. 36

3.4.9 Fermentasi Mikroba Endofit …………………………….... 37

3.4.9.1 Fermentasi Kapang Endofit …………………….… 37

3.4.9.2 Fermentasi Bakteri Endofit ….………..………...… 37

xiii

3.4.10 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi

Mikroba Endofit …………………………………....……. 38

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………..…………….. 39

4.1 Hasil ……………………………………………………………. 39

4.1.1 Isolasi Mikroba Endofit ………………………………….. 39

4.1.2 Uji Kemurnian Bakteri Uji ……………………………….. 40

4.1.3 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji …………………………. 42

4.1.4 Karakterisasi Mikroba Endofit …………………………... 43

4.1.4.1 Karakterisasi Kapang Endofit …………………..... 43

4.1.4.2 Karakterisasi Bakteri Endofit ……………………. 61

4.1.5 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Mikroba Endofit …… 65

4.1.5.1 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Kapang Endofit 65

4.1.5.2 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Endofit 67

4.1.6 Fermentasi Mikroba Endofit …………………………….. 69

4.1.7 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi

Mikroba Endofit ……………............................................. 69

4.1.7.1 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil

Fermentasi Kapang Endofit ……………………… 69

4.1.7.2 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil

Fermentasi Bakteri Endofit ……………………... 71

4.2 Pembahasan …………………………………………………….. 73

BAB 5 PENUTUP …………………………………………………………. 81 5.1 Kesimpulan …………………………………………………….. 81

5.2 Saran …………………………………………………………… 81

BAGAN ALUR PENELITIAN ……………….………………………….... 82

DAFTAR REFERENSI …………...………………………….……………. 83

LAMPIRAN …………………………………………………...……………. 88

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Struktur Sel Bakteri …………………………………………. 8

Gambar 2.2 Garcinia benthami Pierre …………………………………… 25

Gambar 4.1 Escherichia coli ……………………………………………... 41

Gambar 4.2 Staphylococcus aureus ……………………………………… 41

Gambar 4.3 Bacillus Subtilis ……………………………………………... 41

Gambar 4.4 Shigella dysenteriae …………………………………………. 41

Gambar 4.5 Salmonella typhimurium …………………………………….. 42

Gambar 4.6 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji …………………………….. 42

Gambar 4.7 Isolat GB1 …………………………………………………… 43

Gambar 4.8 Isolat GB2 …………………………………………………… 44

Gambar 4.9 Isolat GB3 …………………………………………………… 45

Gambar 4.10 Isolat GB4 …………………………………………………… 46

Gambar 4.11 Isolat GB5 …………………………………………………… 47

Gambar 4.12 Isolat GB6 …………………………………………………… 48

Gambar 4.13 Isolat GB7 …………………………………………………… 49

Gambar 4.14 Isolat GB8 …………………………………………………… 50

Gambar 4.15 Isolat GB9 …………………………………………………... 51

Gambar 4.16 Isolat GB10 …………………………………………………. 52

Gambar 4.17 Isolat GB11………………………………………………….. 53

Gambar 4.18 Isolat GB12………………………………………………….. 54

Gambar 4.19 Isolat GB13………………………………………………….. 55

Gambar 4.20 Isolat GB14………………………………………………….. 56

Gambar 4.21 Isolat GB15………………………………………………….. 57

Gambar 4.22 Isolat GB16………………………………………………….. 58

Gambar 4.23 Isolat GB17………………………………………………….. 59

Gambar 4.24 Isolat GB18………………………………………………….. 60

Gambar 4.25 Isolat IGB1 ………………………………………………….. 61







Gambar 4.32 Zona hambat isolat kapang endofit terhadap B.subtilis …….. 66

Gambar 4.33 Zona hambat isolat kapang endofit terhadap S.aureus ….….. 66

Gambar 4.34 Zona hambat isolat GB2 terhadap S.dysenteriae …………… 66

Gambar 4.35 Zona hambat isolat GB2 terhadap S.typhimurium…...……… 67

Gambar 4.36 Zona antagonis isolat bakteri endofit terhadap E.coli, S.aureus,

& S.dysenteriae ……………………………………………… 68

Gambar 4.37 Zona hambat uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil

fermentasi kapang endofit …………………………………… 70


fermentasi bakteri endofit terhadap E.coli ………………..… 71


xv

fermentasi bakteri endofit terhadap S.aureus ……………….. 72


fermentasi bakteri endofit terhadap B.subtilis ………………. 72


fermentasi bakteri endofit terhadap S.dysenteriae …………... 72


fermentasi bakteri endofit terhadap S.typhimurium………….. 72

xvi

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Beberapa ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif ……….…. 9

Tabel 2.2 Pewarnaan Gram ……………………………………………….. 13

Tabel 4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Kapang Endofit ……….…... 67

Tabel 4.2 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Endofit ………….… 68

Tabel 4.3 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang

Endofit ………………………………………………………….. 70

Tabel 4.4 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Bakteri

Endofit ……………………………………………………….…. 71

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Hasil Determinasi Tanaman ……………………………….. 88

Lampiran 2 Bagan Sterilisasi Permukaan ……………………………….. 89

Lampiran 3 Bagan Isolasi Mikroba Endofit …………………………….. 89

Lampiran 4 Bagan Pemurnian Mikroba Endofit ………………………… 90

Lampiran 5 Bagan Karakterisasi Kapang Endofit ……………………… 91

Lampiran 6 Bagan Fermentasi Mikroba Endofit ………………………… 92

Lampiran 7 Bagan Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi

mikroba endofit ………………………………………..…… 93

Lampiran 8 Hasil Isolasi Mikroba Endofit ……………………………… 93

Lampiran 9 Hasil Stock Culture Mikroba Endofit ……………………… 96

Lampiran 10 Hasil Fermentasi Mikroba Endofit ………………………… 96

Lampiran 11 Data Absorbansi Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji …………. 97

xviii

DAFTAR ISTILAH

AM : Antimikroba

ATCC : American Type Culture Collection

CaCO3 : Kalsium karbonat

DNA : Deoxyribose-nucleic Acid

GB1 : Kode isolat kapang endofit pertama yang diisolasi dari daun yang

berada di tengah ranting

GB2 : Kode isolat kapang endofit kedua yang diisolasi dari daun yang


GB3 : Kode isolat kapang endofit ketiga yang diisolasi dari daun yang

berada di pangkal ranting

GB4 : Kode isolat kapang endofit keempat yang diisolasi dari daun yang


GB5 : Kode isolat kapang endofit kelima yang diisolasi dari daun yang

berada di dekat pucuk daun

GB6 : Kode isolat kapang endofit keenam yang diisolasi dari daun yang


GB7 : Kode isolat kapang endofit ketujuh yang diisolasi dari daun yang

berada di pangkal ranting

GB8 : Kode isolat kapang endofit kedelapan yang diisolasi dari pucuk

daun

GB9 : Kode isolat kapang endofit kesembilan yang diisolasi dari daun

yang berada di tengah ranting

GB10 : Kode isolat kapang endofit kesepuluh yang diisolasi dari daun


GB11 : Kode isolat kapang endofit kesebelas yang diisolasi dari daun


GB12 : Kode isolat kapang endofit keduabelas yang diisolasi dari daun


GB13 : Kode isolat kapang endofit ketigabelas yang diisolasi dari daun

yang berada di pangkal ranting

GB14 : Kode isolat kapang endofit keempatbelas yang diisolasi dari daun


GB15 : Kode isolat kapang endofit kelimabelas yang diisolasi dari daun


GB16 : Kode isolat kapang endofit keenambelas yang diisolasi dari daun


GB17 : Kode isolat kapang endofit ketujuhbelas yang diisolasi dari daun


GB18 : Kode isolat kapang endofit kedelapanbelas yang diisolasi dari

daun yang berada di pangkal ranting

IGB1 : Kode isolat bakteri endofit pertama yang diisolasi dari pucuk daun

IGB2 : Kode isolat bakteri endofit kedua yang diisolasi dari pucuk daun

IGB3 : Kode isolat bakteri endofit ketiga yang diisolasi dari pucuk daun

xix

IGB4 : Kode isolat bakteri endofit keempat yang diisolasi dari daun yang


IGB5 : Kode isolat bakteri endofit kelima yang diisolasi dari daun yang


IGB6 : Kode isolat bakteri endofit keenam yang diisolasi dari daun yang


IGB7 : Kode isolat bakteri endofit ketujuh yang diisolasi dari daun yang


IgM : Immunoglobulin M

KBM : Kadar Bunuh Minimum

KHM : Kadar Hambat Minimum

LAFC : Laminar Air Flow Cabinet

MBC : Minimum Bactericidal Concentration

MIC : Minimum Inhibitory Concentration

MHA : Mueller Hinton Agar

mRNA : messenger Ribonucleic Acid

NA : Nutrient Agar

NaCl : Natrium Klorida

NaOCl : Natrium Hipoklorit

NB : Nutrient Broth

NRRL : Northern Regional Research Laboratory

OD : Optical Density

PABA : Para Amino Benzoic Acid

PAS : Asam p-aminosalisilat

PDA : Potato Dextrose Agar

PDB : Potato Dextrose Yeast

PDY : Potato Dextrose Yeast

RNA : Ribonucleid Acid

tRNA : transfer Ribonucleic Acid

UK : Ungu Kristal

Y : Lugol

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pencarian sumber senyawa bioaktif terus-menerus dilakukan seiring

dengan makin banyaknya penyakit-penyakit baru yang bermunculan, mulai dari

penyakit infeksi, kanker, dan beberapa penyakit berbahaya lainnya. Senyawa

bioaktif dapat diperoleh dari beberapa sumber, diantaranya dari tumbuhan, hewan,

mikroba dan organisme laut. Salah satu sumber senyawa bioaktif yang berasal

dari mikroba adalah mikroba endofit (Prihatiningtias, 2005).

Indonesia merupakan negara yang memiliki area hutan hujan tropis yang

luas. Hutan hujan tropis merupakan sumber tumbuh-tumbuhan yang mengandung

senyawa bioaktif yang potensial (Strobel, 2002). Mikroba endofit adalah mikroba

yang hidup di dalam jaringan tumbuhan pada periode tertentu dan mampu

membentuk koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa membahayakan inangnya,

bahkan seringkali bersimbiosis secara mutualisme (Petrini et al., 1992; Tan &

Zou, 2001). Mikroba endofit dapat diisolasi dari jaringan akar, batang dan daun

(Strobel, 2003). Salah satu fakta yang menarik tentang mikroba endofit adalah

kemampuannya untuk memproduksi senyawa-senyawa bioaktif, baik yang sama

dengan inangnya ataupun tidak sama tetapi seringkali memiliki aktivitas biologis

yang serupa dengan senyawa bioaktif yang diproduksi inangnya (Strobel et al.,

1996; Tan & Zou, 2001; Castillo UF et al., 2002; Strobel, 2002).

Beberapa bakteri endofit mampu menghasilkan produk potensial antara

lain: bakteri endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman Anuma

(Artemisia annua) dapat memproduksi senyawa kimia antimalaria artemisinin di

dalam media cair sintetik (Simanjuntak et al., 2004). Streptomyces griseus dari

tanaman Kandelia candel menghasilkan asam p-aminoacetophenonic sebagai

antimikroba (Guan et al., 2005), Serratia marcescens dari tanaman Rhyncholacis

penicillata menghasilkan oocydin A sebagai antifungi (Strobel et al., 2004).

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa bioaktif merupakan

peluang yang sangat menantang dalam penyediaan bahan baku obat. Pembiakan

atau kultur mikroba endofit dapat dilakukan dalam jumlah yang sangat besar tanpa

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

memerlukan lahan yang luas sebagaimana halnya tumbuh-tumbuhan, demikian

pula waktu yang dibutuhkan sebelum panen pun lebih singkat. Penanganannya

pun relatif lebih mudah dan kemungkinan besar lebih murah dibandingkan

merawat kebun tumbuhan obat yang luas. Dengan demikian penggunaan mikroba

endofit sebagai sumber bahan baku obat secara ekonomis diperkirakan lebih

efisien dibandingkan dengan menggunakan tumbuhan obat (Sinaga et al., 2009).

Pemanfaatan mikroba endofit sebagai sumber bahan baku obat juga akan

mereduksi kerusakan alam yang disebabkan oleh penebangan tumbuhan obat

dalam jumlah besar. Apalagi sudah terbukti pula bahwa dalam satu tumbuhan

dapat diisolasi lebih dari satu bahkan puluhan jenis mikroba endofit yang masing-

masing mempunyai potensi untuk memproduksi satu atau lebih senyawa bioaktif,

maka dapat dikatakan bahwa produksi bahan baku obat melalui kultur mikroba

endofit merupakan peluang yang sangat besar. Oleh sebab itu penelitian-penelitian

untuk mengeksplorasi keanekaragaman jenis serta kandungan zat bioaktif yang

diproduksi oleh mikroba endofit tersebut sangat perlu dilakukan (Sinaga et al.,

2009).

Salah satu keanekaragaman yang perlu dieksplorasi kandungan zat bioaktif

yang diproduksi oleh mikroba endofit yaitu berasal dari famili Clusiaceae, salah

satunya adalah dari genus Garcinia yang merupakan tumbuhan tropis. Di

Indonesia dikenal sebagai tanaman manggis-manggisan dan terdapat sekitar 100

spesies yang tersebar dan merupakan bagian penting dari komposisi hutan (Sosef

et al., 1998; Sari, 1999). Tanaman ini juga tumbuh di daerah subtropis, seperti di

Kepulauan Jepang, Korea dan sebagian wilayah dataran Cina (Ilyas et al., 1994;

Likhitwitayawuid et al., 1998).

Dari berbagai penelitian yang dilakukan pada beberapa spesies Garcinia

berhasil diisolasi senyawa-senyawa kelompok xanton, benzofenon, flavonoid, dan

triterpenoid (Verheij & Coronel, 1992; Likhitwitayawuid et al., 1998). Umumnya

senyawa-senyawa tersebut mempunyai aktivitas biologik dan farmakologik seperti

antiinflamasi, antimikroba, antifungi, dan antioksidan (Likhitwitayawuid et al.,

1998; Iinuma et al., 1998). Bagian tanaman yang berbeda dari Genus Garcinia

seperti buah, kulit buah, bunga, daun, kulit batang dan batang telah digunakan

secara global sebagai ethnomedicine untuk mengobati beberapa gangguan seperti

3


peradangan, stres oksidatif, infeksi mikroba, kanker, dan obesitas (Hemshekhar et

al., 2011).

Garcinia benthami Pierre merupakan salah satu spesies dari genus

Garcinia. Tumbuhan ini dapat ditemukan di Thailand, Malaysia, Singapura,

Filipina, dan Indonesia (Heyne K, 1987; Rachman, 2003). Di Indonesia tanaman

ini banyak terdapat di Sumatera, Jawa dan Kalimantan. Berdasarkan penelitian

sebelumnya ekstrak dari daun Garcinia benthami Pierre mengandung senyawa

alkaloid, flavonoid, steroid/terpenoid, tannin, kuinon, kumarin, dan saponin

(Amelia, 2011).

Oleh karena belum adanya informasi mengenai mikroba endofit dari

tanaman Garcinia benthami Pierre, maka penelitian ini merupakan penelitian

pendahuluan untuk mengisolasi mikroba endofit dari daun tanaman Garcinia

benthami Pierre dan menentukan aktivitas antibakterinya. Uji aktivitas antibakteri

tersebut dilakukan terhadap beberapa bakteri yang menyebabkan penyakit pada

manusia.

1.2 Rumusan Masalah

Dari uraian latar belakang menunjukkan bahwa mikroba endofit dapat

menghasilkan senyawa bioaktif yang dapat digunakan sebagai bahan baku obat.

Mikroba endofit dapat ditemukan di hampir setiap tanaman di bumi, salah satu

tanaman yang diduga memiliki mikroba endofit adalah Garcinia benthami Pierre.

Tanaman tersebut belum pernah dilakukan isolasi mikroba endofit dan diuji

aktivitasnya sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus Subtilis,

Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium.

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk mengeksplorasi antibakteri yang dihasilkan oleh mikroba endofit

yang diperoleh dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre.

1.3.2 Tujuan Khusus

Untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari mikroba endofit yang diisolasi

dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre terhadap Staphylococcus

4


aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan

Salmonella typhimurium.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Teoritis

Hasil penelitian ini adalah memberikan sumbangan ilmu pengetahuan

terhadap ilmu mikrobiologi.

1.4.2 Manfaat Metodologis

Metodologi dalam penelitian ini dapat digunakan untuk mengeksplorasi

mikroba endofit dari berbagai tanaman yang ada di Indonesia.

1.4.3 Manfaat Aplikatif

Hasil penelitian ini dapat menjadi bahan informasi untuk para pembuat

kebijakan dan menambah perbendaharaan antibakteri.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mikroba Endofit

Mikroba endofit dapat ditemukan hampir di semua tanaman di muka bumi

ini, dan merupakan mikroba yang tumbuh di dalam jaringan tanaman. Mikroba

endofit dapat diisolasi dari akar, batang dan daun suatu tanaman. Bakteri dan

fungi adalah jenis mikroba yang umum ditemukan sebagai mikroba endofit, akan

tetapi yang banyak diisolasi adalah golongan fungi. Hubungan antara mikroba

endofit dan inangnya dapat berbentuk simbiosis mutualisme sampai hubungan

yang patogenik (Strobel, 2002).

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder

sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat

diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikroba endofit yang

diisolasi dari tanaman inangnya tersebut. Kurang lebih 300.000 jenis tanaman

yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung satu atau

lebih mikroba endofit yang terdiri dari bakteri dan fungi (Strobel & Daisy, 2003).

Apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat dapat menghasilkan

alkaloid atau metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau bahkan dalam

jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman aslinya untuk

diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan besar memerlukan puluhan tahun

untuk dapat dipanen (Radji, 2005).

Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan

telah berhasil dibiakkan dalam media kultivasi yang sesuai. Demikian pula

metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil

diisolasi dan dimurnikan serta telah dielusidasi struktur molekulnya (Radji, 2005).

Menurut Tan & Zou (2001), mikroba endofit memang dapat menghasilkan

senyawa bioaktif yang karakternya mirip atau sama dengan inangnya. Hal ini

disebabkan adanya pertukaran genetik yang terjadi antara inang dan mikroba

endofit secara evolusioner.

6


2.1.1 Mikroba Endofit yang Menghasilkan Antibiotika

Pestalotiopsis micrispora merupakan fungi endofit yang paling sering

ditemukan di tanaman hutan lindung di seluruh dunia. Endofit ini menghasilkan

metabolit sekunder ambuic acid yang berkhasiat sebagai antifungi (Li, JY et al.,

2001). Phomopsichalasin, merupakan metabolit yang diisolasi dari fungi endofit

Phomopsis spp. berkhasiat sebagai antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella

enterica, Staphylococcus aureus, dan juga dapat menghambat pertumbuhan fungi

Candida tropicalis (Horn WS et al., 1995).

Antibiotika berspektrum luas yang disebut munumbicin, dihasilkan oleh

endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan endofit yang

diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat pertumbuhan

Bacillus anthracis, dan Mycobacterium tuberculosis yang multiresisten terhadap

berbagai obat anti TBC (Castillo UF et al., 2002). Jenis endofit lainnya yang juga

menghasilkan antibiotika berspektrum luas adalah mikroba endofit yang diisolasi

dari tanaman Grevillea pteridifolia. Endofit ini menghasilkan metabolit

kakadumycin. Aktivitas antibakterinya sama seperti munumbicin D, dan

kakadumycin ini juga berkhasiat sebagai antimalaria (Castillo UJ et al., 2003).

2.1.2 Isolasi Fungi Endofit

Pada umumnya fungi endofit diisolasi dari organ tumbuhan yang masih

segar dan telah disterilisasi permukaannya (Agusta, 2009). Sterilisasi permukaan

ini bertujuan untuk menghilangkan mikroorganisme epifit yang berada di

permukaan tumbuhan, sehingga koloni yang diperoleh merupakan koloni endofit

yang berasal dari dalam jaringan tumbuhan (Larran et al., 2001). Untuk sterilisasi

permukaan organ tumbuhan tersebut yang umum digunakan adalah dengan cara

merendamnya dalam alkohol (70 – 95%) (Agusta, 2009). Alkohol bekerja dengan

cara merusak lapisan membran sel mikroorganisme. Alkohol dapat melarutkan

lipid dan mendenaturasi protein yang ada pada membran sel. Hal tersebut dapat

mengganggu fungsi membran sel dalam mengatur transportasi cairan ke dalam

dan keluar sel sehingga membuat sel mikroorganisme menjadi lisis (McDonnell &

Russell, 1999).

7


Akan tetapi, kemampuan alkohol untuk mensterilkan permukaan organ

tumbuhan tersebut mempunyai spektrum yang sempit atau sangat terbatas

sehingga perlu dikombinasikan dengan bahan kimia lainnya, dan biasanya sering

dikombinasikan dengan larutan natrium hipoklorit (NaOCl) (Agusta, 2009).

Natrium hipoklorit merupakan senyawa klorin. Senyawa klorin diketahui mampu

menghambat pertumbuhan sel mikroorganisme dengan cara mengganggu proses

oksidasi dari enzim-enzim penting sehingga fungsi metabolisme dari sel tersebut

terganggu dan sel mikroorganisme tidak dapat tumbuh (Valera et al., 2009).

2.2 Mikroba

2.2.1 Definisi

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme hidup yang berukuran

sangat kecil dan hanya dapat diamati dengan menggunakan mikroskop.

Mikroorganisme ada yang tersusun atas satu sel (uniseluler) dan ada yang tersusun

atas beberapa sel (multiseluler). Walaupun mikroorganisme uniseluler hanya

tersusun atas satu sel, namun mikroorganisme tersebut menunjukkan semua

karakteristik organisme hidup, yaitu bermetabolisme, bereproduksi,

berdiferensiasi, melakukan komunikasi, melakukan pergerakan, dan berevolusi

(Pratiwi, 2008).

2.2.2 Jenis

Organisme yang termasuk ke dalam golongan mikroorganisme adalah

bakteri, archaea, fungi (kapang dan khamir), protozoa, dan virus. Virus, bakteri,

dan archaea termasuk ke dalam golongan prokariot, sedangkan fungi dan

protozoa termasuk ke dalam golongan eukariot (Pratiwi, 2008).

2.2.2.1 Bakteri

Organisme prokariotik dikelompokkan menjadi dua kelompok besar, yaitu

eubakteri yang merupakan bakteri sejati dan archaea yang secara morfologi

serupa dengan eubakteri, namun memiliki perbedaan dalam hal ciri-ciri fisiologis.

Kelompok bakteri terdiri atas semua organisme prokariotik patogen dan

nonpatogen yang terdapat di daratan dan perairan, serta organisme prokariotik

yang bersifat fotoautotrof. Kelompok archaea meliputi organisme prokariotik

8


yang tidak memiliki peptidoglikan pada dinding selnya, dan umumnya hidup pada

lingkungan yang bersifat ekstrem (Pratiwi, 2008).

Gambar 2.1 Struktur Sel Bakteri

(Sumber: http://id.wikipedia.org/wiki/Struktur_sel_bakteri)

a. Morfologi Sel Bakteri

Ada beberapa bentuk dasar bakteri, yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak:

cocci), batang atau silinder (tunggal: bacillus, jamak: bacilli), dan spiral yaitu

berbentuk batang melengkung atau melingkar-lingkar (Pratiwi, 2008).

Satuan ukuran bakteri ialah mikrometer (µm), yang setara dengan 1/1000

mm atau 10-3

mm. Bakteri yang paling umum berukuran kira-kira 0,5 – 1,0 x 2,0 –

5,0 µm (Pelczar, 1986).

b. Struktur Sel Bakteri (Pratiwi, 2008)

1) Struktur Eksternal Sel Bakteri

Glikokaliks (selubung gula) / Kapsul

Slime (lapisan lendir)

Flagela

Fimbria (jamak: fimbriae)

Pili (tunggal: pilus)

Dinding sel

http://id.wikipedia.org/wiki/Struktur_sel_bakteri

9


Tabel 2.1. Beberapa ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif (Pelczar, 1986)

Ciri Perbedaan Relatif

Gram positif Gram negatif

Struktur dinding sel Tebal (15 – 80 nm)

Berlapis tunggal (mono)

Tipis (10 – 15 nm)

Berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding

sel

Kandungan lipid rendah

(1 – 4%)

Peptidoglikan ada

sebagai lapisan tunggal;

komponen utama

merupakan lebih dari

50% berat kering pada

beberapa sel bakteri

Asam teikoat

Kandungan lipid tinggi

(11 – 22%)

Peptidoglikan ada di

dalam lapisan kaku

sebelah dalam;

jumlahnya sedikit,

merupakan sekitar 10%

berat kering

Tidak ada asam teikoat

Kerentanan terhadap

penisilin

Lebih rentan Kurang rentan

Pertumbuhan

dihambat oleh zat-zat

warna dasar,

misalnya kristal

violet

Pertumbuhan dihambat

dengan nyata

Pertumbuhan tidak

begitu dihambat

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada

banyak spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

2) Struktur Internal Sel Bakteri

Sitoplasma: substansi yang menempati ruangan sel bagian dalam. Di

dalam sitoplasma terdapat berbagai enzim, air (80%), protein,

karbohidrat, asam nukleat, dan lipid yang membentuk sistem koloid

yang secara optik bersifat homogen.

10


Membran plasma (inner membrane): struktur tipis yang terdapat di

sebelah dalam dinding sel dan menutup sitoplasma sel. Berfungsi

untuk memecah nutrien dan memproduksi energi.

Daerah inti (daerah nukleoid): mengandung kromosom bakteri.

Ribosom: berperan pada sintesis protein.

Badan inklusi: organel penyimpan nutrisi.

Endospora: struktur dengan dinding tebal dan lapisan tambahan pada

sel bakteri yang dibentuk di sebelah dalam membran sel. Berfungsi

sebagai pertahanan sel bakteri terhadap panas ekstrem, kondisi kurang

air, dan paparan bahan kimia serta radiasi.

2.2.2.2 Kapang

Kapang adalah organisme kemoheterotrof yang memerlukan senyawa

organik untuk nutrisinya (sumber karbon dan energi). Kapang merupakan fungi

yang berfilamen dan multiseluler. Identifikasi kapang didasarkan pada

kenampakan fisik (morfologi), termasuk karakteristik koloni dan spora reproduktif

(Pratiwi, 2008).

a. Morfologi Kapang

Tubuh kapang (thallus) dibedakan menjadi dua bagian yaitu miselium dan

spora. Miselium merupakan kumpulan beberapa filamen yang disebut hifa. Bagian

dari hifa yang berfungsi untuk mendapatkan nutrisi disebut hifa vegetatif.

Sedangkan bagian hifa yang berfungsi sebagai alat reproduksi disebut hifa

reproduktif atau hifa udara (aerial hypha), karena pemanjangannya mencapai

bagian atas permukaan media tempat fungi ditumbuhkan (Pratiwi, 2008).

Terdapat tiga macam morfologi hifa, yaitu (Pratiwi, 2008):

1. Aseptat (coenocytic hypha), yaitu hifa yang tidak memiliki dinding sekat

(septa).

2. Septat hifa (hifa bersekat) dengan sel-sel uninukleat. Septa membagi hifa

menjadi ruang-ruang yang berisi 1 inti, dan pada tiap sekat terdapat pori-pori

yang memungkinkan perpindahan inti dan sitoplasma dari satu ruang ke ruang

lainnya

3. Septa dengan ruang-ruang yang berisi lebih dari 1 inti (multinukleat).

11


b. Reproduksi Kapang

Kapang bereproduksi baik secara aseksual dengan pembelahan,

pembentukan tunas atau spora, maupun secara seksual dengan peleburan inti dari

kedua induknya. Pada pembelahan, sel akan membagi diri membentuk dua sel

yang sama besar, sedangkan pada pertunasan (budding), sel anak tumbuh dari

penonjolan kecil pada sel induk (Pratiwi, 2008).

c. Fisiologi Kapang

Kapang memerlukan kondisi kelembaban yang tinggi, persediaan bahan

organik, dan oksigen untuk pertumbuhannya. Lingkungan yang hangat dan

lembab mempercepat pertumbuhan kapang. Kapang tumbuh dengan baik pada

kondisi lingkungan yang mengandung banyak gula dengan tekanan osmotik tinggi

dan kondisi asam yang tidak menguntungkan bagi pertumbuhan bakteri. Hal ini

memungkinkan kapang dapat tumbuh pada selai atau acar (Pratiwi, 2008).

Kapang merupakan organisme aerob sejati. Kapang tumbuh dalam kisaran

temperatur yang luas, dengan temperatur optimal berkisar antara 22 – 30ºC.

Spesies kapang patogenik mempunyai temperatur pertumbuhan optimal lebih

tinggi, yaitu berkisar antara 30 – 37ºC. Beberapa kapang mampu hidup pada

temperatur 0ºC sehingga menyebabkan kerusakan produk yang disimpan pada

penyimpanan dingin (Pratiwi, 2008).

Kapang berbeda dengan bakteri dilihat dari kondisi lingkungan tempat

hidupnya dan karakteristik nutrisinya. Kapang tumbuh baik pada pH ±5 yang

terlalu asam bagi bakteri; lebih tahan terhadap tekanan osmotik sehingga dapat

tumbuh baik pada kadar garam atau kadar gula yang tinggi; dapat hidup pada

substansi dengan kondisi kelembaban sangat rendah; memerlukan lebih sedikit

nitrogen dibandingkan bakteri; dan dapat memetabolisme karbohidrat kompleks

seperti lignin sehingga dapat tumbuh pada substrat-substrat seperti dinding kamar

mandi, sepatu kulit, dan sampah kertas (Pratiwi, 2008).

2.2.3 Patologis

Sebagian kecil mikroorganisme bersifat patogen. Mikroorganisme alami

dalam tubuh kita disebut mikroorganisme normal atau flora normal. Meskipun

12


flora normal ini tidak patogen, namun dalam keadaan tertentu dapat bersifat

patogen dan menimbulkan penyakit infeksi. Contoh mikroorganisme patogen

adalah bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli O157:H7 yang

menyebabkan diare, Shigella dysenteriae yang menyebabkan disentri, khamir

Candida albicans yang menyebabkan keputihan, kapang Aspergillus flavus yang

menghasilkan aflatoksin yang dapat meracuni makanan, virus Ebola yang

menyebabkan penyakit Ebola, human immunodeficiency virus yang menyebabkan

penyakit AIDS, protozoa Toxoplasma gondii yang menyebabkan toksoplasmosis

dan sebagainya (Pratiwi, 2008).

2.3 Karakterisasi Mikroba

2.3.1 Karakterisasi Bakteri

2.3.1.1 Teknik Pewarnaan (Pelczar, 1986)

Banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan untuk

mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan

prosedur-prosedur pewarnaan untuk:

1. Mengamati dengan lebih baik bentuk morfologi mikroorganisme secara

kasar.

2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.

3. Membantu mengidentifikasi dan/atau membedakan organisme yang

serupa.

Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang

diwarnai untuk pemeriksaan mikroskopis ialah:

1. Penempatan olesan, atau lapisan tipis spesimen, pada kaca objek.

2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan,

menyebabkan mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.

3. Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan

pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial).

Pewarnaan sederhana. Pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad

renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis,

atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana.

13


Pewarnaan diferensial. Prosedur pewarnaan yang menampilkan

perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Dengan

teknik ini biasanya digunakan lebih dari satu larutan zat pewarna atau reagen

pewarnaan.

Pewarnaan Gram. Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling

penting dan paling luas digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan Gram. Dalam

proses ini olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut yaitu ungu

kristal, lugol, alkohol 96% (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna

tandingan lain yang sesuai. Bakteri diwarnai dengan metode Gram ini dibagi

menjadi dua kelompok. Salah satu di antaranya, bakteri Gram positif,

mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua.

Kelompok yang lain, bakteri Gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci

dengan alkohol, dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan warna merah

safranin, tampak berwarna merah. Hal ini tampaknya disebabkan oleh perbedaan

dalam struktur kimiawi permukaannya. Langkah-langkah dalam prosedur serta

hasil-hasilnya pada setiap tahap dirangkumkan pada tabel 2.2 berikut.

Tabel 2.2 Pewarnaan Gram (Pelczar, 1986)

No.

Larutan dan

Urutan

Penggunaannya

Reaksi dan Tampang Bakteri

Gram Positif Gram Negatif

1. Ungu Kristal

(UK)

Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu

2. Lugol (Y) Kompleks UK-Y

terbentuk di dalam sel;

sel tetap berwarna ungu

Kompleks UK-Y

terbentuk di dalam sel;

sel tetap berwarna ungu

3. Alkohol 96% Dinding sel mengalami

dehidrasi, pori-pori

menciut; daya rembes

dinding sel dan membran

menurun, kompleks UK-

Y tak dapat ke luar dari

sel; sel tetap ungu

Lipid terekstraksi dari

dinding sel, pori-pori

mengembang, kompleks

UK-Y keluar dari sel; sel

menjadi tak berwarna

4. Safranin Sel tak terpengaruhi,

tetap ungu

Sel menyerap zat

pewarna ini, menjadi

merah

14


2.3.2 Karakterisasi Kapang

Pengamatan morfologi secara makroskopis kapang dilakukan dengan

mengamati karakteristik koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan

struktur permukaan koloni; ada atau tidaknya tetes eksudat (exudate drops); dan

ada atau tidaknya lingkaran konsentris (zonasi). Pengamatan koloni dilakukan

sejak awal penanaman hingga beberapa waktu tertentu, dan segala macam

perubahan yang terjadi harus dicatat (Gandjar et al.,1999).

Pengamatan mikroskopis tersebut meliputi sekat hifa (bersekat atau tidak

bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak bercabang), warna hifa (hialin,

transparan atau gelap), ada tidaknya konidia, dan bentuk konidia (bulat, lonjong,

berantai, atau tidak beraturan). Pengamatan mikroskopis dilakukan pada

pengamatan hari terakhir (5-7 hari) dengan menggunakan mikroskop (Ariyono et

al., 2014).

2.4 Antimikroba

2.4.1 Definisi

Antimikroba (AM) ialah obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba

yang merugikan manusia (Gunawan, 2011). Menurut Syahrurachman et al.

(1994), antimikroba adalah suatu substansi kimia yang diperoleh dari atau

dibentuk oleh berbagai spesies mikroorganisme lainnya. Antimikroba tersebar di

alam dan memegang peranan penting dalam mengatur populasi mikroba dalam

tanah, air, limbah dan kompos. Antimikroba ini berbeda dalam susunan kimia dan

cara kerjanya. Dari sekian banyak antimikroba yang telah berhasil ditemukan,

hanya beberapa saja yang cukup tidak toksik untuk dapat dipakai dalam

pengobatan. Antimikroba yang kini banyak dipergunakan, kebanyakan diperoleh

dari genus Bacillus, Penicillium dan Streptomyces (Syahrurachman et al., 1994).

2.4.2 Aktivitas dan Spektrum

Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat

menghambat pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik dan

ada yang bersifat membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisidal.

Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau

membunuhnya, masing-masing dikenal sebagai kadar hambat minimum (KHM)

15


dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat

meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisidal bila kadar antimikrobanya

ditingkatkan melebihi KHM (Gunawan, 2011).

Berdasarkan spektrum kerjanya, antimikroba dibagi menjadi dua

kelompok, yaitu berspektrum sempit (benzyl penisilin dan streptomisin) dan

berspektrum luas (tetrasiklin dan kloramfenikol) (Gunawan, 2011).

2.5.3 Mekanisme Kerja

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dibagi dalam lima

kelompok (Gunawan, 2011):

1. Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba

Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini ialah sulfonamida,

trimetoprim, asam p-aminosalisilat (PAS) dan sulfon. Dengan mekanisme kerja

ini diperoleh efek bakteriostatik. Mikroba membutuhkan asam folat untuk

kelangsungan hidupnya. Berbeda dengan mamalia yang mendapatkan asam folat

dari luar, kuman patogen harus mensintesis sendiri asam folat dari asam amino

benzoat (PABA) untuk diikutsertakan dalam pembentukkan asam folat, maka

terbentuk analog asam folat yang nonfungsional. Akibatnya, pertumbuhan

mikroba akan terganggu.

2. Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba

Dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan yaitu suatu kompleks polimer

mukopeptida (glikopeptida). Antimikroba ini akan menghambat reaksi yang

paling dini dalam proses sintesis dinding sel dan diakhiri dengan menghambat

reaksi terakhir (transpeptidasi) dalam rangkaian reaksi tersebut. Oleh karena

tekanan osmotik dalam sel kuman akan menyebabkan terjadinya lisis, yang

merupakan dasar efek bakterisidal pada kuman yang peka. Contoh antimikroba ini

adalah penisilin, sefalosporin, basitrasin, vankomisin, dan sikloserin.

3. Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba

Antimikroba ini dapat merusak permeabilitas selektif dari membran sel

mikroba dengan cara mengubah tegangan permukaan (surface-active agent).

Kerusakan membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari

dalam sel mikroba yaitu protein, asam nukleat, nukleotida, dan lain-lain.

16


Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini yaitu polimiksin, golongan

polien serta berbagai antimikroba kemoterapeutik.

4. Antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba

Untuk kehidupannya, sel mikroba perlu mensintesis berbagai protein.

Sintesis protein berlangsung di ribosom, dengan bantuan mRNA dan tRNA. Pada

bakteri, ribosom terdiri atas dua sub unit, yang berdasarkan konstanta sedimentasi

dinyatakan sebagai ribosom 30S dan 50S. Untuk berfungsi pada sintesis protein,

kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom

70S. Penghambatan sintesis terjadi dengan berbagai cara. Ada yang berikatan

dengan komponen ribosom 30S dan menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca

oleh tRNA pada waktu sintesis protein. Akibatnya akan terbentuk protein yang

abnormal dan nonfungsional bagi sel mikroba. Sebagai contoh: streptomisin dan

tetrasiklin. Ada juga yang berikatan dengan ribosom 50S dan menghambat

translokasi kompleks tRNA-peptida dari lokasi asam amino ke lokasi peptida.

Akibatnya, rantai polipeptida tidak dapat diperpanjang karena lokasi asam amino

tidak dapat menerima kompleks tRNA-asam amino yang baru. Sebagai contoh:

eritromisin, linkomisin, dan kloramfenikol.

5. Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba

Antimikroba ini berikatan dengan enzim polymerase-RNA (pada sub unit)

sehingga menghambat sintesis RNA dan DNA oleh enzim tersebut. Golongan

kuinolon menghambat enzim DNA girase pada kuman yang fungsinya menata

kromosom yang sangat panjang menjadi bentuk spiral hingga dapat masuk ke

dalam sel kuman yang kecil. Contoh antimikroba kelompok ini ialah rifampisin

dan golongan kuinolon.

2.5 Uji Aktivitas Antimikroba (Pratiwi, 2008)

2.5.1 Metode Difusi

a. Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer)

Metode ini untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang

berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami

mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih

17


mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen

antimikroba pada permukaan media agar.

b. E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory

concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi miminal

suatu agen antimikroba untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari

kadar terendah hingga kadar tertinggi dan digerakkan pada permukaan media agar

yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih

yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang

menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.

c. Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada

parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada

bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam)

digoreskan ke arah parit yang berisi agen antimikroba.

d. Cup-plate technique

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, yaitu dibuat sumur pada

media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut

diberi agen antimikroba yang akan diuji.

e. Gradient-plate technique

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara

teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji

ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan

dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dituang di atasnya. Plate

diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan

permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada

arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai

panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin

dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan. Bila:

X: panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin

Y: panjang pertumbuhan aktual

18


C: konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mg/mL atau

µg/mL, maka konsentrasi hambatan adalah: [(X.Y)] = C mg/mL atau µg/mL.

Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari

lingkungan padat dan cair, faktor difusi agen antimikroba dapat mempengaruhi

keseluruhan hasil pada media padat.

2.5.2 Metode Dilusi

Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan

dilusi padat (solid dilution).

a. Metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution)

Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar

hambat minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration atau

kadar bunuh minimum, KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri

pengenceran agen antimikroba pada media cair yang ditambahkan dengan

mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih

tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang

ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair

tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama

18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan

sebagai KBM.

b. Metode dilusi padat/solid dilution test

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media

padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba

yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.

2.5.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Metode Difusi pada Pengujian

Aktivitas Antimikroba

Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil pengamatan aktivitas

antimikroba dengan metode difusi (Lorian, 1980), antara lain:

1) Kedalaman Agar

Untuk memperoleh sensitivitas yang optimal, cawan petri diisi dengan

lapisan agar tidak lebih dari 2 sampai 3 mm dan merata pada setiap bagiannya.

19


Keseragaman kedalaman Agar penting untuk menjamin datarnya bagian dasar

sebagai tempat pengujian.

2) Ukuran Inokulum

Ukuran inokulum merupakan salah satu variabel penting yang

berpengaruh pada besar kecilnya zona hambatan dan konsentrasi hambat

minimum. Jika ukuran inokulum kecil, akan diperlukan lebih banyak waktu untuk

mencapai masa sel mikroba. Akibatnya zona hambat yang terbentuk akan menjadi

lebih besar, dan konsentrasi hambat minimum menjadi lebih kecil.

3) Komposisi Media

Aktivitas zat antimikroba dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti kation-

kation dalam media. pH media dan adanya berbagai macam bahan antagonis.

Kecepatan difusi dari zat antimikroba ditentukan oleh konsentrasi media,

konsentrasi berbagai ion dan adanya ikatan elektrostatik antara zat antimikroba

dengan sekumpulan ion dalam media. Kapasitas gizi dari media juga sangat

mempengaruhi panjangnya fase pertumbuhan dari mikroba uji, dan akan turut

mempengaruhi ukuran zona hambatan dan konsentrasi hambat minimum.

4) Temperatur Inkubasi

Tiap-tiap golongan mikroba memiliki temperatur pertumbuhan optimal

(fungi umumnya 10-35ºC, bakteri 20-45ºC). Inkubasi akan sangat mempengaruhi

pertumbuhan mikroba uji. Kecepatan pertumbuhan akan menurun pada temperatur

yang lebih rendah daripada temperatur optimal pertumbuhan mikroba dan terhenti

pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur optimal pertumbuhan mikroba.

5) Waktu Inkubasi

Besarnya zona hambatan ditentukan pula oleh jangka waktu inkubasi.

Misalnya kebanyakan bakteri patogen dapat diamati pertumbuhannya setelah 5

atau 6 jam inkubasi. Pada inkubasi selanjutnya zona hambatan akan menjadi lebih

kecil karena terjadi perubahan pertumbuhan bakteri pada tepi zona hambatan dan

konsentrasi hambatan minimum akan lebih besar.

6) Konsentrasi zat antimikroba

Semakin tinggi konsentrasi zat aktif antimikroba akan semakin besar

hambatan terhadap pertumbuhan mikroba, sehingga zona hambatan akan lebih

besar.

20


2.6. Pemilihan Media (Lay, 1992)

Beberapa syarat yang harus dipenuhi media pertumbuhan mikroba adalah

sebagai berikut:

1) Cukup mengandung unsur-unsur makanan yang mudah diambil oleh mikroba.

2) Tidak mengandung inhibitor atau zat-zat lain yang menghambat pertumbuhan

mikroba.

3) Memiliki tekanan osmotik yang sesuai dengan kebutuhan mikroba.

4) Memiliki pH yang sesuai kebutuhan mikroba.

5) Steril.

2.7 Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Bacillus Subtilis, Shigella dysenteriae, dan Salmonella

typhimurium.

2.7.1 Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri patogen yang bersifat Gram

positif. Klasifikasi bakteri ini adalah (Sleigh & Timbury, 1994):

Kingdom : Prokaryota

Filum : Bacteria

Kelas : Schizomyces

Ordo : Eubacteriales

Famili : Micrococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus dapat menimbulkan penyakit pada manusia. Setiap

jaringan ataupun alat tubuh dapat diinfeksi olehnya dan menyebabkan timbulnya

penyakit dengan tanda-tanda yang khas, yaitu peradangan, nekrosis, dan

pembentukkan abses. Kuman ini berbentuk sferis, bila bergerombol dalam

susunan yang tidak teratur mungkin sisinya agak rata karena tertekan. Diameter

kuman antara 0,8 – 1,0 mikron. Kuman ini tidak bergerak, tidak berspora dan

Gram positif. Jenis-jenis Staphylococcus di laboratorium tumbuh dengan baik

dalam kaldu biasa pada suhu 37ºC. Batas-batas suhu untuk pertumbuhannya ialah

21


15ºC dan 40ºC, sedangkan suhu pertumbuhan optimum ialah 35ºC. Pertumbuhan

terbaik dan khas ialah pada suasana aerob; kuman ini pun bersifat anaerob

fakultatif dan dapat tumbuh dalam udara yang hanya mengandung hidrogen dan

pH optimum untuk pertumbuhan ialah 7,4. Pada lempeng agar, koloninya

berbentuk bulat, diameter 1-2 mm, cembung, buram, mengkilat, dan

konsistensinya lunak. Warna khas ialah kuning keemasan, hanya intensitas

warnanya dapat bervariasi (Syahrurachman et al., 1994).

2.7.2 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang besar,

membentuk rantai, berspora, dan sifatnya aerob. Panjang bakteri ini 2-3 µm dan

lebarnya 0,7-0,8 µm (Jawetz & Adelberg, 1996).

Bakteri ini menggunakan sumber N dan C untuk energi pertumbuhan.

Spora resisten terhadap perubahan lingkungan, tahan terhadap panas kering dan

desinfektan kimia tertentu selama waktu yang cukup lama dan tetap ada selama

bertahun-tahun dalam tanah yang kering (Jawetz & Adelberg, 1996).

Berikut adalah klasifikasi Bacillus subtilis menurut Madigan (2005):

Kingdom : Bacteria

Filum : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales

Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis

Bacillus subtilis dapat tumbuh pada suhu 45-55°C minimum pada suhu 5-

20°C, dan suhu optimumnya bervariasi antara 25-37°C. Bakteri ini banyak

terdapat di tanah, air, udara, saluran pencernaan hewan, dan bahan pangan tertentu

(Buckle, 1985).

Bacillus subtilis menyebabkan penyakit pada manusia dengan sistem imun

terganggu, misalnya gastroenteritis akut dan meningitis (Jawetz & Adelberg,

1996). Bakteri ini juga dikenal sebagai penyebab keasaman pada makanan kaleng

karena fermentasi gula yang dikandung bahan pangan tersebut (Buckle, 1985).

22


2.7.3 Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang

pendek, motil aktif dan tidak membentuk spora yang diklasifikasikan sebagai

berikut (Juliantina et al., 2008):

Kingdom : Prokaryota

Filum : Gracilicutes

Kelas : Scotobacteria


Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Pembiakan E. coli bersifat aerob atau fakultatif anaerob, pertumbuhan

optimum pada suhu 37ºC. E. coli mempunyai beberapa antigen, yaitu antigen O

(polisakarida), antigen K (kapsular), antigen H (flagella). Antigen O merupakan

antigen somatik berada dibagian terluar dinding sel lipopolisakarida dan terdiri

dari unit berulang polisakarida. Antibodi terhadap antigen O adalah IgM. Antigen

K adalah antigen polisakarida yang terletak di kapsul (Juliantina et al., 2008).

E.coli terdapat di saluran pencernaan manusia dan binatang, dapat pula

ditemukan di sungai, danau, tanah, dan tempat lain yang telah terkontaminasi

feses. E.coli dapat menyebabkan infeksi primer pada usus misalnya diare. Namun

sebagai bagian dari flora normal saluran pencernaan, E.coli berperan penting

untuk pencernaan makanan dengan memproduksi vitamin K dari materi-materi

yang tidak tercernakan di usus besar. Selnya berukuran antara 0,4-0,7 µm x 1,4

µm (Syahrurachman et al., 1994).

2.7.4 Shigella dysenteriae

Shigella dysenteriae merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk batang,

tidak berflagel, dan ukuran 0,5-0,7 µm x 2-3 µm. Sifat pertumbuhan adalah aerob

dan fakultatif anaerob, pH pertumbuhan 6,4-7,8, suhu pertumbuhan optimum

37°C (Syahrurachman et al., 1994). Klasifikasi bakteri ini adalah (Dwidjoseputro,

1998):

23


Kingdom : Prokayota

Filum : Bacteriophyta

Kelas : Gammaproteobacteria


Famili : Bactericeae

Genus : Shigella

Spesies : Shigella dysenteriae

Bakteri ini dapat menyebabkan disentri basiler. Disentri adalah salah satu

dari berbagai gangguan pencernaan yang ditandai dengan peradangan usus

terutama kolon, disertai nyeri perut dan buang air besar yang sering mengandung

darah dan lendir (Pelczar, 1986).

2.7.5 Salmonella typhimurium

Salmonella typhimurium merupakan bakteri Gram negatif, berbentuk

batang, tidak berspora, ukuran 1-3,5 µm x 0,5-0,8 µm, besar koloni rata-rata 2-4

mm, mempunyai flagel peritrikh. Kuman tumbuh pada suasana aerob dan

fakultatif anaerob, pada suhu 15-41°C (suhu pertumbuhan optimum 37,5°C) dan

pH pertumbuhan 6-8 (Syahrurachman et al., 1994).

Berikut adalah klasifikasi Salmonella typhimurium (Batt & Mary, 2014):

Kingdom : Bacteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gammaproteobacteria

Ordo : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Salmonella

Spesies : Salmonella typhimurium

Bakteri dari genus Salmonella merupakan bakteri penyebab infeksi yang

jika tertelan dan masuk ke dalam tubuh akan menimbulkan gejala yang disebut

salmonelosis. Gejala salmonelosis yang paling sering terjadi adalah gastroenteritis

yang disebabkan oleh Salmonella typhimurium. Salmonella tidak selalu

menimbulkan perubahan dalam warna, bau, maupun rasa pada makanan yang

terkontaminasinya. Semakin tinggi jumlah Salmonella di dalam makanan semakin

24


besar kemungkinan timbulnya gejala infeksi pada orang yang menelan makanan

yang telah terkontaminasi oleh bakteri Salmonella (Jay, 1978).

2.8 Genus Garcinia

Genus Garcinia yang merupakan tumbuhan tropis. Di Indonesia dikenal

sebagai tanaman manggis-manggisan dan terdapat sekitar 100 spesies yang

tersebar dan merupakan bagian penting dari komposisi hutan (Sosef et al., 1998;

Sari, 1999). Tanaman ini juga tumbuh di daerah subtropis, seperti di Kepulauan

Jepang, Korea dan sebagian wilayah dataran Cina (Ilyas et al., 1994;

Likhitwitayawuid et al., 1998).

Garcinia mempunyai habitus berupa pohon dengan tinggi mencapai 25-33

m dan jarang yang berupa semak. Batangnya lurus dengan diameter 60-100 cm,

mengecil ke arah ujung. Bentuk pohon seperti kerucut, memiliki percabangan

berselang-seling. Seluruh bagian tanaman mengeluarkan getah putih atau kuning

yang kental dan lengket, bila dilukai. Daun selalu berwarna hijau, berhadapan

silang. Genus ini ada yang berumah satu (monoecious) dan ada yang berumah dua

(dioecious). Bunga berada di ketiak daun. Daun kelopak dan daun mahkota terdiri

dari 4-5 helai; bunga jantan memiliki benang sari yang jumlahnya bervariasi,

dengan tangkai sari bersatu menjadi satu tiang tengah atau membentuk 4-5 berkas.

Bagian putik mengecil atau tidak sama sekali. Bunga betina biasanya berukuran

lebih besar daripada bunga jantan, seringkali menyendiri, benang sari semu

dengan tangkai-tangkai sarinya yang bersatu menjadi sebuah cincin di bagian

pangkal, atau menjadi 4-5 berkas pendek; bakal buah beruang 2-12, biasanya

berbentuk papilla. Bijinya besar, biasanya terbungkus oleh arilus yang berisi

banyak sari buah; embrionya berupa massa yang padat, hanya tersusun atas

hipokotil, sedangkan keping bijinya tidak ada. Bagian kayu dari genus ini

biasanya keras dengan warna yang beragam mulai kuning sampai coklat

kemerahan dan umumnya memiliki tekstur bagus (Veirhej & Coronel, 1992;

Sosef, 1998).

Garcinia mangostana dikenal dengan nama Queen of fruit, selain buahnya

dapat dimakan, kulit ari biji dari buah ini digunakan sebagai obat luka dan infeksi,

penurun panas dan mengurangi rasa sakit. G. cambogia sekarang banyak terdapat

25


di pasaran sebagai suplemen untuk mengurangi berat badan. Getah bagian batang

G. hanburyi Hook digunakan sebagai pencahar, biji G. dulcis Kurz dikenal

sebagai obat gondok dan buah G. indica telah dimanfaatkan sebagai obat cacing

dan kardiotonik. Di bidang industri tanaman ini juga telah dipakai sebagai bahan

dasar sabun dan lilin, minyak dari tanaman ini juga dapat digunakan untuk obat

urut dan urtikaria (Sosef, 1998).

Dari berbagai penelitian yang dilakukan pada beberapa spesies Garcinia

berhasil diisolasi senyawa-senyawa kelompok xanton, benzofenon, flavonoid, dan

triterpenoid (Verheij & Coronel, 1992; Likhitwitayawuid et al., 1998). Umumnya

senyawa-senyawa tersebut mempunyai aktivitas biologik dan farmakologik seperti

antiinflamasi, antimikroba, antifungi, dan antioksidan (Likhitwitayawuid et al.,

1998; Iinuma et al., 1998).

2.9 Garcinia benthami Pierre

Garcinia benthami Pierre merupakan salah satu spesies dari genus

Garcinia. Tumbuhan ini dapat ditemukan di Thailand, Malaysia, Singapura,

Filipina, dan Indonesia (Heyne K, 1987; Rachman, 2003). Di Indonesia banyak

terdapat di Sumatera, Jawa dan Kalimantan. Pada penelitian Elya et al. (2004)

telah berhasil diisolasi senyawa benzofenon baru dari kulit batang Garcinia

benthami Pierre yaitu ismailbenzofenon dan hilmibenzofenon.

Gambar 2.2 Garcinia benthami Pierre

(Sumber: Dokumentasi Pribadi)

26


Tumbuhan Garcinia benthami Pierre secara taksonomi mempunyai

klasifikasi sebagai berikut (Heyne K, 1987):

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Sub kelas : Archichlamydeae

Ordo : Guttiferales

Familia : Clusiaceae

Genus : Garcinia

Species : Garcinia benthami Pierre

Garcinia benthami Pierre mempunyai habitus berupa pohon dengan tinggi

mencapai 30 m. Batangnya lurus, mengecil ke arah ujung. Bentuk pohon berupa

kerucut, memiliki percabangan berselang-seling. Seluruh bagian tanaman

mengeluarkan getah kuning yang kental dan lengket bila dilukai. Daun selalu

berwarna hijau, berhadapan berseling. Bunga berada di ketiak daun. Daun kelopak

dan daun mahkota terdiri dari 4-5 helai. Bunga jantan memiliki benang sari yang

yang jumlahnya bervariasi, dengan tangkai sari bersatu menjadi satu tiang tengah

atas. Bunga betina biasanya berukuran lebih besar dari bunga jantan, seringkali

menyendiri, benang sari semu dengan tangkai-tangkai sarinya yang bersatu

menjadi sebuah cincin di bagian pangkal, bakal buah beruang 2-12 dan biasanya

berbentuk papila. Bijinya besar, biasanya terbungkus oleh arilus yang berisi

banyak sari buah. Embrionya berupa masa padat, hanya tersusun atas hipokotil,

sedangkan bijinya tidak ada (Rachman, 2003).

Penelitian terdahulu dari Garcinia benthami Pierre telah berhasil diisolasi

senyawa benzofenon baru, yaitu ismailbenzofenon dan hilmibenzofenon (Elya et

al., 2004) serta salimbenzophenon (Elya et al., 2006) dari kulit batang G.

benthami. Dari ekstrak aseton kulit batang G. benthami telah berhasil diisolasi

senyawa stigmasterol, asamolean-5,12-dien-3β-ol-28-oat dan senyawa flavonoid

yaitu epikatekin (Elya et al., 2006). Dua triterpenoid telah berhasil diisolasi dari

ekstrak n-heksana kulit batang G. benthami yaitu friedelin dan asam-3β-

27


hidroksida-lanosta-9(11),24-dien-26-oat (Elya et al., 2009). Berdasarkan

penelitian sebelumnya ekstrak dari daun Garcinia benthami Pierre mengandung

senyawa alkaloid, flavonoid, steroid/terpenoid, tannin, kuinon, kumarin, dan

saponin (Amelia, 2011).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari sampai Mei 2015 di

Laboratorium Mikrobiologi Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : cawan petri

(Petriq), tabung reaksi (Pyrex), labu Erlenmeyer (Schott Duran), beaker glass

(Schott Duran), gelas ukur (Pyrex), batang drigalski, batang L, cover glass, kaca

obyek, pipet tetes, spatula, gunting bedah, pisau bedah, pinset, jarum ose, tissue

steril, kertas saring, kertas perkamen, jangka sorong (Trickle), pH indikator,

plastic wrap, alumunium foil, mikropipet dan tip (Bio Rad), Laminar Air Flow

Cabinet, timbangan analitik (Scout Pro), inkubator (Memmert), autoklaf otomatis

(ALP), autoklaf (All American), oven (Memmert), hot plate (Thermo Scientific),

magnetic stirrer, bunsen, shaker (Stuart Scientific), sentrifus (Hettich Zentrifugen

EBA 20), sentrifus berpendingin (Peqlab), vortex (Thermolyne), paper disc 6 mm

(Oxoid), mikroskop cahaya (Olympus), dan alat-alat gelas lain yang biasa

digunakan di laboratorium mikrobiologi.

3.3 Bahan

3.3.1 Sampel Penelitian

Daun tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 4 helai beserta pucuk

daun yang masih segar diperoleh dari koleksi Kebun Raya Bogor. Tanaman ini

telah dideterminasi di Lembaga Penelitian Biologi atau Herbarium Bogoriense,

Bogor.

3.3.2 Bahan untuk Proses Sterilisasi Permukaan

Air bersih yang mengalir, alkohol 70%, natrium hipoklorit (NaOCl)

5,25%, aquades steril.

29


3.3.3 Bahan untuk Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba

Potato Dextrose Agar (Merck), Nutrient Agar (Merck), Mueller Hinton

Agar (Oxoid), Nutrient Broth (Merck), Kalsium karbonat (CaCO3), Potato

Dextrose Broth (Oxoid), dan Yeast Extract (Merck).

3.3.4 Bakteri uji

Bakteri uji yang digunakan yaitu bakteri Gram positif (Staphylococcus

aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633) dan Gram negatif (Escherichia

coli ATCC 35218, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Salmonella typhimurium

ATCC 14028).

3.3.5 Bahan untuk Karakterisasi Mikroba Endofit dan Uji Kemurnian

Bakteri Uji

Larutan kristal violet, lugol, alkohol 96%, larutan safranin, aquades steril,

NaCl 0,9%.

3.3.6 Kontrol Uji Aktivitas Antibakteri

Cakram kloramfenikol konsentrasi 30 µg/cakram (Oxoid) dan aquades

steril.

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba

3.4.1.1 Pembuatan Media PDA (Potato Dextrose Agar)

Media Potato Dextrose Agar (PDA) plate dibuat untuk isolasi kapang

endofit dan pemurnian kapang endofit. Media ini dibuat dengan cara PDA

ditimbang sebanyak 39 gram, kemudian ditambahkan aquades hingga 1 liter.

Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan

magnetic stirrer hingga homogen. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf

selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media dituang ke dalam cawan petri secara

aseptis masing-masing ±10 mL, lalu dibiarkan di suhu ruang hingga media

memadat (Ramadhan, 2011).

30


3.4.1.2 Pembuatan Media Agar Miring PDA (Potato Dextrose Agar)

Media agar miring Potato Dextrose Agar (PDA) dibuat untuk pemurnian

(pembuatan stock culture) kapang endofit. Media ini dibuat dengan cara Potato

Dextrose Agar (PDA) ditimbang sebanyak 39 gram, kemudian ditambahkan

aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan

diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Kemudian media dituang ke

dalam tabung slant masing-masing ±5 mL. Selanjutnya disterilisasi dengan

autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media yang telah steril diletakkan

dalam posisi miring ±45º dan media dibiarkan memadat (Rustanti, 2007).

3.4.1.3 Pembuatan Media NA (Nutrient Agar)

Media Nutrient Agar (NA) plate dibuat untuk isolasi dan pemurnian

bakteri endofit, skrining antibakteri mikroba endofit serta peremajaan bakteri uji.

Media ini dibuat dengan cara Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 20 gram

dan dilarutkan dalam aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian

dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen.

Media disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121ºC.

Kemudian media dituang ke dalam cawan petri masing-masing ±10 mL, media

dibiarkan memadat (Rustanti, 2007).

3.4.1.4 Pembuatan Media Agar Miring NA (Nutrient Agar)

Media agar miring Nutrient Agar (NA) dibuat untuk pemurnian

(pembuatan stock and working culture) bakteri endofit. Media ini dibuat dengan

cara Nutrient Agar (NA) ditimbang sebanyak 20 gram dan dilarutkan dalam

aquades hingga 1 liter. Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan

diaduk dengan magnetic stirrer hingga homogen. Kemudian media dituang ke

dalam tabung slant masing-masing 5 mL. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf

selama 15 menit pada suhu 121ºC. Media yang telah steril diletakkan dalam posisi

miring ±45º dan media dibiarkan memadat (Rustanti, 2007).

31


3.4.1.5 Pembuatan Media MHA (Mueller Hinton Agar)

Media Mueller Hinton Agar (MHA) plate dibuat untuk uji antibakteri dari

supernatan hasil fermentasi mikroba endofit. Media ini dibuat dengan cara 38

gram media Mueller Hinton Agar (MHA) disuspensikan dengan 1 liter aquades.

Larutan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate dan diaduk dengan

magnetic stirrer hingga homogen. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu

121ºC selama 15 menit. Kemudian media dituang ke dalam cawan petri masing-

masing ±10 mL, media dibiarkan memadat (Adawiyah, 2013).

3.4.1.6 Pembuatan Media PDY Broth (Potato Dextrose Yeast Broth)

Media PDY Broth dibuat untuk media fermentasi kapang endofit. Media

ini dibuat dengan cara ditimbang 24 gram Potato Dextrose Broth, 2 gram Yeast

extract, 5 gram Kalsium karbonat (CaCO3). Semua bahan kecuali Kalsium

karbonat dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, ditambahkan aquades hingga 1

liter, dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer di atas hot plate. Kalsium

karbonat ditambahkan sedikit demi sedikit ke larutan media tersebut hingga

dicapai pH 6-7. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit dengan

suhu 121ºC (Ramadhan, 2011).

3.4.1.7 Pembuatan Media NB (Nutrient Broth)

Pembuatan media NB (Nutrient Broth) berdasarkan instruksi pada

kemasan. Media NB (Nutrient Broth) dibuat untuk media fermentasi bakteri

endofit. Media ini dibuat dengan cara ditimbang sebanyak 8 gram Nutrient Broth,

kemudian ditambahkan aquades hingga 1 liter dan dihomogenkan dengan

magnetic stirrer di atas hot plate. Selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf selama

15 menit dengan suhu 121ºC.

3.4.2 Isolasi Mikroba Endofit

3.4.2.1 Sampling Tanaman

Daun dari tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 4 helai beserta

pucuk daun yang masih segar diperoleh dari koleksi Kebun Raya Bogor, lalu

dideterminasi di Lembaga Penelitian Biologi atau Herbarium Bogoriense, Bogor.

32


3.4.2.2 Sterilisasi Permukaan

Sampel daun sebanyak 4 helai beserta pucuk daun yang masih segar dicuci

di bawah air mengalir selama 10 menit. Sterilisasi permukaan dilakukan di dalam

Laminar Air Flow Cabinet (LAFC). Daun direndam di dalam alkohol 70% selama

1 menit, sambil di kocok pelan. Lalu dipindahkan ke dalam larutan natrium

hipoklorit (NaOCl) 5,25% selama 5 menit. Selanjutnya daun tersebut direndam

kembali di dalam alkohol 70% selama 30 detik (Radji et al., 2011). Setelah itu

dibilas dengan aquades steril selama 1 menit dan diulang dua kali. Daun tersebut

dikeringkan di atas kertas saring steril (Ariyono et al., 2014). Kemudian daun

dipotong-potong menjadi beberapa bagian kecil dengan ukuran ± 1 x 1 cm2 pada

daun yang berada didekat pucuk, ditengah ranting, dipangkal ranting dengan

gunting bedah steril dan pada bagian pucuk daun dibelah menjadi 2 bagian dengan

pisau bedah steril. Selanjutnya secara hati-hati diletakkan pada media isolasi PDA

dan NA. Setiap cawan petri berisi satu atau dua potongan. Selanjutnya pada media

PDA diinkubasi pada suhu ruang selama 14 hari dan pada media NA diinkubasi

pada suhu 35ºC selama 3 hari. Semua proses sterilisasi hingga proses pengeringan

dilakukan secara aseptis di dalam LAFC (Ramadhan, 2011).

Kemudian pada aquades steril bilasan terakhir diambil dengan

menggunakan batang L dan diisolasi ke PDA dan NA lainnya, perlakuan ini

berfungsi sebagai kontrol. Perlakuan kontrol berfungsi untuk mengetahui dan

menentukan apakah mikroba yang tumbuh merupakan mikroba endofit atau

bukan. Apabila pada media PDA dan NA kontrol tumbuh mikroba, maka mikroba

yang tumbuh bukanlah mikroba endofit. Sedangkan apabila pada media PDA dan

NA kontrol tidak tumbuh mikroba, maka mikroba yang tumbuh adalah mikroba

endofit (Ariyono et al., 2014).

3.4.3 Pemurnian Mikroba Endofit

3.4.3.1 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang telah tumbuh pada media isolasi kemudian

dimurnikan ke dalam media PDA plate lain. Koloni yang mempunyai bentuk yang

berbeda dengan koloni lainnya dapat dianggap sebagai isolat yang berbeda.

Kemudian dilakukan pemurnian sampai diperoleh isolat murni (tunggal).

33


Pemurnian dilakukan dengan cara menginokulasikan sedikit hifa dengan ose atau

pinset dari setiap koloni endofit yang berbeda ke media PDA dan diinkubasi

selama 7 hari pada suhu ruang (Kumala et al., 2006). Selanjutnya isolat kapang

yang telah murni dipindahkan ke dalam media PDA lain untuk digunakan sebagai

working culture dan media agar miring PDA yang digunakan sebagai stock

culture. Kultur kapang endofit diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang (Kumala

dan Endro, 2007).

3.4.3.2 Pemurnian Bakteri Endofit

Bakteri yang tumbuh pada media isolasi NA, disubkultur pada plate media

NA pada suhu 35ºC selama 24-48 jam, sampai diperoleh koloni murni. Koloni

murni kemudian dipindahkan ke agar miring NA dan diinkubasi selama 24-48 jam

pada suhu 35ºC. Setiap isolat bakteri endofit dibuat dua pada agar miring NA,

masing-masing dipergunakan sebagai stock culture dan working culture (Rosana,

2001).

3.4.4 Karakterisasi Mikroba Endofit

3.4.4.1 Karakterisasi Kapang Endofit

1) Karakterisasi Makroskopis Kapang Endofit

Pengamatan morfologi secara makroskopis kapang dilakukan dengan

mengamati karakteristik koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan

struktur permukaan koloni; ada atau tidaknya tetes eksudat (exudate drops); dan

ada atau tidaknya lingkaran konsentris (zonasi). Pengamatan koloni dilakukan

sejak awal penanaman hingga beberapa waktu tertentu, dan segala macam

perubahan yang terjadi harus dicatat (Gandjar et al.,1999).

2) Karakterisasi Mikroskopis Kapang Endofit

Cawan petri yang berisi tissue, kaca objek, dan cover glass disterilisasi

terlebih dahulu. Kemudian tissue dibasahi dengan aquades steril sehingga suasana

dalam cawan petri menjadi lembab. Kaca objek steril yang berada diatas tissue

selanjutnya ditetesi media PDA dengan menggunakan pipet steril. Kemudian

dengan menggunakan jarum ose diambil sedikit miselium kapang endofit,

34


diletakkan pada media agar PDA yang diteteskan pada kaca objek dan perlahan

ditutup dengan cover glass steril. Setelah itu diinkubasi pada suhu ruang selama 7

hari (Kumala dan Ainun, 2014 dengan modifikasi).

Pengamatan mikroskopis tersebut meliputi sekat hifa (bersekat atau tidak

bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak bercabang), warna hifa (hialin,

transparan atau gelap), ada tidaknya konidia, dan bentuk konidia (bulat, lonjong,

berantai, atau tidak beraturan). Pengamatan mikroskopis dilakukan pada hari ke-7

dengan menggunakan mikroskop (Ariyono et al., 2014).

3.4.4.2 Karakterisasi Bakteri Endofit

1) Karakterisasi Makroskopis Bakteri Endofit

Karakterisasi makroskopis bakteri endofit dilakukan dengan mengamati

morfologi dan pertumbuhan koloni. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk

koloni (whole colony), bentuk tepi (edge), warna (colour) dan bentuk permukaan

(elevation) (Mutmainnah et al., 2008).

2) Karakterisasi Mikroskopis Bakteri Endofit

Karakterisasi mikroskopis dilakukan pengamatan dengan metode

pewarnaan Gram, yaitu menyiapkan preparat uji dengan mengoleskan bakteri

setipis mungkin di atas kaca objek yang kemudian difiksasi dengan cara

dilewatkan di atas nyala api sebentar untuk melekatkan bakteri. Preparat tersebut

diwarnai dengan larutan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan

air mengalir selama 5 detik, diteteskan larutan lugol di atas preparat dan dibiarkan

selama selama 1 menit, dicuci kembali dengan air mengalir kemudian dicuci

dengan alkohol 96% selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol lalu

dicuci kembali dengan aquades mengalir. Diteteskan larutan safranin selama 10-

30 detik kemudian dicuci kembali dengan air mengalir, dikeringkan dengan cara

diletakkan di atas kertas saring dan diperiksa preparat di bawah mikroskop

(Handayani, 2007).

35


3.4.5 Uji Kemurnian Bakteri Uji

1) Uji Kemurnian Makroskopis Bakteri Uji

Sebelum digunakan, bakteri uji di uji kemurniannya terlebih dahulu. Uji

kemurnian bakteri uji dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan

koloni. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk koloni (whole colony),

bentuk tepi (edge), warna (colour) dan bentuk permukaan (elevation)

(Mutmainnah et al., 2008).

2) Uji Kemurnian Mikroskopis Bakteri Uji

Uji kemurnian secara mikroskopis dilakukan pengamatan dengan metode

pewarnaan Gram, yaitu menyiapkan preparat uji dengan mengoleskan bakteri

setipis mungkin di atas kaca objek yang kemudian difiksasi dengan cara

dilewatkan di atas nyala api sebentar untuk melekatkan bakteri. Preparat tersebut

diwarnai dengan larutan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan

air mengalir selama 5 detik, diteteskan larutan lugol di atas preparat dan dibiarkan

selama selama 1 menit, dicuci kembali dengan air mengalir kemudian dicuci

dengan alkohol 96% selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol lalu

dicuci kembali dengan air mengalir. Diteteskan larutan safranin selama 10-30

detik kemudian dicuci kembali dengan air mengalir, dikeringkan dengan cara

diletakkan di atas kertas saring dan diperiksa preparat di bawah mikroskop

(Handayani, 2007).

3.4.6 Peremajaan Bakteri Uji

Peremajaan Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium diinokulasi sebanyak satu ose

ke media agar miring NA dan diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35ºC

(Radji, 2006).

3.4.7 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Hasil peremajaan bakteri uji pada agar miring NA ditambahkan dengan 5

mL NaCl 0,9% steril. Sebanyak 0,2 mL suspensi bakteri masing-masing

diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL yang berisi media NB 200 mL,

36


dikocok dan NB steril tanpa suspensi bakteri sebagai kontrol. Spektrofotometer

visibel diatur dengan panjang gelombang 600 nm, kuvet dibersihkan kemudian

diukur absorban awal NB steril sebagai kontrol dan NB yang mengandung bakteri

pada menit ke-0 (t0). Setelah absorban awal ditentukan, media NB diinkubasi pada

pengocokan 120 rpm pada temperatur 35°C. Setiap interval 30 menit dilakukan

pengukuran absorban untuk mendapatkan kurva pertumbuhan. Kurva

pertumbuhan diakhiri setelah melewati fase stasioner (Khotimah, 2010).

3.4.8 Skrining Mikroba Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

3.4.8.1 Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Skrining kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan

dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method). Bakteri uji yang

digunakan yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium. Masing-masing suspensi

bakteri uji pada media NB yang telah berumur fase mid log diambil 0,1 mL dan

dipipetkan ke dalam media agar NA padat dan disebarkan secara merata dengan

menggunakan batang drigalski (Spread Plate Method). Kemudian, isolat kapang

endofit yang telah dimurnikan ke dalam media PDA diambil dengan sedotan steril

berdiameter 6 mm dan ditempelkan di atas permukaan media NA yang berisi

bakteri uji. Satu cawan petri media NA yang telah berisi bakteri uji dapat ditanami

potongan isolat murni kapang endofit ±6 isolat. Kultur di inkubasi pada suhu

35°C selama 3 hari. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter zona

hambat di sekitar kapang endofit. (Melliawati & Harni, 2009). Isolat yang

menunjukkan zona hambat dipilih sebagai isolat untuk pengujian selanjutnya

yaitu fermentasi dan uji aktivitas antibakteri.

3.4.8.2 Skrining Bakteri Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Skrining bakteri endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan

dengan metode difusi cakram (disc diffusion methods). Bakteri uji yang digunakan

yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Shigella

dysenteriae, dan Salmonella typhimurium. Masing-masing suspensi bakteri uji

pada media NB yang telah berumur fase mid log diambil 0,1 mL dan dipipetkan

37


ke dalam media agar NA padat dan disebarkan secara merata dengan

menggunakan batang drigalski. Isolat bakteri endofit yang telah berumur 24 jam

di media agar miring NA, kemudian ditambahkan 5 mL NaCl 0,9% steril.

Sebanyak 10 µL suspensi bakteri endofit diserapkan pada cakram steril

berdiameter 5 mm dan dikeringkan. Setelah itu, cakram diletakkan di atas media

NA yang telah diinokulasi dengan bakteri uji, kemudian dilakukan inkubasi

selama 24 jam pada suhu 35ºC, dan diamati ada tidaknya zona bening yang

terbentuk (Simarmata et al., 2007 dengan modifikasi).

3.4.9 Fermentasi Mikroba Endofit

3.4.9.1 Fermentasi Kapang Endofit

Kapang endofit yang terseleksi positif menghasilkan zona hambat

dilakukan fermentasi. Proses fermentasi dimulai dengan menumbuhkan kultur

murni pada media PDA selama ±7 hari. Miselia dan media agar dari fungi endofit

diambil sebanyak 3 bulatan berdiameter 6 mm kemudian dimasukkan ke dalam

media PDY 200 mL dan dilakukan inkubasi selama 21 hari pada suhu ruang

dalam kondisi stasioner (Phongpaichit et al., 2006 dengan modifikasi). Hasil

fermentasi disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan

supernatan yang diperoleh dijadikan sebagai larutan uji aktivitas antibakteri

(Rosana et al., 2001 dalam Kumala dan Endro, 2007).

3.4.9.2 Fermentasi Bakteri Endofit

Dilakukan fermentasi cair dengan menggunakan media NB sebanyak 10

mL dalam tabung bersumbat kapas. Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 2

hari dengan kecepatan shaker 170 rpm. Biomassa sel dipanen dengan

menggunakan sentrifus berpendingin 3000 rpm selama 20 menit pada suhu 4°C.

Supernatan dari hasil sentrifus digunakan untuk uji aktivitas antibakteri (Kumala

et al., 2006).

38


3.4.10 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Mikroba

Endofit

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram

(disc diffusion methods). Sebanyak 20 µL larutan uji (supernatan dari hasil

fermentasi mikroba endofit) diserapkan pada kertas cakram steril berdiameter 6

mm. Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan media

MHA padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji (Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella

typhimurium) dengan metode pour plate yaitu dengan cara mengambil 1 mL

suspensi bakteri uji pada fase mid log menggunakan pipet, kemudian diteteskan

ke dalam cawan petri steril dan selanjutnya ditambahkan media MHA cair suhu

±55°C sebanyak 10 mL lalu digoyangkan sampai suspensi bakteri uji merata di

seluruh media, didiamkan sampai membeku dan media siap digunakan. Sebagai

kontrol positif digunakan cakram kloramfenikol konsentrasi 30 µg dan kontrol

negatif yaitu aquades steril yang diserapkan pada cakram dan dikeringkan. Setelah

semua cakram diletakkan di atas permukaan media MHA tersebut, kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35ºC. Aktivitas antibakteri dinyatakan

sebagai diameter zona hambat (mm) yang dihasilkan oleh supernatan hasil

fermentasi mikroba endofit. Diameter zona hambat diukur dengan menggunakan

jangka sorong (Radji et al., 2011 dengan modifikasi).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL

4.1.1 Isolasi Mikroba Endofit

Mikroba endofit diisolasi dari tanaman Garcinia benthami Pierre. Sebelum

isolasi, dilakukan dahulu sterilisasi permukaan terhadap sampel tanaman.

Sterilisasi permukaan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC).

Daun direndam di dalam alkohol 70% selama 1 menit, sambil di kocok pelan.

Lalu dipindahkan ke dalam larutan natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25% selama 5

menit. Selanjutnya daun tersebut direndam kembali di dalam alkohol 70% selama

30 detik (Radji et al., 2011). Setelah itu dibilas dengan aquades steril selama 1

menit dan diulang dua kali (Ariyono et al., 2014).

Pada proses isolasi, koloni mikroba endofit yang tumbuh dari dalam

jaringan daun di media pertumbuhannya yang secara makroskopis berbeda

dianggap merupakan isolat yang berbeda, dan jika bentuk koloni mikroba endofit

sama maka dianggap isolat yang sama, akan tetapi jika terdapat perbedaaan dari

laju pertumbuhan mikroba endofit yang secara makroskopis sama, maka dianggap

sebagai isolat yang berbeda. Setiap koloni dengan morfologi berbeda dipisahkan

menjadi isolat-isolat tunggal, sampai diperoleh isolat murni yaitu isolat yang

hanya mengandung satu bentuk morfologi yang sama.

Berdasarkan hasil isolasi didapatkan 25 isolat mikroba endofit yang terdiri

dari 18 isolat kapang endofit yaitu GB1, GB2, GB3, GB4, GB5, GB6, GB7, GB8,

GB9, GB10, GB11, GB12, GB13, GB14, GB15, GB16, GB17, dan GB18; dan 7

isolat bakteri endofit yaitu IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7.

Kapang endofit tumbuh setelah 5 hari dan bakteri endofit tumbuh setelah 3 hari

dari proses penanaman potongan daun di atas media isolasi. Kontrol sterilisasi

menunjukkan bahwa sterilisasi permukaan yang dilakukan mampu menghambat

pertumbuhan mikroba pada permukaan tanaman sehingga isolat mikroba yang

diperoleh diyakini merupakan mikroba endofit. Isolat kapang dan bakteri endofit

serta kontrol sterilisasi permukaan dapat dilihat pada lampiran 8 hal. 93.

40


4.1.2 Uji Kemurnian Bakteri Uji

Uji kemurnian dilakukan untuk memastikan bahwa bakteri uji yang

digunakan merupakan bakteri uji yang benar-benar murni tanpa adanya

kontaminasi. Maka dilakukan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis.

Hasil dari pengamatan makroskopis adalah sebagai berikut:

1) Escherichia coli

Dalam media pembenihan NA (Nutrient Agar) (35°C, 24 jam), koloni bakteri

berbentuk bulat, berwarna putih dengan permukaan mengkilat.

2) Staphylococcus aureus


berbentuk bulat, berwarna kuning keemasan, permukaan pinggir rata, dan

koloni berdiameter 0,8-1,2 mm.

3) Bacillus Subtilis


berbentuk titik-titik bulat, berwarna putih, permukaan pinggir rata, dan koloni

berdiameter 0,9-1,0 mm.

4) Shigella dysenteriae


berbentuk bulat, berwarna putih, permukaan pinggir rata, dan koloni

berdiameter 0,6-1,9 mm.

5) Salmonella typhimurium


berbentuk bulat, berwarna putih, permukaan pinggir rata, dan koloni

berdiameter 0,9-1,0 mm

41


Hasil dari pengamatan mikroskopis yaitu dengan pewarnaan Gram adalah sebagai

berikut:

1) Escherichia coli

Pengamatan secara mikroskopis (Perbesaran

1000x) Escherichia coli adalah bakteri Gram

negatif berbentuk basil pendek dan berwarna

merah.

Gambar 4.1 Escherichia coli

2) Staphylococcus aureus


1000x) Staphylococcus aureus adalah bakteri

Gram positif berbentuk coccus tersusun

berkelompok seperti anggur dan berwarna ungu.

Gambar 4.2 Staphylococcus aureus

3) Bacillus Subtilis


1000x) Bacillus Subtilis adalah bakteri Gram

positif berbentuk basil dan berwarna ungu.

Gambar 4.3 Bacillus Subtilis

4) Shigella dysenteriae


1000x) Shigella dysenteriae adalah bakteri Gram

negatif berbentuk batang dan berwarna merah.

Gambar 4.4 Shigella dysenteriae

42


5) Salmonella typhimurium


1000x) Salmonella typhimurium adalah bakteri

Gram negatif berbentuk batang dan berwarna

merah.

Gambar 4.5 Salmonella typhimurium

4.1.3 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Pengamatan kurva pertumbuhan dari masing-masing bakteri uji perlu

dilakukan sebelum skrining ataupun pengujian antibakteri. Tujuannya adalah

untuk mengetahui pertumbuhan bakteri. Pada kurva pertumbuhan dapat dilihat

pertumbuhan bakteri berdasarkan fasenya, yaitu fase lag, fase log (fase

eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian. Fase log (fase eksponensial) ini

merupakan fase yang cocok untuk pengujian antibakteri. Kurva pertumbuhan

diakhiri setelah melewati fase stasioner. Data selengkapnya dapat dilihat pada

lampiran 11 hal. 97.

Gambar 4.6 Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

43


4.1.4 Karakterisasi Mikroba Endofit

Karakterisasi mikroba endofit yang telah diisolasi dari daun tanaman

Garcinia benthami Pierre dilakukan dengan pengamatan makroskopis dan

mikroskopis. Pengamatan makroskopis dilakukan dengan media pertumbuhannya

masing-masing, untuk kapang endofit ditumbuhkan pada media PDA dan untuk

bakteri endofit ditumbuhkan pada media NA. Sedangkan pengamatan

mikroskopis dilakukan dengan mengamati mikroba endofit di bawah mikroskop

dengan perbesaran 200-400x untuk kapang endofit dan perbesaran 1000x untuk

bakteri endofit.

4.1.4.1 Karakterisasi Kapang Endofit

1) Isolat GB1

Makroskopis Mikroskopis

(Isolat GB1 tampak atas)

(Isolat GB1 tampak bawah)

Isolat GB1 (Perbesaran 400x)

Gambar 4.7 Isolat GB1

Ket: GB1 (Isolat kapang endofit ke-1 yang diisolasi dari daun yang berada di tengah

ranting).

44


Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna hijau tua dan

bagian pinggir berwarna putih. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini

yaitu hijau tua kebiruan dan bagian pinggir berwarna putih. Kapang ini memiliki

tekstur seperti beludru, bentuk pinggirnya tidak rata, tidak memiliki zonasi dan

exudate drop.

Secara mikroskopis koloni kapang ini memiliki hifa yang tidak bersekat.

Pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang, berwarna transparan, dan tidak

memiliki konidia.

2) Isolat GB2







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna coklat muda dan

bagian pinggir berwarna krem. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini

yaitu bagian tengah berwarna kehijauan, kemudian coklat tua, dan bagian pinggir

45


berwarna krem. Kapang ini memiliki tekstur seperti beludru, bentuk pinggirnya

tidak rata dan memiliki zonasi. Exudate drop pada kapang ini berupa butiran

berwarna hitam.

Secara mikroskopis koloni kapang ini memiliki hifa yang bersekat.


memiliki konidia.

3) Isolat GB3






Ket: GB3 (Isolat kapang endofit ke-3 yang diisolasi dari daun yang berada di pangkal

ranting).



yaitu hijau tua kehitaman dan bagian pinggir berwarna putih. Kapang ini memiliki


exudate drop.

46



Pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang, berwarna transparan, dan memiliki

konidia yang berbentuk bulat.

4) Isolat GB4







ranting).



yaitu hijau tua kehitaman, sedikit kecoklatan dan bagian pinggir berwarna putih.

Kapang ini memiliki tekstur seperti beludru, bentuk pinggirnya tidak rata, tidak

memiliki zonasi dan exudate drop.

47



Pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang, berwarna gelap, dan memiliki

konidia yang berbentuk bulat.

5) Isolat GB5




GB 5 (Perbesaran 200x)


Ket: GB5 (Isolat kapang endofit ke-5 yang diisolasi dari daun yang berada di dekat pucuk

daun).





exudate drop.

48



Pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang, berwarna gelap, dan tidak memiliki

konidia.

6) Isolat GB6







ranting).




tekstur seperti beludru dengan granul berwarna hijau tua, bentuk pinggirnya tidak

rata, tidak memiliki zonasi dan exudate drop.

49




memiliki konidia.

7) Isolat GB7







ranting).




tekstur seperti beludru dengan granul berwarna hijau tua, bentuk pinggirnya tidak

rata, tidak memiliki zonasi dan exudate drop.

50




konidia berbentuk bulat.

8) Isolat GB8






Ket: GB8 (Isolat kapang endofit ke-8 yang diisolasi dari pucuk daun).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna coklat muda

kekuningan dan bagian pinggir berwarna kuning. Warna sebalik (reverse colony)

dari kapang ini yaitu coklat tua, coklat muda, coklat tua, coklat muda, kuning

(berselang-seling). Kapang ini memiliki tekstur seperti kapas, bentuk pinggirnya

tidak rata, memiliki zonasi dan exudate drop berupa butir halus warna bening dan

coklat tua pada hifa.

51




memiliki konidia.

9) Isolat GB9







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna putih dan bagian

pinggir putih. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu putih gading,

kuning muda, dan putih gading (berselang-seling). Kapang ini memiliki tekstur

seperti kapas, bentuk pinggirnya tidak rata, memiliki zonasi dan exudate drop

berupa butir halus warna bening pada hifa.

52




memiliki konidia.

10) Isolat GB10







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna putih dan bagian

pinggir putih. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu putih gading.

Kapang ini memiliki tekstur seperti kapas, bentuk pinggirnya tidak rata, memiliki

zonasi dan exudate drop berupa butir halus warna bening pada hifa.



memiliki konidia.

53


11) Isolat GB11







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna putih dan

bagian pinggir putih. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu putih

gading. Kapang ini memiliki tekstur seperti kapas, bentuk pinggirnya tidak rata,

memiliki zonasi dan exudate drop berupa butir halus warna bening pada hifa.

Perbedaan isolat GB11 dengan isolat GB10 adalah pembentukkan exudate drop

pada GB11 lebih cepat.



memiliki konidia.

54


12) Isolat GB12







ranting).





exudate drop. Perbedaan isolat GB12 dengan isolat GB1 adalah pertumbuhan dari

isolat GB12 lebih lama daripada GB1.



memiliki konidia.

55


13) Isolat GB13







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna hijau tua.

Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu hijau tua. Kapang ini

memiliki tekstur seperti beludru, bentuk pinggirnya tidak rata, tidak memiliki

zonasi dan exudate drop. Perbedaan isolat GB12 dengan isolat GB1 adalah

pertumbuhan dari isolat GB12 lebih lama daripada GB1.



memiliki konidia.

56


14) Isolat GB14







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna coklat tua

kekuningan dengan bagian atas hifa berwarna putih dan bagian pinggir berwarna

putih. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu coklat tua kekuningan

dengan bagian atas hifa berwarna putih dan bagian pinggir berwarna putih.

Kapang ini memiliki tekstur seperti kapas, bentuk pinggirnya tidak rata, memiliki

zonasi dan exudate drop berupa butiran berwarna coklat tua.



memiliki konidia.

57


15) Isolat GB15







ranting).




tekstur seperti beludru dengan granul berwarna abu-abu, bentuk pinggirnya tidak

rata, memiliki exudate drop berupa butiran berwarna hitam, dan tidak memiliki

zonasi.



memiliki konidia.

58


16) Isolat GB16







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna hijau tua,

bagian atasnya terdapat hifa berwarna abu-abu dan bagian pinggir berwarna putih.

Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu hijau tua kebiruan dan

bagian pinggir berwarna putih. Kapang ini memiliki tekstur seperti beludru,

bentuk pinggirnya tidak rata, memiliki zonasi, dan exudate drop berupa butiran

berwarna hitam.



konidia.

59


17) Isolat GB17







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna coklat

kekuningan, hijau muda, krem dan bagian atas terdapat hifa berwarna putih.

Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini yaitu coklat tua, kuning cerah,

hijau, kuning muda, krem (berselang-seling). Kapang ini memiliki tekstur seperti

kapas, bentuk pinggirnya tidak rata, memiliki zonasi, dan exudate drop berupa

butiran berwarna hitam dan oranye.



memiliki konidia.

60


18) Isolat GB18







ranting).

Secara makroskopis, permukaan koloni kapang berwarna putih dan

terdapat spora berwarna hitam. Warna sebalik (reverse colony) dari kapang ini

yaitu putih gading dan spora berwarna hitam. Kapang ini memiliki tekstur seperti

kapas, bentuk pinggirnya tidak rata, memiliki exudate drop berupa butiran halus

berwarna bening pada hifa, dan tidak memiliki zonasi.



konidia.

61


4.1.4.2 Karakterisasi Bakteri Endofit

1) IGB1


Isolat IGB1

IGB 1 (Perbesaran 1000x)

Gambar 4.25 Isolat IGB1

Ket: IGB1 (Isolat bakteri endofit ke-1 yang diisolasi dari pucuk daun).

Secara makroskopis, bakteri ini memiliki bentuk koloni (whole colony)

bulat, bentuk tepi (edge) bergelombang, warna (colour) putih kekuningan, bentuk

permukaan (elevation) timbul.

Secara mikroskopis, bakteri ini jika dilihat di bawah mikroskop dengan

perbesaran 1000x yaitu memiliki bentuk basil, berwarna ungu, dan Gram positif.

2) IGB2


Isolat IGB2




62



bulat, bentuk tepi (edge) rata, warna (colour) putih, bentuk permukaan (elevation)

menggunung.


perbesaran 1000x yaitu memiliki bentuk coccus/diplococcus, berwarna ungu, dan

Gram positif.

3) IGB3


Isolat IGB3

IGB 3 (Perbesaran 1000x) Gambar 4.27 Isolat IGB3



bulat, bentuk tepi (edge) bergelombang, warna (colour) putih, bentuk permukaan

(elevation) timbul.


perbesaran 1000x yaitu memiliki bentuk coccus, berwarna ungu, dan Gram

positif.

63


4) IGB4


Isolat IGB4



Ket: IGB4 (Isolat bakteri endofit ke-4 yang diisolasi dari daun yang berada di dekat

pucuk daun).



menggunung.


perbesaran 1000x yaitu memiliki bentuk basil pendek, berwarna ungu, dan Gram

positif.

5) IGB5


Isolat IGB5




pucuk daun).

64



bulat, dari atas terlihat konsentris, bentuk tepi (edge) rata, warna (colour) kuning,

bentuk permukaan (elevation) timbul.



6) IGB6


Isolat IGB6




pucuk daun).



timbul.



65


7) IGB7


Isolat IGB7




pucuk daun).



menggunung.


perbesaran 1000x yaitu memiliki bentuk coccus, berwarna ungu, dan Gram

positif.

4.1.5 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Mikroba Endofit

4.1.5.1 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Kapang Endofit

Skrining aktivitas antibakteri dari kapang endofit menunjukkan 6 isolat

kapang endofit aktif sebagai antibakteri yaitu isolat kapang GB2, GB8, GB14,

GB16, GB17, dan GB18. Terdapat 3 isolat kapang endofit yang aktif terhadap

Bacillus subtilis yaitu isolat GB2, GB14, dan GB17. Terdapat 4 isolat kapang

endofit yang aktif terhadap Staphylococcus aureus yaitu isolat GB2, GB8, GB16,

dan GB18. Hanya 1 Isolat kapang endofit yang aktif terhadap Shigella dysenteriae

dan Salmonella typhimurium yaitu isolat GB2. Dan tidak ada isolat yang aktif

terhadap Escherichia coli. Data selengkapnya dapat dilihat pada tabel 4.1 hal. 67.

66


Gambar 4.32 Zona hambat isolat kapang endofit terhadap B.subtilis: (a) zona

hambat GB2 terhadap B.subtilis; (b) zona hambat GB14 terhadap B.subtilis; (c)

zona hambat GB17 terhadap B.subtilis

Gambar 4.33. Zona hambat isolat kapang endofit terhadap S.aureus: (a) zona

hambat GB2 terhadap S.aureus; (b) zona hambat GB8 terhadap S.aureus; (c) zona

hambat GB16 terhadap S.aureus; (d) zona hambat GB18 terhadap S.aureus.

Gambar 4.34 Zona hambat isolat GB2 terhadap S.dysenteriae

(a)

(d) (c)

(b)

(c) (b) (a)

(a)

67


Tabel 4.1 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Kapang Endofit

Distribusi Zona Hambat Isolat Kapang Endofit berdasarkan

Bakteri Patogen E.coli, B.subtilis, S.aureus, S.dysenteriae, dan

S.typhimurium (mm)

Isolat

Kapang

Endofit E.coli B.subtilis S.aureus S.dysenteriae S. typhimurium

GB1 0 0 0 0 0

GB2 0 13,9 18,375 12,05 10,8

GB3 0 0 0 0 0

GB4 0 0 0 0 0

GB5 0 0 0 0 0

GB6 0 0 0 0 0

GB7 0 0 0 0 0

GB8 0 0 7,625 0 0

GB9 0 0 0 0 0

GB10 0 0 0 0 0

GB11 0 0 0 0 0

GB12 0 0 0 0 0

GB13 0 0 0 0 0

GB14 0 7,875 0 0 0

GB15 0 0 0 0 0

GB16 0 0 7,55 0 0

GB17 0 8,95 0 0 0

GB18 0 0 6,3 0 0

Gambar 4.35 Zona hambat isolat GB2 terhadap S.typhimurium

4.1.5.2 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Endofit

Skrining aktivitas antibakteri dari bakteri endofit menunjukkan 6 isolat

bakteri endofit yang memberikan zona antagonis terhadap bakteri uji yaitu isolat

kapang IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, dan IGB6. Data selengkapnya dapat

dilihat pada tabel 4.2 hal. 68.

68


Tabel 4.2 Skrining Aktivitas Antibakteri dari Bakteri Endofit

Distribusi Zona Antagonis Isolat Bakteri Endofit berdasarkan

Bakteri Patogen E.coli, B.subtilis, S.aureus, S.dysenteriae, dan

S.typhimurium (mm)

Isolat

Bakteri

Endofit

E.coli B.subtilis S.aureus S.dysenteriae S.typhimurium

IGB1 7,87 0 0 7 0

IGB2 8,2 0 0 6,9 0

IGB3 9,8 0 8,4 6,775 0

IGB4 8,77 0 0 6,65 0

IGB5 8,54 0 0 6,35 0

IGB6 8,46 0 0 6,1 0

IGB7 0 0 0 0 0

Gambar 4.36. Zona antagonis isolat bakteri endofit terhadap E.coli, S.aureus, &

S.dysenteriae, (a) zona antagonis IGB1, 3, dan 4 terhadap E.coli; (b) zona antagonis IGB5

dan 6 terhadap E.coli; (c) zona antagonis IGB3 terhadap S.aureus; (d) zona antagonis

IGB5 dan 6 terhadap S.dysenteriae

(b) (a)

(c) (d)

69


4.1.6 Fermentasi Mikroba Endofit

Fermentasi isolat kapang endofit dilakukan menggunakan media PDY

(Potato Dextrose Yeast), namun tidak semua kapang endofit difermentasi, dari

hasil skrining aktivitas antibakteri yang telah diseleksi didapatkan 6 isolat kapang

endofit yang akan dilanjutkan pada proses fermentasi dan uji aktivitas antibakteri

yaitu isolat GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18. Fermentasi isolat bakteri

endofit dilakukan menggunakan media NB (Nutrient Broth). Semua isolat bakteri

endofit yaitu IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7 dilakukan proses

fermentasi dan uji aktivitas antibakteri.

Hasil dari fermentasi segera disentrifugasi dan supernatan yang diperoleh

adalah sebagai larutan uji untuk uji aktivitas antibakteri dari mikroba endofit

terhadap bakteri patogen (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia

coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella typhimurium).

4.1.7 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Mikroba

Endofit

4.1.7.1 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang

Endofit

Uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi kapang endofit

dilakukan dengan metode difusi cakram (disc diffusion methods) dan pengukuran

zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri uji. Dari pengukuran diameter zona

hambat diperoleh hasil yang ditunjukkan pada tabel 4.3 hal. 70. Supernatan dari

suspensi koloni kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap

Escherichia coli yaitu dari isolat GB18. Tidak ada supernatan dari isolat kapang

endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus. Supernatan

dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis

yaitu GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18. Supernatan dari isolat kapang

endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap Shigella dysenteriae yaitu GB2,

GB16, dan GB17. Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai

antibakteri terhadap Salmonella typhimurium yaitu GB2 dan GB8.

70


Tabel 4.3 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang

Endofit

Distribusi Zona Hambat dari Supernatan Hasil Fermentasi Isolat

Kapang Endofit berdasarkan Bakteri Patogen E.coli, B.subtilis, S.aureus,

S.dysenteriae, dan S.typhimurium (mm)

Isolat Kapang

Endofit E.coli S.aureus B.subtilis S.dysenteriae S.typhimurium

GB2 0 0 7,31 6,98 6,75

GB8 0 0 7,27 0 6,87

GB14 0 0 7,32 0 0

GB16 0 0 7,1 8,08 0

GB17 0 0 7,12 7,34 0

GB18 6,73 0 7,55 0 0

Kloramfenikol

(Kontrol +) 9,08 18,2 19,33 18,93 18,65

Aquades steril

(Kontrol -) 0 0 0 0 0

Zona Hambat Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Kapang Endofit

Gambar 4.37. Zona hambat uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi

kapang endofit: (a) zona hambat isolat kapang terhadap E.coli; (b) zona hambat isolat

kapang terhadap S.dysenteriae; (c) zona hambat isolat kapang terhadap S.typhimurium;

(d) zona hambat isolat kapang terhadap B.subtilis.

71


4.1.7.2 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Bakteri

Endofit

Uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi bakteri endofit

dilakukan dengan metode difusi cakram (disc diffusion methods) dan pengukuran

zona hambat terhadap pertumbuhan bakteri uji. Dari pengukuran diameter zona

hambat diperoleh hasil yang ditunjukkan pada tabel 4.4 berikut.

Tabel 4.4 Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil Fermentasi Bakteri

Endofit

Distribusi Zona Hambat dari Supernatan Hasil Fermentasi Isolat

Bakteri Endofit berdasarkan Bakteri Patogen E.coli, B.subtilis,

S.aureus, S.dysenteriae, dan S.typhimurium (mm)

Isolat Bakteri

Endofit E.coli S.aureus B.subtilis S.dysenteriae S.typhimurium

IGB1 6,95 0 5,88 0 0

IGB2 6,9 0 0 0 0

IGB3 7,08 7,07 6,8 6,92 5,93

IGB4 6,67 0 0 0 0

IGB5 6,52 7,57 0 0 0

IGB6 6,68 7,22 0 6,58 0

IGB7 6,48 0 0 0 0

Kloramfenikol

(Kontrol +) 7,9 18,55 15,82 14,9 14,63

Aquades steril

(Kontrol -) 0 0 0 0 0

Gambar 4.38. Zona hambat uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi

bakteri endofit terhadap E.coli: (a) zona hambat isolat IGB1 terhadap E.coli; (b) zona

hambat isolat IGB2 terhadap E.coli; (c) zona hambat isolat IGB3 terhadap E.coli; (d)

zona hambat isolat IGB4 terhadap E.coli; (e) zona hambat isolat IGB5 terhadap E.coli; (f)

zona hambat isolat IGB6 terhadap E.coli; (g) zona hambat isolat IGB7 terhadap E.coli;

(h) zona hambat Kloramfenikol terhadap E.coli; (i) kontrol negatif.

72


Gambar 4.39. Zona hambat uji

aktivitas antibakteri dari supernatan

hasil fermentasi bakteri endofit

terhadap S.aureus: (a) zona hambat

isolat IGB3 terhadap S.aureus; (b)

zona hambat isolat IGB5 terhadap

S.aureus; (c) zona hambat isolat

IGB6 terhadap S.aureus; (d) zona

hambat Kloramfenikol terhadap

S.aureus; (e) kontrol negatif.




terhadap B.subtilis: (a) zona hambat

isolat IGB1 terhadap B.subtilis; (b)

zona hambat isolat IGB3 terhadap

B.subtilis; (c) zona hambat

Kloramfenikol terhadap B.subtilis;

(d) kontrol negatif




terhadap S.dysenteriae: (a) zona

hambat isolat IGB3 terhadap

S.dysenteriae; (b) zona hambat

isolat IGB6 terhadap S.dysenteriae;

(c) zona hambat Kloramfenikol

terhadap S.dysenteriae; (d) kontrol

negatif.




terhadap S.typhimurium: (a) zona

hambat isolat IGB3 terhadap

S.typhimurium; (b) kontrol negatif;

(c) zona hambat Kloramfenikol

terhadap S.typhimurium

73


4.2 PEMBAHASAN

Garcinia benthami Pierre atau yang lebih dikenal sebagai tanaman

manggis-manggisan merupakan tumbuhan tropis. Dari berbagai penelitian yang

dilakukan pada beberapa spesies Garcinia berhasil diisolasi senyawa-senyawa

kelompok xanton, benzofenon, flavonoid, dan triterpenoid (Verheij & Coronel,

1992; Likhitwitayawuid et al., 1998). Umumnya senyawa-senyawa tersebut

mempunyai aktivitas biologik dan farmakologik seperti antiinflamasi,

antimikroba, antifungi, dan antioksidan (Likhitwitayawuid et al., 1998; Iinuma et

al., 1998). Bagian tanaman yang berbeda dari Genus Garcinia seperti buah, kulit

buah, bunga, daun, kulit batang dan batang telah digunakan secara global sebagai

ethnomedicine untuk mengobati beberapa gangguan seperti peradangan, stres

oksidatif, infeksi mikroba, kanker, dan obesitas (Hemshekhar et al., 2011). Oleh

karena itu penelitian mengenai tanaman ini terus-menerus dikembangkan. Salah

satunya dibidang mikrobiologi, yaitu dengan mengisolasi mikroba endofit dari

tanaman ini dan kemudian diuji aktivitas antibakterinya.

Tahap awal dari proses isolasi mikroba endofit dari daun tanaman

Garcinia benthami Pierre ini adalah sterilisasi permukaan. Sebelum isolasi,

dilakukan terlebih dahulu sterilisasi permukaan terhadap sampel tanaman.

Sterilisasi permukaan ini bertujuan untuk menghilangkan mikroorganisme epifit

yang berada di permukaan tumbuhan, sehingga koloni yang diperoleh merupakan

koloni endofit yang berasal dari dalam jaringan tumbuhan (Larran et al., 2001).

Alkohol 70% digunakan sebagai bahan untuk sterilisasi permukaan karena alkohol

70% bekerja dengan cara merusak lapisan membran sel mikroorganisme. Alkohol

dapat melarutkan lipid dan mendenaturasi protein yang ada pada membran sel.

Hal tersebut dapat mengganggu fungsi membran sel dalam mengatur transportasi

cairan ke dalam dan keluar sel sehingga membuat sel mikroorganisme menjadi

lisis (McDonnell & Russell, 1999).

Kemampuan alkohol untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan

tersebut mempunyai spektrum yang sempit atau sangat terbatas sehingga perlu

dikombinasikan dengan bahan kimia lainnya, dan biasanya sering dikombinasikan

dengan larutan natrium hipoklorit (NaOCl) (Agusta, 2009). Natrium hipoklorit

merupakan senyawa klorin. Senyawa klorin diketahui mampu menghambat

74


pertumbuhan sel mikroorganisme dengan cara mengganggu proses oksidasi dari

enzim-enzim penting sehingga fungsi metabolisme dari sel tersebut terganggu dan

sel mikroorganisme tidak dapat tumbuh (Valera et al., 2009 dalam Agusta, 2009).

NaOCl pada konsentrasi 5,25% digunakan karena telah diketahui sebagai

dekontaminan yang efektif terhadap bakteri Gram negatif, Gram positif dan

bentuk spora dari mikroorganisme (Tilakchand, Mahima et al., 2014).

Isolasi mikroba endofit dari daun Garcinia benthami Pierre dilakukan

pada media PDA untuk kapang endofit dan NA untuk bakteri endofit. Media PDA

mengandung ekstrak kentang, salah satu sumber karbohidrat. Kapang dapat

tumbuh pada media PDA karena kapang mempunyai enzim untuk memotong

polisakarida tersebut menjadi monosakarida yang siap digunakan kapang untuk

kelangsungan hidupnya. NA merupakan salah satu media yang umum digunakan

dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, produk pangan, untuk

membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk

mengisolasi organisme dalam kultur murni. Pada pembuatan media NA ini

ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N2

(Dwidjoseputro, 1998).

Kapang endofit yang diisolasi tumbuh setelah 5 hari dari proses

penanaman potongan daun pada media PDA. Berdasarkan literatur, kapang

endofit akan mulai tumbuh pada minggu kedua setelah inkubasi, dan kapang yang

tumbuh sebelum waktu tersebut kemungkinan besar adalah kontaminan. Mungkin

rekomendasi tersebut cukup beralasan jika kita mengasumsikan bahwa kapang

tersebut terdapat pada bagian dalam jaringan tumbuhan. Namun, perlu diingat

bahwa media tumbuh yang digunakan selama proses isolasi adalah media yang

kaya akan nutrisi sehingga sangat mungkin untuk mempercepat perkembangan

kapang endofit tersebut (Agusta, 2009). Kapang endofit yang berhasil diisolasi

dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 18 isolat.

Kapang endofit yang diisolasi dari pucuk daun dan daun yang berada di

dekat pucuk daun berjumlah masing-masing 1 isolat yaitu isolat GB5 dari pucuk

daun dan isolat GB8 dari daun yang berada di dekat pucuk daun. Sedangkan

kapang endofit yang diisolasi dari daun yang berada di tengah ranting dan di

pangkal ranting berjumlah masing-masing 8 isolat yaitu GB1, GB2, GB4, GB6,

75


GB9, GB10, GB11, GB12 dari daun yang berada di tengah ranting dan GB3,

GB7, GB13, GB14, GB15, GB16, GB17, GB18 dari daun yang berada di pangkal

ranting.

Bakteri endofit yang diisolasi tumbuh setelah 3 hari dari proses

penanaman potongan daun pada media NA. Bakteri endofit yang berhasil diisolasi

dari daun tanaman Garcinia benthami Pierre sebanyak 7 isolat, yaitu 4 isolat

bakteri endofit (IGB1, IGB2, IGB3, IGB4) berasal dari pucuk daun dan 3 isolat

bakteri endofit (IGB5, IGB6, IGB7) berasal dari daun yang berada didekat pucuk

daun. Berdasarkan hasil karakterisasi bakteri endofit secara mikrokopis, dapat

diketahui bahwa semua isolat bakteri endofit yang berhasil diisolasi merupakan

bakteri Gram positif.

Mikroba endofit yang telah tumbuh dimurnikan ke medianya masing-

masing. Untuk kapang endofit dimurnikan ke media PDA, sedangkan untuk

bakteri endofit dimurnikan ke media NA. Tujuan pemurnian isolat mikroba

endofit adalah untuk memisahkan hasil inokulasi yang terdiri dari banyak koloni

yang berlainan jenis sehingga didapatkan koloni murni pada setiap cawan petri.

Koloni mikroba yang diambil untuk dimurnikan adalah koloni yang dominan

(Hadioetomo, 1995). Hal ini dilakukan terus-menerus sampai diperoleh koloni

murni. Koloni murni adalah koloni yang memiliki morfologi yang sama karena

berasal dari pembelahan satu sel (Waluyo, 2005).

Uji kemurnian bakteri uji dilakukan sebelum bakteri uji digunakan untuk

tahapan skrining mikroba endofit yang mempunyai aktivitas antibakteri. Uji

kemurnian ini dilakukan untuk memastikan bahwa bakteri uji yang digunakan

merupakan bakteri uji yang benar-benar murni tanpa adanya kontaminasi. Maka

dilakukan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis. Berdasarkan hasil

yang diperoleh didapatkan bahwa bakteri uji benar-benar murni, sehingga dapat

digunakan untuk skrining antibakteri dan uji aktivitas antibakteri.

Pengamatan kurva pertumbuhan dari masing-masing bakteri uji perlu

dilakukan sebelum skrining ataupun pengujian aktivitas antibakteri. Kurva

pertumbuhan dapat diperoleh dari hubungan antara jumlah sel/mL terhadap waktu

(jam). Tujuannya adalah untuk mengetahui pertumbuhan bakteri. Pada kurva

pertumbuhan dapat dilihat pertumbuhan bakteri berdasarkan fasenya, yaitu fase

76


lag, fase log (fase eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian. Fase lag

merupakan fase adaptasi, yaitu fase penyesuaian bakteri pada suatu lingkungan

baru. Fase log (fase eksponensial) merupakan fase pada saat bakteri tumbuh dan

membelah pada kecepatan maksimum. Fase log (fase eksponensial) ini merupakan

fase yang cocok untuk pengujian antibakteri. Suatu zat antibakteri ketika akan

diuji aktivitas antibakterinya, maka bakteri uji yang digunakan harus dalam

keadaan fase aktif pembelahan sel dengan laju yang konstan. Selanjutnya adalah

fase stasioner yaitu pada saat pertumbuhan bakteri berhenti dan terjadi

keseimbangan antara jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati,

selain itu pada fase ini juga terjadi akumulasi produk buangan yang toksik. Fase

terakhir adalah fase kematian, yaitu pada saat jumlah sel yang mati meningkat, hal

ini disebabkan ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi produk buangan yang

toksik (Pratiwi, 2008).

Pada kurva pertumbuhan bakteri Gram positif yaitu Escherichia coli

menunjukkan fase lag (fase adaptasi) terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-2 dan

mulai meningkat pertumbuhan selnya (fase log) pada jam ke-4 hingga jam ke-15.

Selanjutnya pada jam ke-17 hingga jam ke-22 bakteri mengalami fase stasioner.

Sedangkan pada kurva pertumbuhan Staphylococcus aureus menunjukkan fase lag

(fase adaptasi) terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-2 dan mulai meningkat

pertumbuhan selnya (fase log) pada jam ke-3 hingga jam ke-9.

Pada kurva pertumbuhan bakteri Gram negatif yaitu Bacillus subtilis

menunjukkan fase lag (fase adaptasi) terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-12 dan

mulai meningkat pertumbuhan selnya (fase log) pada jam ke-13 hingga jam ke-16.

Selanjutnya pada jam ke-18 hingga jam ke-23 bakteri mengalami fase stasioner.

Pada kurva pertumbuhan Shigella dysenteriae menunjukkan fase lag (fase

adaptasi) terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-4 dan mulai meningkat

pertumbuhan selnya (fase log) pada jam ke-12 hingga jam ke-19. Pada kurva

pertumbuhan Salmonella typhimurium menunjukkan fase lag (fase adaptasi)

terjadi pada jam ke-0 hingga jam ke-9 dan mulai meningkat pertumbuhan selnya

(fase log) pada jam ke-10 hingga jam ke-19.

Bakteri uji siap digunakan untuk uji antibakteri apabila OD (Optical

Density) telah mencapai 0,08-0,1 (setara 107 CFU/mL). Jika OD lebih besar dari

77


0,1 maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan larutan NaCl fisiologis

(Fitriyah et al., 2013).

Skrining mikroba endofit yang mempunyai aktivitas antibakteri dilakukan

untuk menentukan mikroba endofit yang akan dilanjutkan pada proses fermentasi

dan uji aktivitas antibakteri dari hasil fermentasi. Bakteri uji yang digunakan yaitu

bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC

6633) dan Gram negatif (Escherichia coli ATCC 35218, Shigella dysenteriae

ATCC 13313, Salmonella typhimurium ATCC 14028). Berdasarkan hasil

skrining, didapatkan 6 kapang yang mempunyai zona hambat terhadap bakteri uji,

yaitu isolat kapang endofit GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18. Sehingga

6 isolat kapang inilah yang dilanjutkan pada proses fermentasi dan uji aktivitas

antibakteri.

Berdasarkan hasil skrining tersebut, terdapat satu isolat kapang yang

memberikan zona hambat paling baik dibandingkan lima isolat kapang lainnya

yaitu isolat kapang GB2. Isolat kapang GB2 memberikan hasil positif terhadap 4

bakteri uji yaitu dengan zona hambat 13,9 mm terhadap Bacillus subtilis, 18,375

mm terhadap Staphylococcus aureus, 12,05 mm terhadap Shigella dysenteriae,

dan 10,8 mm terhadap Salmonella typhimurium. Zona hambat menunjukkan

kemampuan kapang tersebut mensekresikan senyawa bioaktif ke dalam media

dengan tujuan mempertahankan hidup dengan menghambat pertumbuhan mikroba

lain yang ada di sekitarnya (Melliawati & Puspita, 2008).

Berdasarkan hasil skrining bakteri endofit, terdapat 6 isolat yang

menunjukkan daya mengantagonis bakteri uji, yaitu IGB1, IGB2, IGB3, IGB4,

IGB5, dan IGB6. Akan tetapi dalam proses fermentasi, 7 isolat yang telah

didapatkan tetap diikutsertakan dalam proses fermentasi, hal ini dilakukan karena

mengingat jumlah isolat bakteri endofit yang diperoleh tidak terlalu banyak bila

dibandingkan dengan isolat kapang endofit. Isolat bakteri endofit yaitu IGB1,

IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7.

Isolat mikroba endofit yang terseleksi dari hasil skrining dilanjutkan pada

proses fermentasi. Fermentasi bertujuan untuk menghasilkan sel mikroba endofit

dalam jumlah yang banyak sehingga senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan

menjadi lebih optimal. Proses fermentasi menggunakan media cair karena

78


fermentasi dengan medim cair lebih efektif untuk memproduksi biomassa

(Pokhrel dan Ohga, 2007) dan senyawa bioaktif dibandingkan fermentasi dalam

media padat (Yan et al., 2010). Media fermentasi yang dipilih adalah media PDY

(Potato Dextrose Yeast) untuk fermentasi kapang endofit dan media NB (Nutrient

broth) untuk fermentasi bakteri endofit. Media PDY mengandung sumber karbon

yang berasal dari ekstrak kentang dan dektrosa serta yeast extract sebagai sumber

nitrogen yang diperlukan kapang selama fermentasi. Sedangkan media NB

mengandung beef extract dan pepton. Proses fermentasi kapang endofit dilakukan

secara stasioner selama 21 hari pada suhu ruang dan fermentasi bakteri endofit

dilakukan dengan di shaker pada kecepatan 170 rpm selama 2 hari pada suhu

ruang.

Hasil fermentasi yang diperoleh kemudian disentrifugasi untuk

memisahkan endapan (biomassa) dan supernatan. Untuk kapang endofit

disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, sedangkan untuk

bakteri endofit disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit pada

suhu 4°C. Kemudian supernatan yang diperoleh segera dipindahkan sebanyak 1

mL pada masing-masing tube steril dengan menggunakan mikropipet dan tip

untuk digunakan sebagai larutan uji aktivitas antibakteri.

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram

(disc diffusion methods). Sebanyak 20 µL larutan uji (supernatan dari hasil

fermentasi mikroba endofit) diserapkan pada kertas cakram steril berdiameter 6

mm. Sebelum cakram diletakkan di atas media yang telah mengandung bakteri uji,

cakram terlebih dahulu dikeringkan sehingga supernatan/larutan uji terserap

sempurna di dalam cakram. Setelah cakram kering, maka segera diletakkan pada

permukaan media MHA padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji

(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae,

dan Salmonella typhimurium) dengan metode pour plate. Sebagai kontrol positif

digunakan cakram kloramfenikol konsentrasi 30 µg dan kontrol negatif yaitu

aquades steril yang diserapkan pada cakram dan dikeringkan. Setelah semua

cakram yang berisi larutan uji, kontrol positif, dan kontrol negatif diletakkan di

atas permukaan media MHA tersebut, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada

suhu 35ºC. Aktivitas antibakteri dinyatakan sebagai diameter zona hambat (mm)

79


yang dihasilkan oleh supernatan hasil fermentasi mikroba endofit. Diameter zona

hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong (Radji et al., 2011 dengan

modifikasi). Penggunaan kloramfenikol sebagai kontrol positif dikarenakan

antibiotik ini mempunyai spektrum yang luas terhadap bakteri Gram positif dan

negatif. Kloramfenikol dapat menghambat sintesis protein mikroba dengan cara

berikatan dengan ribosom subunit 50s dan menghambat enzim peptidil

transferase sehingga ikatan peptida tidak terbentuk pada proses sintesis protein

mikroba (Gunawan, 2011).

Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi

kapang endofit yang dilakukan selama 21 hari didapatkan 1 isolat aktif terhadap

Escherichia coli, 6 isolat aktif terhadap Bacillus subtilis, 3 isolat aktif terhadap

Shigella dysenteriae, dan 2 isolat aktif terhadap Salmonella typhimurium. Isolat-

isolat aktif tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji baik secara

tuntas (memberikan zona bening) maupun zona parsial.

Supernatan dari suspensi koloni kapang endofit yang aktif sebagai

antibakteri terhadap Escherichia coli yaitu dari isolat GB18 dengan zona hambat

6,73 mm. Tidak ada supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai

antibakteri terhadap Staphylococcus aureus. Supernatan dari isolat kapang endofit

yang aktif sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis yaitu GB2 (7,31 mm),

GB8 (7,27 mm), GB14 (7,32 mm), GB16 (7,1 mm), GB17 (7,12 mm), dan GB18

(7,55 mm). Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri

terhadap Shigella dysenteriae yaitu GB2 (6,98 mm), GB16 (8,08 mm), dan GB17

(7,34 mm). Supernatan dari isolat kapang endofit yang aktif sebagai antibakteri

terhadap Salmonella typhimurium yaitu GB2 (6,75 mm) dan GB8 (6,87 mm).

Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri dari supernatan hasil fermentasi

bakteri endofit selama 2 hari didapatkan 3 isolat aktif terhadap Staphylococcus

aureus, 2 isolat aktif terhadap Bacillus subtilis, 7 isolat aktif terhadap Escherichia

coli, 2 isolat aktif terhadap Shigella dysenteriae, dan 1 isolat aktif terhadap

Salmonella typhimurium. Isolat-isolat aktif tersebut mampu menghambat

pertumbuhan bakteri uji baik secara tuntas (memberikan zona bening) maupun

zona parsial.

80


Supernatan dari suspensi isolat bakteri endofit yang aktif sebagai

antibakteri terhadap Staphylococcus aureus yaitu IGB3 (7,07 mm), IGB5 (7,57

mm), dan IGB6 (7,22 mm). Supernatan dari isolat bakteri endofit yang aktif

sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis yaitu IGB1 (5,88 mm) dan IGB3

(6,8 mm). Supernatan dari suspensi isolat bakteri endofit yang aktif sebagai

antibakteri terhadap Escherichia coli yaitu IGB1 (6,95 mm), IGB2 (6,9 mm),

IGB3 (7,08 mm), IGB4 (6,67 mm), IGB5 (6,52 mm), IGB6 (6,68 mm), dan IGB7

(6,48 mm). Supernatan dari isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri

terhadap Shigella dysenteriae yaitu IGB3 (6,92 mm) dan IGB6 (6,58 mm).

Supernatan dari isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri terhadap

Salmonella typhimurium yaitu IGB3 (5,93 mm).

Temuan dalam penelitian ini adalah berhasil diisolasi mikroba endofit

sebanyak 25 isolat yang terdiri dari 18 isolat kapang endofit dan 7 isolat bakteri

endofit, serta telah diuji aktivitas antibakterinya terhadap Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, dan Salmonella

typhimurium yang memberikan hasil positif pada 13 isolat mikroba endofit yaitu

isolat kapang GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18 aktif terhadap Bacillus

subtilis; isolat kapang GB18 aktif terhadap Escherichia coli; isolat kapang GB2,

GB16, dan GB17 aktif terhadap Shigella dysenteriae; isolat kapang GB2 dan GB8

aktif terhadap Salmonella typhimurium; isolat bakteri IGB1, IGB2, IGB3, IGB4,

IGB5, IGB6, dan IGB7 aktif terhadap Escherichia coli; isolat bakteri IGB3,

IGB5, dan IGB6 aktif terhadap Staphylococcus aureus; isolat bakteri IGB1 dan

IGB3 aktif terhadap Bacillus subtilis; isolat bakteri IGB3 dan IGB6 aktif terhadap

Shigella dysenteriae; isolat bakteri IGB3 aktif terhadap Salmonella typhimurium.


BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1) 25 isolat mikroba endofit berhasil diisolasi dari daun tanaman Garcinia

benthami Pierre, yaitu terdiri dari 18 isolat kapang endofit (GB1, GB2, GB3,

GB4, GB5, GB6, GB7, GB8, GB9, GB10, GB11, GB12, GB13, GB14, GB15,

GB16, GB17, dan GB18) dan 7 isolat bakteri endofit (IGB1, IGB2, IGB3,

IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7).

2) Dari 18 isolat kapang endofit, terdapat 6 isolat kapang endofit yang aktif

sebagai antibakteri, yaitu:

- Isolat kapang GB2, GB8, GB14, GB16, GB17, dan GB18 aktif terhadap

Bacillus subtilis.

- Isolat kapang GB18 aktif terhadap Escherichia coli.

- Isolat kapang GB2, GB16, dan GB17 aktif terhadap Shigella dysenteriae.

- Isolat kapang GB2 dan GB8 aktif terhadap Salmonella typhimurium.

3) Didapatkan 7 isolat bakteri endofit yang aktif sebagai antibakteri, yaitu:

- Isolat bakteri IGB1, IGB2, IGB3, IGB4, IGB5, IGB6, dan IGB7 aktif

terhadap Escherichia coli.

- Isolat bakteri IGB3, IGB5, IGB6 aktif terhadap Staphylococcus aureus.

- Isolat bakteri IGB1 dan IGB3 aktif terhadap Bacillus subtilis.

- Isolat bakteri IGB3 dan IGB6 aktif terhadap Shigella dysenteriae.

- Isolat bakteri IGB3 aktif terhadap Salmonella typhimurium.

5.2 Saran

1) Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengetahui senyawa yang terdapat

dalam isolat mikroba endofit yang berhasil diisolasi dari daun Garcinia

benthami Pierre, khususnya isolat yang memiliki aktivitas antibakteri.

2) Perlu dilakukan uji antibakteri dengan spesies bakteri yang lain untuk melihat

potensi antibakteri dari mikroba endofit dari daun Garcinia benthami Pierre

sehingga diharapkan mikroba endofit ini dapat dimanfaatkan untuk

pengobatan.

82


BAGAN ALUR PENELITIAN

Karakterisasi Mikroba Endofit

Fermentasi Mikroba Endofit

Daun Garcinia benthami Pierre

1) Fermentasi Kapang

Endofit

2) Fermentasi Bakteri

Endofit

1) Skrining Kapang Endofit

yang Berpotensi sebagai

Antibakteri

2) Skrining Bakteri Endofit

yang Berpotensi sebagai

Antibakteri

1) Sterilisasi Permukaan

2) Pemurnian Mikroba

Endofit

1) Karakterisasi Kapang

Endofit

2) Karakterisasi Bakteri

Endofit

Isolasi Mikroba Endofit

Uji Aktivitas Antibakteri dari

Supernatan Hasil Fermentasi

Mikroba Endofit

Skrining Mikroba Endofit yang

Berpotensi sebagai Antibakteri

83


DAFTAR REFERENSI

Adawiyah, Nurul Robiatul. 2013. Skrining, Isolasi, dan Uji Aktivitas Antibakteri

Metabolit Bioaktif Jamur Endofit dari Tanaman Kina (Cinchona

pubescens Vahl.). Skripsi Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Agusta, Andria. 2009. Biologi & Kimia Fungi Endofit. Cibinong: Penerbit ITB.

Amelia, Puteri. 2011. Isolasi, Elusidasi Struktur dan Uji Aktivitas Antioksidan

Senyawa Kimia dari Daun Garcinia benthami Pierre. Tesis Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Program Magister Ilmu

Kefarmasian Universitas Indonesia, Depok.

Ariyono, Redha Qadiani, et al. 2014. Keanekaragaman Fungi Endofit Daun

Kangkung Darat (Ipomoea reptans Poir.) pada Lahan Pertanian Organik

dan Konvensional. Jurnal HPT. 2 (1).

Batt, Carl A and Mary-Lou Tortorello. 2014. Encyclopedia of Food Microbiology

Second Edition. USA: Academic Press.

Buckle, K.A. 1985. Ilmu Pangan. UI Press. Jakarta.

Castillo UF et al. 2002. Munumbicins, Wide Spectrum Antibiotics Produced by

Streptomyces NRRL 30562, Endophytic on Kennedia Nigriscans.

Microbiology. 148: 2675-2685.

Castillo UJ et al. 2003. Kakandumycins, Novel Antibiotics from Streptomyces sp.

NRRL 30566, an Endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Lett. 24: 183-

190.

Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan.

Elya, B. et al. 2004. Two New Benzophenones from Garcinia benthami. J. Trop.

Med. Plants. 5 (2): 229-231.

Elya, B, Soleh Kosela & Muhammad Hanafi. 2006. Flavonoid dan Triterpenoid

dari Ekstrak Aseton Garcinia benthami Pierre. Jurnal Bahan Alam

Indonesia. 6 (1): 37-41.

Elya, B, Soleh Kosela & Muhammad Hanafi. 2009. Senyawa Triterpenoid dari

Ekstrak N-Heksana Kulit Batang Tanaman Garcinia benthami. Makara

Sains. 13 (1): 9-12.

Fitriyah, Dina, Christine Jose, & Saryono. 2013. Skrining Aktivitas Antimikroba

dan Uji Fitokimia dari Kapang Endofitik Tanaman Dahlia (Dahlia

variabilis). J. Ind.Che.Acta. 3 (2).

Gandjar et al. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia.

84


Guan SH et al. 2005. p-Aminoacetophenonic Acids Produced by a Mangrove

Endophyte: Streptomyces griseus Subspecies. J Nat Prod. 68: 1198–200.

Gunawan, Sulistia Gan. 2011. Farmakologi dan Terapi. Jakarta: Badan Penerbit

FKUI.

Hadioetomo RS. 1995. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Handayani. 2007. Skrining Kapang Endofit Penghasil Antimikroba dari Ranting

Tanaman Garcinia tetrandra Pierre terhadap Escherichia coli,

Staphylococcuc aureus, Salmonella typhosa, Bacillus subtilis,

Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, dan Aspergillus niger.

Skripsi Sarjana Ekstensi Farmasi FMIPA UI, Depok.

Hemshekhar, M et al. 2011. An Overview on Genus Garcinia: Phytochemical and

Therapeutical Aspects. Springer Science+Business Media B.V.

Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Cetakan I. Jakarta:

Badan Penelitian dan Pengembangan Departemen Kehutanan.

Horn WS et al. 1995. Phomopsichalasin, a Novel Antimicrobial Agent from an

Endophytic Phomopsis Spp. Tetrahedron. 14: 3969-3978.

Iinuma, Munekazu et al. 1998. A Xanthone from Garcinia cambogia.

Phytochemistry. 47 (6): 1169-1170.

Ilyas, M et al. 1994. Isoflavons from Garcinia nervosa. Phytochemistry. 36(3):

807-809.

Jawetz, Melnik & Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: EGC.

Jay, J. M. 1978. Modern Food Microbiology. AVI Publ. Co. Inc., Westport,

Connecticut.

Juliantina, F. R., Ayu, D. C. M, & Nirwani, B. 2008. Manfaat Sirih Merah (Piper

crocatum) sebagai Agen Antibakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan

Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.

Khotimah, Fiqi Khusnul. 2010. Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri Minyak Atsiri

Bunga Cengkeh (Syzygium aromaticum). Skripsi Biologi Fakultas Sains

dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Kumala, Shirly dan Ainun Apriani Pratiwi. 2014. Efek Antimikroba dari Kapang

Ranting Tanaman Biduri. Jurnal Farmasi Indonesia. 7 (2).

Kumala, Shirly dan Endro Budi Siswanto. 2007. Isolation and Screening of

Endophytic Microbes from Morinda citrifolia and their Ability to Produce

Anti-Microbial Substances. Microbiology Indonesia. 1 (3): 145-148.

Kumala, Shirly, Fransisca Shanny, dan Priyo Wahyudi. 2006. Uji Aktivitas

Antimikroba Metabolit Bioaktif Mikroba Endofitik Tanaman Trengguli

(Cassia fistula L.). Jurnal Farmasi Indonesia. 3 (2): 97 - 102.

85


Larran, S., C. Monaco, & H.E. Alippi. 2001. Endophytic Fungi in leaves of

Lycopersicon esculentum. World J. Microbiol. Biotechnol. 17: 181-184.

Lay, Bibiana W. 1992. Mikrobiologi, Edisi 1. Jakarta: Rajawali Press.

Li JY et al. 2001. Ambuic acid, a highly functionalized cyclohexenone with

antifungal activity from Pestalotiopsis spp. and Monochaetia spp.

Pytochemistry. 56: 463-468.

Likhitwitayawuid et al. 1998. Xanthones with Antimalarial Activity from

Garcinia dulcis. Planta Med. 64: 281-282.

Lorian, V. 1980. Antibiotic in Laboratory Medicine, 2th

edition. London: Williams

and Wilkins.

Madigan, M. 2005. Brock Biology of Microorganism. Englewood Cliff: Prentice

Hall.

McDonnell, G. & A.D. Russell. 1999. Antiseptic and disinfectants: Activity,

action, and resistance. Clinical Microbiology Review. 12 (1): 147-179.

Melliawati, Ruth & Puspita Suci Wulandari. 2008. Kapang Endofit dari Taman

Nasional Gunung Halimun Sebagai Penghambat Pertumbuhan Mikroba

Patogen Salmonella thypi dan Candida albicans. Berk. Penel. Hayati. 13:

101-107.

Melliawati, Ruth & Harni. 2009. Senyawa Antibakteri Escherichia coli ATCC

35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dari Kapang Endofit

Taman Nasional Gunung Halimun. Jurnal Natur Indonesia 12 (1): 21-27.

Mutmainnah et al. 2008. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Probiotik dari Saluran

Pencernaan Ayam Kampung Gallus domesticus. Jurnal Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Fakultas Farmasi,

Universitas Hasanuddin Makassar.

Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit

Universitas Indonesia (UI Press).

Petrini O, Sieber TN, Toti L, Viret O. 1992. Ecology, Metabolite Production and

Substrate Utilization in Endophytic Fungi. Natural Toxins. 1: 185-196.

Phongpaichit, Souwalak et al. 2006. Antimicrobial Activity in Cultures of

Endophytic Fungi Isolated from Garcinia Species. Journal FEMS Immunol

Med Microbiol. 48: 367–372.

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Prihatiningtias, W. 2005. Senyawa Bioaktif Fungi Endofit Akar kuning

(Fibraurea chloroleuca Miers) sebagai Senyawa Antimikroba. Tesis

Sekolah Pascasarjana UGM Yogyakarta.

86


Rachman, I. 2003. Sumber Koleksi Herbarium Bogoriense. Bogor: Bidang Botani

Pusat Penelitian Biologi-LIPI.

Radji, Maksum. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2 (3): 113 – 126.

Radji, Maksum. 2006. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Edisi kedua.

Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok: 24-25. Dalam: Rachmayani,

2008.

Radji, Maksum et al. 2011. Isolation of fungal endophytes from Garcinia

mangostana and their antibacterial activity. African Journal of

Biotechnology. 10 (1): 103-107.

Ramadhan, M. Gama. 2011. Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan α-

Glukosidase dari Kapang Endofit Daun Johar (Cassia siamea Lamk.).

Skripsi Program Studi Sarjana Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Indonesia, Depok.

Rosana, Yeva. 2001. Isolasi dan Seleksi Mikroba Endofit Penghasil Antimikroba

dari Tanaman Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi Linn). Tesis

Kekhususan Mikrobiologi Kedokteran Program Studi Ilmu Biomedik-

Program Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Depok.

Rosana, Yeva et al. 2001. Isolasi dan Seleksi Jamur Endofit dari Tanaman

Belimbing Wuluh (Averhoa blith Linn) yang Menghasilkan Bahan Anti-

Mikotik. J Mikol Ked Indones 2: 134-139 dalam Kumala, Shirly dan

Endro Budi Siswanto. 2007. Isolation and Screening of Endophytic

Microbes from Morinda citrifolia and their Ability to Produce Anti-

Microbial Substances. Microbiology Indonesia. 1 (3): 145-148.

Rustanti, Mirna. 2007. Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil Antimikroba

pada Akar Tanaman Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.). Skripsi Program

Studi Sarjana Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Indonesia, Depok.

Sari, R. 1999. Koleksi Garcinia Kebun Raya Bogor: Konservasi dan Potensi.

Prosiding Seminar Nasional Konservasi Flora Nusantara. Balai

Pengembangan Kebun Raya, Lembaga Pengetahuan Indonesia Bogor,

217-221.

Simanjuntak P et al. 2004. Isolasi dan Identifikasi Artemisinin dari Hasil

Kultivasi Mikroba Endofit dari Tanaman Artemisia annua. Majalah

Farmasi Indonesia. 15 (2): 68-74.

Simarmata, Rumella, Sylvia Lekatompessy, dan Harmastini Sukiman. 2007.

Isolasi Mikroba Endofitik dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura

procumbens) dan Analisis Potensinya Sebagai Antimikroba. Berk. Penel.

Hayati. 13: 85–90.

87


Sinaga E, Noverita, dan Fitria D. 2009. Daya Antibakteri Fungi Endofit yang

Diisolasi dari Daun dan Rimpang Lengkuas (Alpinia galangal Sw.). Jurnal

Farmasi Indonesia. 4: 161-162.

Sleigh, JD & Timbury, M.C. 1994. Notes on Medical Bacteriology. Tokyo:

Churchill Livingstone.

Sosef, M. S. M., Hong, L. T. & Prawirohatmodjo, S. 1998. PROSEA (Plant

Resources of South East Asia) Timber Trees: Lesser – Known Timber.

Backhuys Publisher, Leyden. (3): 246-249.

Strobel, Gary A et al. 1996. Taxol from Fungal Endophytes and the Issue of

Biodiversity. Journal of Industrial Microbiology. 17: 417-423.

Strobel, Gary A. 2002. Microbial gifts from rain forests. Can J Plant Pathol. 24:

14-20.

Strobel, Gary and Bryn Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes

and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology

Reviews. 67 (4): 491-502.

Strobel, Gary A et al. 2004. Natural Products from Endophytic Microorganisms. J

Nat Prod. (67): 257–68.

Syahrurachman, Agus et al. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi

Revisi. Jakarta: Binarupa Aksara.

Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites.

Nat Prod Rep. 18: 448-459.

Tilakchand, Mahima, Balaram Naik, & Abhijith S Shetty. 2014. A Comparative

Evaluation of the Effect of 5.25% Sodium Hypochlorite and 2%

Chlorhexidine on the Surface Texture of Gutta-Percha and Resilon Cones

Using Atomic Force Microscope. J Conserv Dent. 17 (1): 18–21.

Valera, M.C et al. 2009. Antimicrobial Activity of Sodium Hypochlorite

Associated with Intracanal Medication for Candida Albicans and

Enterococcus Faecalis Inoculated in Root Canals. J. Appl. Oral Sci. 17

(6): 555-559.

Verheij EWM & Coronel RE. 1992. PROSEA Sumber Daya Nabati Asia

Tenggara. Buah-buahan yang dapat dimakan (2). Bogor.

Waluyo. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang: UMPress.

http://id.wikipedia.org/wiki/Struktur_sel_bakteri diakses tanggal 23 Januari 2015

http://id.wikipedia.org/wiki/Struktur_sel_bakteri

88


LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman

89


Lampiran 2. Bagan Sterilisasi Permukaan

Lampiran 3. Bagan Isolasi Mikroba Endofit

Daun dipotong dengan

ukuran ± 1 x 1 cm2

Media isolasi

PDA

Media isolasi

NA

Diinkubasi

pada suhu

ruang selama

14 hari

Diinkubasi

pada suhu 35ºC

selama 3 hari

Air mengalir

selama 10

menit

4 helai daun

dan pucuk

daun dipilih

Alkohol 70%

selama 1 menit

Natrium hipoklorit

(NaOCl) 5,25%

selama 5 menit

Alkohol 70% selama

30 detik

Aquades steril selama

1 menit diulang dua

kali

Daun dikeringkan di

atas kertas saring

steril

90


Lampiran 4. Bagan Pemurnian Mikroba Endofit

a. Pemurnian Kapang Endofit

b. Pemurnian Bakteri Endofit

Dimurnikan ke dalam media

PDA dan diinkubasi selama

5-7 hari pada suhu ruang

Kapang endofit

tumbuh Isolat kapang

endofit murni

Stock

culture

Dipindahkan ke dalam media

agar PDA dan agar miring

PDA. Kultur kapang endofit

diinkubasi selama 5-10 hari

pada suhu ruang Working culture

Bakteri endofit

tumbuh

Disubkultur pada

plate medium NA

pada suhu 35ºC

selama 24-48 jam

Koloni murni

kemudian

dipindahkan ke agar

miring NA dan

diinkubasi selama

24-48 jam pada suhu

35ºC

stock

culture working

culture

91


Lampiran 5. Karakterisasi Kapang Endofit

a. Karakterisasi Makroskopis Kapang Endofit

b. Karakterisasi Mikroskopis Kapang Endofit

Mengamati karakteristik koloni suatu

biakan, meliputi:

- warna dan struktur permukaan koloni;

- ada atau tidaknya tetes eksudat (exudate

drops); dan

- ada atau tidaknya lingkaran konsentris

(zonasi).

Setelah masa inkubasi selesai,

kemudian diamati secara

mikroskopis dengan mikroskop

cahaya pada perbesaran 200-400

kali

diinkubasi pada suhu ruang

selama 7 hari

92


Lampiran 6. Bagan Fermentasi Mikroba Endofit

a. Fermentasi Kapang Endofit

b. Fermentasi Bakteri Endofit

Koloni bakteri

endofit murni Diinkubasi pada suhu ruang selama 2 hari

dengan kecepatan shaker 170 rpm

Biomassa sel dipanen dengan

menggunakan sentrifus berpendingin 3000

rpm selama 20 menit pada suhu 4°C

Supernatan dari hasil

sentrifus digunakan untuk

uji hayati

Difermentasi cair dengan

menggunakan medium NB sebanyak

10 mL dalam tabung reaksi diameter 2

cm

Koloni kapang

endofit yang telah

murni

Diinkubasi selama 21 hari dengan

suhu ruang dalam kondisi

stasioner.

Miselia dan media agar dari kapang

endofit diambil sebanyak 3 bulatan

berdiameter 6 mm kemudian

dimasukkan ke dalam media PDY

200 mL.

Hasil fermentasi disentrifugasi

dengan kecepatan 3000 rpm

selama 15 menit dan supernatan

yang diperoleh dijadikan sebagai

larutan uji aktivitas antibakteri.

93


Lampiran 7. Bagan Uji Aktivitas Antibakteri dari Supernatan Hasil

Fermentasi Mikroba Endofit

Lampiran 8. Hasil Isolasi Mikroba Endofit

1) Isolasi Kapang Endofit pada Media PDA (Potato Dextrose Agar)

Isolasi kapang endofit pada daun didekat pucuk

Hari ke-0

Hari ke-5

Hari ke-7

Hari ke-14

Kontrol

Didapatkan 1

isolat kapang

endofit yaitu

isolat GB5

Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan

pada permukaan media yang berisi bakteri uji. Amati

zona hambatan yang terbentuk setelah inkubasi.

Ukur diameter zona hambat dengan jangka sorong

Kontrol positif yang

digunakan pada uji

aktivitas antibakteri

adalah kloramfenikol 30

µg/cakram

Kontrol negatif

yaitu aquades steril

yang diserapkan ke

cakram steril.

94


Isolasi kapang endofit pada daun ditengah ranting

Hari ke-5

Hari ke-7

Hari ke-14

Kontrol

Didapatkan 8 isolat kapang endofit

yaitu GB1, GB2, GB4, GB6, GB9,

GB10, GB11, dan GB12

Isolasi kapang endofit pada daun dipangkal ranting

Hari ke-5

Hari ke-7

95


Hari ke-14

Kontrol

Didapatkan 8 isolat yaitu isolat GB3, GB7, GB13, GB14, GB15, GB16, GB17,

dan GB18

Isolasi kapang endofit pada pucuk daun

Hari ke-5

Hari ke-7

Hari ke-14

Kontrol

Didapatkan

1 isolat

kapang

endofit yaitu

GB8

2) Isolasi Bakteri Endofit pada Media NA (Nutrient Agar)

Isolasi bakteri endofit pada daun yang berada di dekat pucuk daun

Hari ke-3

Kontrol

Didapatkan 3

isolat bakteri

endofit yaitu

IGB5, IGB6, dan

IGB7

Isolasi bakteri endofit pada pucuk daun

Hari ke-3

Kontrol

Didapatkan 4

isolat bakteri

yaitu IGB1,

IGB2, IGB3, dan

IGB4

96


Lampiran 9. Hasil Stock Culture Mikroba Endofit

1) Kapang Endofit

GB1

GB2

GB3

GB4

GB5

GB6

GB7

GB8

GB9

GB10

GB11

GB12

GB13

GB14

GB15

GB16

GB17

GB18

2) Bakteri Endofit

Lampiran 10. Hasil Fermentasi Mikroba Endofit

1) Hasil Fermentasi Kapang Endofit

GB2

GB18

GB17 GB16 GB14 GB8 GB18

97


2) Hasil Fermentasi Bakteri Endofit

Lampiran 11. Data Absorbansi Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Absorbansi (Optical Density)

Jam E.coli S.aureus S.dysenteriae B.subtilis S.typhimurium

0 0.007 0.001 0.003 0.002 0.006

1 0.012 0.005 0.007 0.002 0.041

2 0.055 0.014 0.017 0.006 0.130

3 0.203 0.066 0.037 0.009 0.327

4 0.402 0.198 0.088 0.021 0.444

5 0.542 0.404 0.226 0.065 0.347

6 0.624 0.821 0.402 0.163 0.401

7 0.689 1.022 0.579 0.294 0.372

8 0.806 1.142 0.757 0.434 0.364

9 0.884 1.191 0.891 0.633 0.377

10 1.056 1.485 0.892 0.474 0.981

11 1.160 1.479 0.976 0.621 1.094

12 1.470 1.769 0.956 0.830 1.240

13 1.647 2.122 0.990 0.855 1.269

14 1.895 1.946 1.229 1.132 1.430

15 1.973 2.083 1.581 0.156 1.514

16 2.053 1.839 1.631 1.776 1.584

17 2.086 1.911 1.692 1.893 1.648

18 2.072

1.744 1.956 1.668

19 2.058

1.731 1.978 1.734

20 2.057

1.786 1.946 1.682

21 2.033

1.780 1.981 1.745

22 2.033

1.797 1.958 1.763

23

1.944

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA -...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA -...