UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ESTERIFIKASI SENYAWA …

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ESTERIFIKASI SENYAWA HASIL NITRASI ASAM P-

METOKSISINAMAT MENGGUNAKAN 1-PROPANOL

SERTA UJI AKTIVITAS SEBAGAI ANTIINFLAMASI

SKRIPSI

Diajukan sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

AZIZ IQBAL IRAQIA

NIM : 1111102000014

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JULI 2015

vi

ABSTRAK

Nama : Aziz Iqbal Iraqia

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul Skripsi : Esterifikasi Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-

metoksisinamat menggunakan 1-propanol Serta Uji

Aktivitas Sebagai Antiinflamasi.

Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan senyawa isolat kencur (Kaemferia

galanga Linn.) yang memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi. Esterifikasi

senyawa hasil nitrasi asam p-metoksisinamat telah dilakukan untuk mendapatkan

senyawa baru dengan menggunakan 1-propanol sebagai pereaksi. Reaksi ini

menggunakan katalis asam sulfat pekat dan diiradiasi microwave menghasilkan

propil 4-metoksi 6-nitrosinamat dengan rendemen sebesar 13,7 %. Uji Aktivitas

sebagai antiinflamasi dengan Bovine Serum Albumin (BSA) menggunakan metode

denaturasi protein. Uji ini dilakukan dengan membandingkan senyawa etil p-

metoksisinamat, propil 4-metoksi 6-nitrosinamat, dan natrium diklofenak sebagai

standar. Senyawa propil 4-metoksi 6-nitrosinamat memiliki presentase inhibisi

denaturasi protein sebesar 34,37% pada konsentrasi 0,1 ppm, 26,86% pada

konsentrasi 1 ppm, 14,73% ppm pada konsentrasi 10 ppm dan -18,37%. Aktivitas

antiinflamasi senyawa hasil esterifikasi menurun dengan adanya peningkatan

konsentrasi.

Kata kunci : etil p-metoksisinamat, hidrolisi, nitrasi, esterfikasi,

antinflamasi.

vii

ABSTRACT

Nama : Aziz Iqbal Iraqia

Program Studi : Bachelor of Pharmacy

Judul Skripsi : Esterification of p-Methoxycinnamate Acid Nitration

Result Compound Using 1-Propanol and Determination

of Antiinflammatory Activity

Ethyl p-methoxycinnamate (EPMC) is a compound which is isolated from kencur

(Kaemferia galanga Linn.) and has anti-inflammatory activity. Esterification

process of p-methoxycinnamate acid nitration result compound has been done to

obtain a new compound by using 1-propanol as reagent. Concentrated sulfuric

acid were using as a catalyst for the reaction through radiation process bv using

microwave and produced propyl-4-methoxy 6-nitrocinnamate with a yield of

13.7%. The anti-inflammatory activity performed in in vitro using inhibiton

denaturation process of Bovine Serum Albumin (BSA) method by comparing

ethyl p-methoxycinnamate, propyl-4-methoxy 6-nitrocinnamate, and sodium

diclofenac as standart. Propyl-4-methoxy 6-nitrocinnamate has protein

denaturation inhibiton percentage of 34,37% at 0,1 ppm, 26,86% at 10 ppm,

14,73% at 1 ppm, -18,37% at 0,1 ppm. The anti-inflammatory activity of

esterification compund is decreased in the presence of increasing concentration

Kata kunci : Ethyl p-methoxycinnamate, hydrolysis, nitration,

esterification, anti-inflammatory.

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur penulis ucapkan

kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan ridho-Nya sehingga

penulis dapat menyelesaikan penyusunan skripsi ini hingga selesai. Penulisan

skripsi yang berjudul “Esterifikasi Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat

Menggunakan 1-propanol Serta Uji Aktivitas Sebagai Antiinflamasi” bertujuan

untuk memenuhi persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK), Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

Pada kesempatan ini, penulis menyadari bahwa, tanpa bantuan dan

bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan

skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan sebesar-besarnya kepada:

1. Ismiarni Komala, Ph.D., Apt dan Supandi, M.Si., Apt selaku dosen

pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, waktu, tenaga, saran,

dan dukungan dalam penelitian ini.

2. Dr. Arief Sumantri, SKM, M.Kes, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Yardi, Ph.D., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Nelly Suryani,

Ph.D., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, yang telah memberikan banyak motivasi, bantuan, serta ilmu

pengetahuan yang telah diberikan kepada penulis.

4. Lina Elfita, M.Si., Apt dan Puteri Amelia, M.Farm., Apt selaku dewan penguji

yang telah banyak memberikan bimbingan, saran, dan dukungan dalam

penelitian ini.

5. Seluruh dosen di Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, atas

ilmu pengetahuan yang telah diberikan kepada penulis.

ix

6. Kedua orang tua, ayahanda tersayang Solemanto dan ibunda tercinta Hanik

Muawanah yang selalu memberikan kasih sayang, doa yang tak pernah

terputus dan dukungan baik moril maupun materil.

7. Kakakku tersayang Rizqi Muhammad Saputra dan seluruh keluarga besar

yang telah memberikan doa, semangat, dan dukungan hingga penelitian ini

dapat berjalan dengan lancar.

8. Seluruh keluarga besar Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta yang

telah memberikan kesempatan, dan kemudahan untuk melakukan penelitian

serta dukungan yang amat besar.

9. Muhammad Reza, Rhesa Ramadhan, dan Muhammad Haidar Ali atas segala

pengertian, semangat, perhatian, dan bantuannya.

10. Teman-teman seperjuangan BSA : Reza, Sutar, Ali, Nova, Indah, Indri,dan

Mida serta teman-teman di lab PHA yang telah membantu penulis dalam

menyelesaikan penelitian.

11. Teman-teman seperjuangan farmasi 2011 yang telah memberikan pengalaman

serta memori yang tak terlupakan.

12. Serta pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah

memberikan dukungan hingga terwujudnya skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, namun

penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan pada umumnya, dan ilmu farmasi pada

khususnya. Akhir kata, penulis berharap Allah SWT berkenan membalas

segala kebaikan semua pihak yang telah membantu penulis dalam penelitian

ini.

Ciputat, 1 Juli 2015

Penulis

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN ORISINALITAS ............................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN............................................................................. v

ABSTRAK ........................................................................................................... vi

ABSTRACT .......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR.........................................................................................viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................... x

DAFTAR ISI........................................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR...........................................................................................xiii

DAFTAR TABEL ...............................................................................................xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

BAB 1. PENDAHULUAN ................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang............................................................................... 11.2 Rumusan Masalah dan Ruang Lingkup......................................... 31.3 Tujuan Penelitian........................................................................... 31.4 Manfaat Penelitian......................................................................... 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA........................................................................ 5

2.1 Senyawa Etil p-metoksisinamat .................................................... 52.2 Reaksi Hidrolisis ........................................................................... 62.3 Reaksi Nitrasi ................................................................................ 82.4 Reaksi Esterifikasi ......................................................................... 92.5 Spesifikasi 1-propanol, Asam nitrat dan Asam Sulfat................... 11

2.5.1 1-Propanol............................................................................ 112.5.2 Asam Nitrat .......................................................................... 112.5.3 Asam Sulfat.......................................................................... 11

2.6 Kromatografi ................................................................................. 122.6.1 Kromatografi Lapis Tipis..................................................... 13

xii

2.6.2 Kromatografi Kolom............................................................ 152.7 Spektrofotometri............................................................................ 16

2.7.1 Spektofotometri IR............................................................... 162.7.2 Spektrofotometri UV-Vis..................................................... 172.7.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik................................. 18

2.8 Uji Antiinflamasi ........................................................................... 19

BAB 3. METODE PENELITIAN..................................................................... 21

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................... 213.1.1 Tempat ................................................................................. 213.1.2 Waktu ................................................................................... 21

3.2 Alat dan Bahan .............................................................................. 213.2.1 Alat....................................................................................... 213.2.2 Bahan ................................................................................... 21

3.3 Prosedur Penelitian........................................................................ 223.3.1 Modifikasi Asam p-metoksisinamat .................................... 223.3.2 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom (Fraksinasi)......... 23

3.4 Identifikasi Senyawa ..................................................................... 233.5 Uji In vitro Antiinflamasi .............................................................. 24

3.5.1 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi........................ 243.5.2 Pengujian Aktvitas Senyawa Hasil Modifikasi.................... 24

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................. 26

4.1 Modifikasi Struktur Senyawa etil p-metoksisinamat.................... 26

4.1.1 Reaksi Hidrolisis Etil p-metoksisinamat............................ 27

4.1.2 Reaksi Nitrasi APMS (Asam p-metoksisinamat)................ 28

4.1.3 Reaksi Esterifikasi Senyawa Hasil Nitrasi APMS............... 30

4.2 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi ......................................... 324.2.1 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat................. 334.2.2 Senyawa Nitrasi Asam p-metoksisinamat............................ 344.2.3 Esterifikasi Senyawa Hasil Nitrasi....................................... 35

4.3 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan HubunganStruktur Aktivitas Senyawa Hasil Modifikasi.............................40

BAB 5. KESIMPULAN ...................................................................................... 41

5.1 Kesimpulan.................................................................................... 415.2 Saran .............................................................................................. 41

DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................... 42

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur etil p-metoksisinamat........................................................ 5

Gambar 2.2 Jalur asam sikhimat dalam biosintesa fenilpropanoid untuk

menghasilkan etil p-metoksisinamat (Bangun, 2011)..................... 6

Gambar 2.3 Prinsip Reaksi Hidrolisis ................................................................ 7

Gambar 2.4 Mekanisme Reaksi Hidrolisis pada Ester........................................ 7

Gambar 2.5 Mekanisme Reaksi Hidrolisis Ester dengan Katalis Basa............... 8

Gambar 2.6 Mekanisme reaksi nitrasi dengan HNO3 dan H2SO4 pada senyawa

aromatik .......................................................................................... 8

Gambar 2.7 Skema kromatografi lapis tipis........................................................ 15

Gambar 4.1 Mekanisme hidrolisis EPMS menjadi APMS................................. 28

Gambar 4.2 KLT senyawa asam p-metoksisinamat ........................................... 28

Gambar 4.3 Mekanisme nitrasi APMS............................................................... 29

Gambar 4.4 KLT senyawa hasil nitrasi asam p-metoksisinamat........................ 30

Gambar 4.5 Mekanisme esterifikasi hasil nitrasi APMS.................................... 30

Gambar 4.6 Senyawa esterifikasi sebelum dipisahkan dengan kromatografi

kolom .............................................................................................. 31

Gambar 4.7 Hasil KLT senyawa esterifikasi murni ........................................... 31

Gambar 4.8 Hasil KLT senyawa menggunakan eluen heksan : etil .................. 32

Gambar 4.9 Senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat ............................. 33

Gambar 4.10 Struktur senyawa asam p-metoksisinamat ...................................... 34

xiv

Gambar 4.11 Senyawa hasil nitrasi asam p-metoksisinamat ............................... 34

Gambar 4.12 Hasil kromatografi GCMS senyawa hasil nitrasi ........................... 35

Gambar 4.13 Senyawa esterifikasi hasil nitrasi ................................................... 35

Gambar 4.14 Spektrum IR Senyawa Hasil Modifikasi ........................................ 36

Gambar 4.15 Senyawa etil p-metoksisinamat...................................................... 37

Gambar 4.16 Senyawa propil 4-metoksi 6-nitrosinamat...................................... 40

xv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Daftar daerah spektrum IR senyawa esterfikasi hasil nitrasi.................36

Tabel 4.2 Data Pergeseran Kimia (δ) Spektrum 1H NMR dan 13C NMR

Senyawa EPMS dan Senyawa Hasil Esterifikasi Propanol

(CDCl3, 500 MHz).................................................................................38

Tabel 4.3 Hasil Uji antiinflamasi EPMS dan Propil 4-metoksi 6-nitrosinamat.....40

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1: Kerangka Penelitian.......................................................................... 46

Lampiran 2. Skema Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi................................. 47

Lampiran 3. Spektrum GCMS Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat...............48

Lampiran 4. Spektrum Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat ............. 49

Lampiran 5. Spektrum GCMS Senyawa Esterifikasi Hasil Nitrasi Asam p-

metoksisinamat.................................................................................50

Lampiran 6. Spektrum IR Senyawa Esterifikasi...................................................50

Lampiran 7 Spektrum 1H NMR dan 13C NMR Senyawa Esterifikasi................. .51

Lampiran 8. Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi............................................... 56

Lampiran 9. Diagram Hasil Uji Antiinflamasi.....................................................59

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pemanfaatan hasil isolasi dari suatu tumbuhan untuk mensintesis

senyawa lainnya merupakan sebuah terobosan dalam penemuan senyawa

baru. Terdapat banyak sekali tumbuh-tumbuhan di dunia ini yang dapat

dimanfaatkan sebagai obat. Munculnya penyakit-penyakit baru dan

ketidakmampuan suatu obat untuk menyembuhkan suatu penyakit memicu

dilakukannya penelitian untuk menemukan suatu obat yang dapat mencegah

atau mengurangi atau bahkan menyembuhkan suatu penyakit. Di negara kita

sendiri, yaitu Indonesia, memiliki berbagai macam keanekaragaman hayati

terutama tumbuh-tumbuhan. Terdapat 30.000 jenis tumbuhan dari 40.000

jenis tumbuhan di dunia, dan 7.500 jenis diantaranya termasuk tanaman

bekhasiat obat (Kotranas, 2006). Dengan banyaknya jenis tumbuhan yang

berkhasiat obat, Indonesia berpotensi menjadi penyedia bahan baku tanaman

obat.

Secara empirik, kencur (Kaemfera galanga Linn.) berkhasiat sebagai

obat untuk batuk, gatal-gatal pada tenggorokan, perut kembung, mual,

masuk angin, pegal-pegal, pengompres bengkak/radang, tetanus dan

penambah nafsu makan (Miranti, 2009). Sulaiman dkk (2007), menyatakan

bahwa rimpang kencur dapat digunakan untuk penyakit hipertensi, rematik,

dan asma. Penelitian yang dilakukan Sulaiman dkk (2007) juga melaporkan

bahwa ekstrak air daun kencur mempunyai aktivitas antiinflamasi yang diuji

pada radang akut yang diinduksi dengan karagenan. (Aliya dkk., 2011)

Kandungan minyak atsiri dari rimpang kencur diantaranya terdiri atas

etil p-metoksisinamat 58,47%, isobutil β-2-furilakrilat 30,90%, heksil

format 4,78%); derivat monoterpen teroksigenasi (misalnya borneol 0,03%

dan kamfer hidrat 0,83%); serta monoterpen hidrokarbon (misalnya kamfen

0,04% dan terpinolen 0,02%) (Sukari et al., 2008).

Etil p-metoksisinamat adalah senyawa turunan asam sinamat yang

merupakan senyawa dengan kandungan terbesar pada minyak esensial dari

rhizoma tanaman kencur (Kaemferia galanga Linn.). Bermacam-macam

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

presentase jumlah kandungan senyawa ini tergantung dari pelarut dan cara

ekstraksi yang digunakan. Senyawa ini memiliki aktivitas sebagai analgesik

dan anti inflamasi (Sadono & Hasmono, 2001). Asam p-metoksisinamat

merupakan hasil dari hidrolisis etil p-metoksisinamat menggunakan katalis

basa.

Dalam studi in vitro, EPMS secara non selektif menghambat aktivitas

siklooksigenase 1 dan 2 dengan nilai IC50 masing-masing 1,12 μM dan 0,83

μM. Hasil ini menvalidasi aktivitas anti inflamasi dari Kaemferia galanga

yang diberikan dengan menghambat siklooksigenase 1 dan 2. (Umar et al,

2012).

Telah banyak modifikasi struktur pada AINS salah satunya dengan

penambahan gugus nitro. Dikatakan bahwa AINS yang mengandung gugus

nitro dapat mengurangi efek iritasi pada lambung dikarenakan gugus nitro

dapat mempertahankan aliran darah mukosa lambung dan mencegah

melekatnya leukosit ke endotelium vaskuler pada sirkulasi splanknikus

(merupakan salah satu peristiwa paling awal setelah pemberian AINS) yang

dapat meniadakan gangguan penekanan COX-1 sehingga kerusakan mukosa

tidak terjadi. (Halen et al, 2009).

Perubahan asam karboksilat menjadi bentuk esternya pada AINS juga

dapat mengurangi efek iritasi lambung karena senyawa AINS dalam bentuk

ester akan dengan mudah mengalami hidrolisis enzimatik oleh adanya

enzim esterase yang berlimpah di dalam usus halus; karenanya mukosa

lambung tidak akan terkena gugus karboksilat bebas yang menyebabkan

iritasi lambung (Halen et al, 2009).

Pada penelitian modifikasi flurbiprofen dengan cara esterifikasi

menggunakan beberapa pereaksi seperti etanol, metanol, n-propanol, dan

sebagainya. Hasilnya bahwa ester propil flubiprofen lebih dapat mengurangi

gastrotoksisitas secara signifikan bila dibandingkan dengan bentuk ester etil

flurbiprofen. (Mohan, et al., 2007)

Dalam rangka mengeksplorasi hubungan struktur aktivitas senyawa

etil p-metoksisinamat sebagai antiinflamasi, maka perlu dilakukan

3


penelitian mengenai pengaruh penambahan gugus nitro dan penggantian

gugus ester etil dengan gugus propil terhadap aktivitas antiinflamasi EPMS.

Pada penelitian ini dilakukan hidrolisis etil p-metoksisinamat

kemudian dilanjutkan dengan proses nitrasi senyawa hasil hidrolisis,

selanjutnya dilakukan proses esterifikasi dan kemudian dilakukan

pemurnian senyawa sehingga didapat senyawa yang murni. Setelah itu

dilakukan uji aktivitas antiinflamasi dengan membandingkan senyawa hasil

modifikasi, dengan senyawa etil p-metoksisinamat, dan natrium diklofenak

sebagai standar.

Uji antiinflamasi dilakukan secara in vitro menggunakan bovine serum

albumin (BSA) dengan melihat efek denaturasi pada BSA. Pengujian ini

dipilih karena mudah, menggunakan sedikit sampel, waktu analisa yang

cepat dan merupakan uji pendahuluan yang dilakukan sebagai skrining awal

aktivitas anti inflamasi.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah senyawa asam p-metoksisinamat dapat dimodifikasi dengan

penambahan gugus nitro dan dapat diesterifikasi?

2. Bagaimana hubungan struktur senyawa esterifikasi hasil nitrasi asam

p-metoksisinamat terhadap aktivitas antiinflamasi?

1.3 Tujuan Penelitian

a. Memodifikasi struktur asam p-metoksisinamat melalui proses nitrasi

dengan asam nitrat dan esterifikasi dengan 1-propanol.

b. Menentukan aktivitas antiinflamasi senyawa yang dihasilkan dari

esterifikasi hasil nitrasi asam p-metoksisinamat

1.4 Manfaat Penelitian

a. Mengetahui apakah ada pengaruh modifikasi dengan penambahan

gugus nitro dan perubahan ester etil menjadi ester propil dengan

aktivitas antiinflamasi yang diharapkan dapat memberikan informasi

4


baru mengenai hubungan struktur aktivitas senyawa etil p-

metoksisinamat sebagai agen antiinflamasi.

b. Hasil dari penelitian ini diharapkan bisa memberikan informasi untuk

proses modifikasi struktur pada senyawa etil p-metoksisinamat dan

hubungan struktur-aktivitas terhadap anti inflamasinya.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Senyawa Etil p-metoksisinamat

Etil p-metoksisinamat atau C12H14O3 termasuk turunan asam sinamat,

dimana asam sinamat adalah turunan senyawa fenil propanoat. EPMS

sebelumnya dimanfaatkan sebagai bahan tabir surya (Windono et al, 1997),

namun dewasa ini telah diteliti lebih lanjut bahwa EPMS merupakan

senyawa isolat kencur yang memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi non-

selektif menghambat COX-1 dan COX-2 secara in vitro (Umar et al., 2012).

Senyawa EPMS berbentuk kristal berwarna putih dengan berat molekul

206.24 g/mol dan memiliki titik lebur 55-56oC (Bangun, 2011). Etil p-

metoksisinamat merupakan senyawa turunan asam sinamat sehingga

biosintesinya termasuk pada jalur sikhimat. (Gambar 1).

Etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan senyawa ester yang

mengandung cincin benzena dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan

juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga

dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai

variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air, dan heksana.

Gambar 2.1 Struktur etil p-metoksisinamat

6


Gambar 2.2. Jalur asam sikhimat dalam biosintesa fenilpropanoid untuk menghasilkan etilp-metoksisinamat (Bangun, 2011).

2.2 Reaksi Hidrolisis

Secara general, hidrolisis didefinisikan sebagai transformasi kimia dimana

molekul organik berupa RX akan bereaksi dengan air menghasilkan sebuah

struktur dengan ikatan kovalen OH seperti dijelaskan pada gambar 2.3.

Hidrolisis adalah contoh dari kelas reaksi terbesar dalam reaksi kimia disebut

sebagai reaksi perpindahan nukleofilik di mana nukleofil menyerang atom

elektrofilik. Proses hidrolitik mencakup beberapa jenis mekanisme reaksi yang

dapat didefinisikan oleh jenis pusat reaksi di mana terjadi hidrolisis.

Mekanisme Reaksi yang paling sering ditemui subtitusi nukleofilik baik secara

7


langsung maupun tidak langsung dan eliminasi-adisi nukleofilik (Larson and

Weber, 1994).

Gambar 2.3 Prinsip reaksi hidrolisis (Larson and Weber, 1994).

Reaksi hidrolisis dapat terjadi dengan katalis basa atau asam. Mekanisme reaksi

hidrolisis sendiri dikelompokkan berdasarkan tipe reaksi dasar seperti subtitusi

nukleofilik, gugus fungsi yang ditransformasikan dengan reaksi substitusi

nukleofilik, substitusi asil nukelofilik, gugus fungsi yang ditransformasikan

dengan reaksi substitusi asil nukleofilik. Hidrolisis untuk turunan asam

karboksilat masuk ke dalam kategori terakhir yakni gugus fungsi yang

ditransformasikan dengan reaksi subtitusi asil nukleofilik. Mekanisme

hidrolisis pada gambar 2.4 diinisiasi oleh protonasi pada karbonil oksigen.

Protonasi menyebabkan keadaan terpolarisasi pada gugus karbonil melepaskan

elektron dari karbon sehingga bersifat lebih elektrofilik dan akan menerima

penambahan nukleofilik dari air (Larson and Weber, 1994).

Gambar 2.4 Mekanisme reaksi hidrolisis pada ester

Hidrolisis ester dengan katalis basa melalui mekanisme penambahan

nukleofilik OH (gambar 2.5) secara langsung kepada gugus karbonil. Hidrolisis

RX + H2O ROH + X- + H+

8


ester berkatalis basa terjadi karena ion OH merupakan nukleofil yang lebih kuat

dibandingkan air (Larson and Weber, 1994).

Gambar 2.5 Mekanisme reaksi hidrolisis ester dengan katalis basa (Larson and Weber,1994).

2.3 Reaksi Nitrasi

Nitrasi merupakan reaksi subtitiusi atom H pada benzene oleh gugus nitro.

Reaksi ini terjadi dengan mereaksikan benzene dengan asam nitrat (HNO3)

pekat dengan bantuan H2SO4 sebagai katalis. Reaksi yang terjadi adalah

sebagai berikut :

Gambar 2.6 Mekanisme reaksi nitrasi dengan HNO3 dan H2SO4 pada senyawa aromatik

Nitrasi dari benzen awalnya dipengaruhi oleh pembentukan elektrofilik kuat

yaitu ion nitronium, yang mana terjadi karena interaksi antara 2 asam kuat

yaitu asam sulfat dan asam nitrat. Asam sulfat lebih kuat dan dapat

9


memprotonasi asam nitrat pada gugus OH sehingga molekul dari air dapat

berpisah. Selanjutnya benzen menyerang muatan positif atom nitrogen dari

elektrofil, yang mana ikatan N=O lepas pada waktu yang sama. Hal ini

diikuti dengan lepasnya proton untuk menstabilkan gugus aromatis (lynnb,

2012).

Reaksi nitrasi berlangsung dengan penggantian satu atau lebih gugus nitro (-

NO2) menjadi molekul yang reaktif. Gugus nitro akan menyerang karbon

membentuk nitro aromatik atau nitro parafin . Jika menyerang nitrogen

membentuk nitramin dan bila menyerang oksigen membentuk nitrat ester.

Pada proses nitrasi masuknya gugus (-NO2) ke dalam senyawa dapat terjadi

dengan menggantikan kedudukan beberapa atom atau gugus yang ada dalam

senyawa. Umumnya nitrasi yang banya dijumpai adalah nitrasi –NO2

menggantikan atom H (Yogo Tri Yulianto, 2010).

Nitrating agent merupakan reaktan elektrofilik, dimana reaksi akan terjadi

pada ataom karbon dari cincin aromatik yang mempunyai kepadatan

elektron terbesar. Gugus NO2 yang masuk dapat membentuk posisi ortho,

para, dan meta. Jumlah isomer pada produk tergantung pada subtituen ini.

Subtituen meta menyebabkan kepadatan elektron menjadi lebih besar

dibandingkan subtituen ortho dan para, sehingga yield produk nitrasi akan

didominasi isomer meta (Yogo, Tri Yulianto, 2010)

Nitrasi senyawa aromatik merupakan reaksi fundamental dari kepentingan

industri besar dan juga senyawa nitro aromatik merupakan kunci dari

intermediet organik. Campuran reaksi dari asam nitrat dan asam sulfat

digunakan sebagai reagen reaksi nitrasi yang paling umum untuk nitrasi

benzen, alkil benzen dan senyawa aromatik yang sedikit reaktif, tetapi

senyawa aromatik yang sangat reaktif seperti fenol dan anilin sangatlah

mudah untuk teroksidasi (M. Hosseini sarvari et al., 2010)

2.4 Reaksi Esterifikasi

Suatu ester asam karboksilat ialah suatu senyawa yang mengandung gugus

–CO2R dengan R dapat berbentuk alkil maupun aril. Suatu ester dapat

10


dibentuk dengan reaksi antara suatu asam karboksilat dan suatu alkohol,

dengan suatu reaksi yang disebut reaksi esterifikasi (Fessenden &

Fessenden, 1999).

Reaksi esterifikasi bersifat reversible, untuk memperoleh rendemen tinggi

dari ester itu, kesetimbangan harus digeser ke arah ester. Satu teknik untuk

mencapainya adalah dengan menggunakan salah satu zat pereaksi yang

murah yang berlebihan. Teknik lain adalah membuang salah satu produk

dari dalam campuran reaksi (Fessenden & Fessenden, 1999).

Beberapa macam metode esterifikasi antara lain :

a. Cara Fischer

Jika asam karboksilat dan alkohol dan katalis asam (biasanya HCl

atau H2SO4) dipanaskan, terdapat kesetimbangan dengan ester dan

air.

b. Esterifikasi dengan asil halide

Asil halida adalah turunan asam karboksilat yang paling reaktif. Asil

klorida lebih murah dibandingkan dengan asil halida lain. Asil halide

biasanya dibuat dari asam dengan tionil klorida atau fosfor

pentaklorida. (Dinarno, 2009)

c. Esterifikasi antara asam karboksilat dengan conjugated diene

Esterifikasi dengan menggunakan asam karboksilat dan conjugated

diene yang tidak disertai oksigen yang disertai katalis asam saat ini

juga telah banyak dikembangkan. Hal ini dikarenakan conjugated

diene merupakan salah satu bahan yang mudah didapat dan harga

yang relative yang lebih murah. Conjugated diene yang sering

digunakan yaitu 1,3-butadiene, 2-methyl-1,3-butadiene, 2-chloro-

1,3butadiene, 1,3-hexadiene, 2,4-cyclohexadiene dan lainnya.

Produk hasil esterifikasi antara asam karboksilat dengan conjugated

diene yang banyak dijumpai adalah n-butyl asetat, 2-methyl-2-

butenyl butanoate, cyclohexene-3-ylbenzoate dan lainnya (Paul et al,

1977)

11


2.5 Spesifikasi 1-propanol, Asam Nitrat, dan Asam Sulfat.

2.5.1 1-Propanol

1-propanol merupakan cairan tidak berwarna bening dengan bau seperti

etanol. Merupakan produk sampingan dari sintesis metil alkohol dengan

tekanan tinggi dan dalam proses oksidasi propana/butana. Memiliki

rumus kimia C3H8O dengan berat molekul 60,09502 g/mol dan massa

jenis 0,8053 g/ml (20oC),. Titik leleh 1-propanol sebesar -127 oC dan

titk didihnya sebesar 97,2 oC. 1-propanol larut dalam air, propilen glikol

dan larut >10% dala aseton, benzene, eter, dan etanol.

2.5.2 Asam Nitrat

Asam nitrat adalah suatu asam monobasa yang kuat, yang mudah

bereaksi dengan alkali, oksida dan senyawa basa dalam bentuk garam.

Asam nitrat merupakan senyawa yang berperan dalam proses nitrasi,

yaitu sebagai nitrating agent. Memiliki rumus kimia HNO3 dengan

berat molekul 63,012 g/mol dan massa jenis -41,59 g/ml sedangkan titik

didih asam nitrat 83,4 oC. Asam nitrat larut dalam air baik dingin

maupun panas. (Kirk Othmer, 1996., Yogo Tri Yulianto, 2010)

2.5.3 Asam Sulfat

Merupakan cairan tidak berwarna, bening, tidak berbau. Asam sulfat

diperoleh dengan cara mereaksikan gas sulfur dioksida dan oksigen

melalui katalis untuk mengoksidasi sulfur dioksida menjadi sulfur

trioksida. Kemudian, sulfur trioksida akan membentuk asam sulfat

dengan penambahan air. Memiliki rumus kimia H2SO4 dengan berat

molekul 98,078g/mol dan massa jenis 1,84g/ml sedangkan titik didih

asam sulfat 340oC dan titik lelehnya 10,49. Asam sulfat larut dalam air

baik dingin maupun panas. (Perry, 1999., Yogo Tri Yulianto, 2010)

12


2.6 Kromatografi

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut

oleh suatu proses migrasi deferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari

dua fase atau lebih, salah satu di antaranya bergerak secara

berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu

menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam

adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan

muatan ion. Deangan demikian, masing-masing zat dapat diidentifikasi atau

ditetapkan dengan metode analitik (Departemen Kesehatan, 1995).

Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi

diantara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak

(fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga

terpisah dari zat terlarut lainnya, yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir.

Umumnya zat terlarut dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu

pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam dapat

bertindak sebagai zat penjerap, seperti halnya penjerap alumina yang

diaktifkan, silika gel, dan resin penukar ion, atau dapat bertindak melarutkan

zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam

proses terakhir ini suatu lapisan cairan pada suatu penyangga yang inert

berfungsi sebagai fase diam (Departemen Kesehatan,1995).

Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisis kualitatif dan

kuantitatif yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian

Farmakope Indonesia adalah Kromatografi Kolom, Kromatografi Gas,

Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis, dan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi. Kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis umumnya

lebih bermanfaat untuk tujuan identifikasi, karena mudah dan sederhana.

Kromatografi kolom memberikan pilihan fase diam yang lebih luas dan

berguna untuk pemisahan masing-masing senyawa secara kuantitatif dari

suatu campuran (Departemen Kesehatan,1995).

13


2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia.

Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir-butir (fase

diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, atau lapisan

yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan ditotolkan

berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh di

dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok

(fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler

(pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus

ditampakkan (dideteksi) (Stahl Egon dalam Khoirunni’mah, 2013).

Diantara berbagai jenis teknik kromatografi, kromatografi lapis

tipis adalah yang paling banyak digunakan untuk analisis obat di

laboratorium farmasi. Metode ini hanya memerlukan investasi kecil

untuk perlengkapan dan menggunakan waktu yang singkat untuk

menyelesaikan analisis (15-60 menit), memerlukan jumlah cuplikan

yang sangat sedikit (kira-kira 0,1 g). Selain itu, hasil palsu yang

disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin terjadi, kebutuhan

ruangan minimum, dan penanganannya sederhana (Stahl Egon dalam

Khoirunni’mah, 2013).

Ditotolkan Larutan uji dan Larutan baku, menurut cara yang

tertera pada masing-masing monografi dengan jarak antara lebih kurang

1,5 cm dan lebih kurang 2 cm dari tepi bawah lempeng, dan dibiarkan

mengering (tepi bawah lempeng adalah bagian lempeng yang pertama

kali dilalui oleh alat membuat lapisan pada waktu melapiskan zat

penjerap). Ketika bekerja dengan lempeng, gangguan fisik harus

terhindarkan dari zat penjerap (Departemen kesehatan, 1995).

Diberikan tanda pada jarak 10 cm hingga 15 cm di atas titik

penotolan. Lempeng diempatkan pada rak penyangga, hingga tempat

penotolan terletak di sebelah bawah,dan dimasukkan rak ke dalam

bejana kromatografi. Pelarut dalam bejana harus mencapai tepi bawah

lapisan penjerap, tetapi titik penotolan jangan sampai terendam. Bejana

diletakkan tertutup pada tempatnya, dan sistem dibiarkan hingga pelarut

14


merambat 10 cm hingga 15 cm di atas titik penotolan, umumnya

diperlukan waktu lebih kurang 15 menit hingga 1 jam. Lempeng

dikeluarkan dari bejana ,dibuat tanda batas rambat pelarut, dikeringkan

lempeng di udara,dan diamati bercak mula- mula dengan cahaya

ultraviolet gelombang pendek (254 nm) dan kemudian dengan cahaya

ultraviolet gelombang panjang (366 nm). Diukur dan dicatat jarak tiap

bercak dari titik penotolan serta catat panjang gelombang untuk tiap

bercak yang diamati. Harga Rf ditentukan untuk bercak utama. Jika

diperlukan, bercak disemprot dengan pereaksi yang ditentukan, diamati

dan kromatogram zat uji dibandingkan dengan kromatogram baku

pembanding (Departemen kesehatan, 1995).

Jarak pengembangan senyawa kromatogram dinyatakan dengan

angka Rf atau hRf. Angka Rf berjarak antara 0,00 dan 1,00 dan hanya

dapat ditentukan dua desimal. hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100

(h), menghasilkan nilai berjangka 0 sampai 100 Jika dipilih 10 cm

sebagai jarak pengembangan, maka jarak rambat suatu senyawa (titik

awal-pusat bercak dalam cm) x 10 menghasilkan angka hRf Tetapi,

karena angka Rf merupakan fungsi sejumlah faktor, angka ini harus

dianggap sebagai petunjuk saja. Inilah yang menjadi alasan mengapa

angka hRf lah, misalnya hRf 60-70, yang dicantumkan untuk

menunjukan letak suatu senyawa pada kromatogram. (Stahl Egon,

1985)

Rf =

Jika keadaan luar, misalnya kelembaban atmosfer yang tidak

cukup atau penjerap yang sifatnya agak menyimpang, menghasilkan

kromatogram yang secara umum menunjukan angka Rf dari berbagai

komponen lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus

diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi daripada

hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi; jika angka hRf

lebih rendah, komponen polar pelarut harus dinaikkan. Ini dapat

dilakukan dengan cara sederhana, misalnya pada pengaturan sistem

benzena-kloroform atau kloroform-metanol. (Stahl Egon, 1985)

15


Gambar 2.7 Skema kromatografi lapis tipis

2.6.2 Kromatografi Kolom

Alat-alat yang diperlukan untuk kromatografi kolom sangat

sederhana, terdiri dari tabung kromatografi dan sebuah batang

pemampat yang diperlukan untuk memadatkan wol kaca atau kapas

pada dasar tabung jika diperlukan, serta untuk memadatkan zat penjerap

atau campuran zat penjerap dan air secara merata di dalam tabung.

Kadang-kadang digunakan cakram kaca berpori yang melekat pada

dasar tabung untuk menyangga isinya. Tabung berbentuk silinder dan

terbuat dari kaca, kecuali bila dalam monografi, disebutkan terbuat dari

bahan lain. Sebuah tabung mengalir dengan diameter yang lebih kecil

untuk mengeluarkan cairan yang menyatu dengan tabung atau

disambung melalui suatu sambungan anti bocor pada ujung bawah

tabung utama (Departemen kesehatan, 1995).

Ukuran kolom bervariasi; kolom yang umum digunakan dalam

analisis farmasi mempunyai diameter dalam antara 150 mm hingga 400

mm, tidak termasuk tabung pengalir. Tabung pengalir, umumnya

berdiameter dalam antara 3 mm hingga 6 mm,dapat dilengkapi dengan

sebuah kran untuk mengatur laju aliran pelarut yang melalui kolom

dengan teliti. Batang pemampat merupakan suatu batang silinder,

melekat kuat pada sebuah tangkai yang terbuat dari plastik, kaca, baja

tahan karat, atau aluminium, kecuali bila dinyatakan lain dalam

16


monografi. Tangkai batang pemampat biasanya mempunyai diameter

yang lebih kecil dari kolom dan panjang minimal 5 cm melebihi

panjang efektif kolom, batang mempunyai diameter lebih kurang 1 mm

lebih kecil dari diameter dalam kolom (Departemen kesehatan, 1995).

Zat penjerap atau fase diam (bisa berupa aluminium oksida yang

telah diaktifkan, silika gel, tanah diatome terkalsinasi, atau tanah silika

yang dimurnikan untuk kromatografi) dalam keadaan kering atau dalam

campuran dengan air, dimampatkan ke dalam tabung kromatografi kaca

atau kuarsa. Zat uji yang dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut,

dituangkan ke dalam kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam zat

penjerap. Zat berkhasiat diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh

bahan penjerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom. Dengan

penambahan pelarut lebih lanjut melalui kolom, oleh gaya gravitasi atau

dengan memberikan tekanan, masing-masing zat bergerak turun dalam

kolom dengan kecepatan tertentu, sehingga terjadi pemisahan dan

diperoleh kromatogram (Departemen Kesehatan,1995).

2.7 Spektrofotometri

Spektrofotometri merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi

elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang

sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri serapan

ultraviolet, cahaya tampak, inframerah dan serapan atom (Departemen

Kesehatan,1995).

2.7.1 Spektrofotometri IR

Spektrofotometri Infra Merah merupakan alat untuk merekam

spektrum di daerah inframerah yang terdiri dari suatu sistem optik

dengan kemampuan menghasilkan cahaya monokromatik di daerah

4000 cm-1 hingga 625 cm-1 (lebih kurang 2,5 πm hingga 16 πm) dan

suatu metode untuk mengukur perbandingan intensitas perbandingan

cahaya yang ditransmisikan cahaya datang. Spektrum IR digunakan

untuk mengidentifikasi gugus fungsi (Departemen Kesehatan, 1995).

Hampir semua senyawa yang memiliki ikatan kovalen, baik

organik maupun anorganik, menyerap berbagai frekuensi radiasi

17


elektromagnetik di wilayah inframerah dari spektrum elektromagnetik.

Wilayah ini terletak pada panjang gelombang yang berkisar dari sekitar

400 sampai 800 nm (Pavia et al. 2008).

2.7.2 Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri serap merupakan pengukuran interaksi antara

radiasi elektromagnetik panjang gelombang tertentu yang sempit dan

mendekati monokromatik, dengan molekul atau atom dari suatu zat

kimia. Hal ini didasarkan pada kenyataan bahwa molekul selalu

mengabsorbsi cahaya elektromagnetik jika frekuensi cahaya tersebut

sama dengan frekuensi getaran dari molekul tersebut. Elektron yang

terikat dan elektron yang tidak terikat akan tereksitasi pada suatu daerah

frekuensi yang sesuai dengan cahaya ultraviolet dan cahaya tammpak

(UV-Vis) (Roth et al., 1994).

Spektrum absorbsi daerah ini adalah sekitar 220 nm sampai 880

nm dan dinyatakan sebagai spektrum elektron. Suatu spektrum

ultraviolet meliputi daerah bagian ultraviolet (190-380 nm), spektrum

Vis (Visible) bagian sinar tampak (380-780 nm).

Pengukuran dengan alat spektrofotometer UV-Vis didasarkan

pada hubungan antara berkas radiasi elektromagnetik yang

ditransmisikan (diteruskan) atau yang diabsorbsi dengan tebalnya

cuplikan dengan konsentrasi dari komponen penyerap. Hubungan

tersebut dinyatakan dalam Hukum Lambert-Beer (Sastroamidjojo,

1985) :

Keterangan :

(a) Daya Serap

(b) Tebal Kuvet

(c) Konsentrasi larutan

(A) Serapan

A = a . b . c

18


Instrumentasi dari spektrofotometer UV-Vis ini dapat diuraikan

sebagai berikut :

1. Suatu sumber energi cahaya yang berkesinambungan yang

meliputi daerah spektrum yang mana alat tersebut dirancang

untuk beroperasi.

2. Suatu monokromator, yakni sebuah piranti untuk memencilkan

pita sempit panjang gelombang dari spektrum lebar yang

dipancarkan oleh sumber cahaya.

3. Suatu wadah untuk sampel (dalam hal ini digunakan kuvet).

4. Suatu detektor, yang berupa transduser yang merubah energi

cahaya menjadi suatu isyarat listrik.

5. Suatu amplifier (pengganda) dan rangkaian yang merubah energi

cahaya menjadi suatu isyarat listrk.

6. Suatu sistem baca dimana diperagakan besarnya isyarat listrik

yang ditangkap.

2.7.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik

Resonansi magnetik nuklir (NMR) adalah metode spektroskopi

yang bahkan lebih penting bagi ahli kimia organik dari spektroskopi

inframerah. Banyak inti dapat dipelajari dengan teknik NMR, tapi

hidrogen dan karbon yang paling umum tersedia. Jika spektroskopi

inframerah (IR) digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi, NMR

memberikan informasi mengenai jumlah atom magnetis yang berbeda

dari jenis yang dipelajari.

NMR dapat menentukan jumlah masing-masing jenis yang

berbeda dari inti hidrogen serta memperoleh informasi mengenai sifat

dasar dari lingkungan terdekat dari masing-masing jenis. Informasi

yang sama dapat ditentukan untuk inti karbon. Kombinasi IR dan data

NMR seringkali cukup untuk menentukan secara benar struktur

molekul yang tidak diketahui (Pavia et al., 2008).

19


Instrumen NMR terdiri atas komponen-komponen sebagai berikut

(Willard et al., 1988) :

1. Magnet untuk memisahkan energi spin nuklir.

2. Paling tidak terdapat dua saluran frekuensi radio, satu untuk

stabilisasi medan/frekuensi dan satu untuk memberikan frekuensi

radio untuk energi penyinaran. Yang ketiga dapat digunakan untuk

masing-masing inti yang akan dipisahkan.

3. Probe sampel yang mengandung kumparan untuk kopling sampel

dengan bidang frekuensi radio.

4. Detektor untuk memproses sinyal NMR.

5. Generator (Sweep Generator) untuk menyapu bersih baik medan

magnet maupun frekuensi radio melalui frekuensi resonansi

sampel.

6. Rekorder untuk menampillkan spektrum

2.8 Uji Antiinflamasi

Inflamasi merupakan respon imun tubuh yang secara umum terjadi karena

adanya stimulus. Hal itu bisa dikarenakan oleh bakteri, misalnya kontaminasi

bakteri pada luka. Inflamasi juga dapat terjadi ketika sistem kekebalan tubuh

berjuang melawan sesuatu dan terkadang memunculkan efek berbahaya

(IQWiQ, 2010).

Beberapa metode in vitro dapat digunakan dalam mengetahui potensi atau

aktivitas antiinflamasi dari suatu obat, kandungan kimia dan preparat herbal.

Teknik-teknik yang bisa digunakan antara lain adalah pelepasan fosforilasi

oksidatif (ATP biogenesis terkait dengan respirasi), penghambatan denaturasi

protein, stabilisasi membran eritrosit, stabilisasi membran lisosomal, tes

fibrinolitik dan agregasi trombosit (Oyedapo et al., 2010). Selain itu uji

antiinflamasi secara in vitro juga bisa dilakukan dengan melihat efek inhibisi

pada siklooksigenase menggunakan kit khusus uji skrining siklooksigenase

(Umar et al., 2012).

20


Dalam pengembangan AINS, prinsip denaturasi dalam uji antiinflamasi

sering digunakan seperti pada uji antiinflamasi dengan albumin telur (Chandra,

2012) dan uji dengan bovine serum albumin (BSA) (Williams et al., 2008).

Denaturasi protein pada jaringan adalah salah satu penyebab penyakit inflamasi

dan artritis. Produksi dari antigen-auto pada penyakit artritis dapat

mengakibatkan denaturasi protein secara in vivo. Oleh karena itu, penggunaan

suatu agen tertentu yang bisa mencegah denaturasi protein akan bermanfaat

pada pengembangan obat antiinflamasi (Chatterjee et al., 2012).

Indometasin, ibufenak, asam flufenamik dan asam salisilat memiliki

kemampuan dalam mencegah denaturasi BSA yang dipanaskan pada pH

patologis yakni 6,2-6,5. Pada uji BSA, jika senyawa sampel menghambat

denaturasi dengan persen inhibisi >20% maka dianggap memiliki aktivitas

antiinflamasi dan layak untuk dikembangkan lebih lanjut. (Williams et al.,

2008).


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan

Fitokimia, Laboratorium Penelitian I, Laboratorium Penelitian II dan

Laboratorium Kimia Obat Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan.

3.1.2 Waktu

Penelitian ini dimulai pada bulan Februari 2015 sampai bulan Juni

2015.

Alat Dan Bahan

3.2.1 Alat

Spektrofotometri ¹H-NMR dan 13C-NMR (500 MHz, JEOL),

spektrofotometer UV-Vis (HITACHI), vacuum rotary evaporator

(SB-1000 Eyela), digital water bath (SB-100 Eyela), GCMS (Agilent

Technologies), microwave oven ( SAMSUNG, 250 watt, 50 Hz),

spektrofotometri IR, lemari pendingin, Plat aluminium TLC silica gel

60 F254 (Merck), oven, timbangan analitik, penangas, statif, alat-alat

gelas, termometer, mikropipet, batang pengaduk, pinset, pengaduk

magnetik, kertas saring, kapas, alumunium foil, vial uji, botol, pH

indikator.

3.2.2 Bahan

Senyawa etil p-metoksisinamat yang merupakan hasil isolasi dari

kencur (Kaempferia galanga L.), 1-propanol (Merck), Asam nitrat

65%, Asam sulfat pekat, natrium diklofenak (Sigma-Aldrich), natrium

sulfat (Merck), natrium hidroksida (Merck), asam klorida 15%, silika

gel 60 (Merck), dan Bovine Serum Albumin (Sigma-Aldrich). Pelarut

dan bahan pembantu lain : aquades, etil asetat, n-heksan, etanol 95%

dan TBS (Sigma-Aldrich).

22


3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Modifikasi Asam p-metoksisinamat

a. Hidrolisis EPMS

Sebanyak 1,5 gram (0,0375 mol) NaOH dilarutkan dengan

etanol pro analisis dalam gelas kimia, kemudian dipanaskan diatas

hot plate sambil diaduk menggunakan magnetic stirer hingga larut.

Setelah itu ditambahkan senyawa Etil p-metoksisinamat sebanyak

5 gram (0,024mol) ke dalamnya, pemanasan dijaga pada suhu 55˚С

sampai 60˚C. Hasil reaksi ditambahkan aquades dan HCl 15%,

kemudian difiltrasi, filtrat yang didapat ditambahkan kembali HCl

15%. Apabila masih terdapat endapan putih, filtrat kemudian

disaring. Prosedur ini dilakukan berulang kali hingga tidak ada lagi

endapan putih yang terbentuk. Residu yang dihasilkan merupakan

senyawa hasil hidrolisis, kemudian dikeringkan (Mufidah, 2014)

b. Nitrasi

Sebanyak 2,5 gram APMS (0,014 mol) dalam erlenmeyer

ditambahkan dengan 10 ml asam nitrat 65% (0,22 mol) bersuhu -

15oC kemudian diiradiasi microwave 450 W selama 2 menit yang

sebelumnya diletakkan di dalam beaker glass yang berisi es.

Setelah itu ditambahkan dengan akuades lalu disaring, setelah itu

diambil residunya yang berwarna kuning (Bose et al, 2006)

c. Esterifikasi

Sebanyak 500 mg hasil nitrasi APMS ditambahkan dengan 1-

propanol 50 ml aduk menggunakan pengaduk magnetik dan larutan

dipanaskan hingga larut. Kemudian larutan tersebut ditambahkan

dengan 0,2 ml asam sulfat pekat, dimasukan kedalam beaker glass

yang berisi air dan diiradiasi dengan microwave dengan daya 300

W selama 30 menit. Kemudian hasil iradiasi tersebut dipartisi

menggunakan pelarut heksan dan air, diambil fraksi heksannya

(bagian atas), lalu di uapkan hingga pekat. Lalu, hasil yang pekat

23


tersebut ditambahkan dengan heksan hingga menjadi padat. Setelah

itu dilakukan pemurnian dengan menggunakan kolom kromatografi

dengan pelarut heksan dan etil. (Guang Li, 2009)

3.3.2 Pemisahan dengan Kromatografi Kolom (Fraksinasi)

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah menggunakan

kromatografi kolom yang mengacu pada metode yang digunakan

Waters (1985). Silika gel 60 digunakan sebagai fase diam. Sedangkan

fase gerak yang digunakan menggunakan sistem fase gerak dengan

polaritas bertingkat. Masing-masing fraksi yang telah dipisahkan,

dimonitor profilnya melalui KLT menggunakan plat TLC Silica gel 60

F254 (E-merck) dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-

heksana:etil asetat (Hidayati, 2012).

3.4 Identifikasi Senyawa

a. Identifikasi Organoleptis

Senyawa yang didapat baik senyawa murni etil p-metoksisinamat

maupun senyawa hasil modifikasi kemudian diidentifikasi warna,

bentuk dan juga bau.

b. Identifikasi senyawa menggunakan FTIR

Sedikit sampel padat (kira-kira 1 - 2 mg), kemudian ditambahkan

bubuk KBr murni (kira-kira 200 mg) dan diaduk hingga rata. Kemudian

sampel (pelet KBr yang terbentuk) diambil dan kemudian ditempatkan

dalam tempat sampel pada alat spektroskopi inframerah untuk dianalisis

(Hidayati, 2012).

c. Identifikasi Senyawa Menggunakan GCMS

Kolom yang digunakan adalah HP-5MS (30 m × 0,25 mm ID ×

0,25 µm); suhu awal 70oC selama 2 menit, dinaikkan ke suhu 285oC

dengan kecepatan 20oC/min selama 20 menit. Suhu MSD 285oC.

Kecepatan aliran 1,2 mL/min dengan split 1:100. Parameter scanning

dilakukan dari massa paling rendah yakni 35 sampai paling tinggi 550

(Umar et al, 2012).

24


d. Identifikasi senyawa menggunakan 1H-NMR dan 13C-NMR

Sedikit sampel padat (kira-kira 10 mg), kemudian dilarutkan

dalam pelarut kloroform bebas proton (khusus NMR), setelah

dilarutkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung khusus NMR untuk

kemudian dianalisis.

3.5 Uji In vitro Antiinflamasi (Williams et al., 2008)

3.5.1 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi

a. Larutan TBS (Tris Buffer Saline) pH 6.5

Sebanyak 1,21 g Tris base dan 8,7 g NaCl dilarutkan dalam

1000 mL aquades. Kemudian adjust pH sampai 6,3 menggunakan

asam asetat glasial (Mohan, 2003) .

b. Penyiapan variat konsentrasi Na Diklofenak

Pembuatan larutan induk sebesar 10000 ppm Na diklofenak

dengan pelarut metanol. Kemudian dilakukan pengenceran menjadi

1000, 100, 10, dan 1 ppm.

c. Penyiapan variat konsentrasi EPMS dan senyawa propil 4-metoksi

6-nitrosinamat (sampel).

Pembuatan larutan induk sebesar 10000 ppm baik senyawa

EPMS maupun senyawa propil 4-metoksi 6-nitrosinamat dengan

pelarut metanol. Kemudian dilakukan pengenceran menjadi 1000,

100, 10 dan 1 ppm.

d. Pembuatan BSA 0,2 % (w/v)

Sebanyak 0.2 g BSA dilarutkan dalam TBS 100 mL

(Williams et al., 2008).

3.5.2 Pengujian Aktivitas Senyawa Hasil Modifikasi Terhadap

Denaturasi BSA :

a. Pembuatan Larutan Uji (EPMS dan propil 4-metoksi 6-

nitrosinamat)

Larutan Uji (5 mL) terdiri dari 50 µL larutan sampel yang

kemudian ditambah dengan BSA hingga volume 5 mL sehingga

25


didapatkan variat konsentrasi menjadi 100, 10, 1, dan 0.1 ppm.

b. Pembuatan Larutan Kontrol Positif

Larutan kontrol positif (5 mL) terdiri dari 50 µL larutan

natrium diklofenak yang kemudian ditambah dengan BSA hingga

volume 5 mL sehingga didapatkan variat konsentrasi menjadi 100,

10, 1, dan 0.1 ppm.

c. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif.

Larutan kontrol negatif (5 mL) terdiri dari 50 µL methanol

yang kemudian ditambah dengan BSA hingga volume 5 mL.

Setiap larutan di atas dipanaskan selama 5 menit pada suhu 73˚C.

Lalu didinginkan dan diukur turbiditasnya dengan spektrofotometer

pada panjang gelombang 660 nm.

Persentase inhibisi dari denaturasi atau presipitasi BSA

dikalkulasikan dengan rumus berikut

% inhbisi = 100


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Modifikasi Struktur Senyawa etil p-metoksisinamat

Telah banyak dilaporkan bahwa AINS mempunyai efek samping yang

merugikan pada lambung. Oleh karena itu dilakukan modifikasi untuk

mengurangi efek merugikan dari AINS. Penambahan gugus NO pada

struktur etil p-metoksisinamat dapat mengurangi iritasi lambung akibat

AINS dengan cara mempertahankan aliran darah mukosa lambung dan

mencegah melekatnya leukosit ke endotelium vaskuler pada sirkulasi

splanknikus (merupakan salah satu peristiwa paling awal setelah pemberian

AINS) yang dapat meniadakan gangguan penekanan COX-1 sehingga

kerusakan mukosa tidak terjadi. (Halen et al, 2009).

Perubahan asam karboksilat menjadi bentuk esternya pada AINS juga

dapat mengurangi efek iritasi lambung karena senyawa AINS dalam bentuk

ester akan dengan mudah mengalami hidrolisis enzimatik oleh adanya

enzim esterase yang berlimpah di dalam usus halus; karenanya mukosa

lambung tidak akan terkena gugus karboksilat bebas yang menyebabkan

iritasi lambung. Pada penelitian modifikasi flurbiprofen dengan cara

esterifikasi menggunakan beberapa pereaksi seperti etanol, metanol, n-

propanol, dan sebagainya. Hasilnya dapat dismpulkan bahwa ester propil

flubiprofen \dapat mengurangi gastrotoksisitas lebih baik bila dibandingkan

dengan bentuk ester etil flurbiprofen. (Mohan, et al., 2007)

Etil p-metoksisinamat (EPMS) memiliki aktivitas antiinflamasi dengan

mekanisme kerja non selektif menghambat COX-1 atau COX-2 (Umar et al,

2012). Berdasarkan hal tersebut, dalam rangka untuk meningkatkan

aktivitas antiinflamasi maka perlu penambahan gugus NO pada gugus

aromatis EPMS dan penggantian gugus etil dengan propil pada gugus

esternya sebagai upaya untuk meningkatkan efikasi aktivitas antiinflamasi.

Pada uji pendahuluan, reaksi nitrasi langsung dilakukan pada senyawa

EPMS. Didapat beberapa senyawa EPMS ternitrasi yang memiliki

27


kepolaran yang sama sehingga sulit untuk dipisahkan menggunakan

kromatografi kolom. Oleh karena itu perlu dilakukan metode lain yaitu

dengan cara menghidrolisis terlebih dahulu EPMS menjadi Asam p-

metoksisinamat (APMS), lalu dilakukan proses nitrasi APMS, kemudian

diubah lagi menjadi bentuk esternya namun dalam bentuk ester propil

menggunakan 1-propanol.

4.1.1 Reaksi Hidrolisis etil p-metoksisinamat

Pada reaksi ini, NaOH sebagai katalis ditimbang sebanyak 1,5 gram

(0,0375 mol) dan dilarutkan dalam etanol p.a sebanyak 125 ml

kemudian diaduk menggunakan pengaduk magnetik dan dipanaskan

untuk mempercepat pelarutan. Setelah larut , kemudian sebanyak 5

gram EPMS (0,024 mol) ditambahkan ke dalam larutan dan dipanaskan

dengan suhu 600C selama 5 jam. Selama reaksi, dilakukan monitoring

suhu karena reaksi hidrolisis EPMS berlangsung pada suhu 60-700C

dan reaksi sampai mendapatkan spot yang menandakan bahwa telah

terjadi perubahan dari EPMS menajdi APMS yang dapat dilihat pada

gambar 4.2. Setelah proses reaksi telah selelsai dilakukan, dicuci

menggunakan akuades. Kemudian ditambahkan HCl 15% hingga pH 4,

hal ini bertujuan untuk mengikat Na+ dan membentuk garam yang larut

air sedangkan residu yang didapat merupakan hasil hidrolisis APMS.

Mekanisme reaksi hidrolisis etil p-metoksisinamat dapat dilihat pada

gambar 4.1.

28


Gambar 4.1 Mekanisme hidrolisis EPMS menjadi APMS

Persen rendemen dari hasil reaksi hidrolisis etil p-metoksisinamat yaitu

:% rendemen :, × 100% = 85,74 %

Gambar 4.2 KLT senyawa asam p-metoksisinamat demgan eluen heksan : etil (4: 1)

4.1.2 Reaksi Nitrasi APMS (Asam p-metoksisinamat)

Nitrasi merupakan reaksi subtitusi atom H pada benzene oleh gugus

nitro. Reaksi ini dilakukan dengan menggunakan asam nitrat sebagai

agen penitrasi dan asam sulfat sebagai agen pengkatalis. Tujuan dari

reaksi ini yaitu untuk mengganti gugus H pada benzene menjadi gugus

nitro. Sehingga terjadi penambahan gugus nitro pada benzene pada

senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat.

Asam p-metoksisinamat

Etil p-metoksisinamat

29


Untuk mempercepat proses nitrasi EPMS, digunakan teknik cold

microwave. Cold microwave merupakan teknik dimana reaksi

dipercepat menggunakan iradiasi microwave tetapi sebelumnya reagen

yang akan digunakan didinginkan hingga suhu -300C. Keuntungan

teknik ini yaitu waktu reaksi yang sangat cepat dibandingkan dengan

pemanasan secara tradisional. Dengan teknik ini, reaksi yang memakan

waktu berjam-jam dapat dipercepat hanya dalam hitungan menit. Pada

reaksi ini, asam nitrat harus didinginkan terlebih dahulu sebelum

direaksikan (Bose,2006).

Gambar 4.3 Mekanisme nitrasi APMS

Pada reaksi nitrasi ini, sebanyak 2,5 gram senyawa APMS (0,014 mol)

ditambahkan dengan asam nitrat 65% (0,22 mol) bersuhu -150C dalam

labu erlenmeyer kemudian diletakkan kedalam beaker glass yang berisi

dengan es dan diiradiasi dengan microwave 450 watt selama 2 menit.

Setelah reaksi selesai dilakukan, hasil reaksi tersebut ditambahkan

akuades kemudian disaring dan diambil residunya. Residu yang didapat

merupakan senyawa padat berwarna kuning sebanyak 2,066 gram.

Hasil reaksi kemudian dilihat menggunakan KLT yang dapat dilihat

pada gambar 4.4

30


Gambar 4.4 KLT senyawa hasil nitrasi asam p-metoksisinamat dengan eluen heksan :etil (3:2)

4.1.3 Reaksi Esterifikasi Senyawa Hasil Nitrasi APMS (Asam p-

metoksisinamat)

Suatu ester asam karboksilat ialah suatu senyawa yang mengandung

gugus –CO2R dengan R dapat berbentuk alkil maupun aril. Suatu ester

dapat dibentuk dengan reaksi antara suatu asam karboksilat dan suatu

alkohol, dengan suatu reaksi yang disebut reaksi esterifikasi (Fessenden

& Fessenden, 1999).

Gambar 4.5 Mekanisme Esterifikasi Hasil Nitrasi APMS

Pada reaksi ini, dilakukan dengan melarutkan 500 mg senyawa hasil

nitrasi APMS dengan 1-propanol sebanyak 50 ml dalam labu

erlenmeyer. Kemudian aduk menggunakan pengaduk magnetik dan

dipanaskan hinggal larut sempurna. Setelah itu, ditambahkan katalis

Asam sulfat pekat (0,2 ml, 4 mmol) dan diradiasi menggunakan

microwave dengan daya 300 watt selama 30 menit yang sebelumnya

senyawa dimasukkan kedalam beaker glass yang berisi air. Setelah

reaksi selesai, senyawa hasil reaksi dipartisi menggunakan heksan dan

31


akuades untuk memisahkan senyawa hasil reaksi dan asam yang tersisa.

Kemudain diiambil fraksi heksannya dan hasil yang didapat dipisahkan

menggunakan kromatografi kolom yang dimulai dengan menggunakan

pelarut heksan 100% kemudian dilanjutkan menggunakan heksan : etil

asetat (90 : 10). Didapatkan kristal berwarna kuning. Lalu dilakukan

pengecekan menggunakan KLT menggunakan pelarut heksan : etil (4

:1) setiap hasil dari kromatografi kolom (Gambar 4.7)

Gambar 4.6 KLT senyawa esterifikasi sebelum dipisahkan dengan kromatografi kolom, eluenheksan : etil (4:1). (E=EPMS, A=APMS, N=Nitrasi APMS, H=Hasil esterifikasi)

Gambar 4.7 Hasil KLT senyawa esterifikasi murni, eluen heksan : etil (4: 1)

Hasil senyawa teresterifikasi didapatkan persen rendemen yaitu :

% rendemen =,, x 100 % = 13,7 %

32


4.2 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi

Identifikasi senyawa hasil modifikasi dimulai dengan membandingkan nilai

Rf seluruh senyawa melalui KLT menggunakan eluen heksan : etil asetat

dengan perbandingan 4 : 1 (lihat gambar 4.8). Nilai Rf yang di dapat adalah

sebagai berikut :

Etil p-metoksisinamat = 0,65

Senyawa Hasil hidrolisis = 0,125

Senyawa Nitrasi = 0,2

Senyawa nitrasi yang teresterifikasi = 0,3

Berdasarkan nilai Rf dapat diketahui tingkat kepolaran dari senyawa

modifikasi. Nilai Rf etil p-metoksisinamat memiliki nilai tertinggi dimana

senyawa tersebut memiliki polaritas yang rendah. Pada senyawa hasil

hidrolisis, nilai Rf nya lebih kecil dikarenakan memiliki polaritas yang

tinggi dikarenakan terjadi pengurangan C pada gugus karbonil dan adanya

gugus –OH yang terdapat pada senyawa tersebut. Selanjutnya, untuk

senyawa hasil nitrasi memiliki Rf 0,205 dimana nilainya lebih tinggi dari

senyawa hasil hidrolisis yang menandakan polaritanya lebih rendah dari

pada senyawa hasil hidrolisis. Pada senyawa esterifikasi hasil nitrasi

menunjukkan polaritas yang lebih rendah dari pada senyawa hasil nitrasi.

Gambar 4.8 Hasil KLT senyawa menggunakan eluen heksan : etil asetat (4:1)


Senyawa hasilhidrolisis EPMS

Senyawa hasilesterifikasi

Senyawa hasilnitrasi

33


4.2.1 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat

Senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat berupa serbuk berwarna

putih dan tidak berbau.

Gambar 4.9 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat

Pengukuran titik leleh dilakukan menggunakan alat melting point “smp

10” dan didapatkan rentang titik leleh senyawa hasil hidrolisisi etil p-

metoksisinamat yaitu 172-174oC.

Identifikasi senyawa hasil hidrolisis dilakukan dengan mencocokan

senyawa hasil reaksi dengan senyawa hasil reaksi yang dilakukan oleh

mufidah (2014) baik dari nilai Rf, titik leleh, sampai fragmentasi

GCMS nya. Dari interpretasi GCMS menunjukkan bahwa senyawa

hasil hidrolisis muncul pada waktu retensi 9,649 yang memiliki berat

molekul 178,0 dan memiliki fragmentasi massa pada 161; 133; 117; 89;

dan 63 (Lihat lampiran 3 ). Adapun fragmentasi GCMS hasil hidrolisis

EPMS sebagai berikut :

34


Dari hasil titik leleh, nilai Rf dan hasil GCMS, hasil yang didapat

ternyata sama dengan hasil yang dilakukan oleh Mufidah (2014).

Sehingga senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat adalah asam p-

metoksisinamat.

Gambar 4.10 Struktur senyawa asam p-metoksisinamat.

4.2.2 Senyawa Nitrasi Asam p-metoksisinamat

Gambar 4.11 Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat

Elusidasi struktur senyawa hasil nitrasi APMS menggunakan GCMS.

Dari data kromatogram GCMS, terlihat bahwa terdapat berbagai macam

data kromatogram yang menunjukan bahwa terdapat banyaknya reaksi

samping hasil nitrasi APMS.

35


Gambar 4.12 Hasil kromatogram GCMS senyawa hasil nitrasi

4.2.3 Esterifikasi Senyawa Hasil Nitrasi

Senyawa hasil esterifikasi nitrasi asam p-metoksisinamat memiliki

bentuk kristal dengan warna kuning pucat dan memiliki bau yang

lemah.

Gambar 4.13 Senyawa esterifikasi hasil nitrasi

Pengukuran titik leleh dilakukan menggunakan alat melting point.

Rentang titik leleh senyawa hasil reaksi esterifikasi nitro asam p-

metoksisinamat yaitu 85-89 0C

Elusidasi struktur senyawa A yaitu senyawa esterifikasi hasil nitrasi

asam p-metoksisinamat dilakukan dengan analisa menggunakan IR,

GCMS, dan 1H NMR. Penafsiran spektrum IR senyawa A esterifikasi

hasil nitrasi asam p-metoksisinamat (Gambar 4.14) dari berbagai

bilangan gelombang absorbsi gugus fungsi yang spesifik ditunjukan

dalam tabel 4.1 yaitu ditemukan pada bilangan gelombang v 2892,38

36


cm-1 adalah serapan spesifik vibrasi ulur ikatan antar atom C-H. Adanya

gugus aromatik juga ditunjukkan dengan adanya C=C pada bilangan

gelombang v 1624,13 cm-1. Ditemukannya bilangan gelombang

1530,58 untuk gugus N-O menunjukkan bahwa proses nitrasi telah

berhasil dilakukan.

Pada bilangan gelombang 1700,32 cm-1 terdapat C=O merupakan

serapan spesifik vibrasi ulur dari gugus C=O karbonil. Pada bilangan

gelombang 1270,18 cm-1 menunjukkan serapan terdapat serapan vibrasi

C-O dan tidak ditemukannya bilangan gelombang 3500-3650 cm-1

untuk gugus OH menunjukkan bahwa telah terjadi reaksi esterifikasi

dimana asam karboksilat diubah menjadi ester.

Gambar 4.14 Spektrum IR Senyawa Hasil Modifikasi

Tabel 4.1 Daftar daerah spektrum IR senyawa esterfikasi hasil nitrasi

Ikatan Daerah Absorbsi (v, cm-1)

C-H 2892,38

C-O 1270,18

N-O 1530,58

C=C (Aril) 1624,13

C=O 1700,32

Ester (COOR) 2300-2000

5007501000125015001750200025003000350040001/cm

40

50

60

70

80

90

%T

2892

.38

2846

.09

1700

.32

1624

.13

1530

.58

1462

.11

1355

.05

1270

.18

1177

.59

1077

.29

1012

.67

947.

09

nitropropilPMS

37


Hasil interpretasi GCMS menunjukkan bahwa senyawa hasil reaksi

muncul pada waktu retensi 12,409 dan memiliki berat molekul 265,0

dengan fragmentasi massa pada 265; 223; 206; 178; 130; 102; 79; 63;

41,1 (Lihat Lampiran 5 ). Adapun fragmentasi yang terjadi pada

senyawa hasil reaksi adalah sebagai berikut :

Data analisa spektrum IR dan interpretasi GCMS kemudian

dikonfirmasi kembali dengan menggunakan analisa yang terkahir yaitu1H NMR dan 13C NMR. Interpretasi analisa NMR berupa nilai

pergeseran kimia (δ) dalam satuan ppm (Pavia et al., 2008). Untuk hasil

analisa senyawa esterifikasi dengan 1H NMR dan 13C NMR (Lampiran

7) ditunjukkan pada tabel 4.2 dan panduan stuktur pada gambar 4.15

Gambar 4.15 Senyawa Etil p-metoksisinamat

12

34

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

12

38


Tabel 4.2 Data Pergeseran Kimia (δ) Spektrum 1H NMR dan 13C NMR

Senyawa EPMS (Hasali ,2013 dan Mufidah, 2014)) dan Senyawa Hasil

Esterifikasi Propanol (CDCl3, 500 MHz).

N

o.

Pergeseran Kimia (δ, ppm)

Senyawa Esterifikasi Posi

si

Eti p-metoksisinamat

13C NMR 1H NMR 13C NMR 1H NMR

1 166,755 1 167,55 -

2 119,111 6,39 (d, 1H, J=16,2) 2 116,28 6,31 (d, 1H, J=15,6)

3 141,660 7,6 (d, 1H, J=16,7) 3 144,13 7,65(d,1H, J=16,25)

4 127,362 4 127.65

5 133,676 5 130,19 6,90 (d, 2H, J=9,05)

6 114,018 8,01 (d, 1H, J=2,5) 8 114,77 7,47 (d, 2H, J=8,45)

7 154,145 7 161,29 -

8 114,018 7,68 (d,d,1H J=1,9;8,4) 8 114,77 7,47 (d, 2H, J=8,45)

9 125,120 7,1 (d, 1H, J= 8,45) 9 130,19 6,90 (d, 2H, J=9,05)

11 56,931 3,34 (s, 3H) 11 55,89 3,82 (s, 3H)

14 66,536 4,17 (t, 2H, J=13,6) 14 60,77 4,25 (q, 2H, J=7,15)

15 22,211 1,72 (m, 2H J=14,3) 15 14,60 1,33 (t,3H, J=7,15)

16 10,613 0,98 (t, 3H, J=7,1) - - -

Interpretasi NMR pada penelitian ini dilakukan dengan

membandingkan hasil interpretasi NMR pada senyawa etil p-

metoksisinamat pada penelitian mufidah (2014) dan Hasali (2013).

Spektrum 1H NMR memberikan sinyal pada pergeseran kimia 0,98 ppm

(3H) berbentuk triplet, 1,72 ppm berbentuk multiplet berjumlah enam

dan memiliki 2H yang menunjukan bahwa spektrum tersebut merpakan

gugus CH2 dan gugus disampingnya berjumlah 5H yaitu CH2 dan CH3.

Pada 4,17 ppm berbentuk triplet (2H) yang dimana pada sinya ini

terbentuk lebih downfield dikarenakan adanya ikatan oksigen. Spektrum1H NMR memberikan sinyal pada pergeseran kimia 3,34 (3H)

berbentuk singlet. Sinyal ini juga muncul lebih downfield dikarenakan

adanya ikatan dengan oksigen (-OCH3, metoksi). Pergeseran kimia 6,39

ppm (1H) berbentuk doublet memiliki hubungan puncak pada

39


pergeseran kimia 7,6 ppm (1H) yang juga berbentuk doublet, dengan

rentang nilai konstanta kopling yang hampir sama 16,2 dan 16,7 Hz.

Bentuk dari sinyal ini adalah olefin dengan proton berkonfigurasi trans.

Kemudian pada pergeseran kimia 7,1 ppm (1H), 7,68 ppm (1H) dan

8,01 ppm (1H) merupakan proton-proton dari benzen yang tersubstitusi.

Pola sinyal pada pergeseran kimia 7,68 ppm menunjukan bahwa 1

proton terkopling secara ortho dengan 1 proton pada sinyal 7,1 yang

memiliki nilai konstanta kopling sebesar 8,45 Hz. Dan terkopling secara

metha dengan 1 proton pada sinyal 8,01 ppm yang memiliki konstanta

kopling sebesar 2,5 Hz.

Berdasarkan data interpretasi IR, GCMS, 1H NMR dan 13C NMR,

senyawa hasil esterifikasi dari nitrasi asam p-metoksisinamat adalah

propil 4-metoksi 6-nitrosinamat.

Gambar 4.16 Senyawa propil 4-metoksi 6-nitrosinamat

4.3 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur Aktivitas

Senyawa Hasil Modifikasi.

Uji inhibisi denaturasi Bovine Serum Albumin (BSA) dengan

konsentrasi uji 50-0,035 ppm yang dapat memberikan % inhibisi >20%

dianggap memiliki aktivitas antiinflamasi yang potensial (Williams et al,

2008).

Pada uji antiinflamasi ini dilakukan dengan melihat efek penghambatan

denaturasi pada protein. Uji ini dilakukan dengan membandingkan etil p-

metoksisinamat , senyawa hasil esterifikasi dan natrium diklofenak sebagai

Standar.

40


Tabel 4.3 Hasil Uji antiinflamasi EPMS dan Propil 4-metoksi 6-

nitrosinamat

No. Sampel Konsentrasi (ppm) % inhibisi

1.


0,1 30,90

1 36,47

10 46,77

100 54,93

2.

Natrium Diklofenak

0,1 1,59

1 2,99

10 24,93

100 93,43

3.

Propil 4-metoksi 6-nitro

sinamat

0,1 34,37

1 26,86

10 14,73

100 -18,37

Berdasarkan tabel diatas, aktivitas senyawa propil 4-metoksi 6-nitro

sinamat berkurang seiring dengan kenaikan konsentrasi. Pada konsentrasi

0,1 dan1 ppm, terlihat senyawa masih memiliki aktivitas, namun pada

konsentrasi 10 dan 100 ppm, aktivitasnya berkurang dan tidak aktif karena

hasilnya kurang dari 20% inhibisi denaturasi protein.

Tujuan digantinya gugus etil menjadi propil bertujuan untuk

mengurangi efek gastrotoksisitas pada obat-obatan golongan AINS seperti

EPMS. Menurut Mohsan pada percobaannya terhadap flurbiprofen dapat

disimpulkan bahwa modifikasi propil flurbiprofen dapat mengurangi

gastrotoksisitas yang lebih baik daripada modifikasi etil flurbiprofen.

Namun subtitusi propil pada gugus ester menyebabkan aktivitas EPMS

menurun. Hal ini menunjukan bahwa gugus etil pada senyawa EPMS

merupakan gugus farmakofor dimana apabila terjadi pergantian pada gugus

tersebut dapat menurunkan aktivitasnya sebagai antiinflamasi.


BAB 5

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

1. Modifikasi struktur pada senyawa etil p-metoksisinamat berhasil

dilakukan melalu proses hidrolisis menjadi asam p-metoksisinamat,

kemudian dilakukan nitrasi menggunakan asam nitrat, lalu dilanjutkan

dengan esterifikasi menggunakan 1-propanol membentuk senyawa

propil 4-metoksi 6-nitrosinamat dengan rendemen sebesar 13,7%.

2. Senyawa propil 4-metoksi 6-nitrosinamat memiliki presentase inhibisi

denaturasi protein sebesar 34,37% pada konsentrasi 0,1 ppm, 26,86%

pada konsentrasi 1 ppm, 14,73% ppm pada konsentrasi 10 ppm dan -

18,37%. Pada konsentrasi 0,1 ppm dan 1 ppm, senyawa propil 4-metoksi

6-nitrosinamat aktif sebagai antinflamasi. Namun pada konsentrasi pada

konsentrasi 10 ppm dan 100 ppm, senyawa propil 4-metoksi 6-

nitrosinamat tidak aktif sebagai antiinflamasi.

3. Aktivitas antiinflamasi senyawa hasil esterifikasi menurun dengan

adanya peningkatan konsentrasi.

5.2 Saran

1. Perlunya dilakukan analisa spektroskopi HMBC (Heteronuclear

Multiple-Bond Correlation) dan HSQC (Heteronuclear Single-Quantum

Correlation) untuk menentukan posisi gugus nitro pada gugus aromatis

etil p-metoksisinamat dengan tepat.

2. Perlu dilakukan uji in vivo pada senyawa hasil modifikasi untuk

penelitian lebih lanjut


DAFTAR PUSTAKA

Al-Swayeh, O.A.; R.H. Clifford; P.del Soldato; P.K. Moore. 2000. A Comparison

of the Anti-inflammatory and Anti-nociceptive Activity of Nitroaspirin

and Aspirin. British Journal of Pharmacology 343-350.

Bangun, Robijanto. 2011. Semi Sintesis N,N-Bis(2-Hidroksietil)-3-(4-

Metoksifenil) Akrilamida Dari Etil P-Metoksisinamat Hasil Isolasi

Rimpang Kencur (Kaempferia Galanga, L) Melalui Amidasi Dengan

Dietanolamin. Medan: Universitas Sumetra Utara.

Barus, Rosbina. 2009. Amidasi Etil p-Metoksi Sinamat yang Diisolasi dari

Kencur (Kaempferia Galanga, Linn). Medan: Sekolah Pasca Sarjana

Universitas Sumatera Utara.

Chandra, Sangita. 2012. Evaluation of in vitro anti-inflammatory activity of

coffee against the denaturation of protein. Asian Pacific Journal of

Tropical Biomedicine S178-S180.

Chatterjee, Priyanka; Sangita Chandra; Protapaditya Dey; Sanjib Bhattacharya.

2012. Evaluation of Anti-Inflammatory Effects of Green Tea and Black

Tea : A Comparative in vitro Study. J. Adv. Pharm Technol Res Vol 3 (2)

136-138.

Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope IndonesiaLa Edisi IV. Jakarta.

Farmakologi dan Terapi UI. 2007. Departemen Farmakologi dan Terapeutik

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta

Halen, Parmeshwari K.; Prashant R. Murumkar; Rajani Giridhar; Mange Ram

Yadav. 2009. Prodrug Designing of NSAIDs. Mini-Reviews in Medicinal

Chemistry, 9, 124-139.

Hasali, Nor Hazwani Mohd., Omar, Muhammad Nor., Zuberdi, Ahmad

Muzammil., AlFarra, Helmi Yousif. 2013. Biotransformation of ethyl p-

methoxycinnamate from Kaempferia galanga L. Using Aspergillus niger.

International Journal of Biosciences : ISSN: 2220-6655. Vol. 3, No. 7, p.

148-155.

43


IQWiG (Institute for Quality and Efficiency in Health Care). 2010. Pubmed

Health via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0009852/

Diakses pada tanggal 9 Februari 2014.

K. Bose, Ajay; Subhendu N. Ganguly; Maghar S. Manhas; Sheetal Rao; Jeffrey

Speck; Uri Pekelny; Esteban Pombo-Villars. 2006. Microwave promoted

rapid nitration of phenolic compounds with calcium nitrate. USA :

Tetrahedron letters elsivier.

Kalgutkar, Amit S.; Brenda C.; Scott W. R.; Alan B. M.; Kevin R. K.; Rory P. R.;

Lawrence J. M.. 1999. Biochemically based design of cyclooxygenase-2

(COX-2) inhibitors: Facile conversion of nonsteroidal antiinflammatory

drugs to potent and highly selective COX-2 inhibitors. J. Med . Chem.

2000, 43 , 2860-2870.

Khoirunni’mah, Zulfa. 2012. Modifikasi Stuktur Senyawa Metil Sinamat Melalui

Proses Nitrasi Serta Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) Terhadap

Senyawa Hasil Modifikasi. Jakarta: UIN Syaif Hidayatullah.

Larson, Richard A.; Eric J. Weber. 1994. Reaction Mechanisms In Environmental

Organic Chemistry. Lewis Publisher : United States of America

Mufidah, Syarifatul. 2014. Modifikasi Struktur Senyawa Etil p-metoksisinamat

yang Diisolasi dari Kencur (Kaempferia galanga Linn.) Melalui Proses

Nitrasi dan Hidrolisis Serta Uji Aktivitas Sebagai Antiinflamasi. Jakarta :


Muller, H; Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 7th ed. (2008). NY,

NY: John Wiley & Sons; Sulfuric Acid and Sulfur Trioxide. Online

Posting Date: June 15, 2000.

Nurhayati, Umi. 2010. Modifikasi Struktur Etilp-Metoksisinamat Hasil Isolasi

Dari Rimpang Kencur (Kaempferia Gatanga Linn) Menggunakan Pereaksi

Pemecah Eter. Universitas Negeri Yogyakarta.

Olah, George A.; Subhash C. Narang; Judith A.Olah; Koop Lammertsma. 1982.

Recent aspects of nitration : New Preparative Methods and Mechanism

studies (A Review). Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 79 4487-4494.

Oyedapo, O.O.; B.A Akinpeu; K.F. Akinwunmi; M.O Adeyinka; F.O Sipeolu.

2010. Red Blood Cell Membrane Stabilizing Potentials of Extracts of

44


Lantana camara and Its Fractions. International Journal of Plant

Phsyiology and BioChemistry Vol. 2(4) 46-51.

Pavia, Donald L.; Gary M.Lampman; George S.Kriz; James R. Vyvyan. 2008.

Introduction to Spectroscopy Fourth Edition. Brooks/Cole Cengage

Learning. USA.

Qandil, Amjad M. 2012. Prodrugs of Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs

(NSAIDs), More Than Meets the Eye : A Critical Review. International

Journal of Molecular Sciences 17244-17274.

Roth, H.J. et al. 1994. Analisis Farmasi, cetakan kedua diterjemahkan oleh

Sardjono Kisman dan Slamet Ibrahim. Gadjah Mada University Press.

Yogyakarta.

Rukmana, Rahmat. 1994. Kencur. Yogyakarta : Penerbit Kanisius. Cetakan ke-13.

Sastroamidjojo, Hardjono. 1985. Spektroskopi Edisi I. Liberty. Yogyakarta.

Siswandono, Soekardjo Bambang. 2000. Kimia Medisinal. Surabaya: Airlangga

University Press.

Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Institut

Teknologi Bandung. Bandung.

Sukari, M. A., N. W. M. Sharif, A. L. C. Yap, S. W. Tang, B. K. Neoh, M.

Rahmani, G. C. L. Ee, Y. H. Taufiq-Yap, and U. K. Yusuf. 2008.

Chemical Constituens Variation of Essential Oils from Rhizomes of Four

Zingiberaceae Species. The Malaysian J. Anal, Sci., 12:3, 638-644

Taufikurohmah, T.; Rusmini; Nurhayati. 2008. Pemilihan Pelarut Optimasi Suhu

Pada Isolasi Senyawa Etil Para Metoksi Sinamat (EPMS) Dari Rimpang

Kencur Sebagai Bahan Tabir Surya Pada Industri Kosmetik.

Umar, Muhammad I.; Mohd Zaini Asmawi; Amirin Sadikun; Item J. Atangwho 1;

Mun Fei Yam; Rabia Altaf; Ashfaq Ahmed. 2012. Bioactivity-Guided

Isolation of Ethyl-p-methoxycinnamate, an Anti-inflammatory

Constituent, from Kaempferia galanga L. Extracts. Molecules, 17, 8720-

8734.

45


USDA (United States Department of Agriculture). Natural Resource Conservation

Service. Akses online via http://plants.usda.gov/ (Diakses pada tanggal 02

Januari 2015).

Vittalrao, Amberkar Monhabu; Tara Shanbag; Meena Kumari K; K.L Bairy;

Smita Shenoy. 2011. Evaluation of Antiinlammatory and analgesic

activities of alcoholic extract of Kaempeferia Galangan in rats. Indian

J.Physiol Pharmacol 55 (1) : 13-24.

Wahjo Dyatmiko, Mulya H.S, Achmad Fuad, Anik SB (1995) , Validasi Analisis

etyl p-metoksisinamat secara densitometer dalam standarisasi produk jadi

yang mengandung ekstrak etanol dari rimpang kencur (Kaempferia

Galanga L), Laporan Penelitian SPP/DPP Lembaga Penelitian Unair.

Willard, Hobart H.; Lynne L. Merritt, Jr.; John A. Dean; Frank A. Settle, Jr. 1988.

Instrumental Methods of Analysis Seventh Edition. Wadsworth Publishing

Company. California.

Williams, LAD; A.O Connar; L. Latore; O Dennis; S. Ringer; J.A Whittaker; J

Conrad; B.Vogler; H Rosner; W Kraus. 2008. The In Vitro Anti-

denaturation Effects Induced by Natural Product and Non-steroidal

Compounds in Heat Treated (Immunogenic) Bovine Serum Albumin is

Proposed as a Screening Assay for the Detection of Anti-inflammatory

compounds, without the Use of Animals, in the Early Stages of The Drug

Discovery Process. West Indian Medical Journal 57 (4):327.

Windono, Tri; Jany; Widji Suratri. 1997. Aktivitas Tabir Matahari Etil p-

metoksisinamat yang Diisolasi dari Rimpang Kencur. Warta Tumbuhan

Obat Indonesia Volume 3 No.4.

Yulianto, Yogo Tri. 2010. Prarancangan Pabrik Nitrobenzen dai Benzen dan

Asam Campuran dengan Proses Kontinyu Kapasitas 120.000 Ton/Tahun.

Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Muhammadiyah Surakarta.

46


Lampiran 1.Kerangka Penelitian

Senyawa Hasil Nitrasi

IDENTIFIKASI

Uji Invitro Antiinflamasi

Menggunakanmetodedenaturasiprotein padaBovine SerumAlbumin (BSA).


Asam p-metoksisinamat

Kromatografi

Spektrofotometri

1. KromatogfraiLapis Tipis

2.KromatografiKolom

3. GCMS

1. SpektrofotometriIR

2. 1H-NMR

3. 13C-NMR

Reaksi Hidrolisis

Senyawa HasilEsterifikasi

Reaksi Esterifikasiemnggunakan 1-propanol dandiiradiasimicrowave

47


Lampiran 2 Skema Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi EPMS

Senyawa HasilModifikasi

Kromatografi

KromatografiLapis TIPIS

KromatografiKolom

Fraksi-FraksiSenyawa Hasil

Modifikasi

Analisis Data

1H-NMR dan 13C-NMR Spektrofotometer IR

Pemisahan Senyawa HasilModifikasi

Identifikasi MenggunakanInstrumentasi

GCMS

48


Lampiran 3 Spektrum GCMS Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat

49


Lampiran 4 Spektrum Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat

50


Lampiran 5. Spektrum GCMS Senyawa Esterifikasi Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat

50


Lampiran 6. Spektrum IR Senyawa Esterifikasi

5007501000125015001750200025003000350040001/cm

40

50

60

70

80

90

%T

2892

.38

2846

.09

1700

.32

1624

.13

1530

.58

1462

.11

1355

.05

1270

.18

1177

.59

1077

.29

1012

.67

947.

09

nitropropilPMS

51


Lampiran 7 Spektrum 1H NMR dan 13C NMR Senyawa Esterifikasi

52


Lanjutan Spektrum 1H NMR Senyawa Esterifikasi

53


Lanjutan Spektrum 1H NMR Senyawa Esterifikasi

54


Lanjutan Spektrum 13C NMR Senyawa Esterifikasi

55


Lanjutan Spektrum 13C NMR Senyawa Esterifikasi

56


Lampiran 8. Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi

Hasil % Inhibisi Etil p-metoksisinamat

KonsKN = 1,002 KN = 0,205

% INHIBISI Mean SD Mean±SDI II III

0,1 0,675 0,673 0,149 32,6 32,8 27,3 30,9 3,119 30,9±3,119

1 0,602 0,596 0,146 39,9 40,5 29 36,467 6,473 36,467±6,473

10 0,557 0,593 0,114 44,4 40,8 44,3 46,767 4,862 46,767±4,862

100 0,449 0,447 0,008 55,2 52,4 57,2 54,933 2,411 54,933δ

57


Hasil % Inhibisi Senyawa Hasil Esterifikasi

Konsentrasi A B C Rata-Rata SD

0,1 31,91 38,72 32,47 34,36667 3,086749

1 21,3 28,31 30,98 26,86333 4,082094

10 14,45 15,01 14,73 0,28

100 -21,66 -20,69 -12,77 -18,3733 3,981895

58


Hasil % Inhibisi Natrium Diklofenak

Konsentrasi (ppm) % inhibisi SD

0,1 1,590 0,36

1 2,990 0,76

10 24,930 1,84

100 93,430 0,62

59


Lampiran 9. Diagram Hasil Uji Antiinflamasi

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0,1 1 10 100

EPMS

NA DIKLOFENAK

PMNS

25 UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ESTERIFIKASI SENYAWA …

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ESTERIFIKASI SENYAWA …