UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRIPSI

ADIA ALGHAZIA

1112102000080

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

DESEMBER 2016

UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK KAPANG ENDOFIT

DAUN KAYU JAWA (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)

TERHADAP BAKTERI Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Helicobacter pylori DAN Pseudomonas aeroginosa

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

SKRIPSI

Diajukan sebagai syarat untuk mendapatkan gelar sarjana farmasi (S.Farm)

ADIA ALGHAZIA

1112102000080

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

DESEMBER 2016


DAUN KAYU JAWA (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)



iv

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

SKRIPSI INI ADALAH HASIL KARYA SENDIRI,

DAN SEMUA SUMBER YANG DIKUTIP MAUPUN YANG DIRUJUK

TELAH SAYA NYATAKAN DENGAN BENAR

Nama : Adia Alghazia

NIM : 1112102000080

Tanda tangan :

Tanggal : 28 Desember 2016

v

ABSTRAK


NIM : 1112102000080

Program Studi : Farmasi

Judul

Endofit merupakan mikroorganisme menguntungkan yang berinteraksi dengan

tanaman inangnya tanpa menyebabkan gangguan atau kerusakan pada tanaman

inang, Kapang endofit juga mampu menghasilkan metabolit sekunder yang

memiliki aktivitas serupa dengan tanaman inangnya. Tanaman kayu jawa (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr.) merupakan salah satu tanaman lokal yang biasa

digunakan sebagai tanaman obat yang diketahui mengandung senyawa glikosida,

tanin, flavonoid, fenol, dan triterpenoid yang berpotensi sebagai antibakteri.

Tujuan dari penelitiaan ini adalah untuk mengisolasi kapang endofit pada daun

kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) dan menguji aktivitas ekstrak

kapang endofit terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25922, Helicobacter pylori ATCC 43504, dan

Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853. Metode yang digunakan dalam penelitian

ini adalah isolasi kapang endofit, karakterisasi, pemurnian, identifikasi bakteri uji,

fermentasi, ekstraksi dan uji aktivitas antibakteri ekstrak kapang endofit. Kapang

endofit yang dihasilkan dari proses isolasi sebanyak 4 isolat. Isolat kapang endofit

difermentasi statis selama 21 hari dengan medium PDY(Potato Dextrose Agar),

kemudian dilakukan ekstraksi sehingga diperoleh empat fraksi ekstrak. Ekstrak

air, metanol, etil asetat, dan n-heksan, kemudian diuji aktivitas antibakterinya

dengan metode difusi, cakram. Uji aktivitas antibakteri menunjukan dari 16 fraksi

ekstrak kapang endofit 8 fraksi yang berpotensi menghambat pertumbuhan

bakteri uji Staphylococcus aureus, 4 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan

Escherichia coli , 2 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan Helicobacter

pylori, dan 7 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan Pseudomonas

aeroginosa. Ekstrak metanol DM1K menunjukan hasil pengujian paling potensial

dibandingkan fraksi lain.

Kata kunci : Kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.), kapang endofit,

ekstrak kapang endofit, antibakteri, difusi cakram

Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit Daun

Kayu Jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)

Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Helicobacter pylori Dan Pseudomonas aeroginosa

:

vi

ABSTRACT

Name : Adia Alghazia

Department : Pharmacy

Title

Endophytic is benefical microorganism that interacts with plant without causing

any harm to the host. Endophytic can improve the host growing and adaptation.

Besides endophytic can product second metabolites which have similar activities

to the host. Kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) is known as

medicinal plant both empirically and scientifically. That were known to

containing of compounds such as glycocides, tannins, flavonoids, fenols and

triterpenoids. The aim of this experiments was to isolate the endophytic fungi

from leaf kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) and examine their

antibacterial activity againt Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli

ATCC 25922, Helicobacter pylori ATCC 43504, dan Pseudomonas aeroginosa

ATCC 27853 through disc diffusion method. The method used in this experiment

were isolation, purification, characterization, and examine their antibacterial

activity of endophytic fungi. A total of 4 isolates of endophytic fungi were

obtained from kayu jawa leaf. Fermentation of endophytic were fermented under

stationary condition for 21 days at room temperature to get secondary

metabolisms using potato dextrose-yeast (PDY), The crude ekstracts of these

fungi isolates with water, metanol, ethyl acetate, and n-hexane from fermentation

and extraction process were evaluated their antibacterial activity by disk diffusion

method. Test crude extracts showed antibacterial activity of 16 fractions of

endophytic fungi extract, 8 fractions of potentially inhibits the growth of test

bacteria Staphylococcus aureus, 4 fractions potential to inhibit the growth of

Escherichia coli, 2 fractions could potentially inhibit the growth of Helicobacter

pylori, and 7 fractions potential to inhibit the growth of Pseudomonas aeroginosa.

The crude metanol extract DM1K showed potential antibacterial activity instead

of other extracts.

Key Word : Antibacterial activity, Endophytic fungi, Kayu jawa (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr.), Endophytic fungi extrack, disc diffusion

Antibacterial Activity Test Of Endophytic Fungi From Leaf of

(Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) Againt Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori end

Pseudomonas aeroginosa

:

vii

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmanirrahim

Alhamdulillah, segala puji syukur selalu terpanjatkan atas segala nikmat,

karunia, dan ilmu yang bermanfaat yang diberikan oleh Allah

Subhanahuwata’ala, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan

penulisan skripsi ini. Shalawat serta salam senantiasa tercurahkan kepada Nabi

Muhammad SAW, beserta keluarga, sahabat, dan para pengikutnya hingga akhir

nanti semoga kita mendapat syafaat dari beliau.

Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit

Daun Kayu Jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) terhadap bakteri

staphylococcus aureus, escherichia coli, helicobacter pylori dan pseudomonas

aeroginosa” ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

sarjana farmasi di program studi farmasi, fakultas kedokteran dan ilmu kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Selama proses penyusunan dan penulisan laporan ini, penulis menyadari

begitu banyak bantuan dari berbagai pihak yang telah meluangkan waktunya,

mendidik dan membimbing, dan mendoakan yang terbaik kepada penulis. Maka

pada kesempatan kali ini, penulis menyampaikan penghargaan setinggi-tingginya

dan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Bapak Prof. Dr. Arief Sumantri, SKM, M.Kes., selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Eka Putri, M.Si., Apt., dan Bapak Saiful Bahri, M.Si. Sebagai

pembimbing 1 dan pembimbing 2 yang dengan sabar senantiasa meluangkan

waktu dan pikirannya untuk membimbing dan mendidik penulis

4. Ibu Dr, Azrifitria, M.Si.,Apt selaku dosen pembimbing akademik yang setia

membimbing dan memberikan arahan selama kuliah.

5. Bapak dan ibu dosen program studi farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah

memberikan ilmunya kepada penulis

viii

6. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Nur Ansori dan ibunda Kinanti Sumarni

yang selalu memberikan doa, kasih sayang yang luar biasa, dukungan moril

maupun material dan nasihatnya yang tak akan pernah mampu penulis

membalas itu semua. Penulis hanya bisa berdoa kepada Allah yang maha

pengasih lagi maha penyayang agar kiranya dengan kebesarannya mengasihi

dan melindungi Ayahanda dan Ibunda tercinta, melimpahkan rezeki, dan

memberikan keselamatan di dunia dan akhirat kelak.Aamiinn

7. Adikku tersayang Zulfa Alfi Farida dan Aulia Khalda Salsabila yang selalu

memberikan semangat dan keceriaan dalam hidup penulis.

8. Teman-teman penelitiaan endofit dan mikrobiologi Ka Ambar, Ka Ati,

Ismatuz Zulfa, Gunawan, Okin, Vano, Wida, Fadil, Dimut, Lilis, Eha,

Zakiyah, santi yang bersama dalam melakukan penelitian baik suka maupun

duka.

9. Para laboran farmasi : Mba rani, kak lisna, Kak tiwi, Kak eris, kak Yaenab,

Kak rahmadi dan Kak Walid yang telah membantu selama penelitiaan

10. Teman-teman Kontrakan ceria Galih, Ghilman, Santo, Ivan, Irham, Bung

Okin, Brendi, Towi, Om Guns, Boy. Kalian sudah seperti saudara sendiri dan

bersama-sama menjalani keceriaan bersama

11. Teman-teman seperjuangan Mahasiswa/i S1 Farmasi UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta angkatan 2012 Yang selalu penuh kebersamaan dan berjuang bersama,

terkhusus buat Nurul Fitri Rukmana. Dan Tim PDR Dwi Putri dan Intan

Cahyani yang telah banyak membantu diakhir penyelesain penelitian.

12. Seluruh pihak yang telah banyak membantu penulis selama ini yang tidak bisa

penulis sebut satu per satu.

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala

bantuan dan dukungannya kepada penulis.Penulis menyadari bahwa dalam

penulisan skripsi ini masih banyak kelemahan dan kekurangan. Maka dari itu,

segala kerendahan hati penulis sangat mengharapkan kritik dan saran pembaca

agar lebih sempurnanya skripsi ini.

Jakarta, Desember 2016

Penulis

ix

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 1112102000080

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya

ilmiah saya, dengan judul :

Untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat

dengan sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 28 Desember 2016

Yang menyatakan

(Adia Alghazia)


DAUN KAYU JAWA (LANNEA COROMANDELICA (HOUTT.) MERR.)



x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iv

ABSTRAK ........................................................................................................... v

ABSTRACT ......................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ......................................................................................... vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................ ix

DAFTAR ISI ........................................................................................................ x

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4

1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4

1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Kayu Jawa ................................................................................ 5

2.2 Kandungan Kimia .................................................................................... 6

2.2 Mikroba Endofit ....................................................................................... 6

2.3 Kapang Endofit ........................................................................................ 7

2.4 Metabolit Sekunder Kapang Endofit ....................................................... 7

2.5 Isolat Kapang Endofit .............................................................................. 8

2.6 Fermentasi ................................................................................................ 9

2.7 Bakteri ...................................................................................................... 9

2.8 Bakteri Uji ................................................................................................ 10

2.8.1 Staphylococcus aureus ................................................................... 10

2.8.2 Escherichia coli ............................................................................. 10

2.8.3 Helicobacter pylori ........................................................................ 11

2.8.4 Pseudomonas aeruginosa .............................................................. 12

2.9 Anti Bakteri .............................................................................................. 12

2.10 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................ 13

2.11 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Metode Difusi ............................... 15

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ................................................................... 17

3.2 Alat ........................................................................................................... 17

3.3 Bahan ....................................................................................................... 17

3.3.1 Tanaman ......................................................................................... 17

3.3.2 Bahan Kimia .................................................................................. 18

3.3.3 Bakteri Uji ...................................................................................... 18

xi

3.4 Pembuatan Media Pertumbuhan Kapang Endofit .................................... 18

3.4.1 Pembuatan Media PDA.................................................................. 18

3.4.2 Bahan Kimia .................................................................................. 18

3.4.3 Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast) .......................... 18

3.5 Isolasi Kapang Endofit ............................................................................. 19

3.5.1 Sterilisasi Permukaan ..................................................................... 19

3.5.2 Pemurnian Kapang Endofit ............................................................ 19

3.6 Identifikasi Kapang Endofit ..................................................................... 20

3.7 Fermentasi Kapang Endofit ..................................................................... 20

3.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi Kapang Endofit ............................................ 21

3.9 Identifikasi BakteriUji ............................................................................. 21

3.10 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................ 22

3.10.1 Media NA (Nutrient Agar)........................................................... 22

3.10.2 Media MHA (Mueller Hinton Agar) ............................................ 22

3.10.3 Peremajaan Bakteri Uji ............................................................... 22

3.10.4 Pembuatan Suspensi Bakteri ........................................................ 22

3.10.5 Pembuatan Larutan Uji ................................................................ 23

3.10.6 Pembuatan Larutan Kontrol ......................................................... 23

3.11Uji Aktivitas Antibakteri ......................................................................... 23

3.12 Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat .......................................... 24

3.13 Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak kapang yang

berpotensi ....................................................................................................... 24

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tanaman .............................................................................. 25

4.2 Penyiapan Sampel .................................................................................... 25

4.3 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit .................................................... 27

4.4 Karakteristik Isolat Kapang Endofit ........................................................ 29

4.4.1 Isolat DA2K ................................................................................... 30

4.4.2 Isolat DA3K .................................................................................. 31

4.4.3 Isolat DM1K .................................................................................. 32

4.4.4 Isolat DM2K .................................................................................. 33

4.5 Fermentasi Kapang Endofit ..................................................................... 34

4.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi Kapang Endofit ............................................ 35

4.7 Uji Kemurnian Bakteri Uji ....................................................................... 38

4.8 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit Metode Difusi .......... 39

4.9 Penapisan Fitokimia ................................................................................ 43

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan .............................................................................................. 45

5.2 Saran ........................................................................................................ 45

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 46

LAMPIRAN ......................................................................................................... 49

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Hasil isolasi dari variasi daun kayu jawa ................................................ 28

Tabel 2. Hasil pemurnian kapang endofit daun kayu jawa ................................... 29

Tabel 3. Hasil Perolehan berat ekstrak isolat kapang endofit ............................... 35

Tabel 4. Hasil kromatografi lapis tipis ekstrak kapang endofit ............................ 37

Tabel 5. Hasil Uji Kemurnian Bakteri Uji secara Mikroskopik............................ 38

Tabel 6. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen .......................... 40

Tabel 7. Hasil penapisan fitokimia daun dan ekstrak yang berpotensi ................. 43

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tanaman Lannea coromandelica ........................................................ 5

Gambar 2. Sampel daun Lannea coromandelica .................................................. 26

Gambar 3. Isolat DA2K secara makroskopik dan Mikroskopik ........................... 30

Gambar 4. Isolat DA3K secara makroskopik dan Mikroskopik ........................... 31

Gambar 5. Isolat DM1K secara makroskopik dan Mikroskopik .......................... 32

Gambar 6. Isolat DM2K secara makroskopik dan Mikroskopik .......................... 33

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 : Alur Penelitian ................................................................................ 49

Lampiran 2 : Hasil Determinasi ........................................................................... 50

Lampiran 3 : Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit ......................... 51

Lampiran 4 : Pemurnian Kapang Endofit ............................................................ 52

Lampiran 5 : Karakteristik Kapang Endofit ......................................................... 53

Lampiran 6 : Fermentasi dan Ekstraksi Kapang Endofit ..................................... 54

Lampiran 7 : Pembuatan Inokulum Bakteri Uji ................................................... 55

Lampiran 8 : Identifikasi Bakteri ......................................................................... 56

Lampiran 9 : Sterilisasi Permukaan dan Isolasi Kapang Endofit ......................... 57

Lampiran 10 : Daun Kayu Jawa dan Isolasi Daun Kayu Jawa ............................. 58

Lampiran 11 : Hasil Kultur Kapang Endofit ......................................................... 59

Lampiran 12 : Fermentasi Isolat Kapang Endofit ................................................. 60

Lampiran 13 : Ekstrak Isolat DA2K Kapang Endofit ........................................... 61

Lampiran 14 : Ekstrak Isolat DA3K Kapang Endofit ........................................... 62

Lampiran 15 : Ekstrak Isolat DM1K Kapang Endofit .......................................... 63

Lampiran 16 : Ekstrak Isolat DM2K Kapang Endofit .......................................... 64

Lampiran 17 : Hasil Uji Isolat DA2K Terhadap Staphylococus aureus ............... 65

Lampiran 18 : Hasil Uji Isolat DA2K Terhadap E.coli dan H. pylori .................. 66

Lampiran 19 : Hasil Uji Isolat DA2K Terhadap Pseudomonas aeroginosa ......... 67

Lampiran 20 : Hasil Uji Isolat DA3K Terhadap Staphylococus aureus ............... 68

Lampiran 21 : Hasil Uji Isolat DA3K Terhadap E.coli, H. Pylori, P.aero ........... 69

Lampiran 22 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap Staphylococus aureus .............. 70

Lampiran 23 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap Escherichia coli ....................... 71

Lampiran 24 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap Helicobacter pylori .................. 72

Lampiran 25 : Hasil Uji Isolat DM1K Terhadap P.aeroginosa ............................ 73

Lampiran 26 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap Staphylococus aureus .............. 74

Lampiran 27 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap Escherichia coli ....................... 75

Lampiran 28 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap Helicobacter pylori .................. 76

Lampiran 29 : Hasil Uji Isolat DM2K Terhadap P.aeroginosa ............................ 77

Lampiran 30 : Hasil Uji Fraksi Air Terhadap ....................................................... 78

Lampiran 31 : Skrining Penapisan Fitokimia Ekstrak DM1K .............................. 79

1


BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Resistensi penggunaan antibiotik telah menyebabkan masalah global yang

serius bagi kesehatan, Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) menyatakan resistensi

antibiotik adalah salah satu masalah kesehatan global di dunia modern dan

menjadi salah satu tantangan terbesar dunia kesehatan. Resistensi antibiotik

menyebabkan banyak kuman atau bakteri penyebab penyakit kini tak mampu lagi

disembuhkan dengan obat antibiotik biasa. Oleh karena itu pencariaan untuk

mendapatkan jenis antibiotik baru masih sangat diperlukan (Kaitu,2013).

Beberapa sumber yang potensial dalam pencariaan antibiotik baru berasal

dari senyawa bioaktif yang diperoleh dari tumbuhan, hewan, mikroba, dan

organisme lain (Prihatiningtias, 2005). senyawa metabolit sekunder yang

dihasilkan dari jaringan tumbuhan yang tumbuh di hutan tropis memiliki aktivitas

biologi yang tinggi. Dari sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka

bumi, masing-masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroorganisme

endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi. Indonesia merupakan negara yang

memiliki biodiversitas yang tinggi dan kawasan hutan hujan tropis yang luas

sehingga merupakan satu kelebihan dalam pencarian sumber-sumber senyawa

bioaktif. Indonesia merupakan negara yang memiliki area hutan hujan tropis yang

luas. Hutan hujan tropis merupakan sumber tumbuh-tumbuhan yang mengandung

senyawa bioaktif yang potensial (Strobel,2003).

Salah satu sumber senyawa bioaktif berasal dari mikroba endofit,

kemampuan mikroba endofit menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang

hampir sama dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan

dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder. Mikroba endofit yang

diisolasi dari tanaman inangnya dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif

yang memiliki daya antimikroba, antimalaria, antikanker dan sebagainya.

(Strobel, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat

dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau

1

2


bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, sehingga tidak perlu menebang tanaman

aslinya untuk diambil sebagai simplisia (Radji, 2005).

Kapang endofit adalah bentuk organisme yang hidup didalam jaringan

tanaman tanpa merugikan inangnya, kapang endofit mampu menghasilkan

senyawa bioaktif atau metabolit sekunder yang diakibatkan transfer genetik dari

tanaman inangnya ke dalam kapang endofit (Tan & Zou, 2001). Kapang

dilaporkan memiliki potensi yang lebih besar untuk menghasilkan metabolit

sekunder yang bermanfaat sebagai senyawa obat dibandingkan bentuk organisme

endofit lainnya (Wahyudi,1998).

Salah satu tanaman obat tradisional yang banyak dimanfaatkan masyarakat

Indonesia, khususnya masyarakat Watampone, kabupaten Bone, Sulawesi Selatan

adalah Kayu jawa atau dalam masyarakat Bugis dikenal dengan sebutan “aju

jawa”. Tanaman ini adalah salah satu tanaman obat tradisional yang masih sering

digunakan oleh masyarakat Bugis sampai sekarang ini karena khasiatnya yang

dipercaya sangat ampuh dan biasanya digunakan untuk mengobati luka dalam

maupun luka luar. Masyarakat Bugis juga sering menggunakan tanaman aju jawa

ini untuk mengobati penyakit diare, mual dan muntah. Cara penggunaan tanaman

ini berbeda-beda tergantung tujuan penggunaanya, misalnya untuk pengobatan

diare atau muntah masyarakat meminum rebusan tanaman ini. Sedangkan untuk

mempercepat penyembuhan luka, masyarakat menggunakan bagian tanaman kayu

jawa dengan menempelkan ke bagian luka (Rahayu,2006).

kayu jawa (Lannea coromandelica) dengan kandungan metabolit

sekundernya memiliki banyak aktivitas biologis. Kulit batang Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr. Mengandung karbohidrat, flavonoid, saponin,

fenol, tanin, terpenoid dan glikosida (Vadivel. et al,. 2012 ; Rajib, et al,. 2013).

Ranting Lannea coromandelica (Houtt.) Merr. Juga mengandung terpenoid, tanin

dan flavonoid yang dilaporkan memiliki aktivitas dalam penghambatan bakteri

(Gauniyal dkk, 2015).

Penelitiaan terdahulu juga menjelaskan bahwa daun Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr. Mengandung polifenol, alkaloid, steroid, protein,

getah, saponin dan mucilago (Readdy G dkk, 2011). Glikosida, triterpenoid,

flavonoid, fenol, tanin, minyak dan lemak (Vedivel dkk, 2011).

3


Daun lannea coromandelica (Houtt.) Merr. Dilaporkan mempunyai

aktivitas antioksidan, antimikroba, trombolitik (Wahid, 2009). Penelitian yang

telah ada pada tanaman ini menunjukkan bahwa tanaman kayu jawa yang berasal

dari Sulawesi selatan juga memiliki potensi sebagai antibakteri. Pada pengujian

antibakteri dari ekstrak etanol 96% kulit batang kayu jawa (lannea

coromandelica) memiliki aktivitas sebagai antibakteri (Rahmadani,2015). Maka

digunakan bakteri yang berhubungan dengan empiris yang digunakan masyarakat

untuk pengobatan, diantaranya adalah bakteri Staphylococcus aureus, merupakan

bakteri flora normal pada mulut dan saluran pernapasan tetapi bersifat patogen

menyebabkan infeksi pada kulit. Bakteri ini banyak terdapat pada selaput lendir,

kulit, bisul (Dwidjoseputro, 1990). Bakteri Escherichia coli, merupakan bakteri

normal usus namun dalam keadaan tidak normal bersifat patogen, umumnya

menyebabkan diare (Dwidjoseputro,1990). Bakteri Helicobacter pylori adalah

bakteri berbentuk spiral yang ditemukan pada lapisan mukosa lambung atau

melekat pada lapisan epitel lambung. Helicobacter pylori menyebabkan lebih dari

90% dari ulkus duodenum dan hingga 80% dari ulkus lambung (Jawetz, 1992).

Bakeri Pseudomonas aeruginosa, merupakan bakteri yang sering menyebabkan

penyakit bagi manusia, dimana sering diisolasi dari penderita neoplastik, luka dan

luka bakar yang berat.

Melihat adanya kandungan daun kayu jawa yang berpotensi sebagai

antibakteri, serta belum adanya penelitiaan tentang isolasi kapang endofit yang

berasal dari daun kayu jawa serta belum adanya publikasi ilmiah tentang

pengujian dari ekstrak isolat kapang endofit daun kayu jawa (Lannea

coromandelica) sebagai antibakteri ini di Indonesia, membuka kemungkinan

kapang endofit daun kayu jawa sebagai antibiotik yang lebih ramah lingkungan.

Penggunaan endofit daun kayu jawa ini dalam pengembangan antibiotik yang bisa

menjadi suatu eksplorasi kekayaan alam indonesia tanpa harus mengeksploitasi

keanekaragaman hayatinya.

Berdasarkan uraian diatas, maka dilakukan penelitiaan untuk mengisolasi

kapang yang mungkin ada dalam daun kayu jawa Lannea coromandelica dan

menguji aktivitas kapang tersebut terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia

coli, Helicobacter pylori, dan Pseudomonas aeruginosa.

4


1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana mengisolasi kapang endofit dari daun tanaman kayu jawa

(Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) ?

2. Bagaimana aktivitas antibakteri dari ekstrak isolat kapang endofit dari

daun kayu jawa (Lannea coromandelica) terhadap bakteri Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, dan Pseudomonas

aeruginosa.

1.3 Tujuan Penelitian

1. Mendapatkan isolat kapang endofit dari daun tanaman kayu jawa (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr.)

2. Memperoleh ekstrak kapang endofit dari daun tanaman kayu jawa (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr.) yang memiliki aktivitas penghambatan

terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Helicobacter pylori, dan Pseudomonas aeruginosa.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Secara teoritis

Secara teoritis penelitian ini diharapkan akan menambah ilmu pengetahun

tentang aktivitas antibakteri dari kapang endofit yang diisolasi dari daun

tanaman kayu jawa (lannea coromandelica)(Houtt.) Merr.)

1.4.2 Secara metodologi

Secara metodologi penelitian ini diharapkan dapat menjadi refrensi dalam

proses isolasi dan uji antibakteri kapang endofit.

1.4.3 Secara aplikatif

Secara aplikatif hasil penelitian ini diharapkan dapat dikembangkan

sebagai dasar pembuatan antibiotik yang berasal dari ekstrak kapang

endofit daun kayu jawa (lannea coromandelica)(Houtt.) Merr.)

5


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Kayu jawa (Lannea coromandelica)

Gambar 1 Tanaman Lannea coromandelica Daun Lannea coromandelica

(sumber : Erwin Prawirodiharjo, 2014) (sumber : Koleksi pribadi, 2015)

Secara taksonomi, tanaman Kayu Jawa digolongkan sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Phylum : Mannoliophyta

Class : Magnoliatae

Order : Sapindales

Family : Anacardiaceae

Genus : Lannea

Species : Lannea coromandelica

Kayu Jawa merupakan deciduous tree atau pohon gugur yang dapat

tumbuh hingga mencapai 25 m (umumnya 10-15 m). Permukaan batang berwarna

abu-abu sampai coklat tua, kasar, ada pengelupasan serpihan kecil yang tidak

teratur, batang dalam berserat berwarna merah atau merah muda gelap, dan

memiliki eksudat yang bergetah. Daun meruncing, dan berjumlah 7-11. Bunga

berkelamin tunggal berwarna hijau kekuningan. Buah berbiji, panjang 12 mm,

bulat telur, kemerahan, dan agak keras. Tanaman ini berbunga dan berbuah dari

bulan Januari hingga Mei. Lannea coromandelica memiliki sinonim Odina wodier

6


yang tersebar di Himalaya (Swat-Bhutan), Assam, Burma, Indo-China, Ceylon,

Pulau Andaman, China, dan Malaysia (Avinash, 2004).

Tanaman Kayu Jawa (Lannea coromandelica) merupakan tanaman

pekarangan yang dapat dimanfaatkan daun dan kulit batangnya dengan cara

ditumbuk ataupun direbus untuk mengobati luka luar, luka dalam, dan perawatan

paska persalinan (Rahayu 2006). Kulit batang dapat digunakan sebagai astringen,

mengobati sakit perut, lepra, peptic ulcer, penyakit jantung, disentri, dan

sariawan. Perebusan daun juga dianjurkan untuk mengobati pembengkakan dan

nyeri lokal (Wahid, 2009).

2.2 Kandungan Kimia

Berdasarkan studi literatur Lannea coromandelica, Mengandung Alkaloid,

karbohidrat , flavonoid, triterepenoid, steroid, tanin, glikosida, saponin, serta

protein (Joshi, 2012). Md. Tofazzal dan Satoshi Tahara (2009) telah mengisolasi

senyawa dari kulit batang Lannea coromandelica berupa senyawa

dihydroflavonols, (2R,3S)-(+)-3’,5-dihydroxy-4’,7 dimetoxydihiydroflavonol, dan

(2R , 3R)-(+) -4’, 5 ,7- Trimetoxydihydroflavonol.

2.3 Mikroba Endofit

Mikroba endofit adalah mikroorganisme yang hidup di dalam jaringan

tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni

dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya (Tan RX, 2001). Bacon

dan White (2000) mendefinisikan endofit sebagai mikroorganisme yang

membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa menimbulkan gejala penyakit

pada inangnya. Mikroba endofit yang terdapat dalam jaringan tumbuhan ada

beberapa bentuk yaitu: fungi (kapang dan khamir), bakteria, mycoplasma,

archaebacteria. Diantara keempat bentuk organisme tersebut, fungi adalah bentuk

mikroorganisme yang paling banyak ditemukan sebagai endofit (Strobel, 2003).

7


2.4 Kapang Endofit

Kapang endofit merupakan fungi yang hidup di dalam jaringan tanaman

pada jangka waktu tertentu dan membentuk koloni dalam jaringan tanaman

tersebut tanpa merugikan inangnya (Radji, 2005).

Kapang yang masih dalam bentuk spora baik dalam daun, akar dan batang

tidak dapat diamati tanpa ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan. Populasi

kapang endofit yang terdapat pada batang dan daun lebih banyak dibandingkan

pada akar (Purwanto, 2011). Endofit dapat berperan sebagai perangsang

pertumbuhan tanaman dan meningkatkan hasil melalui produksi fitohormon dan

penyedia hara, sebagai penetral kontaminan tanah sehingga meningkatkan

fitoremidiasi, dan agen pengendali hayati. Endofit juga dapat berperan dalam

mengurangi infeksi nematoda, meningkatkan ketahanan tanaman, memproduksi

metabolit sekunder seperti alkaloid, steroid dan lain-lain (Yulianti, 2012).

2.5 Metabolit Sekunder Kapang Endofit

Metabolisme kapang endofit menghasilkan dua jenis metabolit yaitu

metabolit primer dan metabolit sekunder. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh

tanaman memiliki beberapa ciri antara lain spesifik, tidak perlu diproduksi setiap

saat, pada kebanyakan kasus fungsinya tidak diketahui. Berbagai jenis endofit

telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam

media perbenihan yang sesuai. Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi

oleh mikroba endofit tersebut telah berhasil diisolasi. Metabolit sekunder yang

dihasilkan dari mikroba endofit memiliki bioaktivitas yang bermanfaat baik untuk

dunia farmasi maupun pertanian. Bioaktivitas dari kapang endofit yang telah

dilaporkan sangat beragam antara lain sebagai antimikroba, antiviral, antioksidan,

immunosupresif, antikanker, dan antimalaria. Kemampuan mikroba endofit

memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya

merupakan peluang yang sangat besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi

metabolit sekunder dari mikroba endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya

tersebut. Sekitar 300.000 jenis tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-

masing tanaman mengandung satu atau lebih mikroba endofit yang terdiri dari

bakteri dan kapang (Strobel, 2003).

8


2.6 Isolasi Kapang Endofit

Isolasi kapang endofit dilakukan dengan metode direct seed planting.

Tanaman sampel di isolasi langsung dari tanaman hidup atau tanaman yang

diawetkan. Apabila tanaman diawetkan, sedikit dari jaringan tanaman dipotong

dari tanaman dan ditaruh dalam plastik bersegel. Plastik tempat menyimpan

tanaman harus bebas dari udara lembab (Strobel, 2003). Sebelum dilakukan

sterilisasi permukaan, tanaman sampel yang langsung diperoleh dari alam dialiri

dengan air mengalir selama 10 menit hingga bersih dari pengotor seperti debu dan

tanah (Wahyudi P, 1998). Sterilisasi permukaan bertujuan untuk mengeliminasi

mikroba yang terkandung pada permukaan tanaman. Sterilisasi permukaan dapat

dilakukan dengan dicelupkan dalam alkohol 70% , dan direndam di larutan

NaOCl (Strobel, 2003).

Langkah selanjutnya setelah dilakukan sterilisasi permukaan, jaringan

bagian luar dihilangkan dengan pisau steril. Jaringan bagian dalam lalu dipotong

membujur dan diletakkan dengan hati-hati pada permukaan media agar. Potongan

tanaman pada media isolasi diinkubasi selama 7-21 hari

(Strobel,2003; Wahyudi P,1988). Medium isolasi yang umum digunakan untuk

kapang adalah Potato Dextrose Agar (PDA) (Margino, 2008 ; Noverita et al.,

2003 ; Pawle, 2014).

2.7 Fermentasi

Fermentasi merupakan suatu proses untuk mengubah bahan dasar menjadi

produk yang dikehendaki dalam kultur mikroba tertentu. Menurut Purwanto,

2011. dari proses fermentasi yang dilakukan bertujuan untuk menghasilkan

beberapa produk di antaranya :

a. Biomassa sel, misalnya protein sel tunggal.

b. Enzim, seperti enzim amilase dan protease.

c. Metabolit, merupakan senyawa hasil reaksi metabolisme dari kapang endofit,

seperti metabolit primer (misalnya polisakarida, protein, asam nukleat), serta

metabolit sekunder (yaitu senyawa antibiotika).

d. Produk rekombinan, seperti insulin dan interferon.

9


e. Biokonversi, konversi asam asetat dari etanol sorbitol dan produk steroid,

aseton dari propanol, antibiotika dan prostaglandin).

Proses fermentasi kapang endofit menggunakan media Potato Dextrose Yeast.

Medium PDY (Potato Dextrose Yeast) merupakan media fermentasi yang umum

di gunakan karena mengandung sumber karbon yang berasal dari kentang dan

dextrose, serta ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen (Kumala, & Pratiwi,

2014). Senyawa-senyawa sumber karbon dan nitrogen merupakan komponen

terpenting dalam medium fermentasi, karena sel-sel mikroba dan berbagai produk

fermentasi sebagian besar terdiri dari unsur-unsur karbon dan nitrogen, selain itu

juga mengandung garam-garam organik serta beberapa vitamin dan mineral

(Kusumaningtyas et al., 2010).

2.8 Bakteri

Bakteri dibagi dalam golongan Gram positif dan Gram negatif

berdasarkan reaksinya terhadap pewarnaan Gram. Perbedaan antara Gram positif

dan Gram negatif diperlihatkan dari perbedaan dinding sel. Dinding sel bakteri

Gram positif sebagian besar terdiri atas beberapa lapisan peptidoglikan yang

membentuk struktur yang tebal dan kaku. Kekakuan dinding sel bakteri yang

disebabkan karena lapisan peptidoglikan dan ketebalan peptidoglikan ini membuat

bakteri Gram positif resisten terhadap lisis osmotik (Jawetz, 1996). Dinding sel

bakteri Gram negatif mengandung lapisan peptidoglikan yang tipis, membran luar

yang terdiri dari protein, lipoprotein, fosfolipid, lipopolisakarida dan membran

dalam. Selain itu dinding sel bakteri Gram negatif mengandung polisakarida dan

lebih rentan terhadap kerusakan mekanik dan kimia (Jawetz, 1996). Berdasarkan

bentuk morfologinya, maka bakteri dapat dibagi atas tiga golongan yaitu:

(Dwidjoseputro,1990).

1. Golongan basil

Basil (dari bacillus) berbentuk serupa batang, silindris. Sebagian besar bakteri

berupa basil. Ukuran bakteri basil ada yang lebarnya 0,2 sampai 2,0μ sedangkan

panjangnya ada yang 1 sampai 15μ.

10


2. Golongan kokus

Kokus adalah bakteri yang bentuknya bulat. Golongan ini tidak sebanyak

golongan basil. Ukuran bakteri kokus ada yang berdiameter 0,5μ ada pula yang

berdiameter sampai 2,5μ.

3. Golongan spiral

Spiral adalah bakteri yang bengkok atau berbengkok-bengkok serupa spiral.

Bakteri yang berbentuk spiral ini tidak banyak terdapat jika dibandingkan dengan

golongan kokus maupun golongan basil.

2.9 Bakteri uji :

2.9.1. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang bersifat

patogen. Morfologi bakteri ini selnya berbentuk bulat atau kokus berdiameter 0,8

- 1,0μm, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur seperti buah

anggur, tidak membentuk spora, dan tidak bergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu

optimum 37ºC, tetapi membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25ºC).

Pertumbuhan terbaik pada suasana aerob namun juga bersifat aerob fakultatif.

Bakteri ini sering ditemukan ditanah, air tawar, dan selaput lendir pada binatang

berdarah panas termasuk manusia (Jawetz, 1996).

Klasifikasi Staphylococcus aureus adalah sebagai berikut.

Divisi : Protophyta atau Schizophyta

Kelas : Schizomycetes

Bangsa : Eubacteriales

Suku : Micrococcaceae

Marga : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

2.9.2. Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang

pendek yang memiliki panjang sekitar 2μm, diameter 0,7μm, lebar 0,4μm.

(Jawetz,1996). Bakteri ini tidak membentuk spora, tidak tahan asam, sebagian

besar bergerak dengan flagel pentrikus (merata tersebar diseluruh permukaan sel

11


dan beberapa strain mempunyai kapsul). Escherichia coli ini bersifat patogen,

bakteri ini dapat menyebabkan beberapa penyakit pada manusia, antara lain:

menyebabkan infeksi primer pada usus manusia (diare pada anak), infeksi pada

saluran kemih. Bakteri ini banyak ditemukan dalam saluran pencernaan, habitat

pada umumnya adalah ditanah, lingkungan akuatik, makanan, air seni dan tinja.

klasifikasi Escherichia coli adalah sebagai berikut

Devisi : Bacteria

Kelas : Schizomycetes

Bangsa : Enterobacteriales

Suku : Enterobacteriaceae

Marga : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

2.9.3. Helicobacter pylori

H pylori adalah bakteri berbentuk spiral atau batang bengkok, bersifat

Gram negatif, dan hidup dalam lingkungan mikroaerofilik dalam lapisan mukosa,

epitel dan jaringan lambung. Infeksi H. pylori telah diketahui sebagai penyebab

utama penyakit peptic ulcer (tukak lambung dan duodenum).

Klasifikasi Helicobacter pylori adalah sebagai berikut.

Devisi : Bacteria

Kelas : Epsilon Probacteria

Bangsa : Campylobacteralis

Suku : Helicobateraceae

Marga : Helicobacter

Spesis : Helicobacter pylori

2.9.4. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa berbentuk batang dengan ukuran sekitar 0,6 x

2μm. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan terkadang

membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa termasuk bakteri Gram negatif.

Suhu optimum untuk pertumbuhan P. aeruginosa adalah 420C. P. aeruginosa

mudah tumbuh pada berbagai media pembiakan karena kebutuhan nutrisinya

12


sangat sederhana. Bakteri ini dijumpai pada luka bakar, infeksi telinga serta luka-

luka setelah operasi. Klasifikasi Pseudomonas aerugenosa adalah sebagai berikut:

Divisi : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Marga : Pseudomonadales

Suku : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Species : Pseudomonas aeruginosa

2.10 Antibakteri

Antibakteri merupakan zat atau obat untuk membasmi jasad renik yang

diperoleh dari sintesis atau yang berasal dari senyawa non organik. Bakteriostatik

yaitu antimikroba yang hanya menghambat pertumbuhan mikroorganisme.

Bakterisidal adalah antimikroba yang dapat membunuh mikroorganisme.

Mekanisme kerja antibakteri:

1. Menghambat sintesis dinding sel

Struktur dinding sel dapat dirusak dengan cara menghambat

pembentukannya atau mengubah dinding sel setelah terbentuk (Pleczar, 1988).

2. Menganggu keutuhan membran sel mikroba

Membran sitoplasma mempertahankan bahan-bahan tertentu didalam sel

serta mengatur aliran keluar-masuknya bahan-bahan lain. Membran memelihara

integritas komponen-komponen selular. Kerusakan pada membran ini akan

mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan sel atau matinya sel (Pleczar, 1988).

3. Menghambat Sintesis Protein Sel Mikroba

Hidupnya suatu sel bergantung pada terpeliharanya molekul-molekul

protein dan asam nukleat dalam keadaan alaminya. Suatu kondisi atau substansi

yang mengubah keadaan ini, yaitu mendenaturasi protein dan asam-asam nukleat

dapat merusak sel tanpa dapat diperbaiki kembali. Suhu tinggi dan konsentrasi

pekat beberapa zat kimia dapat mengakibatkan koagulasi (denaturasi) ireversible

(tidak dapat balik) komponen-komponen selular yang vital ini (Pleczar, 1988)

13


4. Menganggu metabolisme sel mikroba

Setiap enzim dari beratus-ratus enzim berbeda-beda ada yang di dalam sel

merupakan sasaran potensial bagi bekerjanya suatu penghambat. Banyak zat

kimia telah diketahui dapat mengganggu reaksi biokimia. Penghambatan ini dapat

mengakibatkan terganggunya metabolisme atau matinya sel (Pleczar, 1988).

5. Penghambatan sintesis asam nukleat dan protein

DNA, RNA dan protein memegang peranan penting di dalam proses

kehidupan normal sel. Hal itu berarti bahwa gangguan apa pun yang akan terjadi

pada pembentukan atau pada fungsi zat-zat tersebut dapat mengakibatkan

kerusakan total pada sel (Pleczar, 1988).

2.11 Uji Aktivitas Antibakteri

Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi

cakram,metode pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi cakram dilakukan

dengan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk

adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa

antibakteri. (Hermawan dkk., 2007).

2.10.1 Metode Difusi Cakram

Metode difusi cakram merupakan metode yang paling umum digunakan

untuk melakukan uji zat terhadap mikroorganisme. Metoda ini menghasilkan

kategori sensitivitas berdasarkan difusi antibakteri dari kertas cakram di dalam

media yang sudah mengandung inokulat. Kertas cakram uji diresapi zat uji

kemudian kertas cakram tersebut diletakkan pada permukaan media agar yang

sudah mengandung inokulat uji, selanjutnya diinkubasi. Setelah dilakukan

inkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya zona hambat

atau zona bening di sekeliling cakram (Kusmayati dan Agustini, 2007). Hal

tersebut terjadi karena selama masa inkubasi zat uji yang berada dalam kertas

cakram meresap ke media agar. Zona hambat ini dapat menjadi parameter untuk

menentukan tingkat sensitivitasnya apakah sensitif, parsial, atau resisten.

Metode ini dipengaruhi oleh beberapa faktor fisika dan kimia, selain faktor

antara obat dan organisme misalnya sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran

molekular dan stabilitas obat (Jawetz et al., 2005).

14


2.10.2 Metode Dilusi

Antibakteri dibuat seri kadar konsentrasi yang menurun secara bertahap

menggunakan media padat atau media cair. Selanjutnya media diinokulasi bakteri

uji dan diinkubasi. Kemudian ditentukan KHM (Kadar Hambat Minimum)

antibakteri tersebut (Jawetz et al., 2005). Prinsip metode pengenceran ini adalah

senyawa antibakteri diencerkan hingga diperoleh beberapa macam konsentrasi,

kemudian masing-masing konsentrasi ditambahkan suspensi bakteri uji dalam

media cair. Perlakuan tersebut akan diinkubasi dan diamati ada atau tidaknya

pertumbuhan bakteri, yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan. Larutan uji

senyawa antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya

pertumbuhan bakteri uji, ditetapkan sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) atau

Minimal Inhibitory Concentration (MIC).

Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang

pada media cair tanpa penambahan bakteri uji ataupun senyawa antibakteri, dan

diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi

ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimal Bactericidal

Concentration (MBC) (Pratiwi, 2008).

2.11.3 Uji Bioautografi

Bioautografi merupakan metode spesifik untuk mendeteksi bercak pada

kromatogram hasil KLT yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, dan

antivirus. Dengan metode ini, maka dapat diketahui bercak yang memiliki

aktivitas dan dapat dilakukan isolasi senyawa aktif. Metode ini sangat praktis dan

mudah, namun memiliki kerugian yaitu tidak dapat digunakan untuk menentukan

KHM atau KBM-nya (Pratiwi,2008).

Ada dua macam uji bioautografi :

1. Bioautografi langsung

Metode ini dapat dilakukan dengan dua cara :

a. Plat hasil KLT disemprot dengan suspensi bakteri uji.

b. Plat KLT disentuhkan di atas media agar yang telah ditanami bakteri uji (sering

disebut bioautografi kontak). Setelah diinkubasi, area jernih di mana tidak

terdapat pertumbuhan bakteri merupakan spot senyawa aktif.

15


2. Bioautografi overlay

Metode ini dilakukan dengan cara menuangkan media agar ke dalam petri

dan ditunggu hingga memadat. Selanjutnya plat hasil KLT diletakkan di atas

media agar tersebut. Media agar berisi bakteri uji dituang di atas plat hasil KLT

dan ditunggu hingga memadat. Area hambatan setelah inkubasi pada suhu 37°C

selama 18-24 jam dilihat dengan cara menyemprotkan tetrazolium klorida. Spot

senyawa aktif akan muncul sebagai area jernih dengan latar belakang ungu

(Pratiwi,2008).

Bioautografi langsung merupakan metode bioautografi yang paling banyak

digunakan dari semua metode bioautografi. Prinsip dari metode ini adalah plat

KLT dicelupkan pada suspensi mikroorganisme kemudian diinkubasi. Visualisasi

dari zona ini biasanya dilakukan dengan menggunakan reagen dehydrogenase

untuk deteksi aktivitas, yang paling umum adalah garam tetrazolium.

Dehydrogenase mikroorganisme mengkonversi garam tetrazolium menjadi

berwarna, sehingga terlihat spot krem-putih dengan latar belakang ungu pada

permukaan plat KLT menunjukan keberadaan agen antibakteri (Choma,2010).

2.12 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Uji Antibakteri Metode Difusi

Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil pengamatan aktivitas

antibakteri dengan metode difusi (Lorian, 1980 dalam Yulia, 2005), antara lain :

a. Kedalaman agar

Untuk memperoleh sensitivitas yang optimal, cawan petri diisi dengan

lapisan agar tidak lebih dari 2 sampai 3 mm dan merata pada setiap bagiannya.

b. Ukuran inokulum

Ukuran inokulum merupakan salah satu variabel penting yang

berpengaruh pada besar kecilnya zona hambatan dan konsentrasi hambat

minimum. Jika ukuran inokulum kecil, akan diperlukan lebih banyak waktu untuk

mencapai massa zat sel bakteri. Akibatnya zoba hambat yang terbentuk akan

menjadi lebih besar, dan konsentrasi hambat minimum menjadi lebih kecil.

c. Komposisi medium

Aktivitas zat antibakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti kation-

kation dalam medium, pH medium dan adanya berbagai macam bahan antagonis.

Kecepatan difusi zat antibakteri ditentukan oleh konsentrasi medium, konsentrasi

16


berbagai ion dan adanya ikatan elektrostatik antara zat antibakteri dengan

sekumpulan ion dalam medium. Kapasitas nutrisi dari medium perumbuhan juga

sangat mempengaruhi panjangnya fase pertumbuhan dari bakteri uji, dan akan

turut mempengaruhi ukuran zona hambatan dan konsentrasi hambat minimum.

d. Temperatur medium

Tiap-tiap golongan mikroba memiliki temperatur pertumbuhan optimal

(jamur umumnya 20-37°C, bakteri 30-37°C) (Pelczar dan Chan, 1986). Maka

temperatur inkubasi akan sangat mempengaruhi pertumbuhan mikroba uji.

Kecepatan pertumbuhan akan menurun pada temperatur yang lebih rendah dari

temperatur optimal pertumbuhan mikroba dan terhenti pada temperatur ekstrim

bagi mikroba. Hal yang sama terjadi pada temperatur yang lebih tinggi dari

temperatur optimal pertumbuhan.

e. Waktu inkubasi

Besarnya zona hambatan juga ditentukan oleh jangka waktu inkubasi,

misalnya kebanyakan bakteri patogen dapat diamati pertumbuhan setelah 5 atau 6

jam inkubasi. Pada inkubasi selanjutnya zona hambatan akan menjadi lebih kecil

karena terjadi pertumbuhan bakteri pada tepi zona hambatan dan konsentrasi

hambatan minimum akan besar.

f. Konsentrasi zat antimikroba

Semakin tinggi konsentrasi zat aktif antibakteri akan semakin besar

hambatan terhadap pertumbuhan mikroba, sehingga zona hambatan akan semakin

besar.

17


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian 1 , Laboratorium

Farmakognosi dan Fitokimia, Laboratorium Steril Fakultas Kesehatan dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Penelitian dimulai pada bulan

September 2015 - Juli 2016.

3.2 Alat

Laminar Air Flow, incubator (Memmert), timbangan (Scout Pro),

mikroskop cahaya (Shimadzu), autoklaf (Jall American), autoklaf digital (ALP),

hot plate (ARE Heating Magnetic Stirrer), vacum rotary evaporator, kertas saring

steril, paper disc, micro pipet dan tip, magnetic stirrer, pinset, cawan petri, tabung

reaksi, jarum ose, ose bulat, beaker glass, gelas ukur, tabung reaksi, bunsen, glass

object, cover glass, kaca arloji, batang pengaduk, batang penyebar kaca segitiga,

spatula, labu Erlenmeyer, labu ukur, botol fermentasi dan alat-alat gelas lainnya

yang umum digunakan pada Laboratorium Mikrobiologi.

3.3 Bahan

3.3.1 Tanaman

Sample uji tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kayu

jawa (Lannea coromandelica) diperoleh dari daerah Watampone, Kabupaten

Bone, Sulawesi Selatan. Daun di kemas dalam tempat terpisah dari akar dan

batang. Daun dipilih yang masih hijau,belum terdapat cacat dan dikirim dalam

satu tangkai utuh agar bisa di variasikan. dikirim sudah dalam kondisi bersih dan

dikirim 6 oktober 2015 tiba 8 oktober 2015. Tanaman dideterminasi di Pusat

Penelitian Indonesia (LIPI) Kebun Raya Bogor.

18


3.3.2 Bahan Kimia

Larutan Natrium Hipoklorit (NaOCl) 5,25% (Baycline), Alkohol 70%,

Alkohol 96% dan akuades steril, Metanol teknis, n-heksan teknis, Etil asetat

teknis.

3.3.3 Media Pertumbuhan Mikroba

Nutrient Agar (NA) (Merck), Potato Dextrose Agar (PDA) (Merck),

Mueller Hinton Agar (MHA) (Merck), Dextrose Broth (Merck), Yeast Extract

(Merck).

3.3.4 Bahan untuk identifikasi kapang: pewarna Methylen blue

3.3.5 Bakteri Uji

Bakteri yang digunakan :

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922,

Helicobacter pylori ATCC 43504, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

3.4 Pembuatan Media Pertumbuhan Kapang Endofit

3.4.1 Pembuatan Media PDA

Potato Dextrose Agar 39 g ditimbang dan ditakar 1 liter akuades. Untuk

pembuatan media PDA 10% ditimbang Potato Dextrose Agar 2,4; agar 15 gram;

kloramfenikol 0,5 g; akuades 1 L. Panaskan masing-masing campuran bahan

hingga homogen. Sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit dengan suhu

121°C. Tuang ke dalam cawan petri, masing-masing 15 mL, kemudian dibiarkan

media membeku (Atika, 2011).

3.4.2 Media Agar Miring PDA

Ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram, dan ditakar 1 L akuades.

Campuran bahan dipanaskan hingga homogen. Sterilisasi dengan autoclave

selama 15 menit dengan suhu 121°C. Masukkan ke dalam tabung masing-masing

10 mL . Letakkan tabung dengan posisi miring ± 45° dan biarkan media membeku

(Purwanto,2011).

19


3.4.3 Pembuatan Media PDY (Potato Dextrose Yeast)

Ditimbang 200 g kentang yang telah dikupas dan dibersihkan,

ditambahkan 200 mL akuades, kemudian dipanaskan sampai mendidih. Ekstrak

kentang disaring, kemudian ditambahkan Dextrose sebanyak 10 g, Yeast Extract

2 g, dan ditambahkan akuades sampai 1000 mL. Campuran bahan dihomogenkan

sambil diaduk sampai mendidih diukur pHnya sampai 6. Medium dimasukkan ke

dalam botol fermentasi sebanyak 250 mL, kemudian disterilisasi dengan autoclave

selama 15 menit, pada suhu 121°C (Maryanti,2015).

3.5 Isolasi Kapang Endofit

3.5.1 Sterilisasi Permukaan

Bagian daun tanaman Lannea Coromandelica yang masih segar atau yang

masih terlihat hijau dipilih. Daun Tanaman dibersihkan hingga terbebas dari

pengotor seperti tanah, debu, dan lumut. bagian daun dipotong dengan ukuran 1x1

cm2. Setelah itu, bagian permukaan daun disterilisasi permukaannya.

Mula-mula masing-masing potongan daun uji direndam ke dalam etanol

70% selama 1 menit, lalu di pindahkan potongan daun uji ke dalam larutan NaOCl

5,25% rendam selama 5 menit, terakhir direndam tanaman uji di dalam etanol

70% selama 30 detik dan yang terakhir rendam dengan akuades steril 5 detik.

Daun yang sudah steril kemudiaan dikeringkan diatas kertas saring,

kemudiaan daun dipotong menjadi potongan-potongan kecil berukuran ±1,0 cm.

Daun ditanam diatas permukaan media PDA dan kemudiaan diinkubasi pada suhu

kamar selama 5 – 21 hari (Rustanti, 2007 ; Purwanto, 2011). Setiap cawan petri

dapat ditanam 2 potongan daun. Sebagai kontrol, diinokulasikan akuades bilasan

terakhir pada medium PDA. Proses isolasi dilakukan secara triplo dengan variasi

bagian daun yang muda, daun sedang, dan daun tua.

3.5.2 Pemurniaan Kapang Endofit

Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi selanjutnya dimurnikan

pada cawan petri berisi PDA. Pemurnian dilakukan berdasarkan kenampakan

morfologi secara makroskopis yang meliputi warna dan bentuk koloni dan hifa

yang tumbuh. Sedikit hifa kapang dipindahkan dengan jarum ose steril ke dalam

cawan petri yang berisi PDA, lalu hasil pemurnian tersebut diinkubasi pada suhu

20


ruang 250C selama 7-14 hari (Rachmayani, 2008). Isolat kapang yang telah murni

dipindahkan ke agar miring PDA untuk dijadikan stock culture dan working

culture dan disimpan pada suhu 40C (Handayani, 2007)

3.6 Identifikasi Kapang Endofit

Pengamatan morfologi kapang secara makroskopik dilakukan dengan

mengamati karakteristik koloni suatu biakan, antara lain meliputi: warna dan

struktur permukaan koloni; ada atau tidaknya tetes eksudat; dan ada atau tidaknya

lingkatan kosentris. Pengamatan koloni dilakukan sejak awal penanaman hingga

beberapa waktu tertentu, dan segala macam perubahan yang terjadi harus dicatat

(Gandjar et al., 1999).

Pengamatan secara mikroskopis dilakukan dengan menggunakan metode

Slide Culture (Atlas et al., 1984). Tahapan metode Slide Culture yaitu : kertas

kering diletakkan pada dasar cawan petri dan diatasnya diletakkan kaca objek dan

cover glass, kemudian cawan petri tersebut disterisasi dalam auotoklaf pada suhu

121°C selama 15 menit. Setelah itu, kertas saring dalam cawan Petri dibasahi

dengan akuades steril (Kumala,2008). Kaca objek ditetesi medium PDA dan

dibiarkan memadat, kemudian isolat kapang endofit diinokulasikan pada medium.

Kaca objek yang telah mengandung medium dan isolat kapang ditutup dengan

cover glass. Kapang endofit diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang. Hasil

inkubasi diamati di bawah mikroskop pada pembesaran 20 kali, 40 kali dan 100

kali (Atlas et al., 1984 dalam Jauhari, 2010 dengan modifikasi)

Pengamatan pada mikroskopik meliputi hifa berseptum atau tidak,

miselium terang atau keruh, miselium berwarna atau tidak berwarna, jenis spora

aseksual : sporangiospora, konidia atau arhospora (oidia), ciri kepala pembawa

spora : Sporangium (ukuran, warna, bentuk), kepala spora pembawa konidia :

tunggal, berantai, pertunasan atau kumpulan, bentuk , penampakan spora aseksual

terutama konidia, penampakan sporangiofora atau konidiofora : sederhana atau

bercabang, jika bercabang bentuk percabangan, ukuran dan bentuk kulumela pada

ujung sporangiofora, konidiofora tunggal atau bergrombol (Waluyo,2007).

21


3.7 Fermentasi

Hasil metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit dapat

diperoleh melalui suatu proses fermentasi. Koloni kapang endofit yang telah

dikultur dalam medium PDA selama 7 hari, diambil menggunakan sedotan steril

berdiameter 6 mm empat potongan, bulatan agar yang mengandung isolat kapang

endofit dipindahkan menggunakan jarum ose dimasukkan ke dalam 250 mL

media PDY cair. Kemudian kultur tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama 21

hari dengan kultur diam (statis) (Phongpaichit et al., 2006) (Kumala et al.,2006

dengan modifikasi).

3.8 Ekstraksi Hasil Fermentasi

Koloni kapang yang diperoleh dari proses fermentasi dibagi menjadi 2

bagian. Bagian pertama, biomassa dihaluskan dengan lumpang dan alu kemudian

ditambahkan pelarut metanol ke dalam biomassa kemudiaan diamkan dalam

tempat gelap selama 48 jam, kemudian saring dan ambil filtrat kemudian

dipekatkan dengan vacum rotary evaporator hasilnya adalah ekstrak kental fraksi

metanol digunakan sebagai ekstrak uji 1. Bagian kedua medium air pertumbuhan

yang diperoleh dari fermentasi kapang diekstraksi dengan cara partisi dengan n-

heksan dan etil asetat yang kemudiaan juga dipekatkan dengan vacum rotary

evaporator hasilnya adalah ekstrak pekat yang digunakan sebagai uji 2 dan 3, dan

bagian medium fermentasinya diuji sebagai uji 4 sebagai uji fraksi airnya.

Tujuan ekstraksi dibagi menjadi 2 antara biomassa dan medium

pertumbuhannya adalah pada biomassa diharapkan eksudat di dalam sel keluar

dengan cara pengahalusan sehingga metabolit sekundernya keluar dari selnya

sedangkan ekstraksi dengan cara partisi pada medium fermentasi bertujuan untuk

menarik eksudat yang keluar dan jatuh kedalam medium fermentasi selama proses

fermentasi.

3.9 Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik

pada bakteri uji yang berusia 18-24 jam. Identifikasi makroskopik dilakukan

dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Bakteri uji diambil satu

ose diletakkan diatas kaca objek yang telah ditetesi sedikit NaCl 0,9%. Bakteri

22


disebar pada kaca objek dengan menggunakan ose bulat kemudian difiksasi

dengan cara dilewatkan di atas api. Larutan kristal violet diteteskan di atas

preparat dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian preparat dicuci dengan air

mengalir. Preparat kemudian ditetesi cairan lugol dan dibiarkan selama 45-60

detik, kemudian dicuci dengan air mengalir. Preparat dicuci lagi dengan etanol

96% dan digoyang-goyangkan selama 30 detik. Setelah itu safranin diteteskan di

atas preparat dan dibiarkan selama 1-2 menit. Preparat dicuci dengan air dan

dikeringkan dengan tisu. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x,

200x, dan 400x (Rachmayani, 2008).

3.10 Uji Aktivitas Antibakteri

3.10.1 Medium Nutrient Agar (NA)

Medium yang digunakan untuk peremajaan bakteri adalah nutrient agar

(NA). NA dibuat berdasarkan aturan pakai yang tertera pada kemasan

(Merck).Serbuk NA sebanyak 10 gram dilarutkan dalam 500 mL aquadest dan

dipanaskan hingga mendidih dan agar tercampur rata. Kemudian disterilkan

menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selamat 15 menit. Setelah disterilisasi

medium dapat digunakan dan disimpan di lemari pendingin.

3.10.2 Mueller Hinton Agar (MHA)

Ditimbang sebanyak 37 g bubuk Mueller Hinton Agar (MHA),

ditambahkan 1000 mL aquades, kemudian dihomogenkan dengan menggunakan

magnetik stirer dan dipanaskan di atas hot plate. Medium disterilisasi dalam

autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Suciatmih, 2008).

3.10.3 Peremajaan Bakteri Uji

Peremajaan terhadap bakteri S.aureus,E.coli, H.pylori , dan P.aeruginosa.

dapat menggunakan medium nutrient agar (NA). Medium NA steril dituangkan

ke dalam tabung reaksi sebanyak ± 5 mL. Medium NA didinginkan pada suhu

ruang dengan posisi miring hingga memadat. Diambil satu ose bakteri uji dari

stok kultur, dioleskan secara zig-zag pada media NA miring dan diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 37°C (Leboffe,Michael J. and Burton E. Pierce, 2010).

23


3.10.4 Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri dibiakan dengan cara di inkubasi dengan nutrien agar miring

selama 24 jam pada suhu 37°C, kemudian diambil dengan ose dan disuspensikan

dengan cara dimasukan kedalam tabung berisi 3 mL NaCl fisiologis 0,9% lalu

divortex sampai homogen dan dilihat kekeruhannya yang menandai bahwa ada

pertumbuhan bakteri, kekeruhan disetarakan dengan Mc. Farland no. III yaitu

setara dengan 109 sel bakteri/mL. Kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis

0,9% steril sampai diperoleh konsentrasi 106 sel bakteri/mL (Kuete,2011).

Penggunaan konsentrasi 106 sel bakteri/mL pada suspensi bakteri berdasarkan

kerentanan anaerobik yaitu 106 – 10

4 (pokyni,2010).

3.10.5 Pembuatan Larutan Uji

Larutan uji ekstrak n-heksan, etil asetat dan metanol kapang endofit dari

daun kayu jawa (Lannea Coromandelica), dibuat dengan cara menimbang ekstrak

n-heksan, etil asetat dan metanol dan dilarutkan dalam pelarutnya masing-masing.

3.11 Uji Aktivitas Antibakteri dengan menggunakan difusi cakram

Uji aktivitas antibakteri dilakukan dalam LAF dengan metode difusi

cakram dalam kondisi aseptis. Larutan uji yaitu ekstrak isolat kapang diserapkan

sebanyak 20 μL pada kertas cakram steril dengan konsentrasi 1000 µg/ml.

Cakram yang sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan medium uji.

Kontrol positif yang digunakan pada uji aktivitas antibakteri yaitu menggunakan

cakram kloramfenikol 30 µg. Kontrol negatif yang digunakan yaitu masing-

masing pelarutnya. Bakteri uji diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35°C,

Suspensi bakteri uji dimasukan kedalam cawan petri secara aseptis kemudian

ditambahkan medium agar MHA yang telah disterilkan sebanyak 10 ml kemudian

cawan petri digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi bakteri yang

tersebar merata pada medium MHA (Rachmayani, 2008).

24


3.12 Pengamatan dan Pengukuran Zona Hambat

Cawan petri diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam.

Zona hambat antibakteri diamati berdasarkan diameter hambat yang ditunjukkan

dengan daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dan diukur

dengan menggunakan jangka sorong. Lalu hasil pengukuran dicatat. Pengujian

aktivitas antibakteri dilakukan duplo. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam masa

inkubasi. Daerah bening merupakan petunjuk kepekaan bakteri terhadap antibiotik

atau bahan antibakteri lainnya yang digunakan sebagai bahan uji yang dinyatakan

dengan lebar diameter zona hambat (zona bening) (Vandepitte et al., 2005).

Kemudian diameter zona hambat tersebut dikategorikan kekuatan daya

antibakterinya berdasarkan penggolongan Davis and Stout (1971)

Menurut Davis and Stout (1971), kriteria kekuatan daya antibakteri

sebagai berikut : diameter zona hambat 5 mm atau kurang dikategorikan lemah,

zona hambat 5-10 mm dikategorikan sedang, zona hambat 10-20 mm.

3.13. Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak Kapang Endofit

Yang Berpotensi

Analisis fitokimia merupakan analisis kualitatif yang dilakukan untuk

mengetahui komponen bioaktif yang terkandung dalam daun kayu jawa dan

membandingkannya dengan ekstrak yang berpotensi sebagai antibakteri dari

ekstrak isolat daun kayu. Tujuan dilakukannya skrining fitokimia ini adalah untuk

melihat apakah senyawa metabolit sekunder yang dikandung oleh tanaman

induknya akan sama dengan kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada

kapang endofitnya, Analisis fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid,

saponin, terpenoid dan steroid, flavonoid, tanin dan polifenol.

25


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak

isolat kapang endofit terhadap beberapa bakteri patogen. Sampel tanaman yang

digunakan adalah daun Kayu jawa yang diperoleh dari diperoleh dari daerah

Watampone, Kabupaten Bone, Sulawesi Selatan. Tanaman ini telah banyak

digunakan secara tradisional untuk mengobati berbagai penyakit. Menurut

Strobel, & Daisy (2003), salah satu kriteria tanaman yang dapat dipilih untuk

menghasilkan kapang endofit adalah tanaman yang memiliki sejarah etnobotani

seperti digunakan dalam pengobatan tradisional. Secara empiris, daun Kayu jawa

digunakan untuk mengobati penyakit diare, muntah, tukak peptik, dan luka bakar

(Beknal et al., 2010).

Secara garis besar penelitian ini terbagi menjadi beberapa tahap, yaitu

tahap isolasi dan pemurnian kapang endofit dari sampel tanaman, tahap

karakterisasi isolat kapang endofit, tahap fermentasi kapang endofit, tahap

ekstraksi senyawa metabolit sekunder kapang endofit, dan pengujian aktivitas

antibakteri dari ekstrak hasil fermentasi kapang endofit.

4.1 Determinasi Tanaman

Tanaman kayu jawa Lannea coromandelica (Houtt.)Merr. yang digunakan

dalam penelitian ini diambil dari Bone-Sulawesi selatan dan telah dilakukan

determinasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Pusat Konservasi

Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Hasil determinasi menunjukan bahwa sampel

tanaman yang digunakan adalah Lannea coromandelica (Houtt) Merr., suku

Anacardiacceae. Hasil determinasi tanaman kayu jawa dapat dilihat pada lampiran

2 halaman 47.

4.2 Penyiapan Sampel

Sampel daun dikemas dalam tempat terpisah dari akar dan batang. Daun

dipilih yang masih hijau, belum terdapat cacat dan dikirim dalam satu tangkai

utuh agar bisa divariasikan. dikirim sudah dalam kondisi bersih pada tanggal 6

oktober 2015 tiba 8 oktober 2015.

26


Daun tersebut diambil dari berbagai bagian yang berbeda, yaitu: daun

bagian atas yang terdapat di bawah daun pucuk, daun bagian tengah, dan daun

bagian bawah dekat dengan percabangan batang. Perbedaan bagian dalam

pengambilan sampel ini bertujuan agar kapang endofit yang dihasilkan lebih

banyak dan memberikan hasil yang beraneka ragam. Sampel selanjutnya

dibersihkan dari debu, tanah, dan pengotor-pengotor lain dengan menggunakan air

bersih mengalir lalu permukaan daun dilakukan sterilisasi permukaan.

Gambar 2. Sampel daun Lannea Coromandelica

a. Bagian tua daun (DT)

b. Bagian muda daun (DM)

c. Bagian pucuk daun (DA)

a

C b

27


4.3 Isolasi dan Pemurnian Kapang Endofit

Isolasi kapang endofit diawali dengan proses sterilisasi permukaan. Proses

ini dilakukan untuk menghilangkan mikroorganisme yang berada pada permukaan

tanaman sehingga koloni yang tumbuh pada media isolasi merupakan koloni

endofit (Strobel, & Daisy, 2003). Daun bagian pucuk, muda dan tua kemudian

dicuci dibawah air mengalir selama 10 menit. Tujuan pencucian dengan air

mengalir adalah untuk menghilangkan debu dan kotoran yang menempel pada

permukaan daun (Hafsari dan Asterina, 2013). Masing-masing daun kemudian

direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit, larutan NaOCl 5,25% selama 5

menit, etanol 70% selama 30 detik dan terakhir dibilas dengan akuades steril

selama 3-5 detik. Proses sterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% dan

larutan NaOCl 5,25% sebagai desinfektan. Etanol dan natrium hipoklorit yang

digunakan memiliki aktivitas yang berbeda. Etanol mendenaturasikan protein

dengan mendehidrasi dan menginaktifkan enzim (Rutala et al, 2008). Efek

bakterisida dari etanol 70% lebih baik dibandingkan etanol murni, karena protein

didenaturasi lebih cepat dengan adanya air (Rutala et al., 2008). Natrium

hipoklorit merupakan senyawa yang mengandung klorin yang bekerja dengan

mengoksidasi secara irreversible gugus sulfihidril pada enzim dan menganggu

fungsi metabolik dari sel bakteri (Valera, 2008; Rutala et al., 2008). Pembilasan

dengan aquades steril dilakukan untuk membersihkan mikroorganisme yang mati

oleh desinfektan (Hafsari dan Asterina, 2013) dan untuk menghilangkan sisa

etanol dan natrium hipoklorit yang masih menempel pada daun yang dapat

mengganggu pertumbuhan kapang (Kumala, 2014). Aquades bilasan terakhir ini

digunakan sebagai kontrol untuk mengetahui dan menentukan apakah kapang

yang tumbuh merupakan kapang endofit atau bukan. Jika pada media kontrol

terdapat pertumbuhan kapang, maka kapang yang tumbuh dari isolasi daun

bukanlah kapang endofit. Media yang digunakan untuk isolasi dan pemurnian

kapang endofit adalah media PDA (Potato Dextrose Agar). Media ini bersifat

selektif terhadap kapang dan mengandung kentang sebagai sumber karbohidrat

yang merupakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan kapang (Ariyono et al , 2014).

28


Daun kayu jawa diisolasi dari tiga variasi daun yaitu daun pucuk, daun

muda dan daun tua dengan media potato dextrose agar. Tujuannya dilakukan

variasi adalah agar mendapatkan kapang endofit yang beranekaragam

Tabel 1 Hasil Isolasi dari Variasi Daun Kayu Jawa

Isolasi Daun Tua (DT)

Isolasi Daun Pucuk (DA)

DA1

DA2

DA3

Isolasi daun Muda (DM)

DM1

DM2

DM3

Hasil isolasi menunjukan dari ketiga variasi daun pada daun tua tidak ada

kapang endofit yang tumbuh, akan tetapi melihat ciri-ciri secara makroskopik

yang tumbuh pada isolasi daun tua adalah khamir, karena pada isolasi

menggunakan media PDA sangat dimungkinkan tumbuh kapang dan khamir. Pada

daun pucuk dan daun muda tumbuh kapang dilihat dari bentuk dan ciri-ciri secara

makroskopik dan mikroskopik, kemudian dilakukan proses pemurnian dimana

kapang endofit dari daun muda dan pucuk yang sama secara makroskopik dan

mikroskopik dianggap satu jenis.

29


Tabel 2. Hasil Pemurnian Kapang Endofit Daun Kayu Jawa

Sampel Bagian Daun Jumlah Isolat Kode Isolat

Daun Lannea

coromandelica

Houtt.(Merr.)

Daun dekat dengan

percabangan batang

[Daun Tua] (DT)

-

-

Daun bagian tengah/

Daun Muda (DM)

2

DM1K

DM2K

Daun bagian atas atau

pucuk daun (DA)

2

DA2K

DA3K

Pemurniaan dilakukan berdasarkan morfologi kapang secara mikroskopik

dan makroskopik (Ariyono, 2014). Setiap bentuk, warna, dan karakteristik yang

berbeda dari kapang, ditumbukan dalam satu cawan. Pemurnian dilakukan

berulang kali sehingga diperoleh satu isolat kapang murni.

Hasil dari pemurniaan ditanaman kembali dalam media PDA miring

sebagai stok kultur dan kultur kerja. Stok kultur digunakan sebagai persediaan

yang dapat diremajakan kembali yang diimpan dalam lemari pendingin,

sedangkan stok kerja digunakan untuk kelanjutan pekerjaan. Dari dua kali proses

isolasi dan pemurniaan didapatkan 4 isolat kapang endofit, tabel 2 menunjukan

bahwa kapang endofit dari daun kayu jawa ditemukan pada bagian pucuk dan

daun muda.

4.4 Karakterisasi Isolat Kapang Endofit

Karakterisasi kapang endofit dilakukan terhadap 4 isolat yang diperoleh,

pengamatan karakteristik makroskopik yang dilakukan dengan mengamati warna

koloni, warna sebalik, permukaan koloni (granular, seperti tepung, menggunung,

licin ada atau tidak tetes eksudat), diameter pertumbuhan koloni kapang dan

lingkaran-lingkaran konsentris (Kumala, 2014). Sedangkan pengamatan

karakteristik secara mikroskopik meliputi ada atau tidaknya sekat pada hifa,

pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak bercabang), ada tidaknya konidia, dan

bentuk konidia (Ariyono,2014). Diperoleh 4 isolat, yaitu isolat DA2K, DA3K,

DM1K, DM2K. .

30


4.4.1 Isolat DA2K

Permukaan koloni kapang abu-abu tua dan bagian pinggir berwarna putih

permukaan kapang bergelombang tidak rata, dan dengan diameter 7,5 cm pada

pertumbuhan hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan bagian

pinggir berwarna putih. Secara mikroskopik koloni kapang ini memiliki hifa yang

bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan memiliki konidia

bentuk bulat.

(a) (b)

(c)

Gambar 3. Isolat DA2K secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat DA2K umur 12 hari tampak depan

(b) Isolat DA2K umur 12 hari tampak sebalik

(c) Pengamatan pada mikroskop cahaya perbesaran 1000x

31


4.4.2 Isolat DA3K

Permukaan koloni kapang coklat tua agak kehitaman dan bagian pinggir

berwarna hitam permukaan kapang rata atau tidak bergelombang dan dengan

diameter 5,5 cm pada hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam

dan bagian pinggir berwarna hitam. Secara mikroskopis koloni kapang ini

memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan

tidak memiliki konidia.

(a) (b)

(c)

Gambar 2. Isolat DA3K secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat DA3K umur 12 hari tampak depan

(b) Isolat DA3K umur 12 hari tampak sebalik


32


4.4.3 Isolat DM1K

Permukaan koloni kapang coklat tua agak kehitaman dan bagian pinggir

berwarna hijau tua permukaan kapang pinggir kapang bergelombang dan dengan

diameter 8 cm pada hari ke 12. Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu hitam dan

bagian pinggir berwarna hitam. Secara mikroskopis koloni kapang ini memiliki

hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang ini bercabang dan memiliki

konidia

(a) (b)

(c)

Gambar 5. Isolat DM1K secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat DM1K umur 12 hari tampak depan

(b) Isolat DM1K umur 12 hari tampak sebalik


33


4.4.4 Isolat DM2K

Permukaan koloni kapang berwarna putih seperti kapas dan bagian pinggir

berwarna putih permukaan kapang rata dan diameter 8,4 cm pada hari ke 12.

Warna sebaliknya dari kapang ini yaitu putih kekuningan. Secara mikroskopis

koloni kapang ini memiliki hifa yang bersekat dan pertumbuhan hifa pada kapang

ini bercabang dan tidak memiliki konidia

(a) (b)

(c)

Gambar 6. Isolat DM2K secara makroskopik dan mikroskopik

(a) Isolat DM2K umur 12 hari tampak depan

(b) Isolat DM2K umur 12 hari tampak sebalik


34


4.5 Fermentasi

Fermentasi dilakukan untuk mendapatkan metabolit sekunder yang dihasilkan

oleh kapang (Stanbury dkk, 2003). Sebelum fermentasi dilakukan, kemurniaan

kapang benar dipastikan, dan penyiapan fermentasi dilakukan secara aseptis

sehingga terhindar dari kontaminan (Okafor, 2007).

Proses fermentasi berlangsung selama 21 hari yang dinilai bahwa kapang

sudah melewati masa stationer yang menjadi fase penghasil metabolit sekunder

(Stanbury dkk,2003). Ciri dari fase stationer adalah pertumbuhan kapang tetap,

karena terjadi kematian sel yang diikuti pembentukan sel baru (Pratiwi, 2008)

Proses fermentasi kapang endofit menggunakan media Potato Dextrose Yeast

broth (PDY broth) sebanyak 250 mL, Kandungan PDY broth sama dengan PDA

yang digunakan saat peremajaan, tapi berbentuk cair karena tanpa menggunakan

agar. Media Potato Dextrose Yeast (PDY) terdiri dari kentang, dan dextrose

sebagai sumber karbon, serta yeast ekstrak sebagai sumber nitrogen yang

membantu dalam proses fermentasi (Kumala, & Pratiwi, 2014). Proses fermentasi

dilakukan selama 21 hari pada suhu ruang secara statis (Phongpaichit et al.,2006).

Proses fermentasi mengunakan media PDY yang berupa media cair karena

fermentasi dengan media cair lebih efektif untuk memproduksi biomassa dan

lebih mudah dikerjakan secara aseptis (Pokhrel & Ohga, 2007).

Kapang endofit tumbuh di permukaan media fermentasi cair, media

fermentasi berubah seiring dengan pertumbuhan kapang endofit. Selama proses

fermentasi terjadi perubahan warna pada media. Hal ini diduga adanya metabolit

sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit. Menurut Gandjar et al. (2006),

pertumbuhan kapang endofit dapat diketahui dari penambahan masa sel dan

proses metabolisme kapang yang menyebabkan timbulnya perubahan warna pada

media cair. Metabolit sekunder yang dihasilkan dengan proses statis dapat

diekstraksi dari biomassa miselium dan bagian media (Pokhrel & Ohga, 2007).

35


4.6 Ekstraksi Hasil Fermentasi Kapang Endofit

Hasil fermentasi diekstraksi dengan dua metode yaitu partisi untuk filtrat

dan maserasi untuk biomassanya, ekstraksi dilakukan untuk memisahkan senyawa

metabolit sekunder yang dihasilkan dari fermentasi berdasarkan kepolarannya

(Kumala, 2014), Hasil fermentasi setelah 21 hari dari masing-masing isolat

dipisahkan bagian biomassa dan Media pertumbuhan dengan menggunakan kertas

saring untuk dilakukan proses ekstraksi. Bagian biomassa dihaluskan dengan

lumpang dan alu kemudian dilakukan maserasi dengan pelarut metanol, kemudian

saring dan ambil filtrat kemudian pekatkan dengan vacum rotary evaporator

hasilnya adalah ekstrak kental fraksi metanol. Bagian kedua filtrat yang diperoleh

dari koloni kapang diekstraksi dengan cara partisi bertingkat dengan n-heksan dan

etil asetat yang kemudiaan juga dipekatkan dengan vacum rotary evaporator

hasilnya adalah ekstrak kental fraksi n-heksan dan ekstrak kental etil asetat.

Tabel 3. Hasil perolehan berat ekstrak isolat kapang endofit

Isolat Kapang

Endofit

Biomassa Media Fermentasi kapang

Ekstrak Metanol Ekstrak n-

Heksan

Ekstrak Etil

asetat

DA2K 440 mg 120 mg 210 mg

DA3K 330 mg 60 mg 530 mg

DM1K 660 mg 138 mg 260 mg

DM2K 210 mg 140 mg 99 mg

Ekstraksi dilakukan dengan tujuan untuk menarik senyawa metabolit

sekunder hasil fermentasi yang terdapat dalam isolat kapang endofit. Proses

ekstraksi bagian biomassa dilakukan dengan cara ekstraksi secara dingin yaitu

dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol. Maserasi merupakan

metode ekstraksi yang sederhana dengan merendam bahan dengan pelarut selama

beberapa hari pada temperatur ruang dan terhindar dari cahaya matahari

(Damayanti dan Fitriani, 2012). Keuntungan metode ini adalah peralatan yang

36


digunakan sederhana (Damayanti dan Fitriani, 2012). Bagian biomassa

dihancurkan terlebih dahulu menggunakan lumpang dan alu agar struktur sel

pecah sehingga memudahkan zat aktif terekstraksi oleh pelarut. Ukuran yang

semakin kecil akan meningkatkan luas permukaan sehingga proses ekstraksi akan

semakin efektif (Handa et al., 2008). Metanol dan golongan alkohol merupakan

pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan (Harbone, 2006)

Proses maserasi dilakukan berulang kali hingga tidak terdapat lagi

senyawa yang tertarik oleh pelarut yang ditandai dengan warna pelarut menjadi

bening. Maserat yang didapat kemudian dipekatkan menggunakan rotary

evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental metanol kapang endofit.

Bagian media yang telah dipisahkan dari biomassa dilakukan partisi cair-

cair. Metode ini merupakan pemisahan komponen kimia diantara dua fase pelarut

yang tidak saling bercampur. Komponen kimia akan terpisah ke dalam kedua fase

sesuai dengan tingkat kepolarannya (Gu, 2000). Setiap isolat dilakukan partisi

bertingkat dilakukan menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Hasil partisi

diperoleh fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat. Masing-masing fraksi kemudian

dipekatkan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental n-

heksana dan ekstrak kental etil asetat.

Fraksi ekstrak hasil maserasi dan partisi yang sudah diuapkan dengan

rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental kemudian ekstrak disimpan

dalam vial tertutup di lemari pendingin untuk menjaga kondisi ekstrak. Ekstrak

hasil ekstraksi dapat di lihit di lampiran 13.

Kemudian masing-masing ekstrak dielusi menggunakan kromatografi lapis

tipis (KLT) untuk mengetahui spot senyawa. Tabel 4 memperlihatkan perbedaan

spot serta eluen yang digunakan, hal ini menunjukan bahwa senyawa yang

terkandung dalam setiap ekstrak isolat tidak sama persis.

37


Tabel 4. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Kapang Endofit

NO Isolat Metanol Etil Asetat N-Heksan

KLT Eluen KLT Eluen KLT Eluen

1

DA2K

M:EA

8:2

EA:NH

5:5

NH: M

5:5

2

DA3K

M:EA

8:2

EA:M

5:5

NH:M

5:5

3

DM1K

M:EA

8:2

EA:M

5:5

NH:M

3:7

4

DM2K

M:EA

8:2

EA:NH

8:2

NH:M

3:7

38


4.7 Uji Kemurnian Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji secara mikroskopik dilakukan dengan metode

pewarnaan Gram, uji kemurniaan bakteri uji dilakukan untuk memastikan bakteri

yang akan digunakan dalam pengujian antibakteri. Hasil pewarnaan gram akan

memperlihatkan perbedaan antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif.

Gram positif akan berwarna ungu sedangkan gram negatif berwarna merah.

Terdapat empat bakteri yang digunakan sebagai bakteri uji, yaitu Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori Dan Pseudomonas aeroginosa.

Table 5. Hasil Uji Kemurnian Bakteri Uji secara Mikroskopik

No. Bakteri Uji Gambar Mikroskopik

1 Staphylococcus

aureus

ATCC 25923

Merupakan bakteri Gram

positif dengan membentuk

warna ungu, sel berbentuk

kokus dan berkelompok

seperti buah anggur.

2 Escherichia

coli

ATCC 25922

Bakteri Gram negatif

dengan warna merah,

berbentuk batang tunggal.

3 Helicobacter

pylori

ATCC 43504

Merupakan bakteri Gram

negatif dengan membentuk

warna merah, sel berbentuk

batang agak pendek

4 Pseudomonas

aeroginosa

ATCC 27853

Merupakan bakteri gram

negatif dengan membentuk

warna merah

39


Perbedaan warna yang terjadi disebabkan oleh adanya perbedaan struktur

pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung

peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung

lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakeri

Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan

yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif alkohol akan

merusak lapisan lipopolisakarida sehingga kompleks kristal violet-iodin dapat

tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna

merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).

4.8 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kapang Endofit Metode Difusi

Cakram

Empat fraksi ekstrak dari 4 isolat kapang endofit kayu jawa diujikan

aktivitas antibakterinya terhadap Escherichia coli, Helicobacter pylori Dan

Pseudomonas aeroginosa, empat fraksi tersebut yaitu fraksi metanol kapang

endofit dan fraksi air fermentasi yang di partisi dengan N-heksan dan etil asetat.

Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kapang endofit dilakukan dengan

menggunakan metode difusi cakram. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan

menggunakan bakteri uji yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Helicobacter pylori, dan Pseudomonas aeroginosa. Bakteri yang digunakan

karena bersifat patogen dan dapat menyebabkan terjadinya suatu penyakit, selain

itu juga bakteri uji yang digunakan juga mewakili bakteri Gram negatif

(Eschericia coli, Helicobacter pylori dan Pseudomonas aeroginosa ) dan bakteri

Gram positif (Staphylocccus aureus). Pengujian dilakukan dengan konsentrasi

1000 µg/ml, kemudian masing-masing ekstrak uji diserapkan ke dalam blank disk

yang berdiameter 6 mm sebanyak 20 µl dengan menggunakan mikropipet,

diresapkan pada tempat yang berbeda tidak secara langsung diatas permukaan

media hingga cakram kering. Hal ini bertujuan untuk mencegah pelarut ekstrak

memberikan zona hambat. Pengujian antibakteri menggunakan metode pour plate

dan kemudiaan diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37oC

setelah itu diamati zona bening disekitar cakram disk kemudian diukur dengan

menggunakan jangka sorong.

40


Tabel 6. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen

Isolat

Fraksi Uji

Rata-rata diameter zona hambat (mm)

S.aureus E.coli H.pylori P. aeroginosa

DA2K

Metanol 8,2 mm - - 7,0 mm

n-Heksan - - - 8,1 mm

Etil Asetat - - - 7,9 mm

Air - - - -

DA3K

Metanol 7,1 mm - - -

n-Heksan 7,7 mm - - -

Etil Asetat - - - -

Air - - - -

DM1K

Metanol 8,4 mm 8,1 mm 8,7 mm 7,2 mm


Etil Asetat - 8,2 mm 7,6 mm 7,6 mm

Air - - - -

DM2K

Metanol 7,9 mm 7,7 mm - 7,5 mm


Etil Asetat 8,2 mm 7,9 mm - 7,1 mm

Air - - - -

Kloramfenikol 26,1 mm 25,2 mm 24,2 mm 22,6 mm

Kontrol (-) - - - -

Keterangan : (-) = tidak ada aktivitas antibakteri

Pada uji aktivitas antibakteri ini dilakukan pengujian dua fraksi uji yaitu

fraksi metanol kapang endofit dan fraksi air yang dipartisi bertingkat dengan n-

Heksan dan etil asetat. Hasil pengujian aktivitas antibakteri menunjukan bahwa

dari 16 fraksi ekstrak, fraksi metanol kapang DA2K memiliki aktivitas terhadap

pertumbuhan Staphylococcus aureus sebesar 8,2 mm dan Pseudomonas

aeroginosa sebesar 7,0 mm, Fraksi metanol DA3K memiliki aktivitas terhadap

pertumbuhan Staphylococcus aureus sebesar 7,1 mm, Fraksi metanol DM1K

memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan semua bakteri uji, dan fraksi metanol

DM2K memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan S.aureus sebesar 7,9 mm, E.coli

41


sebesar 7,7 mm dan P.aeroginosa sebesar 7,5 mm. Hal ini terjadi diduga karena

perbedaan kemampuan senyawa yang terkandung dalam fraksi metanol kapang

endofit untuk berdifusi kedalam sel bakteri dan menimbulkan penghambatan

pertumbuhan (Rifda, dkk. 2005).

Pengujian pada fraksi air bertujuan untuk melihat adanya eksudat yang

mengandung senyawa metabolit sekunder yang tidak sengaja keluar dan jatuh

kedalam media fermentasi. Pada fraksi n-Heksan DA2K memiliki aktivitas

terhadap pertumbuhan P.aeroginosa, Fraksi n-Heksan DA3K dan DM1K

memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan P.aeroginosa dan fraksi DM2K

memiliki aktivitas terhadap Staphylococcus aureus.

Fraksi ekstrak etil asetat DA2K memiliki aktivitas terhadaap pertumbuhan

P.aeroginosa sebesar 7,9 mm. Fraksi ekstrak etil asetat DA3K tidak memiliki

aktivitas terhadap pertumbuhan bakteri. Fraksi ekstrak etil asetat DM1K memiliki

aktivitas terhadap pertumbuhan E.coli, H.pylori dan P.aeroginosa dan fraksi

ekstrak DM2K memiliki aktivitas terhadap pertumbuhan S.aureus,E.coli dan

P.aeroginosa

Pada semua fraksi air tidak terbentuk zona hambat terhadap semua bakteri

uji, hal ini disebabkan karena pada fraksi air dimungkinakan sudah tidak ada lagi

kandungan metabolit yang tertinggal di dalamnya.

Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut fraksi yaitu n-heksan, etil

asetat, dan metanol. Natheer et al (2012) menyebutkan bahwa zat yang dijadikan

sebagai kontrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pelarut uji.

Tujuannya adalah sebagai pembanding bahwa pelarut yang digunakan tidak

mempengaruhi hasil uji antibakteri fraksi. Hasil uji difusi cakram menunjukkan

bahwa tidak adanya zona hambat yang terbentuk pada kontrol negatif. Hal ini

mengindikasikan bahwa pelarut yang digunakan tidak berpengaruh terhadap

aktivitas antibakteri fraksi.

Kontrol positif yang digunakan adalah cakram disk kloramfenikol 30 µg.

Kloramfenikol dipilih karena merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat

menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun Gram

negatif. Kloramfenikol memberikan efek dengan cara bereaksi pada sub unit 50S

ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini berfungsi

42


untuk membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat

pada tRNA dengan asam amino terakhir yang sedang berkembang. Sebagai

akibatnya, sintesis protein bakteri akan terhenti seketika dan menyebabkan bakteri

mati (Pratiwi, 2008).

Hasil pengujian menunjukkan bahwa hampir semua penghambatan bakteri

dengan zona hambat yang luas ditunjukkan oleh fraksi ekstrak yang bersifat polar

dan semipolar. Menurut Kanazawa et al (1995), suatu senyawa yang mempunyai

polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antibakteri maksimum, karena untuk

interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan

hidrofilik dan lipofilik. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa larut

dalam fase air yang merupakan tempat hidup bakteri, tetapi senyawa yang bekerja

pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik sehingga senyawa

antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik dan lipofilik untuk mencapai

aktivitas yang optimal, dan penghambatan pertumbuhan bakteri lebih banyak

menghambat bakteri gram positif yang diwakili oleh Staphylococcus aureus.

Bakteri gram positif memang memiliki sensitifitas lebih besar terhadap senyawa

kimia daripada bakteri gram negatif (Pratiwi, 2008).

Hasil pengujian juga menunjukkan bahwa penghambatan pertumbuhan

yang terbentuk pada E.coli, H.pylori dan P.aeroginosa (gram negatif) lebih sedikit

dibandingkan dengan S.aureus (gram positif). Hal ini menunjukkan bahwa E.coli

dan H.pylori lebih tahan terhadap senyawa antibakteri dibandingkan S.aureus .

Hal ini sesuai dengan pernyataan Zuhud et al. (2001) bahwa bakteri Gram negatif

mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap senyawa antibakteri dibandingkan

bakteri Gram positif. Perbedaan ketahanan hambatan mungkin dikarenakan

perbedaan susunan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai lapisan dinding

sel yang lebih kompleks dibandingkan bakteri gram positif (Natheer et al, 2012).

Hasil pengujian antibakteri menunjukan bahwa ekstrak metanol, n-Heksan

dan etil asetat masing-masing membentuk zona hambat pada pertumbuhan bakteri

uji. Ekstrak metanol DM1K menunjukan hasil pengujian yang paling potensial

dibandingkan dengan fraksi lain, karena ekstrak metanol DM1K mampu

memberikan zona hambar pada keempat bakteri uji. Ekstrak etil asetat menyusul

peringkat kedua terbanyak sebagai penghambatan antibakteri, lalu n-Heksan. Hal

43


ini membuktikan bahwa mayoritas metabolit yang dihasilkan kapang endofit saat

fermentasi tetap berada di dalam sel kapang endofit walaupun ada juga yang

terlarut di dalam medianya, meskipun tanpa ada proses pengocokan. Selain itu,

kelarutan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antibakteri diberikan oleh

senyawa yang larut dalam pelarut polar dan semipolar.

4.9 Penapisan Fitokimia Daun Kayu Jawa dan Ekstrak Kapang Endofit

Dengan Zona Hambat Besar

Pada penelitian ini skrining fitokimia dilakukan terhadap daun yang yang

masih segar dan ekstrak kapang endofit yang memiliki zona hambat besar

terhadap bakteri patogen. Hal ini dilakukan untuk melihat apakah senyawa

metabolit sekunder yang dikandung oleh tanaman induknya akan sama dengan

kandungan metabolit sekunder yang terdapat pada kapang endofitnya. Hasil

penapisan fitokimia daun kayu jawa ekstrak kapang endofit dengan zona hambat

besar adalah sebagai berikut :

Tabel 7. Penapisan fitokimia daun dan ekstrak yang berpotensi

Metabolit Sekunder Daun Kayu Jawa Ekstrak Metanol DM1K

Alkaloid - -

Saponin - -

Glikosida + +

Tanin + -

Flavonoid + +

Fenol + -

Triterpenoid + -

Keterangan : (+) = Mengandung Metabolit. (-) = Tidak Mengandung Metabolit

Hasil penapisan fitokimia ekstrak metanol DM1K (pelarut polar)

menunjukkan hasil positif pada pengujian terhadap Flavonoid dan glikosida.

Flavonoid merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoid larut dalam

pelarut polar seperti metanol, etanol, butanol dan air (Harborne, 1987; Markham,

1988), Keefektifan flavonoid sebagai antibakteri juga sudah banyak dilaporkan.

Flavonoid beraktivitas sebagai antibakteri melalui penghambatan sintesis asam

nukleat, penghambatan fungsi membran sitoplasma, dan penhambatan

44


metabolisme energi (Chusnie dan Lamb, 2005). Glikosida adalah senyawa polar

yang keberadaannya dapat di ekstraksi dengan pelarut semi polar dan polar

(Oesman dkk. 2010), mekanisme kerja glikosida sebagai antibakteri adalah

merusak membran sel, rusaknya membran sel menyebabkan substansi intisel

keluar dari sel dan dapat juga mencegah masuknya bahan-bahan penting masuk

kedalam sel, jika fungsi membran sel dirusak maka akan mengakibatkan kematian

sel (Monalisa dkk, 2011).

Hal ini membuktikan bahwa kandungan kimia yang berasal dari daun kayu

jawa juga berada pada isolat kapang kapang endofit, ini dimungkinkan karena

terjadi proses interaksi antara kapang endofit yang hidup dalam jaringan tanaman

dengan tanaman daun kayu jawa tersebut, sehingga kandungan kimia yang berasal

dari tanaman induknya akan sama dengan kapang endofit yang berasal dari

tanaman tersebut, ini sesuai dengan penyataan strobel dan daisy (2003) bahwa

setiap tumbuhan tingkat tinggi dapat mengandung mikroba endofit yang mampu

menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang sama dengan

tumbuhan inangnya akibat koevolusi atau transfer genetik dari tumbuhan

inangnya ke dalam mikroba endofit dan ini merupakan peluang untuk

mendapatkan sumber bahan baku obat yang alami murah dan ramah terhadap

lingkungan.

45


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Diperoleh 4 isolat kapang endofit yang diisolasi dari pucuk daun dan daun

muda dari tanaman kayu jawa Lannea coromandelica (Houtt.) Merr. Yaitu

kapang endofit isolat DA2K, DA3K, DM1K, DM2K.

2. Isolat kapang endofit paling potensial dibandingkan isolat lain pada pengujian

aktivitas antibakteri ini adalah isolat DM1K. Hasil pengujian aktivitas

antibakteri 16 fraksi terhadap bakteri uji menunjukan bahwa terdapat 8 fraksi

ekstrak yang berpotensi menghambat pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus

aureus, 4 fraksi berpotensi menghambat pertumbuhan Escherichia coli,2 fraksi

berpotensi menghambat pertumbuhan Helicobacter pylori, dan 7 fraksi

berpotensi menghambat pertumbuhan Pseudomonas aeroginosa.

5.2 Saran

1. Perlu penelitiaan lebih lanjut tentang isolasi senyawa aktif sebagai antibakteri

dari ekstrak isolat kapang endofit, Terutama pada isolat DM1K fraksi metanol

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi kapang endofit

untuk mengetahui spesiesnya.

3. Perlu penelitiaan lebih lanjut terhadap ekstrak isolat kapang daun kayu jawa

(Lannea coromandelica) tidak hanya sebagai antibakteri, tetapi antimikroba

lainnya.

4. Melakukan optimasi dalam proses fermentasi baik waktu, medium maupun

perlakuan fermentasi (statis atau shaker), sehingga dapat menarik senyawa-

senyawa yang berfungsi sebagai antibakteri.

45

46


DAFTAR PUSTAKA

Atika, Dian. 2007. Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapang

Endofityang Diisolasi dari Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fruticosa

Lauterb dan Garcinia latriflora Blume serta Akar dan Daun Tanaman

Garcinia cowa Roxb. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam. Universitas Indonesia: Depok

Atlas, R.M., A.E. Brown, K.W. Dobra and L. Miller. 1984. Experimental

Microbiology : Fundamentals and Applications. Collier Macmillan

Publishers. London

Avinash Kumar Reddy Lannea coromandelica: The Researcher’s Tree Journal of

Pharmacy Research 2011 ,4(3),577-579

Avinash Kumar Reddy. 2004. Harmacological investigations on the standardized

leaf extractsof Lannea coromandelica (Hout.) Merr. Journal Indian

Choma, I. M dan Grzelak, E. M., 2010. Bioautographic Detection in Thin-Layer

Chomatography. Journal of Chromatography A. Poland : Elsavier

Dwidjoseputro.1990. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Cetakan XI. Jakarta : Penerbit

Djambatan. Hal. 134.

Erwin, prawirodiharjo. 2014. Uji Aktivitas Antioksidan dan Toksisitas Ekstrak

Etanol 70% dan Ekstrak Air Kulit Batang Kayu Jawa (Lannea

coromandelica). Jurusan farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta.

Jawetz E. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran

EGC

Kumala Shirly, Erlita Agustina dan Priyo Wahyudi. 2006. Uji Aktivitas

Antimikroba Metabolit Sekunder Kapang Endofit Tanaman Trengguli

(Cassia fistula L). Jurnal Farmasi Indonesia. 3(2): 97-102

Kaitu, Sidharta, dan Atmojo. 2013. Aktivitas Antibakteri Fungi Endofit Jahe

Merah (Zingeber officinale var.rubrum) Terhadap Escherichia coli dan

Streptococcus pyogenes. Skripsi. Fakultas Teknobiologi. Universitas

Atmajaya:Yogyakarta

Kusumaningtyas, E., M. Natasia and Darmono. 2010. Potensi Metabolit Kapang

Endofit Rimpang Lengkuas Merah dalam Menghambat Pertumbuhan

Eschericia coli dan Staphylococcus aureus dengan Medium Fermentasi

Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY). Seminar

Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Hal : 821-824

47


Mariyanti, Ati. 2015. Isolasi dan Karakterisasi Kapang Endofit Dari Ranting

Tanaman Parijoto (Mednilla speciosa Reinw.Ex Blume) Dan Uji

Aktivitasnya Sebagai Antibakteri. Jurusan farmasi. Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta

Manik, M.A. Wahid, S.M.A. Islam, A. Pal, K.T. Ahmed. 2013. A Comparative

Study of the Antioxidant, Antimicrobial and Thrombolytic Activity of the

Bark and Leaves of Lannea coromandelica (Anacardiaceae). International

Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. Vol. 4(7): 2609-2614. E-

ISSN: 0975-8232; P-ISSN: 2320-5148.

Margino, Sebastian. 2008. Produksi Metabolit Sekunder (Antibiotik) oleh Isolat

Jamur Endofit Indonesia. Majalah Farmasi Indonesia. 19(2) : 86-94

Merlin, J.N., Nimal C., P. Praveen K., and P. Agastian. 2013. Optimization Of

Growth And Bioactive Metabolite Production: Fusarium solani. Asian

Journal Of Pharmaceutical And Clinical Research. 6 (3) : 98-103

Pelczar, Michel J. Jr dan E.C.S. Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi cetakan

kesatu. Penerjemah: Ratna Sri H, dkk. Jakarta: UI Press

Pleczar, Michael J and Chan, E.C.S. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2.

Terjemahan: Ratna Siri Hadioetomo,. et al. Jakarta UI Press

Petrini, O., P.J. Fisher, and L.E. Petrini. 1992. Fungal Endophytes of Bracken

(Pteridium aquilinum), with Some Reflections on Their Use in Biological

Control. Sydowia. 44 : 282-293

Phongpaichit S, Rungjindamai N, Rucachaisiriku V, Sakayaroj J. Antimicrobial

Activity in Cultures of Endophytic Fungi Isolated from Garcinia Species.

FEMS Immunol Med Microbiol. 2006. 48; 367-372.

Pokyni et al,. 2010. Prepared Turbidity Standard Mc Farland. USA

Pratiwi , Silvya. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga

Purwanto. 2011. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Penghambat Polimerisasi HEM

dari Fungi Endofit Tanaman Artemisia annuna L. Tesis. Fakultas Farmasi.

Universitas Gadjah Mada: Yogyakarta

Radji, Maksum. 2005. Peranan Biotekhnologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol II no 3:113-

126

Radji, M., Atiek S., Renita R., and Berna E. 2011. Isolation of Fungal Endophytes

from Garcinia mangostana and Their Antibacterial Activity. African

Journal of Biotechnology. 10 (1) : 103-107

Rahayu, Sunarti , S. Diah, P. Suhardjono. 2006. Pemanfaatan Tumbuhan Obat

secara Tradisional oleh Masyarakat Lokal di Pulau Wawonii, Sulawesi

Tenggara. Jurnal Biodiversitas Vol. 7 (3).

48


Rachmayani, Renita. 2008. Skrining Kapang Endofit Penghasil Antibakteri dan

Antioksidan dari Ranting dan Daun Tanaman Garcinia mangostana.

Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Indonesia : Depok

Rahmadani, fitri. 2015 Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Etanol 96% Kulit

Batang Kayu Jawa (Lannea Coromandelica) terhadap Bakteri

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas

aeruginosa. Jurusan farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN

Syarif Hidayatullah. Jakarta

Rajib Majumder, Md. Safkath Ibne Jami,Md. Efte Kharul Alam and Md. Badrul

Alam Antidiarrheal Activity of Lannea coromandelica Linn. Bark Extract

American-Eurasian Journal of Scientific Research 8 (3): 128-134, 2013

Strobel G, Microbial Gift from Rain Forest. Can J Plant Pathol. 2002; 24:14-20

Strobel, Gary & Bryn Daisy., Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their

Natural

Suciatmih. 2008. Isolasi, Identifikasi Skrining dan Optimasi Kapang Endofit

Penghasil Antimikroorganisme dari Dendrobium crumenatum Sw (Anggrek

Merpati). Skripsi. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Indonesia : Depok

Tan, R.X And W.X. Zou. 2001. Endophyte : A Rich Source Of Fungtional

Metabolite. Nat. Prod, Rep. 18 : 448-459

Valgas, C., de Souza, S. M., Smania, E. F., Smania, A. 2007. Screening Methode

to Determine Antimicrobial Activity of Natural Product. Brazillian Journal

of Microbiology. 34 : 369-380

Wahid Arif. In Vitro Phytochemical and Biological Investigation of Plant Lannea

coromandelica(Family: Anacardiaceae). Thesis to Department of

Pharmacy, East West University. Bangladesh

Wahyudi, P. Mikroba Endofitik Sebagai Penghasil Materi yang Bermanfaat.

Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. 1998; 1761/H/98:1- 9.

WHO. Overcoming Antimicrobial Resistance. Diakses dari: htttp://www.

who.int/infectious-disease-report/2000/ch1-5.htm;

Yulia, P. R. 2005. Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil pada Beberapa

Tanaman Obat Tradisional Indoneisa. Skripsi. Fakultas Matematika Dan

Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia : Depok

Yulianti, Titiek. 2012. Menggali Potensi Endofit untuk Meningkatkan Kesehatan

Tanaman Tebu Mendukung Peningkatan Produksi Gula. Perspektif. 11 (2) :

111 – 122

49


LAMPIRAN 1

BAGAN TAHAPAN PENELITIAAN

Sampel Tanaman

Sterilisasi Permukaan

Isolasi Kapang Endofit

Pemurniaan dan Peremajaan

Kapang endofit

Fermentasi dan Ekstraksi

Uji Aktivitas Antibakteri

50


LAMPIRAN 2

Surat Hasil Determinasi Tanaman kayu jawa (Lannea coromandelica)

LAMPIRAN 3

51


Tahapan Isolasi Kapang Endofit

Sampel Tanaman

Cuci Bersih Dengan Air Mengalir selama 10 Menit

Sterilisasi Permukaan

Tanam pada medium PDA, inkubasi selama 21 hari dalam suhu ruang

Pemurniaan Kapang endofit

Sampel

Alkohol 70% NaOCl 5,25% Alkohol 70% Akuades steril

1 menit 5 menit 30 detik 5 detik

Potong daun dengan ukuran 1x1 cm

52


LAMPIRAN 4

Tahapan permunian kapang endofit

Kapang endofit yang

tumbuh pada medium

isolasi

Isolat kapang yang

telah murni working culture dan stock culture

53


LAMPIRAN 5

Karakteristik Kapang

Hifa kapang ditanam

pada medium PDA

yang terletak pada

kaca objek

Kaca objek diletakkan

dalam petri steril

berisi sedikit air

Inkubasi pada suhu

ruang selama 7 hari

Tetesi dengan alkkohol

96%

Tetesi dengan larutan

metilen blue

Preparat diamati dengan

mikroskop

54


LAMPIRAN 6

Fermentasi dan Ekstraksi kapang endofit

Kapang yang telah murni Inokulasi kapang kedalam medium PDY

Inkubasi pada suhu ruang selama 21 hari

Ekstraksi

pisahkan

Saring dan pisahkan antara biomasa dan

medium kapang endofit dengan kertas saring Biomasa kemudiaan

dihaluskan, kemudian

ditambahkan metanol lalu

didiamkan dalam tempat

gelap selama 48 jam

Kemudiaan saring antara

biomasa dengan metanol

dengan menggunakan

kertas saring, dan

didapatkan maserat

Kemudiaan pekatkan

dengan menggunakan

vacum Rotary evaporator

Di dapatkan ekstrak kental

yang di gunakan sebagai uji

antibakteri fraksi metanol

Uji 1

Filtrat/medium kapang endofit di

ekstraksi dengan cara partisi

bertingkat dengan corong pisah

Filtrat ditambahkan

pelarut n-heksan (1 : 1/2)

Didapatkan ekstrak fraksi n-

heksan kemudian pekatkan

dengan vacum Rotary

evaporator

Filtrat/medium

kapang endofit

Filtrat ditambahkan pelarut

etil asetat (1 : 1/2)

Didapatkan ekstrak fraksi etil

asetat kemudian pekatkan

dengan vacum Rotary

evaporator



antibakteri fraksi n-heksan

Uji 2



antibakteri fraksi etil asetat

Uji 3

Filtrat

digunakan

sebagai uji

4, fraksi

air

Uji 4

55


LAMPIRAN 7

Pembuatan Inokulum Bakteri

Ambil dengan ose

Samakan kekeruhan

Biakan bakteri 10 ml Nacl 0,9% McFarland III

109

CFU/ml

1ml 1ml

9 ml NaCl 0,9% 9 ml NaCl 0,9% 9 ml NaCl 0,9%

108 107 106

1 ml

Bakteri

56


LAMPIRAN 8

Identifikasi Bakteri Uji

Bersihkan dengan

alkohol 70 % Dilewatkan

di atas api

Ditetesi NaCl

steril 0,9 %

Diletakan satu

ose bakteri

ditambahankan

karbol kristal

Bilas

dengan

air

Ditambah

kan lugol

Dicuci dengan

alkohol 96%

Di teteskan

safranin

57


LAMPIRAN 9

Uji Aktivitas Antibakteri

10 ml 1 mL

Agar MHA Suspensi bakteri 106

Ekstrak uji di larutkan dalam

pelarutnya masing-masing dengan

konsentrasi 1000 ppm

20 µL larutan uji di serapkan pada

kertas cakram steril. Kontrol positif

digunakan cakram kloramfenikol

Inkubasi selama 18-24 jam,

pada suhu 350 C

A B C D

E F G H

Suspensi digoyangkan perlahan

untuk memperoleh suspensi

bakteri yang tersebar merata,

dan biarkan agar membeku

Kemudiaan amati zona

hambat yang terbentuk dan

diukur dengan jangka

sorong

58


LAMPIRAN 10

Daun Kayu jawa dan Isolasi Daun Kayu Jawa

Isolasi endofit Daun Tua (DT) Dilakukan Triplo

Isolasi endofit Daun Muda (DM) Dilakukan Triplo

Isolasi endofit Daun Pucuk (DA) Dilakukan Triplo

59


Lampiran 11

Hasil Kultur Kapang Endofit

Kapang Endofit DA2k dari daun pucuk

Kapang Endofit DA2k dari daun pucuk

Kapang Endofit DA3k dari daun Pucuk

Kapang Endofit DA3k dari daun Pucuk

Kapang Endofit DM1k dari daun Muda

Kapang Endofit Dm1k dari daun Muda



60


LAMPIRAN 12

Fermentasi Isolat kapang Endofit

Fermentasi DA2K 21 hari Fermentasi DA3K 21 hari

Fermentasi DM1K 21 hari Fermentasi DM2K 21 hari

61


LAMPIRAN 13

Ekstrak Isolat DA2K Kapang Endofit

ISOLAT DA2K

FRAKSI

GAMBAR KETERANGAN

METANOL

-bobot ekstrak : 440 mg -Warna : Kuning pekat -Bau : tidak berbau -konsistensi : kental

N-HEKSAN

-Bobot ekstrak : 120 mg -warna : kuning -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

ETIL ASETAT

-Bobot ekstrak : 210 mg -warna : kuning kecoklatan -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

AIR

-Warna : kuning bening -bau : tidak berbau -konsistensi : cair

62


LAMPIRAN 14

Ekstrak Isolat DA3K Kapang Endofit

ISOLAT DA3KE FRAKSI

GAMBAR KETERANGAN

METANOL

-Bobot ekstrak : 330 mg -warna : hitam -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

N-HEKSAN

-Bobot ekstrak : 60 mg -warna : coklat kehitaman -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

ETIL ASETAT

-Bobot ekstrak : 530 mg -warna : hitam -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

AIR

-warna : coklat -bau : tidak berbau -konsistensi : cairan

63


LAMPIRAN 15

Ekstrak Isolat DM1K Kapang Endofit

ISOLAT DM1K FRAKSI

GAMBAR KETERANGAN

METANOL

-Bobot ekstrak : 660 mg -warna : coklat muda -bau : berbau khas -konsistensi : kental

N-HEKSAN

-Bobot ekstrak : 138 mg -warna : coklat kemerahan -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

ETIL ASETAT

-Bobot ekstrak : 260 mg -warna : coklat -bau : berbau khas -konsistensi : kental

AIR

-warna : kuning jernih -bau : tidak berbau -konsistensi : cairan

64


LAMPIRAN 16

Ekstrak Isolat DM2K Kapang Endofit

ISOLAT DM2K FRAKSI

GAMBAR KETERANGAN

METANOL

-Bobot ekstrak : 210 mg -warna : coklat -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

N-HEKSAN

-Bobot ekstrak : 140 mg -warna : kuning -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

ETIL ASETAT

-Bobot ekstrak : 99 mg -warna : coklat kehitaman -bau : tidak berbau -konsistensi : kental

AIR

-warna : kuning jernih -bau : tidak berbau -konsistensi : cairan

65


Lampiran 17. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DA2K daun Kayu

Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococus aureus

Ekstrak metanol Ekstrak n-Heksan

Ekstrak Etil Asetat Kloramfenikol (+)

66



Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli dan

Helicobacter pylori

Ekstrak isolat DA2K tidak menunjukan Zona Hambat pada E.coli

Ekstrak isolt DA2K tidak menunjukan Zona Hambat pada H.pylori

67



Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa



68



Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus



69



Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli, Helicobacter

pylori , Pseudomonas aeroginosa

Ekstrak isolat DA3K tidak

menghasilkan zona hambat terhadap

Helicobacter pylori

Ekstrak isolat DA3K tidak

menghasilkan zona hambat terhadap

Escherichia coli

Ekstrak isolat DA3K tidak menghasilkan zona hambat terhadap Pseudomonas

aeroginosa

70


Lampiran 22. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Ekstrak Isolat DM1K daun

Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus



71



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli

Ekstrak metanol

Ekstrak n-Heksan

Ekstrak Etil aetat

Kloramfenikol (+)

Metanol

N-Heksan

E.asetat

72



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Helicobacter pylori



73



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa

Ekstrak metanol

Kloramfenikol (+)

Ekstrak Etil Asetat

74



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus

Ekstrak metanol

Ekstrak n-Heksan


75



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Escherichia coli

Ekstrak metanol

Ekstrak n-Heksan


76



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Helicobacter pylori



77



Kayu Jawa (Lannea coromandelica) Terhadap Bakteri Pseudomonas aeroginosa

Ekstrak metanol

Kloramfenikol (+)

Ekstrak Etil Asetat

78


Lampiran 30. Hasil Uji Diameter Zona Hambat Fraksi air isolat kapang daun

Kayu Jawa (Lannea coromandelica)

Fase air terhadap Staphylococcus aureus Fase air terhadap Pseudomonas aeroginosa

Fase air terhadap Escherichia coli

Fase air terhadap Helicobacter pylori

79


LAMPIRAN 31

Skrining Penapisan Fitokimia Ekstrak Metanol Kapang Endofit DM1K

NO ISOLAT DM1K(METANOL)

HASIL GAMBAR

1 ALKALOID negatif

2 FLAVONOID Positif

3 SAPONIN negatif

4 GLIKOSIDA positif

5 TRITERPENOID negatif

6 FENOL

negatif

7 TANIN negatif

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS...

Documents

Transcript of UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA UJI AKTIVITAS...