Tujuan Instruksional Khusus :

- Mahasiswa mampu menjelaskan mikroba yang berperan dalam fermentasi bahan pangan.

Fermentasi dapat dilakukan dengan mikroba atau dengan enzim

Fermentasi dengan mikroba : mudah dan murah

Fermentasi dengan enzim :

Mahal

Ketelitian tinggi

Memerlukan cara-cara penyimpanan dan perlakuan khusus

Mikroba yang banyak digunakan dalam proses fermentasi :

Bakteri

Kapang

khamir

Perlu seleksi Dengan cara

bioteknologi mikrobial

• Bakteri untuk fermentasi pangan dalam bentuk cair

(misal : asam asetat, nata de coco)

• Khamir untuk susbtrat cair (bir dan wine), serta

medium padat (roti)

• Jamur untuk substrat cair : produksi asam sitrat, atau

untuk produksi jamur itu sendiri : jamur kuping, jamur

tiram, jamur merang dll.

Produk Mikroba

Roti, bir, wine Saccharomyces cerevisae

Yoghurt, kefir, probiotik Bakteri Asam Laktat

Kecap Aspergillus oryzae, Zygosaccharomyces rouxii

Tempe Rhizopus sp

Tapai Hansenulla, Saccharomyces

Asam Cuka Acetobacter acetii

Asam Sitrat Aspergillus niger

Asam Laktat Lactobacillus delbueckii

Nata Acetobacter xylinum

Acar, asinan Bakteri Asam Laktat

Asam Glutamat Corynobacterium glutamicum

Lisin Brevibacterium lactofermentum

Penisilin Penicillium chrysogenum

Bioteknologi : pemanfaatan jasad hidup (tanaman, hewan, jasad renik) atau bahan-bahan yang berasal dari jasad hidup dalam proses industri.

Bioteknologi mencakup : Pemanfaatan teknologi DNA

rekombinan/rekayasa genetik

Rekayasa enzim dan protein

Teknologi biak sel/jaringan

tanaman dan hewan

Teknologi fermentasi

dan imobilisasi

Pemanfaatan biosensor

Antibodi monoklonal

Pelacak DNA (DNA

probes)

Bioteknologi mikrobial dibagi atas 2 fase :

1.Teknologi mikrobial tradisional menggunakan metode-metode :

Seleksi alami

Modifikasi proses untuk memperoleh hasil maksimum, misalnya dengan perubahan media dan kondisi pertumbuhan

2.Teknologi mikrobial dengan rekayasa organisme menggunakan gen-gen asing yang disisipkan pada gen mikrobia (rekayasa genetika) tujuannya untuk mendapatkan strain atau mutan/galur unggul.

Peningkatan produksi pada Penicllium chrysogenum untuk meningkatkan produksi melalui seleksi bertingkat, mutasi dan kawin silang

Rekayasa genetika bakteri asam laktat dalam produk susu mempunyai kemampuan metabolik atau sifat baru seperti :

Menghasilkan senyawa-senyawa penghambat jasad renik yang merugikan Nisin menghambat Listeria monocytogenes

Merombak kolesterol menjadi senyawa lain (coprostanol)

Memproduksi -galaktosidase (yang merombak laktosa glukosa dan galaktosa) dalam jumlah tinggi pada yoghurt.

Tahan terhadap bakteriofag dan mampu mempercepat kematangan keju

Memproduksi berbagai senyawa penyedap (flavor alami) seperti nenas, persik, pisang, jeruk dan protein rasa manis.

Mampu menghasilkan chymosin (renin) penjedal (clotting) susu

Rekayasa genetika pada khamir dalam industri bir menghasilkan khamir dengan sifat :

Mampu merombak karbohidrat malt menjadi

etanol dalam jumlah besar penting dalam pembuatan bir berkalori rendah (lite beer)

Bersifat menggumpalkan (flocculate) dan mengendapkan (sediment)

Osmotoleran

Sanggup memproduksi dan tahan terhadap etanol kadar tinggi

Tahan suhu tinggi

Rekayasa genetika pada mikroba penghasil senyawa bernilai tinggi : Menambah gizi (vitamin A, C, E dan asam amino) Senyawa penyedap (flavor) dan pengharum

(aroma) seperti MSG, berbagai ester (bau rasa buah dan bunga), diasetil (bau/rasa mentega), pyrazine (bau/rasa panggang atau kacang), lactones (bau/ rasa buah atau kelapa). Pewarna seperti astaxantin (jingga) dari khamir

dan karotenoid dari ganggang Biopolimer untuk penstabil (stabilizing agent

pengental (viscosifier), surfaktan, pembuat kapsul, bahan penjedal tak berkalori (non calorie gelling agent). Bahan pemanis tak berkalori (aspartam) Bahan peptida pengasin (orthyltaurine dan lysyl

taurine).

Mikroba Fragrance Rumus Kimia Ascoidea hylacoeti

Fruity, rose -phenyletanol, furan-2-carboxylate

Ceratocytis moniliformis

Fruity, banana, peach, pear, rose

3-Methylbutyl acetate. ,-degalactone, geraniol, citronellol, nerol, linalool, -terpinol

C.variaspora Fragrant, geranium Citronellol, citronellyl, acetate, geranial, neral, geraniol, linalool, geranyl acetate.

C.virescens Rose, fruity 6-methyl-5-heptan-2-olacetat, citronellol, linalool, feraniol, geranyl acetate

Inocybe corydalina

Fruity, jasmine Cinnamic acid methyl ester.

K;uyveromyces lactis

Fruity, rose Citronellol, linalool, geraniol.

Mikroba Fragrance Rumus Kimia

Mycoacia uda Fruity, grassy, almond P-Methylacetophenone, p-tolyl1-

ethanol, p-tolyaldehyde

Penicillum

decumbens

Pine, rose, apple,

mushrooms

Thujopsene, 3-octanone, 1-acten-3-

ol, nerolidol, phenylethanol, -

decalactone

Phellinus sp Fruity, rose,

wintergreen

Methyl benzoate, methyl salicylate,

-phenylethanol, -decalactone

Streptomyces

odorifer

Earthy, camphor Trans-1, 10 dimethyl-trans-9-

decalol, 2-exohydroxy-2-methyl-

bornae.

Trametes

odorata

Honey, rose, fruity,

anise

Methyl phenylacetate, geraniol,

nerol, citronellol.

Trichoderma

viridae

Coconut 6-Pentyl-2-pyrone

Mikroba uniseluler, tidak berklorofil

Tempat hidup: tanah, atmosfir, endapan lumpur laut, air, sumber air panas, di daerah antartika, dalam tubuh hewan, manusia dan tanaman

Digolongkan atas : - aerobik

- anaerobik

Bentuk : bulat (kokus), batang (silindris), lengkung (vibri).

Organisme bersel satu

Inti sel yang mengandung DNA terdapat pada sitoplasma

Sitoplasma dikelilingi oleh membran sel dan dinding sel

Memperbanyak diri dengan proses yang disebut Binary fission (2 sel diperoleh dari 1 sel)

Elisa Julianti - THP-FP USU

Elisa Julianti - ITP-FP USU

Methods of Classification

1- Morphology (microscopic analysis)

Gram-positive Gram-negative

2- Differential Stain

(Gram stain, capsule stain, etc.)

Gram + Gram -

• Specific enzymes: Catalase, Oxidase

• Metabolic Products: e.g fermentation (lactic acid,

acetic acid…)

• Sugar Utilization (lactose, mannose, rammnose) API

identification kits

• Growth characteristics (temperature, anaerobe)

3- Biochemistry

(Catabolic and Anabolic Pathways)

Antigenic structure (Flagella, surface)

test the whole cells or cell extracts for the possession of

specific surface antigens by reaction with specific antibodies

Receptors

-- Phage receptors

test bacteria for possession of specific surface receptors by

testing for sensitivity to a range of test phages (Phage typing

(specific binding and lysis of bacteria)

--Bacteriocin receptors

Toxins

4- Serology (Specific antibodies)

(Slide agglutination)

5- Amino Acid Sequencing (SDS-PAGE)

6- Fatty acids

7- Flow cytometry (Differences in electrical

conductivity)

8- DNA, Restriction enzyme maps

Development of advanced techniques has led to

the re-evaluation of bacterial taxonomy

But

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology is still

regarded as the foundation for classifying

bacteria.

Bakteri anaerobik dapat menghasilkan : butanol, aseton, etanol isopropanol, asam laktat, bakteri dalam pembuatan keju

Golongan aerobik yang terkenal : Acetobacter yang menghasilkan asam asetat, asam glukonat, dihidroksi aseton, sorbose, vitamin B12 dan zat lain yang mengubah substrat melalui oksidasi

Acetobacter acetii : mengoksidasi alkohol menjadi asam asetat. Banyak terdapat pada ragi tape yang sudah berumur > 2 hari sehingga berasa masam.

Acetobacter xylinum : untuk pembuatan nata de coco (mensintesa selulosa dari gula yang dkonsumsi), serta pada produk teh kombucha

Clostridium accetobutilicum. : untuk proses fermentasi aseton-butanol

Bakteri pada fermentasi asam laktat : Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc.

Bividobacterium sp : bersifat anaerob, digunakan sebagai mikroba probiotik, pada produk padat.

Tabel 4. Contoh Fermentasi Asam Laktat dan Kondisi Inkubasinya

Bahan Pangan Bakteri Kondisi Inkubasi

Suhu (oC) Waktu Keterangan

Ubi Kayu Corynebacterium sp Geotrichum sp

Ambien 96 jam

Ikan Bacillus pumilus Bacillus licheniformis

Ambien 3-12 bulan Rasio ikan : garam 3:1 dan 5:1

Jagung Corynebacterium sp Aerobacter sp Lactobacillus sp

Ambien 24-72 jam

Daging Pediococcus cerevisiae Lactobacillus plantarum Lactobacillus curvatus

15-26 24 jam RH 85-90%

Susu Streptococcus thermophilus L.bulgaricus

40-45 2-3

Keju Cottage Streptococcus diacetylactis 22 14-16

Keju Camembert S.cremoris S.lactis

32 a*

Keju Cheddar S.cremoris S.lactis Streptococcus diacetylactis Lactobacillus

32 a*

Sayuran (Mentimun dan Kubis)

Lactobacillus mesenteroides Lacobacillus brevis Lactobacillus plantarum

Ambien 48-260 jam Konsentrasi garam 2.5-6%

Tergolong dalam Thallophyta, tidak berklorofil, tidak berdaun dan tidak berbatang

Tdd golongan patogen dan non patogenik

Peranan kapang dalam industri fermentasi :

Mematangkan keju

Menghasilkan asam organik

Enzim-enzim

Membuat berbagai produk seperti : tauco, tempe, kecap dll

• Genus yang penting dalam fermentasi : Aspergillus, Penicclum, Rhizopus dan Mucor

Multicellular, tubular structures (hyphae)

Hyphae can be septate (regular crosswalls) or nonseptate (coenocytic) depending on the species (grow by apical extension)

◦ Vegetative hyphae grow on or in media (absorb nutrients);

form seen in tissue, few distinguishing features

◦ Aerial hyphae contain structures for production of spores (asexual propagules); usually only seen in culture

Elisa Julianti - THP-FP USU

Identifikasi Kapang • Identification based on colony morphology

(pigment, texture) and morphology of reproductive structures – Conidia - spores formed by budding (blastoconidia) or

disarticulation of existing hypha (arthroconidia)

– Sporangiospores - produced by free-cell formation within sporangium in nonseptate molds

1. sporangium

2. sporangiophore

3. Endospores

4. Nonseptate

hyphae

5. rhizoids

1

2

3

4

5

1. Conidiopspores

2. Phialides

3. Vesicle

4. Conidiophore

5. Septate hyphae

5

1

2 3

4

Morfologi Koloni Kapang

Cryptococcus

neoformans

Candida

albicans

Wangiella

dermatitidis

Aspergillus

fumigatus

T. menta-

grophytes

Trichophyton

tonsurans

Beberapa jenis jamur yang penting dalam fermentasi :

• Aspergillus niger : pada pembuatan asam sitrat, dan dapat mengkontaminasi makanan seperti roti tawar

• Rhizopus oryzae : pada pembuatan tempe

• Neurospora sitophila : sumber beta karoten pada fermentasi tradisional, seperti oncom

• Monascus purpureus : pertama kali ditemukan di Jawa, tapi saat ini menjadi produk utama Cina dengan nama Angkak (hasil fermentasi beras).

• Pencicillum sp : pada produksi antibiotika

Tabel 5. Beberapa Species Kapang dan Produk Metaboliknya Kapang Produk

Aspergillus awamori Asam kojat

A.clavatus Asam sitrat, asam kojat

A.elegans Mannitol

A.flavus Asam kojat, lemak, asam fumarat

A.fumaricus Asam kojat, lemak, asam fumarat

A.fumigatus Asam kojat

A.giganteus Asam kojat

A.gymnosardea Asam kojat

A.glaucus Asam kojat, Mannitol

A.itaconicus Mannitol

A.nidulans Mannitol, Lemak

A.niger Asam sitrat, asam galat, asam glukonat

A.oryzae Asam kojat, preparasi enzim, pati sakarifikasi

A.sydowi Lemak

A.tamarii Asam kojat

Byssochlamys fulva Mannitol

Clasterosporium sp Mannitol, Etil Alkohol

Fusarium sp Etil Alkohol

Mucor piriformis Asam sitrat

M.rouxii Pati sakarifikasi

Paecillomyces divaricatum Asam glukonat

Kapang Produk

P.Cammemberti Keju cammembert

P.chrysogenum Asam sitrat, Asam glukonat, lemak

P.citrinum Asam sitrat, lemak

P.grisco-fulvum Diereks Asam fumarat

P.javanicum an Beijma Lemak

P.purpurogenum var rubrisclerotium

Asam fumarat

P.roqueforti Lemak, Keju roquetor

Rhizopus arrhizus Asam laktat

R.chinensis Asam laktat

R.delemar Pati sakarifikasi

R.elegans Asam laktat

R.japonicus Asam fumarat

R.neqricans Asam fumarat

R.oryzae Asam fumarat, asam laktat

R.pseudochinensis Asam laktat

R.salebrosus Asam laktat

S.shanghaiensis Asam fumarat, asam laktat

R.stolonifer Asam fumarat, asam laktat

R.tritici Asam fumarat, asam laktat

Ustulina vulgaris Asam sitrat

Tergolong dalam sub divisi Thallophyta

Tdd 3 family : - Saccharomycetaceae

- Sporabolomycetaceae

- Cryptococcaceae

Mempunyai sifat pereduksi yang kuat jika suatu media yang mengandung gula dan khamir difermentasi maka gula dan zat lain akan direduksi

Asetaldehid, gliseraldehis, furfuraldehid dan benzaldehid alkohol, gleserol, furfuraldehid dan benzilakohol

Alkohol tak jenuh seperti sitral dan sinamaldehid alkohol olefenik.

Keton metilheksil, meilnonil, metil propil keton serta asetilmetilkarbinol.

Hidroksi dan diketon alkoholnya masing-masing. Alkohol tak jenuh alkohol jenuh, misal nitrobenzen menjadi

anilin, sulfur menjadi hidrogen sulfida dan quinon menjadi quinol, asam malat dan tararat menjadi asam suksinat.

Karakteristik Khamir

• Unicellular, 3-5 µm, reproduce by budding (blastoconidia formation) or fission

• Identified by microscopic morphology (grow on cornmeal agar) and biochemical tests (sugar assimilation, enzymatic activity).

• Molds and yeast are not exclusive forms, some species may exist in both yeast and mold forms (dimorphism).

Ester Produk lain Vitamin Produk Ragi

Etil asetat Asam adenil

Dioksida karbon

Minyak Fusel

Glutation

Asam nukleat

Nukleotida

Kecap

Vinegar

Biotin

Asam folat

Niasin

p-Asam amino

benzoat

Piridoksin

Riboflavin

Tiamin

Ragi roti

Ragi bir

Ragi Foder

Ragi makanan

Ekstrak khamir

Ragi Gum

Ragi Lipida

Harus dapat memproduksi zat yang diinginkan dalam jumlah tinggi. Contoh : galur khusus untuk memproduksi Streptomycin

Biaya operasional rendah

Tahan disimpan sebagai galur murni tanpa penurunan sifat unggulnya

Tahan terhadap perubahan kecil yang terjadi akibat perlakuan tertentu

Tidak mengganggu kesehatan

Tidak toksik atau sifat toksiknya dapat dengan mudah dimatikan.

Mikroba untuk fermentasi dapat diperoleh dari lingkungan tempat produksi atau dari tanah, air dsb yang terbaik : dari lingkungan atau substrat tempat tumbuhnya

Mikroba yang sudah diisolasi kemudian di tumbuhkan pada media pertumbuhannya :

- kontaminan dimatikan

- gunakan kultur yang diperkaya

Mikroba di alam dalam keadaan tercampur (banyak atau sedikit jenis) dengan sifat yang berbeda-beda perlu pemurnian.

Isolasi suatu galur murni dapat dilakukan dengan cara :

1. Secara Bertingkat (Cara Konvensional) : Tingkat I : secara manual (pengenceran) (sampai 10-4

– 10-8) pada pengenceran terakhir dilakukan pemupukan media padat sehingga tumbuh koloni yang terpisah jauh dan diambil satu koloni yang dianggap murni

Tingkat II : dengan media yang bersifat selektif bagi mikroba

Tingkat III : koloni yang seolah-olah sudah murni diencerkan kembali atau diisolasi ulang, kemudian dikarakterisasi untuk membuktikan isolat = galur murni.

2. Dengan alat mikromanipulator : alat yang tdd alat manipulator yang dapat dilihat melalui mikroskop. Alat ini dilengkapi jarum halus yang dapat digerakkan pada objek (kumpulan

mikroba) kemurnian dibuktikan dengan uji fisik atau mikroskopik, atau uji kimiawi (dengan pupukan khusus).

3. Dengan kultur khusus (kultur pemerkaya/enrichment culture) media yang bersifat memberi kemudahan untuk tumbuhnya mikroba tertentu yang diinginkan dan menekan pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan.

Untuk organisme fotosintesis media tanpa sumber energi organik dan anorganik, CO2, inkubasi di bawah sinar matahari. Inokulum berasal dari : sungai, danau, laut dan tanah.

Untuk bakteri litropik yang mampu memanfaatkan amonium, media mengandung NH3, inkubasi di dalam gelap. Inokulum berasal dari : tanah, air limbah atau lumpur.

Organisme yang menggunakan bahan organik tertentu sebagai sumber energi, contoh : mikroba yang menggunakan herbisida 2,4D (2,4 asam dikloropenoksi asetat),

Mikroba yang mampu tumbuh pada suhu tinggi, diinkubasi pada suhu tinggi.

Mikroba yang anaerob diinkubasi pada media kultur tanpa O2.

Dapat digunakan teknik goresan

Cara yang umum :

Dispersikan 1 bagian koloni dalam 2-3 ml air steril

Goreskan 1 ose suspensi di atas media agar membentuk goresan zig zag

Setelah masa inkubasi selesai, ambil koloni terpisah pada setengah terakhir dari goresan

Jika semua koloni tunggal mempunyak ukuran dan penampakan yang seragam kultur murni perlu pengujian mikroskopis

Jika ukuran sudah seragam kultur disimpan dalam agar miring (malt extract agar)

Jika belum seragam ulangi teknik di atas

Elisa Julianti - THP-FP USU

Elisa Julianti - THP-FP USU

Elisa Julianti - THP-FP USU

Teknik goresan tidak efektif untuk jamur benang

Isolasi tergantung dari pengambilan sampel berupa hifa atau spora yang dianggap murni (oleh mata atau alat lain) yang ditunjukkan dengan keseragaman yang terbentuk setelah diinkubasi pada media tumbuh

Penampakan kultur campuran tergantung dari laju pertumbuhan jika beragam : terdapat gumpalan pada titik inokulum

jika kec.pertumbuhan sama : terdapat perbedaan pada sektor pertumbuhan berupa perbedaan miselia, spora atau warna

Tempat sederhana isolasi jamur : media perhitungan dengan sebaran koloni yang baik

Digunakan jarum preparat yang steril untuk mengambil spora atau miselium

Pembebasan jamur dari bakteri sulit kecuali dengan antibiotik

Isolasi jamur yang tumbuh lebih cepat akan lebih mudah

Hifa yang berada disebelah luar biasanya bebas kontaminasi

Untuk memisahkan jamur yang tumbuh cepat dengan yang lambat butuh keterampilan khusus

Jamur yang tumbuh lebih lambat biasanya memiliki waktu perkecambahan dan pembentukan spora yang cepat perlu dilakukan :

- inokulasi setiap hari

- gunakan suhu < atau >

- media dengan aw rendah

- penambahan dikloran

Kultur murni diinokulasikan dalam media yang sesuai jamur diinokulasikan pada titik di tengah agar miring

Penyimpanan jangka pendek : pada agar miring yang ditutup kapas (cara tradisional), atau pada tabung berpenutup yang tetap kering selama penyimpanan, tetapi tutup harus kendur agar jamur mendapat oksigen

Karakteristik utama mikroorganisme :

1. Karakeristik kultural nutrien/kultur spesifik 2. Karakteristik morfologis ukuran sel, susunan

koloni, bentuk, struktur yang dapat diamati

3. Karakteristik metabolik cara melakukan proses biokimia

4. Karakteristik komposisi kimiawi bahan/zat utama yang terkandung

5. Karakteristik antigenik deteksi komponen sel khusus yang mempunyai persamaan antar spesies

Caranya : mikroba yang tidak diketahui spesiesnya, disuntikkan ke hewan, kemudian diambil serum darah hewan tersebut, dan dilakukan reaksi antigen-antibodi yang bersifat spesifik.

6. Karakteristik genetik analisis komposisi DNA yang diisolasikan dari mikroba yang berlainan.

Susunan basa DNA bersifat konstan pada suatu mikroba dan dinyatakan dalam % (G + C) :

G + C

% (G + C) =

A + T + G + C

A = Adenin, T = Thymine, G = Guanine, C = Cytocine

Species % (G+C)

Bacillus substilis 42-43

B.Cereus 32-37

B.Megaterium 36-38

Lactobacillus 46.9

L.Leichmanii 50.8 + 0.5

L.Lactis 50.3 + 1.4

Micrococcus luteus 70.7-75.5

M.Roseus 66 -74

M.varians 66-72

Keuntungan Kultur Campuran

• Produksi yoghurt dan kecap menggunakan kultur murni, namun fermentasi tradisional di Asia banyak menggunakan kultur campuran yang

• Konsumen lebih menyukai produk fermentasi yang diproduksi dengan kultur campuran alami menghasilkan produk dengan aroma yang tajam pada rice wine, kongju dan flavor yang kuat pada kecap kedelai, kanjang dan produk fermentasi lain di Korea

• Aktivitas antikanker dari doenjang yang dibuat dengan fermentasi tradisional lebih tinggi daripada yang dibuat oleh industri menggunakan kultur murni (koji)

Elisa Julianti - THP-FP USU

Tuliskan contoh 1 cara isolasi dan identifikasi sel bakteri, ragi dan kapang (pilih salah satu).

Tulis dengan tulisan tangan

Cantumkan sumber pustaka

Dikumpulkan : Rabu 6 Maret 2013

Elisa Julianti - ITP-FP USU