PENETAPAN KADAR DNA PLASMID

Bab I

Pendahuluan

1.1 Teori Dasar

Plasmid merupakan bagian yang penting dalam rekayasa genetika. Plasmid a-dalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan terdapat di dalam sel hidup. Didalam satu sel dapat ditemukan lebih dri satu plasmid dengan ukuran yang berbeda-beda. Umumnya plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga apabila keadaan sudah kembali norma, maka plasmid akan dibunang. Plasmid telah diproduksi secara komersil oleh banyak perusahaan besar untuk digunakan sebagai vektor kloning. Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria diantaranya yaitu harus berukuran kecil, memiliki gen penanda seleksi dan gen pelapor, serta memiliki situs pemotongan enzim retriksi untuk memudahkan penyisipan DNA kedalam vektor plasmid. Keberadaan DNA plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast.

Pemurnian DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein. Untuk mengukur kemurnian atau menentukan kadar DNA plasmid digunakan spektrofotometri. Spektrofotometri sendiri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada besarnya nilai absorbansi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik. Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA/RNA menggunakan spektrofotometri adalah 260nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan protein menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 280nm. Absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi yang artinya semakin tinggi konsentrasinya, maka semakin tinggi pula absorbansi yang dihasilkan. Untuk menghitung konsentrasi DNA adalah dengan cara panjang gelombang 260nm × faktor pengenceran × 50µg/µl. DNA yang murni memiliki nilai antara 1,8-2,0. Apabila nilai kemurniannya kurang dari 1,8 maka mengalami kontaminasi fenol/protein, jika nilai kemurniannya lebih dari 2,0 maka akan mengalami kontaminan RNA.

1.2 Rumusan Masalah1.3 Tujuan

Mampu memahami dan melakukan penetapan kadar DNA plasmid1.4 Daftar Pustaka

Watson, James D. Tooze, John. Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Penerbit Erlangga. Jakarta.

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM.Yogyakarta.

ELEKTROFORESIS DNA

Bab IPendahuluan

1.1 Teori DasarElektroforesis adalah suatu teknik pemisahan untuk karakterisasi makromolekul, berat molekul dan penetapan kemurnian protein. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak digunakan saat ini dalam percobaan biokimia maupun biologi molekuler. Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik untuk analisis DNA dan protein. Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Dalam proses elektroforesis, molekul ditempatkan kedalam sumur pada gel yang ditempatkan didalam larutan penyangga dan listrik dialirkan. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak didalam matriks gel kearah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung didalamnya. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama. Apabila molekul DNA bermuatan negatif maka di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA yaitu Gel polkiakrilamid, gel alkalin agarosa dan Gel agarosa formaldehid denaturasi. Gel poliakrilamid digunakan untuk memurnikan penanda oligonukliotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. Gel alkalin agarosa berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran sangat besar. Sedangkan Gel agarosa formaldehid denaturasi berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

1.2 Rumusan masalah1.3 Tujuan

Mamapu memahami dan melakukan teknik pemisahan DNA dengan metode elektroforesis.

1.4 Daftar Pustaka

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: erlangga