PATOLOGI KLINIK

A. SESI 1

A.1. HEMOGLOBIN (METODE SIANMETHEMOGLOBIN)PRINSIPWhole blood ditambahkan reagen sianmethemoglobin (HiCN). Kalium ferisianida di dalam reagen mengubah besi hemoglobin dari keadaan ferro (Fe2+) menjadi ferri (Fe3+) untuk membentuk methemoglobin (Hi) yang akan bergabung dengan kalium sianida untuk membentuk pigmen stabil sianmethemoglobin (HiCN). (Hi = hemoglobin = besi di dalam hemoglobin telah dioksidasi kedalam keadaan ferri. HiCN = hemoglobin sianida = Hi yang telah terikat dengan ion sianida). Adanya detergen nonion dalam reagen akan meningkatkan lisisnya eritrosit dan mengurangi jumlah kekeruhan akibat protein abnormal seperti lipoprotein. Intensitas warna dari campuran ini diukur oleh spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Melihat berat jenis larutan adalah proporsional untuk konsentrasi hemoglobin. Semua bentuk hemoglobin dapat diukur menggunakan metode ini kecuali sulfhemoglobin.

SPESIMENWhole blood menggunakan EDTA sebagai anti koagulan. Darah kapiler juga dapat digunakan.

REAGEN DAN ALAT1. Sianmethemoglobin (hemiglobinsianida) (HiCN) / reagen Drabkin berisi kalium sianida (50 mg), kalium ferisianida (200 mg), dihidrogen kalium fosfat (KH2PO4) (140 mg), dan deterjen nonion (1 ml) dalam 1 L akuades2. Tabung reaksi, 10 x 75 mm3. Pipet, 0,02 ml4. Spektrofotometer (540 nm)

PROSEDUR1. Taruh 5 ml reagen HiCN kedalam tabung reaksi yang sudah diberi label. Taruh 5 ml reagen kedalam tabung raksi yang digunakan sebagai blanko.2. Tambahkan 0,02 ml whole blood well-mixed atau darah control kedalam tabung yang sudah diberi label. Cuci pipet 3-5 kali dengan reagen HiCN sampai semua darah hilang dari pipet3. Campur larutan sebelumnya dengan baik dan biarkan dalam posisi berdiri pada temperatur ruangan selama 3 menit untuk memberikan waktu yang adekuat dalam pembentukan HiCN4. Pindahkan campuran kedalam kuvet dan baca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm menggunakan reagen HiCN dalam tabung blanko untuk mengatur berat jenis optik (O.D.) pada 0.0. Catat pembacaan untuk pasien dan sampel kontrol dari skala O.D. dan jadikan petunjuk untuk tabel yang disiapkan dalam melihat nilai hemoglobin yang aktual (g/dl).

A.2. MENGHITUNG ERITROSITMenghitung eritrosit adalah mengungkapkan jumlah eritrosit/liter (L) dalam whole blood. Jumlah eritrosit normal adalah 3,6 - 5,6 x 1012/L untuk wanita dan 4.2 - 6,0 x 1012/ L untuk pria. Bayi baru lahir memperlihatkan jumlah eritrosit 5,0 - 6,5 x 1012/L setelah lahir, dimana secara berkala menurun menjadi 3,5 - 5,1 x 1012/L pada usia 1 tahun.

PRINSIPUntuk menfasilitasi penghitungan dan mencegah lisis eritrosit, whole blood dilarutkan dengan larutan isotonic encer

REAGEN DAN ALAT1. Pipet Thoma red count2. Larutan Hayem (larutan encer red count)- natrium sulfat 2,5g- natrium klorida 0,5g- merkuri klorida 0,25g- akuades 100 ml3. Mikroskop 4. Kasa steril atau lap kim5. Hematocytometer dan cover glass. Satu kotak besar di tengah berisi 25 kotak kecil berukuran sama yang digunakan untuk eritrosita) lima kotak kecil diberi label R pada area yang akan digunakan untuk menghitung eritrositb) kotak besar di tengah mempunyai volume 0,1 l. Oleh karena itu, volume setiap 25 kotak kecil adalah 0,004 l untuk lima kotak kecil

SPESIMENWhole blood menggunakan EDTA ata heparin sebagai antikoagulan. Darah kapiler juga dapat digunakan.

PROSEDUR1. Ambil darah sampai tanda 0,5 pada pipet red count dan encerkan kedalam tanda 101 dengan cairan encer red count, sehingga menghasilkan 1:200 pengenceran darah2. Campur eritrosit yang telah diencerkan selama 3 menit3. Bersihkan chamber hitung4. Isi chamber hitung (satu larutan red count mengisi setiap sisi dari hematocytometer). Setiap chamber hitung diisi, biarkan kira-kira 3 menit sehingga membuat sel eritrosit mengendap agar mudah dihitung5. Hitung sel eritrosita) letakkan secara hati-hati chamber hitung pada mikroskopb) gunakan pembesaran lemah (10 x). letakkan kotak besar di tengah pada area tengah lapang pandang. Periksa seluruh kotak besar untuk setiap persebaran eritrositc) secara hati-hati ubah ke perbesaran kuat (40x)d) pindahkan chamber hitung pada ujung kiri atas kotak kecil telihat dalam lapang pandang. Kotak ini selanjutnya terbagi menjadi 16 kotak yang lebih kecil untuk memudahkan penghitungan.e) hitung semua sel eritrosit pada kotak ini, ingat untuk menghitung sel-sel pada dua garis margin luar, tetapi keluarkan yang terletak pada dua garis lainnya pada tepif) beberapa sel eritrosit dapat berada pada salah satu sisi lainnya, sehingga tidak muncul penuh. Sel-sel ini dimasukkan dalam penghitungang) jika terdapat sel leukosit apa saja pada area yang dihitung, jangan masukkan sel ini dalam hitungan. (sel leukosit biasanya lebih besar dari eritrosit dan tidak mempunyai penampakan yang halus)h) hitung sel eritrosit pada setiap lima kotak kecili) hitung sel eritrosit pada sisi berlawanan dari chamber hitung yang sesuai dengan lima kotak kecil6. Hitung sel eritrosit untuk setiap red count dan rata-rata daridua hasil untuk laporan akhir

RBC/L = # sel di dalam lima kotak kecil x koreksi untuk pengenceran x 106Koreksi untuk volume

RBC/L = # sel di dalam lima kotak kecil x 200 x 1065 x 0,2 x 0,2 x 0,1

Contoh :# sel di dalam lima kotak kecil = 400Pengenceran = 1:200Volume yang dihitung = lima kotak kecilKonversi ke liter = x 106RBC/L = 400 x (1:200) x 200 x 106 = 4 x 1012

A.3. PENGUKURAN HEMATOKRIT (METODE MIKROHEMATOKRIT)PRINSIPWhole blood disentrifugasi untuk membungkus sel eritrosit dengan maksimal. Ruangan yang ditempati oleh sel eritrosit diukur dan diperlihatkan dalam persentase seluruh volume whole blood.

SPESIMENWhole blood menggunakan dipotasium ethylene-diaminatetraasetat acid (EDTA) sebagai antikoagulan. (cairan EDTA diperkirakan dapat menyebabkan penurunan 2-3% dalam hematokrit berkaitan dengan sedikit pengecilan sel eritrosit)

REAGEN DAN ALAT1. Tabung mikrohematokrit, panjang kira-kira 75 mm dengan diameter bagian dalam kira-kira 1,2 mm. Dua tipe tabung mikrohematokrit yang dapat dibeli: (1) berisi heparin (kede warna dengan pita merah) sebagai antikoagulan, digunakan untuk whole blood non-antikoagulan, (2) tabung biasa (kede warna dengan pita biru) digunakan untuk whole blood dengan antikoagulan. Tabung mikrohematokrit dapat menampung kira-kira 0,05 ml whole blood2. Clay-like sealing blood3. Sentrifuge mikrohematrokrit yang dapat menghasilkan RCF 10000-15000 g. sentrifuge harus dapat mencapai kecepatan maksimum selama 30 detik4. Pembaca tabung mikrohematokrit

PROSEDUR1. Biarkan darah kapiler atau whole blood dengan antikoagulan masuk kedalam dua tabung hematokrit sampai kira-kira 2/3 diisi dengan darah. (gelembung udara menandakan teknik yang jelek tetapi tidak mempengaruhi hasil dari pengujian ini)2. Segel salah satu ujung tabung mikrohematokrit dengan bahan clay dengan meletakkan bagian kering dari tabung pada clay dengan posisi vertical (tabung mikrohematokrit membentuk sudut 90 terhadap clay)3. Letakkan dua tabung mikrohematokrit dalam alur radial dari kepala sentrifuge secara benar berlawanan terhadap lainnya, dengan bagian yang tersegel berada jauh dari pusat sentrifuge4. Sentrifugasi selama 5 menit5. Ambil segera tabung mikrohematokrit segera setelah sentrifuge berhenti berputar. Tentukan hasil untuk masing-masing mikrohematokrit menggunakan alat pembaca tabung mikrohematokrit. Duplikat hasil harus cocok kurang lebih unit (%). Jika tidak, ulangi prosedur. Hematrokrit dapat dilihat dalam 2 cara: (1) sebagai persentase, contohnya 42%, atau (2) sebagai fraksi desimal, contohnya 0,42

A.4. PENGUKURAN RETIKULOSITPENDAHULUANSel eritrosit melewati 6 tahap perkembangan : pronormoblast, basofilik normoblast, ortokromik normoblast, retikulosit, dan sel eritrosit matur. Tahap pertama sampai keempat secara normal dibatasi sampai sumsum tulang belakang. Retikulosit bagaimanapun dapat ditemukan pada sum-sum tulng belakang dan darah tepi. Penghitungan retikulosit sangat penting sebagi alat diagnostic. Ini sebagai cerminan produksi jumlah eritrosit pada sum-sum tulang belakang.

PRINSIPSetelah ortokromik normoblast kehilangan nukleusnya, sejumlah kecil RNA masih terdapat didalam sel eritrosit, dan sel ini diketahui sebagai retikulosit. Untuk mendeteksi adanya RNA, sel eritrosit ini harus diwarnai pada saat mereka masih hidup. Proses ini disebut pewarnaan supravital.

REAGEN DAN ALAT1. Pewarna retikulosit dapat dipilih salah satu dibawah ini:a) Larutan pewarna new metilen blue:New Metilen Blue (CI 52030)1,0 gNatrium klorida0,89 gAkuades 100 mlb) Brilliant Cresyl Blue:Brilliant Cresyl blue1,0 gNatrium klorida 0,85%99 mlCampur selama 15 menit, saring, dan simpan pada suhu ruangan. Saring kembali pada saat digunakan kembali2. Slide kaca3. Tabung mikrohematokrit4. Tabung reaksi kecil5. Mikroskop

SPESIMENWhole blood (1 ml) menggunakan EDTA sebagai antikoagulan. Darah kapiler juga dapat digunakan

PROSEDUR1. Taruh 3 tetes pewarna retikulosit yang telah disaring pada tabung reaksi kecil2. Tambahkan 3 tetes whole blood well-mixed kedalam tabung yang berisi pewarna3. Campur isi tabung dan biarkan pada suhu ruangan, atau inkubasi pada suhu 37C selama 15 menit. Hal ini memberikan waktu yang adekuat untuk retikulosit mengalami pewarnaan4. Pada akhir menit ke 15, campur isi tabung dengan baik5. Siapkan beberapa ganjalan atau apusan berputar dan biarkan di udara agar mongering6. Letakkan kaca slide pertama pada mikroskop dan gunakan perbesaran lemah (10 x), cari area dengan apusan paling tipis dimana sel eritrosit tersebar merata dan tidak saling bersentuhan satu sama lain. Secara hati-hati ubah pada perbesaran minyak imersi (100 x) dan selanjutnya letakkan pada area dimana terdapat kira-kira 100-200 sel eritrosit per satu daerah lapang pandang.7. Segera setelah area dipilih, retikulosit dapat dihitung. Sel eritrosit dapat bercahaya pada medium berwarna hijau. RNA terdapat pada retikulosit berwarna biru gelap. Reticulum dapat berlimpah atau tersebar, tergantung pada tahap perkembangan sel; retikulosit muda memiliki banyak RNA sedangkan kebanyakan sel retikulosit matur menunjukkan sejumlah kecil RNA. Hitung semua sel eritrosit pada daerah lapang pandang pertama pada satu sel counter. Dalam waktu yang bersamaan, hitung satu persatu retikulosit di lapang pandang yang sama pada sel counter kedua. Sebagai pertimbangan, sebuah retikulosit sel eritrosit harus berisi dua atau lebih partikel berwarna biru. Pindahkan slide yang telah dijabarkan kedalam prosedur penghitungan sel diferential menggunakan metode cross section sampai semua retikulosit dalam 1000 sel eritrosit telah dihitung8. Rata-ratakan kedua hasi dan kalkulasi jumlah retikulosit seperti yang diperlihatkan dibawah ini:

% retikulosit = jumlah retikulosit dalam 1000 sel eritrosit10

A.5. INDEKS ERITROSITIndeks sel eritrosit digunakan untuk menentukan ukuran dan isi hemoglobin dalam eritrosit. Terdiri atas mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), dan mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC). Dipakai secara luas dalam penghitung sel otomatis yang secara rutin menghitung indeks eritrosit pada setiap uji sampel darah, indeks ini sering digunakan sebagai pembantu diagnosis dan membedakan anemia.

MEAN CORPUSCULAR VOLUME (MCV)MCV adalah kalkulasi dari jumlah sel eritrosit dan hematokrit serta menandakan jumlah rata-rata dari eritrosit dalam femtoliter (fL)Rumus :MCV = Hct x 103fL RBC/LContoh :Hct= 45% (atau 0,45 L)RBC= 5,0 x 1012/L1 L= 1015/LMCV= 0,45 x 1015/L 5,0 x 1012/L= 0,09 x 103 fL= 90 fLKisaran normal untuk MCV: 80-100 fL

MEAN CORPUSCULAR HEMOGLOBIN (MCH)MCH adalah kalkulasi dari hemoglobin dan jumlah eritrosit, menandakan berat rata-rata hemoglobin dalam eritrosit, dan harus selalu menunjukkan korelasi dengan MCV dan MCHC.Rumus : MCH = Hb (g/L) pg RBC/L

Contoh :Hb= 15 g/dLRBC= 5 x 1012/L1 g= 1012 pgMCH= 15 x 1013 pg/L 5 x 1012/L= 15 x 10 pg/L 5/L= 30 pgKisaran normal untuk MCH: 27-31 pg

MEAN CORPUSCULAR HEMOGLOBIN CONCENTRATION (MCHC) MCHC adalah kalkulasi dari Hb dan Hct dan sebuah ungkapan dari konsentrasi rata-rata dari Hb dalam eritrositRumus : MCHC = Hb (g/dL) x 100% HctAtau,MCHC = Hb (g/dL) Hct (ditandai sebagai fraksi)Contoh :Hb= 15 g/dLHct= 45% (atau 0,45)1 g= 1012 pgMCHC= 15 g/dL x 100% 45 g/dL= 0,333 x 100%= 33,3%Atau,MCHC= 15 g/dL 0.45= 3.33 g/dLKisaran normal untuk MCHC: 31-36%, atau 31-36g/dL

A.6. FILM DARAH TEPI Pemeriksaan film darah tepi (PBF) adalah bagian yang penting dalam berbagai investigasi hematologi dan dapat menyediakan berbagai petunjuk untuk membatu diagnosis klinis. Film darah harus disiapkan dengan baik, diwarnai bagus dan diperiksa secara sistematis.

Persiapan : tolong diingat kembali bagaimana cara mendapatkan apusan darah yang ideal (petunjuk skill lab blok 8)

PROSEDUR Pertama film harus dilihat dibawah perbesaran lemah untuk menilai kualitas dari persiapan, jumlah dan distribusi, pewarnaan sel, serta untuk mendapatkan daerah dimana sel eritrosit tersebar merata dan tidak berubah.Memeriksa apusan darah menggunakan perbesaran lemah (10 x) Sel eritrosit, leukosit dan platelet harus terwarnai dengan benar Cek apakah terdapat sebaran sel leukosit pada apusan darah Estimasi jumlah sel leukosit (dengan memperhatikan jumlah sel leukosit /lapang pandang dan jumlah dari sel leukosit dalam hubungan dengan jumlah sel eritrosit). Hal tersebut harus cocok dengan hasil tes yang diperoleh. Jika tidak, penghitungan jumlah sel leukosit harus diulangi. Periksa ujung tepi apusan (bagian ekor) jika apusan ganjalan digunakan. Jika terdapat peningkatan jumlah sel leukosit pada area berbeda penghitungan sel maka menunjukkan ketidakakuratan. Jika terdapat gumpalan platelet, apusan dapat menunjukkan berkurangnya platelet. Dalam situasi ini, apusan darah harus dibuang dan dibuat yang lain. Ketika mengamati apusan darah, sangat penting untuk mencatat apapun yang tidak lazim atau irregular seperti pembesaran, sel bentuk abnormal atau pembentukan rouleaux sel eritrosit Pilih area apusan darah dimana penghitungan berbeda dimulai, letakkan setetes minyak pada kaca slide dan secara hati-hati pindahkan pada perbesaran minyak imersi (100x)Memilih area yang sesuai, perbesaran 40x dapat digunakan untuk pemeriksaan yang lebih kritis. Pada akhirnya, perbesaran kuat (100x) harus digunakan untuk melihat bentuk lebih jelas dari sel atau berbagai hal yang dicurigai. Sel eritrosit, leukosit, dan platelet harus diperiksa secara sistematis. Ketika mempelajari pewarnaan apusan, jangan memproses jauh sampai ke bagian tebal pada slide. Karakteristik morfologi dari sel-sel sulit dibedakan pada area ini. Sebaliknya jangan gunakan apusan pada bagian yang tipis dimana sel eritrosit muncul seluruhnya diisi dengan hemoglobin, secara umum berubah dan tidak menunjukkan gambaran morfologi yang benar Morfologi abnormal dapat dinilai sebagai 1+ (ringan), 2+ (sedang) atau 3+ (tanda) untuk menandakan derajat keparahan