Teknik RP-HPLC untuk pemisahan protein

Hasib Habibie, 1208105033 Bioanalisis

Kromatografi

Prinsip & teori dasar Kromatografi

Kromatografi Cair untuk Bioanalisis

Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography (Marie-Isabel Aguilar)

Prinsip dan teori dasar kromatografi

Kimia Bioanalisis

Prinsip Kromatografi

• Awalnya ditemukan oleh ilmuwan botani Rusia Mikhail Semenovich Tswett di awal abad 20

• Merupakan metode pemisahan dimana analitnya berada dalam fasa gerak (cair maupun gas) yang dipompakan pada fasa diam

• Salah satu fasa hidrofilik, lainnya lipofilik.

• Tergantung polaritasnya.

• Secara garis besar dapat berupa Kromatografi Gas dan Kromatografi Cair. Pada GC untuk molekul yang heat-stable dan volatile. Pada LC, sampel harus terlarut secara sempurna dalam fasa gerak.

Komponen sampel berinteraksi dengan fasa diam dan fasa gerak berbeda tergantung waktu retensi tiap komponen

Prinsip pemisahan Kromatografi.

Teori Dasar Kromatografi

• Faktor kapasitas

• Faktor selektivitas

• Efisiensi

• Persamaan Van deemter

• Plot Van deemter : Difusi Eddy, Difusi Longitudinal, transfer massa

Teori dasar Kromatografi

Faktor Kapasitas

Faktor Selektivitas

Persamaan Van deemter

Aplikasi Kromatografi untuk Bioanalisis

Kimia Bioanalisis

Pemisahan Protein

Sifat/Karakteristik Metode Pemisahan

Hidropobisitas K. Fasa terbalik

Muatan K. Pertukaran Ion

Biospesifisitas K. Affinitas

Ukuran, bentuk K. Size exclusion

Kromatografi untuk Bioanalisis

Fasa-terbalik

• Pemisahan biomolekul ex. peptida, asam amino, karbohidrat & steroid, yang larutan dalam campuran air-asetonitrile.

Pertukaran ion

• Pemisahan seluruh molekul bermuatan, ex. Protein large, nukleotida dan asam amino

• Bergantung pada pH

Afinitas

• spesifik untuk biomolekul tertentu

• Tahapannya sample introduction, adsorpsi, washing & desorpsi

Size Exclusion

• Bergantung pada ukurannya atau BM.

• Pemisahan polimer dalam media non-cair.

Gambar atas : Urutan pelarut bergantung pada polaritas dan keccapatan elusi

Gambar Bawah : Instrumen HPLC

Kromatografi Fasa Terbalik

Fasa diam yang biasa digunakan

Etil silana (C2) hingga n- octadesil silane (C18). Adapun yang paling sering digunakan yakni oktil silane (C8) dan (C18)

Perbedaan dalam RP-HPLC

Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography (Marie-Isabel Aguilar)

Kimia Bioanalisis

Kelebihan & Kekurangan RP-HPLC

• Resolusi yang tinggi dalam berbagai kondisi bahkan untuk gugus yang punya kemiripan tinggi.

• Selektivitasnya dapat dimodifikasi dengan mengubah karakteristik fasa diam

• High Recovery dan produktivitas yang tinggi

• Reprodusibilitas yang baik dalam pemisahan berulang2 dalam waktu yang lama dikarenakan fasa diam/sorbent yang stabikl dalam berbagai fasa gerak yang digunakan.

• Namun, RP-HPLC dapat menyebabkan denaturasi sampel protein karena penggunaan asetonitril.

Prinsip KCKT-Fasa terbalik

Alat dan Bahan

Alat

• Kolom oktadesil silika

• Saringan pelarut

• Saringan sampel

• Buffer A: 0.1% (v/v) TFA dalam air

• Buffer B: 100% CH3CN mengandung 0.1% (v/v) TFA

• Sistem HPLC dan detektor UV

Bahan

Asetonitril (CH3CN),

Air

Asam Trifluoroasetat (TFA).

Metode

• Preparasi Sampel

• Preparasi Pelarut

• Ekuilibrasi Kolom/Instrumen

• Injeksi Sampel

Preparasi Sampel

• 1 mg sampel dilarutkan dalam 1 mL buffer A. Jika ada material tidak terlarut, sampel disaring pada saringan 0.22-μm.

Preparasi Pelarut

• Semua pelarut disaring pada a 0.22-μm filter• Untuk menghilangkan partikulat yang dapat menghalangi pelarut. • If the HPLC instrument is not installed with on-line degassing

capability, check with your instrument requirements to assess whether further degassing is required.

Column Equilibration and Blank Run

1. Kondisi optimal standar HPLC

• a. Pelarut: 100% Buffer A

• b. Laju aliran: 1 mL/min

• c. Panjang Gelombang deteksi: 215 nm

• D. Suhu: Ambient

2. 10 μL water dimasukkan/diinjeksi.

Injeksi Sampel & Analisis

• Sebanyak 10 μL sampel diinjeksi. Gradien linear yang digunakan yakni 0 sampai 100% buffer B selama 30 menit.

• Gambar di samping menunjukkan kromatogram tipikal peptida

Monoclonal antibodies yang di analisis dalam waktu 9 menit memberikan puncak yang tajam.

Biotherapeutic proteins are a growing class of pharmaceutical drugs.

Insulin Variants

Notes

• Fase diam

• Diameter Kolom

• Ukuran Pori

• Buffer A

• Buffer B

• Laju Aliran

• Suhu

• Gradien Linear

Thankyou

Fasa Gerak

• Awalnya, fasa gerak yang digunakan di RP-HPLC menggunakan air saja namun sangat hidrofobik. Sehingga dibutuhkann pelarut organik untuk elusi. Pelarut organik akan menurunkan polaritas fasa gerak.

• Penambahan pelarut organik dapat menyebabkan denaturasi protein karena mengganggu interaksi hidrofobik antara rantai samping non-polar dari protein dan ikatan hidrogen dalam ikatan peptida. Sehingga waktu retensi semakin lama.

Ion Pairing Agent

• TFA dapat juga memiliki efek ion pairing agent. IPA ini berfungsi untuk mengikat molekul sampel dengan interaksi ionik, mengubah hidrofobisitasnya. Sehingga waktu retensi dan selektivitas dapat lebih baik.

• IPA ini dibutuhkan untuk mengikat analit ke fasa diam

Ion Surpression

• Stabilitas gel silika tergantung pH harus dibawah 7.5. Untuk mengatasinya, asam kuat spt TFA/ asam ortofosfat digunakan sehingga pH 2-3.

• Menggunakan pH rendah pada fasa gerak, protein juga mengandung gugus ionizable dan tingkat ionisasi ini dapat berefek pada waktu retensi. Pada kondisi pH rendah, ionisasi gugus karboksil dapat terjadi dan gugus amino sepenuhnya terdeprotonasi.

• Sehingga solut dapat dilihat sbg suatu species tunggal ionized. TI kebanyakan peptida dan protein kebanyakan di atas angka pH tsb. Selektivitas yang tinggi bisa didapatkan di bawah TI peptida.