STRES OKSIDATIF MENURUNKAN JUMLAH SEL OTOT POLOS KORPUS KAVERNOSUM PENIS TIKUS

I NYOMAN GEDE WARDANA

BAGIAN ANATOMI FK UNUDUNIVERSITAS UDAYANA

LAPORAN PENELITIAN

STRES OKSIDATIF MENURUNKAN JUMLAH SEL OTOT POLOS KORPUS KAVERNOSUM PENIS TIKUS

I NYOMAN GEDE WARDANA

BAGIAN ANATOMI FK UNUD UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR 2015

STRES OKSIDATIF MENURUNKAN JUMLAH SEL OTOT POLOS KORPUS KAVERNOSUM PENIS TIKUS

i

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadapa Ida Sang Hyang Widhi Wasa, atas karunia

dan rahmat-Nya lah penelitian yang berjudul “Stres Oksidatif Menurunkan Jumlah Sel Otot

Polos Korpus Kavernousm Penis Tikus” dapat penulis selesaikan dalam rangkamelaksanakan

Tri Dharma perguruan tinggi di Universitas Udayana

Dengan sepenuh hati penulis sampaikan rasa hormat, penghargaan, dan terima kasih

yang sedalam-dalamnya kepada

1. Prof. Dr. dr. Nyoman Mangku Karmaya, M. Repro., PA (K) yang telah memberikan

banyak sekali masukan dan bimbingan selama pelaksanaan penelitian ini

2. Pak Yulianto laboran di Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada yang banyak

sekali membantu, memberikan pelajaran yang sangat berharga dalam hal pemeriksaan

MDA, SOD, pemeliharaan tikus, nekropsi, pengambilan darah, dan pengambilan

organ selama penelitian dikerjakan di Yogya

3. Mbak Arik dan keluarga di Yogya yang banyak membantu dan menjaga tikus peneliti

selama penelitian di Yogya

4. Pak Bambang Supriyadi laboran di Bagian Histologi FKH UGM yang membantu

penulis dalam hal pembuatan preparat untuk pemeriksaan histopatologi

5. Drh. Ketut Eli Supartika, M.Sc di BBV yang juga turut membimbing serta membantu

penulis membaca sediaan histopatologis

6. Tidak lupa semua teman-teman di Bagian Anatomi yang selalu memberikan dorongan

dan masukan selama penulis menempuh pendidikan di Program Studi Ilmu Biomedik

Universitas Udayana

Penulis juga sangat berterima kasih kepada semua pihak yang ikut membantu dalam

penelitian ini, semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa senantiasa melimpahkan berkat dan

rahmat-Nya kepada mereka semua.

Denpasar, Desember 2015

Penulis

ii

ABSTRAK

STRES OKSIDATIF MENURUNKAN JUMLAH SEL OTOT POLOS KORPUS

KAVERNOSUM PENIS TIKUS

Saat ini banyak sekali peneliti yang tertarik mencari peranan stres oksidatif dalam

patofisiologi terjadinya disfungsi ereksi. Stres oksidatif adalah kondisi terjadinya ketidak

seimbangan antara pro-oksidan dengan kemampuan antioksidan untuk meredam terbentuknya

spesies oksigen reaktif. Stres oksidatif telah diketahui mempunyai peranan penting pada

patofisiologi infertilitas pada pria dan wanita. Akan tetapi pengaruhnya terhadap integritas

jaringan erektil penis masih belum diketahui secara jelas, khususnya terhadap jumlah sel otot

polos korpus kavernosum penis. Lainnya halnya dengan testosteron telah diketahui sangat

penting dalam menjaga integritas jaringan penis.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bagaimana pengaruh kondisi stres oksiditif

terhadap jumlah sel korpus kavernosum penis tikus

Penelitian ini memakai racangan randomized control group post-test only. Hewan

coba yang digunakan sampel dalam penelitian ini adalah tikus jantan strain Sprague Dawley

(SD) berusia 3 bulan dengan berat 250-300 gram dan dalam kondisi sehat yang diperoleh dari

kandang hewan coba di Pusat Studi Pangan dan Gizi Program Pascasarjana Universitas

Gadjah Mada-Yogyakarta. Sebanyak 30 ekor tikus jantan strain SD dibagi menjadi 3

kelompok dan setiap kelompoknya terdiri atas 10 ekor mencit. Dua kelompok diberi stres

overcrowding 4 jam/hari selama 3 dan 6 minggu. Sampel darah diambil pada kantus sinus

orbitalis medialis untuk diperiksa kadar MDA dan SOD.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa stres oksidatif menyebabkan menurunnya

jumlah sel otot polos korpus kavernosum. Rerata jumlah sel otot polos sebelum diberikan

stres adalah 20, setelah 3 minggu diberikan stres 14,20 (P < 0,05). Rerata jumlah sel otot

polos setelah minggu ke 6 adalah 7,8. Jadi dapat disimpulkan bahwa pemberian stres

oksidatif menurunkan jumlah sel otot polos korpus kavernosum penis tikus.

Kata kunci: stres oksidatif, stres psikososial, testosteron, MDA, SOD, sel otot polos korpus

kavernosum.

iii

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ……………………………………………........... i

ABSTRAK ...…………………………………………………….. ii

DAFTAR ISI ………………………………………………………. iii

PENDAHULUAN …………………………………………………......... 1

METODE PENELITIAN ………………………………………................. 2

HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………………………... 5

KESIMPULAN …………………………………….............................. 10

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………….. 11

1

PENDAHULUAN

Stres oksidatif adalah kondisi dimana sistem pertahanan antioksidan tidak adekuat

untuk menginaktifkan senyawa oksigen dan nitrogen reaktif yang dihasilkan tubuh baik itu

karena produksinya yang berlebih, menurunnya sistem pertahanan antioksidan, atau

keduanya. Stres oksidatif mempunyai peranan penting pada penyakit yang bersifat akut dan

kronis dan proses penuaan normal. Radikal bebas diperlukan bagi kelangsungan beberapa

proses fisiologis dalam tubuh, namun radikal bebas yang berlebihan dapat membahaykan

tubuh karena menyebabkan terjadinya kerusakan pada asam-basa nukleus, lemak, dan protein

yang mempengaruhi kondisi kesehatan sel dan viabilitasnya atau menginduksi terjadinya

berbagai macam respon seluler melalui pembentukan senyawa reaktif sekunder dan akhirnya

kematian sel oleh karena nekrosis atau apoptosis (Dalle-Donne et al., 2006).

Dalam keadaan normal tubuh mampu meredam efek radikal bebas melalui sistem

antioksidan baik yang enzimatis maupun non-enzimatis. Dan apabila radikal bebas yang

terbentuk berlebih dan inadekuat dinonaktifkan oleh sistem pertahanan antioksidan maka

akan terjadi stres oksidatif (Dalle-Donne et al., 2006). Kadar radikal hidroksil dan

peroksinitrit yang berlebih dapat merusak membran sel dan lipoprotein melalui proses yang

dinamakan peroksidasi lipid. Reaksi ini akan membentuk MDA (malondialdehid) yang

bersifat sitotoksik dan mutagenik. Protein juga dapat dirusak oleh SOR dan SNR yang dapat

menyebabkan hilangnya aktivitas enzim. Stres oksidatif yang merusak DNA dapat

menyebabkan terjadinya mutasi (Pham-Huy, 2008).

Stres oksidatif menyebabkan terjadinya kerusakan pada hati yang ditandai dengan

peningkatan kadar enzim alanin transaminase (ALT) dan penurunan kadar enzim aspartat

transaminase (AST) serta terjadinya steatosis pada sel-sel hati yang diberikan karbon

tetraklorida dengan dosis 0,1 dan 1,0 ml/kg berat badan. Dosis tersebut juga menimbulkan

2

kerusakan pada ginjal yang ditandai dengan adanya peningkatan serum kreatinin (Panjaitan et

al., 2007).

Radikal bebas juga sangat berperan penting dalam terjadinya disfungsi ereksi pada

pria. Interaksi antara nitrit oksida (NO) dengan senyawa oksigen reaktif merupakan salah satu

mekanisme penting dalam patofisiologis disfungsi ereksi. Nitrit oksida akan berinteraksi

dengan superoksida untuk membentuk peroksinitrit yang telah dilaporkan berperan penting

dalam terjadinya aterogenesis (Agarwal et al., 2006).

Integritas dan jumlah sel otot polos korpus kavernosum sangat penting dalam fisiologi

ereksi, ini ditunjukkan oleh penelitian Traish et al., 2003. Dengan melakukan kastrasi pada

kelinci didapatkan menurunnya tekanan intrakavernosus, perubahan pada keseimbangan

jumlah jaringan ikat dengan jumlah otot polos korpus kavernosum, penurunan konsentrasi

NO, adanya akumulasi sel lemak pada regio subtunikal korpus kavernosum dan akhirnya

menyebabkan terjadinya disfungsi veno-oklusi dan disfungsi ereksi.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh stres oksidatif terhadap integritas

jaringan penis khususnya jumlah sel otot polos korpus kavernosum

METODE PENELITIAN

Pemberian stres oksidatif. Untuk menimbulkan stres oksidatif hewan coba diberikan stres

overcrowding dengan cara 5 ekor hewan coba dimasukkan ke dalam kandang dengan ukuran

20x10x12 cm selama 4 jam/hari selama 3 dan 6 minggu.

Jumlah sampel. Jumlah sampel dari tiap kelompok perlakuan akan dihitung menggunakan

rumus federer. Kelompok perlakuan berjumlah dua (kelompok 3 minggu dan 6 minggu)

dengan satu kelompok kontrol. Rumus federer: (n-1) (t-1) ≥ 15 ; dengan t=jumlah kelompok

(3) dan n = jumlah sampel.

(n-1) (3-1) ≥ 15 n ≥ 8,5

3

Berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah sampel minimal yang diperlukan adalah 9

untuk setiap kelompok percobaan. Oleh karena pemberian perlakuan adalah 5 ekor hewan

coba dalam 1 kandang maka sampel dibulatkan menjadi 10.

Rancangan Penelitian dan Hewan Coba

Penelitian ini memakai racangan randomized control group post-test only. Hewan

coba yang digunakan sampel dalam penelitian ini adalah tikus jantan strain Sprague Dawley

(SD) berusia 3 bulan dengan berat 250-300 gram dan dalam kondisi sehat yang diperoleh dari

kandang hewan coba di Pusat Studi Pangan dan Gizi Program Pascasarjana Universitas

Gadjah Mada-Yogyakarta. Sebanyak 30 ekor tikus jantan strain SD dibagi menjadi 3

kelompok dan setiap kelompoknya terdiri atas 10 ekor mencit. Dua kelompok diberi stres

overcrowding 4 jam/hari selama 3 dan 6 minggu. Sampel darah diambil pada kantus sinus

orbitalis medialis untuk diperiksa kadar MDA dan SOD.

Pemeriksaan Kadar Malondialdehid

Pemeriksaan kadar MDA dan SOD dikerjakan di Laboratorium Pusat Studi Pangan

dan Gizi Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada-Yogyakarta. Pemeriksaan kadar

MDA mengikuti metode yang dijabarkan oleh Wuryastuti (1996). Darah dimasukkan ke

dalam tabung yang mengandung EDTA 1 mg/ml darah, kemudian disentrifuse 4000 rpm

selama 15 menit untuk mendapatkan plasma. Plasma ini kemudian digunakan untuk

memeriksa kadar MDA dan SOD.

Dipersiapkan dua buah tabung 13 ml polypropilen. Satu buah untuk standar

sedangkan sisanya untuk sampel plasma. Masing-masing tabung ditambahkan 750 µl H3PO4,

dan 250 µl TBA (Thiobarbituric acid). Kemudian untuk satu tabung dimasukkan sampel

plasma sebanyak 50 µl, sedangkan tabung yang lagi satu dimasukkan 50 µl larutan standar

(1,1,3,3, Tetraethoxypropane).

4

Masing-masing tabung ditambahkan 450 µl H2O dan dikocok ke dalam vortex. Kedua

tabung dipanaskan dengan suhu 100° C selama 60 menit, kemudian didinginkan dalam ice

bath selama ± 10 menit (sampai timbul warna merah muda). Kemudian sampel dipersiapkan

untuk pemeriksaan dalam column Sep-Pak C18.

Pertama ke dalam column Sep-Pak C18 dimasukkan methanol sebanyak 4 ml lalu

dibuang. Setelah itu ditambahkan 5 ml H2O dan dibuang. Sampel/standar kemudian

dimasukkan dan juga dibuang, di dinding akan terlihat warna merah muda. Setelah itu

dimasukkan kembali 4 ml methanol dan ditampung ke dalam tabung dan dibaca dalam

spektrofotometer dengan panjang gelombang 532 nm. Satuannya yang didapat adalah

mmol/l.

Pemeriksaan Kadar Superoksid Dismutase

Untuk pemeriksaan kadar antioksidan SOD dilakukan berdasarkan buku manual dari

Randox laboratories, 2006. Dipersiapkan dua buah tabung, satu digunakan untuk standar

sedangkan yang lagi satu digunakan untuk pemeriksaan sampel plasma. Ke dalam tabung

sampel dimasukkan 0,05 ml sampel plasma, sedangkan ke dalam tabung standar dimasukkan

0,05 ml larutan standar. Kedua tabung dimasukkan 1,7 ml larutan mixed substrate. Kedua

larutan dalam tabung dikocok dengan mesin vortex. Terakhir ditambahkan larutan xanthine

oxidase 0,25 ml ke dalam masing-masing tabung dan dikocok dengan mesin vortex. Setelah

30 detik pertama absorbansi campuran dibaca (A1) dalam spektrofotometer dan tiga menit

berikutnya (A2).

Kadar SOD dihitung dengan rumus:

Jumlah Sel Otot Polos Korpus Kavernosum. Hewan coba dari masing-masing kelompok

dikorbankan untuk diambil organ penisnya kemudian difiksasi dengan formalin buffer 10%

A2 – A1 3

5

dan selanjutnya dikirim ke Laboratorium Patologi untuk diwarnai dengan pewarnaan

Trichrome Light Green (Gomori, 1950). Dari hasil pewarnaan Trichrome Light Green otot

polos akan berwarna merah sedangkan jaringan ikan akan berwarna hijau. Jumlah sel otot

polos korpus kavernosum adalah rerata jumlah sel otot polos yang terdapat diantara dua sinus

kavernosum (trabekel) yang diperiksa pada 5 lapangan pandang dengan menggunakan

pembesaran 40x.

Analisis Data. Data yang diperoleh dalam penelitian ini akan dianalisis dengan

menggunakan uji One-Way Anova dengan menggunakan program SPSS ver 17

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kadar MDA dan SOD

Malondialdehid (MDA) adalah senyawa dialdehid yang merupakan produk akhir

peroksidasi lipid di dalam tubuh. Konsentrasi MDA yang tinggi menunjukkan adanya proses

oksidasi dalam membran sel. Radikal bebas dan peroksidasi lipid merupakan produk yang

hidupnya sangat singkat dan sulit diperiksa secara langsung. Sedangkan MDA lebih stabil

dan merupakan produk degradasi peroksidasi lipid yang memiliki waktu hidup yang lebih

lama (Aricioglu et al., 1993). Dari hasil yang ditunjukkan pada grafik 1 dan 2 dapat dilihat

bahwa semakin lama diberikan stres overcrowding rerata kadar MDA semakin meningkat

secara signifikan (P<0,05). Sedangkan rerata kadar antioksidan SOD menurun secara

signifikan (P<0,05). Adanya peningkatan rerata kadar MDA dan disertai dengan menurunnya

kadar antioksidan SOD menandakan bahwa hewan coba sudah mengalami stres oksidatif

(Dalle-Donne et al., 2006).

Enzim superoksida dismutase berperan penting dalam terjadinya disfungsi ereksi.

Interaksi antara NO dengan senyawa oksigen reaktif merupakan salah satu mekanisme

penting dalam patofisiologis disfungsi ereksi. Nitrit oksida akan berinteraksi dengan

superoksida untuk membentuk peroksinitrit yang telah dilaporkan berperan penting dalam

6

terjadinya aterogenesis. Peroksinitrit kemudian berinteraksi dengan tirosil yang

mengakibatkan tidak aktifnya enzim superoksida dismutase sehingga pembuangan

superoksida akan berkurang. Hal ini menyebabkan terjadinya peningkatan pembentukan

peroksinitrit dan menurunnya konsentrasi NO. Peroksinitrit menyebabkan relaksasi otot polos

korpus kavernosum kurang poten dibandingkan dengan NO. Relaksasi otot polos korpus

kavernosum berlangsung singkat dibandingkan dengan NO. Selain itu, kembalinya tegangan

jaringan oleh peroksinitrit berlangsung lambat dibandingkan dengan NO. Mekanisme inilah

yang mendasari terjadinya relaksasi yang tidak efektif pada jaringan kavernosus yang

akhirnya menyebabkan terjadinya disfungsi ereksi. Peroksinitrit dan superoksida dilaporkan

juga menyebabkan terjadinya apoptosis di endotel yang akhirnya juga akan menyebabkan

berkurangnya produksi NO. Berkurangnya kadar NO merupakan dasar terjadinya disfungsi

ereksi (Agarwal et al., 2006).

Grafik. 1. Rerata Kadar MDA (mmol/L) pada Setiap Kelompok Perlakuan

3,93

15,71

26,14

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

Kontrol Stres 3 Minggu Stres 6 Minggu

Kad

ar M

DA

(m

mol

/L)

Kelompok Perlakuan

7

Grafik 2. Rerata Kadar SOD (µ/grHb) pada Setiap Kelompok Perlakuan

Jumlah Sel Otot Polos Korpus Kavernosum

Dari hasil analisis statistik didapatkan jumlah sel otot polos dari masing-masing

kelompok berbeda secara signifikan (P<0,05) sedangkan dari hasil pemeriksaan

histopatologis didapatkan jumlah sel otot terlihat berkurang jika stres diberikan semakin lama

(Gambar 1). Endotel dari sinus kavernosum juga terlihat mengalami disintegritas (tanda

panah). Ada beberapa penelitian yang menunjukkan adanya hubungan antara stres oksidatif

dengan integritas struktur dari jaringan penis

Grafik 3. Rerata Jumlah Sel Otot Polos Korpus Kavernosum Penis (CCSM) pada Setiap

Kelompok Perlakuan.

767,79

592,53

354,63

0,00

200,00

400,00

600,00

800,00

1000,00

Kontrol Stres 3 Minggu Stres 6 Minggu

Kad

ar S

OD

(µ

/grH

b)

Kelompok Perlakuan

20,20

14,20

7,90

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Kontrol Stres 3 Minggu Stres 6 Minggu

Jum

lah

CC

SM

Kelompok Perlakuan

8

(Wink et al., 1998) dalam penelitiannya mendapatkan adanya hubungan antara

radikal bebas terhadap sel otot polos korpus kavernosum. Produksi NO (nitrit oksida) yang

berlebih sebagai akibat adanya proses inflamasi seperti penyakit peyroni, trauma penis, dan

priapismus menyebabkan efek sitotoksik pada sel otot polos korpus kavernosum. Sementara

itu penelitian yang dilakukan Evliyaoglu et al., 1997 dengan mengkondisikan tikus

mengalami veno oklusif priapismus menunjukkan peningkatan kadar lipid peroksidasi pada

jaringan korpus kavernosum.

Gambar 1. A. Penampang melintang korpus kavernosum tikus sebelum stres (10x). (VDP:

Vena Dorsalis Penis; CS: Korpus Spongiosum; CC: Korpus Kavernosum; SC: Sinus

Kavernosum; URT: Uretra). B. Penampang melintang korpus kavernosum penis yang

A B

C

9

diberikan stres 3 minggu. C. Penampang melintang korpus kavernosum penis yang diberikan

stres 6 minggu. Pewarnaan dilakukan menggunakan Trichrome Light Green

Gambar 2. Rerata Jumlah Sel Otot Polos Korpus Kavernosum pada masing-masing

Kelompok Perlakuan

Leungwattanakij et al., 2003 menemukan adanya fibrosis pada korpus kavernosum

setelah dilakukan neurotomi yang ditandai dengan peningkatan ekspresi β1 mRNA, HIF-1α,

TGF-β1, dan ekspresi protein kolagen tipe III dengan pemeriksaan imunohistokimia.

KESIMPULAN

Stres oksidatif yang diberikan dengan cara crowding pada penelitian ini menurunkan

jumlah sel otot polos korpus kavernosum tikus galur SD. Mekanisme bagaimana jumlah sel

otot polos korpus kavernousm penis menurun masih belum jelas, apakah akibat langsung dari

A B

C

10

radikal bebas yang dihasilkan selama stres atau karena akibat penurunan pada jumlah hormon

testosteron. Sebagaimana diketahui hormon testosteron juga berperan penting dalam menjaga

makro struktur dari penis. Perlu penelitian lagi mengenai bagaimana kadar hormon

testosteron selama stress crowding ini diberikan

11

DAFTAR PUSTAKA

Agarwal, A., Nandipati, K.C., Sharma, R.K., Zippe, C.D., Raina, R. 2006. Role of Oxidative

Stress in the Pathophysiological Mechanism of Erectile Dysfunction. Journal of

Andrology. 27 (3): 335: 347.

Aricioglu, A., Aykol, S., Yenikaya, E., Baykaner, K., Serdar-Alp, M., and Turkozkan, N.

1993. Investigation of Serum and Tissue Lipid Peroxidation and Serum Ascorbic Acid,

and Iron Levels in Human Brain Tumour. Turkish Neurosurgery 3: 150-153.

Dalle-Donne. I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., and Milzani, A. 2006. Biomarkers of

Oxidative Damage in Human Disease. Clinical Chemistry. 52 (4): 601-623.

Evliyaoglu, Y., Kayrin, L., and Kaya, B. 1997. Effect of Pentoxifylline on Veno-occlusive

Priapism-Induced Corporeal Tissule Lipid Peroxidation in Rat Mode. Urol Res. 25: 143-

147.

Leungwattanakij, S. Bivalacqua, T.J., Usta, M.F., Yang, D.Y., Hyun, J.S., Champion, H.C.,

Abdel-Mageed, A.B., and Hellstrom, W.J.G. 2003. Cavernous Neurotomy Causes

Hypoxia and Fibrosis in Rat Corpus Cavernosum. J Androl. 24: 239-245.

Panjaitan RGP., Handharyani E., Chairul., Masriani., Zakiah Z., Manalu Wasmen. Pengaruh

Pemberian Karbon Tetraklorida terhadap Fungsi Hati dan Ginjal Tikus. MAKARA,

Kesehatan, Vol. 11. (1). Juni 2007. P11-16.

Pham-Huy, L.A.P, He, H., and Pham-Huy, C. 2008. Free Radicals, Antioxidants in Disease

and Health. Int J Biomed Sci. 4: 89-96.

Traish, A.M., Goldstein, I., Kim, N.N. 2007. Testosterone and Erectile Function: From Basic

Reasearch to a New Clinical Paradigm for Managing Men with Androgen Insufficiency

and Erectile Dysfunction. Eur Urol. 52: 54-70.

Wink, D.A., Feelisch, M., Fukuto, J., Chistodoulou, D., Jourd'Heuil, D., Grisham, M.B.,

Vodovotz, Y., Cook, J.A., Krishna, M., DeGraff, W.G., Kim, S., Gamson, J., Mitchell,

J.B. 1998. The Cytotoxicity of Nitroxyl: Possible Implications for the

Pathophysiological Role of NO. Arch Biochem Biophys. 351: 66-74.