DNA.1.1 SIFAT KIMIA DAN FISIKA DNA Dibawah ini diuraikan beberapa sifat fisika-kimia dari DNA. Sifat-sifat tersebut adalah stabilitas DNA, pengaruh asam, pengaruh alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung.Stabilitas DNAKetika kita melihat struktur tangga berpilin molekul DNA sepintas akan nampak bahwa struktur tersebut menjadi stabil akibat adanya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang berpasangan. Tetapi, sebenarnya Ikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan basa hanya akan sama kuatnya dengan ikatan hidrogen antara basa dan molekul air apabila DNA berada dalam bentuk rantai tunggal. Jadi, ikatan hidrogen jelas tidak berpengaruh terhadap stabilitas struktur asam nukleat, tetapi sekedar menentukan spesifitas perpasangan basa. Penentu stabilitas struktur DNA terletak pada interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat. Pengaruh asamDi dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya HClO4 dengan suhu lebih dari 100C,DNA akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen-komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan glikosidik antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat dikatakan bersifat apurinik.Pengaruh alkaliPengaruh alkali terhadap DNA mengakibatkan terjadinya perubahan status tautomerik basa. Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA mengalami denaturasi. Denaturasi kimiaSejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi DNA pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid (COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder DNA menjadi berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.ViskositasDNA kromosom dikatakan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi karena diameternya hanya sekitar 2 nm, tetapi panjangnya dapat mencapai beberapa sentimeter. Dengan demikian, DNA tersebut berbentuk tipis memanjang. Selain itu, DNA merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA akan mempunyai viskositas yang tinggi. Karena sifatnya itulah molekul DNA menjadi sangat rentan terhadap fragmentasi fisik. Hal ini menimbulkan masalah tersendiri ketika kita hendak melakukan isolasi DNA yang utuh.Kerapatan apungAnalisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung (bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi ke dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA akan bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini dikenal sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium density gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik. Sifat-sifat Spektroskopik-Termal Asam NukleatSifat spektroskopik-termal DNA meliputi kemampuan absorpsi sinar UV, hipokromisitas, serta denaturasi termal dan renaturasi DNA Masing-masing akan dibicarakan sekilas berikut ini.Absorpsi UVDNA dapat mengabsorpsi sinar UV karena adanya basa nitrogen yang bersifat aromatik; fosfat dan gula tidak memberikan kontribusi dalam absorpsi UV. Panjang gelombang untuk absorpsi maksimum oleh DNA adalah 260 nm atau dikatakan maks = 260 nm. Nilai ini jelas sangat berbeda dengan nilai untuk protein yang mempunyai maks = 280 nm. Sifat-sifat absorpsi DNA dapat digunakan untuk deteksi, kuantifikasi, dan perkiraan kemurniannya.HipokromisitasMeskipun maks untuk DNA dan RNA konstan, ternyata ada perbedaan nilai yang bergantung kepada lingkungan di sekitar basa berada. Dalam hal ini, absorbansi pada 260 nm (A260) memperlihatkan variasi di antara basa-basa pada kondisi yang berbeda. Nilai tertinggi terlihat pada nukleotida yang diisolasi, nilai sedang diperoleh pada molekul DNA rantai tunggal (ssDNA) atau RNA, dan nilai terendah dijumpai pada DNA rantai ganda (dsDNA). Efek ini disebabkan oleh pengikatan basa di dalam lingkungan hidrofobik. Istilah klasik untuk menyatakan perbedaan nilai absorbansi tersebut adalah hipokromisitas. Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik (kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan hiperkromik terhadap dsDNA. Denaturasi termal dan renaturasiDi atas telah disinggung bahwa beberapa senyawa kimia tertentu dapat menyebabkan terjadinya denaturasi DNA. Ternyata, panas juga dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat. Proses denaturasi ini dapat diikuti melalui pengamatan nilai absorbansi yang meningkat karena molekul rantai ganda (pada dsDNA) akan berubah menjadi molekul rantai tunggal.Denaturasi termal pada DNA, terjadi sangat cepat dan bersifat koperatif karena denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya.Suhu ketika molekul DNA mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel DNA, dan berkisar dari 80 C hingga 100C untuk molekul-molekul DNA yang panjang.DNA yang mengalami denaturasi termal dapat dipulihkan (direnaturasi) dengan cara didinginkan. Laju pendinginan berpengaruh terhadap hasil renaturasi yang diperoleh. Pendinginan yang berlangsung cepat hanya memungkinkan renaturasi pada beberapa bagian/daerah tertentu. Sebaliknya, pendinginan yang dilakukan perlahan-lahan dapat mengembalikan seluruh molekul DNA ke bentuk rantai ganda seperti semula. Renaturasi yang terjadi antara daerah komplementer dari dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi.1.2 struktur kimia dan fisik dnaDNA adalah polimer dari nukleotida-nukleotida. Nukleotida-nukleotida dalamDNA dihubungkan satu dengan yang lainnya oleh ikatan fosfodiester, yaitu ikatan yang terjadi antara Carbon katida dari satu nukleotida terdiri dari sebuah gula pantosa (deoksiribosa), satu buah fosfat dan satu basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut berikatan dengan carbon pertama dari gula deoksiribosa, sedangkan fosfat berikatan dengan Carbon kelima dari gula yang sama. Basa nitrogen yang menyusun nukleotida dikelompokan menjadi 2 yaitu: Purine, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa dua cincin. Termasuk diantaranya adalah : adenin dan guanin. Primidin, yaitu basa nitrogen yang strukturnya berupa satu cincin. Termasuk diantaranya adalah : citosin dan timin. Struktur kimia Dan fisik dnaSetiap molekul DNA terdiri dari sub unit deoksiribonukleotida monofosfat. Setiap unit tersebut tersusun dari kelompok fosfat yang berikatan dengan gula pada atom karbon no. 5 dengan Carbon no.3 dari gula berikutnya disebut ikatan fosfodiester (Wolf, 1993) Menurut Hukum Chargaff susunAN dna: Chargaff meneliti proporsi relatif dari purin dan purimidin dalam suatu DNA dari sejumlah organisma. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa dalam DNA dari organisma apapun jumlah A=T dan C=G. Dengan menggunakan difraksi sinar X diketahui bahwa DNA mempunyai susunan helix. Dua rantai polinukleotida tersebut tersusun dalam a coiled double helix.Rantai gula dan fosfat membentuk rangka luar dari helix. Basa nitrogen-basa nitrogen yang melekat pada gula menonjol ke dalam pusat helix. Jarak antara 2 strand adalah 1,1 nm yang diisi oleh basa nitrogen Jarak antara 2 basa adalah 3,4 A Setiap putaran dalam helix terdapat 10 basa Setiap putaran dalam helix mempunyai jarak 34 A Kedua stran (rantai 1polinukleotida) anti paralel artinya suatu rantai mempunyai arah yang berlawanan dengan rantai pasangannya. Misalnya suatu stran berakhir dengan gugus 5 fosfat sedang rantai pasangannya berakhir dengan gugus 3 OH (hidroksil).Kedua rantai polinukleotida komplementer artinya urytan nukleotida pada suatu rantai menentukan urutan nukleotida pada rantai pasangannya.Antara satu basa nitrogen dengan basa pasangannya dihubungkan oleh ikatan hidrogen. *) Dua ikatan hidrogen antara A dan T*) Tiga ikatan hidrogen antara C dan G 10. Basa nitrogen A hanya dapat berpasangan dengan T, sedangkan C dengan G 11.Kemungkinan jumlah urutan basa adalah tidak terbatas, urutan yang berbeda menkode informasi yang berlainan.1.3 Fungsi DNA sebagai Materi Genetik DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme harus dapat menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini. 1. DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik, yang dilaksanakan melalui replikasi. 2. DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan fungsi fenotipik, yang dilaksanakan melalui ekspresi gen 3. DNA sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yangbersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah1.4 Replikasi DNAAda tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatifsemikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNAawal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Padareplikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehinggakedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun, masing-masing untai ini tetapdipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untapolinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif kedua untai polinukleotidamengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotidayang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru. Di antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Percobaan ini dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl. Komponen utama Replikasi, adalah sebagai berikut : 1. DNA cetakan, yaitu molekul DNA atau RNA yang akan direplikasi. 2. Molekul deoksiribonukleotida, yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTp. Deoksiribonukleotida terdiri atas tiga komponen yaitu: (i) basa purin atau pirimidin, (ii) gula 5-karbon( deoksiribosa) dan (iii) gugus fosfat. 3. Enzim DNA polimerase, yaitu enzim utama yang mengkatalisi proses polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. 4. Enzim primase, yaitu enzim yang mengkatalisis sintesis primer untuk memulai replikasi DNA. 5. Enzim pembuka ikatan untaian DNA induk, yaitu enzim helikase dan enzim lain yang membantu proses tersebut yaitu enzim girase. 6. Molekul protein yang menstabilkan untaian DNA yang sudah terbuka,yaitu protein SSB (single strand binding protein). 7. Enzim DNA ligase, yaitu suatu enzim yang berfungsi untuk menyambung fragmenfragmen DNA. Sintesis untaian DNA yang baru akan dimulai segera setelah kedua untaian DNA induk terpisah membentuk garpu replikasi Pemisahan kedua untaian DNA induk dilakukan oleh enzim DNA helikase. Proses replikasi dimulai ketika enzim DNA helikase memisahkan dua untai DNA heliks ganda, seperti ritsleting terbuka. Kemudian, setiap untai DNA yang lama akan berfungsi sebagai cetakan yang menentukan urutan nukleotida di sepanjang untai DNA komplementer baru yang bersesuaian dengan cara mendeteksi basa komplemennya. Sintesis DNA berlangsung dengan orientasi 5'-P 3'-OH. Oleh karena ada dua untaian DNA cetakan yang orientasinya berlawanan, maka sintesis kedua untaian DNA baru juga berlangsung dengan arah geometris yang berlawanan namun semuanya tetap dengan orientasi 5' 3'. Setelah mendapatkan pasangan yang sesuai, nukleotida yang baru tersebut disambung satu sama lain untuk membentuk tulang punggung gula-fosfat untai DNA yang baru. Jadi, setiap molekul DNA terdiri atas satu untai DNA lama dan satu untai DNA baru. Sekarang, terdapat dua molekul DNA yang sama persis dengan satu molekul DNA induk. Enzim DNA polimerase memiliki fungsi lain, yaitu mengoreksi DNA yang baru terbentuk, membetulkan setiap kesalahan replikasi, dan memperbaiki DNA yang rusak. Adanya fungsi tersebut menjadikan rangkaian nukleotida DNA sangat stabil dan mutasi jarang terjadi.1.4 Transkripsi telah disebutkan bahwa fungsi dasar kedua yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat)nya.Transkripsi mempunyai ciri-ciri kimiawi yang serupa dengan sintesis/replikasi DNA, yaituAdanya sumber basa nitrogen berupa nukleosida trifosfat. Bedanya dengan sumber basa untuk sintesis DNA hanyalah pada molekul gula pentosanya yang tidak berupa deoksiribosa tetapi ribosa dan tidak adanya basa timin tetapi digantikan oleh urasil. Jadi, keempat nukleosida trifosfat yang diperlukan adalah adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sitidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP).Adanya untai molekul DNA sebagai cetakan. Dalam hal ini hanya salah satu di antara kedua untai DNA yang akan berfungsi sebagai cetakan bagi sintesis molekul RNA. Untai DNA ini mempunyai urutan basa yang komplementer dengan urutan basa RNA hasil transkripsinya, dan disebut sebagai pita antisens. Sementara itu, untai DNA pasangannya, yang mempunyai urutan basa sama dengan urutan basa RNA, disebut sebagai pita sens. Meskipun demikian, sebenarnya transkripsi pada umumnya tidak terjadi pada urutan basa di sepanjang salah satu untai DNA. Jadi, bisa saja urutan basa yang ditranskripsi terdapat berselang-seling di antara kedua untai DNA. Sintesis berlangsung dengan arah 5 3 seperti halnya arah sintesis DNA.Gugus 3- OH pada suatu nukleotida bereaksi dengan gugus 5- trifosfat pada nukleotida berikutnya menghasilkan ikatan fosofodiester dengan membebaskan dua atom pirofosfat anorganik (PPi). Reaksi ini jelas sama dengan reaksi polimerisasi DNA. Hanya saja enzim yang bekerja bukannya DNA polimerase, melainkan RNA polimerase. Perbedaan yang sangat nyata di antara kedua enzim ini terletak pada kemampuan enzim RNA polimerase untuk melakukan inisiasi sintesis RNA tanpa adanya molekul primer. Secara garis besar transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Masing-masing tahap akan dijelaskan secara singkat sebagai berikut.Pengenalan promoterAgar molekul DNA dapat digunakan sebagai cetakan dalam sintesis RNA, kedua untainya harus dipisahkan satu sama lain di tempat-tempat terjadinya penambahan basa pada RNA. Selanjutnya, begitu penambahan basa selesai dilakukan, kedua untai DNA segera menyatu kembali. Pemisahan kedua untai DNA pertama kali terjadi di suatu tempat tertentu, yang merupakan tempat pengikatan enzim RNA polimerase di sisi 5 (upstream) dari urutan basa penyandi (gen) yang akan ditranskripsi. Tempat ini dinamakan promoter.InisiasiSetelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan terikat pada suatu tempat di dekat promoter, yang dinamakan tempat awal polimerisasi atau tapak inisiasi (initiation site). Tempat ini sering dinyatakan sebagai posisi +1 untuk gen yang akan ditranskripsi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan di tapak inisiasi dan sintesis RNA pun segera dimulai. ElongasiPengikatan enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya pada untai DNA cetakan membentuk kompleks transkripsi. Selama sintesis RNA berlangsung kompleks transkripsi akan bergeser di sepanjang molekul DNA cetakan sehingga nukleotida demi nukleotida akan ditambahkan kepada untai RNA yang sedang diperpanjang pada ujung 3 nya. Jadi, elongasi atau polimerisasi RNA berlangsung dari arah 5 ke 3, sementara RNA polimerasenya sendiri bergerak dari arah 3 ke 5 di sepanjang untai DNA cetakan. TerminasiBerakhirnya polimerisasi RNA ditandai oleh disosiasi kompleks transkripsi atau terlepasnya enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya dari untai DNA cetakan. Begitu pula halnya dengan molekul RNA hasil sintesis. Hal ini terjadi ketika RNA polimerase mencapai urutan basa tertentu yang disebut dengan terminator.Terminasi transkripsi dapat terjadi oleh dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk batang dan kala (loop) seperti pada Gambar 5.1.Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang berbeda-beda.1.5 Faktor-faktor Penentu StrukturDNAStruktur untaian (helix) DNA ditentukan oleh tumpukan (stacking) basa-basa nukleotida berdekatan yang ada pada satu untai, sedangkan struktur untai-gandanya ditentukan oleh ikatan hidrogen antara basa-basa yang berpasangan.Tumpukan-basaBasa-basa purin dan pirimidin yang menyusun molekul DNA terletak pada suatu bidang datar yang tegak lurus terhadap aksis untaian DNA. Oleh karena itu, molekul DNA dapat dianggap sebagai tumpukan-basa-basa nukleotida.b. Ikatan hidrogenPada molekul DNA, ikatan hidrogen berperanan di dalam membentuk struktur heliks antara untaian yang berpasangan. Pasangan antara nukleotida A-T ditentukan oleh adanya dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G-C ditentukan oleh adanya tiga ikatan hidrogen.c. Kandungan DNA dan kapasitas genetikSemakin kompleks suatu jasad maka semakin besar pula kandungan DNA-nya per sel haploid (dikenal seagai C value). Jasad yang mempunyai nilai-C yang lebih besar tidak selalu berarti mempunyai lebih banyak gen dibanding dengan jasad yang nilai-C-nya kecil. C value paradox dapat terjadi karena beberapa kelompok jasad mempunyai banyak urutan basa DNA yang tidak mengkode asam amino (non-coding DNA). Urutan basa DNA semacam ini banyak terdapat pada bagian intron dan urutan berulang (repetitive DNA).d. Enzim yang dapat mendepolimerisasi DNAMolekul DNA dapat didepolimerisasi menjadi komponen dasar penyusunnya (yaitu nukleotida) dengan menggunakan enzim nuklease. Enzim nuklease terdiri atas beberapa tipe yang secara umum dibedakan menjadi (1) DNase (mendepolimerisasi DNA) dan (2) RNase (mendepolimerisasi RNA). DNase ada yang hanya memotong molekul DNA untai-tunggal dan ada yang hanya memotong DNA untai-ganda. DNase dapat dibedakan lagi menjadi 2 macam, yaitu: (1) eksonuklease, yaitu DNase yang memotong DNA dari ujung molekul 5 atau dari ujung 3, dan (2) endonuklease, yaitu DNase yang memotong DNA dari bagian dalam untaian DNA.1.6 sekuening DNAPrinsip Sekuensing DNAMolekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau bahkan gen yang diinginkan. Namun, hal ini masih memerlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa fragmen tersebut benar-benar sesuai dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat dilakukan atas dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan. Penentuan urutan (sekuensing) basa DNA pada prinsipnya melibatkan produksi seperangkat molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini dimigrasikan/dipisahkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid atau polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) agar pembacaan sekuens dapat dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan sekilas dua macam metode sekuensing DNA. Metode Maxam-GilbertMetode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap.Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.Hasil dari metode ini dapat diketahui sekuens fragmen DNA yang dipelajari atas dasar laju migrasi masing-masing pita. Lajur kedua berisi fragmen-fragmen yang salah satu ujungnya adalah A atau G. Untuk memastikannya harus dilihat pita-pita pada lajur pertama. Jika pada lajur kedua terdapat pita-pita yang posisi migrasinya sama dengan posisi migrasi pada lajur pertama, maka dapat dipastikan bahwa pita-pita tersebut merupakan fragmen yang salah satu ujungnya adalah G. Sisanya adalah pita-pita yang merupakan fragmen dengan basa A pada salah satu ujungnya. Cara yang sama dapat kita gunakan untuk memastikan pita-pita pada lajur ketiga, yaitu dengan membandingkannya dengan pita-pita pada lajur keempat.Seperti halnya pada elektroforesis gel agarosa laju migrasi pita menggambarkan ukuran fragmen. Makin kecil ukuran fragmen, makin cepat migrasinya. Dengan demikian, ukuran fragmen pada contoh tersebut di atas dapat diurutkan atas dasar laju/posisi migrasinya. Jadi, kalau diurutkan dari yang terkecil hingga yang terbesar, hasilnya adalah fragmen-fragmen dengan ujung TTGCCCCGCGTGGCGCAAAGG. Inilah sekuens fragmen DNA yang dipelajari.Metode SangerDewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga.Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP.Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3nya. Untuk melihat ukuran fragmen-fragmen hasil sekuensing tersebut dilakukan elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid sehingga akan terjadi perbedaan migrasi sesuai dengan ukurannya masing-masing. Setelah ukurannya diketahui, dilakukan pengurutan fragmen mulai dari yang paling pendek hingga yang paling panjang, yaitu fragmen dengan ujung C (satu basa) hingga fragmen dengan ujung G (sembilan basa). Dengan demikian, hasil sekuensing yang diperoleh adalah CCACGTATG. Urutan basa DNA yang dicari adalah urutan yang komplementer dengan hasil sekuensing ini, yaitu GGTGCATAC. Ketika sekuens suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali gambaran yang dapat diperoleh dari sekuens tersebut. Analisis sekuens perlu dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket perangkat lunak, misalnya paket GCG Universitas Wisconsin dan DNAstar.Proyek-proyek Sekuensing GenomSejalan dengan berkembangnya mesin-mesin sekuensing DNA automatis (automatic DNA sequencer), sejumlah organisasi telah memberikan perhatian dan dukungan dana bagi penentuan sekuens genom berbagai spesies organisme penting. Beberapa genom yang ukurannya sangat kecil seperti genom virus HIV dan fag telah disekuens seluruhnya. Genom sejumlah bakteri, misalnya E. coli (4,6 x 106 pb), dan khamir Saccharomyces cerevisiae (2,3 x 107 pb) juga telah selesai disekuens. Sementara itu, proyek sekuensing genom tanaman Arabidopsis thaliana (6,4 x 107 pb) dan nematoda Caenorhabditis elegans saat ini masih berlangsung. Proyek Genom Manusia (Human Genom Project), yang diluncurkan pada tahun 1990 dan sebenarnya diharapkan selesai pada tahun 2005, ternyata berakhir dua tahun lebih cepat daripada jadwal yang telah ditentukan.Pada genom manusia dan genom-genom lain yang berukuran besar biasanya dilakukan pemetaan kromosom terlebih dahulu untuk mengetahui lokus-lokus gen pada tiap kromosom. Selanjutnya, perpustakaan gen untuk suatu kromosom dikonstruksi menggunakan vektor YACs (lihat Bab XI) dan klon-klon YACs yang saling tumpang tindih diisolasi hingga panjang total kromosom tersebut akan tercakup. Demikian seterusnya untuk kromosom-kromosom yang lain hingga akhirnya akan diperoleh sekuens genom total yang sambung-menyambung dari satu kromosom ke kromosom berikutnya1.7 kerusakan DNADNA adalah molekul sel yang sangat rentan terhadap kerusakan. Kerusakan DNA adalah perubahan dalam strutur dasar dan dan fungsi rantai DNA. paparan radiasi, trauma fisik, bahan kimia dan bahkan metabolisme normal DNA dapat menimbulkan timbulnya bermacam lesi DNA. Penyebab kerusakan DNA sendiri dapat dibagi dalam dua faktor. Faktor intrinsik meliputi oksigen dan hasil metabolismenya (ROS), rekombinasi sintesis imunoglobulin dan kegagalan proses replikasi DNA. Sedangkan faktor ekstrinsik tergantung kadar dan durasi rangsangan, yang akan mempengaruhi sensitifitas sel, meliputi irradiasi sel, misalnya ultra violet radiation (UVR), ionizing radiation (IR) yang akan menyebabkan cross link dan rusaknya rantai DNA. Selain itu bahan kimia yang bersifat mutagenik/karsinogenik juga dapat mempengaruhi integritas DNA dan replikasinya. Kerusakan DNA berpengaruh pada struktur rantai Double helix DNA, adanya kerusakn DNA menyebabkan rantai dna tidak berpasangan dengan rantai dna yang seharusnya, atau mendapat pasangan rantai baru yang tidak sesuaiKerusakan DNA dapat menyebabkan terjadinya delesi. Delesi adalah salah satu macam perubahan struktur kromosom, yaitu hilangnya suatu segmen dari kromosom beserta gen-gen yang terdapat padanya. Adanya delesi biasanya karena pengaruh penyinaran dengan sinar X, radioaktif serta bahan lain yang berpengaruh kuat.Delesi dapat terjadi apabila sebuah kromosom putus di dua tempat, sehingga bagian yang putus akan melepaskan diri dan tertinggal dalam plasma dan akan hilang. Daftar PustakaPoedjiadi, Anna. 2005.Dasar-dasar Biokimia.UI press.JakartaStryer, L. 1988, Biochemistry, thrid edition. Stanford University, W.H. Freeman and Company, New York Wolf, L.S., 1993, Molecular and cellular Biology. California: Wardsworth Publishing Company D. L. Nelson and M. M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Worth Publishers, 3rd edition, 2000.